DE68908203T2

DE68908203T2 - Spaltungsverfahren bei Methioninresten oder Polypeptiden.

Info

Publication number: DE68908203T2
Application number: DE89830050T
Authority: DE
Inventors: Umberto Canosi; Fazio Gabriele De; Stefano Villa
Original assignee: Istituto di Ricerca Cesare Serono SpA
Current assignee: Merck Serono SpA
Priority date: 1988-02-17
Filing date: 1989-02-10
Publication date: 1994-03-10
Anticipated expiration: 2009-02-11
Also published as: DE68908203D1; JPH023696A; IT1219454B; EP0329622A3; US4960868A; EP0329622A2; IL89296A; ES2044214T3; IT8847643A0; ATE92933T1; IL89296A0; EP0329622B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Spaltung von Polypeptiden an ihrem Methioninrest beziehungsweise ihren Methioninresten durch die Verwendung einer Guanidinlösung in Salzsäure zusammen mit Cyanbromid.
Verschiedene pharmakologisch interessierende Peptide, die die Aminosäure Methionin nicht enthalten, beispielsweise Somatostatin (K. Itakura et al., Science 198, 1056-1063, 1977), Insulin (Goeddel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 106, 1979), EGF-Analoga (Sumi et al., J. Biotechnology 2, 59-74, 1985) oder GRF-Analoga (Kempe et al., Bio-Technology 4, 565-568, 1986) wurden durch rekombinante DNA-Techniken aus Mikrobenzellen, beispielsweise Bakterienzellen, hergestellt. Die diese Peptide kodierenden Gene wurden derart in Plasmidvektoren (Träger) kloniert, daß sie Hybridproteine exprimieren. Diese Proteine bestehen aus einer Polypeptidsequenz, bevorzugt bakteriellen Ursprungs, die dem aminoterminalen Anteil entspricht, und dem pharmakologisch interessierenden Peptid, das dem carboxyterminalen Anteil entspricht. Diese zwei Teile werden durch ein Methionin getrennt.
Die Trennung der zwei Reste, die das Hybridprotein bilden, wird durch Reaktion mit Cyanbromid (CNBr) erreicht, einer chemischen Verbindung, die eine Polypeptidkette mit hoher Spezifität auf der Höhe eines Methioninrestes beziehungsweise von Methioninresten spaltet. In der Literatur wird beschrieben, daß die Spaltungsreaktion mit CNBr im allgemeinen in Gegenwart von 70% Ameisensäure durchgeführt wird (Meth. in Enzymol. 11, 238, 1967). 70 %-ige Ameisensäure entspricht ein gut protein-lösendes Mittel. Weiterhin können unter geeigneten Bedingungen ganze E. coli-Zellen durch eine derartige Lösung aufgebrochen werden (Itakura et al., Science 198, 1056, 1977). Dies ist insbesondere vorteilhaft, wenn mit Proteinen gearbeitet wird, die durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt wurden.
Während dieses Verfahren einen bevorzugten Anwendungsbereich bei der Spaltung von Hybridpolypeptiden findet, deren biologisch interessierende Peptidfraktion die Aminosäure Methionin nicht enthält, wird dieses Verfahren auch auf die Spaltung von methioninaminosäuren-enthaltenden Polypeptiden, unabhängig von ihrem Ursprung, angewandt. Beispielsweise ist die Selektivität der Spaltung der Carboxylgruppe von Methionin mit CNBr derart, daß das Verfahren auch bei der Proteinsequenzierung eine breite Anwendung fand.
Es wurde jedoch gefunden, daß ein derartiges Verfahren einige Nachteile aufweist, wenn das bereitzustellende Proteinmolekül inter- und/oder intramolekulare Disulfidbindungen enthält. Ameisensäure weist reduzierende Eigenschaften auf (The Merck Index, 10. Ausgabe, S. 605, 1983), die die Produktionsausbeute von inter- und/oder intramolekulare Disulfidbindungen enthaltenden Peptiden beeinflussen können. Tatsächlich können diese Bindungen während der CNBr-Reaktion in Gegenwart von 70 % Ameisensäure reduziert und während der weiteren Reinigung der Peptide nicht richtig reoxidiert werden, wodurch aspezifische intermolekulare (zwischen zwei Polypeptidketten) und/oder intramolekulare (innerhalb der gleichen Polypeptidkette) Disulfidbindungen entstehen, die im Ausgangsmolekül nicht vorliegen.
Es ist eine erste Aufgabe der Erfindung, ein neues Verfahren zur Spaltung von Polypeptiden am Methioninrest beziehungsweise an den Methioninresten bereitzustellen. Es ist eine zweite Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, welches die Wiedergewinnung der Peptidmoleküle, die durch Spaltung am Met-rest beziehungsweise an den Met-resten durch CNBr freigesetzt wurden, in einer im wesentlichen quantitativen Weise ermöglicht, ohne die Disulfidbindungen zu reduzieren.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Verwendung einer Lösung aus Guanidinhydrochlorid (GdmCl) (oft auch als Guanidiumchlorid bezeichnet) in Gegenwart geeigneter Mengen an Salzsäure als Reaktionsmittel zur Spaltung durch CNBr an den Methioninresten beziehungsweise am Methioninrest eines Polypeptids. Ein derartiges Reaktionsmittel ermöglicht sowohl die Auflösung gereinigter Proteine und das Aufbrechen und Homogenisieren ganzer Zellen, die ein gewünschtes Polypeptid oder ein Zwischenprodukt hiervon exprimieren, wobei in beiden Fällen ermöglicht wird, daß die Spaltungsreaktion am Methionin des Polypeptids durch CNBr stattfindet.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Spaltung rekombinanter heterologer Hybridpolypeptide unter Freisetzung des interressierenden Peptids angewandt werden. Das Verfahren kann auch angewandt werden, um die richtigen Positionen der Disulfidbindungen in den Proteinmolekülen zuzuordnen.
