DE19850429A1

DE19850429A1 - Fragmente

Info

Publication number: DE19850429A1
Application number: DE1998150429
Authority: DE
Inventors: Andre Schrattenholz; Alfred Maelicke; Sascha Pfeiffer
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-10-27
Filing date: 1998-10-27
Publication date: 2000-05-04
Also published as: WO2000024887A3; WO2000024887A2; AU6470299A

Abstract

Es wird unter anderem ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von ligandenbindenden, insbesondere extrazellulären, Fragmenten der Untereinheiten von Rezeptoren, insbesondere von Neuro- und Hormonrezeptoren, in isolierter, nativer Form mit folgenden Schritten bereitgestellt: DOLLAR A - Expression der Fragmente, DOLLAR A - Solubilisierung der Fragmente, insbesondere die in inclusion bodies enthaltenen, DOLLAR A - Entfernen der für die Solubilisierung notwendigen Denaturierungsmittel, DOLLAR A - Renaturierung der Fragmente und DOLLAR A - Entfernen der für die Renaturierung notwendigen Mittel.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von ligandenbindenden, insbesondere extrazellulären, Fragmenten der Untereinheiten von Rezeptoren, insbesondere von Neuro- und Hormonrezeptoren, in isolierter, nativer Form.

Weiterhin betrifft die Erfindung Fragmente der Untereinheiten von Rezeptoren, insbesondere von Neuro- und Hormonrezeptoren, ein pharmakologisches Screening-Verfahren für Rezeptoren, insbesondere von Neuro- und Hormonrezeptoren, ein spektrokopisches Strukturuntersuchungsverfahren, ein Kristallisationsverfahren und unter anderem entsprechende Verwendungen der Fragmente.

Rezeptoren, insbesondere Neuro- und Hormonrezeptoren, sind bis dato einer detaillierten Strukturaufklärung durch Verfahren wie beispielsweise NMR oder Röntgenstrukturanalyse von Kristallen nicht zugänglich.

Trotz einiger Fortschritte in den Methoden (Léna, C. & Changeux, J. P. (1993) Trends Neurosci. 16, 181-186; Hucho, F., Tsetlin, V. I. & Machold, J. (1996) Eur. J. Biochem. 239, 539-557; Bertrand, D. & Changeux, J.-P. (1995), Sem. Neurosci. 7, 75-90; Conti-Fine, B. M., Maelicke, A. Reinhardt-Maelike, S., Chiapinelli, V. & McLane, K. E. (1995); Maelicke, A. (1992) in Receptor Subunits and Complexes, eds. Barnard, E. A., Burgen, A. S. V. & Roberts, G. C. K. (Cambridge University Press, Cambridge), pp. 119-162; Lindstrom, J. (1996) Mol. Neurobiol. 15, 193-222), ganze Membranproteine zu kristallisieren, sind bis heute nur ca. 20 Membranproteine kristallisiert und deren dreidimensionale Struktur aufgeklärt, wobei jedoch insbesondere die Aufklärung von Neurotransmitter-Rezeptoren noch aussteht.

Dank rekombinanter Proteintechnologie ist es in einer Reihe von Fällen gelungen, strukturelle Details lediglich von Liganden (nämlich von Bungarotoxin) im Zusammenhang mit kurzen (Länge ca. 20 Aminosäuren) Proteinbruchstücken mittels NMR aufzuklären. Diese sehr kleinen Bruchstücke weisen jedoch nur eine sehr geringe Aussagekraft auf, da sie nicht die entsprechende Tertiärstruktur ausbilden (Gershoni, J. M., Hawrot, E. & Lentz, T. L. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4973-4977; Basus, V. J., Song, G. & Hawrot, E. (1993) Biochemistry 32, 12290 -12298).

