JPWO2004018669A1 - 塩誘導性キナーゼ２及びその用途 - Google Patents

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Abstract

本発明のポリペプチドは、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０又は配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドである。本発明のポリペプチドは、脂肪細胞等における代謝異常が関与する疾患の予防・改善薬等として有用である。

Description

本発明は、マウス由来の塩誘導性キナーゼ２（Ｓａｌｔ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｋｉｎａｓｅ ２：ＳＩＫ２）ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリペプチドに対する抗体、該ポリペプチドの活性を促進する、または阻害する化合物のスクリーニング方法、および該ポリペプチドの作用を抑制または亢進する組成物等に関する。
各種のホルモンや神経伝達物質が細胞内のｃＡＭＰ濃度を増加させることが知られている。細胞内ｃＡＭＰ濃度が上昇すると、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）を活性化させる。ＰＫＡの触媒ドメインが、ＰＫＡ活性を負に調節する調節ドメインから解離されることによってＰＫＡが活性化されることが報告されている（Ｍａｙｒら、ネイチャー・レビューズ・モレキュラー・セル・バイオロジー（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ）２，５９９−６０９（２００１））。活性化されたＰＫＡはｃＡＭＰ応答配列（以下、本明細書において「ＣＲＥ」ともいう）に結合する転写因子であるｃＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、本明細書において「ＣＲＥＢ」という」）をリン酸化し、リン酸化されたＣＲＥＢがＣＲＥに結合し、遺伝子の転写活性を制御することが知られている。
脂肪細胞の分化および機能も、やはり細胞内ｃＡＭＰによって調節されており（Ｒｅｕｓｃｈら、モレキュラー・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）２０，１００８−１０２０（２０００））、ＣＲＥＢの活性化は脂肪細胞の分化誘導に必要不可欠であり、主にＣＲＥＢが脂肪細胞分化を調節していることが報告されている。また、プレニレーションの阻害によりインスリン誘導性の脂肪細胞の分化機構が阻害された場合、ＣＲＥＢの活性化により脂肪細胞の分化が補完されることも報告されている。一方、ＣＲＥＢは血糖ホメオスタシスの機構を制御している。すなわち、ｃＡＭＰ−ＰＫＡ−ＣＲＥＢ−ＣＲＥシグナルは脂肪細胞の分化や機能、血糖の調節において非常に重要な役割を果たしており、ｃＡＭＰ−ＰＫＡ−ＣＲＥＢ−ＣＲＥシグナルをコントロールすることで肥満や糖尿病等を予防、改善できると考えられる。
しかしながら、現在までに報告されているＣＲＥＢバインディングプロテイン（ＣＢＰ）は脂肪細胞以外の組織においても発現しているため、それらを利用して脂肪細胞の機能を制御することは困難である。したがって、脂肪細胞で特異的に発現するＣＲＥＢのモジュレーターを同定し、そのモジュレーターの生理活性を制御することができれば、肥満や糖尿病等の発症を予防、改善できると考えられる。従って、脂肪細胞に特異的なＣＲＥＢのモジュレーターが望まれていた。
高塩食ストレス処理したラットの副腎皮質において、塩誘導性キナーゼ（ＳＩＫ）をコードしているｃＤＮＡが同定された［Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４５３，１３５−１３９（１９９９）］。ＳＩＫは、ストレス刺激下における脂肪代謝の調節に重要な役割を有するセリン・スレオニン キナーゼであるＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ ファミリーに属する酵素であり、この酵素（ＳＩＫ）はｃＡＭＰ−ＰＫＡシグナルで誘導され、ＰＫＡで活性化されたＣＲＥＢの遺伝子発現活性を制御し、その制御はＳＩＫのタンパク質リン酸化活性と相関することが報告されている［Ｊ．Ｄｏｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７７，１５６２９−１５６３７（２００２）］。しかしながら、ＳＩＫも広い範囲の組織で発現しており［Ｘ．Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １５（８），１２６４−１２７６（２００１）；Ｊ．Ｄ．Ｆｅｌｄｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７４，２２２７−２２３８（２０００）］、脂肪細胞に特異的なＣＲＥＢのモジュレーターとはいい難い。
一方、脂肪細胞組織における脂質代謝は２つのホルモンシグナル経路の制御下にあることが報告されている。すなわち、インシュリンはグルコースの吸収および脂質生成を誘導しており、一方、アドレナリンやグルカゴン等の外因性の刺激により生成されるｃＡＭＰは脂質分解を誘導しており、この２つのシグナル系の間のバランスがくずれると、脂肪組織が高インシュリン血症に曝され、脂肪組織は徐々にインシュリン刺激に対して耐性となる［Ｓｕｌ．Ｈ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６０，３１７−３４５（１９９８），Ｓａｌｔｉｅｌ，Ａ．Ｒ．，ａｎｄ Ｋａｈｎ，Ｃ．Ｒ．Ｎａｔｕｒｅ ４１４，７９９−８０６（２００１）］。脂肪組織や肝、骨格筋等の生物学的代謝に関与している組織でインシュリン耐性が生じると、最終的には肥満や２型糖尿病等の全身のエネルギー代謝異常を引き起こすことになる。インシュリンレセプター基質１（ＩＲＳ−１）タンパク質はインシュリン−シグナルカスケードの鍵となる分子である。すなわち、ＩＲＳ−１タンパク質はインシュリン依存的に活性化されたインシュリンレセプターキナーゼの作用によってチロシン残基がリン酸化され、チロシンがリン酸化されたＩＲＳ−１タンパク質は、続いて細胞内カスケードを誘発する。ＩＲＳ−１タンパク質がある非生理学的な条件下でセリン残基がリン酸化されたことが報告されている。ＩＲＳ−１タンパク質のセリン−リン酸化は、インシュリン−シグナルカスケードの効率を制御しており、その結果として、インシュリン刺激に対して動物を耐性化していると思われる。ＩＲＳ−１タンパク質のセリン−リン酸化に関与するいくつかのプロテインキナーゼ分子が同定され、報告されている［Ｔａｎａｓｉｊｅｖｉｃ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８，１８１５７−１８１６６（１９９３）］。
上述したように、肥満や糖尿病等の発症を予防、改善するためには、脂肪細胞に特異的なＣＲＥＢおよびＩＲＳ−１のモジュレーターの役割が重要である。
本発明は、上述したような脂肪細胞に特異的なＣＲＥＢのモジュレーターとしての活性を有すると共にＩＲＳ−１に対してモジュレーターとしての活性を有するペプチド等を提供することを目的とする。
上述した、ＳＩＫにはアイソフォームが存在することが判明し、従来のＳＩＫをＳＩＫ１とし、新たに見出されたＳＩＫはＳＩＫ２と命名された。これらのＳＩＫの分析の結果、ＳＩＫ１は主に副腎や卵巣に主に発現しており、ＳＩＫ２は主に脂肪細胞に発現していることが明らかになったため、ＳＩＫ２が脂肪細胞の分化成熟を制御している可能性について研究を進めると共に、マウスＳＩＫ２の完全長ｃＤＮＡ配列が明らかにされている。
さらに、ＳＩＫ２の生理機能の解析を行った結果、ＳＩＫ２はＣＲＥＢの活性化をＣＲＥＢのロイシンジッパー部分（ｂＺＩＰ）を介して制御することが明らかになった。また、本発明者らは、ＳＩＫ２は３つのドメイン部分を有することを見出し、それらはキナーゼ活性を有するキナーゼドメイン（ドメイン１）、タンパクの安定化の役割を果たしている安定化ドメイン（ドメイン２）およびキナーゼ活性を制御している制御ドメイン（ドメイン３）であり、ドメイン２がリン酸化制御を受け、リン酸化により転写抑制活性を失うことを明らかにした。すなわち、ドメイン２はタンパク質の安定化だけを司っているのではないことが明らかになった。
さらに、ドメイン３は転写抑制に特に重要な役割を有しており、ＳＩＫ２のＣＲＥＢの活性化機能を制御していること、特にドメイン３がリン酸化されると、ＳＩＫ１およびＳＩＫ２のＣＲＥＢの抑制活性が低下する。この効果は脂肪細胞においてはＳＩＫ２では顕著であるがＳＩＫ１はそれほど顕著ではない。また、ドメイン３は、ＳＩＫ１においてはＳＩＫ１タンパクを核内へ移行する機能および核外へ排出する機能を有するのに対して、ＳＩＫ２においてはＳＩＫ２タンパクを核外へ排出する機能のみ有する。ドメイン３がリン酸化された状態でＳＩＫ１とＳＩＫ２の酵素活性が消失した場合、ＳＩＫ１およびＳＩＫ２はＣＲＥＢを活性化する。しかし、ＳＩＫ１のドメイン３が核内移行にも働くことから、低ｃＡＭＰ刺激状態ではＳＩＫ１はＣＲＥＢを活性化できない。これは、ＳＩＫ１とＳＩＫ２のドメイン３の機能の違い、すなわち細胞内局在によるものであり、核内型ＳＩＫは如何なる条件でもＣＲＥＢを活性化することができないのに対し、細胞質型ＳＩＫは上述の条件下でＣＲＥＢを活性化することができること、ＳＩＫ２が脂肪細胞で多量に発現されること、ＳＩＫ２およびＳＩＫ１はヒトＩＲＳ−１のセリン（７９４）をリン酸化すること、褐色脂肪細胞ではＳＩＫ２の活性および量が減少していること、および糖尿病動物の白色脂肪細胞において、その活性および量が上昇していることを本発明者らは見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の（Ａ）〜（Ｌ）のいずれか１のポリペプチドと少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその塩を提供するものである。
（Ａ）配列番号：２で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号：１で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリペプチド；
（Ｂ）配列番号：２で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号：１で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド；
（Ｃ）配列番号：４で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号：３で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリペプチド；
（Ｄ）配列番号：４で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号：３で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド；
（Ｅ）配列番号：６で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号：５で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリペプチド
（Ｆ）配列番号：６で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号：５で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド；
（Ｇ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号：７で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリペプチド；
（Ｈ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号：７で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド；
（Ｉ）配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号：９で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリペプチド；
（Ｊ）配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号：９で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド；
（Ｋ）配列番号：１２で表されるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号：１１で表される塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリペプチド；
（Ｌ）配列番号：１２で表されるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号：１１で表される塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド。
また、本発明は、以下の（ａ）〜（ｍ）のいずれか１のポリヌクレオチドと少なくとも９５％以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドを提供するものである。
（ａ）配列番号：１で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：１で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：３で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：５で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：５で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：７で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：７で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号：９で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：９で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号：１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号：６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号：１２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｍ）（ａ）〜（ｌ）のいずれか１のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチド。
また、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含有する組換ベクターおよび発現ベクターを提供するものである。
また、本発明は、上記発現ベクターを保持する宿主細胞を提供するものである。
また、本発明は、上記宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、得られた培養物からポリペプチドを回収することを含む、上記ポリペプチドまたはその塩の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、上記核酸、または上記ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの検出に有用な核酸プローブを提供するものである。
また、本発明は、上記ポリペプチドに対して親和性を有する抗体、または該抗体のフラグメント、並びに上記ポリペプチドに対して親和性を有する抗体を産生するハイブリドーマを提供するものである。
また、本発明は、上記ポリペプチド、または本発明の組換ベクターを含有する医薬組成物を提供するものである。
また、本発明は、上記抗体、該抗体のフラグメント、または上記ポリヌクレオチドに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチドを含有する医薬組成物を提供するものである。
また、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含有する遺伝子診断用組成物を提供するものである。
また、本発明は、上記医薬組成物を投与することを含む、疾患または生理状態の予防または改善方法を提供するものである。
また、本発明は、上記ポリペプチドを含有する検体を試験化合物と接触させ、上記ポリペプチドの活性を促進または阻害する活性を検出する工程を含むことを１特徴とする、上記ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法を提供するものである。
また、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、およびｃＡＭＰ応答配列の制御下にあるレポーター遺伝子を含む発現ベクターを試験化合物と接触させ、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する活性を検出する工程を含むことを特徴とする、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法を提供するものである。
また、本発明は、上記スクリーニング方法によって同定された、上記ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物を含有する医薬組成物を提供するものである。
また、本発明は、塩誘導性キナーゼ２の発現が亢進することによって生じる疾患または生理状態の予防または改善方法であって、上記医薬組成物を投与することを含むことを特徴とする、疾患または生理状態の予防または改善方法を提供するものである。
また、本発明は、塩誘導性キナーゼ２の発現が低下することによって生じる疾患または生理状態の予防または改善方法であって、上記医薬組成物を投与することを含むことを特徴とする、疾患または生理状態の予防または改善方法を提供するものである。
また、本発明は、上記ポリペプチドを試験化合物と接触させ、該試験化合物と該ポリペプチドとの結合を検出し、上記ポリペプチドに対して特異的に結合する化合物を同定する工程を含むことを特徴とする、上記ポリペプチドに特異的に結合する化合物のスクリーニング方法を提供するものである。
また、本発明は、上記ポリペプチドが活性を示す条件下で該ポリペプチドと試験化合物とを接触させ、該試験化合物の存在下における該ポリペプチドの活性を評価し、該試験化合物の非存在下における該ポリペプチドの活性と比較し、その比較結果により上記試験化合物の上記ポリペプチドの活性調節能を同定する工程を含むことを特徴とする、上記ポリペプチドに対する活性調節能を有する化合物のスクリーニング方法を提供するものである。
また、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド検体を該標的ポリヌクレオチドの発現に適した条件下で試験化合物と接触させ、上記標的ヌクレオチドの発現の変化を検出し、上記試験化合物の非存在下および種々の量の存在下における上記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する工程を含むことを特徴とする、上記ポリヌクレオチドの発現に影響を与える化合物のスクリーニング方法を提供するものである。
また、本発明は、試験化合物の存在下、自己リン酸化能を有するタンパク質をリン酸化させるリン酸化工程、リン酸化された状態のリン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体と、上記タンパク質とを結合させる抗体結合工程、および上記タンパク質と上記抗体との反応を検出する測定工程を含むことを特徴とする、自己リン酸化能を有するタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法を提供するものである。
また、本発明は、自己リン酸化能を有するタンパク質を産生する能力を有する細胞を、上記タンパク質の発現に適した条件で培養する工程、該細胞を、試験化合物の存在下、リン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体と接触させる抗体結合工程、および上記タンパク質と上記抗体との反応を検出する測定工程を含むことを特徴とする、上記タンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法を提供するものである。
また、本発明は、試験化合物の存在下、塩誘導性キナーゼと、塩誘導性キナーゼによってリン酸化される基質とを接触させて該基質をリン酸化させるリン酸化工程、リン酸化された状態の基質を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の基質を認識する抗体と、上記リン酸化された基質とを反応させる抗体結合工程、および上記基質と上記抗体との反応を検出する測定工程とを含むことを特徴とする、塩誘導性キナーゼの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法を提供するものである。
また、本発明は、上記ポリペプチドを含有することを特徴とする、上記ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用キットを提供するものである。
また、本発明は、自己リン酸化能を有するタンパク質と、リン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体とを含有することを特徴とする、自己リン酸化能を有するタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用キットを提供するものである。
図１は、ラットＳＩＫ１とマウスＳＩＫ２蛋白のアミノ酸配列を示す。
図２は、各組織におけるＳＩＫ１およびＳＩＫ２のｍＲＮＡの存在を調べた結果である。
図３は、ラットＳＩＫ１およびマウスＳＩＫ２のタンパク質リン酸化活性を比較した結果である。
図４は、ラットＳＩＫ１およびマウスＳＩＫ２のＣＲＥ抑制活性を比較した結果である。
図５は、スタウロスポリンによるマウスＳＩＫ２のタンパク質リン酸化活性の阻害を示す結果である。
図６は、抗体の検出を行った結果である。
図７は、抗体とペプチドとの反応性を示す結果である。
図８は、ＳＩＫの阻害剤の検討結果を示す図である。
図９は、ＣＲＥ抑制活性を比較した結果である。
図１０は、３Ｔ３−Ｌ１細胞内における、ラットＳＩＫ１およびマウスＳＩＫ２の細胞内分布を示す結果である
図１１は、脂肪細胞分化の過程において誘導される、各種脂肪細胞分化マーカーおよびＳＩＫ１、ＳＩＫ２のｍＲＮＡの定量を行った結果を示す図である。
図１２は、ＳＩＫ２のＧＳＴ−ヒトＩＲＳ１、ＧＳＴ−ヒトＩＲＳ１（Ｓ７９４Ａ）に対するタンパク質リン化酸活性を比較した結果である。
図１３は、各種細胞におけるＳＩＫ２ ｍＲＮＡおよびＳＩＫ２タンパク質の量、およびＳＩＫの活性を調べた結果である。
図１４は、ＳＩＫの自己リン酸化部位を調べた結果である。
図１５は、二重リン酸化を認識する抗体と、リン酸化されたＳＩＫとの反応を示す結果である。
図１６は、各種抗体とＳＩＫとを、ＳＩＫ阻害剤の存在下で反応させた結果である。
以下、本発明について詳細に説明する。
まず、本発明のポリペプチドについて説明する。
本発明のポリペプチドは、以下の（Ａ）〜（Ｌ）のいずれか１のポリペプチドと少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその塩である。
（Ａ）配列番号：２で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号：１で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリペプチド；
（Ｂ）配列番号：２で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号：１で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド；
（Ｃ）配列番号：４で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号：３で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリペプチド；
（Ｄ）配列番号：４で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号：３で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド；
（Ｅ）配列番号：６で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号：５で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリペプチド
（Ｆ）配列番号：６で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号：５で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド；
（Ｇ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号：７で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリペプチド；
（Ｈ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号：７で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド；
（Ｉ）配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号：９で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリペプチド；
（Ｊ）配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号：９で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド；
（Ｋ）配列番号：１２で表されるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号：１１で表される塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリペプチド；
（Ｌ）配列番号：１２で表されるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号：１１で表される塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド。
本明細書において、「実質的に同一」とは、ポリペプチドの活性が実質的に同一であることを意味する。一部のアミノ酸が欠失、置換または付加された場合、その欠失、置換または付加がなされたポリペプチドは、欠失、置換または付加がなされていないものと活性が同一であれば、実質的に同一である。一般的に、相同性の程度が、全体の９０％、好ましくは９５％であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであれば、実質的に同一であると解釈される。一般には、アミノ酸配列中の一部（好ましくは１〜２０個、更に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは数個）のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなるポリペプチドは実質的に同一である。
以下、本発明のポリペプチドについて説明する。
本発明のポリペプチドは、上記（Ａ）〜（Ｌ）のいずれか１のポリペプチドと少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその塩である。
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドとは、マウス由来の塩誘導性キナーゼ２（ＳＩＫ２）のＮ末端のメチオニンからＣ末端のスレオニンまでの９３１個のアミノ酸からなるペプチド配列である。このポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドとの相同性の程度が、全体の約９０％、好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであれば、実質的に同一であると解釈される。従って、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列中の一部（好ましくは１〜２０個、更に好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数個）のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドも実質的に同一である。このようなポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡが用いられる。
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ＳＩＫ２のタンパク質リン酸化活性を担うとともに、脂肪細胞を含む一般的な培養細胞内で発現させた場合にはｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）制御下にある遺伝子の転写調節活性を有する。すなわち、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ＳＩＫ２のタンパク質リン酸化活性を担うとともに、脂肪細胞を含む一般的な培養細胞内で発現させた場合にはｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）制御下にある遺伝子の転写を抑制する活性を有する。
配列番号：４で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドとは、配列番号：２で表わされるポリペプチドである、マウス由来の塩誘導性キナーゼ２（ＳＩＫ２）の５７７番目のプロリンから６２３番目のグルタミンまでの４７アミノ酸からなる制御ドメイン部分（ドメイン３部分）である、ペプチド配列である。このポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドとの相同性の程度が、全体の約９０％、好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであれば、実質的に同一であると解釈される。従って、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列中の一部（好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドも実質的に同一である。このようなポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡが用いられる。
配列番号：４で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ＳＩＫ２のタンパク質リン酸化活性を制御しているとともに、脂肪細胞を含む一般的な培養細胞内で発現させた場合にはリン酸化を受けることによってｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）制御下にある遺伝子の転写調節活性を有する。すなわち、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ＳＩＫ２のタンパク質リン酸化活性を制御するとともに、脂肪細胞を含む一般的な培養細胞内で発現させた場合にはリン酸化を受けることによってｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）制御下にある遺伝子の転写活性のモジュレータとしての機能を有する。
配列番号：６で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドとは、配列番号：２で表わされるポリペプチドである、マウス由来の塩誘導性キナーゼ２（ＳＩＫ２）の２０番目のチロシンから２７１番目のメチオニンまでの２５２アミノ酸からなる、キナーゼ活性を有するドメイン部分（ドメイン１部分）である、ペプチド配列である。このポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、配列番号：６で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドとの相同性の程度が、全体の約９０％、好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであれば、実質的に同一であると解釈される。従って、配列番号：６で表わされるアミノ酸配列中の一部（好ましくは１〜２０個、更に好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数個）のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドも実質的に同一である。このようなポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：５で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡが用いられる。
配列番号：６で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ＳＩＫ２のタンパク質リン酸化活性を担うとともに、脂肪細胞を含む一般的な培養細胞内で発現させた場合にはｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）制御下にある遺伝子の転写調節活性を有する。すなわち、配列番号：６で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ＳＩＫ２のタンパク質リン酸化活性を担うとともに、脂肪細胞を含む一般的な培養細胞内で発現させた場合にはｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）制御下にある遺伝子の転写を抑制する活性を有する。さらに、配列番号：６で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、そのリン酸化活性を失うと、ＣＲＥ制御下にある遺伝子の転写を亢進する。
配列番号：８で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドとは、配列番号：２で表わされるポリペプチドである、マウス由来の塩誘導性キナーゼ２（ＳＩＫ２）の２９３番目のイソロイシンから３４５番目のプロリンまでの５３アミノ酸からなる安定化ドメイン部分（ドメイン２部分）であるペプチド配列である。このポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドとは配列番号：８で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドとの相同性の程度が、全体の約９０％、好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであれば、実質的に同一であると解釈される。従って、配列番号：８で表わされるアミノ酸配列中の一部（好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドも実質的に同一である。このようなポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：７で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡが用いられる。配列番号：８で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、タンパク質の安定化を担うとともに、脂肪細胞を含む一般的な培養細胞内で発現させた場合にはリン酸化を受けることによってｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）制御下にある遺伝子の転写を調節する活性を有する。すなわち、配列番号：８で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、タンパク質の安定化を担うとともに、脂肪細胞を含む一般的な培養細胞内で発現させた場合には、リン酸化を受けることによって、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）制御下にある遺伝子の転写活性のモジュレータとしての機能を有する。
配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドとは、配列番号：２で表わされるポリペプチドである、マウス由来の塩誘導性キナーゼ２（ＳＩＫ２）の５７７番目のプロリンから５９４番目のグリシンまでの１８アミノ酸からなる制御ドメイン部分（ドメイン３ａ部分）であるペプチド配列である。このポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドとは配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドとの相同性の程度が、全体の約９０％、好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであれば、実質的に同一であると解釈される。従って、配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列中の一部（好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドも実質的に同一である。このようなポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：９で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡが用いられる。配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ＳＩＫ２タンパク質の核外への排出に関与しているとともに、脂肪細胞を含む一般的な培養細胞内で発現させた場合には、リン酸化を受けることによってｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）制御下にある遺伝子の転写を調節する活性を有する。すなわち、配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ＳＩＫタンパク質の核外への排出に関与しているとともに、脂肪細胞を含む一般的な培養細胞内で発現させた場合には、リン酸化を受けることによって、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）制御下にある遺伝子の転写活性のモジュレータとしての機能を有する。
配列番号：１２で表されるアミノ酸配列よりなるポリペプチドとは、配列番号：２で表されるポリペプチドである、マウス由来の塩誘導性キナーゼ２（ＳＩＫ２）の５９５番目のイソロイシンから６２３番目のグルタミンまでの２９アミノ酸からなる制御ドメイン部分（ドメイン３ｂ部分）を含むペプチド配列を意味する。このポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列よりなるポリペプチドとは配列番号：１２で表されるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと相同性の程度が、全体の約９０％、好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであれば、実質的に同一であると解釈される。従って、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列中の一部（好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドも実質的に同一である。このようなポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１で表される塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡが用いられる。配列番号：１２で表されるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ＳＩＫ２タンパク質の細胞質局在に関与している。
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２で表わされるポリペプチドは、マウスおよび他の温血動物（例えば、ヒト、ラット、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、サル等）の脂肪細胞に特異的に発現しているポリペプチドである。従って、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０または配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列、特に配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、マウス組織もしくは細胞から採取されるＳＩＫ２タンパク質に由来するもの、またはマウス以外の温血動物の組織もしくは細胞から採取されるＳＩＫ２ホモログ、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に基づいて遺伝子工学的に作製されるポリペプチド、あるいは該アミノ酸配列に基づいて化学的に合成されるポリペプチドであってもよい。
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０又は配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドとしては、ＣＲＥ制御下にある遺伝子の転写を制御する活性を有するポリペプチドであって、具体的には、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０又は配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列と約９０％以上、好ましくは約９５％以上の相同性を有するポリペプチドである。これら実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０又は配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列において、１もしくは２以上のアミノ酸が欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列、１もしくは２以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、リン酸、糖鎮や脂肪酸等で修飾されたアミノ酸配列、またはそれらが組み合わされたアミノ酸配列を含有するポリペプチドが含まれる。また、タンパク質の発現の際に使用される融合タンパク質、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ヒスチジンヘキサマー等が結合したＳＩＫ２も実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドに含まれる。
本発明のポリペプチドは、左端がＮ末端（アミノ基末端）、右端がＣ末端（カルボキシル基末端）であり、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）、またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであっても良い。また、上記エステルにおけるＲとしては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル等の炭素数が１〜６個のアルキル基、シクロペンチル、シクロヘキシル等の炭素数が３〜８個のシクロアルキル基やアリール基、アラルキル基等が挙げられる。さらに、本発明のポリペプチドには、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保襞されているもの、あるいは糖鎖が結合した糖タンパク質等の複合タンパク質等も含まれる。
本発明のポリペプチドの塩としては、生理学的に許容される無機酸および有機酸、アルカリ金属塩等の塩基等との塩が用いられ、生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。無機酸としては、例えば塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸、有機酸としては、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等が挙げられる。
本発明のポリペプチドまたはその塩は、前述した温血動物の細胞または組織をホモジナイズした後、酸等で抽出を行い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わせことによる公知のタンパク質の精製方法によってＳＩＫ２タンパク質を単離精製し、必要に応じてペプチダーゼ等を用いて配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０または配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列に相当する部分を含むポリペプチドを調製することにより製造することができる。また、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を逆転写ポリメレース チェイン リアクション法（ＲＴ−ＰＣＲ法）等を用いて調製し、これを適当な発現ベクターに挿入して宿主細胞に導入し、得られた形質転換体を培養することによっても製造することができる。すなわち、組換えタンパク質であってもよい。上記宿主細胞の培養は、脂肪分化誘導作用を有する物質の存在下で行ってもよい。上記宿主細胞の培養を脂肪分化誘導作用を有する物質の存在下で行うことにより、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡが誘導され、本発明のポリペプチドの産生が促進されるので好ましい。
また、前駆脂肪細胞を、脂肪分化誘導作用を有する物質の存在下で培養し、得られた培養物から、本発明のポリペプチドまたはその塩を製造することができる。この場合も、脂肪分化誘導作用を有する物質によって、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡが誘導され、本発明のポリペプチドの産生が促進される。なお、脂肪分化誘導作用を有する物質としては、例えばデキサメタゾン、インスリン、ｃＡＭＰ、チアゾリジン誘導体等が挙げられる。
また、市販のタンパク質合成樹脂を用いて化学合成することによっても製造することができる。
配列番号：４で表わされるドメイン３に相当するポリペプチドまたはその塩は、従来より公知のペプチドの合成方法に従って製造することができる。また、配列番号：２で表わされるポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
また、配列番号：６で表わされるドメイン１に相当するポリペプチドまたはその塩は、従来より公知のペプチドの合成方法に従って製造することができる。また、配列番号：２で表わされるポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
配列番号：８で表わされるドメイン２に相当するポリペプチドまたはその塩は、従来公知のペプチドの合成方法に従って製造することができる。また、配列番号：２で表わされるポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
配列番号：１０で表わされるドメイン３ａに相当するポリペプチドまたはその塩は、従来より公知のペプチドの合成方法に従って製造することができる。また、配列番号：２または配列番号：４で表わされるポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
配列番号：１２で表されるドメイン３ｂに相当するポリペプチドまたはその塩は、従来公知のペプチドの合成方法に従って製造することができる。また、配列番号：２または配列番号：４で表されるポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
得られたポリペプチドが遊離体である場合には、公知の方法によって適当な塩に変換することができる。また塩として得られた場合には、公知の方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、上述した本発明のポリペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、前述した細胞または組織由来のｍＲＮＡまたはそれから逆転写酵素によって調製されたｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドであってもよい。
次に、本発明のポリヌクレオチドについて説明する。
本発明のポリヌクレオチドは、以下の（ａ）〜（ｍ）のいずれか１のポリヌクレオチドと少なくとも９５％以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