Es wurde erfindungsgemäß gefunden, daß die Lösung aus Guanidinhydrochlorid in Salzsäure keine reduzierende Aktivität besitzt, wenn sie in einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung benutzt wird. Deshalb werden irgendwelche möglichen Disulfidbindungen der Proteine nicht verändert. Weiterhin weist diese Lösung ein Auflösungs- bzw. Aufschlußvermögen auf, das besser ist als 70 % Ameisensäure, wodurch eine signifikante Verringerung der Reaktionsvolumina möglich ist, sowohl wenn ein gereinigtes Protein verwendet wird als auch dann, wenn intakte Mikrobenzellen, zum Beispiel Bakterienzellen, verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen durch rec-DNA hergestellt.
Guanidinhydrochlorid wird bevorzugt in einer Konzentration von 6 M verwendet, wenn auch geringere Konzentrationen im erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar sind. Die Konzentration von Guadininhydrochlorid muß in jedem Fall derart sein, daß sie eine gute Solubilisierung der zu behandelnden Proteine und/oder ganzen Zellen ermöglicht.
Die Molkonzentration der Salzsäure in der Endlösung liegt normalerweise zwischen 0,1 und 1 M. Dieser Bereich steht im Einklang mit den Erfordernissen einer wirksamen Solubilisierung und einer zufriedenstellenden Stabilität der Proteine im Reaktionsmedium. Die Erfindung wird im folgenden unter besonderer Bezugnahme auf die Herstellung von zyklischem Somatostatin aus einem Hybridpolypeptid, bezeichet als TrpE-SS14, erhalten durch die in der europäischen Patentanmeldung EP-A-160 190 beschriebenen Verfahren offenbart. Andere Anwendungsbeispiele, auf die das erfindungsgemäße Verfahren anwendbar ist, sind die Herstellungen des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) durch die Spaltung, mittels CNBr, eines Hybridpolypeptids mit Beta-Galactosidase (J. of Biotechnology 2, 59, 1985); die Herstellung von menschlichem Proinsulin aus einem in E.coli expremierten Vorläufer, beispielsweise entsprechend dem in der europäischen Patentanmeldung EP-A-55 945 beschriebenen Verfahren; weiterhin alle ähnlichen Situationen, in denen das Polypeptid, welches isoliert werden soll, wenigstens einen Methioninrest und bevorzugt inter- und/oder intramolekulare Disulfidbindungen enthält, da diese Bindungen auf Reduktionsmittel empfindlich reagieren.
Vorläufige, mit Somatostatin oder Schweineinsulin durchgeführte Experimente zeigten die reduzierende Wirkung von Ameisensäure. Es wurde dann gefunden, daß durch Ersetzen der Ameisensäure durch in HCl gelöstes Guanidiumchlorid die Spaltung am Methioninrest beziehungsweise an den Methioninresten weiterhin stattfand, während keine Reduktion der Disulfidbindungen stattfand.
Die Analyse des zyklischen Somatostatins wurde durch HPLC- oder durch Radioimmuntestverfahren durchgeführt. In diesem Fall wurden für das zyklische Somatostatin polyklonale Antikörper mit einer erhöhten Spezifität für das zyklische Somatostatin verwendet, die das lineare Molekül nicht erkannten. Die Insulinanalyse wurde mit Hilfe von HPLC durchgeführt.
Die vorläufigen Versuche werden in den Zeichnungen veranschaulicht, wobei:
Figur 1 die folgenden HPLC-Chromatogramme zeigt:
A zyklisches SS14;
B mit 70 % Ameisensäure behandeltes SS14: es wird eine Abnahme des Peaks, der zyklischem SS14 entspricht, beobachtet, und das Auftreten anderer Peaks für lineares SS14 und für verschiedene polymerisierte SS14;
C das aus B resultierende Material, weiterbehandelt mit DTT: das verbleibende zyklische SS14 und die verschiedenen polymerisierten Formen, die aus B resultieren, werden ebenfalls zu linearem SS14 umgewandelt;
D zyklisches SS14, behandelt mit 6 M Guanidin in 0,2 M HCl: das gesamte SS14 verbleibt in der zyklischen Ausgangsform.
Figur 2 zeigt die folgenden HPLC-Chromatogramme:
A a-b-Standardinsulin;
B Mit 70 % Ameisensäure behandeltes a-b-Insulin: es wird eine Abnahme des Peaks beobachtet, der dem a-b-Standardinsulin entspricht; weiterhin treten andere Peaks auf;
C Das aus B resultierende Material wird weiter mit DTT behandelt: das gesamte a-b-Insulin wird in einzelne lineare a- und b-Insulinketten umgewandelt;
D a-b-Standardinsulin, behandelt mit 6 M Guanidiumchlorid, 2 M HCl: das gesamte Insulin bleibt in der komplexen a-b-Form;

