JP4333862B2 - 後根神経節におけるヒトナトリウムチャンネルの調節 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、テトロドトキシン抵抗性（ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）の新規なヒトナトリウムチャンネルおよびそれに関連するヌクレオチド、並びに、急性若しくは慢性の痛み、あるいはその他の興奮性過敏症の治療に有効な薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイに関する。本出願は、１９９８年１月２９日に出願された米国仮出願６０／０７２９９０、１９９８年１１月２０日に出願された米国仮出願６０／１０９４０２、１９９８年１１月２０日に出願された米国仮出願６０／１０９６６６、１９９９年１月２９日に出願されたＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０２００８、および１９９９年７月１６日に出願された米国特許出願０９／３５４１４７とに関連しており、これらは、その全体が参考文献として本明細書に援用されている。
【０００２】
【従来の技術】
Ａ．ナトリウムチャンネル
電位依存性ナトリウムチャンネルは、特殊化されたタンパク質分子の１種類であり、興奮性細胞（ニューロンおよび筋繊維）に、電気インパルスを引き起こし伝播させる分子バッテリーとして機能している。ラットの脳由来の電位依存性Ｎａ⁺チャンネルは、小孔を形成するａサブユニット（２６０ＫＤａ）と、ａサブユニットの特性を調節し得る２つの補助的サブユニット、ｂ１（３６ＫＤａ）およびｂ２（３３ＫＤａ）との３つのサブユニットからなる。細胞膜を通してＮａ電流を発生させる機能的なチャンネルを形成するには、ａサブユニットのみで十分である（Catterall, (1993) Trends Neurosci. 16, 500-506; Isom et al., (1994) Neuron 12, 1183-1194）。脊椎動物においては９個の別個のａサブユニットが同定されており、これらは、ある拡大している遺伝子ファミリーのメンバーによってコードされている（Goldin (1995) Handbook of receptors and channels (North, editor) CRC Press; Akopian et al., (1996) Nature 379, 257-262; Akopian et al., (1997) FEBS Lett. 400, 183-187; Sangameswaran et al., (1996) J. Biol. Chem. 271, 5953-5956）。また、それらのうちの幾つかに対応したオルソログが、ヒトを含む種々の哺乳類種からクローニングされている。特定のａサブユニットは、組織および発育に対して特異的に発現される（Beckh et al., (1989) EMBO J. 8, 3611-3616; Mandel, (1992) J. Membr. Biol. 125, 193-205）。電位依存性ナトリウムチャンネルのａサブユニットの異常発現パターンまたは変異は、ヒトおよび動物における数々の障害の根底にある（Roden & George, (1997) Am. J. Physiol. 273, H511-H525; Ptacek, (1997) Neuromuscul. Disord. 7, 250-255; Cannon, (1997) Neuromuscul. Disord. 7; 241-249; Cannon, (1996) Trends Neurosci. 19, 3-10; Ruzzo et al, (1996) Eur. Neurol. 36, 3-12）。
【０００３】
電位依存性ナトリウムチャンネルａサブユニットは、その内部ホモロジーは異にするが、同じような予測構造を持つ４つのドメイン（Ｄ１−４）からなり、これらのドメインは、３つの細胞内ループ（Ｌ１−３）により繋がれている。これらの４個のドメインは、細胞膜にたたみ込まれてチャンネルを形成している。このチャンネルは、小孔を介して細胞質と細胞外との両方に開く。その小孔は、細胞膜の生理学的状態に応じて開いたり閉じたりする。
【０００４】
それぞれのドメインは、６個の膜貫通セグメント（Ｓ１−６）からなり、これらのセグメントは、細胞内および細胞外リンカーで、そのタンパク質分子を細胞膜に織り込んでいる。これら４個のドメインにおけるＳ５−Ｓ６セグメントのリンカーは、チャンネルの小孔に並ぶ配列および高度に保持されたアミノ酸のサブセットを含んでいる。このサブセットは、ナトリウムイオンをチャンネルの小孔を介して選択的に細胞質内へ移動させ、それによって電流が生じるようフィルターとして働いている。４個のドメインのそれぞれにある両親媒性のＳ４セグメントは、３個のアミノ酸毎に繰り返される塩基性残基に富んでおり、電圧センサーとして働き、細胞膜内外の電圧差の違いから形態的変化を起こす。この変化が、また、細胞外Ｎａ⁺イオン勾配に対し小孔が開くよう、そのタンパク質に形態的変化を引き起こす。
【０００５】
もっとも知られた電位依存性ナトリウムチャンネルａサブユニットでは、小孔の開口（活性化）後、数ミリ秒内で、チャンネルは急速に閉まり、不作動状態（不活性）に変化する。一方、ＳＮＳタイプのチャンネルは、ゆっくりと不活性化し、活性化にはより大きな電圧変化を必要とする。ドメインＤ３とＤ４をつなぐループであるＬ３は、活性化後に小孔を閉じてチャンネルを不活性状態に誘発させる細胞内プラグとして働くトリペプチドを含んでいる。不活性化の後、これらのチャンネルは更に形態変化を起こし、独自の静止状態を回復し、次の活性化に応じられるようになる。この期間は、不活性化からの回復（リプライミング）と言われる。異なるチャンネルは、異なった速度でリプライムし、ＳＮＳにおけるリプライミングは、比較的早い。
【０００６】
電位依存性ナトリウムチャンネルファミリーは、アミノ酸の類似性に基づいて、さらに２つのサブファミリーに区分される（Felipe et al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 30125-30131）。クローニングされた９個のチャンネルのうち８個は、サブファミリー１に属する。これらのチャンネルは、特にそれらのＳ４細胞膜セグメントにおいて、多くの構造上の特徴を共有している。しかしながら、その幾つかのチャンネルは、不活性化およびリプライミングに対し、別個の動的特性を持っていると示されている。異形型チャンネルとも言われるただ１個のサブファミリー２のチャンネルのみが、ヒト、ラットおよびマウスの組織において同定されている。このサブファミリーは、主に、Ｓ４セグメントにおける減少した数の塩基性残基で特徴づけられており、よって、サブファミリー１に比較し、違った膜電圧依存性を持つだろうと予測されている。サブファミリー２チャンネルの生理学的機能については、その電気生理学的特性が未だ解明されておらず、現在のところ知られていない。
【０００７】
神経毒であるテトロドトキシンにより、電位依存性ナトリウムチャンネルを遮断することは、感受性（ＴＴＸ−Ｓ）および抵抗性（ＴＴＸ−Ｒ）表現型とに、これらのチャンネルを機能的に分類することに役立ってきた。これまでに、哺乳類の２つのＴＴＸ−Ｒ性チャンネルが同定されており、そのうちの１つは、心筋および中枢神経系内の非常に限られた部位に特有のものであり、２つ目のＴＴＸ−Ｒ性チャンネルであるＳＮＳは、後根神経節および三叉神経節の末梢ニューロンに制限されている。ＴＴＸに対し抵抗性または感受性を授与する特定のアミノ酸残基は、チャンネル小孔のイオン選択性フィルターに局在化されている。また、ＳＮＳチャンネルについては、国際特許出願ＷＯ９７／０１５７７に記載されている。
【０００８】
Ｂ．疾病状態におけるナトリウムチャンネルの役割
Ｎａチャンネルａサブユニットのアイソタイプが異なると、それが示す動的特性および電圧依存性が異なるので、興奮性の細胞の興奮特性は、細胞が発現するチャンネルの種類の精密な混和に依存する。心筋および骨格筋ａサブユニットの突然変異体が、数々の筋肉障害を起こすと示されてきた。その数例が、次に挙げてある。骨格筋チャンネルのＳ４における、ただ１つの塩基性アミノ酸残基の変化は、このチャンネルの動的特性を変え、多くの患者に疾病状態を誘発するのに十分である。心筋チャンネルのＬ３におけるトリペプチド（不活性化ゲートに隣接している）の欠失は、長期ＱＴ症候群と呼ばれる心臓障害を誘発する。チャンネルの小孔に並ぶ領域であるＳｃｎ８ａのドメイン１のＳ５−Ｓ６リンカーにおける、単一のアミノ酸の変化は、マウス突然変異体"Ｊｏｌｔｉｎｇ"を引き起こす。他の突然変異によるこのチャンネルの完全な欠損は、マウスにおけるモーターエンドプレート"ｍｅｄ"障害を引き起こす。この突然変異は、運動ニューロンから神経が分布した筋肉への刺激損失として特徴づけられる。
【０００９】
Ｃ．ナトリウムチャンネルと痛み
軸策損傷（軸策とも呼ばれる神経繊維への損傷）は、慢性の痛み（神経障害痛と言われる）を引き起こす。数々の研究が、軸策損傷後における、ニューロン体および樹状突起の変えられた興奮性を示しており（Eccles et al., (1958) J. Physiol. 143: 11-40; Gallego et al., (1987) J. Physiol. (Lond) 391, 39-56; Kuno & Llinas, (1970) J. Physiol. (Lond) 210, 807-821）、軸策損傷に引き続き、ニューロン体および樹状突起上のＮａ⁺チャンネル密度に変化が起こることが明らかになっている（Dodge & Cooley, (1973) IBM J. Res. Dev. 17, 219-229; Titmus & Faber (1986) J. Neurophysiol. 55, 1440-1454; Sernagor et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7966-7970）。また、ニューロンにおいて異種のナトリウムチャンネルが異常に混合されて発現されると、異常な興奮につながり（Rizzo et al., (1996) Eur. Neurol. 36, 3-12）、興奮性過敏症状、感覚異常症、または痛みの一因となり得る。
【００１０】
ラットＤＲＧニューロンを使った最近の研究において、ＴＴＸ−Ｒ性およびＴＴＸ−Ｓ性電流の発現プロフィール、並びにＤＲＧニューロンにおいてこれらの電流の原因となるチャンネルをコードするｍＲＮＡの転写物数が、種々の障害に引き続き、劇的に変化することが示されてきた（Rizzo et al., (1995) Neurobiol. Dis. 2: 87-96; Cummins et al., (1997) J. Neurophysiol. 17, 3503-3514; Dib-Hajj et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14950-14954）。例えば、同定された感覚系皮膚求心性ニューロンにおいて、軸策損傷後に、ゆっくりと不活性化するＴＴＸ−Ｒ性電流が減衰し、それと同時に、急速に不活性化するＴＴＸ−Ｓ性Ｎａ⁺電流が増強することが示されてきた（Rizzo et al., (1995) Neurobiol. Dis. 2, 87-96）。また、痛い刺激に反応する(痛み)ニューロンにおいて、軸策損傷後に、ゆっくりとリプライムするＴＴＸ−Ｓ性電流とＴＴＸ−Ｒ性電流がなくなり、急速にリプライムするＴＴＸ−Ｓ性電流が増大することが示されてきた（Dib-Hajj et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14950-14954）。また、ＳＮＳ転写の下位調節（ダウンレギュレート）およびそれと同時に起こるα−ＩＩＩ転写の上位調節（アップレギュレート）が示されている（Cummins & Waxman (1997) . Neurophysiol. 17, 3503-3514）。ａＩおよびａＩＩｍＲＮＡｓの濃度がゆるやかに上昇することも、軸策損傷に関連している（Waxman et al., (1994) J. Neurophysiol. 72, 466-470）。ナトリウムチャンネルプロフィールのこうした変化は、軸策損傷後に患者が被る神経障害痛の根底にある異常なニューロン興奮の一因と思われる。
【００１１】
痛みに関連する炎症（炎症性の痛みと言われる）も、痛みに反応するＤＲＧニューロンにおけるナトリウム電流プロフィールに変化を引き起こす。炎症性の調節子は、培養系で、痛みに反応するＤＲＧニューロンのうち小さなＣタイプのものにおいて、ＴＴＸ−Ｒ性電流を上位調節する（Gold et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1108-1112; England et al., (1996) J. Physiol. 495, 429-440）。このような調節子の急速な働きは、それらの働きが、存在しているＴＴＸ−Ｒ性チャンネルの翻訳後の修飾を含むことを示している。また、炎症により、ＴＴＸ−Ｒ性Ｎａ⁺電流が増加し、ＣタイプのＤＲＧニューロンのＳＮＳ転写が上位調節されることが決定されている（Tanaka et al., (1998) Neuroreport. 9, 967-972）。本明細書のデータは、ナトリウム電流プロフィールの変化が、炎症により引き起こされた痛みの一因であることを提案している。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
Ｄ．慢性の痛みに対する治療
様々な種類の薬（フェニトインおよびカルバマゼピンのような抗痙攣剤、メキシチーネのような抗不整脈剤、リドカインのような局所麻酔薬）が、Ｎａ⁺チャンネルに作用する。様々なＮａ⁺チャンネルは、異なる特性を持つナトリウム電流を引き起こすので、特定チャンネルのサブタイプを選択的に遮断または活性化（またはその他の調節）することには、重要な治療価値があると期待される。さらに、特定の種類のニューロンにおける、ある種のａ−サブユニットのアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）（ＰＮ１、ＳＮＳ、ＮａＮ）の選択的な発現は、それらの性質を選択的に変えるための手段を提供する。
【００１３】
ＤＲＧの痛みに反応するニューロンは、ＰＮＳにおいてのＴＴＸ−Ｒ性Ｎａ⁺電流の主な供給源である。したがって、ＴＴＸ−Ｒ性電流を引き起こすＮａ⁺チャンネルは、痛みを引き起こすニューロンの操作にとって、比較的特異的なターゲットを提供する。このようなＤＲＧニューロンの、ある１つのＴＴＸ−Ｒ性チャンネル（ＳＮＳ）の分子構造は、これまでに同定されているが、本発明以前には、他のＴＴＸ−Ｒ性チャンネルがこれらのニューロンに存在するかどうか、決定されていない。もし、このようなチャンネルが同定されるとすれば、それらは、痛みに反応するニューロンにおいて選択的に発現されるターゲット分子として、理想的な候補物であり、また、それらの調節は痛みの伝達を弱め得る。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、後根神経節または三叉神経節において選択的に発現される、電位依存性Ｎａ⁺チャンネル（ＮａＮチャンネル）をコードする単離された核酸分子を含む。（本発明者等の本出願に先行する米国仮出願６０／０７２９９０においては、このＮａＮチャンネルは、ＮａＸと言われた）。好ましい実施の形態においては、前記の単離された核酸分子は、図１（配列番号１）、図７Ａ（配列番号４）、図８Ａ（配列番号６）、図１１Ａ（配列番号４１）に示される配列、この配列の対立遺伝子変異体（ａｌｌｅｉｃ ｖａｒｉａｎｔ）、またはストリンジェントな条件下で前記の配列にハイブリダイズする核酸分子を含む。
【００１５】
その他の実施の形態においては、本発明は、後根神経節または三叉神経節において選択的に発現される電位依存性Ｎａ⁺チャンネルをコードする単離された核酸分子単独からなる発現ベクター、または、前記の単離された核酸分子に適当な調節および発現制御要素が備わった発現ベクターを含む。好ましい実施の形態においては、発現ベクターは、図１（配列番号１）、図７Ａ（配列番号４）、図８Ａ（配列番号６）、図１１Ａ（配列番号４１）に示される配列、この配列の対立変異体、またはストリンジェントな条件下で前記の配列にハイブリダイズする核酸分子を有する単離された核酸分子を含む。
【００１６】
さらに、本発明は、後根神経節または三叉神経節において選択的に発現される、適当な調節および発現制御要素を備えた、電位依存性Ｎａ⁺チャンネルをコードする単離された核酸分子を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を含む。好ましい実施の形態においては、発現ベクターは、図１（配列番号１）、図７Ａ（配番号４）、図８Ａ（配列番号６）、図１１Ａ（配列番号４１）に示される配列、この配列の対立変異体、またはストリンジェントな条件下で前記の配列にハイブリダイズする核酸分子有する単離された核酸分子を含む。
【００１７】
また、本発明は、後根神経節または三叉神経節において選択的に発現される、単離された電位依存性Ｎａ⁺チャンネルを含む。好ましい実施の形態においては、このチャンネルは、図２（配列番号３）、図７Ｂ（配列番号５）、図８Ｂ（配列番号８）または図１１Ｂ（配列番号４２）に示されるアミノ酸配列を有し、または図２（配列番号３）、図７Ｂ（配列番号５）、図８Ｂ（配列番号８）または図１１Ｂ（配列番号４２）に示される配列、この配列の対立遺伝子変異体、またはストリンジェントな条件下で前記の配列にハイブリダイズする核酸分子でコードされている。このチャンネルのペプチドフラグメントも、本発明に含まれる。
【００１８】
本発明の他の局面は、ＮａＮチャンネルの活性を調節する薬剤を同定する方法であって、前記薬剤を、その表面にＮａ⁺チャンネルを発現している細胞に接触せしめ、脱分極化または結果として起こるナトリウム電流の変化を測定する工程を含む。この測定工程は、電圧クランプ測定法により、脱分極化および細胞内ナトリウムレベルを測定することにより、またはナトリウムの流入を測定することにより達成される。
【００１９】
本発明の他の局面は、ＮａＮチャンネルをコードするｍＲＮＡの転写または翻訳を調節する薬剤を同定する方法である。この方法は、前記薬剤を、その表面にＮａ⁺チャンネルを発現している細胞に接触せしめ、その結果生じるナトリウムチャンネルの発現レベルを測定する工程を含む。
【００２０】
また、本発明は、ＤＲＧニューロンまたは三叉ニューロン中のＮａＮチャンネルを介して流れるＮａ⁺電流を調節（例えば抑制または増強）することが可能な薬剤の有効量を投与することによって、動物またはヒト検体において、痛み、感覚異常症および興奮性過敏症を治療するための方法を含む。この方法には、ＮａＮチャンネルをコードするｍＲＮＡの転写または翻訳を調節することが可能な薬剤の有効量を投与することが含まれてもよい。
【００２１】
本発明の他の局面は、上述した核酸に対してアンチセンスである単離された核酸である。好ましい実施の形態においては、アンチセンス核酸は、ＮａＮチャンネルｍＲＮＡの発現を、そのｍＲＮＡを含む細胞において調節するのに十分な長さのものである。
【００２２】
