HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Erfindungsgebiet
-
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum
Solubilisieren, Reinigen und Falten (refolding) eines
Fusionsproteins, das aus menschlichem Nervenwachstumsfaktor und
einem Teil menschlichen Wachstumshormons besteht.
Beschreibung des Standes der Technik
-
Durch die Methode der Genmanipulation ist es möglich, für
Wirtszellen heterogenes Protein herzustellen, indem in die
Wirtszellen Gene eingebracht werden, die für das Protein
kodieren. Die so hergestellten heterogenen Proteine nehmen
oftmals eine Struktur höherer Ordnung an, welche die
Expression ihrer eigenen physiologischen Aktivität inhibiert, und
sie verbleiben in Form von unlöslichen Agglomeraten in den
Wirtszellen. Diese unlöslichen heterogenen Proteine
erfordern für ihre wirksame Verwendung unausweichlich eine Reihe
von Behandlungen, zu denen die Solubilisierung, Reinigung
und Faltung gehören.
-
Die Reihe von Behandlungen zum Solubilisieren und Falten von
in den Wirtszellen hergestelltem unlöslichen heterogenen
Protein kann auf bekannte Weise durchgeführt werden, wobei
z.B. das unlösliche heterogene Protein zur Solubilisierung
in einer Lösung eines starken Proteindenaturierungsmittels,
wie einer 4-9 M Guanidinhydrochloridlösung, behandelt und
dann durch Verringern der Konzentration des
Proteindenaturierungsmittels gefaltet wird. Bei diesem Verfahren liegt
jedoch das Problem in der Handhabung einer großen Menge von
Materialien, da die Dialyse oder Verdünnung der Lösung
erforderlich ist, um die Konzentration des
Proteindenaturierungsmittels zu verringern. Wenn eine Verbindung wie
Guanidinhydrochlorid verwendet wird, tritt ein zusätzliches
Problem bei der Behandlung der erzeugten Abfallflüssigkeit auf.
Guanidinhydrochlorid kann nicht durch ein gewöhnliches
Verfahren zur Abfallflüssigkeitsentsorgung, wie etwa das
Belebtschlammverfahren, beseitigt werden.
-
In "Protein Purification: Micro to Macro", Seite 279-305
(1987), ist offenbart, daß die Wirkungen von denaturierenden
Mitteln oftmals additiv oder synergistisch sind. Ein
Beispiel dafür ist die Beobachtung, daß der pH, bei dem ein
Protein denaturiert, bei Zugabe von chaotropen Mitteln
herabgesetzt wird.
-
Ein weiteres Verfahren zur Faltung ist bekannt, worin
unlösliches heterogenes Protein zur Solubilisierung in einer
Alkalilösung behandelt und durch anschließendes Herabsetzen
des pH-Werts der Lösung gefaltet wird. In diesem Verfahren
wird im Vergleich zu dem vorhergehenden Verfahren eine
einfachere und leichtere Methode zum Handhaben einer großen
Menge von Materialien bereitgestellt, da die Herabsetzung
des pH-Werts durch Zugabe einer sauren Substanz erreicht
werden kann.
-
Das Problem bei diesem Verfahren ist jedoch, daß die
Solubilisierungsrate von unlöslichem heterogenen Protein zu
niedrigen Werten tendiert, da die Alkali lösung schwerlich mit
dem Inneren der Agglomerate des unlöslichen heterogenen
Proteins in Berührung gebracht wird. Eine niedrige
Solubilisierungsrate ist nicht bevorzugt, da sie zu einer niedrigeren
Ausbeute führt.
-
Gemäß "Protein Purification: Micro to Macro", Seiten 429-442
(1987), ist die Konzentration des Proteins von besonderer
Bedeutung, da die optimale Konzentration niedrig liegen kann
(1 mg/ml oder weniger), wobei höhere Konzentrationen die
Aggregation oder Ausfällung begünstigen.