Vorläufige Tests

1 100 ug an zyklischem SS14 (synthetisches Somatostatin, Stilamin , Serono) werden mit 1ml 70 % Ameisensäure behandelt. Nach 18stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wird die Lösung durch HPLC analysiert. Es wurde eine 70 %ige Verringerung von SS14 zusammen mit dem Auftreten verschiedener verunreinigender Peaks (Figur 1 A, B) beobachtet. Nach der Lyophilisierung wurde die Mischung mit einem Überschuß an Dithiotreitol (DTT) (einem starken Reduktionsmittel) bei pH 8,5 zwei Stunden lang bei 37ºC behandelt.Es wird ein einzelner Peak (100% der Ausgangsmenge) von linearem Somatostatin (Figur 1 C) erhalten. Dies beweist die Erkenntnis, daß 70% Ameisensäure (obwohl nicht quantitativ) die Disulfidbindung von SS14 unter Bildung einer Mischung aus zyklischem SS14, linearem SS14 und verschiedenen polymerisierten Formen reduziert. Diese Mischung wird, wenn sie mit einem starken Reduktionsmittel wie DTT behandelt wird, quantitativ zu linearem Somatostatin umgewandelt.
In einem ähnlichen Experiment, das unter Verwendung einer Lösung aus 6 M Guanidinhydrochlorid in 0,2 M HCl an Stelle von 70 % Ameisensäure dürchgeführt wurde, wurde nach 18stündiger Inkubation bei Raumtemperatur keine Verringerung des zyklischen Somatostatins in einem HPLC-Test beobachtet (Figur 1 D).
2 100 ug Schweineinsulin werden mit 100 ul 70 % Ameisensäure behandelt. Nach 18stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wird die Lösung durch HPLC analysiert. Eine Verringerung des Insulinpeaks als auch das Auftreten anderer beachtenswerter kontaminierender Peaks werden beobachtet (Figur 2 A, B). Damit beeinflußt Ameisensäure das Schweineinsulin durch teilweise Reduzierung seiner Disulfidbindungen stark. Nach der Lyophilisierung wurde die Mischung mit einem Überschuß an Dithiotreitol (DTT) bei pH 8,5 zwei Stunden lang bei 37 ºC behandelt. Nur zwei Peaks werden erhalten, wobei beide, qualitativ und quantitativ, die zwei einzelnen a- und b-linearen Insulinketten repräsentieren.
In einem ähnlichen Experiment, bei dem an Stelle von 70 % Ameisensäure eine Lösung aus 6 M Guanidinhydrochlorid in 0,1 M HCl verwendet werden, konnte nach 18stündiger Inkubation bei Raumtemperatur keine Verringerung der Konzentration an nativem Insulin durch einen HPLC-Test beobachtet werden (Figur 2 D).
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde sowohl auf das teilweise gereinigte Hybridprotein TrpE-SS14 und auf eine dieses Protein enthaltende bakterielle Zellsuspension angewandt.
Die experimentellen Ergebnisse sind in den nachfolgenden Beispielen angegeben. Beispiel 1 zeigt die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf die Spaltung des teilweise gereinigten TrpE-SS14-Hybridinsulins, wie es beispielsweise durch das in der europäischen Patentanmeldung EP-A-160 190 beschriebenen Verfahren erhalten wurde. Beispiel 2 zeigt die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf die Verarbeitung ganzer E.coli-Zellen, die unter den Bedingungen zur TrpE-SS14-Proteinexpression wuchsen.