（ａ）配列番号：１で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：１で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：３で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：５で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：５で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：７で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：７で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号：９で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：９で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号：１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号：６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号：１２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｍ）（ａ）〜（ｌ）のいずれか１のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチド。
本発明のポリヌクレオチドは、上述した本発明のポリペプチドをコードするポリペプチドである。具体的には、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９又は配列番号：１１で表わされるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチドを含む。
また、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０又は配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチドを含む。
また、本発明のポリヌクレオチドは、上記のポリヌクレオチドのいずれか１とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを含む。
上述の配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０又は配列番号１２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、脂肪細胞を含む一般的な培養細胞内で発現させた場合にはｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）制御下にある遺伝子の転写を制御する活性を有するポリペプチドである。
本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９又は配列番号：１１で表わされる塩基配列と約９５％以上、好ましくは９７％以上の同一性を有する塩基配列を含有するポリヌクレオチドがハイブリダイズし得る条件である。このような条件としては、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜２０ｍＭの濃度で、かつ温度が約６０〜６５℃の温度である条件が好ましく、ナトリウム濃度が約１９ｍＭの濃度で、かつ温度が約６５℃の温度である条件が更に好ましい。ハイブリダイゼーションは、公知の方法に従って行なうことができる。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのクローニングの手段としては、ヒトまたは他の温血動物由来のＳＩＫ２遺伝子の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだポリヌクレオチドを本発明のポリペプチドの一部または全領域をコードするヌクレオチド断片もしくは合成ヌクレオチドを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。
ＤＮＡの塩基配列を変換し、部分的に変異が導入されたポリペプチドを製造することができる。ＤＮＡの塩基配列の変換は、市販のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ ＥｘｐｒｅｓｓＫｍ（宝酒造）、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造）等を用いて行うことができる。
クローン化された本発明のポリヌクレオチドは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加して使用することができる。該ポリヌクレオチドはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧ、また３’末端側に翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらのコドンは、適当な合成アダプターを用いて付加することもできる。
本発明のポリヌクレオチドは、例えばヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の温血動物におけるＳＩＫ２をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ（本発明のポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド）の異常（遺伝子異常）を検出するためのプローブとして用いることができる。
次に、本発明の組換ベクター、発現ベクターについて説明する。
本発明のポリペプチドの発現ベクターとしては、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから目的とするポリヌクレオチド断片を切り出し、該ポリヌクレオチド断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって製造することができる。ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８またはｐＵＣ１１８等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５またはｐＣ１９４）、酵母由来のプラスミド（例えばｐＳＨ１９またはｐＳＨ１５）、λファージ等のバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルス等のウイルス等の動物ウイルスの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等が用いられる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター等が、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ＸＹＬプロモーター、ＨＷＰプロモーター、ＣＷＰプロモーター等が好ましく、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等が好ましく、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター等が好ましく用いられる。また、昆虫細胞を宿主として用いる場合はポリヘドリンプロモーター、ＯｐｌＥ２プロモーター等が用いられる。
発現ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｇｄｉと略称する場合がある）等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされた蛋白質を他の蛋白質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼおよびプロテインＡ）との融合蛋白質として発現させることも可能である。このような融合蛋白質は、部位特異的プロテアーゼを使用して切断し、それぞれの蛋白質に分離することができる。
上記選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞等が用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）），ＪＭ１０３（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）），ＪＡ２２１（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）），ＨＢ１０１（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９））、Ｃ６００（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９巻，４４０（１９５４）、ＤＨ５αおよびＪＭ１０９等が用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４（Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）），２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕およびバチルス・ブレビス等が用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｍ７１およびハンセヌラ・ポリモーファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）等が用いられる。昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ ａｃｒｅａ由来の細胞等が用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ細胞；ＢｍＮ細胞）等が用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ Ｖｉｖｏ），１３，２１３−２１７，（１９７７））等が用いられる。昆虫としては、例えば、カイコの幼虫等が用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）〕。哺乳動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞等が用いられる。
また、必要に応じて、宿主細胞に適したシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’端末側に付加してもよい。宿主細胞としてエシェリヒア属菌を用いる場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列等が用いられ、宿主細胞としてバチルス属菌を用いる場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列等が用いられ、宿主細胞として酵母を用いる場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列等が用いられ、宿主細胞として動物細胞を用いる場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列等のシグナル配列が用いられる。このようにして構築された本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
上述した宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）；Ｇｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）等に記載の方法に従って行なうことができる。バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）等に記載の方法に従って行なうことができる。酵母を形質転換するには、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５巻，１９２９（１９７８）等に記載の方法に従って行なうことができる。昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７−５５（１９８８）等に記載の方法に従って行なうことができる。哺乳動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。このようにして、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
上述した形質転換体の培養は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が好ましく用いられ、該液体培地中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。上記炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖等が挙げられ、上記窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液等の無機または有機物質等が挙げられ、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子等を上記液体培地に添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８であることが好ましい。エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４３１−４３３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮｅＷ Ｙｏｒｋ １９７２〕等を用いることが好ましい。培地には、必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸等の薬剤を加えてもよい。宿主細胞がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃の温度で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えてもよい。宿主細胞がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃の温度で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えてもよい。宿主細胞が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｋ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１巻，５３３０（１９８４）〕があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整することが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃の温度で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えてもよい。
宿主細胞が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたもの等が好ましく用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整することが好ましい。培養は通常約２７℃の温度で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えてもよい。宿主が哺乳動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３巻，１（１９５０）〕等が用いられる。培地のｐＨは約６〜８に調整することが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃の温度で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えてもよい。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のポリペプチドを生成することができる。上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、当該技術分野で公知の方法で菌体または細胞を集め、この菌体または細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム処理および／または凍結融解等によって菌体または細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る方法等が適宜用いられる。緩衝液には尿素や塩酸グアニジン等の蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭ等の界面活性剤を含有させてもよい。培養液中に本発明のポリペプチドが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体または細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、または抽出液中に含まれる本発明のポリペプチドの精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法等の溶解度を利用して分離・精製を行う方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の主として分子量の差を利用して分離・精製を行う方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電の差を利用して分離・精製を行う方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用して分離・精製を行う方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用して分離・精製を行う方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用して分離・精製を行う方法等が用いられる。
上述のようにして得られる本発明のポリペプチドが遊離体で得られる場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。なお、形質転換体が産生するポリペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼ等が用いられる。かくして生成する本発明のポリペプチドの存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティング等により測定することができる。本発明のポリペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明のポリペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明のポリペプチドまたはその塩（以下、本発明のポリペプチドと略記することもある）に対する抗体は、本発明のポリペプチドを抗原として用い、自体公知の抗体、または抗血清の製造法に従って製造することができる。抗原として用いられる本発明のポリペプチドとしては、上記の本発明のポリペプチドまたはその塩であればいずれのものを用いてもよい。
次に、本発明の抗体、または該抗体のフラグメント、上記抗体を産生するハイブリドーマについて説明する。
本発明の抗体、または該抗体のフラグメントは、上述した本発明のポリペプチドに対して親和性を有するものであり、上述した本発明のポリペプチドに対して親和性を有するものであれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。該抗体は、本発明のポリペプチドまたはその塩を抗原として用い、従来公知の抗体または抗血清の製造方法に従って製造することができる。また、上記抗体を産生するハイブリドーマは、従来公知の方法に従って製造することができる。以下、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の作製方法について、以下に説明する。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のポリペプチドは、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６逓毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、標識化させたポリペプチドと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５（１９７５）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウイルス等が挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１等の温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素等で標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素等で標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法等が挙げられる。モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））等を用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、前記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧ等の活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原であるポリペプチド自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、前記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のポリペプチドに対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。ポリクローナル抗体は、前記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水等、好ましくは血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、前記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、前記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
本発明のポリペプチドに対して親和性を有する抗体は、被検液中の本発明のポリペプチド（例えば、生体試料中のＳＩＫ２蛋白質）のイムノアッセイによる定性、定量や組織染色等に使用することができる。さらに、本発明の抗体はＳＩＫ２の発現量や細胞内局在から判断されるＣＲＥ抑制活性の検討に利用できる。特にＳＩＫ１とＳＩＫ２を区別することのできる抗体は、ＳＩＫ１およびＳＩＫ２の発現量や活性等を個別に検討するために用いることができる。また、ＳＩＫ１およびＳＩＫ２の活性を特異的に中和、制御することも可能である。
さらに、ＳＩＫ１および／またはＳＩＫ２の翻訳後修飾、例えばリン酸化等、を特異的に認識する抗体は、抗体を用いる治療に応用することができる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドの定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（すなわち、本発明のポリペプチド）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出する。このような検出手段としては、例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられる。標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質等が用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕等が用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きいものが好ましく用いられる。このような酵素としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が挙げられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等が挙げられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等が挙げられる。さらに、抗体または抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いてもよい。抗原または抗体の不溶化に際しては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロース等の不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、ガラス、磁気粒子等が用いられる。
