JPH10503091A

JPH10503091A - アセチルコリン作動性イオンチャネル受容体サブユニットのクローニングと発現

Info

Publication number: JPH10503091A
Application number: JP8505839A
Authority: JP
Inventors: ベレンエルゴイヘン，アナ; エス．ジョンソン，デビッド; リチャードボールター，ジェームズ; フォックスハイネマン，スチーブン
Original assignee: ザソールクインスチチュートフォアバイオロジカルスタディズ
Priority date: 1994-07-21
Filing date: 1995-07-18
Publication date: 1998-03-24
Also published as: US5683912A; US6100046A; US6013766A; EP0765391B1; ATE317434T1; DE69534776D1; EP0765391A1; US6646109B1; CA2192694C; WO1996003504A1; DE69534776T2; CA2192694A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、アルファ９ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットをコードする単離された核酸、およびこれにコードされる受容体サブユニットタンパク質を提供する。また、本発明の核酸を含有するベクター、これで形質転換される宿主細胞、アルファ９ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニット、および本発明の受容体サブユニットおよびその突然変異体を発現する宿主細胞ならびにトランスジェニック非ヒト哺乳動物中で組換え発現される少なくとも１つのアルファ９サブユニットよりなる機能性ニコチン性アセチルコリン受容体が提供される。本発明の受容体は、少なくとも１つのアルファ９ニコチン性アセチルコリンサブユニットよりなり、アセチルコリンに活性化されるが、ニコチンとムスカリンにより阻止される陽イオン性受容体チャネルを形成する。本発明はまた、少なくとも１つの本発明のサブユニットを含有する、機能的な本発明の受容体のイオンチャネル活性を調節する化合物の同定方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】アセチルコリン作動性イオンチャネル受容体サブユニットのクローニングと発現発明の背景細胞間コミュニケーションは、多細胞系の機能にとって必須である。脳、内分泌系、腸神経系および神経筋接合内の情報伝達のメディエーターとしてのイオンチャネルタンパク質は、細胞膜を通過する電圧変化を生成するイオン流量（ion flux）を調節し、同時に生理的シグナル（例えば、リガンド濃度や経膜的電圧の変化）のセンサーとしても作用する。リガンド作動性イオンチャネル（ligand-g ated ion channels）は、中枢神経系の細胞間の迅速な対話を可能にし、１つの細胞から放出される化学的神経伝達物質シグナルを標的細胞の細胞膜に沿って伝搬する電気シグナルに変換する。リガンド作動性イオンチャネルは、成分サブユニットが関連遺伝子にコードされるマルチマータンパク質複合体である。現在多くのファミリーのリガンド作動性受容体が同定され、配列の同一性に基づいて性状解析されている。陽イオン性チャネルを形成するものには、例えば興奮性ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲｓ）、興奮性グルタミン酸活性化受容体、５−ＨＴ₃セロトニン受容体、ＡＴＰ受容体および筋形質リアノジン（ryanodine）受容体がある。陰イオン性チャネルを形成するものには、例えば阻害性ＧＡＢＡおよびグリシン活性化受容体がある。神経伝達物質アセチルコリン（ＡＣｈ）は、薬理学的に異なる２つのタイプの受容体を活性化する：リガンド作動性イオンチャネルスーパーファミリーのニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）と、Ｇ−タンパク質結合受容体スーパーファミリーのムスカリン性アセチルコリン受容体（ｍＡＣｈＲ）（テーラー、エー・グッドマン−ギルマン、ティー・エィチ・ラル、エー・エス・ニーズおよびピー・テーラー（Taylor，A．Goodman-Gilman，T.H．Rall，A.S．Nies and P.Taylor）編（ニューヨーク：パーガモン・プレス（Pergamon Press））、ｐｐ．１６６−１８６，１９９０）；（テーラー、エー・グッドマン−ギルマン、ティー・エィチ・ラル、エー・エス・ニーズおよびピー・テーラー（Taylor，A． Goodman-Gilman，T.H．Rall，A.S．Nies and P．Taylor）編（ニューヨーク：パーガモン・プレス（Pergamon Press））、ｐｐ．１２２−１４９，１９９０）。多くの病理および症状がｎＡＣｈＲに関係がある（例えば、重症筋無力症、精神分裂病、アルツハイマー病、トウーレット病およびニコチン中毒）。生化学的および電気生理的データは、ニコチン性およびムスカリン性受容体は、機能的に異なるものであることを証明している（ボナー（Bonner）ら、Ｓｃｉｅｎｃe，２３７，５２７−５３２，１９８７）。ｎＡＣｈＲは、原形質膜を４回またがる関連するタンパク質サブユニットよりなる５量体であり、ｍＡＣｈＲは、原形質膜を７回またがると考えられている単一のポリペプチド鎖により形成される。５つのサブユニットよりなる糖タンパク質であるニコチン性アセチルコリン受容体は、アセチルコリンの結合を陽イオン性チャネルに伝達する。５つの受容体サブユニットは、中央のチャネルの周りに擬対象性の環を形成する。ニューロンのニコチン性ＡＣｈＲ（ＮｎＡＣｈＲ）は、多くの中枢および抹消シナプスでの神経伝達を仲介し、１０個の異なるニューロン遺伝子にコードされる２つのタイプのサブユニット（アルファとベータ）よりなる。卵母細胞中のサブユニットＲＮＡの特定の組合せが発現すると、生物物理的に異なるチャネルが得られる（これらのチャネルは、そのチャネルを調節するリガンドに基づき薬理学的に区別される）。組換えＤＮＡ技術により、脊椎動物の筋肉のｎＡＣｈＲサブユニットであるアルファ１、ベータ１、ガンマ、デルタ、およびイプシロン、ならびにニューロンのサブユニットであるアルファ２、アルファ３、アルファ４、アルファ５、アルファ６、アルファ７、アルファ８、ベータ２、ベータ３、およびベータ４（ラットの命名法）の同定が可能になった。これらのサブユニットの種々の組合せにより、ＡＣｈとニコチンに活性化される機能性組換え受容体チャネル複合体が得られる。神経筋接合部のｎＡＣｈＲは、（αｌ）₂βｌγδ化学量論を有すると考えられている（ガルジ（Galzi）ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏl．，３１，３７−７２，１９９１）。これに対して、ニューロンｎＡＣｈＲサブユニットのアルファ２、アルファ３、およびアルファ４は、ベータ２またはベータ４と協同して機能性ｎＡＣｈＲに集合させる（ボウルター（Boulter）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７７６３−７７６７，１９８７；バリベット（Ballivet）ら、Ｎｅｕｒｏｎ，１，８４７−８５２，１９８８；ワダ（Wada）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，３３０−３３４，１９８８；デネリス（Deneris）ら、Ｎｅｕｒｏｎ，１，４５−５４，１９８８；ヅボイジン（Duvoision）ら、Ｎｅｕｒｏｎ，３，４８７−４９６，１９８９；クツリエ（Couturier）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，１７５６０−１７５６７，１９９０）が、ニューロンのアルファ７およびアルファ８サブユニットは、他のサブユニットの非存在下で機能性ｎＡＣｈＲを形成することができる（クツリエ（Couturier）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，１７５６０−１７５６７，１９９０；セグエラ（Seguela）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１３，５９６−６０４，１９９３；ゲルザニッチ（Gerzanich）ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４５，２１２−２２０，１９９４）。１０個の異なるニコチン性アセチルコリンサブユニット遺伝子が存在するため、機能性受容体を生成するサブユニットの多くの組合せが可能である。すでにクローン化された遺伝子から調製することができるサブユニットの多くの組合せにもかかわらず、未変性のｎＡＣｈＲの性質は、必ずしも組換え受容体の性質と一致しない（サージェント（Sargent）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１６，４０３−４４３，１９９３）。例えば、ウシのクロム親和性細胞、ラット中のコリン作動性受容体やヒヨコの蝸牛有毛細胞中のコリン作動性受容体は、既知のサブユニットのいかなる組合せにも一致しない薬理学的プロフィールを示し（シルバン（Shirvan）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８８，４８６０−４８６４，１９９１：ホウスレイ（Housley）ら、Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ，２４４，１６１−１６７，１９９１；フックス（Fuchs）ら、Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ，２４８，３５−４０，１９９２；エロステグイ（Erostegui）ら、ＨｅａｒｉｎｇＲｅｓ．，７４，１３５−１４７，１９９４）、従って別のまだ同定されていないサブユニットの存在を示唆している。従って、ニコチン性アセチルコリン受容体スーパーファミリーの別のメンバーを同定し、そのようなｎＡＣｈＲサブユニットおよびそこから構築される機能性受容体を性状解析するニーズがあり、これには機能性受容体の産生における種々のサブユニットの構築（すなわち、リガンド結合部位およびリガンド作動性経膜的チャネルを含有するサブユニット構築）の本質を解明し、サブユニット構築体の構造と対応する受容体の薬理学的プロフィールの間の関係を解明することが含まれる。本発明は、これらのニーズを満足し、同時に関連する利点を与える。発明の要約本発明は、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）サブユニットをコードする単離された核酸、これにコードされる単離された受容体サブユニット、ならびに組換え発現したアルファ９ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）を提供する。さらに、そのような核酸を含有するベクターとプローブ、そのような核酸で形質転換された宿主細胞、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびそのようなオリゴヌクレオチドを含有する組成物、本発明の受容体に特異的に結合する抗体、およびそのような抗体を含有する組成物、ならびにトランスジェニック非ヒト哺乳動物が、提供される。本発明のアルファ９ｎＡＣｈＲサブユニットは、アセチルコリンに活性化される陽イオン（カルシウムを含む）に透過性の陽イオン性受容体チャネル複合体を形成する。本発明の機能性アルファ９ｎＡＣｈ受容体は、ホモマー受容体として発現（すなわち、１つのタイプのサブユニットのみが機能に必要である）されるか、または本発明の受容体は、機能性受容体を形成するのに２つ以上のタイプのサブユニットが必要であるヘテロマー受容体として発現される。さらに本発明は本発明の受容体の活性、そのような受容体をコードする核酸の活性を調節する化合物の同定方法を提供する。図面の簡単な説明図１は、アルファ９ｎＡＣｈＲサブユニットをコードするｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列の下に示す。シグナルペプチドの切断は、アミノ酸１位で起きることが予測される（フォン−ヘイネ（Von-Heijne）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１４，４６８３−４６９１，１９８６）。シグナルペプチドをコードするアミノ酸に、負の数を割り当てた。ヌクレオチドは５’から３’の方向に、成熟タンパク質の推定Ｎ−末端残基のコドンの最初のヌクレオチドから開始して、番号を付けた。アミノ酸残基１の５’側のヌクレオチドは、負の数で示す。矢尻は、ゲノム配列決定により決定されたイントロンの位置を示す。膜にまたがる領域には下線を引いてある。