In der EP 0 786 520 A1 wird unter anderem ein Verfahren zur gentechnologischen Herstellung von biologisch aktivem beta-NGF (nerve growth factor) durch Expression einer entsprechenden DNA-Sequenz in Prokaryonten als Wirtszellen offenbart, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die nach Expression erhaltenen unlöslichen Aggregate von inaktivem beta-NGF durch

1. 1.) Solubilisierung,
2. 2.) gegebenenfalls Dialyse oder/und Derivatisierung des erhaltenen beta-NGF mit der oxidierten Form einer Verbindung, deren reduzierte Form Sulfhydrylgruppen aufweist und deren oxidierte Form ein über eine Disulfidbrücke verbundenes Dimer der Verbindung ist, zum gemischten Disulfid, und
3. 3.) Naturierung mit Hilfe eines Redoxsystems, bestehend aus einer Verbindung in oxidierter oder/und reduzierter Form, deren reduzierte Form Sulfhydrylgruppen aufweist und deren oxidierte Form ein über eine Disulfidbrücke verbundenes Dimer ist,

bei einer Temperatur zwischen 0°C und 30°C, einem pH-Wert zwischen 8 und 10 sowie in Gegenwart von Tris-Base oder Tris-Salz und/oder Arginin in eine lösliche aktive Form von beta-NGF überführt.

In US 5,599,709 wird unter anderem die Isolierung und Sequenzierung von cDNA-Klonen dargestellt, die zwei neuronale alpha-bungarotoxin-bindende Protein-Untereinheiten kodieren. Desweiteren wird die Expression dieser Untereinheiten (Spalte 1, 1. Absatz: ". . . and to the expression of these subunits or their subsegments . . . using recombinant technology . . .") vorgestellt.

In WO 91/15602 werden unter anderem nikotinische Acetylcholinrezeptor-Untereinheiten sowie Herstellungsverfahren für solche Untereinheiten enthaltende funktionale Rezeptoren beschrieben.

Fürs pharmakologische Screening von Medikamenten, die mit Rezeptoren, insbesondere mit Neurorezeptoren, interagieren, stehen zur Zeit im wesentlichen nur elektrophysiologische Oocytenversuche (neben weiteren ektopischen Expressionssystemen wie HEK (human embryonic kidney cells)) zur Verfügung, die mit dem Nachteil behaftet sind, daß sie sehr aufwendig, Zeit- und somit kostenintensiv sind.

Aus dem genannten Stand der Technik ergibt sich daher das Problem, ausreichende Mengen an biologisch aktivem Rezeptormaterial in reiner Form, insbesondere an Neuro- und Hormonrezeptormaterial, zur Verfügung zu stellen, um damit spektroskopische Strukturuntersuchungen von biologisch aktivem Rezeptormaterial, insbesondere von Neuro- und Hormonrezeptormaterial, zu ermöglichen und ein kostengünstiges pharmakologisches Screening-Verfahren für Rezeptoren, insbesondere für Neuro- und Hormonrezeptoren, bereitzustellen.

Dieses Problem wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren nach Anspruch 1, Fragmente nach Anspruch 17, Verfahren nach den Ansprüchen 18 bis 20 und Verwendungen nach den Ansprüchen 21 bis 26 gelöst.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden zunächst die jeweils biologisch aktiven Fragmente von Rezeptoren, insbesondere von Neuro- und Hormonrezeptoren, insbesondere die extrazellulären Fragmente, insbesondere bei Neurorezeptoren aus der Super-Genfamilie der pentameren Ionenkanäle, exprimiert. Die Expression wird durch übliche Verfahren bewerkstelligt. Beispielsweise mittels PCR-Verstärkung aus einem cDNA-Klon (1. Heraussuchen von DNA-Sequenzen für die interessanten Rezeptor-Untereinheiten (oder nahe Verwandte) in allgemeine zugänglichen Datenbanken (z. B. NCBI); 2. Herstellung entsprechend spezifischer Oligonukleotide mittels eines Nucleotid-Synthezisers; 3. Herstellung einer cDNA-Bank über m-RNA-Isolation aus Gewebe; 4. gezielte Amplifizierung der interessanten cDNA mit Hilfe der spezifischen Oligonukleotide) unter Verwendung von Primern, die beispielsweise mit Restriktionsstellen für NdeI und BamHI ausgestattet sind, und entsprechenden Endonukleasen werden die Fragmente in einen passenden Vektor, beispielsweise in pET3a, ligiert. Die entstandenen Plasmide werden insbesondere nach dem Verfahren nach Birnboim (Birnboim, H. C. (1983) Meth. Enzymol. 100, 243-255) isoliert und danach zur Transfektion in passende Wirte eingeführt. Die Expression findet dann nach vorheriger Induktion der transformierten Bakterien statt. Die exprimierten Fragmente werden in den sogenannten inclusion bodies (Kompartimente, die in diesen Fällen vor allem die entsprechenden Fragmente enthalten, die in der angefallenen Form wasserunlöslich und nicht biologisch aktiv sind) "gesammelt". Diese werden mit bekannten Verfahren von den Wirten separiert und vorgereinigt.