また、本発明の抗体を用いることによって、本発明のポリペプチドを感度良く定量することができる。さらには、本発明の抗体を用いて生体試料中のＳＩＫ２の濃度を定量することによって、ＳＩＫ２の濃度の増加が検出された場合、例えば、脂肪細胞の分化抑制もしくは脂肪細胞の代謝機能不全が関与する疾患（例えば、糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化、高尿酸血症、循環器疾患等）等の疾病に罹患しているか、または将来上記疾患に罹患する可能性が高いと診断することができる。ＳＩＫ２の濃度が減少した場合は、ＣＲＥの過剰な活性化が持続し、細胞の異常増殖やそれに伴う癌の危険度の予測に利用可能である。
また、本発明の抗体は、脂肪細胞・組織等に存在するＳＩＫ２または本発明の組換えポリペプチドを分離精製するための抗体カラムの作製、精製時の各分画中のＳＩＫ２または組換えポリペプチドの検出に使用することができる。さらに、本発明の抗体は、被検細胞内におけるＳＩＫ２もしくは本発明のポリペプチドの挙動の分析等のために使用することができる。
次に、本発明の医薬組成物について説明する。
本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチド、または本発明の組換ベクターを含有する。
また、本発明の医薬組成物は、本発明の抗体またはそのフラグメント、または本発明のポリヌクレオチドに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチドを含有する。
本発明のポリペプチド、または本発明の組換ベクターを含有する医薬組成物（本発明の第１の実施の形態にかかる医薬組成物）について説明する。
ＳＩＫ２は、脂肪細胞におけるＣＲＥの制御下にある遺伝子の転写を調節することにより、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化や脂肪細胞における糖代謝および脂質代謝機能を調節している。従って、本発明のポリペプチドは、脂肪細胞の分化亢進、代謝機能亢進が関与する種々の疾患の予防・改善剤として使用することができる。例えば、生体内においてＳＩＫ２が減少または欠損しているために、脂肪細胞の分化抑制および代謝機能の調節が十分に、あるいは正常に発揮されない患者に対して、（イ）本発明のポリヌクレオチドを標的細胞内で機能し得るプロモーターの制御下においた発現ベクターを該患者に投与して生体内で本発明のポリペプチドを発現させることによって、（ロ）取り出した細胞に本発明のポリヌクレオチドを上記と同様に導入し、本発明のポリペプチドを発現させた後に、該細胞を患者に移植することによって、または（ハ）本発明のポリペプチドを該患者に投与すること等によって、該患者におけるＳＩＫ２の役割を補完することができる。本発明のポリヌクレオチドを上記の予防・改善剤として使用する場合は、該ポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター等の適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って投与することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤等の生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテル等のカテーテルによって投与できる。本発明のポリペプチドを上記の予防・改善剤として使用する場合は、好ましくは９０％、更に好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上に精製されたポリペプチドを使用することが好ましい。本発明のポリペプチドは、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等として経口的に、あるいはエアロゾル化して吸入剤の形で、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤等の注射剤の形で非経口的に使用できる。
例えば、本発明のポリペプチドを生理学的に許容し得る担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定化剤、結合剤等とともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。錠剤、カプセル剤等に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の膨化剤、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリン等の甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリー等の香味剤等が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂等の液状担体を含有することができる。注射剤は、本発明のポリペプチドを通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール等）、酸化防止剤等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
本発明のポリヌクレオチドが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、温血動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等）に対して投与することができる。本発明のポリペプチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、抗肥満薬として本発明のポリペプチドを経口投与する場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき該ポリペプチドを好ましくは約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、更に好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、最も好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該ポリペプチドの１回投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、抗肥満薬として本発明のポリペプチドを注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該ポリペプチドを好ましくは約０．０１〜３０ｍｇ程度、更に好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、最も好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
上記医薬組成物は、脂肪分化誘導作用を有する物質を含有していてもよい。該脂肪分化誘導作用を有する物質としては、例えばデキサメタゾン、インスリン、ｃＡＭＰ、チアゾリジン誘導体等が挙げられる。脂肪分化誘導作用を有する物質は、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を促進するため、ＳＩＫ２の産生を促進するものと考えられる。
次に、本発明のポリヌクレオチドに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチドを含有する医薬組成物（本発明の第２の実施の形態にかかる医薬組成物）について説明する。
本発明のポリヌクレオチドに相補的に結合し、該ポリヌクレオチドの発現を抑制することができるアンチセンスヌクレオチドは、生体内における本発明のポリヌクレオチドの産生を抑制することができるので、ＳＩＫ２の発現を抑制し、ＳＩＫ２の発現過多が関与する疾患（例えば糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化、高尿酸血症、循環器疾患等）の予防・治療剤として使用することができる。アンチセンスヌクレオチドを予防・治療剤として使用する場合、上述した本発明のポリヌクレオチドを含有する各種の予防・治療剤と同様にして実施することができる。例えば、該アンチセンスヌクレオチドを用いる場合、該アンチセンスヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター等の適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。該アンチセンスヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤等の生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテル等のカテーテルによって投与できる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に投与することもできる。該アンチセンスヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、本発明のアンチセンスヌクレオチドを吸入剤として気管内に局所投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ）においては、一日につき該アンチセンスヌクレオチドを約０．１〜１００ｍｇ投与する。
なお、本発明のポリヌクレオチドに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチドとしては、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有し、該ポリヌクレオチドの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスヌクレオチドであってもよいが、アンチセンスＤＮＡが好ましい。本発明のポリヌクレオチドに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のポリヌクレオチドに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のポリヌクレオチドの相補鎖）の全塩基配列と好ましくは約７０％以上、更に好ましくは約８０％以上、更に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列が挙げられる。
さらに、該アンチセンスヌクレオチドは、組織や細胞における本発明のポリヌクレオチドの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
次に、本発明の抗体、または該抗体のフラグメントを含有する医薬組成物（本発明の第３の実施の形態にかかる医薬組成物）について説明する。
ＳＩＫ２の活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、ＳＩＫ２の発現過多が関与する疾患（例えば、糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化、高尿酸血症、循環器疾患、等）に対する医薬（予防・治療剤）として使用することができる。本発明の抗体を含有する上記疾患の予防・治療剤は、そのまま液剤として、または適当な剤形の医薬組成物として、温血動物（例えば、ヒト、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルート等によっても異なるが、例えば、成人の糖尿病の治療・予防のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、好ましくは０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、更に好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、最も好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、好ましくは１日１〜５回程度、更に好ましくは１日１〜３回程度、注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。
症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、本発明の抗体と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等があげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウム等が用いられる。非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤等が例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
次に、本発明の遺伝子診断用組成物について説明する。
本発明の遺伝子診断用組成物は、本発明のポリヌクレオチドを含有する。
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、プローブとして使用することにより、温血動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等）におけるＳＩＫ２をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多等の遺伝子診断剤として有用である。本発明のポリヌクレオチドを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））等に記載の方法により実施することができる。例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより発現過多が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によりＤＮＡの突然変異が検出された場合は、例えば、脂肪細胞の分化抑制もしくは脂肪細胞の代謝機能不全が関与する疾患（例えば、糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化、高尿酸血症、循環器疾患等）等の疾病に罹患している、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
次に、本発明の疾患または生理状態の予防または改善方法について説明する。
本発明の疾患または生理状態の予防または改善方法は、塩誘導性キナーゼ２の発現が低下することによって生じる疾患または生理状態、および塩誘導性キナーゼ２の発現が亢進することによって生じる疾患または生理状態を予防または改善するものである。
塩誘導性キナーゼ２の発現が低下することによって生じる疾患または生理状態の予防または改善方法は、本発明の第１の実施の形態にかかる医薬組成物を投与することを含む。
また、塩誘導性キナーゼ２の発現が亢進することによって生じる疾患または生理状態の予防または改善方法は、本発明の第２または第３の実施の形態にかかる医薬組成物を投与することを含む。
ＳＩＫ２は、脂肪細胞におけるＣＲＥの制御下にある遺伝子の転写を調節することにより、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化や脂肪細胞における糖代謝および脂質代謝機能を調節している。従って、本発明のポリペプチドまたは本発明のポリヌクレオチドは、脂肪細胞の分化亢進、代謝機能亢進が関与する種々の疾患を予防または改善するために用いられる。例えば、生体内においてＳＩＫ２が減少あるいは欠損しているために、脂肪細胞の分化抑制および代謝機能の調節が十分に、あるいは正常に発揮されない患者に対しては、本発明の第１の実施の形態にかかる医薬組成物を用いることにより、糖代謝異常、脂質代謝異常または脳神経障害等の疾患または生理状態を予防または改善することができる。
また、本発明の第２または第３の実施の形態にかかる医薬組成物を用いることにより、ＳＩＫ２の発現が亢進することによって生じる疾患または生理状態を予防または改善することが可能である。
このような疾患または生理状態としては、糖代謝異常、脂質代謝異常または脳神経障害等が挙げられる。
次に、本発明のスクリーニング方法について説明する。
本発明の第１の実施の形態にかかるスクリーニング方法は、本発明のポリペプチドを含有する検体を試験化合物と接触させ、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する活性を検出する工程を含むことを特徴とする。本発明のスクリーニング方法によって、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニングすることができる。
本発明の第１の実施の形態にかかるスクリーニング方法は、本発明のポリペプチドを試験化合物と接触させ、該試験化合物と該ポリペプチドとの結合を検出し、上記ポリペプチドに対して特異的に結合する化合物を同定する工程を含んでいてもよい。
また、本発明の第１の実施の形態にかかるスクリーニング方法は、本発明のポリペブチドが活性を示す条件下で該ポリペプチドと試験化合物とを接触させ、上記試験化合物の存在下における該ポリペプチドの活性を評価し、上記試験化合物の非存在下における該ポリペプチドの活性と比較し、その比較結果により上記試験化合物の上記ポリペプチドの活性調節能を同定する工程を含んでいてもよい。
また、本発明の第２の実施の形態にかかるスクリーニング方法は、本発明のポリヌクレオチド、およびｃＡＭＰ応答配列の制御下にあるレポーター遺伝子を含む発現ベクターを試験化合物と接触させ、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する活性を検出する工程を含むことを特徴とする。
また、本発明の第２の実施の形態にかかるスクリーニング方法は、本発明のポリヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド検体を該標的ポリヌクレオチドの発現に適した条件下で試験化合物と接触させ、上記標的ヌクレオチドの発現の変化を検出し、上記試験化合物の非存在下および種々の量の存在下における上記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する工程を含んでいてもよい。
ＳＩＫ２は、例えば脂肪細胞におけるＣＲＥ活性を負に調節して脂肪細胞の分化および機能を制御することができる。キナーゼドメインのＣＲＥ活性調節活性はタンパク質リン酸化活性と互いに相関しているので、本発明のポリペプチドのタンパク質リン酸化活性を阻害する化合物は、同時にＣＲＥ活性調節作用（ＣＲＥ抑制効果）を阻害し、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化および／または脂肪細胞における代謝機能を促進することができ、耐糖能異常、糖尿病、肥満、高脂血症等の疾病に対する予防・改善剤として有用である。
一方、本発明のポリペプチドのタンパク質リン酸化活性を促進する化合物はＣＲＥ活性化を介した細胞生存活性を阻害し細胞死を引き起こす可能性があり、癌治療への応用が期待される。また、ＳＩＫ１およびＳＩＫ２のキナーゼドメインの一次構造が非常に類似していることから、本発明のポリペプチドの活性を阻害する化合物または促進する化合物は同時にＳＩＫ１の機能にも影響を及ぼすと期待される。また、その様な場合は各組織、臓器におけるＳＩＫ１およびＳＩＫ２の発現量の差により上記化合物が効率良く作用する組織、臓器を左右する。例えば、ＳＩＫ１は痙攣誘発時に脳の海馬で異常誘導される。この様な状態で本発明のポリペプチドの活性を阻害する化合物または促進する化合物はＳＩＫ１により特異的に作用し、細胞生存に関わるＣＲＥ活性を調節することで脳障害等の予防に役立つものと期待される。海馬に着目した場合は同様のＣＲＥ活性調節効果でアルツハイマー病等への改善効果が期待される。
したがって、本発明のポリペプチドの蛋白質リン酸化活性に及ぼす試験化合物の効果を検出することにより、ＳＩＫ２キナーゼドメインのＣＲＥ活性調節活性阻害剤もしくは促進剤をスクリーニングすることができる。あるいは、ＳＩＫ２キナーゼドメインのＣＲＥ活性調節活性阻害剤もしくは促進剤は、ＣＲＥの制御下にあるレポーター遺伝子を導入された細胞における該レポーター遺伝子の発現を指標としてもスクリーニングすることができる。
なお、ＳＩＫ１及びＳＩＫ２の各ドメインがリン酸化された場合のＣＲＥ調節活性について下記表１にまとめた。
Figure 2004018669
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本発明のスクリーニング方法には、本発明のポリペプチドが用いられる。また、本発明のスクリーニング方法は、本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞（好ましくは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された形質転換体（例、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の細胞））を用いてもよい。該形質転換体は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびＣＲＥの制御下にあるレポーター遺伝子を含むポリヌクレオチドで形質転換されたものであることが好ましい。
本発明の第３及び第４の実施の形態にかかるスクリーニング方法は、タンパク質の自己リン酸化能を指標とするスクリーニング方法である。第３の実施の形態にかかるスクリーニング方法は、試験化合物の存在下、自己リン酸化に適した条件下でタンパク質をリン酸化する工程、リン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体と上記タンパク質を反応させる抗体結合工程、および上記タンパク質と上記抗体との反応を検出する測定工程を含むことを特徴とする。
本発明の第４の実施の形態にかかるスクリーニング方法は、タンパク質を産生する能力を有する細胞を、上記タンパク質の発現に適した条件下で培養する工程、該細胞により産生されたタンパク質を試験化合物の存在下、自己リン酸化に適した条件下でリン酸化する工程、リン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体と、上記タンパク質を反応させる抗体結合工程、および上記タンパク質と上記抗体との反応を検出する測定工程を含むことを特徴とする。
また、本発明の第５の実施の形態にかかるスクリーニング方法は、試験化合物の存在下、塩誘導性キナーゼと、塩誘導性キナーゼによってリン酸化される基質とを接触させて該基質をリン酸化させるリン酸化工程、リン酸化された状態の基質を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の基質を認識する抗体と、上記基質とを反応させる抗体結合工程、および上記基質と上記抗体との反応を検出する測定工程とを含むことを特徴とする。
以下、本発明のスクリーニング方法について具体的に説明する。
本発明の第１の実施の形態にかかるスクリーニングである、リン酸化活性を指標とするスクリーニング方法について説明する。
本発明のポリペプチドを、二価カチオン存在下で試験化合物および［３２Ｐ］−ＡＴＰ［必要に応じて、さらにＳＩＫ２でリン酸化される基質蛋白質もしくはペプチド（例えば、ＧＳＴ−Ｓｙｎｔｉｄｅ２（Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２００１）１５，１２６４−１２７６）、Ｓｙｎｔｉｄｅ２、ヒストン脱アセチル化酵素、ＨＤＡＣ５、ヒストンアセチル化酵素、ｐ３００等）］と反応させ、反応液をゲル電気泳動した後、ゲル上のタンパク質の３２Ｐの取り込みをＸ線フィルムで検出することにより、タンパク質リン酸化活性（自己リン酸化活性および／または他の基質タンパク質をリン酸化する活性）を測定する。試験化合物の存在により３２Ｐの取り込みが消失するか、非存在下に比して減少していれば、用いた試験化合物はタンパク質リン酸化阻害効果、したがってＣＲＥ活性調節活性阻害効果を有すると結論できる。反対に、３２Ｐの取り込みが試験化合物の非存在下に比して増加していれば、用いた試験化合物はタンパク質リン酸化促進効果、したがってＣＲＥ活性調節活性促進効果を有すると結論できる。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−Ｘ線フィルム法以外にも、ペプチドやタンパク質をトラップできる素材（例えばＤＥ８１セルロース膜、ＰＶＤＦ膜）も利用でき、そこに結合している３２Ｐを測定してもよい。さらに、ペプチドやタンパク質にリン酸基が結合することによる総電荷の変化、分子量変化または抗原抗体反応性の変化も既に一般にタンパク質リン酸化酵素のリン酸化活性測定に利用されており、ラジオアイソトープを用いる方法以外にもＳＩＫ２キナーゼドメインのリン酸化活性の検出に利用可能である。
次に、本発明の第２の実施の形態にかかる、本発明のポリヌクレオチド、およびＣＲＥ−レポーター遺伝子を含む発現ベクターを用いたスクリーニング方法について説明する。
上記の本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびＣＲＥの制御下にあるレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等）を含む発現ベクターを、これらのベクターに適合した宿主細胞に導入する。なお、発現ベクターは当該技術分野において公知の方法により製造することができる。