図１に示す配列情報はまた、配列番号１と２にパテントイン（Patentin）フォーマットで記載してある。図２Ａは、アルファ９サブユニット遺伝子の制限酵素地図を示し、図２Ｂは、アルファ９サブユニット遺伝子の全コード配列にまたがる重複ゲノムクローンであるＭ６とＭＮＡＮＯの部分的制限酵素地図を示す。ＮｃｏＩとＮｈｅＩ制限部位はｐＭＮＡＮＯ中でマッピングされておらず、ＳａｃＩ制限部位はｐＭ６中でマッピングされていない。図３は、既知のｎＡＣｈＲアルファサブユニットのアミノ酸配列を並べたものである。ヒヨコのサブユニットであるアルファ８以外のすべての配列は、ラットのサブユニットに相当する。すべての配列で同じ残基は、黒い背景に白文字で示してある。相同性を最大にするために、スペースを入れてある。予測されるシグナルペプチドと膜をまたぐ可能性のある４つの領域を示してある。星印は、すべてのｎＡＣｈＲアルファサブユニットで保存されているシステイン残基１２７、１４１、１９１、および１９２（成熟ペプチドのアルファ９の番号付け、シグナルペプチドよりなる２８アミノ酸残基が欠如している）を示す。図４Ａと４Ｂは、アルファ９を注入した卵母細胞のコリン作動性アゴニストに対する電気生理的応答を示す。図４Ａは、アルファ９ｃＤＮＡを注入し電圧クランプで−５０ｍＶに維持した卵母細胞において、ＡＣｈ、ニコチン、ムスカリン、１，１−ジメチル−４−フェニルピペラジニウム（ＤＭＰＰ）、およびオキソトレモリン−Ｍ（ＯＸＯ−Ｍ）により、誘発された電流応答を示す。図４Ｂは、ＡＣｈ、ＤＭＰＰおよびＯＸＯ−Ｍに対する濃度−応答曲線を示す。示した値は、１つの薬剤について少なくとも４つの卵母細胞で得られたピーク電流値の平均と平均の標準誤差である。標準誤差が記号より小さい場合は、誤差棒は示していない。各細胞の応答は、ＡＣｈにより誘発された最大電流に対して標準化した。ＡＣｈ濃度−応答曲線にヒル（Hill）式（ＥＣ₅₀＝９．７μＭ；傾き＝１．３）を当てはめた。図５Ａと５Ｂは、種々のアンタゴニストによるアルファ９注入卵母細胞中のＡＣｈ応答の遮断を示す。阻害曲線は、１０μＭのＡＣｈと、増加する濃度の（− ）ニコチンもしくは（＋）ムスカリン（図５Ａ参照）およびストリキニーネ、ｄ −ツボクラリン（ｄ−ＴＣ）もしくはアトロピン（図５Ｂ参照）のいずれかを同時添加して得られた。応答は、１０μＭのＡＣｈに誘発される対照電流のパーセント（％）で表した。１つの薬剤について少なくとも４つの卵母細胞で得られたピーク電流値の平均と平均の標準誤差が示してある。標準誤差が記号より小さい場合は、誤差棒は示していない。図６は、α−およびκ−ブンガロトキシンに対するアルファ９注入卵母細胞中の、ＡＣｈで誘発した電流の感度を示す。−５０ｍＶの保持電圧で記録した１００μＭのＡＣｈに対する代表的電流応答を示す。卵母細胞をα−ブンガロトキシン（α−ＢＴＸ、Ａ）またはκ−ブンガロトキシン（κ−ＢＴＸ、Ｂ）で３０分プレインキュベート後、ＡＣｈの第２の試験濃度を添加した。図７Ａ〜７Ｃは、アルファ９注入卵母細胞中のＡＣｈ誘発電流の電圧依存性と、組換えアルファ９受容体のＣａ²⁺透過性を示す。図７Ａにおいて、アルファ９注入卵母細胞中のＡＣｈ誘発電流の電圧−電流関係は、電流応答のプラトー期に電圧ランプ（２秒継続、＋５０ｍＶ〜−１２０ｍＶ）を適用して測定した。トレースは、４つの異なる卵母細胞で得られたものの代表である。図７Ｂは、２０ｍＭの１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ¹，Ｎ¹−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）５０ｎｌの注入の前後の、アルファ９注入卵母細胞の１００μＭのＡＣｈで誘発した代表的電流のトレースを示す。図７Ｃは、３５０ｍＭＮａＣｌ含有リンゲル液に浸けて電圧クランプで−１０ｍＶに保持したアルファ９注入卵母細胞中の、ＡＣｈで誘発した電流を示す。図８は、ラット蝸牛におけるアルファ９転写体の検出を示す。増幅反応は、鋳型として総ＲＮＡから転写したｃＤＮＡとアルファ９特異的プライマーを用いて、例６に記載のように行なった。増幅産物の分離は、１．５％アガロースゲルで行い臭化エチジウムで染色した。各反応混合物の１０μＭ分を、各レーンにのせた。レーン１、ＤＮＡラダー（ladder）；レーン２、ＤＮＡ鋳型無し；レーン３、嗅上皮ｃＤＮＡからの増幅産物；レーン４、嗅上皮ｃＤＮＡからの増幅産物；レーン５、座骨神経ｃＤＮＡからの増幅産物。図９Ａ〜９Ｆは、ラット胚の矢状断面と成体脳の冠状断面のｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション、およびアルファ９の同定と転写体の局在の結果を示す。図９Ａと９Ｂは、ラット胚のステージＥ１６の下垂体、嗅上皮、胸骨舌骨筋および舌における、アルファ９転写体の存在を示す。図９Ｃと９Ｄは、ステージＥ１６におけるラット胚の下垂体の高倍率画面であり、アルファ９転写体が、神経部の前葉ではなく隆起部に局在化している。図９Ｅと９Ｆは、成体ラットの脳の下垂体隆起部におけるアルファ９転写体の存在を示す。発明の詳細な説明分子クローニング研究により、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）の構造および機能的多様性が証明された。現在まで、脊椎動物の神経系に７つのアルファサブユニット（アルファ２〜アルファ８）と３つのベータサブユニット（ベータ２〜ベータ４）が性状解析されている。本発明は、神経伝達物質アセチルコリン（ＡＣｈ）により活性化されるこのファミリーの受容体サブユニット遺伝子の新しいメンバーの同定と機能的性状解析を示す。この新しいメンバーは、アルファ９と呼ばれる。アルファ９の分子構造は、これがメタボトロピック（ムスカリン性）ＡＣｈ受容体ファミリーよりもイオノトロピック（ニコチン性）ＡＣｈ受容体ファミリーに属することを示す。しかし、組換えアルファ９受容体の混合ニコチン性−ムスカリン性の性質は、すべての既知の機能性ニコチン性受容体の薬理学的プロフィールとは異なる。本発明の新規なｎＡＣｈＲサブユニット遺伝子の単離と同定は、ラットｎＡＣｈＲアルファ７サブユニットｃＤＮＡをプローブとして用いて、ラットゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより行われた。ＤＮＡ配列解析により、１つの単離されたゲノムクローンがタンパク質をコードし、大部分のアミノ酸配列はリガンド作動性イオンチャネル遺伝子スーパーファミリーのメンバーであることが明らかにされた。既知のサブユニットとの相同性から、これはＧＡＢＡ_A 、グリシンまたは５−ＨＴ₃受容体サブユニットよりｎＡＣｈＲサブユニットに、より関連していた。細胞外ドメイン中の保存された連続システイン残基の存在（これは、すべてのｎＡＣｈＲアルファサブユニットの証明であり、アセチルコリン結合ドメインの一部であると考えられている（ポポトとチャング（popot an d Changeux）、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．６４，１１６２−１１９３，１９８４））は、この遺伝子がｎＡＣｈＲアルファサブユニットをコードすると示唆していた。従って、現在の命名法に従って、この新しく発見されたサブユニットは、ｎＡＣｈＲ遺伝子ファミリーのアルファ９サブユニットと命名された。単離されたゲノムクローンから得られたポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）断片を使用して、ラット嗅上皮ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。４つの独立したｃＤＮＡクローンを単離し、その１つはアルファ９サブユニットの読みとり枠をコードする１９３７塩基対挿入体を含有した。そのヌクレオチドと推定アミノ酸配列を図１に示す（および、パテントイン（Patentin）フォーマットで配列番号１と２に示す）。全長アルファ９ｃＤＮＡは、４５１アミノ酸残基の成熟タンパク質をコードし、前に２８残基のリーダー配列がある。これは、ｎＡＣｈＲ遺伝子ファミリーの他のメンバーの特徴を有する（膜にまたがる可能性のある領域を予測する４つの疎水性領域、ＭＳＲＩ〜IV（カイトとドリトル（Ky te and Doolitle）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，１０５−１３２，１９８２）、すべてのｎＡＣｈＲアルファサブユニットに存在する１２７、１４１、１９１および１９２位のシステイン残基（成熟ペプチドのアルファ９の番号付け、シグナルペプチドよりなる２８アミノ酸残基が欠如している）を含む）。全長アルファ９ｃＤＮＡをプローブとして用いて、ファージベクターラムダＤＡＳＨ IIとラムダＦＩＸ II中で作成したマウスゲノムライブラリーをスクリーニングした。２つの重複するゲノムクローンを得た（図２参照）。アルファ９サブユニット遺伝子の全コード配列にまたがるこれらのクローンを、プラスミドベクター中にクローン化し、アルファ９サブユニット遺伝子構造を、イントロン −エキソン境界の配列決定により決定した。この遺伝子は、５つのエキソンから構成され、すべての既知のｎＡＣｈＲ遺伝子とは異なるイントロン−エキソン構造を有する（ノダ（Noda）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３０５，８１８−８２３，１９８３；ネフ（Nef）ら、ＥＭＢＯＪ．，７，５９５−６０１，１９８８；ワダ（W ada）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，３３０−３３４，１９８８；ブオナンノ（B uonanno）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，７６１１−７６１６，１９８９；ボウルター（Boulter）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，４４７２ −４４８２，１９９０）。例えば、最初の４つのエキソンのイントロン−エキソン境界が保存されている他のｎＡＣｈＲサブユニット遺伝子に対して、アルファ９遺伝子のエキソンIIIとIVは融合している。アルファ９ｃＤＮＡクローンを配列決定し、その配列を他のｎＡＣｈＲアルファサブユニットの配列と比較した（図３参照）。配列の類似性に基づき、アルファ９サブユニットは、ｎＡＣｈＲサブユニット遺伝子ファミリーの遠いメンバーのようである。これは、ニューロン性アルファ２〜アルファ６（３６〜３９％アミノ酸配列同一性）サブファミリーまたは筋肉のアルファサブユニット（３７％）から遠いのと同様に、ニューロン性アルファ７〜アルファ８サブファミリー（３８％）からは遠い。アルファ９は、ファミリーの他のメンバーと最も高度に保存された配列成分を共有するが、いくつかのアミノ酸残基は、他のアルファサブユニット中の不変体中に存在するものとは異なる。例えば、保存された疎水性残基Ｐｈｅ−９９とＶａｌ−２３０（成熟ペプチドのアルファ９の番号付け、シグナルペプチドよりなる２８アミノ酸残基が欠如している）は、アルファ９タンパク質の極性残基Ｓｅｒ−９９とＳｅｒ−２３０に変化しており、保存された陽性荷電の残基Ｌｙｓ−１４４は非荷電残基Ｔｈｒ−１４４により置換されている。ＭＳＲ II中に存在する疎水性残基Ｌｅｕ−２５５（アルファ１〜アルファ６サブユニット）またはＭｅｔ−２５５（アルファ７〜アルファ８サブユニット）は、アルファ９サブユニット中の極性アミノ酸Ｇｌｎ−２５５により置換されている。さらに、他のｎＡＣｈＲサブユニットと比較すると、アルファ９はＭＳＲ IIとＭＳＲ IIIの間のＴｈｒ残基の欠失を有する。ツノガエル（Xenopus）卵母細胞の発現研究に適した全長アルファ９ｃＤＮＡは、ヌクレオチド−９４〜１７６６（図１；すなわち、配列番号１に示す残基７９〜１９３８）から、発現ベクターｐＧＥＭＨＥ（リマン（Liman）ら、Ｎｅｕｒｏｎ，９，８６１−８７１，１９９２）中にサブクローニングして作成した。ｃＤＮＡは、メサージ・マシーン(mMessage mMachine)転写キットを用いて、ＮｈｅＩで線状化したプラスミドで合成した。アルファ９ｃＲＮＡの注入の２日後、９５％以上の電圧クランプしたツノガエル（Xenopus）卵母細胞がアセチルコリンに応答した。１００μＭのアセチルコリンに応答する内部電流は、２０〜５００ｎＡの範囲であった。図４Ａは、アセチルコリン添加に応答した代表的電流トレースを示す。このアゴニストの高濃度（＞１０μＭ）は、急速なピーク応答を誘発し、これは急速にプラトーレベルに崩壊した。アルファ９を発現する卵母細胞は、グルタミン酸、ＧＡＢＡ、グリシン、セロトニン、ＡＴＰ、ヒスタミン、およびアデノシンに対して非感受性であった。