-
Es ist bekannt, daß Protein eine Primär-, Sekundär-,
Tertiär- und manchmal Quartärstruktur annimmt. Die
Primärstrukturen sind aus etwa 20 Arten von Aminosäuren
zusammengesetzt und bisher sind mehr als 200 verschiedene
Primärstrukturen festgestellt worden. Die Sekundär- und
Tertiärstrukturen, sogenannte Strukturen höherer Ordnung, werden
durch die intramolekulare Verknüpfung zwischen Aminosäuren
in der Primärstruktur von Proteinen hervorgerufen. Es sind
gegenwärtig mehr als 100 Arten von Tertiärstrukturen
bekannt, die mit Hilfe der Röntgenbeugung zur
Kristallstrukturanalyse festgestellt wurden. Außerdem lehrt die neuere
Methode der Genmanipulation, daß selbst diejenigen
heterogenen Proteine, welche in Wirtszellen schwierig herzustellen
sind, in fusionierter Form mit einem weiteren Protein,
welches leicht herzustellen geht, hergestellt werden können.
Bei dieser Methode werden zwei oder mehrere Arten von
Protein in fusionierter Form über eine Aminosäuresequenz, wie
Thrombin, Faktor Xa und Trypsin, kombiniert hergestellt,
welche durch ein willkürlich gewähltes Enzym spezifisch
abgebaut wird, und das Produkt wird später mit diesem Enzym
behandelt, um ein angestrebtes Protein herzustellen.
-
Für die so durch die Methode der Genmanipulation
hergestellten Proteine oder fusionierten Proteine mit vielen
verschiedenen Strukturen gibt es vermutlich ein Optimum der
Bedingungen für die Behandlungsschritte, wie die Solubilisierung,
Reinigung und Faltung usw. Zum Beispiel kann ein unlösliches
fusioniertes heterogenes Protein, das aus menschlichem
Nervenwachstumsfaktor (im folgenden als NGF bezeichnet) und
einem Teil menschlichen Wachstumshormons (im folgenden als hGH
bezeichnet), welche beide von Escherichia coli hergestellt
werden, besteht, durch Behandeln mit einer Alkalilösung
solubilisiert werden, aber es ergibt einen Niederschlag,
wenn der pH für die Faltungsbehandlung herabgesetzt wird,
was zu einer merklichen Verringerung der Ausbeute führt.
-
Es ist den Erfindern der vorliegenden Erfindung gelungen,
die Probleme des Standes der Technik durch ausführliche und
fortgesetzte Untersuchungen des Verfahrens der
Behandlungsschritte, wie der Solubilisierung, Reinigung und Faltung von
unlöslichem fusionierten heterogenen Protein, welches bisher
unbekannt war, zu lösen und so haben sie schließlich diese
Erfindung zustandegebracht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Die vorliegende Erfindung soll ein Verfahren zum
Solubilisieren, Reinigen und Falten eines Fusionsproteins
bereitstellen, das aus menschlichem Nervenwachstumsfaktor und
einem Teil menschlichen Wachstumshormons besteht, umfassend
die folgenden Schritte:
-
a) das Inkontaktbringen des Fusionsproteins mit einer
wäßrigen Säurelösung umfassend 7 M Harnstoff,
-
b) das Einstellen des pH-Werts auf 10 bis 13 durch Zufügen
einer alkalischen Substanz und Erniedrigen der
Harnstoffkonzentration auf ungefähr 3,5 M und
-
c) das Erniedrigen des pH-Werts.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
-
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden ausführlicher
beschrieben.
-
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt drei Schritte,
entsprechend der Solubilisierung, Reinigung und Faltung des
Proteins.
(1) Die Solubilisierungsbehandlung des unlöslichen
fusionierten heterogenen Proteins
-
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit,
bei dem Bruchstücke von Bakterien, die unlösliches
fusioniertes heterogenes Protein enthalten, welche
durch Aufbrechen von Wirtszellen, z.B. durch
Homogenisieren oder Ultraschall, hergestellt wurden, oder
Konzentrate der Bakterienbruchstücke, die aus den obigen
Bakterienbruchstücken durch Zentrifugation,
Ultrafiltration oder Gelfiltration hergestellt wurden, mit
einer wäßrigen Säure lösung in Gegenwart eines schwachen
Denaturierungsmittels für Protein in Kontakt gebracht
werden, um das gewünschte Fusionsprotein zu
solubilisieren.