Anschließend findet die Solubilisierung der inclusion bodies statt. Auch hier kommen in der Regel konventionelle Methoden in Frage, beispielsweise die Einstellung in Puffersystemen, denen chaotrope, denaturierende Reagenzien, beispielsweise Guanidiniumchlorid, und Reduktionsmittel, beispielsweise Dithioerythritol, zugesetzt werden. Diese Homogenisierung kann von anschließenden Reinigungsschritten begleitet werden, beispielsweise von Zentrifugationsdurchläufen.

Danach wird eine auf die Verhältnisse eingestellte Dialyse durchgeführt, um hauptsächlich das Reduktionsmittel, beispielsweise Dithioerythritol, zu entfernen.

Schließlich werden die Fragmente renaturiert, d. h., ihnen wird die Möglichkeit eingeräumt, sich in einem bestimmten Medium wieder "einzustellen", also ihre native Sekundär- und Tertiärstruktur wieder anzunehmen. Solche Systeme sind aus dem Stand der Technik bekannt und beinhalten neben Faltungshilfen (Agenzien zur Faltungshilfe wie beispielsweise Amino guanidyl-Buttersäure; Faltungshilfen sind Moleküle, die über eine funktionelle Gruppe, beispielswiese eine Guanidinium-Gruppe, verfügen, die Wasserstoff und im allgemeinen polare Wechselwirkungen destabilisiert, sowie über eine weitere Gruppe, beispielsweise eine Carboxyl- und Amino-Gruppe, die obige Wechselwirkungen begünstigt) Oxidoshuffling- Systeme. Diese Systeme sind Redoxsysteme, die hauptsächlich aus einer Verbindung in oxidierter oder/und reduzierter Form bestehen, deren reduzierte Form Sulfhydrylgruppen aufweist und deren oxidierte Form ein über eine Disulfidbrücke verbundenes Dimer ist. Als Beispiel sei Glutathion genannt.

Nach der Renaturierung wird eine auf die Verhältnisse eingestellte Dialyse durchgeführt, um im wesentlichen die für die Renaturierung notwendigen Mittel zu entfernen.

Anschließend werden die Fragmente mit nativer Konformation mit bekannten Verfahren, beispielsweise durch Ultrafiltration, konzentriert.

In vorteilhafter Weise stammen die Neurorezeptoren aus der Super-Genfamilie der ligandengesteuerten pentameren Ionenkanäle, wobei es besonders vorteilhaft ist, wenn ein Fragment ein Proteinfragment ist, das aus den Aminosäuren 1-209 der nikotinischen Acetylcholinrezeptor-alpha-Untereinheit von Torpedo marmorata besteht und die zum Proteinfragment entsprechende Matrize ein cDNA/RNA-Fragment ist, das für die Aminosäuren 1-209 der nikotinischen Acetylcholinrezeptor-alpha-Untereinheit von Torpedo marmorata kodierend ist, da sich dies in der Praxis besonders bewährt hat.

Die in den Unteransprüchen 5 bis 16 aufgeführten Ausgestaltungen haben sich aufgrund ihrer Praxisbewährtheit als vorteilhaft herausgestellt:
Die Expression findet in E. coli statt.

Die bei der Expression verwendeten Primer sind mit Restriktionsstellen für NdeI und BamHI versehen.

Die Fragmente werden in einen pET3a-Vektor ligiert.