アルファ９サブユニットのクローニングの前にクローン化したすべての機能性ｎＡＣｈＲアルファサブユニットは、ツノガエル（Xenopus）卵母細胞中での発現時に、ニコチンに活性化されるヘテロマーまたはホモマー性の受容体チャネル複合体を形成する（ボウルター（Boulter）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７７６３−７７６７，１９８７；ズボイジン(Duvoisi n)ら、Ｎｅｕｒｏｎ，３，４８７−４９６、１９８９；クツリエ（Couturier）ら、Ｎｅｕｒｏｎ，５，８４７−８５６，１９９０；ルエジとパトリック（Luet je and patrick）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１，８３７−８４５，１９９１；セグエラ（Seguela）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１３，５９６−６０４，１９９３；ゲルザニッチ（Gerzanich）ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４５，２１２−２２０，１９９４）。驚くべきことにニコチン（０．１μＭ〜１ｍＭ）は、アルファ９を注入した卵母細胞中でいかなる応答も誘発しなかった（図４Ａ）。ベクター２またはベクター４ｎＡＣｈＲサブユニットとともにアルファ９を同時発現しても、ニコチンに活性化される受容体チャネルは形成されなかった。アルファ９受容体チャネル複合体はまた、ムスカリンにより活性化されなかった（図４Ａ）。さらに、ニコチン性アゴニストのシトシンもムスカリン性アゴニストのベタネコル（bethanecol）およびプロカルピン（pilocarpine）も、電流応答を誘発しなかった。しかし、ニコチン性アゴニスト１，１−ジメチル− ４−フェニルピペラジニウム（ＤＭＰＰ）、およびムスカリン性Ｍ１アゴニストであるオキソトレモリン−Ｍ（ＯＸＯ−Ｍ）ともに、アルファ９注入卵母細胞で内部電流を誘発した（図４Ａ）。図４Ｂは、これらのコリン作動性アゴニストに対する濃度応答曲線を示す。アセチルコリンの見かけの親和性（ＥＣ₅₀）は、１０μＭであった。ＤＭＰＰとＯＸＯ−Ｍにより誘発された最大電流応答は、アセチルコリンで観察されたものの約５％であった。ニコチンもムスカリンも、アルファ９ｃＲＮＡを注入した卵母細胞で応答を誘発しなかった（図４Ａ参照）が、いずれの古典的コリン作動性アゴニストも、アセチルコリンに誘発される電流を低下させた。図５Ａは、１０μＭのアセチルコリンと増加する濃度のニコチンもしくはムスカリン（それぞれ、ＩＣ₅₀＝３０μ Ｍと７５μＭ）の同時添加により得られる阻害曲線を示す。図５Ｂに示すように、アルファ９受容体チャネル複合体はまた、ニコチン性アンタゴニストであるｄ −ツボクラリン（ＩＣ₅₀＝０．３μＭ）、ならびにムスカリン性アンタゴニストであるアトロピン（ＩＣ₅₀＝１．３μＭ）により阻止された。アルカロイドのストリキニーネ（グリシン作動性クロリドチャネルのブロッカーとして古典的に使用されている）は、ＩＣ₅₀が０．０２μＭのアルファ９ホモマーの強力なアンタゴニストであることがわかった（図５Ｂ）。α−ブンガロトキシン（１００ｎＭ）とκ−ブンガロトキシン（１００ｎＭ）は、１００μＭアセチルコリンに対する応答を阻止した（図６）。これらのトキシンによる阻止は、カエルのリンゲル溶液で卵母細胞を１０分間洗浄することによりほぼ完全に逆転した。電気生理的性質は、アルファ９注入卵母細胞で注入後２〜７日目に測定した。アセチルコリンのプラトー応答で２秒の電圧ランプの適用で得られた電流−電圧（Ｉ−Ｖ）関係は、図７Ａに示す。Ｉ−Ｖ曲線は非線形であり、−５０ｍＶでアセチルコリンにより誘発される最大の内部電流を示した。電流応答はマイナス〜 −５０ｍＶの電圧で低下した。１００μＭのアセチルコリンで誘発される内部電流と１μＭのアセチルコリンで誘発される内部電流との比は、−８０ｍＶ（１．０）より−５０ｍＶ（２．１）で大きかったという事実は、過分極電位での電流応答の低下は、アゴニスト濃度に依存するかも知れないことを示している。−５０ｍＶより陽性の保持電流において、アセチルコリンに活性化される内部電流は −２５ｍＶまで低下し、そこで＋２０ｍＶの保持電流までの強い整流作用が観察された。保持電流を段階的に増加させた時に得られるピークとプラトー応答のＩ −Ｖ曲線は、図７Ａに示すものと同じ形を示した。このＩ−Ｖ関係から、見かけの逆電流−２５ｍＶが予測された。この値は、非選択的陽イオン性電流または陰イオン性（Ｃｌ^-）電流と一致する。５０ｍＭから１５０ｍＭへの外部ＮａＣｌ濃度の変化は、アセチルコリン誘発電流の逆電位を陽性にシフトさせた。これは、アルファ９チャネルが、Ｎａ⁺に対して透過性であることを示している。アルファ９発現卵母細胞中の１００ｍＭアセチルコリンに誘発されるピーク応答のほとんどは、卵母細胞にカルシウムキレート剤である１、２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ¹，Ｎ¹−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）を注入した時消失した（図７Ｂ）。すなわち、他のｎＡＣｈＲサブユニットで示唆されているように（ゲルザニッチ（Gerzanich）ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４５，２１２−２２０，１９９４）、この結果は、アセチルコリンに誘発される電流の一部は、卵母細胞中に存在することが知られているＣｌ^-電流からＣａ²⁺活性化Ｃｌ^-チャネルが担っていることを示している（ミレジとパーカー（Miledi and Parker）、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄ）．，３５７，１７３−１８３，１９８４）。アセチルコリンに応答したＣａ²⁺活性化Ｃｌ^-電流の参加をさらに試験するために、外部ＮａＣｌ濃度を一時的に３５０ｍＭに上げ２つの電極電圧クランプの間で卵母細胞を−１０ｍＶに保持して、Ｃｌ^-とＮａ⁺の逆電流を反対の方向へシフトさせた。この条件を用いると、１００μＭのアセチルコリンは外部電流の後に内部電流を誘発した（図７Ｃ）。他のニューロン性ｎＡＣｈＲについて報告されているように（ヴェルニノ（Vernin o）ら、Ｎｅｕｒｏｎ，８，１２７−１３４，１９９２；セグエラ（Seguela）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１２，５９６−６０４，１９９３）、内部電流はおそらくアルファ９受容体チャネルを介する陽イオンの流入の結果であり、外部電流はおそらくＣａ²⁺活性化Ｃｌ^-チャネルを介するＣｌ^-の流出の結果であろう。１、２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ¹，Ｎ¹−四酢酸を注入した卵母細胞で得られるＩ−Ｖ曲線は、前述のものと同じ形を有しており、実験の条件下ではＣｌ^-電流はＩ／Ｖ曲線に寄与しないことを示唆していた。前記ツノガエル（Xenopus）卵母細胞の発現実験は、アルファ９タンパク質サブユニットは、アセチルコリンにより活性化されるイオンチャネルを形成し、Ｎａ⁺とＣａ²⁺の両方に透過性であることを証明している。アルファ７とアルファ８ニューロン性サブユニット（クツリエ（Couturier）ら、Ｎｅｕｒｏｎ，５，８４７−８５６，１９９０；ゲルザニッチ（Gerzanich）ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４５，２１２−２２０，１９９４）と同様に、アルファ９は集合してホモマー受容体チャネル複合体になることができる。これは、受容体チャネル複合体を形成するのにベータサブユニットの同時集合を必要とする他の機能性ニューロン性ｎＡＣｈＲアルファサブユニットとは異なる（ボウルター（ Boulter）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７７６３−７７６７，１９８７；バリベット（Ballivet）ら、Ｎｅｕｒｏｎ，１，８４７−８５２，１９８８；ワダ（Wada）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，３３０−３３４，１９８８）。アルファ９注入卵母細胞中でアセチルコリンにより誘発される電流は、保持電位マイナス〜−５０ｍＶで低下した。これは、アセチルコリン、または卵母細胞を維持するために使用される溶液中に存在する陽イオンにより、チャネルの電位依存性阻止により得られる。この阻止は高アゴニスト濃度でより顕著であったという事実は、この作用の少なくとも一部は、アセチルコリンによる電位依存性チャネル阻止が原因であることを示している。高濃度のアセチルコリンとカルバミルコリンは、ＢＣ３Ｈ−１細胞中に存在する筋肉ｎＡＣｈＲの電位依存性および濃度依存性チャネル阻止を引き起こすことが知られている（サインとステインバック（Sine and Steinbach）、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，４６，２７７−２８４，１９８４）。一次構造と電気生理的性質に基づくと、アルファ９タンパク質は、リガンド作動性イオンチャネルのニコチンファミリーに属し、このファミリーには、ｎＡＣｈＲ、ＧＡＢＡ_A、グリシンおよび５−ＨＴ₃受容体がある。しかしすでに記載されているように、アルファ９注入卵母細胞では、ニコチン、ムスカリン、ｄ−ツボクラリンおよびアトロピンは、アセチルコリン誘発電流応答を阻止した。従って、アルファ９受容体チャネル複合体は、コリン作動性受容体の薬理学的分類のニコチン亜分画やムスカリン亜分画にも入らない（ピー・テイラー（P．Taylor ）治療薬の薬理学的基礎、エー・グッドマン−ギルマン、ティー・エィチ・ラル、エー・エス・ニーズおよびピー・テーラー（Taylor，A．Goodman- Gilman，T.H．Rall，A.S．Nies and P．Taylor）編（ニューヨーク：パーガモン・プレス（Pergamon Press））、ｐｐ．１２２−１４９と１６６−１８６，１９９０）。ニコチン性アゴニストであるＤＭＰＰとムスカリン性アゴニストであるＯＸＯ−Ｍは両方とも、アルファ９注入卵母細胞中で電流応答を誘発することができるという知見は、アルファ９受容体が混合ニコチン性−ムスカリン性薬理作用を示すことを示している。さらにグリシン受容体アンタゴニストであるストリキニーネによるアルファ９受容体の阻止は、異常である。ツノガエル（Xenopus ）卵母細胞中で発現されたアルファ７とアルファ８ホモマーで、ストリキニーネの同様の作用が報告されている（セグエラ（Seguela）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１２，５９６−６０４，１９９３；ゲルザニッチ（Gerzanich）ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４５，２１２−２２０，１９９４）。アルファ９タンパク質サブユニットは、ｎＡＣｈＲアルファサブユニットの推定アセチルコリン結合部位内に、最も保存されたアミノ酸残基を含有する（デニス（Dennis）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ，２７，２３４６−２３５７，１９８８；ガルジ（Galzi）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，１０４３０−１０４３７，１９９０）。しかし、アルファ９タンパク質中の２つの非保存性置換であるＰｈｅ−９９からＳｅｒへの置換とＬｙｓ−１４４からＴｈｒへの置換（成熟タンパク質の番号付け、リーダー配列よりなる２８アミノ酸残基が欠如している）は、ｎＡＣｈＲの推定されるアゴニスト結合部位の第１のおよび第２のドメインの近くにある。これらのアミノ酸置換は、アルファ９受容体チャネル複合体の明確な薬理的性質を担う。アルファ９遺伝子の組織発現パターンを測定するために、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション試験を行なった。アルファ９ゲノムクローンのコード配列から得られるインビトロ合成したＲＮＡを、ラット胚の矢状断面と成体ラットの脳の冠状断面にハイブリダイズさせた。転写体の存在は、ステージ１６のラット胚の下垂体に観察された（図９Ｂと９Ｄを参照）。アルファ９遺伝子発現は、下垂体の隆起部に限定して観察され、前葉と神経下垂体は検出できるシグナルを示さない。アルファ９ｍＲＮＡはまた、成体ラットの隆起部に存在しており、正中隆起の下側表面に存在している（図９Ｆを参照）。アルファ９発現はまた、Ｅ１６ラットの嗅覚粘膜中に観察される（図９Ｂを参照）。アルファ９転写体は、嗅覚器の各鼻甲介の内側をおおう多列円柱上皮に検出される。さらに成長しているラットの舌にも発現が見られる（図９Ｂ）。最後に、成体の脳の１８０ｍｍ毎の２０ｍｍの冠状断片について行なったｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ラットの中枢神経系でアルファ９遺伝子発現はなかった。ラット蝸牛の凍結切片について行なったｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、すべての蝸牛回転部の外有毛細胞領域でもアルファ９遺伝子が発現されることを示している。アルファ９遺伝子の発現は、蝸牛のらせん神経節ニューロンまたは他の蝸牛の支持構造では見られなかった（図９Ｂを参照）。