本発明の他の局面は、ＮａＮＮａ⁺チャンネルに特異的な標識モノクローナル抗体または他の標識リガンドを投与することによって、動物またはヒト検体において、ＤＲＧニューロンまたは三叉ニューロンに媒介されて起こる興奮性神経過敏症に関連する痛みのレベルの尺度を提供するするための、または、痛みの発生の遺伝子座を画像化するためのシンチグラフィー法である。
【００２３】
本発明の他の局面は、ＮａＮナトリウムチャンネルを発現する組織、細胞および細胞種を同定する方法である。この方法は、細胞表面で、細胞表面へ行く途中で、またはＮａＮをコードするｍＲＮＡの存在下で、ＮａＮを検出する工程から成る。
【００２４】
さらに、本発明は、ＮａＮをコードする外因性核酸を発現する形質転換された細胞を製造する方法を含む。この方法は、適当な調節および発現制御要素とともに、図１、図７Ａ、図８Ａまたは図１１Ａに示される配列、この配列の対立遺伝子変異体、またはストリンジェントな条件下で前記の配列にハイブリダイズする核酸分子を有する単離された核酸分子を含むベクターで細胞を形質転換する工程を含む。また、本発明は、組換えＮａＮタンパク質を製造する方法を含み、この方法は、ＮａＮナトリウムチャンネルまたはタンパク質が発現される条件下で、形質転換された宿主を培養し、ＮａＮタンパク質を回収する工程を含む。
【００２５】
また、本発明は、ＮａＮチャンネルまたはそのポリペプチドフラグメントに特異的な、単離された抗体を含む。単離された抗体は、標識されていてもよい。
【００２６】
本発明の他の局面は、軸策切断された、炎症を起こした、さもなければ損傷したＤＲＧニューロン、または高周波数で興奮するようになった正常なＤＲＧニューロンにおいて、急速にリプライミングするナトリウム電流の流れを減少させることが可能な薬剤の有効量からなる治療的組成物を含む。また、本発明は、動物またはヒト患者において、前記の治療的組成物を投与することによって、急性の痛み、急性若しくは慢性の神経性または炎症性の痛み、および興奮性過敏症状を治療する方法を含む。
【００２７】
また、本発明は、痛みおよび興奮性過敏症の症状の治療に用いる候補化合物をスクリーニングする方法を含む。この方法は、軸策切断された、炎症を起こした、さもなければ損傷されたＤＲＧニューロンにおいて、ＮａＮチャンネルのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現または活性を変化させる前記の候補化合物の能力を試験することによる。
【００２８】
【発明の実施の形態】
本発明は、出願人等によって発見され、ＮａＮと名づけられた新規な遺伝子に関する。ＮａＮは、以前には同定されていなかった、ここではＮａＮと言われるタンパク質をコードしている。ＮａＮは、ａサブユニット電位依存性ナトリウムチャンネルタンパク質ファミリーに属し、ＴＴＸ−Ｒ性のナトリウム電流を引き起こす。このようなチャンネルは、ニューロンおよび筋繊維のような興奮性の細胞において、インパルスの発生と伝播の根底にある。ＮａＮは、新規なナトリウムチャンネルであり、これまでに同定された他のチャンネルとは別個の配列を持つ。他のニューロンでなく感覚ニューロンで発現されるという、この選択的なＮａＮの発現は、急性および／または慢性の痛み病理に関連した診断上および／または治療上の使用にとって、このチャンネルを有効なターゲットとしている。
【００２９】
Ａ．定義
本明細書においては、幾つかの技術的用語および語句を使い、それらは、以下の意味を持つこととする。
【００３０】
語句「調節する」または「変える」とは、特定の受容体、リガンドまたは電流の流れの量と活性を上位または下位調節することを言う。例えば、薬剤は、Ｎａ⁺電流を抑制（減少）または増強（増加）することにより、Ｎａ⁺電流を調節し得る。同様に、薬剤は、ＮａＮナトリウムチャンネルの発現量、または発現するＮａＮチャンネルの活性を調節し得る。
【００３１】
語句「ナトリウム電流」または「Ｎａ⁺電流」とは、特定のイオン、この場合はナトリウムイオンに対し、選択的に透過性のチャンネル（特殊化されたタンパク質）を介して起こる、細胞膜を横切るナトリウムイオンの流れを意味する。
【００３２】
語句「電位依存性」とは、細胞膜が特定の電圧範囲にあるとき、イオンチャンネルが開くことを意味する。電圧感受性ナトリウムチャンネルは、細胞膜が脱分極化された時に開く。その後、これらのチャンネルは、Ｎａ⁺イオンを細胞内へ流れ込ませ、脱分極化を更に進める。これにより、細胞は、電気インパルス（活動電位としても知られる）を引き起こす。
【００３３】
語句「急速にリプライムする」とは、他の電位依存性ナトリウムチャンネルのファミリーメンバーに比べ、電流が、より急速に不活性化から回復することを意味する。
【００３４】
用語「ＴＴＸ−Ｒ」または「ＴＴＸ−Ｓ」とは、細胞膜を渡っての電流の流れが、約１００ｎＭのテトロドトキシン（特定種において生産される神経毒）濃度に対して、それぞれ抵抗性または感受性であることを意味する。
【００３５】
語句「末梢神経系（ＰＮＳ）」とは、脳および脊髄以外の神経系部分を意味し、例えば脊根およびそれに関連する後根神経節（ＤＲＧ）および三叉神経節などの神経節、ならびに末梢神経繊維についていう。
【００３６】
語句「Ｎａ⁺電流を抑制する」とは、薬剤が、それにさらされていない対照細胞と比較し、電流の流れを減少させることを意味する。好ましい抑制剤は、他のナトリウムチャンネルの電流に影響すること無く、選択的にこのような電流を抑制する。さもなければ、その抑制剤は、他のチャンネルに比べ、関心のチャンネルを流れるナトリウム電流を、非常に大きな程度で抑制する。
【００３７】
語句「Ｎａ⁺電流を増強する」とは、薬剤が、それにさらされていない対照細胞と比較し、電流の流れを増強させることを意味する。好ましい増強剤は、他のナトリウムチャンネルの電流に影響すること無く、選択的にこのような電流を増大する。さもなければ、その増強剤は、他のチャンネルに比べ、関心のチャンネルを流れるナトリウム電流を、非常に大きな程度で増大する。
【００３８】
語句「特異的にハイブリダイズする」とは、例えば配列番号１、４、６または４１のＤＮＡ配列のようなＮａＮナトリウムチャンネルをコードする核酸に、非常にストリンジェントな条件で、または中程度にストリンジェントな条件で、ハイブリダイズする核酸について言う。
【００３９】
語句「単離された核酸」とは、他のペプチドをコードする核酸の夾残物に比べ、実質的に精製されたか、または、それらから分離された核酸のことを言う。核酸とは、ｃＤＮＡ分子およびアンチセンスＲＮＡ分子を含む全てのＤＮＡおよびＲＮＡ型を意味する。
【００４０】
語句「ＲＴ−ＰＣＲ」とは、リバーストリプターゼ酵素を使ったＲＮＡの逆転写（ＲＴ）に引き続き起こる、特定のｃＤＮＡテンプレートについての、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使った増幅工程を意味する。ＰＣＲは、遺伝的または遺伝子に特定的なプライマーおよび熱的に安定なＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、を必要とする。
【００４１】
語句「選択的に発現される」とは、電位依存性ナトリウムチャンネルが、他の組織に比べある限定された組織において、多量に検出され発現されることを意味する。例えば、後根神経節または三叉神経節において、選択的に発現される電位依存性Ｎａ⁺チャンネルは、他の組織や細胞種と比べ、後根神経節または三叉神経節において、より大量に検出される。電位依存性Ｎａ⁺チャンネルの量は、特異的なＲＮＡ量の検出および特定の抗体を使ったチャンネルタンパク質の検出を含む、利用可能などんな方法によっても検出できる。
【００４２】
Ｂ．ＮａＮナトリウムチャンネルの特性付け
本発明は、これまでに同定されることが無かった電位依存性ナトリウムチャンネルａサブユニット（ＮａＮ）に関する。ＮａＮは、ＴＴＸ−Ｒ性の電位依存性チャンネルであり、また、身体（後根神経節またはＤＲＧ）および顔(三叉神経節)へ入っていく感覚ニューロンにおいて選択的に発現されていると予測されている。ＮａＮタンパク質分子をコードする配列部分である、オープンリーディングフレームは、図２（配列番号３）、図７Ｂ（配列番号５）、図８Ｂ（配列番号８）または図１１Ｂ（配列番号４２）に示されているその推定上のアミノ酸配列を使い、異なる動物種（ラット、マウス、ヒト）から決定されている。
【００４３】
電位依存性ナトリウムチャンネルの適切なランドマーク配列の全てが、ＮａＮの予測された位置に存在しており、このことは、ＮａＮがナトリウムチャンネルファミリーに属することを指し示す。しかし、ＮａＮは、これまでに同定されてきた全てのナトリウムチャンネルとは異なり、それらとは、５３％以下の配列上の同一性を共にしている。ＮａＮは、ＰＮＳにおいて本発見以前に同定されたＮａ⁺チャンネルサブユニットであり唯一他のＴＴＸ−Ｒ性のものであるＳＮＳとも異なる。発明者等は、ＳＮＳに基づく若しくは特異的であるプライマーまたはプローブを使うこと無しに、ＮａＮを同定しクローニングした。さらに、ＮａＮとＳＮＳは、その予測されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、ほんの４７％の類似性を共有し、これは、全てのサブファミリー１メンバーに対するＮａＮの限られた類似性に比較される。
【００４４】
現存しているａサブユニットに対する配列類似性の低さから、ＮａＮが新規な遺伝子であり、現存しているチャンネルの単なる変異体でないことが、明らかに確認される。他の電位依存性チャンネルに比較しての配列の違いは、ＮａＮが新規でありこれまでに同定されていないようなプロトタイプであり、ＳＮＳと比べて異なった特性を持つ三番目の種類のＴＴＸ−Ｒ性チャンネルであろうことを示唆している。痛みに反応するＤＲＧニューロンおよび三叉ニューロンにおいて存在するＮａＮとＳＮＳは、薬学的な介入に対し異なって反応しうる。感覚性のＤＲＧニューロンおよび三叉ニューロンにおけるＮａＮの選択的な発現は、脳および脊髄における他のニューロンに影響すること無く、選択的にこれらの感覚ニューロンの性質を変えるターゲットを提供する。痛みに反応するＤＲＧニューロンに特徴的であり、痛みのメッセージの伝播と神経損傷後およびその他の痛みの状態における異常な興奮パターンに寄与している、ＴＴＸ−Ｒ性電流の機能調節のためにデザインされた薬の効果を、より完璧に理解するためには、ＮａＮチャンネルの性質をさらに解明することが重要である。
【００４５】
Ｃ．ＮａＮ核酸
本発明の核酸分子は、図１、図７Ａ、図８Ａおよび図１１Ａに示されたヌクレオチド配列、並びに図２、図７Ｂ、図８Ｂおよび図１１Ｂのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。また、本発明の請求項にかかる核酸は、図１、図７Ａ、図８Ａおよび図１１Ａに示されたヌクレオチド配列からなる核酸と、または図２、図７Ｂ、図８Ｂおよび図１１Ｂのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる核酸とに、特異的にハイブリダイズする核酸を含む。そのヌクレオチド配列からなる核酸に、特異的にハイブリダイズする核酸は、非常にストリンジェントな条件下、または中程度にストリンジェントな条件下で、前記の核酸に安定して結合している。非常にストリンジェントな条件、または中程度にストリンジェントな条件とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（(1989) Molecular Cloning ？ A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press）またはＡｕｓｕｂｅｌ等（(1995) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing）によって、一般的に定義され利用されているものである。ストリンジェンシーの正確なレベルは、重要でなく、むしろ、選択的なハイブリダイゼーションが起こった時、明瞭で検出可能な信号が提供される条件を選択すべきである。
【００４６】
ハイブリダイゼーションは、配列同一性（ホモロジー）、配列のＧ＋Ｃ含有量、緩衝液塩の含有量、配列の長さおよび二重溶解温度（Ｔ[ｍ]）の関数である（Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press参照）。配列長、緩衝液塩の濃度および温度の類似性は、ハイブリダイゼーション法により、配列の同一性（ホモロジー）を評価するにあたり、有効な変数を提供する。例えば、少なくとも９０％のホモロジーがあれば、一般に、ハイブリダイゼーションは、２０ＸＳＳＣから希釈された６ＸＳＣＣのような緩衝液塩中で６８℃で行われる（Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning ？A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press参照）。最終のサザンブロット洗浄用の緩衝液塩が、例えば、０．１ＸＳＳＣのような低濃度で、例えば、６８℃のような高温において使われると、二つの配列はハイブリッド二重鎖（ハイブリダイズ）を形成する。上記のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を共に使用することは、高度のストリンジェンシーまたは高度にストリンジェントな条件であると定義される。中程度にストリンジェントな条件は、二つの配列が少なくとも約８０％のホモロジーを持つときに、使用され得る。ここで、ハイブリダイゼーションは、６ＸＳＳＣを使い約５０〜５５℃の温度で行われる。最終の洗浄には、約１〜３ＸＳＳＣの塩濃度と、約６０〜６８℃の温度とが使われる。これらのハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、中程度にストリンジェントな条件を定義する。
【００４７】
特に、特異的なハイブリダイゼーションは、２つの核酸分子の間に高度な相補性があるというの条件下で起こる。特定のハイブリダイゼーションにおいては、一般に、相補性は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％であり、好ましくは、約９０〜１００％、さらに好ましくは、約９５〜１００％である。配列番号４１および配列番号４２のヒトＮａＮ配列に関して言えば、好ましい相同（ホモロガス）配列とは、一般的には、配列番号４２に対して、少なくとも８１％のアミノ酸配列類似性または少なくとも７５％若しくは７６％の配列同一性を示すＮａＮタンパク質をコードするものである。
【００４８】
個々で使用されているホモロジーまたは同一性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）分析によって決定される（Karlin et al. (1990) Proc. Natl. Acd. Sci. USA 87, 2264-2268および Altschul, (1993) J. Mol. Evol. 36, 290-300、両者とも、参考文献として本明細書に援用されている）。ＢＬＡＳＴ分析は、配列の類似性捜索用に作られ、プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘによって利用されたアルゴリズムを使用している。ＢＬＡＳＴプログラムによって使われるアプローチは、疑問の配列とデータベース配列の間の類似したセグメントを最初に考慮し、次に、同定された全ての対の統計学的有意性を評価し、最後に、前もって選択されている有意性の閾値を満足する対にだけ約言する。配列データベースの類似性捜索における基本問題の論議については、本明細書に参考文献として援用されているＡｌｔｓｃｈｅｌ等の文献（Nat. Genet. (1994) 6, 119-129）を参照する。ｈｉｓｔｏｇｒａｍ、ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ、ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ、ｅｘｐｅｃｔ（例えば、データベース配列に対するマッチを報告するための統計上の有意性閾値）、ｃｕｔｏｆｆ、ｍａｔｒｉｘ、ｆｉｌｔｅｒの捜索パラメータは、デフォルトセッティングのままである。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘによって使われるデフォルトのスコアマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスであり、本明細書に参考文献として援用されている（Henikoff et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919）。ｂｌａｓｔｎについては、スコアマトリックスは、Ｍ（例えば、マッチする残基の一対に対する報酬スコア）とＮ（例えば、ミスマッチする残基の一対のためのペナルティスコア）の比によってセットされ、ＭおよびＮのデフォルト値は、それぞれに５および−４である。
【００４９】
本発明の核酸は、本発明に従う様々な方法において使われ得る。例えば、これらの核酸は、相同性のＮａＮ配列をコードする他のＤＮＡ配列を、ハイブリダイゼーションにより選択するために、他のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのライブラリーをスクリーニングするための核酸プローブとして使われる。意図される核酸分子としては、放射性ヌクレオチドで、または非放射性法（例えば、ビオチン）で、ラベルされたＲＮＡまたはＤＮＡがある。スクリーニングは、近く関連する相同体または遠く関連する相同体を単離するために、様々なストリンジェンシー（イオン強度と、温度と、および／もしくはフォルムアミドの存在との普通のコンビネーションを使って、ハイブリダイゼーションＴｍ操作を通じ）の下で行われる。また、これらの核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使って、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを増幅するプライマーを生産するために使われる。さらに、本発明の核酸配列は、例えば、ＮａＮの制御要素であり側面に位置する配列のような、ゲノムにおける隣接する配列を同定するために使われる。また、これらの核酸は、ＮａＮの遺伝子発現のレベルを調節するために利用され得るアンチセンスプライマーまたは構築物を生産するために使われる。そのアミノ酸配列は、ＮａＮに特異的で、ＮａＮを特異的な細胞に局所化でき、細胞表面でＮａＮチャンネルの機能を調節できる抗体をデザインし製造するために使われる。
【００５０】
また、本発明の核酸分子には、組換えにより調製された変質（altered）ＮａＮ配列が含まれる。例えば、融合タンパク質は、本明細書において開示されたオープンリーディングフレームまたはその機能的断片、および、いかなる利用可能な融合タンパク質を使って調製される。また、キメラなＮａＮタンパク質（例えば、異種からの個々のドメインを含むキメラなタンパク質）をコードする核酸分子を調製することもできる。これらのキメラなタンパク質には、マウス若しくはラットのドメインを含むヒトＮａＮキメラ、または、ヒトのドメインを含むマウス若しくはラットのキメラが含まれるが、それらに限定されるものではない。好ましいキメラとしては、ヒトＮａＮのアミノ酸６７０に相当する残基を取り巻いているラット若しくはマウスのドメインを有するヒトＮａＮがある。