Die Transfektion wird in prokaryotischen Expressionssystemen, insbesondere im E. coli- Stamm BL21(DE3)pLys, durchgeführt.

Die Transfektion wird in eukaryotischen Expressionssystemen, insbesondere in Hefe- Stämmen, durchgeführt. Solche Expressionssysteme weisen im Hinblick auf posttranslationale Modifikationen Vorteile auf.

Bei der Solubilisierung werden chaotrope Reagenzien verwendet.

Das chaotrope Reagenz ist Guanidiniumchlorid und/oder Harnstoff.

Die inclusion bodies werden mit Hilfe von Guanidiniumchlorid, Dithioerythritol und/oder Dithiothreitol und/oder Mercaptoethanol und Ultraschallbehandlung behandelt.

Bei der Renaturierung wird ein Oxidoshuffiing-System verwendet.

Das Oxidoshuffiing-System enthält Glutathion.

Dem Oxidoshuffiing-System wird Arginin zugesetzt. Das Arginin ist eine Faltungshilfe (refolding agent), die die Renaturierung unterstützt.

Für die Entfernung der für die Solubilisierung notwendigen Denaturierungsmittel und/ oder für die Entfernung der für die Renaturierung notwendigen Mittel wird eine Dialyse durchgeführt.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es zum ersten Mal möglich, kostengünstig ein pharmakologisches Screeningverfahren zum Austesten der pharmakologischen Aktivität einzelner Wirkstoffe und Medikamente bezüglich der jeweiligen Untereinheiten entsprechender Rezeptoren, insbesondere entsprechender Neuro- und Hormonrezeptoren, genauer: der ligandenbindenden (also unter Umständen die Wirkstoffe bindenden) Fragmente der Untereinheiten entsprechender Rezeptoren, bereitzustellen und darüber hinaus überhaupt erst ein spektroskopisches Strukturuntersuchungsverfahren bezüglich der ligandenbindenden Fragmente über eine entsprechende Kristallisationsmöglichkeit zu ermöglichen, da die die Kristallisation störenden hydrophoben, häufig membrandurchspannenden Fragmente nicht vorhanden sind.

Die oben aufgezeigten vorteilhaften Eigenschaften gelten auch für die entsprechenden Verwendungen.

Das nachfolgenden Beispiel dient zur Erläuterung der Erfindung.

Materialien

Nikotinische Acetylcholinrezeptor-reiche Torpedo Membran-Fragmente (TMF) (3 mg/ml; 5 nmol von ACh-Stellen/mg) wurden erhalten durch Homogensierung von 200 g eines Torpedo marmorata elektrischen Organs, gefolgt von mehreren Zentrifugationsschritten und alkalischer Behandlung (siehe Schrattenholz, A., Godovac-Zimmermann, J., Schäfer, H. J., Albuquerque, E. X. & Maelicke, A. (1993), Eur. J. Biochem. 216, 671-677).

N-(propionyl-³H)-alpha-Bungarotoxin (54-68 Ci/mmol) wurde von Amersham, Braunschweig, bezogen. Alle anderen Chemikalien waren von p. a.-Reinheit.

Expression von alpha-nAChR_1-209 in E. coli:
Das für die Aminosäuren 1-209 der alpha-Untereinheit von Torpedo marmorata kodierende cDNA-Fragment wurde erhalten durch PCR-Verstärkung unter Verwendung von zwei Primern, die komplementär zu den Nukleotid-Sequenzen 1-18 und 610-627 mit der Torpedo marmorata cDNA sind. Die Primer wurden mit Restriktionsstellen für NdeI und BamHI konstruiert, das gereinigte cDNA-Fragment wurde anschließend in einen pET3a- Vektor ligiert. Plasmide wurden nach der Methode von Birnboim isoliert und anschließend verwendet, um kompetente E. coli - Bakterien des Stranges BL21(DE3)pLysS zu transfektieren. Die Expression des alpha-nAChR_1-209-Fragmentes wurde unter Verwendung des T7-Expressions-Systems nach IPTG-Induktion der transformierten BL21(DE3)pLys- Bakterien durchgeführt. Das alpha-nAChR_1-209-Proteinfragment wurde zum größten Teil ausschließlich in E. coli-inclusion bodies gefunden. Die Bakterien wurden mittels Ultraschall-Behandlung in einem 10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 10 mM MgCl₂ enthaltenden Extraktionspuffer (pH = 8,0) zerstört und die inclusion bodies anschließend mittels 50- minütiger Zentrifugation bei 10.000 U/min abgeerntet.