上記宿主細胞としては、好ましくは３Ｔ３−Ｌ１等の前駆脂肪細胞の他、ＣＯＳ−７、ＣＯＳ−１、ＣＨＯ、Ｙ１細胞等を使用することができるが、これらに限定されるものではない。また、ＣＲＥの代わりに、同様にｃＡＭＰ依存的に遺伝子の転写を活性化するプロモーター［例えば、ＣＹＰ１１Ａ（Ｌｉｎら，上述）、ｃ／ＥＢＰ β（Ｒｅｕｓｃｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００）２０，１００８−１０２０）等］を用いることもできる。宿主細胞への遺伝子導入法も特に制限されず、例えばリポフェクション法、リン酸カルシウム法、電気パルス法、マイクロインジェクション法等が利用可能である。一定時間培養後、試験化合物の存在下でＣＲＥを活性化させるための試薬（例えば、１μＭデキサメタゾン，１ｍＭジブチリル−ｃＡＭＰおよび１μｇ／ｍＬインスリンを含有する溶液等）および試験化合物を含む環境下で数時間程度刺激した後、細胞を回収し、レポーター遺伝子の発現量をそれぞれ自体公知の手法を用いて測定する。レポーター遺伝子の発現が上昇すれば、用いた試験化合物はＳＩＫ２のＣＲＥ活性調節活性を阻害する効果を有すると結論できる。反対にレポーター遺伝子の発現が減少すれば、該化合物はＳＩＫ２のＣＲＥ活性調節活性を促進する効果を有すると結論できる。
また、ｃＡＭＰの効果を検討するために、フォルスコリン処理を施したり、ＰＫＡ発現ベクターを上記の発現ベクターと共に導入することも可能である。
上述した、本発明のスクリーニング方法における試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等があげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
次に、本発明の第３の実施の形態にかかる、スクリーニング方法について説明する。
本発明の第３の実施の形態にかかるスクリーニング方法は、試験化合物の存在下、自己リン酸化能を有するタンパク質をリン酸化させるリン酸化工程、リン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体と、上記タンパク質とを反応させる抗体結合工程、および上記タンパク質と上記抗体との反応を測定する測定工程を含むことを特徴とする。
上記自己リン酸化能を有するタンパク質としては、例えば塩誘導性キナーゼ等が挙げられる。また、本発明の第３の実施の形態にかかるスクリーニング方法においては、本発明のポリペプチドを用いることができる。以下、本発明の第３の実施の形態にかかるスクリーニング方法において用いられる自己リン酸化能を有するタンパク質を、単にタンパク質等ともいう。
本発明第３の実施の形態にかかるスクリーニング方法においては、試験化合物の存在下、タンパク質等をリン酸化させる。本発明のスクリーニング方法において用いられる試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等があげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記タンパク質等のリン酸化は、上記タンパク質のリン酸化を誘導することが可能なバッファー中で行うことができる。該バッファーとしては、例えば、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ｄＴＴ（ジチオスレイトール）、５ｍＭ ＭｎＣｌ２、５ｍＭ ＡＴＰ等が挙げられる。タンパク質等をリン酸化させる条件としては、４〜４０℃の温度で３０秒〜９０分程度放置することが好ましい。また、タンパク質等のリン酸化は、上記バッファー中に上記タンパク質等を溶解させて行ってもよいが、担体に固相化した上記タンパク質をリン酸化させてもよい。例えば、タンパク質を直接または抗体等を介して固相（例えばアガロース、デキストラン、セルロース等の不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、ガラス等）に固定化する。
また、自己リン酸化能を有するタンパク質として塩誘導性キナーゼを産生する細胞、または塩誘導性キナーゼを発現する組換えベクターを保持する宿主細胞を、本発明の宿主細胞をポリペプチド（自己リン酸化能を有するタンパク質）の発現に適した条件で培養し、得られた培養物から得られたポリペプチドを用いてもよい。この場合、塩誘導性キナーゼは、例えばデキサメタゾン等の化合物によって誘導されるので、このような化合物を細胞培養培地中に添加してもよい。
次いで、リン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識し、自己リン酸化されていない状態のタンパク質と反応しない抗体、またはリン酸化されていない状態の上記タンパク質を認識し、自己リン酸化された状態の上記タンパク質と反応しない抗体と、上記タンパク質を反応させる。反応は４〜４０℃の温度で、１〜２４時間程度放置あるいは撹拌することにより行う。上記抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。該抗体は、自己リン酸化される部位に対応する配列を有する合成ペプチドを作製し、該合成ペプチドあるいはリン酸化した該合成ペプチドを抗原として用い、従来公知の抗体の製造方法に従って製造することができる。該抗体の製造方法については、上述した本発明の抗体の製造方法と同様である。
次いで、リン酸化された上記タンパク質等と、リン酸化された状態またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体との反応を測定する。該タンパク質と抗体との結合を測定する方法としては、当業者に知られた抗原−抗体反応を利用した方法が挙げられる。例えば、該タンパク質に結合したリン酸化部位を認識する抗体（以下、一次抗体ともいう）に対する抗体（以下、二次抗体ともいう）を標識して用いる方法が挙げられる。標識は、酵素、蛍光物質、金属、色素等を用いて当業者に公知の方法によって行うことができる。
例えば、以下に説明する方法によって測定することができる。固相化されたタンパク質等に一次抗体を結合させ、洗浄した後、標識剤で標識された二次抗体を反応させ、洗浄した後、一次抗体を介して固相化された二次抗体を検出する。この標識二次抗体は、例えばα−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等の酵素で標識し、用いた酵素の酵素活性を利用して発色または比色させて検出を行う。ただし、必ずしも二次抗体を用いることは必要ではなく、一次抗体を標識することによって直接一次抗体の反応を測定することもできる。上述のようにしてタンパク質と抗体との結合物を測定し、試験化合物を存在させない場合と比較する。
抗体としてリン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体を用いた測定系では、試験化合物の存在下における抗体の結合が増加した場合、自己リン酸化活性が促進され、減少した場合には、自己リン酸化活性が阻害されたことがわかる。抗体としてリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体を用いた測定系では、試験化合物の存在における抗体の結合が増加した場合、自己リン酸化活性が阻害され、減少した場合には、自己リン酸化活性が促進されたことがわかる。
次に、本発明の第４の実施の形態にかかる、スクリーニング方法について説明する。
本発明の第４の実施の形態にかかるスクリーニング方法は、自己リン酸化能を有するタンパク質を産生する能力を有する細胞を、上記タンパク質の発現に適した条件で培養する工程、該細胞により産生されたタンパク質を試験化合物の存在下、自己リン酸化に適した条件下でリン酸化する工程、リン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体と上記タンパク質を反応させる抗体結合工程、および上記タンパク質と上記抗体との反応を検出する測定工程を含むことを特徴とする。
自己リン酸化能を有するタンパク質、リン酸化された状態またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体、タンパク質と抗体との複合体の測定方法については、第３の実施の形態にかかるスクリーニング方法と同様である。
自己リン酸化能を有するタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、前駆脂肪細胞、本発明の宿主細胞等が挙げられる。該細胞を、増殖飽和になるまで培養し、次いでタンパク質等の発現に適した条件下でタンパク質の発現を誘導する。誘導後、試験化合物を添加して更に培養した後、細胞をパラホルムアルデヒド等を含有する固定液で固定化し、上記抗体と反応させることが好ましい。
前駆脂肪細胞を使用する場合には、タンパク質の発現を誘導させる際に脂肪分化誘導作用を有する物質の存在下で培養することが好ましい。該脂肪分化誘導作用を有する物質としては、デキサメタゾン、インスリン、ｃＡＭＰ、チアゾリジン誘導体等が挙げられる。脂肪分化誘導作用を有する物質は、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を促進するため、塩誘導性キナーゼの産生を促進するので、上記細胞を培養する場合に培地に添加しておくことが好ましい。
上述のようにしてタンパク質等と抗体との反応を測定し、試験化合物を存在させない場合と比較する。
抗体としてリン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体を用いた測定系では、試験化合物の存在下における抗体の結合が増加した場合、自己リン酸化活性が促進され、減少した場合には、自己リン酸化活性が阻害されたことがわかる。抗体としてリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体を用いた測定系では、試験化合物の存在下における抗体の結合が増加した場合、自己リン酸化活性が阻害され、減少した場合には、自己リン酸化活性が促進されたことがわかる。
次に、本発明の第５の実施の形態にかかる、スクリーニング方法について説明する。
本発明の第５の実施の形態にかかるスクリーニング方法は、試験化合物の存在下、塩誘導性キナーゼと、塩誘導性キナーゼによってリン酸化される基質とを接触させて該基質をリン酸化させるリン酸化工程、リン酸化された状態の基質を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の基質を認識する抗体と、上記基質とを反応させる抗体結合工程、および上記基質と上記抗体との反応を検出する測定工程とを含むことを特徴とする。
上記スクリーニング方法において用いられる基質としては、例えばｐ３００、ＨＤＡＣ５、ＧＳＴ−Ｓｙｎｔｉｄｅ２（Ｌｉｎら，上述）、Ｓｙｎｔｉｄｅ２、ヒストン脱アセチル化酵素、ヒストンアセチル化酵素及びＩＲＳ−１等が挙げられる。このような基質がリン酸化された状態を認識する抗体、リン酸化されていない状態を認識する抗体は、常法に従って製造することができる。
また、第５の実施の形態にかかるスクリーニング方法においては、塩誘導性キナーゼを基質として用いてもよく、この場合には塩誘導性キナーゼの有する自己リン酸化活性を指標としてスクリーニングを行う。また、この場合に用いる抗体は、上述した第３の実施の形態にかかるスクリーニング方法において用いられるものと同様である。
上述のようにして基質と抗体との反応を測定し、試験化合物を存在させない場合と比較する。
抗体としてリン酸化された状態の基質を認識する抗体を用いた測定系では、試験化合物の存在下における抗体の結合が増加した場合、リン酸化活性が促進され、減少した場合には、リン酸化活性が阻害されたことがわかる。抗体としてリン酸化されていない状態の基質を認識する抗体を用いた測定系では、試験化合物の存在下における抗体の結合が増加した場合、リン酸化活性が阻害され、減少した場合には、リン酸化活性が促進されたことがわかる。
上述した、本発明のスクリーニング方法は、糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化、高尿酸血症および循環器疾患の予防・治療用化合物を探索するために用いられる。すなわち、本発明のスクリーニング方法によって同定された、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物は医薬組成物として用いられる。
すなわち、本発明のポリペプチドの活性を促進する化合物は、上述した本発明の第１の実施の形態にかかる医薬組成物と同様に用いられる。
また、本発明のポリペプチドの活性を阻害する化合物は、上述した本発明の第２および第３の実施の形態にかかる医薬組成物と同様に用いられる。すなわち、糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化、高尿酸血症および循環器疾患の予防・治療用医薬組成物として用いられる。
次に、本発明のスクリーニング用キットについて説明する。
本発明の第１の実施の形態にかかるスクリーニング用キットは、本発明のポリペプチドを含有することを特徴とし、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニングするために用いられる。
本発明の第１の実施の形態にかかるスクリーニング用キットには、本発明のポリペプチド、または他の基質をリン酸化するためのリン酸基供与体を含有することが好ましい。また、本発明のポリペプチドによってリン酸化される基質ポリペプチドを含有してもよい。
本発明の第１の実施の形態にかかるスクリーニング用キットは、リン酸化活性を指標とする。
リン酸化活性を指標とする本発明のスクリーニング方法のために用いられるキットは、上記した本発明のキナーゼ活性を有するアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはそれと実質的に同等のポリペプチドを構成として含有する。好ましくは、該スクリーニング用キットは、本発明のポリペプチドが自身もしくは他の基質をリン酸化するためのリン酸基供与体（例えば、［３２Ｐ］標識もしくは非標識ＡＴＰ等）をさらに含有する。また、必要に応じて、該スクリーニング用キットは、本発明のポリペプチドによってリン酸化され得る基質タンパク質もしくはペプチドを構成として含むことが好ましい。このような基質タンパク質もしくはペプチドとしては、例えば、ＧＳＴ−Ｓｙｎｔｉｄｅ２（Ｌｉｎら，上述）、Ｓｙｎｔｉｄｅ２、ヒストン脱アセチル化酵素、ＨＤＡＣ５、ヒストンアセチル化酵素、ｐ３００等が挙げられる。さらに、リン酸化活性の検出に必要な他の試薬や器具等を含んでいてもよい。
また、本発明の第２の実施の形態にかかるスクリーニング用キットは、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を含有することを特徴とし、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニングするために用いられる。
本発明の第２の実施の形態にかかるスクリーニング用キットには、上記宿主細胞用の培地、ｃＡＭＰ応答配列を活性化するための試薬を含有することが好ましい。
本発明の第２の実施の形態にかかるスクリーニング用キットは、ＣＲＥ制御下にあるレポーター遺伝子の発現を指標とする。
本発明の第２の実施の形態にかかるスクリーニング用キットは、本発明のキナーゼ活性を有するアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはそれと実質的に同等のポリペプチドを産生する能力を有し、且つＣＲＥもしくは代替のｃＡＭＰ依存的シスエレメント［例えば、ＣＹＰ１１Ａ（Ｌｉｎら，上述）、ｃ／ＥＢＰ β（Ｒｅｕｓｃｈら，上述）等；］の制御下にあるレポーター遺伝子（以下、ＣＲＥ−レポーターと略記する場合もある）を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞［好ましくは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびＣＲＥ−レポーターを共導入された形質転換体（例えば、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の細胞）］を含有する。本発明のポリペプチドを内因的に産生する細胞としては、ヒトまたは他の温血動物由来の脂肪細胞等が挙げられる。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＣＲＥ−レポーターを担持する発現ベクターとしては、上記した通りのものが使用され得る。該ベクターの導入法も上述の方法を使用することができる。また、該スクリーニング用キットは、任意で、上記細胞用の培地、ＣＲＥを活性化させるための試薬（例えば、１μＭデキサメタゾン，１ｍＭジブチリル−ｃＡＭＰおよび１μｇ／ｍＬ インスリンを含有する溶液等）、内因的にｃＡＭＰを上昇させるための試薬（例えば、フォルスコリン等）をさらに構成として含有していてもよい。
本発明の第３の実施の形態にかかるスクリーニング用キットは、自己リン酸化能を有するタンパク質と、リン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体またはリン酸化されていない状態の上記タンパク質の自己リン酸化部位を認識する抗体とを含有することを特徴とする。
上記自己リン酸化能を有するタンパク質としては、例えば塩誘導性キナーゼ、等が挙げられる。
リン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体またはリン酸化されていない状態の上記タンパク質の自己リン酸化部位を認識する抗体としては、上述した本発明のスクリーニング方法において用いたものと同様である。
本発明の第４の実施の形態にかかるスクリーニング用キットは、自己リン酸化能を有するタンパク質を産生する能力を有する細胞と、リン酸化された状態の上記タンパク質の自己リン酸化部位を認識する抗体またはリン酸化されていない状態の上記タンパク質の自己リン酸化部位を認識する抗体とを含有することを特徴とする。上記自己リン酸化能を有するタンパク質としては、例えば塩誘導性キナーゼ等が挙げられる。
また、リン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体またはリン酸化されていない状態の上記タンパク質の自己リン酸化部位を認識する抗体としては、上述した本発明のスクリーニング方法において用いたものと同様である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿等から選ばれた化合物であり、例えば、本発明のキナーゼドメインのタンパク質リン酸化活性およびＣＲＥ活性調節活性を阻害もしくは促進する化合物等である。具体的には、公知のタンパク質リン酸化酵素阻害剤であるジメチルスルホキシドやスタウロスポリン等が本発明のポリペプチドの阻害剤として例示される。
本発明のポリペプチドのＣＲＥ活性調節活性を阻害する化合物は、例えば、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化抑制、または脂肪細胞における糖もしくは脂質代謝機能の不全等が関与する疾患（例えば、糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化、高尿酸血症、循環器疾患等）に対する予防・改善剤等として有用である。本発明のポリペプチドのＣＲＥ活性調節活性を促進する化合物は、例えば、ＣＲＥ活性化を阻害することによる細胞死を促進させ、癌に対する治療効果の改善が期待できる。さらに、該剤がＳＩＫ１の活性へも影響及ぼす場合は脳障害の改善に利用できる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の予防・治療剤として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、前記した本発明のポリペプチドを含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤等に製剤化し、経口的または非経口的に投与することができる。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、温血動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等）に対して投与することができる。該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、糖尿病治療の目的で本発明のポリペプチドのＣＲＥ活性調節活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、糖尿病治療の目的で本発明のポリペプチドを阻害する化合物を注射剤の形で成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を通常約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
次に、本発明のポリペプチドの誘導を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法について説明する。本発明のポリペプチドの誘導を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法は、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、本発明のポリペプチドの自己リン酸化活性および／または他のタンパク質のリン酸化活性、またはｃＡＭＰ応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を指標として、本発明のポリペプチドの誘導を促進または阻害する活性を検出する工程を含むことを特徴とする。ｍＲＮＡの検出は従来公知のノーザンブロット法等により実施することができる。リン酸化活性、転写調節活性は、上述した方法により検出することができる。
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸等を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号または当該分野における慣用略号に基づくものである。本明細書において用いられる略号の例を以下に示す。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸、ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸、Ａ：アデニン、Ｔ：チミン、Ｇ：グアニン、Ｃ：シトシン、ＲＮＡ：リボ核酸、ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸、ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸、ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸、ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸、ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸、ＡＴＰ：アデノシン三リン酸、ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸、ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム、Ｇｌｙ：グリシン、Ａｌａ：アラニン、Ｖａｌ：バリン、Ｌｅｕ：ロイシン、Ｉｌｅ：イソロイシン、Ｓｅｒ：セリン、Ｔｈｒ：スレオニン、Ｃｙｓ：システイン、Ｍｅｔメチオニン、Ｇｌｕ：グルタミン酸、Ａｓｐ：アスパラギン酸、Ｌｙｓ：リジン、Ａｒｇ：アルギニン、Ｈｉｓ：ヒスチジン、Ｐｈｅ：フェニルアラニン、Ｔｙｒ：チロシン、Ｔｒｐ：トリプトファン、Ｐｒｏ：プロリン、Ａｓｎ：アスパラギン、Ｇｌｎ：グルタミン、ＰＧｌｕ：ピログルタミン酸
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ：メチル基、Ｅｔ：エチル基、Ｂｕ：ブチル基、Ｐｈ：フェニル基、ＴＣ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基、Ｔｏｓ：ｐ−トルエンスルフォニル、ＣＨＯ：ホルミル、Ｂｚｌ：ベンジル、Ｃｌ２−Ｂｚｌ：２，６−ジクロロベンジル、Ｂｏｍ：ベンジルオキシメチル、Ｚ：ベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ：２−クロロベンジルオキシカルボニル、Ｂｒ−Ｚ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル、Ｂｏｃ：ｔ−ブトキシカルボニル、ＤＮＰ：ジニトロフェニル、Ｔｒｔ：トリチル、Ｂｕｍ：ｔ−ブトキシメチル、Ｆｍｏｃ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル、ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール、ＨＯＯＢｔ：３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン、ＨＯＮＢ：１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド、ＤＣＣ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