すでに公表されているニューロン性ｎＡＣｈＲ遺伝子は、脊椎動物の中枢神経系で発現されるとして報告されている（サージェント（Sargent）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１６，４０３−４４３，１９９３）。前記で開示したように、ラット脳の冠状断片について行なったｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション試験は、中枢神経系でアルファ９遺伝子発現を示さなかった。低レベルのアルファ９転写体または検出を逃れた非常に限定された発現パターンを否定できないが、結果は、他のｎＡＣｈＲサブユニットに比較して、アルファ９はインビボのコリン作動性機能の明確なサブセットに関与しているかも知れないことを示唆する。ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション試験は、ラットにおいて下垂体の隆起部、嗅上皮、蝸牛の外有毛細胞および舌の骨格筋でアルファ９サブユニット遺伝子が発現されることを示した。隆起部は、ペプチド分泌細胞、性腺刺激ホルモン分泌細胞および甲状腺刺激ホルモン産生細胞より構成される、脊椎動物下垂体の解剖学的に明確に規定された部分を構成する（ウィットウスキー（Wittkowski）ら、ＡｃｔａＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１２６，２８５−２９０，１９９２）。ニコチンへの接触に応答した神経内分泌作用（例えば、黄体形成ホルモン、甲状腺刺激ホルモン分泌の阻害）は、ヒトやラットで報告されている（フクセ（Fuxe）ら、Ｐｓｙｃｈｏｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１４，１９−４１，１９８９）。これらの作用は、視床下部ｎＡＣｈＲの活性化が原因であるとされているが、アルファ９ｎＡＣｈＲサブユニットの下垂体での存在は、ニコチンが下垂体に直接作用するかも知れないことを示す。嗅覚細胞が、嗅覚機能を調節する遠心性の神経支配を受ける可能性がある（シャーレイ（Shirley）、Ｏｌｆａｃｔｉｏｎ．Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，３３，１−５３，１９９２）。アセチルコリンの添加は、ゆっくりした電位を引き起こし、嗅覚受容体ニューロンのスパイク活性を調節するため、コリン作動性調節が示唆されている（ボウベット（Bouvet）ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，５，２１４−２２３，１９８８）。嗅覚ニューロンのアセチルコリン応答のさらなる薬理的性状解析および嗅上皮内のアルファ９サブユニットのより正確な局在化が必要であるが、嗅上皮中のアルファ９転写体の存在は、記載されたコリン作動性作用の分子的基礎を提供するかも知れない。舌の成長している筋肉のアルファ９遺伝子発現は興味深い。実施したｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションでは、シグナルが実際に筋肉繊維に局在化されているか、または周りの結合組織にあるかを区別することができない。しかし、アルファ９転写体は、すべての成長する骨格筋に存在するのではないようである。例えば、ラット胚の矢状中断面について行なったｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション試験は、体軸筋の肋間にアルファ９転写体の証拠を示さなかった。卵母細胞中で発現されるホモマー性アルファ９受容体の全体の薬理的特徴は、他のクローン化ｎＡＣｈＲのものとは異なる（ボウルター（Boulter）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７７６３−７７６７，１９８７；バリベット（Ballivet）ら、Ｎｅｕｒｏｎ，１，８４７−８５２，１９８８；ワダ（Wada）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，３３０−３３４，１９８８；クツリエ（Couturier）ら、Ｎｅｕｒｏｎ，５，８４７−８５６，１９９０；ゲルザニッチ（Gerzanich）ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４５，２１２ −２２０，１９９４）。ラット蝸牛のアルファ９遺伝子の発現パターンを試験するために、蝸牛の総ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡについてＰＣＲを行なった。アルファ９遺伝子のイントロン−エキソン境界をまたがる断片を増幅するために、アルファ９配列に特異的なプライマーを設計し使用した。図８に示すように、予測されるサイズ（５７３塩基対）の断片を、アルファ９プライマーでラット蝸牛ｃＤＮＡから増幅した。ＡｃｃＩ、ＨｉｎｆＩ、およびＮｃｏＩによる断片の制限エンドヌクレアーゼ解析は、これがアルファ９転写体由来であることをさらに確認した。アルファ９遺伝子はまた、ラットの嗅上皮中で転写されるため、この組織から得られるＲＮＡを陽性対照として用いた。ＰＣＲに使用されたパラメータとともに非常に低レベルの転写体が、試験した任意の組織に検出された可能性を排除するために、陰性対照としてラットの座骨神経ｃＤＮＡを使用した。アルファ９の特異的プライマーを用いて座骨神経からＤＮＡは増幅されず（図８参照）、アルファ３とアルファ４サブユニットの両方が各特異的プライマーとともにこの組織中に検出された。アルファ９受容体チャネルの可能性のある薬理学的役割は、蝸牛有毛細胞の遠心性の神経支配である。蝸牛の外有毛細胞は、脊椎動物の音の機械的増幅に関与すると言われている（フロック、アール・クリンケとアール・ハートマン（Floc k，R．Klinke and R．Hartmann）編（ベルリン：スプリンガー−フェアラーク（ Springer-Verlag），ｐｐ．２−８，１９８３）。これらの細胞はコリン作動性の遠心性の神経支配を受ける。これらの遠心性ニューロンの電気刺激により、聴神経繊維の感度の低下とチューニングが行われ、これが次に聴覚の外傷からの保護を誘発する（ブラウンとヌッタル（Brown and Nuttal）、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄ．），３５４，６２５−６４６，１９８４；クリンケ（Klinke），ＨｅａｒｉｎｇＲｅｓ．，２２，２３５−２４３，１９８６；ラジャンとジョンストン（Rajan and Johnstone），ＢｒａｉｎＲｅｓ．，４５８，２４１− ２５５，１９８８）。蝸牛有毛細胞の遠心性神経支配に関与するアセチルコリン受容体の分子的性質は記載されていない。非選択的陽イオンチャネルおよびＧ− タンパク質結合受容体の両方が提唱されているが、この受容体をニコチン性またはムスカリン性として性状解析するのにコリン作動性アゴニストおよびアンタゴニストはほとんど役に立たない（ホウスレイとアシュモア（Housley and Ashmor e）、Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ，２４４，１６１−１６７，１９９１；フックスとムロフ（Fuchs and Murrow）、Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ，２４８，３５−４０，１９９２；フックスとムロフ（Fuchs and Murrow）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１２，８００−８０９，１９９２；カケハタ（Kakehata）ら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄ．），４６３ −，２２７−２４４，１９９３；エロステグイ（Erostegui）ら、ＨｅａｒｉｎｇＲｅｓ．，７４，１３５−１４７，１９９４）。従って、このコリン作動性受容体の一次構造に関わらず、そのユニークな薬理学的特徴に基づき、これは従来記載されていないタイプの受容体であると示唆されている（フックスとムロフ（Fuchs and Murrow）、Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ，２４８，３５− ４０，１９９２；エロステグイ（Erostegui）ら、ＨｅａｒｉｎｇＲｅｓ．，７４，１３５−１４７，１９９４）。ここで提示した結果は、アルファ９受容体は、蝸牛遠心系のコリン作動性成分であることを示唆する。この結論は、主にラット蝸牛の有毛細胞中のアルファ９転写体の存在に基づく。これまでの証拠は、蝸牛遠心系が、バックグランドノイズ内のシグナルの検出の改良、ノイズ障害からの蝸牛の保護、および注意が別のところになければならない時聴覚刺激から蝸牛応答を減弱させることに関与していることを示唆する。種々の実験は、蝸牛遠心系のコリン作動性成分もまた、アミノ配糖体高分子の内耳神経毒性に関与することを証明した。高用量で投与した時、これらの抗生物質は外有毛細胞（ＯＨＣ）を変性させる（ゴバエルツ（Govaerts）ら、ＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，５２，２２７−２５１，１９９０）。この変性の結果は、耳鳴りから聴力の完全な喪失まである。アミノ配糖体がＯＨＣにその内耳神経毒性を及ぼす機序に関する現在の理論は、細胞内メッセージ伝達システムの阻止のために代謝が不安定になるというものである。同時に遠心性のシナプスも不安定化され、刺激後に放出されるＡＣｈの量をモニタリングおよび制御できなくなる。その結果、不安定化されたＯＨＣが過剰に刺激（ＡＣｈの過剰）されて変性が観察される（ウィリアムズ（Williams）ら、ＨｅａｒｉｎｇＲｅｓｌ，３０，１１−１８，１９８７）。従って、遠心性末端から有毛細胞への遠心性のシグナルの伝達を受け持つアルファ９受容体は、アミノ配糖体抗生物質の内耳神経毒性能の発揮に密接に関与している。従って、少なくとも１つのアルファ９受容体サブユニットよりなる受容体に対するアンタゴニスト（すなわち、アルファ９ブロッカー）は、アミノ配糖体誘導性の内耳神経毒性の副作用を低下または排除する。本発明は、アルファ９ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットをコードする単離された核酸を提供する。「核酸」（ポリヌクレオチドとも呼ばれる）という語句は、ＲＮＡならびに１本鎖および２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを包含する。本明細書において、「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、天然の環境から分離または取り出されたポリヌクレオチドを意味する。アルファ９ｎＡＣｈＲ受容体サブユニットをコードするポリヌクレオチドを単離する１つの方法は、当該分野で公知の方法を用いてＤＮＡプローブと哺乳動物ゲノムライブラリーをプローブ結合させることである。アルファ９受容体遺伝子から得られるＤＮＡプローブは、この目的に特に有用である。アルファ９受容体をコードするＤＮＡおよびｃＤＮＡ分子を用いて、ヒト、哺乳動物、または他の動物供給源から相補的なゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを得ることができる。そのような分子はまた、下記で詳述する方法により、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングして、関連するｃＤＮＡまたはゲノムクローンを単離するのに使用することができる。本発明の核酸には、図１に示す核酸配列（配列番号１も参照）と実質的に同じヌクレオチド配列が包含される。本発明はまた、図１（および配列番号１）に示すヌクレオチド配列の縮重変種である核酸を包含する。「縮重変種」とは、遺伝コードのために、特定のハイブリダイゼーション条件下で本発明の核酸と必ずしもハイブリダイズしないアルファ９ｎＡＣｈＲサブユニットをコードする核酸を意味する。本発明のポリペプチドまたはタンパク質をコードする好適な核酸は、図１（配列番号２も参照）に示すアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチドよりなる。あるいは、本発明のポリペプチドをコードする好適な核酸は、高厳密性条件下で、図１（および配列番号１）に示すヌクレオチド配列の実質的に全配列、または実質的な部分（すなわち、典型的には少なくとも２５〜３０の連続するヌクレオチド）とハイブリダイズする。本明細書においてハイブリダイゼーションの厳密性とは、ポリヌクレオチドハイブリッドが安定である条件を意味する。