Beispiel 1:

A Herstellung des Lysats:

E.coli-Zellen wurden wie in der EP-A-160190 beschrieben zur Expression des TrpE-SS14-Polypeptids gezüchtet. 100 g dieser Zellen wurden in 500 ml 0,2 M Tris-HCl, pH 7,6, 0,2 M NaCl, 0,01 M Magnesiumacetat und 5 % Glycerin resuspendiert und bei 4 ºC durch den Dyno-Mill KDL-Disintegrator (WAB, Schweiz), der Glasmikrokugeln verwendet, zerkleinert.
Nach der Homogenisierung wurde die lysierte Zellsuspension durch ein Stück Gaze filtriert, um die Glasmikrokügelchen und die Zelltrümmer abzutrennen.
Das TrpE-SS14-Protein ist unlöslich und neigt dazu, spontan auszufallen; eine schnellere Ausfällung wird jedoch durch die Zugabe von 10 % Ammoniumsulfat erreicht.
Nach der Zugabe des Salzes wird die Mischung gerührt und in 10 ml Proben für die nächsten Behandlungen aufgeteilt.

B Behandlung durch Ameisensäure/CNBr:

Eine 10 ml Probe wird bei 10 000 g 15 Minuten lang zentrifugiert, und die pelletierten Proteine werden mit 10 ml 70 % Ameisensäure, die 240 mg CNBr enthält, resuspendiert. Die Reaktionsmischung wird anschließend bei 4 ºC 18 Stunden lang inkubiert und anschließend zentrifugiert, um die unlöslichen Bestandteile abzutrennen, und der Überstand wird zur Titration des vorhandenen zyklischen SS14 gesammelt.
Die HPLC-Analyse zeigt das Vorliegen von 14 ug pro ml an zyklischem SS14.

C Behandlung durch Guanidin-HC1/CNBr:

Eine 10 ml Probe wird bei 10 000 g 15 Minuten lang zentrifugiert, und die pelletierten Proteine werden mit 10 ml 6 M Guanidin in 0,2 M HCl, enthaltend 240 mg an CNBr, resuspendiert. Die Reaktionsmischung wird bei 4 ºC 18 Stunden lang inkubiert und anschließend zentrifugiert, um unlösliche Bestandteile zu entfernen, und der Überstand wird zur Titration des vorhandenen zyklischen SS14 gesammelt.
Die HPLC-Analyse zeigt das Vorliegen von 47ug pro ml an zyklischem SS14.
Die oben beschriebenen experimentellen Ergebnisse zeigen, daß der Ersatz von 70 % Ameisensäure durch Guanidin-HCl entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren eine sehr signifikante Zunahme (47/14) an zyklischem SS14, erhalten durch Spaltung an Met mit CNBr, ermöglicht.