ラットＳＩＫ１（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０２０４８０）およびマウスＳＩＫ２（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０６７７８０）蛋白のアミノ酸配列を図１Ａに示す。図１Ａにおいて共通領域は四角で囲ってある。ラットＳＩＫ１蛋白およびマウスＳＩＫ２の一次構造の比較から、ＳＩＫファミリーキナーゼは３個以上のドメイン（以下、３個のドメインをそれぞれ、ドメイン１、２、３と称する）を有していることが明らかである。なお、ドメイン１の一致率は７８％であり、ドメイン２の一致率は７０％であり、ドメイン３の一致率は７３％であった。従って、ドメイン１〜３を有しているタンパク質はＳＩＫファミリーとみなすことができ、その生理活性作用も、以下に示す実施例３および４の結果から相同であるといえる。
ＢｌａｓｔサーチによりヒトにはマウスＳＩＫ２に相同であるが機能が不明のタンパク質が存在していることが示唆されている（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＸＭ０４１３１４）。
図１ＢにマウスＳＩＫ２蛋白と、そのヒト相同遺伝子（以後ヒトＳＩＫ２）由来予想タンパク質との比較を示す。マウスＳＩＫ２とヒトＳＩＫ２の相同性は非常に高く、ラットＳＩＫ１とマウスＳＩＫ２の相同性よりも高い。すなわち、ラットＳＩＫ１とマウスＳＩＫ２の比較や特異性に関しての知見は当然ヒトＳＩＫ２にも当てはまると予想される。
また、実施例４の結果から、ＳＩＫ２は２つのタンパク質リン酸化活性（自己リン酸化活性およびＧＳＴ−Ｓｙｎｔｉｄｅ２リン酸化活性）を有しており、これらは互いに相関することが判明した。ＳＩＫ１およびＳＩＫ２は同一の酵素活性を有しており、相同なアミノ酸の置換（ＳＩＫ１（Ｋ５６Ｍ）、ＳＩＫ２（Ｋ４９Ｍ））により双方とも酵素活性を消失した。すなわち、ＳＩＫ１およびＳＩＫ２の相同性はその生理機能に反映されると判断される。
さらに、以下に示す実施例７、８においてＳＩＫ１特異的、ＳＩＫ２特異的、ドメイン３のリン酸化状態を認識する抗体が作製された。ＳＩＫ１およびＳＩＫ２のドメイン３に存在するセリン（ＳＩＫ１では５７７番目、ＳＩＫ２では５８７番目）がＰＫＡによりリン酸化されると、キナーゼドメインの活性の有無にかかわりなくＣＲＥ抑制活性が減少する。これらの抗体を使い分けることによりＳＩＫのＣＲＥ抑制活性を間接的に評価できる試薬として利用するのみならず、ＳＩＫ１およびＳＩＫ２が原因の疾患の臨床検査試薬への応用が期待できる。
以下に、実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキュラー クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ）に記載されている方法に従った。
ラットＳＩＫ１と５’端が相同であるＥＳＴクローン（ＩＤ：２８４２７１６、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃ：ＡＶ１４６４３６）、および３’端が相同であるＥＳＴクローン（ＩＤ：ＩＭＡＧＥ１２３０８７８、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃ：ＡＡ８８００８６）のｃＤＮＡ配列を参考に、配列番号：１３で表わされるマウスＳＩＫ２の５’端プライマー、および配列番号：１４で表わされるマウスＳＩＫ２の３’端プライマーを作製した。なお、配列番号：１３の５’端から８番目の塩基まではＢａｍＨＩリンカーである。また、配列番号：１４の４６番目のＧは元々はＴであるためＢａｍＨＩで切断されるが、以下のクローニング作業によりＢａｍＨＩ切断部位はｃＤＮＡの５’に存在することが好ましいため、この位置のＴをＧに置換している。次いで、マウス白色脂肪細胞（Ｓｌｃ：ｄｄｙ（日本エスエルシー））由来ＲＮＡからＳＩＫ２の蛋白翻訳領域全長ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法を用いて増幅した。
増幅したｃＤＮＡをｐＴａｒｇｅｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へ付属の酵素を使用して導入し、得られた独立クローン５種の配列を決定した（図１Ａ）。５種のクローンの配列は完全に一致したことから、決定した塩基配列にはＰＣＲによる変異は含まれないものと判断した。マウスＳＩＫ２の塩基配列から予想されるアミノ酸配列をＮＣＢＩのＢｌａｓｔサーチで確認したところ、既知のタンパク質のアミノ酸配列とは一致しなかった。すなわち、マウスＳＩＫ２は新規のタンパク質であることが確認された。図１Ａに、マウスＳＩＫ２およびラットＳＩＫ１の配列を示した。マウスＳＩＫ２は９３１個のアミノ酸残基を有する、分子量約１２０ｋＤａのタンパク質である。マウスＳＩＫ２は、ラットＳＩＫ１とは３３．５％の相同性を有していた。マウスＳＩＫ２およびラットＳＩＫ１は、類似の配列を有しており、３つの高度に保存されたドメインを有している。ドメイン１はセリン／スレオニンプロテインキナーゼドメインであり、ＳＩＫ２のＮ末端付近に存在し、マウスＳＩＫ２とラットＳＩＫ１との間で７８％の相同性を有する。ドメイン２はタンパク質の中央部に存在しており、マウスＳＩＫ２とラットＳＩＫとの間で７０％の相同性を有する。ドメイン３はＣ末端の３分の１の位置に存在し、プロテインキナーゼＡ依存性リン酸化部位を有する。
マウスＳＩＫ１（ｍＳＩＫ１）およびマウスＳＩＫ２（ｍＳＩＫ２）のｃＤＮＡをプローブ（Ａｍｅｒｃｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製キットを利用して３２Ｐで標識）としてマウスの種々の組織におけるｍＲＮＡの存在をノーザン法により解析した。結果を図２に示す。図２は、各組織におけるＳＩＫ１およびＳＩＫ２のｍＲＮＡの存在を調べた結果である。図２において、Ｂｒａｉｎは脳、Ａｄｒｅｎａｌは副腎、Ｏｖａｒｙは卵巣、Ｔｅｓｔｉｓは精巣、ＷＡＴは白色脂肪組織、ＢＡＴは褐色脂肪組織、Ｌｉｖｅｒは肝臓、Ｓｋ Ｍｕｓｃｌｅは骨格筋、Ｈｅａｒｔは心臓、Ｋｉｄｎｅｙは腎臓、Ｌｕｎｇは肺、Ｓｐｌｅｅｎは脾臓を用いたときの結果を示す。なお、Ｇ３ＰＤＨはグリセロアルデヒド−３−ホスホデヒドロゲナーゼを示す。図２に示すように、ＳＩＫ２は精巣においても弱く発現しているが、脂肪細胞において特異的に発現していることがわかった。また、Ｘ線フィルムを利用したＳＩＫ２のｍＲＮＡ検出には一晩で可能であったが、ＳＩＫ１のｍＲＮＡの検出には１週間を有した。このことから、ＳＩＫ２の高発現組織である脂肪細胞でのＳＩＫ２の発現量はＳＩＫ１の高発現組織である副腎での発現量の１０倍以上であると推定された。
次に、タンパク質リン酸化活性を欠損させたｍＳＩＫ２（Ｋ４９Ｍ）を、配列番号：１５で表わされるオリゴＤＮＡ、およびｐＴａｒｇｅｔ−ｍＳＩＫ２ベクターを鋳型とし、ＧｅｎＥｄｉｔｏｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を利用して部位特異的変異法により作製した。作製した変異ＳＩＫ２ ｃＤＮＡは全長ＳＩＫ２の４９番目のリジンがメチオニンに置換された変異ＳＩＫ２をコードしている。
ｍＳＩＫ２を培養細胞で発現・精製し、ｍＳＩＫ２の生理活性を検出する目的で、野生型および変異型ＳＩＫ２（Ｋ４９Ｍ）をコードするｃＤＮＡ断片をＢａｍＨＩとＮｏｔＩ消化（ＮｏｔＩはｐＴａｒｇｅｔのクローニング部位に存在するものでｍＳＩＫ２ ｃＤＮＡに由来しない）でｐＴａｒｇｅｔベクターから切り出し、グルタチオン Ｓ トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ融合発現ベクターｐＥＢＧ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）のＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ間へ導入し、ｐＥＢＧ−ＳＩＫ２を作製した。
次に、ｍＳＩＫ２が有する酵素活性を検出した。ＧＳＴ−ｍＳＩＫ２またはＧＳＴ−ｍＳＩＫ２（Ｋ４９Ｍ）の発現にはＣＯＳ−７細胞を用いた。比較のためにＧＳＴ−ラットＳＩＫ１およびＧＳＴ−ラットＳＩＫ１（Ｋ５６Ｍ：全長ＳＩＫ１の５６番目のリジンがメチオニンに置換された変異ＳＩＫ１：Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２００１）１５，１２６４−１２７６）を作製した。
実施例３で得られたｐＥＢＧ−ＳＩＫ２（３μｇ）をＬｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎ２０００試薬（１０μＬ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、ＣＯＳ−７細胞へ導入した。導入後２日目にＣＯＳ−７細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、細胞溶解液（Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，上述）７００μＬで細胞を溶解し、Ｌｉｎらの方法（上述）で細胞抽出液を調製した。次に、細胞抽出液中のＧＳＴ−ｍＳＩＫ２またはＧＳＴ−ｍＳＩＫ２（Ｋ４９Ｍ）タンパク質をＭｉｃｒｏＳｐｉｎ ＧＳＴ−Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を利用して精製した。
精製したＧＳＴ−ｍＳＩＫ２またはＧＳＴ−ｍＳＩＫ２（Ｋ４９Ｍ）タンパク質について、抗ＧＳＴ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）および抗ヤギ−ＨＲＰ融合２次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）を用いたウエスタンブロット法で量および質を確認した。
得られたＧＳＴ−ｍＳＩＫ２を５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２存在下（全量２０μＬ）で１μＬ ＧＳＴ−Ｓｙｎｔｉｄｅ２（Ｌｉｎら、上述）と［３２Ｐ］−ＡＴＰ（３７ｋＢｑ：ＩＣＮ社製）と混合し、３０℃で１時間反応させた。反応は１０μＬのＳＤＳ−サンプルバッファーを加え１００℃で５分間加温することで停止させた。反応済みサンプルの１０μＬを１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、そのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを乾燥させて３２Ｐの取り込みをＸ線フィルム（ＭＳ−ｆｉｌｍ：Ｋｏｄａｃ社製）で３０分間感光させて検出した。結果を図３に示す。図３は、ラットＳＩＫ１およびマウスＳＩＫ２のタンパク質リン化酸活性を比較した結果である。図３から明らかなように、野生型ＧＳＴ−ｍＳＩＫ２は自己リン酸化活性とＧＳＴ−Ｓｙｎｔｉｄｅ２リン酸化活性を有することが判明した。一方、ＧＳＴ単独および変異型ＧＳＴ−ｍＳＩＫ２（Ｋ４９Ｍ）にはそれらの活性は存在しなかった。比較のためＧＳＴ−ラットＳＩＫ１およびＧＳＴ−ラットＳＩＫ１（Ｋ５６Ｍ）を用いて同様の実験を行なったところ、同様の結果が得られた。
ＳＩＫ２のＣＲＥ転写抑制活性を検出する目的で、ｐＴａｒｇｅｔ−ＳＩＫ２およびｐＴａｒｇｅｔ−ＳＩＫ２（Ｋ４９Ｍ）各２００ｎｇを、ＣＲＥ制御下にルシフェラーゼ遺伝子を配置した発現ベクター（ｐＴＡＬ−ＣＲＥ：２００ｎｇ：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）と共にＬｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎ２０００試薬（２μＬ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて前駆脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１へ導入した。また、ラットＳＩＫ１の知見からマウスＳＩＫ２ドメイン３に存在することが予想されるＰＫＡリン酸化部位を破壊したｍＳＩＫ２（Ｓ５８７Ａ）を、配列番号：１６で表わされるオリゴＤＮＡを用いて導入した。
作製したｍＳＩＫ２（Ｓ５８７Ａ）は全長ＳＩＫ２の５８７番目のセリンがアラニンに置換されている。導入効率の補正のためウミシイタケ由来のルシフェラーゼをＳＶ４０プロモーター下に発現するベクター（ｐＲＬ−ＳＶ４０：３０ｎｇ：Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を共導入した。１６時間後、ＣＲＥを活性化させるためにフォルスコリン（５０μＭ）を用いて６時間の刺激を行った後、細胞を回収し、レポーター遺伝子の発現量をＤｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を利用して検討した。
ＣＲＥ特異的活性の指標はまず、ｐＴＡＬ−ＣＲＥ若しくはＣＲＥが結合していないルシフェラーゼベクター（ｐＴＡＬ）導入細胞のルシフェラーゼ活性をそれぞれウミシイタケ由来ルシフェラーゼの活性で補正し、補正後のｐＴＡＬ−ＣＲＥに由来する活性をｐＴＡＬに由来する活性で割ることでＣＲＥに由来する特異的活性を求めた。結果を図４に示す。図４は、ラットＳＩＫ１およびマウスＳＩＫ２のＣＲＥ抑制活性を比較した結果である。図４から明らかなように、ＳＩＫ２の強制発現はＣＲＥの活性化を阻害することがわかった。このＣＲＥ抑制活性は、ベクターのみ導入した場合やリン酸化活性欠損ｍＳＩＫ２（Ｋ４９Ｍ）においては観察されなかった。このことから、ＳＩＫ２が有するリン酸化活性とＣＲＥ抑制活性とは互いに相関していることが判明した。また、リン酸化活性欠損ＳＩＫ２（Ｋ４９Ｍ）の強制発現は、ベクターのみを導入した場合（コントロール）よりもさらにＣＲＥを活性化させた。したがって、マウスＳＩＫ２キナーゼドメイン（ドメイン１）のリン酸化活性欠損変異は、正常キナーゼドメインとは異なり、ＣＲＥ制御下にある遺伝子の転写促進作用を有することが示唆された。
比較のためｐＩＲＥＳ−ラットＳＩＫ１、ｐＩＲＥＳ−ラットＳＩＫ１（Ｋ５６Ｍ）およびラットＳＩＫ１ドメイン３に存在する５７７番目のセリンをアラニンに置換したｐＩＲＥＳ−ＳＩＫ１（Ｓ５７７Ａ）を用いて同様の実験を行ない、マウスＳＩＫ２と同様の結果を得た。図４に結果を示した。
ＣＯＳ−７細胞で発現させ精製したＧＳＴ−ｍＳＩＫ２タンパク質を、５％ＤＭＳＯおよびスタウロスポリン（Ｓｉｇｍａ社）の１、１０、１００ｎＭの各５％ＤＭＳＯ溶液と実施例３の試験管内反応系で混合した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法でリン酸化活性を検出することにより、マウスＳＩＫ２の酵素活性阻害を評価した。結果を図５に示す。図５は、スタウロスポリンによるマウスＳＩＫ２のタンパク質リン酸化活性の阻害を示す結果である。ＧＳＴ−ｍＳＩＫ２の自己リン酸化およびＧＳＴ−Ｓｙｎｔｉｄｅ２リン酸化活性は、ＤＭＳＯ単独でも３割程度阻害された。さらに、ＳＩＫ２のリン酸化活性はスタウロスポリンで濃度依存的に阻害されたが、１ｎＭで残存活性２割程度まで阻害された。１０ｎＭおよび１００ｎＭ濃度においては、ほぼ１００％阻害された。
ラットＳＩＫ１の３４２番目から７７６番目、マウスＳＩＫ２の３４６番目から７７９番目までのアミノ酸をコードするｃＤＮＡ領域をＴ７プロモーターの制御下に発現させるベクター（ｐＥＴ２８ａ：Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に導入し、ＢＬ２１（ＤＥ３）株を用いて発現させ、目的ポリペプチドを精製し、抗原とした。体重が１．９ｋｇの雌ウサギ（系統：日本白色種）に、抗原０．４ｍｇを３回投与した。アジュバントとしてＴｉｅｒ Ｍａｘ Ｇｏｌｄ ０．５ｍｌ／回を使用した。
抗体の検出をウェスタンブロットにより行った。結果を図６に示す。図６に示すように、ラットＳＩＫ１およびマウスＳＩＫ２それぞれに特異的な反応性を示す抗体が作製された。
ラットＳＩＫ１のドメイン３に存在するセリン（５７７番目に存在するセリン）がリン酸化されたペプチド（ＣＱＥＧＲＲＡｐＳＤＴＳＬＴ：５７１番目から５８２番目のアミノ酸のＮ−末端にシステインを導入、ｐＳはホスホセリン）をＳｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｃｏ．，ＬＴＤから購入し、このペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させたＫＬＨ−ペプチド複合体を免疫原として抗体を作製した。体重が１．９ｋｇの雌ウサギ（系統：日本白色種）に、免疫原０．４ｍｇを３回投与した。アジュバントとしてＴｉｔｅｒ Ｍａｘ Ｇｏｌｄ ０．５ｍＬ／回を使用した。
次いで、上述のようにして得られた、５７７番目に存在するセリンがリン酸化されたペプチドをビオチンに結合させたビオチン結合ペプチドをストレプトアビジンカラムに結合させたアフィニティーカラムを用いて特異的抗体を精製した。
抗血清１０ｍｌをＰＢＳにて２倍に希釈した後、アフィニティーカラムへ通し、結合しないタンパク質を２０ｍｌのＰＢＳで洗い流した。結合した特異的抗体の溶出は５ｍｌのＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ（ｐＨ２．０）で行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで抗体の溶出を検出後、１／５量のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）で中和して保存した。
図７（ａ）に、野生株のペプチド、５７７番目のセリンをアラニンに置換したペプチドと抗体との反応を調べた結果を示す。ＣＢＢはクーマーシーブリリアントブルー染色を意味し、何もない場合には反応がなく、存在する場合には反応があることを示すコントロール物質として用いられている。図７（ａ）に示すように、キャリアプロテインのＧＳＴは反応せず、ＰＫＡによってリン酸化された野生株のペプチドは反応するが、５７７番目のセリンをアラニンに置換されることによってリン酸化されなくなったペプチドが反応しないことがわかる。図７（ａ）の下側の実験は、野生株のペプチドがＰＫＡによるリン酸化を受けない場合には反応しないことを示す。
ＨＡタグ付きのＳＩＫ１およびＳ５７７Ａ変異ＳＩＫ１をＣＯＳ−７細胞で高発現させた後、８Ｂｒ−ｃＡＭＰで３０分間処理し、細胞からＨＡ−タグ抗体を利用してＳＩＫ１を免疫沈降させた。次いで、抗ＳＩＫ１抗体および抗リン酸化Ｓｅｒ５７７Ａ抗体を用いてウェスタンブロットを行い、ＳＩＫＩおよびリン酸化Ｓｅｒ５７７を検出した。
図７（ｂ）から明らかなように、本抗体はドメイン３のリン酸化状態を検出できることが確認された。
ｐ３００の８９番目のセリンをアラニンに置換（Ｓ８９Ａ）することによって、ｐ３００がＳＩＫによるリン酸化を受けないかどうかを検討した。さらに、ペプチドｐ３００〔８４−９３（Ｓ８９Ａ）〕がＳＩＫのリン酸化活性を阻害することができるかどうかを検討した。Ｌｉｎらの方法でＳＩＫ２の活性を測定する際、ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）の５％溶液およびスタウロスポリンを含有するＤＭＳＯ溶液を加えた。ＳＩＫ２はＧＳＴ結合体としてＣＯＳ−７細胞で発現させ、アマーシャム・ファルマシア社のＧＳＴ−Ｍｉｒｏｓｐｉｎキットで精製した。
結果を図８に示す。図８は、ＳＩＫの阻害剤の検討結果を示す図である。
図８（ａ）に示すように、ｐ３００の８９番目のセリンがアラニンに置換されたペプチドはリン酸化されなくなることがわかる。
図８（ｂ）に示すように、８９番目のセリンがアラニンに置換された、リン酸化されないｐ３００ペプチドはＳＩＫの酵素活性を阻害することがわかる。また、左のレーンおよび中央のレーンは、ＳＩＫが合成基質（Ｓｙｎｔｉｄｅ２）をリン酸化した結果を示す。
図８（ｃ）は、阻害活性を有するペプチドのＣＲＥ活性への影響を調べた実験結果である。ＧＦＰＣは緑蛍光タンパクのＣ−末端結合型であり、ペプチドのキャリアーとして用いており、ＧＦＰのＣ末端に目的ペプチドを結合したものであり、左はコントロールであり、右がｐ３００〔８４−９３（Ｓ８９Ａ）〕を結合した時のＣＲＥ活性である。黒がＰＫＡのみでＳＩＫが存在しない場合のＣＲＥ活性、であり、灰色がＰＫＡおよびＳＩＫが存在する場合のＣＲＥ活性である。ｐ３００〔８４−９３（Ｓ８９Ａ）〕は、細胞内でＳＩＫのＣＲＥ抑制活性、すなわち、リン酸化活性を阻害していることが示された。
実施例５における前駆脂肪細胞でのＣＲＥのアッセイ系に、Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ−α（ＴＮＦα）５０ｎｇ／ｍｌを加え、実施例５と同様の実験を行った。なお、ＴＮＦαはＣＲＥＢを阻害することが報告されている。結果を図９に示す。図９Ａから明らかなように、ＴＮＦαはＳＩＫ２の高発現がなされていない場合でも、ＰＫＡによるＣＲＥの活性化を十分に抑制していた。
また、出芽酵母のＧａｌ４タンパク質のＮ末端側（Ｇａｌ４ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ：Ｇａｌ４ＤＢ）にＣＲＥＢを導入し、Ｇａｌ４結合配列が５つ連続した配列を有するプロモーターの下流にレポーター遺伝子（ホタルルシフェラーゼ）を導入したプラスミドを利用してＤＢをＣＲＥを介さずにＣＲＥＢの転写能を検討した。Ｇａｌ４−ＣＲＥＢ（全長）の系においては、ｂＺＩＰ ｄｏｍａｉｎを有するため、転写がＳＩＫ２およびＴＮＦαのそれぞれで抑制された（図９Ｂ参照）。
また、Ｇａｌ４−ＣＲＥＢ（−ｂＺＩＰ）の系では、ＳＩＫ２の作用点（ｂＺＩＰ）が無いためＳＩＫ２では転写の抑制が起こらなかったが、ＴＮＦαでは抑制が起こっていることがわかった（図９Ｃ参照）。
上記の結果から、ＳＩＫ２はｂＺＩＰドメインを作用点にして転写活性を抑制していることが確認された。
従って、ＳＩＫ２阻害剤のスクリーニングに応用することができることが明らかとなった。すなわち、ＣＲＥＢ（全長）とＣＲＥＢ（−ｂＺＩＰ）を別々のＤＮＡ結合因子に結合させ、その下流にそれぞれのＤＮＡ結合因子に対応する配列を異なるレポーター遺伝子を導入する。例えば、Ｇａｌ４−ＣＲＥＢ（全長）に対して５×Ｇａｌ４結合配列−ホタルルシフェラーゼ、ＬｅｘＡ−ＣＲＥＢ（−ｂＺＩＰ）に対して５×ＬｅｘＡ結合配列−ウミシイタケルシフェラーゼという組み合わせを作製し、これらとＳＩＫ２を細胞に共導入して、検討する化合物を加え、ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼの活性の比から、化合物がＳＩＫ２を阻害するか否かを検討することができる。
マウスＳＩＫ２のドメイン３に存在することが予想されるＰＫＡリン酸化部位を破壊したｍＳＩＫ２（Ｓ５８７Ａ）を、配列番号：１６で表わされるオリゴＤＮＡ、およびＴａｒｇｅｔ−ｍＳＩＫ２ベクターを鋳型として、ＧｅｎＥｄｉｔｏｒＭｕｔａｇｅｎｓｉｓキット（Ｐｒｏｍｅ社製）を用いて部位特異的変位法により作製した。作製したＳＩＫ２ ｃＤＮＡは全長ＳＩＫの５８７番目のセリンがアラニンに置換された変異ＳＩＫ２をコードしている。
ｍＳＩＫ２を培養細胞で発現し、ｍＳＩＫ２の細胞内分布を調べる目的で、野生型および変異型ＳＩＫ２（Ｓ５８７Ａ）をコードするｃＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩフラグメントをｐＧＦＰＣのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ位置にそれぞれ組み、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ融合発現ベクター、ｐＧＦＰ−ＳＩＫ２およびｐＧＦＰ−ＳＩＫ２（Ｓ５８７Ａ）を作製した。
上述のようにして得られたｐＧＦＰ−ＳＩＫ２およびｐＧＦＰ−ＳＩＫ２（Ｓ５８７Ａ）（０．５μｇ）をＬｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎ２０００試薬（１０μＬ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、３Ｔ３−Ｌ１細胞へ導入した。３Ｔ３−Ｌ１細胞は、１０％ウシ胎児血清および抗生剤を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ’Ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で３７℃、５％−ＣＯ２−９５％空気雰囲気中で培養した。１６時間培養を行った後、細胞を分化カクテルミックス（０．５ｍＭ ３−メチル−１−イソブチルキサンチン、１μｇ／ｍＬ インシュリンおよび１μＭデキサメタゾン）で１２時間処理した後、固定し、ＧＦＰ（緑蛍光タンパク質）の発光により細胞を観察した。
比較として、分化カクテルミックスで処理せずに同様の実験を行い、またＧＦＰ−ラットＳＩＫ１およびＧＦＰ−ラットＳＩＫ１（Ｓ５７７Ａ）を用いて同様の実験を行った。結果を図１０に示す。図１０は、３Ｔ３−Ｌ１細胞内における、ラットＳＩＫ１およびマウスＳＩＫ２の細胞内分布を示す結果である。図１０においてＷＴはＧＦＰ−ラットＳＩＫおよびＧＦＰ−マウスＳＩＫ２を示し、Ｓ５７７ＡおよびＳ５８７Ａは、それぞれＧＦＰ−ラットＳＩＫ（Ｓ５７７Ａ）およびＧＦＰ−マウスＳＩＫ２（Ｓ５８７Ａ）を示す。
図１０に示すように、３Ｔ３−Ｌ１細胞内で発現されたＧＦＰ−ＳＩＫ１は、ほとんどが核内に存在し、細胞を分化カクテルミックスで処理した場合には細胞質へ移行した。一方、ＧＦＰ−マウスＳＩＫ２は、核内において弱い緑色蛍光シグナルが検出されたが、静止期および分化カクテルミックスで処理した細胞のいずれにおいても、そのほとんどが細胞質に存在していた。