【００５１】
Ｄ．ベクターと形質転換された宿主細胞
また、本発明は、適応性のある宿主細胞の中でナトリウムチャンネルをコードする核酸の発現を、複製および指示することが可能な組換えベクターからなる。例えば、本発明に従い、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのような酵素を使って、ＤＮＡをベクターへ挿入することは、いろいろな従来の方法によっても行うことができる。このようなＤＮＡの挿入は、ＤＮＡと望ましいベクターが同じ制限酵素によって切られていれば、相補的ＤＮＡ末端が作製されるので、簡単に遂行できる。もし、そうでなければ、ＤＮＡのシングルストランドを消化することによって作製された切断末端を修飾し、ブラント（平滑）末端を作製する必要がある。または、適当なＤＮＡによりシングルストランド末端を埋めて同じ結果を成し遂げる必要がある。このようにして、ブラント末端連結反応が行われる。代わりとして、いろいろな望ましい位置が、ヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端に連結することによって作製される。このようなリンカーは、制限位置認識配列をコードする特異的オリゴヌクレオチドからなる。
【００５２】
利用可能ないろいろなベクターおよび適応性のある適当な宿主細胞が使われる（Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning ？ A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press; Ausubel et al., (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing）。商業的に利用可能なベクターには、例えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社または他の供給源から入手可能なものが含まれる。
【００５３】
本発明のｒＤＮＡ（組換えＤＮＡ）分子による、適当な宿主細胞の形質転換は、一般に、使われたベクターの種類と宿主システムに依存する周知の方法によって成される。カエルの卵胞子にＲＮＡが挿入されると、チャンネルを発現する。しかし、哺乳類細胞系における発現のほうが、好ましい。原核生物の形質転換に関しては、電気的ポーレーションおよび塩処理法が、一般的に利用される（例として、Cohen et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110-2114; および Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning ？ A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press を参照）。ｒＤＮＡを含むベクターを使って脊椎動物の細胞を形質転換することに関しては、電気的ポーレーション、カチオン性脂質または塩処理法が、一般的に利用される（Graham et al., (1973) Virology 52, 456-467; Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76, 1373-1376）。
【００５４】
上手く形質転換された細胞、つまり本発明のｒＤＮＡ分子を含む細胞は、周知の技術により同定できる。例えば、本発明のｒＤＮＡが導入された細胞は、単一コロニーを作製するようクローニン化されうる。これらのコロニーから細胞は、収穫され、溶解され、それらのＤＮＡ含有物は、ｒＤＮＡの存在を確かめるため、従来法により調べられる（Southern, (1975) J. Mol. Biol. 98, 503-517）。または、細胞によって製造されたタンパク質は、免疫学的手法により、アッセイされる。もし、組換えＤＮＡの構築に、緑蛍光タンパク質のような標識が利用されるとすると、このような細胞の蛍光によって細胞を区分けすることから、感染された細胞をインビボで検出できる。
【００５５】
組換えチャンネルの一過性の発現については、Ｎａ⁺電流または細胞内Ｎａ⁺量の測定するための形質転換された宿主細胞は、一般に、りん酸カルシウム塩沈降法を使い、蛍光性レポータープラスミドで、ＨＤＫ２９３細胞のような細胞を、構築物で感染させることにより調製する（Ukomadu et al., (1992) Neuron 8, 663-676）。ＨＥＫ２９３細胞は、１０％の胎児牛血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で補充された高濃度のグルコースを含むＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中で成長する。４８時間後、緑蛍光を示す細胞を、記録のために選択する（Dib-Hajj et al., (1997) FEBS Lett. 416, 11-14）。
【００５６】
組換えチャンネルを常時発現している細胞系の調製については、ＮａＮ構築物を哺乳類細胞の選択的マーカーを有する他のベクターへクローニングする。形質転換は、りん酸カルシウム沈殿法により行われる（Ukomadu et al., (1992) Neuron 8, 663-676）。ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ−２９３）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、その他の適した細胞系を、１０％の胎児牛血清で補充したＤＭＥＭ培地で、標準的な培養の条件下で成長させる。この細胞培養培地に、りん酸カルシウムとＤＮＡの混合物を加え、１５〜２０時間経過した後、細胞を新鮮な培地で洗浄する。４８時間後、ネオマイシン抵抗性を獲得した細胞を選択するため、抗生物質（Ｇ４１８）を加える。２−３週間後、Ｇ４１８を加えた培地中で、１０〜２０の単離された細胞コロニーを、滅菌された１０ｍｌ用のピペットチップを使って取り入れる。コロニーを更に４〜７日間成長させ、薄くはがし、引き続き、ホールセルパッチクランプレコーディング法およびＲＴ−ＰＣＲにより、チャンネルの発現について試験する。
【００５７】
Ｅ．Ｎａ ⁺ 電流を測定する方法
Ｒｉｚｚｏ等（(1994) J. Neurophysiol. 72, 2796-2815）およびＤｉｂ−Ｈａｊｊ等（(1997) FEBS Lett. 416, 11-14）によって記載された通り、Ｎａ⁺電流を、パッチクランプ法を使って測定する（Hamill et al., (1981) Pflugers Arch. 391, 85-100）。ＭａｃＩｎｔｏｓｈ Ｑｕａｄｒａ ９５０または同様のコンピュータで、Ｐｕｌｓｅ（ｖｖ７．５２、ＨＥＫＡ製、ドイツ）などのプログラムを使って、これらの記録データを得る。一般に、加熱研磨された電極を、Ｓｕｔｔｅｒ Ｐ−８７プーラーまたはこれに類したものを使って、キャピラリーガラスから作製する。非常に精密な分析では、一般に、細胞の初期シール抵抗が＜５Ｇｏｈｍである場合、分析のために考慮される。このような細胞は、大量の漏れ電流、細胞膜ブレブ、および５Ｍｏｈｍ以下の接触抵抗を持つ。一般に、接触抵抗は、実験を通してモニターされ、もし、抵抗の変化が起こればデータは分析に使われない。電圧エラーは、シリーズ抵抗補正を使って最小限化され、容量アーチファクトは、コンピュータにより制御された増幅回路またはこれに類似する他の方法を使って取り消される。活性化と不活性化の電圧依存性を比較するために、補正後の電圧エラーの最大限が±１０ｍＶの細胞を使う。普通、電圧クランプレコーディングには、直線漏れ減法を使う。膜電流は、一般に、５ＫＨｚでフィルターにかけられ、２０ＫＨｚで試験に使われる。ピペットには、標準的な溶液（例えば、１４０ｍＭ ＣｓＦ、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＥＧＴＡ、および１０ｍＭ Ｎａ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．３））が含まれる。標準的細胞外溶液は、一般的に、１４０ｎＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＣａＣｌ₂、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１０ｍＭグルコースの溶液（ｐＨ ７．３）である。
【００５８】
形質転換された細胞またはＤＲＧニューロンについての、細胞内パッチクランプレコーディング法のような方法を使った電圧クランプ研究は、ナトリウム電流密度の量的測定（細胞中のナトリウムチャンネル数）およびチャンネルの生理学的特性を提供する。ナトリウムチャンネルのようなイオンチャンネルを通して流れる電流を測定するこれらの方法は、Ｒｉｚｚｏ等によって記載されている（(1995)Neurobiol. Dis. 2, 87-96）。これに変わる手法として、ナトリウムチャンネル機能の遮断または増強は、ナトリウム感受性色素またはアイソトープで標識されたＮａを使ったオプティカルイメージングにより測定される。これらの方法は、Ｒｏｓｅ等（(1997) J. Neurophysiol. 78, 3249-3258）および Kimelberg & Walts（(1988) The Neuronal Microenvironment (Boulton et al., 編集) Humana Press）により記載されており、ナトリウムチャンネルが開いたときに起こる細胞内のナトリウムイオン濃度の増加を測定する。
【００５９】
Ｆ．細胞内ナトリウム（ [ Ｎａ ⁺ ] _i ）の測定
Ｎａ⁺を発現する細胞に対する様々な薬剤の効果は、ＳＢＦＩまたはこれに類似する他のイオン感受性色素を使った[Ｎａ⁺]_iの比較イメージ法によって測定できる。Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ等（(1994) J. Neurosci. 14, 2464-2475）により記載された通り、この方法では、細胞内フリーＮａ⁺は、例えばＳＢＦＩ（Ｓｏｄｉｕｍ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ ｉｓｏｐｈｔｈａｌａｔｅ；（Harootunian et al., (1989) J. Biol. Chem. 264, 19458-19467）または類似色素のようなＮａ⁺に対しての指示薬を使って測定される。細胞は、最初に、色素の膜透過性アセトキシメチルエステル型（ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）中に１０ｍＭのストック濃度で溶解されている）で仕込まれる。顕微鏡台上で、比較イメージセットアップ（例としてＧｅｏｒｇｉａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）によってレコーディングを獲る。励起光は、適当な波長（例えば、３４０：３８５ｎｍ）を持つように提供される。励起光は、反射板（４００ｎｍ）を介して細胞に通され、４５０ｎｍ以上の蛍光を収集する。蛍光信号は、例えばイメージ増倍装置（ＧｅｎＩＩＳｙＳ）で増幅され、ＣＣＤカメラまたはフレームグラバーに接続した同類の装置により収集される。蛍光衰退を計上するため、蛍光比３４０：３８５が細胞内フリーＮａ⁺のアッセイに使われる。
【００６０】
それぞれの実験後、周知のＮａ⁺濃度（一般的に、０および３０ｍＭ、または、０、３０、および５０ｍＭ[Ｎａ⁺]）を含む換算用の溶液、およびグラミシジンやモネンシンのようなイオノフォアを、細胞の一面に注ぎＳＢＦＩ蛍光較正を行う。ＲｏｓｅやＲａｎｓｏｍ（(1996) J. Physiol. (Lond) 491, 291-305）にって報告されたように、細胞内ＳＢＦＩの３４５／３９０ｎｍ蛍光比は、[Ｎａ⁺]_iの変化と共に単調に変化する。一般に、実験を多数（一般に少なくとも４回）の異なるカバースリップについて繰り返す。これにより、対照細胞および様々な濃度の薬剤にさらされた細胞における、細胞内ナトリウムの、統計学的に有意義な測定が提供される。
【００６１】
Ｇ． ²² Ｎａまたは ⁸⁶ Ｒｂを測定することにより、Ｎａ ⁺ 流入を測定する方法
²²Ｎａは、ガンマ線エミッターであり、Ｎａ⁺流入を測定するために使われる（Kimelberg & Waltz, (1988) The Neuronal Microenvironment (Boulton et al., 編集) Hamana Press）。また、⁸⁶Ｒｂは、Ｎａ⁺／Ｋ⁺−ＡＴＰａｓｅ活性を測定するために使われる（Sontheimer et al., (1994) J. Neurosci. 14, 2464-2475）。⁸⁶Ｒｂイオンは、Ｋ⁺イオンと同様に、Ｎａ⁺／Ｋ⁺−ＡＴＰａｓｅによって取り除かれるが、⁴²Ｋ⁺に比べ、非常に長い半減期を持っている（Kimelberg & Mayhew (1975) J. Biol. Chem. 250, 100-104）。したがって、ウアバイン感受性⁸⁶Ｒｂの一方向取り込みを測定することは、ニューロンにおける電気的興奮のもう１つの指標となるＮａ⁺／Ｋ⁺−ＡＴＰａｓｅ活性をアッセイするための定量法を提供する。ＮａＮを発現する細胞を、アイソトープ²²Ｎａと共に培養した後、アイソトープの細胞内含有量を、液体シンチレーション計数法または類似の方法により測定する。また、細胞内タンパク質を、ＧｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔとＫｉｍｅｌｂｅｒｇによって記載された培養細胞のための修正（(1989) Anal. Biochem. 177, 41-45）に従い、例えばビシンコニン酸タンパク質アッセイ（Smith et al., (1985) Anal. Biochem. 150, 76-85）の様な方法で測定する。²²Ｎａおよび⁸⁶Ｒｂの流れを、ＮａＮを遮断、抑制または増強する薬剤の存在下でまたは非存在下で測定する。これにより、これらの薬剤のＮａＮに対する作用を確定する。
【００６２】
Ｈ．ＮａＮ媒介電流を調節する薬剤を同定する方法
ＮａＮナトリウムチャンネルを介して、Ｎａ⁺電流を調節（すなわち、遮断または増強）することが可能な薬剤を同定するために、幾つかのアプローチが使われる。一般的に、ＮａＮナトリウムチャンネルを発現するモデルとなる培養細胞系が、このような薬剤を同定するために使われる。また、幾つかの従来アッセイ法が、Ｎａ⁺電流の測定に使われる。このような従来アッセイには、上述した、パッチクランプ法、[Ｎａ⁺]_iのイメージ比較法、および²²Ｎａと⁸⁶Ｒｂの使用が含まれる。
【００６３】
本発明における一つの実施の形態では、Ｎａ⁺電流を調節する候補化合物の活性を評価するために、形質転換を受けた適当な宿主細胞でＮａＮを発現しているものへ、薬剤を接触させる。それらを混合した後、または、適当な培養時間後、その薬剤がＮａ⁺電流量を抑制したか増強したかを決定するために、Ｎａ⁺電流を測定する。
【００６４】
Ｎａ⁺電流を抑制または増強する薬剤は、このようにして同定される。その道の専門家であれば、特定の薬剤がＮａ⁺電流量を調節するかどうかを決定するに当たり、様々な周知技術を容易に使うことができる。
【００６５】
Ｎａ⁺は、痛みの信号を出している細胞に選択的に発現されるので、急性または慢性の痛みに対し薬剤によって処理された実験動物の反応を測定することによって、Ｎａ⁺チャンネル機能を遮断、抑制または増強するその薬剤をデザインすることも可能である。本発明のこの局面におけるある実施形態では、ラットのような実験動物は、例えば、ＮａＮを遮断または抑制する薬剤（または、遮断または抑制すると考えられる薬剤）で処理される。その後、様々な痛みの刺激に対する反応を、後尾軽打試験および肢撤回反射のような試験法を使い測定し、処理されていない対照動物と比較する。これらの方法については、Ｄｕｂｎｅｒによる記載（(1994) Textbook of Pain (Wall & Melzack, 編集) Churchill Livingstone 出版社）がある。本発明のこの局面における他の実施形態にでは、ラットなどの実験動物に、フォルマリン（Cubuisson & Dennis (1997) Pain 4, 161-74）、フロイントアジュバント（Iadarola et al., (1998) Pain 35, 313-326）またはカラゲーニンのような痛みを起す炎症性の薬剤を局所的に注射し、または、持続性の痛みを生じさせる神経圧縮（Bennett & Xie, (1988) Pain 33, 87-107; Kim & Chung (1992) Pain 50, 355-363）または神経断面切断（Seltzer et al., (1990) Pain 43, 205-218）を行う。その後、様々な普通の刺激および痛みの刺激に対する動物の反応を測定する。例えば、暖刺激または暑刺激から撤回反射までの時間の潜在時間を測定し（Dubner, (1994) Textbook of Pain (Wall & Melzack, 編集) Churchill Livingstone 出版社）、対照動物とＮａＮを変化させると考えられる薬剤で処理された動物とを比較する。
【００６６】
ＮａＮの好ましい抑制剤および増強剤は、ＮａＮＮａ⁺チャンネルに選択的である。それらは、絶対的に選択的（ナトリウムチャンネルを抑制するが他のチャンネルや受容体とは結合せず、直接的に他のチャンネルや受容体に影響を与えないテトロドトキシン、ＴＴＸのようなもの）でも、または、比較的に選択的（数種のイオンチャンネルに結合し、およびそれらを遮断するが、ナトリウムチャンネルに偏好があるリドカインのようなもの）でもよい。抑制剤または増強剤にとって、効き目があるために、絶対的な選択性は必要でない。ナトリウムチャンネルに対する効果と他のチャンネルまたは受容体に対する効果との比により、ターゲットに加えて幾つかのチャンネルに対する薬剤の１効果または複数の効果を測定する（Stys et. al., (1992) J. Neurophysiol. 67, 236-240）。ＮａＮの調節物を、第一次感覚ニューロンで発現される他のチャンネルを調節する薬剤と組み合わせまたは共投与することができる。これらには、ＰＮ１／ｈＮＥおよびＳＮＳ／ＰＮ３（Waxman (1999) Pain Supplement 6:S133-140）があるが、これらに限定されるものではない。
【００６７】
本発明の調節薬剤は、例えば、ペプチド、小分子、天然毒および他の毒、ビタミン誘導体、並びに炭水化物であろうと予想される。その道の専門家であれば、本発明の調節薬剤の構造的性質に関しては、制限が無いということが容易に認識できる。ＮａＮまたはそれを通っての電流量を調節する薬剤については、分子ライブラリーのスクリーニングにより明らかになる。同様に、天然毒（特定の魚、両生類および無脊椎動物によって生産されるものなど）についても、スクリーニングができ得る。ナトリウムチャンネルを発現している形質転換された宿主細胞または他の細胞を、これらの薬剤にさらし、結果として起こるＮａ⁺電流の変化を測定することにより、日常的に、このような薬剤は同定され得る。
【００６８】