当業者に公知のように、ハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度と温度の関数である（例えば、サムブルーク（Sambrook）ら、分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）（第２版）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、１９８９；参考のため本明細書に引用される）参照）。本発明は、本発明の核酸によりコードされる単離されたアルファ９ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパク質、および該サブユニットよりなるアルファ９ニコチン性アセチルコリン受容体を提供する。アルファ９ｎＡＣｈＲサブユニットは、長さが約４５１アミノ酸であるタンパク質よりなる。アルファ９サブユニットのアミノ酸配列は、図１（および配列番号２）に示す。本明細書において、「単離されたタンパク質」という語句は、通常その本来のインビボの環境でタンパク質と結合している細胞性成分および／または汚染物質を含まないタンパク質を意味する。本発明のポリペプチドおよび／またはタンパク質は、天然に存在するアレレ性変種、ならびにその組換え型を含む。アルファ９ｎＡＣｈＲポリペプチドは、当業者に公知の種々の方法を用いて単離することができる。本発明のタンパク質の単離と精製に利用できる方法には、沈降法、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィーがある。他の公知の方法は、ドイチャー（Deutscher）ら、タンパク質精製のガイド：酵素学の方法（Guide to Protein Purification: M ethods in Enzymology）Ｖｏｌ．１８２（アカデミックプレス（Academic Press ）、１９９０）に記載されている（参照により本明細書に取込まれる）。あるいは、本発明の単離されたポリペプチドは、すでに記載されている公知の方法、例えばサムブルーク（Sambrook）ら、分子クローニング：実験室マニュアル（Mole cular Cloning: A Laboratory Manual）（第２版）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、１９８９；参考のため本明細書に引用される）を用いて得ることができる。本発明のポリペプチドは、適当な宿主細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、両生類細胞（すなわち、卵母細胞）、または哺乳動物細胞）中で、当該分野で公知の方法を用いて、アルファ９ｎＡＣｈＲサブユニットをコードする核酸を発現することにより産生することができる。発現されたポリペプチドは、公知の方法を用いて回収できる。本発明のポリペプチドは、発現ベクター（以下の詳述）で形質転換された細胞から直接単離できる。本発明のポリペプチド、その生物活性を有する断片、および機能性同等物は、化学的合成により産生することもできる。本明細書において、「生物活性を有する断片」とは、集合して、アセチルコリンに活性化されカルシウムに対して透過性の陽イオン性チャネルになることができる、図１（配列番号２も参照）に記載のアミノ酸配列で示されるアルファ９ポリペプチドの任意の部分を意味する。合成ポリペプチドは、例えばアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems，Inc.）モデル４３０Ａまたは４３１Ａ自動ペプチド合成機（フォスターシティー、カリホルニア州）を用いて、製造業者の試薬を用いて産生することができる。本明細書において、「ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）サブユニット」という用語は、膜にまたがる領域を予測させる高度に疎水性の４つの領域と、１２７、１４１、１９１、および１９２位（成熟ペプチドに関するものであり、２８個のアミノ酸リーダー配列を含まない）にシステイン残基を含有する、組換え発現／産生した（すなわち、単離されたまたは実質的に純粋な）タンパク質を意味する。そのようなタンパク質サブユニットは、集合して陽イオン性チャネルになり、これはアセチルコリンにより活性化される。本発明のｎＡＣｈＲサブユニットには、一次転写体の副スプライシングにより産生されるｍＲＮＡによりコードされるその変異体、ならびに生物活性を有する断片を含む。本発明のアルファ９ｎＡＣｈＲサブユニットは、本明細書に記載の方法により評価すると、同じかまたは異なるタイプの少なくとも１つの追加のｎＡＣｈＲサブユニットと組合わさって、機能性受容体の形成に寄与する。本明細書において、「機能性受容体」という用語は、例えばアセチルコリン（ＡＣｈ）のようなリガンドの結合により、受容体イオンチャネルが開き、このためＣａ²⁺およびＮａ⁺ やＫ⁺のような陽イオンが細胞内に入ることができるようになるものを意味する。「機能性の本発明の受容体」のアゴニスト活性化により、受容体が誘導される。「組換え発現／産生された」、「単離された」、または「実質的に純粋な」という用語による、本発明の核酸、ポリペプチドまたはタンパク質の修飾は、ヒトの手によりそのような形で産生され、その本来のインビボの細胞性環境から分離された核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を包含する。このヒトの介入の結果、本発明の組換え核酸、ポリペプチドおよびタンパク質は、対応する天然に存在する分子では役に立たない方法（例えば、薬剤の可能性のある化合物の同定）で有用である。「実質的な配列相同性」を有する配列は、典型的には本発明の核酸と少なくとも約９０％の同一性を共有するヌクレオチド配列、および典型的には本発明のポリペプチドと少なくとも約９５％のアミノ酸同一性を共有するアミノ酸配列を意味する。しかし、スプライス変種、保存的アミノ酸置換、または縮重コドンの置換により上記レベルより低い相同性を有するポリペプチドまたは核酸もまた、本発明の範囲に包含されることを認識すべきである。本発明はまた、プロモーターに機能的に結合したアルファ９受容体サブユニットをコードする核酸、および他の制御配列を提供する。本明細書において「機能的に結合した」という用語は、制御配列およびエフェクター配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写停止部位および翻訳停止部位、および他のシグナル配列）との、核酸の機能的関係を意味する。プロモーターへの核酸の特異的に機能的な結合とは、プロモーターを特異的に認識しそこに結合するＲＮＡポリメラーゼにより、ＤＮＡの転写がプロモーターから開始されるような、核酸とプロモーターの間の物理的および機能的関係を意味する。適当なプロモーターには、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合および転写開始に充分な特異的配列がある。さらに、適当なプロモーターには、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合および転写開始活性を調節する配列がある。そのような配列は、ｃｉｓ作用性であるかまたは、トランス活性化因子に応答性であってもよい。制御の性質に依存して、プロモーターは構成性または制御性である。プロモーターの例には、ＳＰ６、Ｔ４、Ｔ７、ＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ステロイド誘導性プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルスなどがある。本発明で使用されるベクターは、アルファ９受容体サブユニットをコードする核酸が機能的に結合できるプロモーターとクローニング部位の両方を有する。当該分野で公知のそのようなベクターは、インビトロまたはインビボでＲＮＡを転写することができ、ストラタジーン（Stratagene）（ラホイア（La Jolla）、カリホルニア州）やプロメガ・バイオテク（Promega Biotech）、マジソン、ウィスコンシン州）などから市販されている。発現および／またはインビトロ転写を最適化するために、クローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去、添加または改変して、余分の、不適当な可能性のある副翻訳開始コドンまたは転写または翻訳レベルで発現を妨害または低下させる他の配列を除去することが必要かも知れない。あるいは、コンセンサスリボゾーム結合部位を開始コドンのすぐ５ ’に挿入して発現を増強することができる（例えば、コザク（Kozak）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７（１９９１））。同様に、転写を増強するために、同じアミノ酸をコードする別のコドンを、アルファ９ｎＡＣｈＲサブユニットの本来のコドンの代わりに使用することができる（例えば、宿主細胞のコドンの好み、Ｇ−Ｃの豊富なドメインの存在を低下させるなど）。本発明で使用できる適当なベクターの例としては、ウイルス（例えば、バキュロウイルスやレトロウイルス）、バクテリオファージ、コスミッド、プラスミド、および当該分野で典型的に使用される組換えビヒクルがある。本発明の核酸は、当該分野で公知の方法を用いてベクターゲノム中に挿入される。例えば、挿入体とベクターＤＮＡは、適当な条件下で制限酵素と接触させて、互いに対合してリガーゼと結合できる相補的な末端を、各分子に作成させる。あるいは、合成リンカーを、制限酵素処理された本発明の核酸の末端に結合させる。これらの合成リンカーは、ベクターＤＮＡ中の特定の制限部位に対応する核酸配列を含有する。さらに、停止コドンおよび適当な制限部位を含有する核酸を、例えば以下のいくつかまたはすべてを含有するベクターに結合することができる：選択マーカー遺伝子（例えば、哺乳動物細胞中での安定なまたは一過性転写体の選択のためのネオマイシン遺伝子；高レベルの転写のためのヒトＣＭＶの前初期遺伝子からのエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡ安定性のためのＳＶ４０からの転写停止およびＲＮＡ処理シグナル；正しいエピソーム複製のためのＳＶ４０ポリオーマ複製開始点およびＣｏｌＥｌ；多機能の複数のクローニング部位；およびセンスおよびアンチセンスＲＮＡのインビトロ転写のためのＴ７およびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ。他の方法も当該分野で公知であり、利用できる。また、アルファ９ｎＡＣｈＲサブユニットをコードする核酸よりなるベクターが提供され、このベクターは、細菌細胞、酵母細胞、両生類細胞（すなわち、卵母細胞）、哺乳動物細胞または他の動物細胞での発現に適するようになっている。このようなベクターはさらに、アルファ９ｎＡＣｈＲサブユニットをコードする核酸に対してその発現を可能にするように位置する細菌細胞、酵母細胞、両生類細胞、哺乳動物細胞または動物細胞の発現に必要な制御成分を含有してよい。本明細書において、「発現」とは、核酸がｍＲＮＡに転写され、そしてペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳される過程を意味する。核酸がゲノムＤＮＡ由来の場合、適当な真核細胞宿主が選択されるなら、発現にはｍＲＮＡのスプライシングを含んでもよい。発現に必要な制御成分には、ＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモーター配列、およびリボゾーム結合のための転写開始配列がある。例えば、細菌性発現ベクターには、ｌａｃプロモーター、シャイン−ダルガルノ（Shine-Dalgarno）転写開始配列、および開始コドンＡＵＧのようなプロモーターがある（サムブルーク（Sambrook）ら、分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）（第２版）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、１９８９；参考のため本明細書に引用される）。同様に、真核細胞発現ベクターには、ＲＮＡポリメラーゼIIのための異種または同種プロモーター、下流のポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボゾームの分離のための停止コドンがある。このようなベクターは、市販されているか、または当該分野で公知の方法を用いて入手できる配列から構築される。本発明はまた、組換えアルファ９ニコチン性アセチルコリン受容体を発現する形質転換された宿主を提供する。このような宿主は、アルファ９ｎＡＣｈＲサブユニットをコードする核酸で形質転換される。本発明の形質転換宿主の例は、哺乳動物細胞中での発現に特異的に適合させたプラスミドを含む哺乳動物細胞である。このプラスミドは、アルファ９ｎＡＣｈＲサブユニットをコードする核酸、およびサブユニットの発現に必要な制御成分を含有する。本発明で使用される適当な哺乳動物細胞には、例えばマウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌｔｋ^-細胞、ＰＣ１２およびＮ２Ａニューロン細胞、ＨＥＫ −２９３腎細胞およびＣＧ４神経膠細胞がある。