脂肪細胞組織においてＳＩＫ２遺伝子が高度に発現していることがわかったので、前駆脂肪細胞−脂肪細胞分化の過程におけるＳＩＫ２ ｍＲＮＡの量を測定した。具体的には、３Ｔ３−Ｌ１繊維芽細胞を４日間ＤＭＥＭ培地中で培養し、細胞を飽和させた。細胞が飽和した後、細胞を分化カクテルミックス（０．５ｍＭ メチルイソブチルキサンチン、１μｇ／ｍｌインシュリンおよび１μＭデキサメタゾン）と高濃度グルコース（２．５ｇ／Ｌ）を含むＤＭＥＭ培地中で２日間培養し、細胞の分化を開始した。培地を２日毎に高グルコース含有新鮮培地と交換しながら７日間培養した。細胞が飽和する前（Ｇｒｏｗｔｈ）、飽和後（Ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）および処理後一定時間毎に細胞を取り出し、ＳＩＫ２およびＳＩＫ１のｍＲＮＡレベル、および他の脂肪細胞分化マーカー（Ｐｒｅｆ−１、ｃ／ＥＢＰβ、ｃ／ＥＢＰδ、ＳＲＥＢＰ−１、ｃ／ＥＢＰα、ＰＰＡＲγおよびａＰ２）の定量を行った。これらの定量は、必要なｃＤＮＡプローブを用いたノーザンブロット分析により行った。
結果を図１１に示す。図１１は、脂肪細胞分化の過程において誘導される、各種脂肪細胞分化マーカーのｍＲＮＡの定量を行った結果を示す図である。図１１（ａ）に示すように、最初の２４時間の培養後に、ＳＩＫ２のｍＲＮＡが顕著に発現し、そのレベルは７日後に前駆脂肪細胞がほとんど成熟脂肪細胞に分化（ｏｉｌ Ｒｅｌ−０染色による判定）するまで高く維持された。一方、ＳＩＫ１のｍＲＮＡは、ＳＩＫ２のｍＲＮＡと比較するとかなり濃度は低かった（図１１（ａ）において、ＳＩＫ１とＳＩＫ２とはフィルムの露光時間が異なっている）が、最初の２４時間で濃度が上昇し、７日目までその濃度が維持された。前駆脂肪細胞のマーカーであるＰｒｅｆ−１のｍＲＮＡのレベルは、２日目から減少し始めた。脂肪分化の初期の段階で出現することが知られている転写因子であるｃ／ＥＢＰβ、ｃ／ＥＢＰδのｍＲＮＡのレベルは、ＳＩＫ２と同様に最初の２４時間で上昇した。ＳＲＥＢＰ−１、ｃ／ＥＢＰα、ＰＰＡＲγおよびａＰ２は、脂肪生成の遅応答性遺伝子として知られているが、これらのｍＲＮＡのレベルは、２日目または４日目から上昇し始めた。
脂肪分化の初期の段階で出現することが知られている、ｃ／ＥＢＰβ、ｃ／ＥＢＰδについては、分化カクテルミックスのメチルイソブチルキサンチンに代えて、ジブチルｃＡＭＰ（１ｍＭ）を分化カクテルミックスの構成物として使用し、分化刺激後１〜１２時間までのｍＲＮＡの発現を調べた。結果を図１１（ｂ）に示す。図１１（ｂ）に示すように、ｃ／ＥＢＰβ、ｃ／ＥＢＰδのいずれのｍＲＮＡも１時間以内に上昇したが、ｃ／ＥＢＰδのｍＲＮＡのレベルは２時間後には徐々に下降した。
３種のホルモン、インシュリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）、ｃＡＭＰおよびデキサメタゾン（ＤＸ）の混合物の中の、いずれがＳＩＫ２遺伝子の転写を刺激しているかを調べるため、これらのホルモン単独、および３種の混合物とともに２時間インキュベートし、ＳＩＫ２のｍＲＮＡのレベルを測定した。用いたホルモンの濃度は、それぞれ、インシュリンが１μｇ／ｍｌ、ｃＡＭＰが１ｍＭ、デキサメタゾンが１μＭであった。測定は、それぞれのｃＤＮＡプローブを用いたノーザンブロット分析により行った。結果を図１１（ｃ）に示す。図１１（ｃ）に示すように、インシュリンおよびｃＡＭＰは単独でもＳＩＫ２遺伝子の転写を促進したが、デキサメタゾンは単独で、３種のホルモンの混合物と同程度のＳＩＫ２遺伝子の活性化を示した。
上述の結果は、ＳＩＫ２が脂肪細胞組織においてシグナル変換経路に関与していることを強く示唆しているが、そのためにはＳＩＫ２活性の細胞内標的分子を特定する必要がある。ヒトインシュリンレセプター基質（ＩＲＳ）１のアミノ酸配列の一部がＳＩＫのリン酸化モチーフと一致するので、このペプチドがＳＩＫ２の基質として機能し得るか否かを調べた。
ヒトＩＲＳ−１に使用する哺乳類の発現ベクターを用意するためにｐＥＢＧ−ｈＩＲＳ−１，Ｓｐｅ ＩおよびＮｏｔ Ｉ部位を５’−および３’−末端においてヒトＩＲＳ−１ ｃＤＮＡの部位特異的変異法により作製した。得られた完全長ヒトＩＲＳ−１ ｃＤＮＡはＳｐｅ Ｉ−およびＮｏｔ Ｉ−消化により単離し、ｐＥＢＧベクターのＳｐｅ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ部位中へ連結させ、ベクターを得た。変異型ヒトＩＲＳ−１（Ｓ７９４Ａ）用のベクターは、配列番号：１７で表されるオリゴＤＮＡを用いて、部位特異的変異法により作製した。
上述のようにして得られたベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎ２０００試薬（１０μＬ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、ＣＯＳ−７細胞へ導入した。また、実施例３で得られたＧＳＴ−ＳＩＫ２を発現するベクターを導入し、Ｈ３ ３２ＰＯ４によりプレインキュベートした後、ＧＳＴ−ヒトＩＲＳ−１またはＧＳＴ−ヒトＩＲＳ−１（Ｓ７９４Ａ）とＧＳＴ−ＳＩＫ２またはＧＳＴ−ＳＩＫ２（Ｋ４９Ｍ）とを共発現させた。３２ＰＯ４（０．０５ｍＣｉ：１．８５ＭＢｑ）と共に１２時間培養を行った後、細胞溶解液（Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，上述）７００μＬで細胞を溶解した。ＧＳＴ−ヒトＩＲＳ−１はグルタチオンカラム（ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ ＧＳＴ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ：アマーシャムバイオサイエンス社製）により精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）を行い、オートラジオグラフィーによりリン酸化のレベルを可視化した。結果を図１２の上段に示す。図１２は、ＧＳＴ−ヒトＩＲＳ−１およびＧＳＴ−ヒトＩＲＳ−１（Ｓ７９４Ａ）のリン酸化を比較した結果である。図１２に示すように、ＧＳＴ−ヒトＩＲＳ−１は、ＳＩＫ２によって速やかにリン酸化されたが、ＳＩＫ２（Ｋ４９Ｍ）発現細胞中においてもわずかにリン酸化された。これは、ＩＲＳ−１がＣＯＳ−７細胞中でＳＩＫ２以外のプロテインキナーゼによりリン酸化されたためである。一方、ＧＳＴ−ヒトＩＲＳ−１（Ｓ７９４Ａ）は、ＳＩＫ２およびＳＩＫ２（Ｋ４９Ｍ）によってほとんどリン酸化されなかった。この結果は、ヒトＩＲＳ−１の７９４位のセリンが細胞中でＳＩＫ２によってリン酸化されたことを示唆する。
Ｃ５７ＢＬＫｓ／Ｊ ｄｂ／ｄｂマウス（以下、ｄｂ／ｄｂ肥満・糖尿病マウスという）およびＣ５７ＢＬ／６Ｃｒマウス（以下、野生型マウスという）から、白色脂肪細胞組織、褐色脂肪細胞組織、肝臓および骨格筋を採取し、それぞれｍＲＮＡを抽出した。白色脂肪細胞組織および褐色脂肪細胞組織から５μｇ、肝臓および骨格筋から３０μｇのＲＮＡをノーザンブロット分析して、ＳＩＫ２ ｍＲＮＡの検出を行った。
結果を図１３（ａ）に示す。図中においてＷＴは野生型マウスを意味し、ｄｂはｄｂ／ｄｂ肥満・糖尿病マウスを意味する。また、ＷＡＴは白色脂肪細胞組織、ＢＡＴは褐色脂肪組織、Ｌｉｖｅｒは肝臓、ＳｋＭは骨格筋を意味する。図１３（ａ）に示すように、野生型マウスおよびｄｂ／ｄｂ肥満・糖尿病マウスのいずれにおいても、白色脂肪細胞組織、褐色脂肪細胞組織においてＳＩＫ２ｍＲＮＡが同レベルで検出された。これに対し、肝臓および骨格筋においては、野生型マウスおよびｄｂ／ｄｂ肥満・糖尿病マウスのいずれにおいてもＳＩＫ２ｍＲＮＡの濃度は非常に低かった。また、野生型マウスおよびｄｂ／ｄｂ肥満・糖尿病マウスの間でｍＲＮＡの量に相違はなかった。比較として、ＳＩＫ１ｍＲＮＡの量を検出した。ＳＩＫ１ｍＲＮＡの量は、褐色脂肪細胞組織、肝臓および骨格筋においてｄｂ／ｄｂ肥満・糖尿病マウスにおいては野生型マウスよりも上昇していた。
実施例１４で得られた、白色脂肪細胞組織および褐色脂肪細胞組織から３ｍｇ、肝臓および骨格筋から１８ｍｇのタンパク質を含有するホモジネートから免疫沈降法によりタンパク質を精製し、ウェスタンブロット分析によりＳＩＫ２の検出を行った。ウェスタンブロット分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、抗ＳＩＫ２抗体を用いて行った。結果を図１３（ｂ）に示す。図１３（ｂ）に示すように、ｄｂ／ｄｂ肥満・糖尿病マウスの白色脂肪細胞組織におけるＳＩＫ２タンパクの量は野生型マウスに比べて高いことがわかる。一方、褐色脂肪細胞組織においては、ｄｂ／ｄｂ肥満・糖尿病マウスの方が量は少なかった。肝臓および骨格筋においては、ＳＩＫ２の量が少ないので、ｄｂ／ｄｂ肥満・糖尿病マウスと野生型マウスとの間でほとんど差が認められなかった。
次いで、実施例１４および１５で用いた組織から免疫精製したＳＩＫ２について、ＧＳＴ−Ｓｙｎｔｉｄｅ２を基質として用いてｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるキナーゼ活性のアッセイを行った。結果を図１３（ｃ）に示す。図１３（ｃ）に示すように、ｄｂ／ｄｂ肥満・糖尿病マウスの白色脂肪細胞組織のＳＩＫ２活性は野生型マウスよりも高いことがわかる。一方、褐色脂肪細胞組織においては、ＳＩＫ２活性は野生型マウス、ｄｂ／ｄｂ肥満・糖尿病マウス共に低かったが、野生型マウスの方がｄｂ／ｄｂ肥満・糖尿病マウスよりも高かった。この結果は、図１３（ｂ）の結果から明らかなように、ＳＩＫ２タンパク質の含有量の相違に一致していることを示唆する。肝臓ホモジネートは、ＳＩＫ２活性を有していたが、ｄｂ／ｄｂ肥満・糖尿病マウスの方が野生型マウスよりもわずかに高い活性であった。骨格筋では、認識できるＳＩＫ２活性を示さなかった。これらの結果は、ＳＩＫ２タンパク質が、その活性と同様に糖尿病マウスの白色脂肪細胞組織において上昇していることを示す。
実施例８で示したように、ラットＳＩＫ１の５７７番目に存在するセリンがリン酸化されることがわかった。また、ｃＡＭＰ−ＰＫＡ系が亢進していない状態のＣＯＳ−７細胞（８Ｂｒ−ｃＡＭＰ未処理）でも、５７７番目のセリンはかなりリン酸化されていることがわかった。また、５７７番目のセリンがリン酸化されると、ＳＩＫ１が核外移行する現象から判断すると、５７７番目のセリンは未処理細胞内でもＰＫＡ以外のリン酸化酵素によってリン酸化されることが予想される。例えば、ＰＫＡ活性がほとんど検出されないＹ１変異株内でも、未処理細胞内のＳＩＫの核外移行が観察されている。また、５７５位のアルギニンをアラニンに変異した変異体はＰＫＡでリン酸化されないにもかかわらず、核外移行が亢進することが報告されている（Ｔａｋｅｍｏｒｉ，Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７７（４４）４２３３４−４２３４３（２００２））。上述したことから、ＳＩＫの５７７番目のセリンはＰＫＡ以外によってもリン酸化され、リン酸化されたＳＩＫが核外移行を行うことがわかる。
そこで、ＳＩＫ１自身が５７７番目のセリンをリン酸化するか否かを検討した。実施例４で得られたＧＳＴ−ラットＳＩＫ１を用い、実施例４と同様に実験を行った。基質としては、野生型ラットＳＩＫ１、５７７番目のセリンがアラニンに置換された変異体（Ｓ５７７Ａ）、５７４番目のアルギニンがアラニンに置換された変異体（Ｒ５７４Ａ）、５７５番目のアルギニンがアラニンに置換された変異体（Ｒ５７５Ａ）、及び５７４番目及び５７５番目のアルギニンがアラニンに置換された変異体（Ｒ５７４／５７５Ａ）を用いた。
変異体の作製は、Ｔａｋｅｍｏｒｉ，Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７７（４４）４２３３４−４２３４３（２００２））に記載した方法に従って実施した。
結果を図１４Ａに示す。図１４Ａに示すように、野生型ＳＩＫ１はリン酸化されたが、Ｓ５７７Ａ、Ｒ５７４Ａ、Ｒ５７４／５７５Ａはリン酸化されなかった。これに対し、Ｒ５７５Ａは野生型よりも遙かに効率よくリン酸化された。本実施例の反応はＳＩＫペプチドを基質とした分子間反応であるが、ＳＩＫ１の５７７番目のセリンはＳＩＫ１の分子内に存在しているので、その基質濃度は試験管内に比べ遙かに高く、５７７番目のセリンはＳＩＫ１のドメイン１によって効率良くリン酸化されると予想される。
次に、リン酸化されたＧＳＴ−ＳＩＫ１及びリン酸化されたＧＳＴ−ＳＩＫ２を基質として用い、抗体として実施例８で得られたものを用いてウェスタンブロット分析を行った。結果を図１４Ｂに示す。図１４Ｂに示すように、実施例８で得られた抗体は、ＳＩＫ１の５７７番目のセリン、及びＳＩＫ２の５８７番目のセリンの自己リン酸化状態を認識することがわかった。なお、ＳＩＫ１の５７７番目の近傍の配列はマウス、ラット及びヒトで保存されている。
上述したように、ＳＩＫ１の５７７番目のセリンがリン酸化部位であることが判明したが、ＳＩＫ１のドメイン１及びドメイン２の一部だけでも自己リン酸化活性があることがわかっている（Ｘ．Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １５（８），１２６４−１２７６（２００１））。すなわち、５７７番目のセリン以外にも自己リン酸化部位が存在している。そこで、どのアミノ酸がリン酸化されているかを、ＧＳＴ−ラットＳＩＫ１（１−３４３アミノ酸）及びＧＳＴ−ヒトＳＩＫ２（３−３４８アミノ酸）（ＧｅｎＢａｎｋ ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡＢ９１４４２）を３２Ｐ−ＡＴＰ存在下で反応させて自己リン酸化させた。次いで、６Ｎ塩酸でＳＩＫポリペプチドを加水分解し、個々のアミノ酸に分解し、薄層クロマトグラフィーにて分離した。結果は示さないが、自己リン酸化されているアミノ酸は、ＳＩＫ１及びＳＩＫ２共にセリンであった。ＳＩＫ１及びＳＩＫ２の領域で共通のセリンは４つあり、ＳＩＫ１で示すと、１３５番目、１８６番目、２０９番目及び２４８番目のセリンである。４つのセリンを、それぞれ個々にアラニンに置換し、それら変異体ＳＩＫ１のタンパク質リン酸化活性及び自己リン酸化活性の比を測定した。結果を示さないが、１８６番目のセリンをアラニンに置換した場合に、タンパク質リン酸化及び自己リン酸化活性が消失した。この結果より、１８６番目のセリンが自己リン酸化部位であることが判明した。
また、ＳＩＫ１の１８２番目のスレオニンをアラニンに置換し、同様に活性を測定した。その結果、ＳＩＫ１のリン酸化活性が非常に低くなった。この結果より、ＳＩＫ１においては１８２番目のスレオニンが細胞内でリン酸化されており、ＳＩＫ１の酵素活性に必要であることがわかった。
次いで、ＳＩＫ１の１８２番目のスレオニン及び１８６番目のセリンの二重リン酸化を認識する抗体を以下のようにして作製した。
合成ペプチドＧＥＰＬＳｐＴＷＣＧｐＳＰＰＹＡＡ（ｐＴ：リン酸化スレオニン、ｐＳ：リン酸化セリン）をＳｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｃｏ．，ＬＴＤから購入し、これをＫＬＨに結合させ、抗原として利用した。抗体の作製法は、実施例８と同様である。
得られた抗体を用いて、実施例４で用いたＧＳＴ−ＳＩＫＴ及びＧＳＴ−ＳＩＫ２を基質として用い、ウェスタンブロット分析を行った。結果を図１５に示す。図１５に示すように、得られた抗体はＳＩＫ１とは良く反応するが、ＳＩＫ２とはわずかに反応した。
３Ｔ３−Ｌ１細胞を、９６穴プレートにまき、細胞が増殖飽和になるまで培養した。なお、プレート内に入れた培地はＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳであり、培養は３７℃で５％ＣＯ２で行った。次いで、デキサメタゾンを濃度１μＭとなるように各プレートに加え、ＳＩＫを誘導した。誘導して１時間経過した後、ＳＩＫの阻害剤であるスタウロスポリンを、１０、１００及び１０００ｎＭとなるようにプレートに加え、更に１時間培養を行った。なお、０は溶媒のみを加えた。次いで、細胞をＰＢＳに４％パラホルムアルデヒドを加えて室温で１５分間放置して固定した。次いで、ＰＢＳで４回洗浄した後、ＴＢＳＴ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳ）に１％スキムミルクを溶解させたブロッキング溶液で細胞を反応させた。次いで、同じブロッキング溶液に、５７７番目のセリンがリン酸化されたＳＩＫ１に対する抗体、１８２番目のスレオニン及び１８６番目のセリンがリン酸化されたＳＩＫ１に対する抗体、抗ＳＩＫ１抗体、５７７番目のセリンがリン酸化されていないＳＩＫ１に対する抗体を含む抗血清（５００倍希釈）を１００μｌ加え、一晩反応させた。一晩反応させた後、未反応抗体をＰＢＳで４回洗浄して除去し、ＴＢＳに１％スキムミルクを溶解させた反応液にＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ二次抗体を１０００倍に希釈した溶液を加え、室温で２時間反応させた。次いで、ＰＢＳで４回洗浄した後、コニカイムノステインＨＲＰ試薬（コニカ社製）を利用して抗原抗体反応を可視化した。
結果を図１６に示す。図１６に示すように、抗リン酸化Ｓｅｒ５７７抗体、及び抗リン酸化Ｔｈｒ１８２−Ｓｅｒ１８６抗体とＳＩＫとの反応性は、スタウロスポリン１０ｎＭで有意に低下した。これに対し、抗ＳＩＫ１抗体との反応はスタウロスポリンの添加によって極端には変化しなかった。更に、５７７番目のセリンがリン酸化されていないＳＩＫ１に対する抗体は、スタウロスポリン濃度に依存して反応性が高まった。
上記の結果より、上記の系を利用することにより、ＳＩＫの活性を促進または阻害する物質をスクリーニングすることが可能であることがわかる。
ヒトＳＩＫ２の１７０番目のグリシンから１８４番目のアラニンまでの１５アミノ酸の１７５番目のスレオニンと１７９番目のセリンがリン酸化されたペプチド、ＧＥＬＬＡｐＴＷＣＧｐＳＰＰＹＡＡ（ｐＴ；リン酸化スレオニン、ｐＳ；リン酸化セリン）、を合成した。スレオニン及びセリンは予めリン酸化したものを用いた。このペプチドをＫＬＨに結合させたＫＬＨ−ペプチド複合体を免疫原として作成し、雌ウサギ（日本白色種）に初回０．４ｍｇを皮下注射し、その後２週間毎に０．２ｍｇを３回皮下注射した。最終免疫の１０日後に抗血清を採取した。１７５番目のスレオニンと１７９番目のセリンがリン酸化されたペプチドをセファロース樹脂に共有結合させたアフィニティーカラムをＰＢＳで平衡化した後、採取した抗血清を流した。ＰＢＳでカラムを洗浄後、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）で溶出される分画を１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．２）で直ちに中和、分取した。この分画をＰＢＳに対し透析し特異抗体を得た。ウサギ１羽に対し約０．５ｍｇの特異抗体が得られた。
ＳＩＫ２のＣＲＥ転写抑制活性を検出する目的で、ＳＩＫ２をコードする遺伝子をＥｃＲ２９３細胞へ導入した。
ｐＩＮＤベクター５μｌ、１０×Ｈバッファー（東洋紡（株）製、組成：５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、１０００ｍＭ ＮａＣｌ）５μｌ、ＢａｍＨＩ ２μｌに、蒸留水を加えて全量を５０μｌとし、混和した後、３７℃の温度で１．５時間、制限酵素処理を行った。
また、別に、上記ｐＩＮＤベクターを、実施例３で得られたｐＥＢＧ−ＳＩＫ２に代えて同様の操作を行った。
上記制限酵素処理を行った後、反応系を、フェノール／クロロホルム処理し、エタノール沈殿を行った。エタノール沈殿物に、１０×Ｈバッファー２μｌ、ＮｏｔＩ １μｌを加え、蒸留水を加えて全量を２０μｌとし、混和した後、３７℃の温磨で１．５時間、制限酔素処理を行った。反応終了後、ＤＮＡを１％ＬＭＰアガロースで電気泳動（１００Ｖ、３０分）を行った。泳動後、目的のバンドをメスで切り出し、切り出したゲルバンドをゲルバンド切り出し回収キットを用いて精製した。
精製したＤＮＡ断片（ｐＩＮＤベクター及びｐＥＢＧ−ＳＩＫ２）を含む溶液各２μｌ、ＤＮＡリガーゼ１μｌを試験管に入れ、蒸留水を加えて全量を２０μｌとし、ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応は、１６℃の温度で３時間行った。ライゲーション反応終了後、ＪＭ１０９コンピテントセル１５μｌにトランスフォーメーションを行い、ＬＢ−ａｍｐ培地上に塗布し、３７℃で、１６時間培養した。得られたコロニーを、液体培地（ＬＢ−ａｍｐ）３ｍｌにて３７℃で１６時間培養した後、プラスミド（ｐＩＮＤ−ＳＩＫ２）の回収を行った。得られたプラスミドを、再度ＢａｍＨＩ ＮｏｔＩで制限酵素処理した後、電気泳動確認を行った。
Ｅｃｒ２９３細胞にｐＶｇＲＸＲプラスミドをトランスフェクションした後、プラスミドが導入された細胞をゼオシンで選択した。生き残ったＥｃＲ２９３細胞を４種類の濃度で６０ｃｍシャーレで培養し（３７℃、１〜２日）、細胞の状態が５０％コンフレントになっている細胞を選び、ｏｐｔｉ−ＭＥＭ ２ｍｌで細胞を２回洗浄した後、トランスフェクションを行った。
トランスフェクションするＤＮＡは、ｐＩＮＤ−ＳＩＫ２ ０．５μｇとｐＴＡＬ−ＣＲＥ１．５μｇを２００μｌの１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ溶液に加えて、さらにリポフェクタミン２０００試薬を６μｌ加え混和後、１５分間、室温でインキュベートしたものを用いた。トランスフェクション反応は、上記の処理後の細胞に対して、上記処理後のＤＮＡ溶液を加えて、３７℃で３時間反応させた。反応終了後、培地を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ溶液４ｍｌに代えて、３７℃で１６時間培養した。
細胞を培養している培地をＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（５００μｇ／μｌ）に代え、２日間の間隔で培地交換をしながら約１週間細胞培養を行った。細胞が程良く死亡したところで、２４穴プレートに細胞を１つずつチップで吸い上げて移した。さらに培養を行い、程良く細胞が増えたところでレポーターアッセイを行い安定化株を採取した。採取した細胞を、上記記載の方法で再度セレクションをかけた後、安定化株を採取した。２度のスクリーニングを行い採取した細胞を大量に増殖し、ＳＩＫ２のＣＲＥ転写抑制活性を検出する細胞を得た。
９６穴プレートの各ウェルに、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地（０．２ｍｌ）を入れ、それぞれのウェルに、上述のようにして得られた細胞を入れ、３７℃で５％ＣＯ２環境下で細胞が繁殖飽和になるまで培養する。次いで、ポナステロンＡ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社製、４．３μＭ）、フォルスコリン（４０μＭ）及び試験化合物を各ウェルに加え、６時間の刺激を行った。６時間の刺激終了後、細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性をＤｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて測定し、試験化合物のＳＩＫ２阻害活性を調べる。
本発明は脂肪組織に特異的に発現しているＳＩＫ２、ＳＩＫ２に特異的な抗体、およびＳＩＫ２のリン酸化状態を認識する抗体を提供することにより、ＳＩＫ２の生理活性を制御あるいは促進する化合物の同定やＣＲＥ抑制活性を評価するための試薬を提案することができる。また、ＳＩＫ２のアゴニスト、アンタゴニストのスクリーニングによりＳＩＫ２の作用を抑制または亢進する組成物を提供することができる。さらに、脂肪細胞の分化や脂肪細胞における糖および脂質代謝の異常が関与する疾患、特に糖尿病や高脂血症、高血圧、動脈硬化等代謝異常が原因の疾患、および肥満そのものの予防・改善薬としての応用が期待できる。
さらに、本発明のポリペプチドのタンパク質リン酸化活性を促進する化合物はＣＲＥ活性化を介した細胞生存活性を阻害し細胞死を引き起こさせる可能性があり、癌への応用が期待される。ＳＩＫ機能阻害剤もしくは促進剤はＳＩＫにより特異的に作用するような状態では、細胞生存に関わるＣＲＥ活性を調節することで脳障害等の予防に役立つものと期待され、アルツハイマー病等への改善効果が期待される。
【配列表】
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Claims (70)

  1. 以下の（Ａ）〜（Ｌ）のいずれか１のポリペプチドと少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその塩。
    （Ａ）配列番号：２で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号：１で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリペプチド；
    （Ｂ）配列番号：２で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号：１で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド；
    （Ｃ）配列番号：４で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号：３で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリペプチド；