Ｉ．組換えタンパク質の発現、合成および精製
組換えＮａＮタンパク質を、例えば大腸菌株ＨＢ１０１、ＤＨ５ａまたはＣＡＧ−４５６のようなプロテアーゼ欠失株の中で、発現させることができ、従来法により精製することができる。
【００６９】
本発明のペプチド薬剤は、当該分野で知られる標準的な固相（または液相）ペプチド合成法を使って調製することが可能である。加えて、これらのペプチドをコードするＤＮＡは、商業的に入手可能なオリゴヌクレオチド合成機器を使って合成され、標準的な組換え生産システムを使って組換え製造される。固層ペプチド合成を使う生産は、もし遺伝子によってコードされないアミノ酸が入っていれば必要とされる。
【００７０】
Ｊ．抗体および免疫検出
本発明の薬剤の他の種類は、Ｎａ⁺チャンネルに免疫反応性を持つ抗体である。これらの抗体は、チャンネルを介して、電流の流れを遮断、抑制または増強することができ得る。抗原決定領域であるＮａＮの部位、特に（しかし、必ずしもそうでない）細胞上の細胞外に出ている部位、を含むペプチドで、適当な動物被検体を免疫化することにより、これらの抗体は得られる。また、これらの免疫学的薬剤は、２次抑制薬を同定するための競合結合研究においても使うことができる。これらの抗体は、従来法によって適当に標識化されれば、イメージング研究においても利用できる。
【００７１】
Ｋ．トランスジェニック動物の生産
突然変異体、ノックアウトおよび修飾されたＮａＮ遺伝子を含むトランスジェニック動物も、本発明に含まれる。また、ＮａＮおよびＳＮＳ／ＰＮ３遺伝子の両者が修飾を受け、分裂され、またはある型で修飾されたトランスジェニック動物も、本発明に含まれる。トランスジェニック動物は、遺伝子的に修飾を受けた動物であり、組換え、外因性、またはクローニングされた遺伝子材料を実験的に転移してできたものである。このような遺伝子材料は、度々トランス遺伝子といわれる。トランス遺伝子の核酸配列は、この場合においてはＮａＮの型であり、その特定の核酸配列が普通には見られないゲノムの遺伝子座か、またはトランス遺伝子のための普通遺伝子座のどちらかへ組み込まれる。トランス遺伝子は、ターゲット動物の種類とは異なる種類のゲノムから、または同じ種類のゲノムから派生した核酸配列からなる。
【００７２】
用語「生殖細胞系トランスジェニック動物」とは、遺伝子変異または遺伝子情報がその生殖細胞系に導入され、その遺伝子情報を子孫に移転することができる能力を得たトランスジェニック動物のことを言う。もし、実際に、このような子孫がその変異または遺伝子情報の幾つかまたは全部を所有していれば、それらもまた、トランスジェニック動物である。
【００７３】
その変異または遺伝子情報は、受容者が属する動物種にとって外来のものであるか、特定の個々の受容者にとって外来のものであるか、または遺伝子情報は既に受容者によって所有されている。最後の場合、変異した遺伝子または導入された遺伝子は、自然の遺伝子とは異なって発現され得る。
【００７４】
トランスジェニック動物は、胚幹細胞への遺伝子注入、電気的ポレーション、微量注入、遺伝子ターゲティング、並びに組換えウイルス感染およびレトロウイルス感染、を含む様々な異なる方法によって生産することができる（米国特許４７３６８６６号；米国特許５６０２３０７号； Mullins et al. (1993) Hypertension 22, 630-633; Brenin et al. (1997) Surg. Oncol. 6, 99-110; Tuan (1997), Recombinant Gene Expression Protocols, Humana Press (1997）。
【００７５】
数々の組換えマウスまたはトランスジェニックマウスが生産されてきた。これらの中には、活性化されたガン遺伝子配列を発現するもの（米国特許４７３６８６６号）、サイウイルスＳＶ４０Ｔ−抗原を発現するもの（米国特許５７２８９１５号）、インターフェロン制御因子−１（ＩＲＦ−１）の発現を欠くもの（米国特許５７３１４９０号）、ドーパミン性障害を示すもの（米国特許５７２３７１９号）、血圧制御に関係しており少なくとも１つのヒト遺伝子を発現するもの（米国特許５７３１４８９号）、自然に生じたアルツハイマー病の状態に非常に似た状態を示すもの（米国特許５７２０９３６号）、細胞接着を媒介する能力が劣ったもの（米国特許５６０２３０７号）、牛成長ホルモン遺伝子を所有するもの（Clutter et al. (1996) Genetics 143, 1753-1760）、または、完全なヒト抗体の反応を発生できるもの（McCarthy (1997) Lancet 349, 405）、が含まれる。
【００７６】
マウスとラットがほとんどのトランスジェニック実験の動物として選択されてきた一方、他の動物種を使うことの方が好ましい場合、または必要な場合がある。トランスジェニック工程は、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ハムスター、ラビット、ウシ、およびギニアピッグを含むネズミ科以外の動物においても、成功して使われてきた（Kim et al. (1997) Mol. Reprod. Dev. 46, 515-526; Houdebine (1995) Reprod. Nutr. Dev. 35, 609-617; Petters (1994) Reprod. Fertil. Dev. 6, 643-645; Schnieke et al. (1997) Science 278, 2130-2133; および Amoah (1997) J. Animal Science 75, 578-585）。
【００７７】
核酸断片を組換えに適任な哺乳類細胞へ導入する方法は、多数の核酸分子の同時形質転換に都合が良ければいかなる方法であってもよい。トランスジェニック動物を生産する詳しい工程は、米国特許５４８９７４３号および米国特許５６０２３０７号に開示されたものを含み、当業者にとって容易に利用可能である。
【００７８】
以下に示される特定の実施例は単に例示に過ぎず、本発明の範囲を制限するものではない。
【００７９】
実施例
【００８０】
【実施例１】
ラット NaN 遺伝子コード配列のクローニングおよび解析
ａ．ＲＮＡの調製
性成熟Sprague-Dawley種ラットより腰椎（L4〜L5）部分の後根神経節（ＤＲＧ）を切除し、全細胞ＲＮＡをチオシアン酸グアニジン・フェノール一回抽出法（Chomczynski, (1987) Anal. Biochem. 162, 156-159）により分離した。分析用には数匹の動物から同時にＤＲＧ組織を切除して用いた。１％アガロースゲル中で電気泳動によって、ＲＮＡの品質および相対収量を測定した。原材料の後根神経節は４個体から平均１０ｍｇと限られた量しか得られなかったため、ＲＮＡ収量の定量は行わなかった。ＰｏｌｙＡＴｒａｃｔ分離システム（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、製造者の指示に従い、３００μｇの後根神経節トータルＲＮＡからポリＡ＋ＲＮＡを精製した。精製ＲＮＡの半分は、定量せずにマラソンｃＤＮＡ（後述）調製に用いた。
【００８１】
ｂ．逆転写
分析用に、基本的に以前報告（Dib-Hajj et al., (1996) FEBS Lett. 384, 78-82）したように第一鎖ｃＤＮＡを合成した。簡潔に説明すると、最終量２５ｍｌ中で、１ｍＭのランダム・ヘキサマー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）および５００単位のスーパースクリプトII逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用い、１００単位のリボヌクレアーゼ阻害剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ社）存在下にトータルＲＮＡを逆転写した。反応バッハァーは、５０ｍＭＴｒｉｓ塩酸（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭ ＤＴＴおよび１２５ｍＭ ｄＮＴＰからなっていた。反応を３７℃で９０分間、４２℃で３０分間進行させ、６５℃で１０分間熱することにより停止させた。
【００８２】
ｃ．第一鎖ｃＤＮＡ合成
マラソンｃＤＮＡ合成の実験プロトコルは、下記に要約するように、製造者のマニュアルに従って行った（バッファーおよび酵素は全て製造者であるＣｌｏｎｔｅｃｈ社より購入した）。
【００８３】
滅菌した０．５−ｍｌミクロ遠心チューブ中で以下の試薬：ポリＡ＋ＲＮＡサンプル１ｍｇ（１−４ｍｌ）、ｃＤＮＡ合成プライマー １ｍｌ（１０ｍＭ）および滅菌Ｈ₂Ｏ、を全量が５ｍｌとなるように混合する。成分を混合し、チューブを短時間マイクロ遠心機で遠心する。混合液を７０℃で２分間保温し、次に直ちにチューブを氷中で２分間急冷する。チューブを瞬時遠心（タッチ・スピン）して結露分を集める。各反応チューブに以下の試薬：５Ｘファースト・ストランド・バッファー２ｍｌ、ｄＮＴＰミックス（１０ｍＭ）１ｍｌ、[α-³²Ｐ]ｄＣＴＰ（１ｍＣｉ／ｍｌ）１ｍｌ、ＡＭＶ逆転写酵素（２０単位／ｍｌ）１ｍｌを加え、１０ｍｌ容とする。放射標識ｄＣＴＰ（ｃＤＮＡ合成の収量測定用）は、任意であって、使用しない場合は滅菌Ｈ₂Ｏで置き換えてもよい。穏やかにピペッティングしてチューブの内容物を混合し、チューブをタッチ・スピンして内容を底に集める。混合液を結露の少ないようインキュベータ中、４２℃で一時間保温し、第一鎖ｃＤＮＡの収量を増やす。チューブを氷中に置き、第一鎖合成反応を停止する。
【００８４】
ｄ．第２鎖ｃＤＮＡ合成
上記の反応チューブに以下の組成の試薬：滅菌Ｈ₂Ｏ ４８．４ｍｌ、５Ｘセカンド・ストランド・バッファー１６ｍｌ、ｄＮＴＰミックス（１０ｍＭ） １．６ｍｌ、２０Ｘセカンド・ストランド・エンザイム・カクテル４ｍｌを加え全容量を８０ｍｌとする。穏やかにピペッティングして前記成分を完全に混合し、マイクロ遠心機でチューブを短時間遠心する。混合液を１６℃で１．５時間保温した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ２ｍｌ（１０単位）を加え、穏やかにピペッティングして内容物を完全に混合し、混合液を１６℃で４５分間保温する。ＥＤＴＡ／グリコーゲンを４ｍｌ加えて混合し、第２鎖反応を終了させる。混合液を等容のバッファー飽和フェノール（ｐＨ７．５）：クロロフォルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出する。ボルテックスにより内容物を完全に攪拌し、チューブをマイクロ遠心機で最高速度（毎分14,000回転または13000xg）４℃にて０分間遠心し、液層を分離する。上層の水層を注意深く、清浄な０．５ｍｌチューブに移し替える。水層を１００ｍｌのクロロフォルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出し、ボルテックスし、前回同様に遠心して液層を分離する。上層の水層を注意深く、清浄な０．５ｍｌチューブに回収する。２分の１容の４Ｍ酢酸アンモニウムおよび２．５倍容の９５％エタノールを室温で加え、二本鎖ｃＤＮＡをエタノール沈殿する。ボルテックスにより完全に攪拌した後、ただちにチューブをマイクロ遠心機で最高速度、室温にて２０分間遠心する。上清を注意深く除き、沈殿ペレットを３００ｍｌの８０％エタノールで洗う。前回同様にチューブを１０分間遠心し、上清を注意深く除去する。 沈殿ペレットを１０分間ほど風乾しｃＤＮＡを１０ｍｌの滅菌Ｈ₂Ｏに溶かし、−２０℃で貯蔵する。ｃＤＮＡ溶液２ｍｌを適切な分子量マーカー用ＤＮＡ（例えば、Ｇｉｂｃｏ・ＢＲＬ社製１kilobpラダーなど）とともに１．２％ＥｔＢｒ／アガロースゲル上で泳動することによりｃＤＮＡの収量およびサイズを分析する。ＥｔＢｒ染色がシグナルを示さず、反応液中に[α-³²Ｐ]ｄＣＴＰが含まれていた場合は、アガロースゲルを真空ゲルドライ装置にて乾燥した後、−７０℃にて一晩Ｘ線フィルムに露光する。
【００８５】
ｅ．アダプターのライゲーション
室温下、０．５ｍｌミクロ遠心チューブ中で、各試薬を以下の順、すなわち、ｄｓｃＤＮＡ ５ｍｌ、マラソン ｃＤＮＡアダプター（１０ｍＭ）２ｍｌ、５ＸＤＮＡライゲーション・バッファー２ｍｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（１単位／ｍｌ）１ｍｌ、の順に加え、全量を１０ｍｌとする。穏やかにピペッティングして成分を完全に混合した後、チューブをマイクロ遠心機で短時間遠心する。１６℃終夜か、室温（１９〜２３℃）で３〜４時間のいずれかで保温する。混合液を７０℃で５分間加熱し、リガーゼ酵素を失活させる。この反応液１ｍｌを２５０ｍｌのトリシン−ＥＤＴＡバッファーで希釈し、ＲＡＣＥのプロトコルに使用する。希釈していないアダプターをライゲーションしたｃＤＮＡを使用するまで−２０℃で保存する。
【００８６】
ｆ．ＰＣＲ
ＮａＮ遺伝子の最初の発見においては、ａ−サブユニットＩ、IIおよびIIIのドメイン１（Ｄ１）中の高度保存配列に対して設計された汎用プライマーを使用し、さらに発見された新規ａ-サブユニットを収容するためにより多くのプライマーを追加した。このようにして全ての公知のＮａ＋チャンネルにある保存配列を認識する汎用プライマーを用いた。増幅領域の中央部には有意な配列があり、遺伝子長ポリモルフィズム（多型性）が認められた（図６および Gu et al., (1997) J. Neurophysiol. 77, 236-246; Fjell et al., (1997) Mol. Brain Res. 50, 197-204）。コドンの縮退に応じ、ｃＤＮＡプール中に存在しうる全てのテンプレート（表１）に対して高い効率でプライミングが行われるよう、順方向プライマー４本（Ｆ１〜Ｆ４）および逆方向プライマー３本（Ｒ１〜Ｒ３）を設計した。しかしながら、反応のストリンジェンシー（厳格性）によっては、これらのいずれのプライマーも複数のテンプレートに結合し得る。順方向プライマーＦ１は、サブユニットａＩ、ａIII；ａＮａ６；ａＰＮ１；ａｍ１、ａｒＨ１およびａＳＮＳ／ＰＮ３にマッチする。個々のサブユニットの配列中にはこのプライマーに対して１ないし２箇所のミスマッチを示す。すなわち、第１６位のＣに対してＴ、および第１８位のＧに対してＡ（ａＮａ６）、第６位のＲに対してＣ（ａｍ１）、第１８位のＧに対してＡ（ａｒＨ１）、そして第３位のＣに対してＴ（ａＳＮＳ）である。順方向プライマーＦ２はサブユニットａIIに適合する。順方向プライマーＦ３は、ａＮａ６と完全に一致し、またａｒＨ１に対しては単一のミスマッチすなわち第１６位のＴに対しＣでマッチする。逆方向プライマーＲ１はサブユニットａＩ、ａII、ａIII、ａＮａ６、ａＰＮ１、ａｍ１およびａｒＨ１にマッチする。このプライマーは４つのサブユニットと比較すると以下のミスマッチ部位を有する。すなわち、第３位のＡに対してＧ、第４位のＧに対してＴ、および第７位のＧに対してＴ（ａＩ）；第１位のＣに対してＴおよび第１９位のＧに対してＡ（ａＰＮ１）；第３位のＡに対してＧおよび第７位のＧに対してＡ（ａｍ１）；第３位のＧに続いてＧの追加、第１４〜１５位のＣＴに対してＧＣおよび第２１位のＴに対してＡ（ａｒＨ１）。逆方向プライマーＲ２はサブユニットａＳＮＳ／ＰＮ３にマッチする。
【００８７】
表１ ＮａＮ遺伝子の同定およびクローニングに用いた汎用およびＮａＮ特異的プライマー。マラソンプライマーを除く全てのプライマーはエール大学、病理学科、分子医学重要技術プログラムにおいて合成された。
【表１】

ラットのｍＮａ２．３類似遺伝子と推定されるαＮａＧからの類似する配列を増幅するため、マウスの非典型ナトリウムチャンネルｍＮａ２．３を用いて、順方向プライマーＦ４および逆方向プライマーＲ３を設計した（Felipe et al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 30125-301231）。増幅された配列をｐＣＲ−ＳＣＲＩＰＴベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＳｒｆＩ部位にクローニングした。前記ヌクレオチド断片は対応するｍＮａ２．３配列に対し８８％の同一性を示した（Ｄｉｂ−ＨａｊｊとＷａｘｍａｎ、未発表）。制限酵素ＸｂａＩは、本サブユニットにユニーク（一箇所のみ切断点を持つ）であることが見出された。最近、推定ナトリウムチャンネルであるＮａＧ様（ＳＣＬ−１１：Ｙ'０９１６４）サブユニットの全長ｃＤＮＡクローンの配列が公表された（Akopian et al., (1997) FEBS Lett. 400, 183-187）。報告された配列は本発明者らの配列と９９％一致し、ＮａＧのＰＣＲ産物のサイズおよび制限酵素多型性が確認される。
【００８８】
図６に増幅産物の予想サイズおよびサブユニット特異的な制限酵素認識部位を示した。サブユニット配列は全てＧｅｎｂａｎｋデータベース（登録番号： ａＩ：Ｘ０３６３８；αII：Ｘ０３６３９；αIII：Ｙ００７６６；αＮａ６：Ｌ３９０１８；αｈＮＥ−Ｎａ：Ｘ８２８３５；αｍ１ Ｍ２６６４３；αｒＨ１ Ｍ２７９０２およびαＳＮＢＳ Ｘ９２１８４；ｍＮａ２．３ Ｌ３６７６１９）。続いて、ＮａＮ特異的プライマーおよび汎用プライマーＲ４およびＲ５の２本とを用い、前述の断片の３'末端側ＮａＮ配列の増幅が達成された。Ｒ４プライマーの配列はドメインIIＳ６セグメントのちょうどＮ末端に位置するアミノ酸配列ＭＷＶ／ＤＣＭＥＶ（配列番号３８）に基づいた。（参考資料として電位依存性ナトリウムチャンネルａサブユニットの図３模式図を参照）。Ｒ５プライマーの配列は、ドメインIIIＳ３セグメントのＮ末端部分の一部を形成するアミノ酸配列ＡＷＣＷＬＤＦＬ（配列番号４３）に基づく。
【００８９】
増幅反応は、通常６０μｌ容中で、第１鎖ｃＤＮＡ１ｍｌ、各プライマー０．８ｍＭおよびＥｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡポリメーラーゼ ミックス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）１７．５単位を用いて行った。Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡポリメーラーゼ ミックスは、従来の熱耐性ＤＮＡポリメラーゼ類と比較して、非特異的な増幅の増加なしにＰＣＲ産物の収率を増加する（Barnes, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 91, 2216-2220; Cheng et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA91, 5695-5699）。ＰＣＲ反応バッファーは、５０ｍＭＴｒｉｓ塩酸（ｐＨ９．２）、１６ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２．２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、２％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０からなる。前述（Dib-Hjj et al., (1996) FEBS Lett. 384, 78-82）のように、増幅反応はプログラム式サーマルサイクラー装置（ＰＴＣ−２００、ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社）を用いて２段階で行った。第一に、熱変性ステップを９０℃で４分間、アニーリングステップを６０℃で２分間、そして伸長反応ステップを７２℃で９０秒とした。第２に、熱変性ステップを９４℃で１分間、アニーリングステップを６０℃で１分間、および伸長反応ステップを７２℃で９０秒とした。第２段階は３３回のリピートとし、最終サイクルの伸長反応ステップを１０分間に延長し、全段で３５サイクルとした。