Reinigung und Renaturierung des exprimierten Proteins aus E. coli-inclusion bodies:
Das das alpha-nAChR_1-209-Fragment enthaltende Pellet wurde solubilisiert in 0,1 molarem Tris, 0,1 molarem Dithioerythritol mittels Ultraschlall-Behandlung und Inkubation für 2 Stunden bei 20°C. Die Lösung wurde 24 Stunden dialysiert gegen 0,1 molarem Tris, 0,1 molarem EDTA, 6 molarem Guanidin-HCl bei einem pH von 8,5 unter Verwendung einer Gegenstrom-Dialyse mittels eines Hohlfaser-Membranmoduls (Variperm L, BITOP, Witten) (Schwarz et al., 1994), um Dithioerythritol zu entfernen. Für einen typischen Renaturierungsansatz wurden 100 µl des Dialysats in 20 ml 100 mM Tris-HCl, 5 mM Glutathion (reduzierte Form), 0,5 mM Glutathion (oxidierte Form), 10 mM EDTA, 1000 mM Arginin (pH = 9,5) verdünnt und 24 Stunden bei 10°C inkubiert. Danach wurde die Renaturierungslösung dreimal 24 Stunden gegen 10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 10 mM Sucrose (pH = 7,4) dialysiert und die erhaltene Lösung des alpha-nAChR_1-209-Fragments mittels Ultrazentrifugation unter Verwendung von Centriplus-10-Konzentratoren (Amicon) bei 3.000 g und 4°C auf 2-10 mg/ml (80-400 µM) konzentriert. Die Proteinbestimmung wurde unter Verwendung der BCA-Methode (bicinchoninic acid) (Smith et al., 1985) durchgeführt. SDS-PAGE wurde nach Laemmli (1970) durchgeführt.

Sequenz-Analyse

Das alpha-nAChR_1-209-Protein wurde auf Polyvinylidenfluorid-Membranen (PVDF) nach oben beschriebener SDS-PAGE (Matsudeira, 1990) elektrogeblottet, die Schnitt-Membran wurde direkt auf einen Applied Biosystems gepulsten liquid-phase (ABI 477A)-Sequenzer appliziert. Aliquote der bei jedem Zyklus vom Sequenzer abgegebenen Phenylthiohydantoin- Aminosäuren wurden online unter Verwendung des ABI 120A reverse-phase HPLC-Systems (Applied Biosystems) analysiert.

Massenspektroskopie

Peptid-Proben wurden in 5 µl 50% Acetonitril/0,1% TFA (Trifluoressigsäure) gelöst und 5 Minuten sonifiziert (Ultraschall ausgesetzt). Aliquote von 0,5 µl wurden auf eine Target-Disk appliziert und erlaubt, an der Luft zu trocknen. Anschließend wurden 0,3 µl der Matrix- Lösung (1% (Gew./Vol.) alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure in 50% Acetonitril/0,1% TFA (Vol./Vol.) zu einer Probe gegeben und dieser wiederum erlaubt, zu trocknen. Peptid- Spektren wurden erhalten unter Verwendung einer Bruker Biflex time-of-flight Massenspektrometer.

Titration von freien Sulfhydryl-Gruppen

Freie Sulfhydryl-Gruppen in einer 300 µM Lösung des alpha-nAChR_1-209-Proteins wurden in einem spektrophotometrischen Assay unter Verwendung von Ellman's Reagenz (Dithio-bis- nitrobenzoesäure) bestimmt. Die Anwesenheit von freien Sulfhydryl-Gruppen wird durch äquimolare Bildung eines gefärbten Produkts detektiert, das bei 405 nm mit einer Empfindlichkeit von annähernd 1 nM gemessen werden kann.