宿主細胞は、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔法、微量注入法、またはリポフェクチン法などの当該分野で公知の方法を用いて、前述のようなプラスミドにより形質転換される。本発明で使用できる他の適当な宿主には、卵母細胞、特にツノガエル（Xenopus）卵母細胞がある。本発明において、ニコチン性アセチルコリン受容体は、少なくとも１つのアルファ９サブユニットを含有する宿主細胞中で組換え法で発現される。組換え受容体はホモマーまたはヘテロマーである。すなわち、形質転換される宿主細胞は、アルファ９サブユニットを含有する受容体、または少なくとも１つのアルファ９サブユニットと１つまたはそれ以上の他のｎＡＣｈＲサブユニットを含有する受容体を発現することができる。本発明はまた、核酸プローブを提供する。このようなプローブは、アルファ９ｎＡＣｈＲサブユニットをコードする配列と特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドよりなる。本明細書において、「プローブ」という語句は、図１（また配列番号１も参照）に記載の少なくとも１４個の連続塩基を含有するヌクレオチド配列を有する、１本鎖または２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。アルファ９サブユニットを他のアルファｎＡＣｈＲサブユニットから区別するために使用されるプローブは、好ましくはアルファ９ヌクレオチド配列の細胞質性ループ領域からの少なくとも１４個の連続塩基から構成される。あるいは、ｎＡＣｈＲファミリーの追加のサブユニットを見つけるために使用されるプローブは、好ましくはアルファ９ヌクレオチド配列の膜にまたがる領域からの少なくとも１４個の連続塩基から構成される。本明細書において、「特異的にハイブリダイズする」という用語は、相補的な核酸配列を認識し、相補的な塩基対の間で水素結合を介して２重らせん部分を形成するポリヌクレオチドの能力を包含する。核酸プローブ技術は、当業者に公知であり、そのようなプローブは長さが異なり、検出物質（例えば、放射性同位元素、蛍光色素など）で標識してプローブの検出を促進することは、当業者は容易に理解できるであろう。本発明のプローブは、アルファ９ｎＡＣｈＲサブユニットをコードする核酸の存在の検出に有用である。例えば、プローブをｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションに使用して、アルファ９ｎＡＣｈＲサブユニットを発現する特異的組織を同定することができる。さらに、アルファ９ｎＡＣｈＲサブユニットをコードする核酸に相補的なオリゴヌクレオチドは、アルファ９遺伝子および関連ｍＲＮＡの検出、または相同性スクリーニングまたはゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーまたは当該分野で公知増幅法を用いて関連遺伝子を単離するのに有用である。本発明はさらに、アルファ９ｎＡＣｈＲサブユニットをコードするｍＲＮＡの任意の部分と特異的にハイブリダイズしてｍＲＮＡの翻訳を妨害することができる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、アルファ９サブユニットをコードするｃＤＮＡの任意の部分と特異的に結合できる配列を含有する。本明細書において、「特異的に結合する」という用語は、相補的な核酸配列を認識して、相補的な塩基対の間で水素結合を形成して、これと２重らせん部分を形成する、核酸配列の能力を意味する。また本発明において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、アルファ９ｎＡＣｈＲ受容体をコードするｍＲＮＡに結合してその翻訳を妨害することができる、アルファ９ｎＡＣｈＲサブユニットの発現を低下させるのに有効な量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドよりなる組成物が提供される。本発明により提供される組成物は、細胞膜を通過することができる許容される疎水性担体よりなり、また選択された型の細胞に特異的な受容体に結合し、こうして選択された型の細胞により接種される構造よりなる。この構造は、細胞の型に特異的な受容体に結合することが公知のタンパク質の一部であってもよい。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド組成物（ＡＯＣ）は、注入により被験体に投与するために血流中で、または実験室の細胞培養条件下で安定であるように設計される。ＡＯＣの物理的および化学的性質は、組成物が細胞膜を通過して細胞質の中に入ることができるように選択される。そのような組成物は、ＡＯＣを細胞内に促進および輸送する、小さい疎水性化学構造、または特異的細胞輸送系を含むように設計することができる。さらに、ＡＯＣは、選択された細胞集団にのみ結合して接種されるようにＡＯＣをターゲティングすることにより、ある選択された細胞集団にのみ投与できるように設計される。ターゲティングは、前述のようなある特異的な細胞型中にのみ存在する受容体に、細胞特異的ＡＯＣを設計することにより行われる。あるいは、ＡＯＣは、標的ｍＲＮＡ配列を選択的に認識して結合するように設計することもできる。後者の例では、ターゲティングは、例えば図１（配列番号１）に示す配列内に含有される配列を用いて行われる。ＡＯＣは、（１）標的ｍＲＮＡに結合し、ＲＮａｓｅＩ消化によりｍＲＮＡの変性を誘導することにより、または（２）翻訳制御因子またはリボゾームの結合を妨害、または他の化学的構造（例えば、リボゾーム配列、または標的ｍＲＮＡを変性させるかもしくは化学的に修飾する反応性の化学的な基）を含有させることにより、標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害することにより、標的ｍＲＮＡ配列を不活性化するように設計される。ＡＯＣは、ｍＲＮＡ標的に向かわせた時、そのような性質を示すことができることは証明されている（コーエン（Cohen）ら、ＴＩＰＳ，１０：４３５（１９８９）およびウェイントラウブ（Weintraub）、Ｓｃｉ．Ａｍｅｒｉｃａｎ，Ｊａｎｕａｒｙ（１９９０），ｐｐ．４０；いずれも参照により本明細書に取込まれる）。本発明はまた、本発明のアルファ９ｎＡＣｈＲポリペプチドおよび／またはタンパク質との特異的反応性を有する抗体を提供する。抗体の活性断片は、「抗体」の定義の中に包含される。本発明の抗体は、当該分野で公知の方法により産生される。例えば、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、例えば、ハーローとレーン（Harlow a nd Lane）、抗体：実験室マニュアル（Antibodies:A Labroratory Manual）（コールドスプリングハーバーラボラトリー(Cold Spring Harbor Labroatory)，１９８８）（参照により本明細書に取込まれる）に記載の方法により、産生することができる。本発明のアルファ９タンパク質またはその部分は、そのような抗体を産生するための免疫原として使用することができる。あるいは、合成ペプチドを調製（市販の合成機を用いて）して、免疫原として使用することができる。アミノ酸配列は、当該分野で公知の方法で解析して、対応するアルファ９の本発明のタンパク質の親水性または疎水性ドメインを含有するかどうかを決定することができる。キメラ、ヒト化、ＣＤＲ−移植または２官能性抗体のような改変抗体も、当該分野で公知の方法で産生することができる。そのような抗体はまた、ハイブリドーマ、化学的合成または組換え法（例えば、サムブルーク(Sambrook) ら、分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）（第２版）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold S pring Harbor Laboratory）、１９８９）（参照により本明細書に取込まれる）、およびハーローとレーン（Harlow and Lane）、同上）により産生することもできる。抗−ペプチドおよび抗−融合蛋白を使用することができる（例えば、バホウス（Bahouth）ら、ＴｒｅｎｄｓＰｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１２：３３８（１９９１）；アウスベル（Ausubel）ら、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（John Wiley and Sons）、参照により本明細書に取込まれる）。本発明の抗体は、例えばアルファ９本発明の受容体の単離などの種々の用途を有する。さらに該抗体は、アルファ９受容体の存在および受容体の局在化、サブユニット組成および機能性ドメインの構造の解析のための有用である。細胞表面上のアルファ９ｎＡＣｈＲの存在の検出方法は、アルファ９ｎＡＣｈＲ受容体に特異的に結合する抗体に細胞を接触させ、細胞表面上の結合抗体の存在を検出することよりなる。アルファ９受容体の検出に関して、本発明の抗体は、例えばインビトロ診断法またはインビボイメージング法に使用することができる。試料中のアルファ９受容体のインビトロ検出に有用な免疫学的方法には、検出できる抗体を用いる免疫測定法がある。そのような免疫測定法には、例えば、当該分野で公知のＥＬＩＳＡ、パンデックス（Pandex）微量蛍光測定法、凝集法、フローサイトメトリー、血清診断法、および免疫組織学的染色法がある。抗体は、当該分野で公知の種々の手段により検出することができる。例えば、検出マーカーは、抗体に直接または間接に結合することができる。有用なマーカーには、例えば放射性核種、酵素、蛍光性、発色性および化学発光性標識物がある。さらに、本発明の抗体は、動物およびヒトならびにこれらから単離される生物組織中のアルファ９受容体のイオンチャネル活性を調節するのに使用することができる。従って、本発明は、担体、および天然に存在するリガンドが受容体に結合するのを阻止するのに有効な量の、アルファ９受容体に特異性を有する抗体よりなる組成物を提供する。細胞の表面に存在するアルファ９受容体のエピトープに対するモノクローナル抗体（この抗体は、配列番号２に記載のものと実質的に同じアミノ酸配列を有する）は、この目的のために有用である。本発明はさらに、アルファ９タンパク質をコードする核酸を発現することができるトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。また、生物学的に機能性のアルファ９タンパク質をコードする核酸を発現することができないか、またはある意味で生物学的に欠損しているアルファ９タンパク質を発現することができるトランスジエニック非ヒト哺乳動物が提供される。機能不全の程度は、突然変異したタンパク質をコードするようにアルファ９核酸を操作することにより、変更することができる。本発明はまた、アルファ９ｍＲＮＡに相補的なアンチセンスｍＲＮＡに転写できるアンチセンス核酸よりなるゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。このようなアンチセンスｍＲＮＡは、アルファ９ｍＲＮＡにハイブリダイズし、その翻訳を低下させる。本発明のトランスジェニック動物に使用される核酸は、特定の型の細胞に発現が誘導または限定されるように、誘導性プロモーターおよび／または組織特異的制御成分に結合していてもよい。適当なプロモーターの例には、メタロチオネインプロモーターおよびＬ７プロモーターがある。トランスジェニック動物を作成するための哺乳動物宿主への核酸物質の移動は、適当な受精胚に物質を、微量注入法、レトロウイルス感染法または他の当該分野で公知の方法で移動させて行われる。（例えば、ホーガン（Hogan）ら、マウス胚の操作：実験室マニュアル（Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual）（コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor La boratory）、１９８６を参照）。本発明のトランスジェニック動物の作成のために相同的組換えも使用することができる。相同的組換え法は、当該分野で公知である。相同的組換え法は、組換えまたは突然変異遺伝子で本来の（内因性）遺伝子を置換して、本来の（内因性）アルファ９受容体サブユニットを発現できないが、例えば突然変異受容体サブユニットを発現することができる動物を産生する。相同的組換え法に対して、微量注入法は、宿主遺伝子を除去することなく宿主ゲノムに遺伝子を加える。微量注入法は、内因性および外因性アルファ９受容体サブユニットを発現することができるトランスジェニック動物を産生することができる。トランスジェニック動物モデル系は、受容体応答を活性化または阻害する受容体特異的リガンド（すなわち、アゴニストおよびアンタゴニスト）の同定のための化合物のインビボスクリーニングに有用である。