【００９０】
一次ＲＡＧＥ増幅反応はＤＲＧの希釈マラソンｃＤＮＡテンプレート４ｍｌ、マラソンＡＰ−１およびＮａＮ特異的プライマー０．２ｍＭおよびＥｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ 酵素ミックス３．５単位を用い、全量を５０ｍｌとして行った。伸長反応時間は予期される産物に基づいて毎分８００ｂｐとなるように調整した。５'および３'ＲＡＣＥ増幅を、マラソンＡＰ−１／ＮａＮ−特異的Ｒ６プライマーのペア、およびＮａＮ−特異的Ｆ５／マラソンＡＰ−１プライマーのペアをそれぞれ用いて行った。ＰＣＲ反応バッファーは、５０ｍＭＴｒｉｓ塩酸（ｐＨ９．２）、１６ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、３．０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、２％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０からなる。３段階増幅反応はプログラム式サーマルサイクラー機（ＰＴＣ−２００、ＭＪリサーチ社）を用いて行った。初段熱変性ステップは９２℃で２分間とした。続いて、熱変性９２℃・２０秒、アニーリングステップ６０℃・１分間、伸長反応ステップ６８℃を１サイクルとして３５サイクルとした。最後に伸長反応を６８℃で５分間行った。Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを、一次ＲＡＧＥ増幅産物の５００倍希釈２ｍｌを用い、全量５０ｍｌとして一次ＲＡＧＥ反応と同条件で行った。プライマー・ペア、ＡＰ−２／ＮａＮ特異的Ｒ７およびＮａＮ特異的Ｆ６／マラソンＡＰ２を、それぞれＮｅｓｔｅｄ５'および３'ＲＡＣＥ反応に用いた。２次ＲＡＧＥ産物を１％アガロースゲルからバンド単離し、Ｑｉａｅｘゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。
【００９１】
図３にＮａＮの推定構造の模式説明図を示す。細胞内ループは種々のサブユニット間で長さ、配列ともに変化に富んでいる。この例外は、ドメインIIIとIVの間のループである。
【００９２】
【実施例２】
ラットＮａＮチャンネルの推定アミノ酸配列の決定
ＮａＮ関連クローンおよび２次ＲＡＣＥ断片を、エール大学ＤＮＡシークェンシング・グループ Ｗ．Ｍ．ケック財団バイオテクノロジー・リソース研究所において配列決定した。予想アミノ酸配列決定を含む配列分析は、市販ソフトウェアＬａｓｅｒｇｅｎｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ）およびＧＣＧを用いて実施した。図２にＮａＮの推定アミノ酸配列を示す。ドメインＩ〜IVの膜貫通セグメントを下線で示した。
【００９３】
【実施例３】
マウスＮａＮ配列の決定
マウス三叉神経節トータルＲＮＡの抽出、ポリＡ＋ＲＮＡの精製およびマラソンｃＤＮＡ構築を前述のラットにおける実験と同様に行った。一次増幅はラットＮａＮプライマーを用いて行った。順方向プライマーはラット配列のヌクレオチド７６５−７８７（５'ＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧ３'）（配列番号２４）に対応し、そして逆方向プライマーはラット配列のヌクレオチド１１５６−１１３７（５'ＧＡＣＡＡＡＧＴＡＧＡＴＣＣＣＡＧＡＧＧ３'（配列番号２５）；ネガティブストランド）に対応する。増幅により期待されるサイズの断片が得られた。本断片の配列はラットＮａＮと高い類似性を実証した。異なったラット由来プライマーおよび新規マウスＮａＮ配列に基づいて新たに設計されたプライマーを用いて、他の断片を増幅した。最終的に、マウスマラソンｃＤＮＡテンプレートおよびマウスＮａＮ特異的プライマーと、マラソンｃＤＮＡ合成時に導入されたアダプタープライマーとを組み合わせて用い、より長い断片を増幅した。これらの断片をプライマー・ウォーキング法により配列決定した結果を図７Ａに示した。
【００９４】
ラットＮａＮ同様、マウスＮａＮヌクレトチド配列においても、４１位の翻訳開始コドンＡＴＧから数えて−８番目に位置するフレーム外ＡＴＧが欠失している。翻訳終止コドンＴＧＡは５３１４位に位置する。ポリＡ付加信号（ＡＡＴＡＡＡ）は５７８９位に位置し、２３ヌクレオチド長と推定されるポリＡテールは５８００位から始まる。前記配列は、ラットＮａＮと９０％類似する１７６５アミノ酸残基のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）をコードする（図７Ｂ）。ＮａＮをコードする遺伝子はＳｃｎ１１ａと命名された。
【００９５】
マウスＮａＮの染色体上の位置
Ｓｃｎ１１ａの３'ＵＴＲから得た２７４ｂｐの断片についてＳＳＣＰ解析を行い、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統およびＳＰＲＥＴ／Ｅｉ系統間の遺伝子多型を同定した。９４匹の動物についてＢＳＳ戻し交配パネル法（Rowe et al., (1994) Mamm. Genome 5, 253-274）による遺伝子型（ゲノタイプ）決定を行い、第９染色体遠位端マーカー群とリンケージすることが証明された（図１０）。Ｓｃｎ１１ａとマイクロサテライトマーカーＤ９Ｍｉｔ１９との間では組換えは観察されなかった。マウス第９染色体のＭＧＤコンセンサスマップと発明者らのデータを比較した結果、Ｓｃｎ１１ａは、他の２つのＴＴＸ−Ｒ型電位依存性ナトリウムチャンネルＳｃｎ５ａ（George et al., (1995) Cytogenet Cell. Genet. 68, 67-70）およびＳｃｎ１０ａ（Kozak & Sangameswaran, (1996) Mamm. Genome 7, 787-788; Souslova et al., (1997) Genomics 41, 201-209）に近接することが明らかになった。
【００９６】
【実施例４】
ヒトＮａＮコード配列の部分および全体の決定
移植患者からヒトＤＲＧを得た。トータルＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成は前述の方法で行った。
【００９７】
順方向プライマーはＥＳＴ ＡＡ４４６８７８の配列３１０−２９４（マイナス鎖）に相当する。前記プライマーの配列は、５'ＣＴＣＡＧＴＡＧＴＴＧＧＣＡＴＧＣ３'（配列番号２６）である。逆方向プライマーはＥＳＴ ＡＡ８８５２１ １の配列２７０−２４７（マイナス鎖）に相当する。前記プライマーの配列は５'ＧＧＡＡＡＧＡＡＧＣＡＣＧＡＣＣＡＣＡＣＡＧＴＣ３'（配列番号２７）となる。前述の方法で増幅を行った。ＰＣＲ増幅はうまくゆき、そして２．１Ｋｂｐｆ断片が得られた。前記断片はゲル精製され、マウスＮａＮで行ったのと同様にプライマーウォーキング法による配列決定を外注した。ＥＳＴ配列を両方向に延長し、他のサブユニットと比較したところ、新たに得られた配列はマウスＮａＮと最も高い類似性が認められた。
【００９８】
ＰＣＲプライマーとして用いた本断片両端の順・逆のプライマーを利用してヒト２．１ｋｂｐ断片について配列決定を行った。両プライマーでは伸長しきれなかった残りの部分の配列決定には、これらに加えて新たに２本のプライマーを用いた。このようにして、順方向プライマー１（上記）および本２．１ｋｂｐ断片５'末端近傍に相当するヒトＮａＮ逆方向プライマー（５'ＧＴＧＣＣＧＴＡＡＡＣＡＴＧＡＧＡＣＴＧＴＣＧ３'）（配列番号４４）を用い５'上流側配列にまで延長した。部分アミノ酸配列を図８Ｂとして提出する。
【００９９】
ヒトＮａＮの部分ＯＲＦは１２４１アミノ酸残基からなる。前記配列は、国立バイオテクノロジーインフォメーションセンター（National Center for Biotechnology Information）のアドバンスドＢＬＡＳＴプログラムを用いて解析した結果、ラットＮａＮの相当部分に対して６４％の同一性を示した（伝統的な置換法を許容する場合では７３％の類似性となる）。クラスタル法による並列比較（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェア、ＤＮＡＳｔａｒ社）を用いるとヒトＮａＮはマウスおよびラットＮａＮに対し、それぞれ６８％および６９％の類似性を示す。マウスとラット間では相当部分の類似性は８８％となる。
【０１００】
更なる配列決定により、ｃＮＤＡ配列は、ヒトＮａＮ遺伝子のオープンリーディングフレーム全長にわたっていることが分かった。この伸張した配列は、図１１Ａ（配列番号４１）に示されている。ｃＤＮＡの部分配列に関して言及された特徴に加えて、伸張された配列の顕著な特徴には、３１位の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）、５４００位の翻訳終止コドンがある。認識可能なポリアデニル化信号は、まだ観察されていないが、開示された配列の３'に位置していると推定される。ヒトＮａＮタンパク質の推定上のアミノ酸配列は、図１１Ｂ（配列番号４２）に記されている。
【０１０１】
【実施例５】
ラットＮａＮのオルターナティブスプライシング変異体の単 離
ラットｃＤＮＡクローンの挿入部分ＤＮＡをシークェンシングすることによって、図１および２に示すラットＮａＮ全長ｃＤＮＡに対し、Ｃ末端側が切断された短縮型をコードするラットＮａＮｃＤＮＡが得られた。前記変異体ＮａＮｃＤＮＡは、全長ＮａＮのＣ末端側３８７アミノ酸残基を欠失し、そのＣ末端には新規の９４アミノ酸残基の延長を含むＮａＮをコードする。この新規の配列は、エクソン２３内の潜在的スプライシング・ドナー・サイトとイントロン２３の位置にあたる部分からなる新たなエクソン２３'から生じる。この新規のＣ末端アミノ酸配列は：ＡＡＧＱＡＭＲＫＱＧ ＤＩＬＧＰＮＩＨＱＦ ＳＱＳＳＥＴＰＦＬＧ ＣＰＱＱＲＴＣＶＳＦＶＲＰＱＲＶＬＲＶＰ ＷＦＰＡＷＲＴＶＴＦ ＬＳＲＰＲＳＳＥＳＳ ＡＷＬＧＬＶＥＳＳＧ ＷＳＧＬＰＧＥＳＧＰ ＳＳＬＬ （配列番号２８）である。短縮型変異体のＮ末端側は図２に示した全長ラットＮａＮのアミノ酸残基第１〜１３７８番と同一である。代替エクソンおよびそのスプライシングパターンはｃＤＮＡ配列および染色体ゲノム配列のそれぞれの領域を比較することにより確認された。
【０１０２】
【実施例６】
他のＮａＮ配列の単離法
ａ．ゲノムＤＮＡからのＮａＮ配列の単離
３種の電位依存性ナトリウムチャンネルａサブユニットのゲノム構造は、既に決定された（George et al., (1993) Genomics 15, 598-606; Souslova et al., (1997) Genomics 41, 201-209; McClatchey et al., (1992) Hum. Mol. Genet.1, 521-527; Wang et al., (1996) Genomics 34, 9-16）。これらの遺伝子群は、それらの構成において顕著な類似性を有し、大部分のエクソン・イントロンの境界の予想マップを提供する。本明細書に開示され、入手可能なＮａＮのラット、マウスおよびヒトｃＤＮＡ配列に基づき、標準的ＰＣＲプロトコルを用いて、他の種からのＮａＮ同族配列を増幅するＰＣＲプライマーを設計する。
【０１０３】
代替的に（ラット、マウス、またはより好ましくはヒト配列に基づく）ＮａＮ特異的プローブで、市販のゲノムＤＮＡライブラリーを標準的ライブラリースクリーニング法（Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning ？ A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press; Ausubel et al., (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Greene 出版社）を用いてスクリーニングする。この戦略は、配列決定できるゲノムＤＮＡ単離体を与え、そしてエキソン／イントロン境界がラット、マウスまたはヒトｃＤＮＡ配列へのホモロジーによって決定できる。
【０１０４】
ｂ．解剖・生検・外科手術組織からの全長ＮａＮ配列対立遺伝子変異体の単離
ヒト神経節トータルＲＮＡを単離するために、死後人体、胎児または生検サンプルまたは手術組織から得たヒト後根神経節または三叉神経節または他の頭頚部神経節より全長ＮａＮヒトｃＤＮＡホモローグを単離する。トータルリボ核酸（ＲＮＡ）は、これらの組織から実施例１に記載したイソチオシアン酸グアニジン中に抽出することによって単離される（Saiki et al., (1985) Science 230, 1350-1354）。
【０１０５】
ラットＮａＮナトリウムチャンネルｃＤＮＡのヒトホモローグ全長転写産物のサイズを決定するにあたっては、転写産物のサイズを決定する方法は実施例９に記載のとおりである。
【０１０６】
【実施例７】
ヒトＤＲＧｃＤＮＡライブラリーの製造
実施例４において、標準的な分子生物学の手法を用いヒトＤＲＧまたは三叉神経節のポリＡ＋ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを調製した（Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning ？A Laboratory Approachm, Cold Spring Harbor Press; Ausubel et al., (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Greene 出版社）。
【０１０７】
ポリＡ＋ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）プライマーにハイブリダイズさせ、逆転写酵素により１本鎖ｃＤＮＡとしてコピーした。次いで、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド中のＲＮＡをリボヌクレアーゼＨにより断片化させつつ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩにより第２鎖断片を合成した。大腸菌ＤＮＡリガーゼを用い、２本鎖ｃＤＮＡの両端を修復し、かつ、特定の制限酵素（例えば、ＥｃｏＲＩ）認識部位を持つリンカーを連結した。集積したｃＤＮＡインサートをラムダ−Ｚａｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）などの種々の市販品バクテリオファージベクターの１つに連結した。操作手順を以下に詳述する。
【０１０８】
ａ．第１鎖ｃＤＮＡ合成
ポリＡ＋ＲＮＡ１０ｍｇを滅菌水に溶解し１ｍｇ／ｍｌの濃度とする。ＲＮＡを６５〜７０℃で、２〜５分間熱し、次ぎに直ちに氷中で急冷する。別のチューブに、５ｍＭｄＮＴＰミックス（終濃度各５００μＭ）２０ｍｌ、５ｘＲＴバッファー（終濃度１ｘ）４０ｍｌ、２００ｍＭＤＴＴ（終濃度１０ｍＭ）１０ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）12-18（終濃度５０ｍｇ／ｍｌ）、６０ｍｌ脱イオン水、１０単位ＲＮａｓｉｎ（終濃度５０単位／ｍｌ）１０ｍｌを、この順に加える（全体で１８０ｍｌ）。Ｖｏｌｔｅｘで混和し、短時間ミクロ遠心機にかけ、この混合液をＲＮＡの入ったチューブに加える。２００単位のＡＭＶまたはＭＭＬＶ逆転写酵素２０ｍｌを、２００ｍｌの溶液の終濃度が１０００単位／ｍｌとなるように加える。数回上下にピペッティングして混和した後、１０ｍｌを、α³²ＰｄＣＴＰ１ｍｌを入れた別のチューブに移す。通常、両方のチューブを室温で５分間保温した後、両方のチューブを４２℃で１．５時間保温する。放射標識したアリコートを、取りこみと回収率が推定できるよう回収する。０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を１ｍｌ加えて反応を停止し、−２０℃で凍結保存する。放射標識した反応液は、後にｃＤＮＡインサートの平均サイズおよび収量を推定するのに用いる。０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を４ｍｌ、バッファー添加フェノールを２００ｍｌ加えて主反応を停止する。混合液を十分にボルテックスし、マイクロ遠心機により室温で１分間遠心して液相を分離し、上部の水層を新しいチューブに移す。フェノール層を１ｘＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．５）で再抽出し、２回の抽出の水層を集める。フェノール層を再抽出することにより収量が改善される。ｃＤＮＡを、７．５Ｍ酢酸アンモニウム（終濃度２．０〜２．５Ｍ）および９５％エタノールを用いてエタノール沈殿する。ドライアイス・エタノール浴中に１５分間置き、４℃にまで暖め、マイクロ遠心機中、４℃で１０分間、最高速度で遠心して核酸をペレット化する。黄白色の小ペレットを氷冷７０％エタノールで洗い、マイクロ遠心機に４℃、最高速度で３分間かける。再び上清を除き、短時間ペレットを乾燥する。
【０１０９】
ｂ．第２鎖合成
通常、第１鎖合成反応のペレットを２８４ｍｌの水に再懸濁し、以下の試薬を以下の順に加える（全量４００ｍｌ）：５ｍＭ ｄＮＴＰミックス（各終濃度５０μＭ）４ｍｌ、５ｘ第２鎖バッファー（終濃度１ｘ）８０ｍｌ、５ｍＭ β-ＮＡＤ（終濃度１５０μＭ）１２ｍｌ、１０μＣｉ／ｍｌ α³²Ｐ-ｄＣＴＰ（終濃度５０μＣｉ／ｍｌ）２ｍｌ。ボルテックスで混和し、短時間マイクロ遠心機にかけた後、ＲＮａｓｅＨ ４単位（終濃度１０単位／ｍｌ）４ｍｌ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ２０単位（終濃度５０単位／ｍｌ）４ｍｌ、および大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ１００単位（終濃度２５０単位／ｍｌ）１０ｍｌ。上下にピペッティングして混和し、短時間マイクロ遠心機にかけた後、１２〜１６時間、１４℃で保温する。第２鎖合成の後、反応液４ｍｌを取り、酸不溶性画分への放射標識取り込み分から収率を決定する。第２鎖合成反応液を４００ｍｌのバッファー添加フェノールで抽出し、前述のように、２００ｍｌのＴＥバッファーｐＨ７．５で再抽出する。次ぎに、前述のように２本鎖ｃＤＮＡをエタノール沈殿する。
【０１１０】