Radioligand-Studien

Radioliganden-Bindungsstudien wurden unter Verwendung eines DEAE-Filterdisk-Assays (Maelicke et al., 1977; Blanchard et al., 1979) durchgeführt. Im wesentlichen wurden geeignete Konzentrationen vom alpha-nAChR_1-209-Fragment in einem 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 10 mM Sucrose (pH = 7,4) enthaltenden Puffer mit Verdünnungen von N- (propionyl-³H)-alpha-Bungarotoxin 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dieser Zeit wurden Komplexe von Rezeptorfragment und (³H)-alpha-Bungarotoxin auf dem Filter gehalten, während freier Ligand durch zweimaliges Waschen mit 0,1% Triton X 100 entfernt wurde. Aliquote des Waschpuffers wurden zur Bestimmung freier Radioligand- Konzentrationen verwendet, die Filter wurden getrocknet und anschließend in einem Gewebelöser gelöst (Solvable, Packard) bevor diese der Flüssigkeits-Szintillationszählung unterworfen wurden. Vergleichsstudien mit kleinen nikotinischen Liganden wurden bei Konzentrationen von 4 nM von (³H)-alpha-Bungarotoxin beziehungsweise 10 nM alpha- nAChR_1-209-Fragment durchgeführt.

CD-Messungen

CD-Spektren wurden bei 24°C unter Verwendung eines Jasco J-710-Spektropolarimeter gemessen. Die Zellweglänge betrug 0,1 mm. Die Scan-Geschwindigkeit betrug 50 nm/min; die Antwortzeit 4 s und der Bereich 190-250 nm. Optische Aktivität wurde ausgedrückt als Hauptrückstands-Elliptizität Θ in Grad × cm² × dmol^-1, basierend auf einem Hauptrestgewicht von 118. Die Konzentration von alpha-nAChR_1-209-Fragment betrug 40 µM, wobei die Sekundärstruktur unter Verwendung des CONTIN-Programms (Provencher & Glöckner, 1981) berechnet wurde.

Ergebnisse

Nach Induktion durch IPTG exprimierten kompetente E. coli-Bakterien hohe Mengen an Torpedo-alpha-nAChR_1-209-Fragment (10 mg aus 1 l Kultur) in einer aggregierten, denaturierten Konformation, die in wäßrigen Lösungen ohne Verwendung von Detergentien oder organischen Lösungsmitteln vollständig unlöslich ist.

Um die native und funktionale Konformation wiederherzustellen, ist es notwendig, zuerst zu solubilisieren und vollständig das nikotinische Bindungsprotein zu entfalten unter Verwendung chaotroper Reagenzien unter reduzierenden und moderaten alkalischen Bedingungen (6 M Guanidin-HCl und 100 mM Dithiothreitol, pH = 8,5). In einem nächsten Schritt wurde das reduzierte, denaturierte alpha-nAChR_1-209-Fragment durch Dialyse gegen 6 M Guanidin-HCl, 10 mM EDTA erhalten, wobei dadurch Dithiothreitol entfernt und die durch Spuren von Metallionen katalysierte Reoxidation verhindert wurde.

Das Falten (refolding) des denaturierten Proteins und die korrekte Bildung von Disulfid- Bindungen wurde erreicht durch Verdünnung von 100 µl Guanidin/EDTA-solubilisierten nAChR-Fragments in 20 ml eines reduziertes und oxidiertes Glutathion enthaltenden Puffers (GSH, 5 mM; GSSG, 0,5 mM) als "Oxidoshuffling-System" und 1 M L-Arginin als Stabilisierungs-Reagenz (Faltungshilfe) mit anschließender Inkubation in diesem Puffer für 24 Stunden bei 10°C. Die Titration freier Suilhydryl-Gruppen unter Verwendung von Ellmann's Reagenz (Dithio-bis-nitrobenzoesäure) zeigte, daß keine freien Sulfhydryl- Gruppen in einer 40 µM Lösung des gefalteten alpha-nAChR_1-209-Fragments detektierbar sind (Detektionslimit dieser Methode: < 1 nM), d. h., daß die vier vorhandenen Cysteine bei der Bildung von zwei Disulfidbindungen beteiligt sind.