    （Ｄ）配列番号：４で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号：３で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド；
    （Ｅ）配列番号６：で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号：５で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリペプチド
    （Ｆ）配列番号：６で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号：５で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド；
    （Ｇ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号：７で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリペプチド；
    （Ｈ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号：７で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド；
    （Ｉ）配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号：９で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリペプチド；
    （Ｊ）配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号：９で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド；
    （Ｋ）配列番号：１２で表されるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号：１１で表される塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリペプチド；
    （Ｌ）配列番号：１２で表されるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号：１１で表される塩基配列にハイブリダイズ可能なｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつｃＡＭＰ応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド。
  2. 温血動物細胞から分離、精製して得られたものである、請求項１に記載のポリペプチドまたはその塩。
  3. 上記動物細胞がマウス由来のものである、請求項２に記載のポリペプチドまたはその塩。
  4. 以下の（ａ）〜（ｍ）のいずれか１のポリヌクレオチドと少なくとも９５％以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド。
    （ａ）配列番号：１で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：１で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
    （ｂ）配列番号：３で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
    （ｃ）配列番号：５で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：５で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
    （ｄ）配列番号：７で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：７で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
    （ｅ）配列番号：９で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：９で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
    （ｆ）配列番号：１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
    （ｇ）配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
    （ｈ）配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
    （ｉ）配列番号：６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
    （ｊ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
    （ｋ）配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
    （ｌ）配列番号：１２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
    （ｍ）（ａ）〜（ｌ）のいずれか１のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチド。
  5. 請求項４に記載のポリヌクレオチドを含有する組換ベクター。
  6. 請求項４に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
  7. 請求項６に記載の発現ベクターを保持する宿主細胞。
  8. 請求項７に記載の宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、得られた培養物からポリペプチドを回収することを含む、請求項１に記載のポリペプチドまたはその塩の製造方法。
  9. 上記宿主細胞の培養を、脂肪分化誘導作用を有する物質の存在下で行う、請求項８に記載のポリペプチドまたはその塩の製造方法。
  10. 前駆脂肪細胞を、脂肪分化誘導作用を有する物質の存在下で培養し、得られた培養物から、請求項１に記載のポリペプチドまたはその塩を回収することを含む、請求項１に記載のポリペプチドまたはその塩の製造方法。
  11. 請求項８〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドまたはその塩の製造方法によって製造されたポリペプチドまたはその塩。
  12. 請求項４に記載のポリヌクレオチド、または請求項１に記載のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの検出に有用な核酸プローブ。
  13. 請求項１に記載のポリペプチドに対して親和性を有する抗体、または該抗体のフラグメント。
  14. 請求項１に記載のポリペプチドに対して親和性を有する抗体を産生するハイブリドーマ。
  15. 請求項１に記載のポリペプチド、または請求項５に記載の組換ベクターを含有する医薬組成物。
  16. 更に、脂肪分化誘導作用を有する物質を含有する、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 脂肪細胞の分化、または糖または脂質の代謝機能亢進が関与する疾患の予防または改善剤として用いられる、請求項１５または１６に記載の医薬組成物。
  18. 上記疾患が、糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化、高尿酸血症または循環器疾患である、請求項１５または１６に記載の医薬組成物。
  19. 請求項４に記載のポリヌクレオチドを含有する遺伝子診断用組成物。
  20. 塩誘導性キナーゼ２をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの発現を検出する、請求項１９に記載の遺伝子診断用組成物。
  21. 脂肪細胞の分化、または糖または脂質の代謝機能不全が関与する疾患の診断に用いられる、請求項１９に記載の遺伝子診断用組成物。
  22. 上記疾患が、糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化、高尿酸血症または循環器疾患である、請求項２１に記載の遺伝子診断用組成物。
  23. 請求項１３に記載の抗体、該抗体のフラグメント、または請求項４に記載のポリヌクレオチドに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチドを含有する医薬組成物。
  24. 脂肪細胞の分化、または糖または脂質の代謝が関与する疾病の予防または改善剤として用いられる、請求項２３に記載の医薬組成物。
  25. 上記疾患が、糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化、高尿酸血症または循環器疾患である、請求項２３に記載の医薬組成物。
  26. 脂肪細胞の分化抑制または脂肪細胞の代謝機能不全が関与する疾患の診断に用いられる、請求項２３に記載の医薬組成物。
  27. 上記疾患が、糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化、高尿酸血症または循環器疾患である、請求項２３に記載の医薬組成物。
  28. 塩誘導性キナーゼ２の発現が低下することによって生じる疾患または生理状態の予防または改善方法であって、
    請求項１５または１６に記載の医薬組成物を投与することを含むことを特徴とする、疾患または生理状態の予防または改善方法。
  29. 上記疾患または生理状態が、糖代謝異常、脂質代謝異常または脳神経障害である、請求項２８に記載の疾患または生理状態の予防または改善方法。
  30. 塩誘導性キナーゼ２の発現が亢進することによって生じる疾患または生理状態の予防または改善方法であって、
    請求項２３に記載の医薬組成物を投与することを含むことを特徴とする、疾患または生理状態の予防または改善方法。
  31. 上記疾患または生理状態が、糖代謝異常、脂質代謝異常または脳神経障害である、請求項３０に記載の疾患または生理状態の予防または改善方法。
  32. 請求項１に記載のポリペプチドを含有する検体を試験化合物と接触させ、請求項１に記載のポリペプチドの活性を促進または阻害する活性を検出する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法。
  33. 請求項１に記載のポリペプチドの自己リン酸化活性および／または他のタンパク質のリン酸化活性を指標として、請求項１に記載のポリペプチドの活性の促進または阻害活性を検出する、請求項３２に記載のスクリーニング方法。
  34. 請求項４に記載のポリヌクレオチド、およびｃＡＭＰ応答配列の制御下にあるレポーター遺伝子を含む発現ベクターを試験化合物と接触させ、請求項１に記載のポリペプチドの活性を促進または阻害する活性を検出する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法。
  35. 請求項１に記載のポリペプチドを試験化合物と接触させ、該試験化合物と該ポリペプチドとの結合を検出し、上記ポリペプチドに対して特異的に結合する化合物を同定する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドに特異的に結合する化合物のスクリーニング方法。
  36. 請求項１に記載のポリペプチドが活性を示す条件下で該ポリペプチドと試験化合物とを接触させ、上記試験化合物の存在下における該ポリペプチドの活性を評価し、上記試験化合物の非存在下における該ポリペプチドの活性と比較し、その比較結果により上記試験化合物の上記ポリペプチドの活性調節能を同定する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドに対する活性調節能を有する化合物のスクリーニング方法。
  37. 請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド検体を該標的ポリヌクレオチドの発現に適した条件下で試験化合物と接触させ、上記標的ヌクレオチドの発現の変化を検出し、上記試験化合物の非存在下および種々の量の存在下における上記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する工程を含むことを特徴とする、請求項４に記載のポリヌクレオチドの発現に影響を与える化合物のスクリーニング方法。
  38. 脂肪分化誘導作用を有する物質の存在下で行う、請求項３２〜３７のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
  39. 試験化合物の存在下、自己リン酸化能を有するタンパク質をリン酸化させるリン酸化工程、
    上記タンパク質のリン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体と、上記タンパク質とを反応させる抗体結合工程、および
    上記タンパク質と上記抗体との反応を測定する測定工程を含むことを特徴とする、自己リン酸化能を有するタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法。
  40. 試験化合物の存在下、塩誘導性キナーゼをリン酸化させるリン酸化工程、
    上記塩誘導性キナーゼのリン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体と、上記塩誘導性キナーゼとを反応させる抗体結合工程、および
    上記塩誘導性キナーゼと上記抗体との反応を測定する測定工程を含むことを特徴とする、塩誘導性キナーゼの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法。
  41. 試験化合物の存在下、請求項１に記載のペプチドをリン酸化させるリン酸化工程、
    上記ポリペプチドのリン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体と、上記ポリペプチドとを反応させる抗体結合工程、および
    上記ポリペプチドと上記抗体との反応を検出する測定工程とを含むことを特徴とする、上記ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法。
  42. 自己リン酸化能を有するタンパク質として、自己リン酸化能を有するタンパク質を産生する能力を有する細胞、または該自己リン酸化能を有するタンパク質の発現ベクターで形質転換された宿主細胞をタンパク質の発現に適した条件で培養し、得られた培養物から得られたポリペプチドを用いる、請求項３９に記載のスクリーニング方法。
  43. 塩誘導性キナーゼとして、塩誘導性キナーゼを産生する能力を有する細胞、または請求項６に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件で培養し、得られた培養物から得られたポリペプチドを用いる、請求項４０に記載のスクリーニング方法。
  44. 上記ポリペプチドまたはその塩として、請求項６に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件で培養し、得られた培養物から得られたポリペプチドを用いる、請求項４１に記載のスクリーニング方法。
  45. 脂肪分化誘導作用を有する物質の存在下で行う、請求項３９〜４４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
  46. 試験化合物の存在下、自己リン酸化能を有するタンパク質を産生する能力を有する細胞を、上記タンパク質の発現に適した条件で培養する工程、
    該細胞を、上記タンパク質のリン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体と接触させ、上記タンパク質と上記抗体とを反応させる抗体結合工程、および
    上記タンパク質と上記抗体との反応を検出する測定工程を含むことを特徴とする、上記タンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法。
  47. 上記細胞の培養を、脂肪分化誘導作用を有する物質の存在下で行う、請求項４６に記載のスクリーニング方法。
  48. 試験化合物の存在下、塩誘導性キナーゼを産生する能力を有する細胞を、塩誘導性キナーゼの発現に適した条件で培養する工程、
    該細胞を、上記塩誘導性キナーゼのリン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体と接触させ、上記塩誘導性キナーゼと上記抗体とを反応させる抗体結合工程、および
    上記塩誘導性キナーゼと上記抗体との反応を検出する測定工程とを含むことを特徴とする、塩誘導性キナーゼの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法。
  49. 上記細胞の培養を、脂肪分化誘導作用を有する物質の存在下で行う、請求項４８に記載のスクリーニング方法。
  50. 試験化合物の存在下、請求項４に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを保持する宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件で培養する工程、
    該宿主細胞を、上記ポリペプチドのリン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体と接触させ、上記ポリペプチドと上記抗体とを反応させる抗体結合工程、および
    上記ポリペプチドと上記抗体との反応を検出する測定工程とを含むことを特徴とする、上記ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法。
  51. 上記細胞の培養を、脂肪分化誘導作用を有する物質の存在下で行う、請求項５０に記載のスクリーニング方法。
  52. 試験化合物の存在下、塩誘導性キナーゼと、塩誘導性キナーゼによってリン酸化される基質とを接触させて該基質をリン酸化させるリン酸化工程、リン酸化された状態の基質を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の基質を認識する抗体と、上記基質とを反応させる抗体結合工程、および上記基質と上記抗体との反応を検出する測定工程とを含むことを特徴とする、塩誘導性キナーゼの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法。
  53. 請求項３２〜５２のいずれか１項に記載のスクリーニング方法によって同定された、請求項１に記載のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物を含有する医薬組成物。
  54. 糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化、高尿酸血症または循環器疾患の予防・治療用化合物を探索するための請求項３２〜５２のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
  55. 請求項１に記載のポリペプチドを含有することを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用キット。
  56. 請求項１に記載のポリペプチド、または他の基質をリン酸化するためのリン酸基供与体を含有する、請求項５５に記載のスクリーニング用キット。
  57. 請求項１に記載のポリペプチドによってリン酸化される基質ポリペプチドを含有する、請求項５５または５６に記載のスクリーニング用キット。
  58. 請求項６に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を含有することを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用キット。
  59. 上記宿主細胞用の培地、ｃＡＭＰ応答配列を活性化するための試薬を含有する、請求項５８に記載のスクリーニング用キット。
  60. 脂肪分化誘導作用を有する物質を含有する、請求項５５〜５９のいずれか１項に記載のスクリーニング用キット。
  61. 自己リン酸化能を有するタンパク質と、リン酸化された上記タンパク質の自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の上記タンパク質の自己リン酸化部位を認識する抗体とを含有することを特徴とする、自己リン酸化能を有するタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用キット。
  62. 塩誘導性キナーゼと、リン酸化された状態の塩誘導性キナーゼの自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない塩誘導性キナーゼの自己リン酸化部位を認識する抗体とを含有することを特徴とする、塩誘導性キナーゼの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用キット。
  63. 請求項１に記載のポリペプチドと、リン酸化された上記ポリペプチドの自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の上記ポリペプチドの自己リン酸化部位を認識する抗体とを含有することを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用キット。
  64. 自己リン酸化能を有するタンパク質を産生する能力を有する細胞と、リン酸化された状態の上記タンパク質の自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の上記タンパク質の自己リン酸化部位を認識する抗体とを含有することを特徴とする、自己リン酸化能を有するタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用キット。
  65. 塩誘導性キナーゼを産生する能力を有する細胞と、リン酸化された状態の塩誘導性キナーゼの自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の塩誘導性キナーゼの自己リン酸化部位を認識する抗体とを含有することを特徴とする、自己リン酸化能を有するタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用キット。
  66. 請求項４に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを保持する宿主細胞と、リン酸化された状態のタンパク質の自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態のタンパク質の自己リン酸化部位を認識する抗体とを含有することを特徴とする、自己リン酸化能を有するタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用キット。
  67. 請求項４に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを保持する宿主細胞と、リン酸化された状態の塩誘導性キナーゼの自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の塩誘導性キナーゼの自己リン酸化部位を認識する抗体とを含有することを特徴とする、塩誘導性キナーゼの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用キット。
  68. 請求項４に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを保持する宿主細胞と、リン酸化された請求項１に記載のポリペプチドを認識する抗体、またはリン酸化されていない請求項１に記載のポリペプチドを認識する抗体とを含有することを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用キット。
  69. 脂肪分化誘導作用を有する物質を含有する、請求項６１〜６８のいずれか１項に記載のスクリーニング用キット。
  70. 請求項１に記載のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、請求項１に記載のポリペプチドの自己リン酸化活性および／または他のタンパク質のリン酸化活性、またはｃＡＭＰ応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を指標として、請求項１に記載のポリペプチドの誘導を促進または阻害する活性を検出する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドの誘導を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法。
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