第２鎖合成を完了するために、２本鎖ｃＤＮＡの両端を酵素混合液で処理し断端を平滑化する。ペレットを４２ｍｌの水に再懸濁し、以下の試薬を以下の順に加える（全量８０ｍｌ）：５ｍＭ ｄＮＴＰミックス（各終濃度３１０μＭ）５ｍｌ、５ｘＴＡバッファー（終濃度１ｘ）１６ｍｌ、５ｍＭβＮＡＤ（終濃度６２μＭ）１ｍｌ。ボルテックスで混和し、短時間マイクロ遠心機にかけ、以下を加える：２ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡ（終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）４ｍｌ、ＲＮａｓｅＨ ４単位（終濃度５０単位／ｍｌ）４ｍｌ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ２０単位（終濃度２５０単位／ｍｌ）４ｍｌ、およびＴ４ＤＮＡポリメラーゼ８単位（終濃度１００単位／ｍｌ）４ｍｌ。前述のように混和し、３７℃で４５分間保温する。１２０ｍｌのＴＥバッファー（ｐＨ７．５）、次いで１ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ ｔＲＮＡを加える。２００ｍｌのバッファー添加フェノールで抽出し、前述のように、１００ｍｌのＴＥバッファーで再抽出する。前述のように２つの水層の分を合わせエタノール沈殿する。
【０１１１】
ｃ．２本鎖ｃＤＮＡへのリンカーの付加
室温で０．５ｍｌマイクロ遠心チューブに以下の試薬：二重鎖ｃＤＮＡ １００ｎｇ、リンカー・アダプター溶液（１０ｍＭ）２ｍｌ、５ｘＤＮＡライゲーションバッファー２ｍｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（単位／ｍｌ）１ｍｌを以上の順序で加え、全量を１０ｍｌとする。穏やかにピペッティングして内容物を完全に混和した後、チューブをマイクロ遠心機中で短時間遠心する。１６℃で一晩、または室温（１９〜２３℃）で３〜４時間保温する。７０℃で５分間熱してリガーゼ酵素を失活させる。このｃＤＮＡを通常はＥｃｏＲＩにより消化して、ベクターへ連結するためのｃＤＮＡの粘着性末端を用意し、そしてリンカーによるコンカテマーを切断する。反応液の組成は、通常、ｃＤＮＡ１０ｍｌ、１０ｘＥｃｏＲＩバッファー（内容は販売元により異なる）２ｍｌ、ＥｃｏＲＩ（１０単位／ｍｌ）２ｍｌに滅菌水を加えて全量を２０ｍｌとする。混合液を３７℃で２〜４時間保温する。
【０１１２】
ｄ．ｃＤＮＡのサイズ分画
通常、サイズ限外濾過カラムを用いて、リンカー分子および短い（３５０ｂｐ）ｃＤＮＡ断片を除去する。例えば、プラスチック製カラム（プラスチック製５ｍｌピペットを用いてもよい）に滅菌したグラスウールの小片で栓をして、１−ｍｌ セファロースＣＬ−４Ｂカラムを調製する。前記カラムを、０．１Ｍ食塩を含む１ｘＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で平衡化する。ｃＤＮＡをカラムにロードし２００μｌづつ分画を採取する。各分画の２μｌアリクォートをゲル電気泳動法およびオートラジオグラフィーにより分析して、ｃＤＮＡ溶出画分のピークを決定する。通常、ピークの前半分を含む画分をプールし、エタノール沈殿で精製し、蒸留水１０μｌに再懸濁する。
【０１１３】
ｅ．ｃＤＮＡのバクテリオファージベクターへのクローニング
ｃＤＮＡのクローニングおよび増殖用に設計され、あらかじめＥｃｏＲＩで消化され、断端がリン酸化されたものが市販されている（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製ラムダｇｔ１０など）。調製したｃＤＮＡを製造者のマニュアルに従ってラムダベクターにライゲーションにより挿入する。ライゲーションしたベクター／ｃＤＮＡ分子を市販のパッケージング抽出液を用いてファージ粒子にパッケージする。
【０１１４】
【実施例８】
ヒトｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ａ．ライブラリーのスクリーニング用のＤＮＡ断片（プローブ）の標識化
ＮａＮの第１３７１-１７５１番のようなＮａＮに特異的な核酸配列を認識するＲＮＡプローブを用いる。他のヌクレオチド配列は、ヒト核酸配列のヌクレオチド第７６５-１１６０番のようなＮａＮ配列に基づき開発することができる（図２，７および８）。ＮａＮのＨｉｎｄIII／ＢａｍＨＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳＫ＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に挿入した。得られた構築物の配列をシークェンシングで確認した。挿入ＤＮＡの方向は、ＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩのそれぞれの制限酵素切断部位で直線化した構築物をの５'端および３'端がＴ７およびＴ３ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターそれぞれに近接するようにした。ジゴキシゲニン標識されたセンス（ＨｉｎｄIIIで直線化しＴ７ＲＮＡポリメラーゼで転写）およびアンチセンス（ＢａｍＨＩで直線化しＴ３ＲＮＡポリメラーゼで転写）の転写産物をＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ転写キット（Ａｍｂｉｏｎ社）を用い、製造者の特性表に基づきインビトロで調製した。簡潔に説明すると、１μｇの直線化したテンプレートをそれぞれのＲＮＡポリメラーゼにより、以下試薬を含む、すなわち、それぞれのＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮａｓｅ阻害剤および反応バッファーを含む１ｘ酵素ミックス（Ａｍｂｉｏｎ社）、７．５ｍＭＡＴＰ、ＧＴＰおよびＣＴＰのヌクレトチド、５．６２５ｍＭ ＵＴＰおよび１．７２５ｍＭ Ｄｉｇ−１１ＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）からなる全量２０μｌ中で転写した。インビトロ転写反応は３７℃水浴中で、３時間行った。リボヌクレアーゼを含まないデオキシリボヌクレアーゼＩ（２単位／μｌ）１μｌを各反応液に加え、３７℃でさらに１５分間保温することによりＤＮＡテンプレートを除去した。ヌクレアーゼを含まない水、３０μｌおよびＬｉＣｌ溶液（７．５Ｍ塩化リチウム、５０ｍＭ ＥＤＴＡ）２５μｌを加えて反応を停止した。
【０１１５】
混合液を−２０℃で３０分間保温した。ＲＮＡ転写産物をマイクロフュージ遠心機で１３０００ｘｇ、４℃、１５分間ペレットした。上清を取り除き、ペレットを１００μｌの７５％エタノールで一回洗った。混合液を室温１３０００ｘｇで５分間再遠心した。その後、ペレットを閉じたチャンバー内で風乾し、続いてリボヌクレアーゼを含まない水、１００ｍｌに溶解した。転写産物の収量および完全性は、ＤＩＧ／Ｇｅｎｉｕｓキットを用い、製造者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）の推奨する条件で、フォルムアルデヒド入りアガロースゲル上で対照用ＤＩＧ標識ＲＮＡと比較して決定した。あるいはまた、熟練した当業者であれば、オートラジオグラフィー分析用の放射標識プローブを設計することもできる。
【０１１６】
ラット、マウスまたはヒトＮａＮナトリウムチャンネルｃＤＮＡの他の領域、例えば３'非翻訳領域配列なども、同様の方法により、ｃＤＮＡライブラリ・スクリーニングまたはノザン・ブロット解析用のプローブとして用いることができる。とりわけ、ファルマシア社製オリゴ・ラベリング・キット、Ｇｅｎｉｕｓキット（ベーリンガー・マンハイム社）などの市販のキットを用いてプローブを調製することができる。
【０１１７】
ｂ．ｃＤＮＡライブラリー・スクリーニング
前述のように、ＮａＮの３'非翻訳領域または他の領域に由来する非放射能標識（上記）または放射標識したＤＮＡまたはｃＲＮＡのＮａＮ特異的プローブを用い、適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション・ウォッシュ（５０〜６０℃、５ｘＳＳＣ、３０分）により、ヒトＮａＮナトリウムチャンネルの全長ホモローグを含む組換えプラークを検出する。組換えファージを乗せたニトロセルロースまたはナイロンのフィルターの調製を伴う、標準的プロトコル（Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning ？A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press; Ausubel et al., (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Greene 出版社）を用いて、ライブラリーをスクリーニングする。次いで組換えＤＮＡをＮａＮ特異的プローブ（上記）とハイブリダイズさせる。適度にストリンジェントなウォッシュを行う。
【０１１８】
複数のデュープ・フィルター上で陽性の（すなわち、アーチファクトまたはバックグラウンドではない）プラークを選び、以降の精製を行う。通常、ファージを分離するため、希釈後、一回以上のスクリーニングを実施する。その後、この結果得られたプラークを精製し、ＤＮＡを抽出してクローンＤＮＡのサイズを定性的に解析する。クローン群について、標準的手法で互いにクロス・ハイブリダイゼーションを行い（Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning ？A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press）、別個の陽性クローンを同定する。
【０１１９】
通常、チャンネルをコードする重複するクローンが単離される。次ぎに、標準的クローニング手法を用いて、任意の５'非翻訳配列、開始コドンＡＴＧ、コード配列、停止コドンおよび任意の３'非翻訳配列、ポリＡ付加コンセンサス配列、および場合によりポリＡ配列、を含む全長ｃＤＮＡ構築体を製造する。重複クローン断片が、全長ｃＤＮＡクローンを構成するに十分な断片を生成しない場合、ＲＡＣＥ（ＰＣＲに基づく）のような別法を用いて、不足部分または全長クローンを生成することができる。
【０１２０】
ｃ．ヒト類似全長クローンの特徴づけ
ラットおよびマウスのメッセンジャーＲＮＡのサイズと比較するため、全長クローンから得られるＮａＮ特異的ｃＤＮＡ配列をプローブとして用い、ノザンブロット解析法により、ヒト組織中のメッセンジャーＲＮＡのサイズを決定する。ラットＮａＮについて記載したものと同様の方法を用いて、クローンしたｃＤＮＡの生物学的活性を確認する。
【０１２１】
【実施例９】
ラット、マウスまたはヒトアミノ酸配列由来ＤＮＡ配列を用いるポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）による、全長ヒトＮａＮナトリウムチャンネルのクローンニングのアプローチ
トータルＲＮＡおよびポリＡ＋ＲＮＡを死後人体、胎児または生検または手術摘出組織から得たヒト後根神経節、三叉神経節または他の頭頚部神経節から、前述のように単離する。それから実施例１に記載したように、ｃＤＮＡの調製法およびＰＣＲに基づく手法を使用する。
【０１２２】
ラット、マウスまたはヒトＮａＮ特異的コード配列に由来する縮退ＰＣＲプライマー（図２（配列番号３）、図７Ｂ（配列番号５）、図８Ｂ（配列番号８）および図１１Ｂ（配列番号４１）参照）を用い、ポリメラーゼ連鎖反応によりｃＤＮＡを増幅する（Saiki et al., (1985) Science 230, 1350-1354）。熟練した当業者であれば、必要とするホモローグ配列を取得するためにＰＣＲ反応において、多くの変更可能な操作条件を操作することができる。このような条件としては、各サイクルおよびステップの温度、サイクルおよびステップ数、熱耐性ポリメーラーゼ、およびＭｇ²⁺濃度を挙げることができるが、これらに限定されない。ＮａＮナトリウムチャンネルのうち、より保存された配列に由来するＮｅｓｔｅｄプライマーを用いれば、より高度の特異性を達成することができる。
【０１２３】
通常、増幅反応は、第１鎖ｃＤＮＡ１μｌ、各プライマー０．８ｍＭおよびＥｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡポリメーラーゼ ミックス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）１．７５単位を用い、全量６０μｌで行う。Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡポリメーラーゼ ミックスは、従来の熱耐性ＤＮＡポリメラーゼ等と比較して、非特異的な増幅の増加なしでＰＣＲ産物の収量を増やす（Barnes, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA91, 2216-2220; Cheng et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5695-5699）。ＰＣＲ反応バッファーは、５０ｍＭＴｒｉｓ塩酸（ｐＨ９．２）、１６ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２．２５ｍＭＭｇＣｌ₂、２％（Ｖ／Ｖ）ＤＭＳＯおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０からなる。前述（Dib-Hajj et al., (1996) FEBS Lett. 384, 78-82）のように、増幅反応はプログラム式サーマルサイクラー装置（ＰＴＣ−２００、ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社）を用いて行う。第１に、熱変性ステップを９０℃で４分間、アニーリングステップを６０℃で２分間、そして伸長反応ステップを７２℃で９０秒とする。第２に、熱変性ステップを９４℃で１分間、アニーリングステップを６０℃で１分間、および伸長反応ステップを７２℃で９０秒とする。第２段階は３３回のリピートにして全段で３５サイクルとし、最終サイクルの伸長反応ステップを１０分間に延長する。これに加えて、サンプルと並行して対照反応を実施する。これには、１）ｃＤＮＡを除く全ての成分（ネガティブ・コントロール）、２）構成的に発現する産物（例えば、ＧＡＰＤＨ）に対する、プライマーと全ての反応液成分を用いるべきである。
【０１２４】
ＰＣＲ反応産物を１〜１．６％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルで調べる。おおよそ予想したサイズの増幅反応産物に対応するゲル（エジジウムブロミドで染色し、紫外線光で観察する）に基づきゲルから切り出し、ＤＮＡを精製する。
【０１２５】
この結果得られるＤＮＡは直接シークエンシングを行うか、例えばｐＣＲII、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）またはｐＧＥＭＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）などであって、これに限定されない、適切なベクターにライゲーションする。この後、クローンをシークェンシングして、ラット、マウスまたはヒト部分ＮａＮナトリウムチャンネル配列と類似する配列を含むものを同定する。
【０１２６】
【実施例１０】
クローンの分析
実施例９で得られた候補クローンを慣用技法により、さらに特徴づけする。また、慣用技法により、発現産物の生物学的活性も確認する。
【０１２７】
【実施例１１】
ヒト胎児組織からの全長ＮａＮ配列の単離
前述の標準的ＰＣＲプロトコルおよび標準的スクリーニング手順を用いて、市販のヒト胎児ｃＤＮＡライブラリーおよび／またはｃＤＮＡプールを、ＮａＮ特異的（ＰＣＲ用）プライマーまたはプローブ（ライブラリー・スクリーニング用）でスクリーニングする。
【０１２８】
【実施例１２】
ラットＤＲＧまたは三叉神経ニューロンのＲａｔＮａＮ断片によるノザンブロット
全ＤＲＧおよび／またはＤＲＧまたは三叉神経節（陽性反応組織として）および大脳半球、小脳および肝臓（陰性反応組織として）からの全ＲＮＡの、１０〜３０μｇを変性１％アガロース−フォルムアルデヒド・ゲルまたはアガロース−グリオキサル・ゲル中で電気泳動し、それから標準的分子生物学マニュアル（Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning ？A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press; Ausubel et al., (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Greene 出版社）に記載され、複数のステップで達成されるとも記載されているようにナイロン・メンブレンに移す。放射標識（放射比活性が１０⁸ｄｐｍ／μｇ以上）またはジゴキシゲニン標識したＲＮＡプローブが通常ノーザン分析に用いられる。アンチセンスＲＮＡプローブ（ＮａＮ特異的プローブを用いるインサイチュハイブリダイゼーションについて記載する実施例２０を参照）を、センスＤＮＡ断片からインビトロ合成で創製する。ＲＮＡを固定化したメンブレンを６ｘＳＳＣに浸し、ＲＮＡ側を上にしてハイブリダイゼーション用チューブ内に置く。メンブレン１０平方センチメートル当たり１ｍｌのプレハイブリダイゼーション・ハイブリダイゼーション溶液を加える。通常、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは市販のハイブリダイゼーション用オーブン内のガラスチューブ中で行われる。チューブをハイブリダイゼーション用オーブン内に置き、回転させながら、６０℃で１５分間ないし１時間保温する。希望する容量のプローブをピペットでハイブリダイゼーション・チューブに注入し、回転させながら６０℃で一晩保温を続ける。ハイブリダイゼーション溶液内のプローブ濃度は、比放射活性が１０⁸ｄｐｍ／μｇであれば１０ｎｇ／ｍｌ、または比放射活性が１０⁹ｄｐｍ／μｇであれば２ｎｇ／ｍｌとすべきである（ジゴキシゲニン標識プローブは２〜１０ｎｇ／ｍｌで用いる）。
【０１２９】
ハイブリダイゼーション溶液を注ぎ出し、等量の２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを加える。回転させながら室温で５分間保温を行う。ウォッシュ液を交換し、このステップを繰り返す。バックグラウンドを低らすためには、ウォッシュ液の容量を倍加することも役に立つかもしれない。ウォッシュ液を等量の０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳに交換し、チューブを回転しながら室温で５分間保温する。ウォッシュ液を交換し、このステップを繰り返す（これはストリンジェンシーの低いウォッシュである）。中程度ないし高度にストリンジェントな条件には、適度な温度（４２℃）または高温（６８℃）に予熱したウォッシュ液によりさらにウォッシュする。最終のウォッシュ液を除き、メンブレンを２ｘＳＳＣ中、室温でリンスする。次いで、オートラジオブラフィーを１週間までの期間実施する。代替法として、非放射性プローブを使用する場合は、化学発光技術（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を利用して信号を検出する。ゲルからの信号をゲル用標準分子量マーカーと比較し、転写産物のサイズを計算する。
【０１３０】
【実施例１３】
ＲＴ−ＰＣＲ法によるＮａＮの組織特異的分布