核酸、オリゴヌクレオチド（アンチセンスを含む）、これらを含有するベクター、形質転換宿主、受容体サブユニットおよびこれらの組合せ、ならびに本発明の抗体は、本発明のアルファ９受容体サブユニットのアゴニストまたはアンタゴニストとして機能する化合物を同定するために、インビトロで化合物をスクリーニングするために使用することができる。このようなインビトロスクリーニング測定法は、本発明のアルファ９受容体サブユニットの機能と活性に関する有用な情報を提供し、これは１つまたはそれ以上の型の受容体サブユニットまたは受容体サブタイプと特異的な相互作用をすることができる薬剤の同定と設計を促進することができる。本発明はまた、アルファ９ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットに結合する化合物の同定法を提供する。このような方法では、本発明の受容体サブユニットは競合的結合測定法において使用される。このような測定法は、多数の化合物を迅速にスクリーニングして、どの化合物が（もし存在すれば）アルファ９ｎＡＣｈＲサブユニットに結合することができるかを決定することができる。次に、結合することが見いだされた化合物でより詳細な測定法を行い、本発明の受容体（すなわち、少なくとも１つのアルファ９サブユニットよりなるｎＡＣｈＲ）のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物を決定することができる。本発明はさらに、本発明の受容体（すなわち、少なくとも１つのアルファ９サブユニットよりなるｎＡＣｈＲ）の活性を調節する化合物の同定のためのバイオアッセイを提供する。１つの態様において、バイオアッセイは、少なくとも１つのアルファ９サブユニットよりなる受容体を発現する細胞に、少なくとも１つの可能性のあるアゴニストを与え、次にイオンチャネル活性について細胞をモニタリングすることにより行われる。さらに別の態様において、バイオアッセイは、少なくとも１つのアルファ９サブユニットよりなる受容体を発現する細胞に、一定量の既知のアルファ９アゴニストと、少なくとも１つの可能性のあるアンタゴニストの増加する量を接触させ、次にイオンチャネル活性について細胞をモニタリングすることにより行われる。本発明はまた、アルファ９ｎＡＣｈＲサブユニット遺伝子の制御領域を調節する化合物を同定するためのバイオアッセイを提供する。そのような測定法は、受容体遺伝子に機能的に結合したアルファ９遺伝子の制御領域の少なくとも一部よりなる核酸作成体で形質転換した哺乳動物細胞を用いて行われる。形質転換された細胞は、少なくとも１つの化合物（この化合物が制御領域を調節する能力は不明である）と接触される。次に細胞を、レポーター遺伝子の発現についてモニタリングする。使用される適当なレポーター遺伝子には、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ルシフエラーゼ遺伝子などがある。本発明の受容体の「活性を調節する」化合物またはシグナルとは、アルファ９受容体の活性を変化させて、化合物またはシグナルの存在下では受容体は化合物またはシグナルの非存在下とは異なるようにする、化合物またはシグナルを意味する。調節に影響する化合物には、アゴニストやアンタゴニストがある。アゴニストは、アルファ９受容体機能を活性化するアセチルコリンのような化合物を包含する。また、アンタゴニストは、アルファ９受容体の機能を妨害する化合物を包含する。典型的にはアンタゴニストの作用は、アゴニストに誘導された受容体活性化の阻止として観察される。アンタゴニストには、競合的および非競合的アンタゴニストがある。競合的アンタゴニスト（または競合的ブロッカー）は、アゴニスト結合に特異的な部位またはその近傍と相互作用する。非競合的アンタゴニストまたはブロッカーは、アゴニスト相互作用部位とは異なる部位と相互作用して、受容体の機能を不活性化する。当業者に理解されているように、ｎＡＣｈＲ活性を調節する化合物の同定のためのバイオアッセイ法は、一般的に対照との比較が必要である。１つのタイプの「対照」は、化合物に接触させた試験細胞または試験培養物と実質的に同じように処理した細胞または培養物であるが、「対照」細胞または培養物は化合物に接触されていない点が異なる細胞または培養物である。例えば、電圧クランプ電気生理的方法を用いる方法では、細胞を浸している外部溶液を単に変化させることにより、化合物の存在下でまたは非存在下で同じ細胞を試験することができる。使用される他のタイプの「対照」細胞または培養物は、トランスフェクションされた細胞と同一の細胞または培養物であるが、「対照」細胞または培養物は機能的アルファ９ｎＡＣｈＲ受容体サブユニットを発現しない点が異なる細胞または培養物である。従って、トランスフェクションされた細胞の化合物に対する応答は、同じ反応条件下で同じ化合物に対する「対照」細胞または培養物の応答（または応答の欠如）と比較される。本発明のさらに別の態様において、アルファ９ｎＡＣｈＲのイオンチャネル活性は、上記の任意のバイオアッセイにより同定される少なくとも１つの化合物の有効量に受容体を接触させることにより調節することができる。以下の例は本発明を例示するものであり、決してこれを限定するものではない。例１ゲノムライブラリーのスクリーニング全長アルファ７ｎＡＣｈＲサブユニットｃＤＮＡ（セグエラ（Seguela）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１３，５９６−６０４，１９９３）を用いて、５×１０⁵クローンのラムダチャロン（lambdaCharon）４Ａラットゲノムライブラリー（ジェームズ・エバーワイン（James Eberwine）博士、ペンシルバニア大学医学部、薬学部、フィラデルフィア、ペンシルバニア州、より得た）をスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、６５℃で、１ＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリス −塩酸、ｐＨ８．０、０．５％ＳＤＳ、１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび０．１％（ｗ／ｖ）ずつのフィコール、ポリビニルピロリドンおよびウシ血清アルブミン中で行なった。フィルターを、４５℃で２×ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、１８０ｍＭＮａＣｌ、９ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、０．９ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、および１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で洗浄した。アルファ９サブユニット遺伝子のエキソンIVとＶを含有する約１６ｋｂのクローンを単離した。例２ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング例１に記載のラットゲノムクローンのコード配列から得られたＰＣＲ断片（ヌクレオチド２８３〜８０６、図１；すなわち、配列番号１のヌクレオチド４５５〜９７９）をプローブとして用いて、１×１０⁶プラークのラムダＮＭ１１４９成体ラット嗅上皮ｃＤＮＡライブラリー（ヘインツ・ブレア（Heinz Breer）博士とクラウス・ラミング（Klaus Raming）博士から得た、スタットガアルト−ホーヘンハイム（Stuttgart-Hohenheim）大学、動物生理学研究所（Institute of Zoophysiology）、スタットガアルト（Stuttgart）、ドイツ）をスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは例１で記載したように行い、フィルターを６５ ℃で０．２×ＳＳＰＥで洗浄した。４つの独立クローンを単離し、１つが全長アルファ９ｃＤＮＡを含有していた（図１）。アルファ９ｃＤＮＡは、８７塩基対の５’非翻訳領域、１４３７塩基対の読みとり枠、および４１３塩基対の３’非翻訳領域から構成される。全長アルファ９ｃＤＮＡをプローブとして用いて、ファージベクターラムダＤＡＳＨIIおよびラムダＦＩＸIIで作成した２つのマウス（１２９ＳｖＪ）ゲノムライブラリーをスクリーニングした。２つの重複するゲノムクローンを得た（図２）。アルファ９サブユニット遺伝子の全コード配列にまたがるこれらのクローンをプラスミドベクター中にクローン化し、イントロン −エキソン境界にわたる配列を決定してアルファ９サブユニット遺伝子構造を決定した。例３ヌクレオチド配列測定と解析シーケナーゼ２．０キット（米国バイオケミカル（United States Biochemica l）、クリーブランド、オハイオ州）と合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、アルファ９サブユニットｃＤＮＡクローンを配列決定した。ウイスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（Genetics Computer Group）［デベロ（D evereux）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１２，３８７−３９５，１９８４］の配列解析ソフトウェアを用いて、アルファ９アミノ酸配列と他のｎＡＣｈＲアルファサブユニットとを比較した。対になった配列の間の配列の同等％を、同一の残基の数を短い配列中の残基の総数で割って、この計数に１００を掛けて計算した。例４電気生理的方法ヌクレオチド−９４〜１７６６（図１；すなわち、配列番号１の残基７９〜１９３８）を、発現ベクターｐＧＥＭＨＥ（リマン（Liman）ら、Ｎｅｕｒｏｎ，９，８６１−８７１，１９９２）中にサブクローニングして、ツノガエル（Xeno pus）卵母細胞発現試験に適した全長アルファ９ｃＤＮＡを作成した。ｃＲＮＡは、メサージ・マシーン(mMessage mMachine)転写キットを用いて、ＮｈｅＩで線状化したプラスミドで合成した。卵母細胞の単離と維持は既に記載されている（ボウルター（Boulter）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７７６３−７７６７，１９８７）。各卵母細胞に、１〜１０ｎｇのｃＲＮＡを注入した。２〜７日後、アクソクランプ２Ａ増幅器（Axoclamp 2A amplifier）（アクソン・インスツルメンツ（Axon Instruments）、フオスターシティー、カリホルニア州）を用いて２電極電圧クランプで、電気生理的記録を行なった。電圧電極は３ＭＫＣｌが充填され、抵抗は約１０Ｍオームであった。電流電極は０．３ＭＫＣｌが充填され、抵抗は約１Ｍオームであった。特に明記しなければ、保持電圧は−５０ｍＶであった。Ｉ−Ｖ関係は、ｐＣｌａｍｐ５．５ソフトウェア（アクソン・インスツルメンツ（Axon Instruments））を用いて、アゴニストの存在下で２秒間電圧ランプをかけて、アゴニスト添加の前と後に得られた対照の平均値を引いて求めた。すべての記録をデジタル化し、コンピューターに保存した。エス・トライネリス（S．Traynelis）博士（ソーク生物試験研究所（Salk Institute for Biologica l Studies）、ラホイア、カリホルニア州）により設計され供与されたソフトウェアを用いて、データを解析した。卵母細胞に連続的にカエルリンゲル液（１０ｍＭヘペス、ｐＨ７．２、１１５ｍＭＮａＣｌ、１．８ｍＭＣａＣｌ₂および２．５ｍＭＫＣｌ）を注いだ。卵母細胞を注入しないものでは薬剤の添加による応答は観察されなかった。阻害曲線（図４Ｂ、５Ａおよび５Ｂを参照）のために、アンタゴニストを１０μＭのアセチルコリンと同時に加えた。α−ブンガロトキシンとκ−ブンガロトキシン（図６Ａと６Ｂを参照）の場合は、卵母細胞をこれらの薬剤と３０分間プレインキュベートした。１回の実験あたり少なくとも４個の卵母細胞のピーク電流の平均と平均の標準誤差を、図に示した。すべての曲線フィッティングは、シグマ・プロット（Sigma Plot）ソフトウェア（ヤンデル・サイエンティフィック（Jandel S cientific））を用いて以下の式により行なった：（ｉ）応答（濃度−応答曲線用）＝［（最大−最小）／（１＋（ＥＣ₅₀／濃度）ⁿ ）］＋最小、および（ii）応答（濃度−阻害曲線用）＝［（最大−最小）／（１＋（濃度／ＩＣ₅₀）ⁿ ）］＋最小。硫酸アトロピン、二酒石酸（−）−ニコチン、塩化（＋）−ムスカリン、塩酸ストリキニーネ、およびオキソトレモリン−Ｍは、アールビーアイ（ＲＢＩ）（ナチック（Natick）、マサチューセッツ州）から得、カッパ−ブンガロトキシンは、ブイ・チアピネリ（V．Chiappinelli）博士（セントルイス大学メディカルセンター、セントルイス、ミズーリ州）より供与された。すべての他の薬剤は、シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Co.）（セントルイス、ミズーリ州）から得た。薬剤は、カエルリンゲル液に溶解した。トキシン溶液にウシ血清アルブミン（１００ｍｇ／ｍｌ）を加えた。