Beispiel 2

A 160 mg E.coli-Zellen, erhalten nach Zentrifugation von 10 ml einer Bakterienkultur, die ein TrpE-SS14-Hybridpolypeptid (vergleiche die europäische Patentanmeldung EP-A- 160 190) enthält, werden in 10 ml von 26,6 mg CNBr enthaltender 70 %iger Ameisensäure resuspendiert und eine Minute lang gerührt, um einen guten Aufschluß der Zellen zu erreichen. Nach 18stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wird die Reaktionsmischung zentrifugiert, und der Überstand wird gesammelt, um die Titration des vorhandenen zyklischen SS14 zu ermöglichen. Die durch RIA (Radioimmuntest) durchgeführte Titration zeigt das Vorliegen von 10,8 ug an zyklischem SS14 pro ml Kultur.
B1 160 mg E.coli-Zellen, erhalten nach Zentrifugation von 10 ml einer TrpE-SS14-Hybridpolypeptid (vergleiche EP-A-160 190) enthaltenden Bakterienkultur werden in 10 ml 6 M Guanidin in 1 M HCl resuspendiert. Es werden 26,6 mg CNBr hinzugegeben, die Mischung wird eine Minute lang gerührt, um die Zellen aufzuschließen, und die Reaktionsmischung wird 18 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugation entfernt, und der Gehalt an zyklischem SS14, titriert durch das RIA- Verfahren, beträgt 27,57 ug pro ml Kultur.
B2 160 mg Zellen, erhalten nach Zentrifugation von 10 ml einer ein TrpE-SS14-Hybridpolypeptid (vergleiche EP-A-160 190) enthaltenden Bakterienkultur, werden in 10 ml 6 M Guanidin in 0,2 M HCl resuspendiert. Es werden 26,6 mg CNBr hinzugegeben, die Mischung wird eine Minute lang gerührt, und die Reaktionsmischung wird 18 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach dem Entfernen der Zelltrümmer durch Zentrifugation wird das durch die Reaktion mit CNBr freigesetzte Somatostatin durch das RIA-Verfahren titriert, und es beträgt 24,8 ug pro ml Kultur.
B3 160 mg Zellen, erhalten nach Zentrifugation von 10 ml einer TrpE-SS14-Hybridpolypeptid (vergleiche EP-A-160 190) enthaltenden Bakterienkultur, werden in 5 ml 6M Guanidin in 1 M HCl resuspendiert. Es werden 26,6 mg CNBr zuge-geben, die Mischung wird eine Minute lang gerührt, um die Zellen aufzuschließen und die Mischung wird 18 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugation entfernt, und der Gehalt an zyklischem SS14, titriert durch das RIA- Verfahren, beträgt 26,6 ug pro ml Kultur.
B4 160 mg Zellen, erhalten nach Zentrifugation von 10 ml einer TrpE-SS14-Hybridpolypeptid (vergleiche EP-A-160 190) enthaltenden Bakterienkultur, werden in 5 ml 6M Guanidin in 0,2 M HCl resuspendiert. Es werden 26,6 mg CNBr zugegeben, die Mischung wird eine Minute lang gerührt, um die Zellen aufzuschließen, und die Mischung wird 18 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugation entfernt, und der Gehalt an zyklischem SS14, titriert durch das RIA- Verfahren, beträgt 21,25 ug pro ml Kultur.
Die Ergebnisse des Beispiels 2 sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben, die die Mengen an zyklischem SS14 auflistet, die durch Reaktion mit CNBr in Gegenwart von entweder 70 % Ameisensäure oder verschiedener Lösungen aus Guanidin + HCl freigesetzt wurden. Tabelle Wirkung von Ameisensäure und Guanidinhydrochlorid auf die Gewinnung von zyklischem Somatostatin Zelllysismischung Reaktionsvolumen (ml) Zyklisches SS14 (ug/ml)* 70% Ameisensäure Guanidin
* Die Konzentrationen beziehen sich auf 1 ml Kultur.
Die Analyse der oben angegebenen Ergebnisse zeigt, daß gemäß dem erfindungsgemäßen Erfahren eine Wiedergewinnung an zyklischem SS14 erreicht wird, die signifikant höher ist als die, die durch ein herkömmliches Verfahren unter Verwendung von 70 % Ameisensäure erreichbar ist. Weiterhin bleibt die Zunahme der Ausbeute an zyklischem SS14 sogar dann signifikant, wenn das Volumen des Reaktionslösungsmittels halbiert wird oder wenn die Konzentration der Salzsäure, in der das Guanidin aufgelöst wurde, verringert wird.

Claims

1. Verfahren zum Spalten eines Polypeptids an einem Methioninrest bzw. an Methioninresten durch Reaktion mit Cyanbromid, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung von Guanidiumchlorid in Salzsäure als Reaktionsmedium verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid ein heterologes Hybridpolypeptid ist und die Spaltung in der Freisetzung des gewünschten Polypeptids resultiert.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das Polypeptid inter- und/oder intra-molekulare Disulfidbrücken enthält.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion an ganzen Zellen ausgeführt wird, die das Polypeptid exprimieren.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsmedium 6 M Guanidin, gelöst in Salzsäure mit einer Konzentration von zwischen 0,1 und 1 M ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid die Aminosäuresequenz von Somatostatin enthält.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid die Aminosäuresequenz von Proinsulin enthält.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid die Aminosäuresequenz des epidermalen Wachstumsfaktors enthält.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion an ganzen E.coli-Zellen ausgeführt wird, die das Polypeptid exprimieren.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die E.coli-Zellen durch rec-DNA-Techniken hergestellt werden.