ＮａＮ特異的順方向（５'ＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＡＡ３'）（配列番号３９）および逆方向（５'ＧＡＣＡＡＡＧＴＡＧＡＴＣＣＣＡＧＡＧＧ３'）（配列番号２５）プライマーを用い、複数のラットから調製したｃＤＮＡをテンプレートとするＲＴ−ＰＣＲを行った。これらのプライマーは、ＮａＮ配列中ヌクレオチド第７６５番および第１１５６番の間（３９２ｂｐ）を増幅し、これらはデータベース中に類似の配列が存在しないことから（国立バイオテクノロジーインフォメーションセンターのＢＬＡＳＴＮなどのプログラムを使用）判断してＮａＮ特異的である。通常、増幅反応は、第１鎖ｃＤＮＡ１μｌ、各プライマー０．８μＭおよびＥｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡポリメラーゼ酵素ミックス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）１．７５単位を用い、全量６０μｌとして実施した。Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡポリメーラーゼ酵素ミックスは、従来の熱耐性ＤＮＡポリメラーゼ等と比較して、非特異的な増幅の増加なしにＰＣＲ産物の収量を増加する（Barnes, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2216-2220; Cheng et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5695-5699）。ＰＣＲ反応バッファーは、５０ｍＭＴｒｉｓ塩酸（ｐＨ９．２）、１６ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２．２５ｍＭＭｇＣｌ₂、２％（Ｖ／Ｖ）ＤＭＳＯおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０からなる。前述（Dib-Hajj et al., (1996) FEBS Lett. 384, 78-82）のように、増幅反応はプログラム式サーマルサイクラー装置（ＰＴＣ−２００、ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社）を用い、２段階で行った。第１に、熱変性ステップを９４℃で４分間、続いてアニーリングステップを６０℃で２分間、そして伸長反応ステップを７２℃で９０秒で行った。第２に、熱変性ステップを９４℃で１分間、アニーリングステップを６０℃で１分間、次いで伸長反応ステップを７２℃で９０秒とした。第２ステージは３３回のリピートとして全段で２５〜３５サイクルとし、最終サイクルの伸長反応ステップを１０分間に延長した。
【０１３１】
異なる組織においてＮａＮの信号の欠落がテンプレートの分解またはＰＣＲの阻害因子によるものではないことを確認するため、内部対照としてグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を用いた。ラットＧＡＰＤＨの配列をヌクレオチド第３２８−９９４番（登録番号：Ｍ１７７０１）に対応する６６ｂｐの産物を増幅するプライマーを用いて、共増幅した。ヒト遺伝子の構造に基づき、増幅産物は複数のエクソン・イントロン接合部位にまたがる（Benham et al., (1987) Nature 328, 275-278）。調整されたトータルＲＮＡを汚染しているかもしれないゲノムの偽遺伝子発現産物からのＧＡＰＤＨ配列の増幅を防止するため、逆転写反応に先立ち、定法どおりデオキシリボヌクレアーゼＩによる処理を行った（Ercolani et al., (1988) J. Biol. Chem. 263, 15335-15341）。
【０１３２】
ＮａＮＤＲＧおよび三叉神経節のニューロンにおいて第一義的かつ優先的に発現する。図４に、種々の神経性および非神経性組織について行ったＲＴ−ＰＣＲによるスクリーニングの結果を示す。レーン１，２，４，９および１６は４００ｂｐマーカーとともに泳動した単一の増幅産物が、３９２ｂｐのＮａＮ特異的産物と一致することを示す。レーン１および１６、２，４および９は、それぞれＤＲＧ、大脳半球、網膜および三叉神経節を用いた産物を含む。このアッセイ法により、ＮａＮは、小脳、視神経、脊髄、座骨神経、前頭部脳神経節(superior cranial ganglia)、骨格筋、心筋、副腎、子宮、肝または腎（それぞれ、レーン３、５−８、および１０−１５）において検出されなかった。並行して行ったＰＣＲ反応においては、ＧＡＰＤＨの増幅産物が同様に得られていることから（データ示さず）、ＮａＮの信号が大脳半球および網膜において減衰し、かつ、他の組織において検出されないことは、分解したＲＮＡまたはｃＤＮＡテンプレートおけるのＰＣＲの阻害因子によるものではないことがわかる。
【０１３３】
【実施例１４】
ＮａＮコード配列による宿主細胞の形質転換
ナトリウム電流、または細胞内ナトリウムイオンレベルの測定のための形質転換宿主細胞は、通常、ＨＥＫ２９３細胞などの細胞にコンストラクト（構築物）とともに、蛍光レポータープラスミド（ｐＧｒｅｅｎ Ｌａｎｔｅｒｎ−１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）をリン酸カルシウム沈殿法を用いて同時に形質導入することにより調製される（Ukomadu et al., (1992) Neuron 8, 663-676）。ＨＥＫ２９３細胞は、通常１０％子牛胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）添加高ショ糖ＤＭＥＤ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中で培養する。４８時間後、緑色の蛍光を発する細胞を記録用に選択する（Dib-Hajj et al., (1997) FEBS Lett. 416, 11-14）。
【０１３４】
組換えチャンネルを恒常的に発現する細胞株を調製するためには、ＮａＮコンストラクトを他の哺乳類細胞用選択マーカーを備えるベクターにクローニングする。形質導入にはリン酸カルシウム沈殿法を用いる（Ukomadu et al., (1992) Neuron 8, 663-676）。ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ−２９３）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）その他の適切な細胞株を１０％子牛胎児血清添加ダルベッコ改変イーグル培地中で標準的組織培養条件下で培養する。細胞培養液にＤＮＡ・リン酸カルシウム混合液を加え、１５〜２０時間置いた後、細胞を新鮮な培地で洗う。４８時間後、抗生物質（Ｇ４１８、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を加え、ネオマイシン耐性形質を獲得した細胞を選択する。Ｇ４１８で２〜３週間後、１０〜２０個の単離コロニーを滅菌した１０ｍｌピペットの先を使って収穫する。コロニーをさらに４〜７日培養し、分割し、続いて、全細胞パッチ・クランプ記録手法およびＲＴ−ＰＣＲ法によりチャンネルの発現を試験する。
【０１３５】
【実施例１５】
ＮａＮ特異的抗体の生産
抗原性ＮａＮ特異的ペプチドを用い、ウサギにボリクローナル抗体を生成させ、ラット、マウスまたはヒトＮａＮに特異的な抗体を製造する。一例として、免疫原性および表面到達性の基準を満足するので、ペプチド鎖ＣＧＰＮＰＡＳＮＫＤＣＦＥＫＥＫＤＳＥＤ（ラットアミノ酸第２８５−３０４番）（配列番号４０）が選択された。このペプチド配列は公開データベース中のいかなる配列にも適合しない。下線を付したシステイン（Ｃ）残基はジスルフィド結合の形成を防ぐためにアラニン（Ａ）に変更された。このアミノ酸変更により抗体の特異性に大差を生じないと期待される。
【０１３６】
ペプチド合成、ウサギの免疫感作、アンチペプチド抗体のアフィニティ精製法は標準的手法によった。精製抗体は培養物中、ＤＲＧに対して試験を行った。これらの抗体を用い、過剰量ペプチドによるブロッキングに前後して、標準的手法に従い免疫染色を実施した。
【０１３７】
ＤＲＧニューロンを１６〜２４時間培養後、下記のごとく処理し、ＮａＮ蛋白を免疫化学的に検出した。生理食塩水（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５．３ｍＭ ＫＣＬ、１ ＩＴＩＭＭ９０２ ２５ｍＭ ソルビトール、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３ｍＭ ＣａＣｌ₂ ｐＨ７．２）でカバーガラスを洗い、４％パラフォルムアルデヒド・０．１４Ｍリン酸バッファー中で、４℃、１０分間固定し、リン酸バッファー食塩水（ＰＢＳ）で５分間三回洗浄後、２０％ヤギ正常血清、１％ウシ血清アルブミン、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳで１５分間ブロッキングした。これらカバーガラスを抗ＮａＮ抗体（１００倍希釈液）中で４℃、一晩保温した。一晩保温に続き、カバーガラスをＰＢＳでよく洗った後、Ｃｙ３標識・抗ウサギＩｇＧ（１：３０００、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）とともに室温で２時間保温した。カバーガラスをＰＢＳで洗浄後、アクアポリマウントでスライドガラスにマウントした。ニューロンを、蛍光波長ユニットを装備したライツアリストプラン光学顕微鏡で検査し、Ｄａｇｅ社ＤＣ３３０ＴカラーカメラおよびＳｃｉｏｎＣＧ−７カラーＰＣＩフレームキャプチャ装置で画像を録画した（図７を参照）。
【０１３８】
【実施例１６】
ニューロパシックペインモデルでのＮａＮ発現の変動
ニューロパシック・ペインのＣＣＩモデルを使用して、ＤＲＧニューロンにおけるナトリウムチャンネル発現の可塑性を調べた。体重２４０〜２６０ｇのＳｐｌａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系成熟メスラット２２匹をペントバルビータール・ナトリウム塩（５０ｍｇ／ｋｇ静注）で麻酔し、右側座骨神経を大腿部中央で露出した。ＢｅｎｎｅｔｔｅとＸｉｅの方法（１９８８，Pain 33, 87-107）により、クロム・ガット手術糸（４−０号）で神経周囲を４針、緩く結紮した。切開部位を層状に重ねて閉じ、静菌性抗生物質を筋注した。
【０１３９】
既に、坐骨神経離断を行うと軸索切断したＤＲＧにおけるナトリウム電流に劇的な変動が見られ、これと並行してこれらのニューロンにおいて種々のナトリウムチャンネルの転写産物が変動することが判明している。ＴＴＸ−Ｒであるナトリウム電流および２つのＴＴＸ−Ｒナトリウムチャンネル（ＳＮＳ／ＰＮ３およびＮａＮ）は、顕著に減衰したが、その一方、急速にリプライミングされるＴＴＸ−Ｓ電流が出現するようになり、ＴＴＸ−Ｓ電流を生じるαIIIナトリウムチャンネルの転写産物はアップレギュレートされる。本発明者らは、軸索切断と対照的に、術後１４日間でＤＲＧにＣＣＩに起因する変化が生じることを見出した。ＴＴＸ−Ｒナトリウム電流同様、２つの感覚ニューロンに特異的なＴＴＸ−ＲチャンネルであるＮａＮおよびＳＮＳの転写産物は著しくダウンレギュレートされ、その一方、ＴＴＸ−Ｓ αIIIナトリウムチャンネルの転写産物は、小径ＤＲＧニューロンでアップレギュレートされていた。これらの変化は、外傷から引き起こされる痛覚過敏の一因であるＤＲＧニューロンの高興奮性の原因の一部となりうる。
【０１４０】
【実施例１７】
パッチクランプ法を用いるＮａＮチャンネル活性を調節する薬剤のアッセイ法
クローニングＮａ+チャンネルを発現する細胞を用い、ＮａＮチャンネルの活性を調節する薬剤、例えば、チャンネルを遮断し、または阻害し、あるいはチャンネルの開口を促進する薬剤をアッセイする。チャンネル活性は電位依存性であるため、試験する薬剤によって変調されたベースライン活性を観察するためには、脱分極条件を用いることもある。脱分極は、利用可能ないかなる手段によっても達成できるが、例えば、細胞外カリウムイオン濃度を約２０〜４０ｎＭに増加させるか、あるいは電気パルスを繰り返し印加する、などの方法がある。
【０１４１】
試験する薬剤をＨＥＫ２９３細胞またはＮａ+チャンネルを発現する他の形質転換細胞と培養する（Dib-Hajj et al., (1997) FEBS Lett. 416, 11-14）。十分な期間培養を続けた後、Ｎａ+チャンネル活性における薬剤によって誘発された変化をパッチクランプ法で測定することができる（Hamill et al., (1981) Pflugers Arch. 391, 85-100）。これらの測定のデータは、マッキントッシュ・クァドラ９５０または同様のコンピューター上でＰｕｌｓｅ（バージョン７．５２、ドイツ、ＨＥＫＡ社）などのプログラムを用いて得られる。ガラス毛細管をＳｕｔｔｅｒ社Ｐ−８７プラー機または同様の装置を用いて、炎で先端を滑らかにして電極（０．８〜１．５ＭＷ）を工作する。通常、細胞については、シール電圧初期値が５Gオーム未満である、漏洩電流が大きい（−８０ｍでの保持電流が０．１ｎＡ未満）、膜に気泡がある、およびアクセス抵抗値が５Ｍオーム未満である場合のみ分析が考慮される。アクセス抵抗値をモニターし、抵抗値に変動が生じた場合はデータを使用しない。直列の補償抵抗を用いて、電圧誤差を最小にする、そして、必要であればコンピューター制御アンプまたは同様の手法でキャパシタンス浮動を相殺する。
【０１４２】
電位依存性活性化および不活性化を比較できるよう、細胞は、通常、補償後の最大電圧変動が１０ｍＶ以下となるものを使用する。電圧クランプ記録を取るためにリニアサブトラクション法を用いる。膜電流は、典型的には５ＫＨｚでフィルターをかけ、２０ＫＨｚでサンプリングする。ピペット溶液は、１４０ｍＭ ＣｓＦ、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＥＧＴＡおよび１０ｍＭ Ｎａ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）などの標準的溶液を含む。標準のベージング溶液は１４０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＣａＣｌ₂、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１０ｍＭグルコース（ｐＨ７．３）などの標準的溶液である。
【０１４３】
適切な濃度のＴＴＸに暴露するか、および／または、それらの異なる定常（電位）不活性化特性に基づきトロドトキシン（ＴＴＸ）抵抗性およびＴＴＸ感受性Ｎａ+電流を区別する、プレ・パルスプロトコルによってＴＴＸ抵抗性およびＴＴＸ感受性電流を測定する（Cummins & Waxman (1997) J. Neurophysiol. 17, 3503-3514; Sontheimer & Waxman, (1992) J. Neurophysiol. 68, 1001-1011）。
【０１４４】
標準的パルスプロトコルを用いて、データを収集し、解析して電位依存性、定常（電位）状態の特性、キネティックス、およびリプライミングなどのナトリウム電流の性状を測定する。電流量および細胞のキャパシタンスを測定することによりＮａ+電流密度を推定し、これに基づいて異なる条件下でのチャンネル密度を比較することが可能となる（Cummins & Waxman (1997) J. Neurophysiol. 17, 3503-3514, 30）。電流クランプ条件で細胞を調べて、自発性および誘発性活動電位の発生パターン、発生の閾値、反応周波数特性、および脱分極・過分極、さらに発電の他の局面を調べる（Sontheimer & Waxman, (1992) J. Neurophysiol. 68, 1001-1011）。ＮａＮを発現する対照細胞、および試験する薬剤に曝露された細胞の両方でこれらの測定を行う。
【０１４５】
【実施例１８】
細胞内ナトリウム［Ｎａ ⁺ ］測定によるＮａＮチャンネル 活性を調節する薬剤のアッセイ
試験する薬物を、ＮａＮチャンネル活性を呈する細胞とともに培養する。十分な期間の培養後、薬剤により誘発されたＮａ⁺チャンネル活性の変化を、ＳＢＦＩを用い、イメージの相対強度により［Ｎａ⁺］量を測定する。本方法では、ＳＢＦＩ（ナトリウム結合性ベンゾフランイソフタレート（Harootunian et al., (1989) J. Biol. Chem. 264, 19458-19467））のようなＮａ⁺の指示薬または同様の色素を用いて、よって細胞質中のフリー［Ｎａ⁺］を測定する。まず、細胞に膜透過性であるＳＦＢＩのアセトキシメチル・エステル体（ＳＢＦＩ／ＡＭ）または同様の色素（通常、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に１０ｍＭの濃度に溶かしてストック溶液とする）をロード（浸透）させる。市販の相対光強度測定装置（例えば、Ｇｅｏｒｇｉａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製品など）を用いて顕微鏡のステージ上で信号強度を記録する。適切な波長（例えば、３４０：３８５ｎｍ）の励起光を供給する。励起光を円二色性反射盤（４００ｎｍ）を通して、細胞へ通過させ、４５０ｎｍ以上の発光を集光する。蛍光シグナルは、例えば（ＧｅｎIIＳｙＳなどの）イメージ・インテンシファイアーで増幅され、ＣＣＤカメラまたは同様のデバイスに集められ、フレーム・グラバーへインターフェースされる。蛍光の減衰を考慮して、細胞質中フリー［Ｎａ⁺］のアッセイには３４０：３８５の波長比が用いられる。
【０１４６】
ＳＢＦＩの蛍光強度を較正するため、細胞に既知濃度のＮａ⁺を含む較正用溶液を潅流する（典型的には、０および３０ｍＭ、または、０，３０および５０ｍＭ［Ｎａ+］、およびグラミシジンおよびモネンシン）。ＲｏｓｅとＲａｎｓｏｍの報告によれば（Rose & Ransom, (1996) J. Physiol. (Lond) 491, 291-305）、ＳＢＦＩの３４５／３９０の蛍光比は［Ｎａ⁺］i濃度の変化に対して単調に変化する。実験は複数（典型的には少なくとも４）の異なるカバーガラスを用いて繰り返し行い、対照用細胞、およびチャンネルの活性を遮断し、阻害し、または増強する様々の濃度の薬剤に曝露した細胞において統計的に有意な測定結果が得られるようにする。このような方法はＳｏｎｔｈｅｉｍｅｒらにより解説されている（Sontheimer et al., (1994) J. Neurosci. 14, 2464-2475）。
【０１４７】
【実施例１９】
シンチグラフィック・イメージングによるＮａＮチャンネル活性を調節する薬物のアッセイ