例５ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションラットＥ１６胚の矢状中断面（ハイブリッド−レディ組織（Hybrid-ready tis sue）、ノバゲン（Novagen）、マジソン、ウィスコンシン州）の切片と成体ラット脳の２０μｍ厚の冠状切片を用いて、シモンズ（Simmons）ら（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１２，１６９−１８１，１９８９）の記載したプロトコールにより実験を行なった。³⁵Ｓ−または³²Ｐ−標識物ＲＮＡプローブを、アルファ９ｃＤＮＡから得た（例えば、ヌクレオチド２８３〜８０６、図１；すなわち、配列番号１のヌクレオチド４５５〜９７９）。ハイブリダイゼーションは６５ ℃で行い、最終洗浄は、７２℃で０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、１８０ｍＭＮａＣｌ、１７ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）中で行なった。スライドを、コダックＮＴＢ−２エマルジョンに浸し、４℃で３週間露光した後コダックＤ１９で現像し、次にニス１（Niss1）染色した。例６増幅反応成体のスプラーグ−ドーレイ（Sprague-Dawley）ラットから組織を得た。ラットを断頭し、組織を迅速に分離し、液体窒素に浸漬した。チョムクジンスキーとサッキ（Chomczynski and Sacchi）（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５９，１９８７を参照）に従って、トリゾール（TRIzol）試薬（ギブコ・ビーアールエル（GIBCO BRL）、ゲーサーズバーグ（Gaithersbur g）、メリーランド州）を用いて総ＲＮＡを単離した。スーパースクリプト・プレアンプリケーション・システム（Superscript Preamplification System）（ギブコ・ビーアールエル（GIBCO BRL））を用いて、２μｇの総ＲＮＡから第１の鎖のｃＤＮＡを合成した。５０ｎｇのｃＤＮＡを含む画分を増幅反応の鋳型として用いた。アルファ９の以下の特異的プライマーを用いた：センスプライマー、ヌクレオチド７７８〜８０２；アンチセンスプライマー、ヌクレオチド１３５３〜１３２７（図１；それぞれ、配列番号１のヌクレオチド９５１〜９７５およびヌクレオチド１５２６〜１５００）。予測された断片は、１つのイントロン− エキソン境界にまたがる。ｃＤＮＡからの増幅の場合は５７３塩基対バンドが予測され、汚染しているゲノムＤＮＡの増幅からは、約１４５０塩基対の断片が得られるであろう。反応は以下の反応混合物中で行なった：５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、５ＵのＴａｑエンハンサー（ストラタジーン（Stratagene）、ラホイア（La Jolla）、カリホルニア州）、５μＭの各プライマー、５０μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ、２０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．５、１０ｍＭ（Ｈ₄Ｎ）₂ＳＯ₄、２ｍＭＭｇＳＯ₄、０．１％トリトンＸ−１００および０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン。サイクルパラメータは：９５℃ で２分の後、次に各５５℃で１分、７２℃で１分、９５℃で３０秒を３４サイクル、そして最後に、５５℃で１分、７２℃で５分を１サイクル。例７ラット蝸牛中のアルファ９転写体の検出アルファ９遺伝子がラット蝸牛中で発現されるかどうかを測定するために、蝸牛の総ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡについて増幅反応を行なった。例５に記載のように、イントロン−エキソン境界をまたぐ断片を増幅し、さらにゲノムＤＮＡの増幅を避けるために、アルファ９配列に特異的な２つのプライマーを用いた。アルファ９は嗅上皮に存在するため、この組織から得られたｃＤＮＡを陽性対照として使用した。増幅反応に使用したパラメータで、試験した任意の組織中に非常に少量の転写体が検出される可能性を排除するために、座骨神経ｃＤＮＡを含めた。アルファ９の特異的プライマー（図８）を用いると座骨神経からＤＮＡは増幅されなかったが、各特異的プライマーによりこの組織中にアルファ３およびアルファ４サブユニットが検出された。アルファ９ｃＤＮＡからの増幅について、ラットの蝸牛で予測されたサイズ（５７３塩基対）の断片が得られた。ＡｃｃＩ、ＨｉｎｆＩおよびＮｃｏＩによる断片の制限エンドヌクレアーゼ解析により、この断片はアルファ９転写体から得られたことが確認された。具体的な態様について本発明を説明したが、本明細書に記載の具体例は本発明を例示するためのものであることは当業者に容易に理解されるであろう。本発明の精神と範囲を逸脱することなく、種々の修飾や変更が可能であることは理解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 7823−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 9735−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者ジョンソン，デビッドエス. アメリカ合衆国 92037 カリフォルニア州ラジョラ，リージェンツロード 9152 − エル. (72)発明者ボールター，ジェームズリチャードアメリカ合衆国 92075 カリフォルニア州サンディエゴ，サウスリオスアベニュー 147 (72)発明者ハイネマン，スチーブンフォックスアメリカ合衆国 92037 カリフォルニア州ラジョラ，クリフリッジレーン 8481

Claims

【特許請求の範囲】１．アルファ９ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）サブユニットをコードする単離された核酸。２．核酸はＤＮＡを含む、請求の範囲第１項に記載の単離された核酸。３．ＤＮＡはｃＤＮＡである、請求の範囲第２項に記載のＤＮＡ。４．ＤＮＡは配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする、請求の範囲第２項に記載のＤＮＡ。５．ＤＮＡは、高厳密性条件下で配列番号１に記載のヌクレオチド配列とハイブリダイズする、請求の範囲第２項に記載のＤＮＡ。６．ＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列と実質的に同じである、請求の範囲第２項に記載のＤＮＡ。７．請求の範囲第２項に記載のＤＮＡを含むベクター。 8．請求の範囲第７項に記載のベクターを含有する宿主細胞。９．細胞は、少なくとも１つのアルファ９ｎＡＣｈＲサブユニットを含む機能性ｎＡＣｈ受容体を発現する、請求の範囲第８項に記載の宿主細胞。１０．受容体はホモマーである、請求の範囲第９項に記載の宿主細胞。１１．受容体はヘテロマーである、請求の範囲第９項に記載の宿主細胞。１２．請求の範囲第２項に記載の少なくとも１４個の連続ヌクレオチドを含む核酸プローブ。１３．請求の範囲第２項に記載のＤＮＡに相補的な単離されたｍＲＮＡ。１４．請求の範囲第１３項に記載のｍＲＮＡに特異的に結合しその翻訳を調節する、アンチセンスオリゴヌクレオチド。１５．単離されたアルファ９ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニット、およびその生物活性を有する断片。１６．サブユニットは、配列番号２に記載のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する、請求の範囲第１５項に記載の単離されたアルファ９ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニット。１７．サブユニットは、配列番号２に記載のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する、請求の範囲第１５項に記載の単離されたアルファ９ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニット。１８．宿主細胞中で組換え発現される機能性ニコチン性アセチルコリン受容体であって、（ｉ）下垂体、嗅上皮、蝸牛および舌で発現され、（ii）アセチルコリンにより活性化されるが、ニコチンとムスカリンにより阻止され、そして（iii）少なくとも１つのアルファ９アセチルコリン受容体サブユニットを含む、上記受容体。１９．アルファ９ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットは、配列番号２に記載のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する、請求の範囲第１８項に記載の受容体。２０．アルファ９ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットは、配列番号２に記載のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する、請求の範囲第１８項に記載の受容体。２１．アルファ９ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットに特異的に結合する抗体。２２．抗体はモノクローナル抗体である、請求の範囲第２１項に記載の抗体。２３．抗体はポリクローナル抗体である、請求の範囲第２１項に記載の抗体。２４．少なくとも１つのアルファ９サブユニットを含むニコチン性アセチルコリン受容体の発現を調節するのに有効な量の請求の範囲第１４項に記載のオリゴヌクレオチド、および細胞膜を通過できる許容される疎水性担体、を含む組成物。２５．少なくとも１つのアルファ９サブユニットを含むニコチン性アセチルコリン受容体への、天然に存在するリガンドの結合を阻止するのに有効な量の請求の範囲第２１項に記載の抗体、および許容される担体、を含む組成物。２６．アルファ９ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットをコードするＤＮＡを発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。２７．発現される受容体が野生型のアルファ９ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットを含有しないように、受容体をコードするＤＮＡが突然変異されている、請求の範囲第２６項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。２８．トランスジェニック非ヒト哺乳動物はマウスである、請求の範囲第２６項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。２９．アルファ９ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットをコードする核酸の同定方法であって、核酸の集団を含有する試料に請求の範囲第１２項に記載のプローブを接触させ（ここで、接触は高厳密性ハイブリダイゼーション条件下で行われる）、そして該プローブにハイブリダイズする核酸を同定することよりなる、上記方法。３０．請求の範囲第９項に記載の細胞に試験化合物を接触させ、そこに結合する化合物を同定することよりなる、アルファ９ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットに結合する化合物の同定方法。３１．少なくとも１つのアルファ９サブユニットを含むニコチン性アセチルコリン受容体の活性を調節する化合物の同定のためのバイオアッセイであって、請求の範囲第９項に記載の細胞に、少なくとも１つの化合物（この化合物が受容体のイオンチャネルを調節する能力は未知である）に接触させ、その後にイオンチャネル活性の変化について細胞をモニタリングすることよりなる、上記バイオアッセイ。３２．細胞が少なくとも１つの可能性のあるアゴニストと接触する、請求の範囲第３１項に記載の方法。３３．細胞が、一定量のアゴニストと増加する量の少なくとも１つの可能性のあるアンタゴニストと接触する、請求の範囲第３１項に記載の方法。３４．アルファ９ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニット遺伝子の制御領域を調節する化合物の同定方法であって、アルファ９遺伝子の制御領域の少なくとも一部（制御遺伝子の該部分は受容体遺伝子に機能的に結合している）を含む核酸構築体で哺乳動物を形質転換し、形質転換した細胞に、少なくとも１つの化合物（ここで、この化合物がアルファ９受容体サブユニット遺伝子の制御領域を調節する能力は未知である）を接触させ、そしてレポーター遺伝子の発現について細胞をモニタリングすることよりなる、上記バイオアッセイ。