-
Das fusionierte Protein ist das Zielprotein, welches am
stromaufwärts gelegenen Ende des N-Terminus mit dem
ganzen oder einem Teil eines allogenen oder heterogenen
Proteins kombiniert ist, welches von den verwendeten
Wirtszellen leicht hergestellt werden kann. Gemäß der
vorliegenden Erfindung ist das fusionierte Protein aus
NGF und hGH zusammengesetzt.
-
Zu Proteindenaturierungsmitteln gehören im allgemeinen
bekannte Denaturierungsmittel, wie z.B.
Guanidinhydrochlorid, Harnstoff, oberflächenaktive Mittel und
Thiocyansäuresalze. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist
Harnstoff am meisten bevorzugt, da er den geringsten
Einfluß auf den lebenden Organismus hat und leicht
beseitigt werden kann. Die Konzentration des
Proteindenaturierungsmittels kann diejenige sein, bei der ein
unlösliches fusioniertes heterogenes Protein leicht in
der Lösung dispergiert wird. Die Konzentration, welche
für die Dispergierung erforderlich ist, kann in
geeigneter Weise bestimmt werden, wobei hauptsächlich die
Natur des Denaturierungsmittels in Betracht zu ziehen
ist. Wenn Harnstoff als Denaturierungsmittel verwendet
wird, muß berücksichtigt werden, daß Protein im
allgemeinen durch Harnstoff bei einer Konzentration von
mehr als 2 M denaturiert wird und daß Agglomerate von
unlöslichem fusionierten heterogenen Protein bei einer
Harnstoffkonzentration dispergiert werden können, die
niedriger ist als die, bei der das Protein denaturiert
wird.
-
Proteindenaturierungsmittel können entweder in Form
einer Lösung in einer wäßrigen Säure lösung oder zusammen
mit dem fusionierten Protein vorliegen, bevor eine
wäßrige Säurelösung in Kontakt mit den Agglomeraten des
unlöslichen fusionierten Proteins gebracht wird.
Letzteres erscheint besser, da eine geringere Menge des
Proteindenaturierungsmittels ausreichend sein kann. In
dieser Erfindung erleichtert es das Dispergieren eines
unlöslichen fusionierten heterogenen Proteins mit einem
Proteindenaturierungsmittel einer wäßrigen Säurelösung,
in die Tiefe der Agglomerate des fusionierten Proteins
einzudringen, um die Solubilisierungsrate zu
verbessern. Während der Dispergier- und
Solubilisierungsschritte kann das gesamte Gemisch zusätzlich in
Bewegung gehalten werden.
-
Die wäßrigen Säurelösungen können wäßrige Lösungen von
geläufigen sauren Substanzen sein, zu denen z.B.
anorganische Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure,
Thiocyansäure, Iodwasserstoffsäure und Bromwasserstoffsäure,
und organische Säuren, wie Essigsäure, gehören. Unter
diesen sind jedoch wäßrige Lösungen von organischen
Säuren wie Essigsäure bevorzugt, da organische Säuren
fusioniertes heterogenes Protein wirksamer
denaturieren. Die Konzentration der sauren Substanzen kann
diejenige sein, bei deren PH der wäßrigen Lösung das
angestrebte fusionierte heterogene Protein reversibel durch
Säure denaturiert wird. Zum Beispiel sollte für das
fusionierte Protein, das aus NGF und hGH
zusammengesetzt ist, ein pH von 2-5, vorzugsweise 3-4, mittels
einer sauren Substanz herbeigeführt werden.
(2) Die Reinigungsbehandlung des unlöslichen fusionierten
heterogenen Proteins
-
Der Schritt der Reinigung von unlöslichem fusionierten
heterogenen Protein gemäß der vorliegenden Erfindung
umfaßt das Erhöhen des pH-Werts der Säurelösung, welche
das solubilisierte fusionierte heterogene Protein
enthält, durch Zugabe einer Alkalisubstanz.