Die letzten Schritte im Renaturierungsprozeß beinhalten die Dialyse von renaturiertem alpha nAChR_1-209-Fragment gegen einen mehr physiologischen Puffer, der 10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 10 mM Sucrose (pH = 7,4) enthält, und gegebenenfalls die Konzentrierung des Proteins mittels Ultrafiltration (bis zu 5-10 mg/ml bzw. 200-400 µM).

Zur Identitätsbestätigung wurde das alpha-nAChR_1-209-Fragment auf PVDF-Membranen elektrogeblottet und anschließend einem automatisierten Edmann-Abbau ausgesetzt. Die einzige Sequenz mit anfänglicher Ausbeute von ungefähr 8 pmol war SEHETRLVANLLENY, was identisch mit den N-terminalen Aminosäuren des nikotinischen Acetylcholin-Rezeptors aus Torpedo ist. Die Molekularmasse des Fragments wurde mittels MALDI-Massenspektroskopie mit 24.896,2 gemessen, das gut mit der berechneten theoretischen Masse von 24.683,3 übereinstimmt.

Isoelektrisches Fokussieren unter Verwendung eines nichtlinearen Gradienten von pH 3 bis 10 deckte einen isoelektrischen Punkt von 5,53 auf, der nahe dem theoretischen Wert von 5,41 ist. Die Absorptionsmessung bei einer Wellenlänge von 280 nm einer 10 µM Lösung des Torpedo alpha-nAChR_1-209-Fragments ergab einen Extinktionskoeffizien von 61.000 +/- 500 cm^-2 m^-1, der in Übereinstimmung mit dem berechneten Wert (59.840 cm²mM^-1) der bekannten Menge an aromatischen Aminosäureresten ist und die Homogenität der Probe anzeigt.

Ein N-(Propionyl-³H)-alpha-Bungarotoxin als Radioligand verwendender DEAE-Filter-Disk- Assay wurde zur Untersuchung der Bindungseigenschaften eines renaturierten Torpedo alpha-nAChR_1-209-Fragments verwendet. Die Dissoziationskonstante dieses Radioliganden betrug 4,0 +/- 0,8 nM. Der Scachard-Plot ist linear, was eine einzelne Bindungsstelle für alpha-Bungarotoxin nahelegt und die Dissoziatonskonstante und die maximale Konzentration an Bindungsstellen (B_max = 3 nM) bestätigt.

Unter Benutzung des oben für Gleichgewichts-Bindungsstudien beschriebenen DEAE-Filter- Tests wurden auch die Kinetiken von Assoziation und Dissoziation von Toxin und Rezeptorfragment untersucht. Die ermittelte Assoziationskinetik war zweiter Ordnung mit einer Konstante k_on = 8,2 × 10⁵ M^-1s^-1, welche derjenigen, die für die Assoziation von Toxin und nativem membrangebundenen Rezeptor gefunden wurde, sehr nahe kommt (Maelicke, A., Fulpius, B. W., Klett, R. P. & Reich, E. (1977) J. Biol. Chem. 252, 4811-4830). Die Dissoziation des Toxin-Fragment-Komplexes wurde nach Zugabe eines 300-fachen Überschusses an nicht-radioaktivem Toxin bestimmt. Die gefundene Dissoziationskinetik ist erster Ordnung mit einer Konstante k_off = 0,4 × 10^-3 min. Der Quotient von k_off und k_on, 0,5 nM, entspricht dem K_D-Wert und ist ein Ausdruck der hohen Affinität des Toxins zum Fragment, welche im selben Bereich liegt wie diejenige des Toxins zum nativen membrangebundenen Rezeptor.