クローンしたＮａ⁺チャンネルを発現する細胞株を用い、ＮａＮチャンネル活性を調節する薬剤、例えば、チャンネルを遮断し、阻害し、あるいはチャンネルの開口を促進する薬剤をアッセイする。例えば、試験する薬剤を、Ｎａ⁺チャンネルを発現するＨＥＫ２９３、または他の形質転換細胞（Dib-Hajj et al., (1997) FEBS Lett. 416, 11-14）と培養する。十分な期間の培養後、アイソトープ法によりＮａ⁺の流入量を測定し、薬剤により誘発されたＮａ⁺チャンネル活性の変化を検出する。²²Ｎａは、ガンマ線の放出体であり、Ｎａ⁺の流量測定に利用でき（Kimelberg & Waltz, (1988) The Neuronal Microenvironment (Boulton et al., 編集) Humana Press）、そして³⁶Ｒｂ⁺はＮａチャンネル活性の指標となるＮａ+／Ｋ+ＡＴＰａｓｅ活性の測定に利用できる（Sontheimer et al., (1994) J. Neurosci. 14, 2464-2475）。⁸⁶Ｒｂ⁺イオンはＫ⁺イオンと同様にＮａ⁺／Ｋ+ＡＴＰａｓｅに取り込まれるが、その半減期は⁴²Ｋ⁺よりもはるかに長いという利点を有する（Kimelberg & Mayhew (1975) J. Biol. Chem. 250, 100-104）。したがって、一方向性のウアバイン感受性³⁶Ｒｂ⁺の取り込みを測定することにより、活動電位の源であるＮａ+／Ｋ+ＡＴＰａｓｅ活性を定量的にアッセイすることができる。
【０１４８】
ＮａＮを発現する細胞を培養しアイソトープ標識した後、細胞内のアイソトープ含量を液体シンチレーションカウンターまたは類似の方法で測定し、細胞蛋白量を培養細胞用変法等（Goldschmidt & Kimelberg (1989) Anal. Biochem. 177, 41-45）に従うビシンコニン酸蛋白アッセイ（Smith et al., (1985) Anal. Biochem. 150, 76-85）等で決定する。Ｎａ+を遮断し、阻害し、またはチャンネルの開口を促進する薬剤の存在下または非存在下で²²Ｎａおよび³⁶Ｒｂ⁺の流量を決定する。これによりこれら薬剤のＮａＮに対する作用の決定が可能となる。
【０１４９】
【実施例２０】
ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション
ａ．プローブ
プローブは実施例５に記載したように調製する。
【０１５０】
ｂ．ＤＲＧニューロンの培養
成熟ラットからのＤＲＧニューロンの培養法は確立されており、既に報告されている（Rizzo et al., (1994) J. Neurophysiol. 72, 2796-2815）。 簡略に述べると、Ｓｐｌａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系成熟メスラットからの腰椎神経節（Ｌ４、Ｌ５）の支持組織・髄鞘を除去し、コラーゲナーゼ、次いでパパインを含む酵素溶液中で順次培養する。組織を、１：１ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびハンクスＦ１２培地、１０％ウシ胎児血清、１．５ｍｇ／ｍｌトリプシン・インヒビター、１．５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、１００単位／ｍｌペニシリン、および０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンをふくむ培養液中で摩砕し、細胞を５００〜１０００個／ｍｍ²の密度でポリオルニチン／ラミニンを塗布したカバーガラス上に播いた。細胞を加湿した９５％空気／５％ＣＯ²インキュベーター中で、３７℃に一晩維持し、その後、前述のように ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション・細胞化学用に処理する（Black et al., (1994) Brain Res. Mol. Brain Res. 23, 235-245; Zur et al., (1995) Brain Res. Mol. Brain Res. 30, 97-105）。熟練した当業者であれば、同様の方法で三叉神経節を培養することもできる。
【０１５１】
ｃ．組織の調製
Ｓｐｌａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系成熟メスラットを、例えば抱水クロラールで深層麻酔し、まず、リン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）溶液で、次に４％パラフォルムアルデヒド添加ソレンセンリン酸バッファー、ｐＨ７．４を、４℃で心臓を通して還流した。潅流固定の後、Ｌ４およびＬ５の部位の後根神経節および三叉神経節を採取し、新鮮な固定液中に置いた。２〜４時間後、組織を４％パラフォルムアルデヒドおよび３０％Ｓｕｃｒｏｓｅを含む０．１４Ｍリン酸バッファー中に置き、４℃で一晩保存した。１５μｍの組織切片を切り、ポリ-Ｌ-リジンを塗布したスライドガラス上に置いた。スライドを以前に報告されたようにｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション・細胞化学用に処理する（Waxman et al., (1994) J. Neurophysiol. 72, 466-470; Black et al., (1994) Brain Res. Mol. Brain Res. 23, 235-245）。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション・細胞化学処理を行った後、スライドを脱水、清浄し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔでマウントした。図５にこの結果を示す。
【０１５２】
ＮａＮセンス・リボプローブでハイブリダイズしたＤＲＧ切片は、非特異的標識を示さなかった（図５、パネルＣ）。ＮａＮアンチセンス・リボプローブをハイブリダイズしたＤＲＧ（図５、パネルＡ）および三叉神経節（パネルＢ）では、ＮａＮのシグナルが殆どの小ニューロン（直径３０ｍｍ未満）に存在しており、対照的に、殆どの大ニューロン（直径３０ｍｍ以上）は、ＮａＮのハイブリダイゼーションによるシグナルを示さなかった。アンチセンスＮａＮリボプローブをハイブリダイズした脊索、小脳および肝臓の切片には特異的シグナルは観察されなかった（それぞれ、パネルＤ、ＥおよびＦ）。
【０１５３】
【実施例２１】
マイクロサテライト配列
以下にマウスのイントロン・マイクロサテライト配列を示す。これらのマイクロサテライトは、ヒトＳＣＮ１１ａ遺伝子では多型性を示すかもしれない、疾病に関連する変異体対立遺伝子をスクリーニングするためのマーカーとして利用できるであろう。このようなスクリーニング法として、ハイブリダイゼーションまたはアンプリフィケーション・アッセイは、容易く利用できる。
【０１５４】
イントロン４：マイクロサテライトはｄＴｄＧ（配列番号２９）
AGTTTAATGTTGAGTGAATTGTGGTGGTGATTTCCCACTTGAGGCCTTTGTGTTAAAGCCCAATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGGTTGGGGGGTGGTGGCAGAGTCTGGTATTGGTAAGGTGAGAGCAATCCCAGAACGTCCACCTGCTCTTCCATTTTATTAATCAGGCAGGCCTCT
イントロン５：マイクロサテライトはｄＣｄＴｄＧ（ｄＮｄＧ２）_x（Ｘ５−３０）（配列番号３０）
GTAAGCCACTGGCTCTTAACTAAAATGCTCGTTGGCATTAGAACATTTCTGAGCTGGGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGATGGTGGTGGTGGAGGTGGNGGTGGAGGTGGTGGCTGTGGTGGTGGNGGTGGTGGTGGTGGTGGANGTGGANGTGGTGGCGTGGTGGTGGNGGTGGTGGTGGAGGTGGTGGCTGTGGTGGTNGTGGTGGC
イントロン６：マイクロサテライトはｄＣｄＡ（配列番号３１）
TGTGCATGCTTGATTCCCAGCTCCTATGGTCTGATTACTCGGTCCTTAGGAGCAAGGCCAGACTGTCCACCCTGACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGTGTAGAGAATTACCTCATTCTTGGAGTTTCTCTGGAAAAGGAATGTCTCAAAGCCAAGTTCACAGAGCAACAGCTG
イントロン８：５'マイクロサテライトはｄＴのストレッチが後に続くｄＴｄＣｇ（配列番号３２）
TGTTAGAAACTCTAAGACAATGAAGCACCATGCTGGAAATAAGAGCACAAACTCTTTCTTCATGCATTACCCACTGCTTGTGCTTTCACCTTAGTGCTCGTGCTCTCTCTTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTTTTTTTTTTTTT
イントロン８：３'マイクロサテライトはｄＣｄＡ（配列番号３３）
CACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGAGAAACACTGTCGCAGTCATACATATAAAGATAAATACATCTTAAAAAAAGAACCATGTGATTGAGTTATAAAATATTCCAACTTAT
イントロン１０Ｂ：マイクロサテライトはｄＣｄＡ、続いて、３個のヌクレオチド下流のｄＣｄＡ₃（配列番号３４）
AGGTCATTTCCTCTGCAGTGTGCTTGGCAGGAAAAACTTCCTGGCTATTCAAGTCAGTGCCCTGCTTGATCATCCATGTATCACACACACACAAAACAAACAAACAAACAAACAAAACCCTGGGGAAGAAGGAAGAGGTTAAGCACATAGGCAGAGAGCAGCCAGGCTGACTCAGAGCAAACACCTGATCATTCTTCCAT
イントロン１２：マイクロサテライトはｄＰｙｄＧ（ｄｔ／ｄＣｄＧ）（配列番号３５）
GTGCTGGGATCAAAGGCGTGCGCCGCCACCACGCCCGGCCCCTTTTTATGTTTCAAATTTACTTTTATCATGTGCACGTGTGTGGGTGCGTGCATGTGTGTGCGTGCGTGTGCGTGTGNGTGTGNGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG
イントロン１４：マイクロサテライトはｄＣｄＡ（配列番号３６）
CACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACTTGCATCTTTGAGTTAATTGGATAGGCTGAGTCTTACACCGGAATCATACTGTTGC
イントロン１５Ａ：マイクロサテライトはｄＣｄＡ（配列番号３７）
CCAATGAGAGACTCTTGTCTCAAAAAAGCCATGGTGTCCAGATCCTGAGGAATAACACCTAAGAATGTGCTCTGGCCTGAAAACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGTTTTATTTATTTATTTAAAAAAATATGTCTCTAGGCATTGCTGAAATGTCTCCTACAGGATTAAGTCAACCAGAGCCA

【０１５５】
上記の議論および実施例は、単に特定の好適な実施の形態の詳細な記述を提示するものであることを理解すべきである。本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な修正や等価な変更がなしうることは、当業者にとっては明白であろう。本特許明細書において引用および参照された文献は、その全体が参考文献として本明細書に取り込まれている。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ラットＮａＮｃＤＮＡ（配列番号３）の配列を示す。
【図２】 ラットＮａＮｃＤＮＡ（配列番号３）の推定上のアミノ酸配列を示す。ドメインＩ−ＩＶの予測された細胞膜部分に下線が引いてある。ＴＴＸ−Ｒ表現型に関連するＤＩ−ＳＳ２のアミノ酸、セリン"Ｓ"は、太活字で示してある。
【図３】 ＮａＮのａ−サブユニットの予測された２次構造の模式図を表す。
【図４】 様々な組織からの抽出物のα−ＮａＮについての、ＮａＮに特異的なプライマーを使って行ったＲＴ−ＰＣＲ分析結果を示す。ＮａＮは、背骨神経節と三叉神経節において多量に発現している。低レベルのＮａＮが大脳半球と網膜組織において検出される。小脳、視神経、脊髄、挫骨神経、上位頸部神経節、骨格筋、心筋、副腎、子宮、肝臓および腎臓では、ＮａＮ信号は検出されない。
【図５】 インサイチュハイブリダイゼーションによる、α−ＮａＮの組織内分布を示す。三叉神経節細胞は、中程度から高程度のハイブリダイゼーション信号を示す（Ａ）。後根神経節細胞は、その小さな細胞において、中程度から高程度のハイブリダイゼーション信号を示す（Ｂ）。大きな後根神経節細胞では、ハイブリダイゼーション信号が減衰している（矢印）。ＤＲＧニューロンにおいては、センスプローブの信号が無い（Ｃ）。脊髄、小脳および肝臓においては、ハイブリダイゼーション信号は見られない（Ｄ−Ｆ）。全ての組織は、成長したスプレードーリーラットからのものである（スケールバー＝５０μｍ）。
【図６】 ラットのα−サブユニットのドメイン１の増幅生産物の予測された長さ、およびそのサブユニットに特異的な制限酵素プロフィールを示す。
【図７Ａ】 マウスのＮａＮのヌクレオチド（配列番号４）配列を示す。
【図７Ｂ】 マウスのＮａＮのアミノ酸（配列番号５）配列を示す。
【図８Ａ】 ヒトＮａＮタンパク質の部分的なヌクレオチド配列（配列番号６）を示す。
【図８Ｂ】 ヒトＮａＮタンパク質の部分的なアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【図９】 成長したラットのＬ４／５神経節から得られ、ＮａＮに対する抗体と反応し、免疫蛍光局在決定用に処理されたＤＲＧニューロンの培養物を示す。（Ａ−Ｂ）ＮａＮ免疫染色は、ＤＲＧニューロンの細胞体で顕著である。（Ｃ）ＮａＮは、ＤＲＧニューロンの細胞体並びに神経突起に存在する。（Ｄ）ＮａＮタンパク質を発現しないニューロンのノルマルスキー写真像。（Ｄ'）ＮａＮタンパク質を発現しないニューロンの蛍光写真像。
【図１０Ａ】 マウス染色体９末端上での、Ｓｃｎ１ １ａおよびそれに関連する遺伝子の場所を示す。ジャクソンＢＳＳバッククロスからのハプトタイプ。黒箱は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊアリールを表し、白箱は、ＳＰＲＥＴ／Ｅｉアリールを表す。それぞれのハプトタイプを持つ動物数が、それそれの行の下に示してある。タイピングが不明瞭なときは、欠けているデータは、近接したデータから推論された。
【図１０Ｂ】 図１０Ａのデータに基づく染色体９末端のマップ。ＭＧＤコンセンサスマップからのＳｃｎ５ａとＳｃｎ１０ａの位置およびヒトのオルソログ位置が印されている。ナンバーは、コンセンサスマップ上のｃＭ位置である。
（http://www.informatics.jax.org/bin/ccr/index）。
【図１１Ａ】 完全なオープンリーディングフレームにわたるヒトＮａＮ遺伝子のｃＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号４１）を示す。
【図１１Ｂ】 完全長ヒトＮａＮタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４２）を示す。
【配列表】

Claims (25)

1. 配列番号４２に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を示し、テトロドトキシン抵抗性の電位依存性ナトリウムチャンネル活性を有するタンパク質をコードする、単離された核酸分子。
2. 配列番号４１に対して少なくとも９０％の配列同一性を示し、テトロドトキシン抵抗性の電位依存性ナトリウムチャンネル活性を有するタンパク質をコードする、単離された核酸分子。
3. 配列番号４１に記載の塩基配列からなる、単離された核酸分子。
4. 配列番号４１の残基３１〜５４０３に対して少なくとも９０％の配列同一性を示し、テトロドトキシン抵抗性の電位依存性ナトリウムチャンネル活性を有するタンパク質をコードする、単離された核酸分子。
5. 配列番号４１の残基３１〜５４０３の塩基配列からなる、単離された核酸分子。
6. ヒト由来である、請求項１に記載の単離された核酸分子。
7. 配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性を示す、請求項２に記載の単離された核酸分子。
8. 配列番号４２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、単離された核酸分子。
9. １つ以上の発現制御要素と作動可能に連結された、請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子。
10. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクター。
11. 請求項１０に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
12. 原核生物及び真核生物からなる群から選択される、請求項１１に記載の宿主細胞。
13. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子を含むように形質転換された宿主細胞。
14. 請求項１２又は１３に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、組換えタンパク質の製造方法。
15. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子にコードされる、テトロドトキシン抵抗性の電位依存性ナトリウムチャンネルタンパク質。
16. 配列番号４２に記載のアミノ酸配列からなる、テトロドトキシン抵抗性の電位依存性ナトリウムチャンネルタンパク質。
17. 請求項１５又は１６に記載のテトロドトキシン抵抗性の電位依存性ナトリウムチャンネルタンパク質に特異的に結合する単離された抗体。
18. 標識されている、請求項１７に記載の単離された抗体。
19. 請求項１５又は１６に記載のテトロドトキシン抵抗性の電位依存性ナトリウムチャンネルタンパク質の活性を調節する薬剤を同定する方法であって、当該タンパク質を発現する細胞に薬剤を接触させる工程と、当該タンパク質の活性の変化を測定する工程とを含む方法。
20. 前記測定が、膜電位の測定によって達成される、請求項１９に記載の方法。
21. 前記測定が、細胞内ナトリウムのレベルを測定することによって達成される、請求項１９に記載の方法。
22. 前記測定が、ナトリウムの流入を測定することによって達成される、請求項１９に記載の方法。
23. 前記ナトリウムの流入が、 ²² Ｎａまたは ⁸⁶ Ｒｂを用いて測定される、請求項２２に記載の方法。
24. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子に対してアンチセンスである、単離された核酸分子。
25. 請求項１５又は１６に記載のテトロドトキシン抵抗性の電位依存性ナトリウムチャンネルタンパク質の発現を調節することができる、請求項２４に記載の単離された核酸分子。

Images