Claims

1. Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Iigandenbindenden, insbesondere extrazellulären, Fragmenten der Untereinheiten von Rezeptoren, insbesondere von Neuro- und Hormonrezeptoren, in isolierter, nativer Form mit folgenden Schritten:

1. Expression der Fragmente,
2. Solubilisierung der Fragmente, insbesondere die in inclusion bodies enthaltenen,
3. Entfernen der für die Solubilisierung notwendigen Denaturierungsmittel,
4. Renaturierung der Fragmente und
5. Entfernen der für die Renaturierung notwendigen Mittel.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Neurorezeptoren aus der Super-Genfamilie der liganden-gesteuerten pentameren Ionenkanäle stammen.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Fragment ein Proteinfragment ist, das aus den Aminosäuren 1-209 der nikotinischen Acetylcholinrezeptor-alpha-Untereinheit von Torpedo marmorata besteht.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die zum Proteinfragment entsprechende Matrize ein cDNA/RNA-Fragment ist, das für die Aminosäuren 1-209 der nikotinischen Acetylcholinrezeptor-alpha-Untereinheit von Torpedo marmorata kodierend ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression in E. coli stattfindet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die bei der Expression verwendeten Primer mit Restriktionsstellen für NdeI und BamHI versehen sind.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Fragmente in einen pET3a-Vektor ligiert werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Transfektion in prokaryotischen Expressionssystemen, insbesondere im E. coli-Stamm BL21(DE3)pLys, durchgeführt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Transfektion in eukaryotischen Expressionssystemen, insbesondere in Hefe-Stämmen, durchgeführt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Solubilisierung chaotrope Reagenzien verwendet werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das chaotrope Reagenz Guanidiniumchlorid und/oder Harnstoff ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die inclusion bodies mit Hilfe von Guanidiniumchlorid, Dithioerythritol und/oder Dithiothreitol und/oder Mercaptoethanol und Ultraschallbehandlung behandelt werden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Renaturierung ein Oxidoshuffiing-System verwendet wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Oxidoshuffling- System Glutathion enthält.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß dem Oxidoshuffling- System Arginin zugesetzt wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß für die Entfernung der für die Solubilisierung notwendigen Denaturierungsmittel und/oder für die Entfernung der für die Renaturierung notwendigen Mittel eine Dialyse durchgeführt wird.

17. Fragmente der Untereinheiten von Rezeptoren, insbesondere von Neuro- und Hormonrezeptoren, hergestellt durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16.

18. Pharmakologisches Screening-Verfahren für Rezeptoren, insbesondere von Neuro- und Hormonrezeptoren, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Verfahren Fragmente nach Anspruch 17 verwendet.

19. Spektroskopisches Strukturuntersuchungsverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Verfahren Fragmente nach Anspruch 17 verwendet.

20. Kristallisationsverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Verfahren Fragmente nach Anspruch 17 verwendet.

21. Verwendung eines Fragmentes nach Anspruch 17 in pharmakologischen Screening- Verfahren.

22. Verwendung eines Fragmentes nach Anspruch 17 in spektrokopischen Strukturuntersuchungsverfahren.

23. Verwendung einer Expression nach einem der Ansprüche 5 bis 9 und/oder einer Solubilisierung nach einem der Ansprüche 10 bis 12 und/oder einer Dialyse nach Anspruch 16 und/oder einer Renaturierung nach einem der Ansprüche 13 bis 15 zur Herstellung von ligandenbindenden, insbesondere extrazellulären, Fragmenten der Unterheiten von Rezeptoren, insbesondere von Neuro- und Hormonrezeptoren, in isolierter, nativer Form.

24. Verwendung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Neurorezeptoren aus der Super-Genfamilie der liganden-gesteuerten pentameren Ionenkanäle stammen.

25. Verwendung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß ein Fragment ein Proteinfragment ist, das aus den Aminosäuren 1-209 der nikotinischen Acetylcholinrezeptor-alpha-Untereinheit von Torpedo marmorata besteht.

26. Verwendung nach Anspruch 25, daß die zum Proteinfragment entsprechende Matrize ein cDNA/RNA-Fragment ist, das für die Aminosäuren 1-209 der nikotinischen Acetylcholinrezeptor-alpha-Untereinheit von Torpedo marmorata kodierend ist.