-
Zu den eingesetzten Alkalisubstanzen können z.B.
Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat,
Ammoniak, Alkylamine und dergleichen ohne jede
Einschränkung gehören
-
Der pH sollte auf einen Wert, bei dem das fusionierte
heterogene Protein reversibel durch Alkali denaturiert
wird, und deshalb vorzugsweise auf einen möglichst
hohen pH-Wert angehoben werden. Bei einem hohen pH-Wert
können mehr Verunreinigungen, die nicht das fusionierte
heterogene Protein sind, ausfallen, was zu einer
verbesserten Reinigung führt und gleichzeitig kann die
Rate des in einer wäßrigen Alkalilösung solubilisierten
Proteins verbessert werden. Im Falle eines fusionierten
Proteins, das aus NGF und hGH zusammengesetzt ist,
sollte der pH z.B. auf 10-13 angehoben werden.
-
Verunreinigungen, die bei hohem pH ausfallen, können in
jeder gebräuchlichen Weise entfernt werden, wie etwa
durch Zentrifugation, Ultrafiltration, Gelfiltration
und dergleichen.
(3) Die Faltungsbehandlung des unlöslichen fusionierten
heterogenen Proteins
-
Die Faltungsbehandlung von unlöslichem fusionierten
heterogenen Protein gemäß der vorliegenden Erfindung
besteht darin, den pH einer wäßrigen Alkalilösung,
welche darin gelöstes fusioniertes heterogenes Protein
enthält, zu erniedrigen, um das Protein wieder in eine
Form zu falten, welche physiologische Aktivität
aufweisen kann.
-
Wenn eine hohe Konzentration eines
Proteindenaturierungsmittels bei der Solubilisierungsbehandlung verwendet wird, ist
jedoch eine zusätzliche Behandlung zur Erniedrigung der
Konzentration des Denaturierungsmittels eventuell auch für den
enzymatischen Abbau des fusionierten Proteins erforderlich.
Deshalb ist es bei der Solubilisierungsbehandlung zur
Faltung bevorzugt, zum Dispergieren von Agglomeraten von
unlöslichem fusionierten heterogenen Protein entweder ein
Proteindenaturierungsmittel in einer Konzentration zu
verwenden, bei der das Protein nicht denaturiert wird, oder
alternativ dazu ein Denaturierungsmittel in einer hohen
Konzentration zu verwenden, von der erwartet wird, daß sie auf
einen Wert erniedrigt wird, der nicht ausreichend ist, um
das Protein zu denaturieren, wenn die Lösung mit einer
wäßrigen Säurelösung vermischt wird. Wenn eine hohe
Konzentration eines Proteindenaturierungsmittels verwendet wird
und die daraus hervorgehende Lösung nach der
Faltungsbehandlung das Denaturierungsmittel in einer Konzentration
enthält, die hoch genug ist, um das fusionierte Protein zu
denaturieren, kann die Konzentration, falls dies
erforderlich ist, durch Dialyse oder Verdünnung erniedrigt werden.
So ist die Verwendung eines Proteindenaturierungsmittels bei
der Solubilisierungsbehandlung vorteilhaft, um eine höhere
Solubilisierungsrate von unlöslichem fusionierten
heterogenen Protein zu erhalten und folglich die endgültige Ausbeute
an Protein zu verbessern.
-
Wie oben erwähnt worden ist, wird ein fusioniertes
heterogenes Protein zuerst in einer wäßrigen Säurelösung
solubilisiert und anschließend wird der pH der Lösung erhöht, wie es
in der Behandlung (2) oben erläutert ist.
-
Als Alkali können allgemein bekannte Alkalisubstanzen, wie
sie oben bei der Reinigungsbehandlung beschrieben wurden,
eingesetzt werden. Aber organische Basen wie Ammoniak oder
Triethylamin sind bevorzugt, da sie eine höhere Rate der
Faltung versprechen, als dies bei anderen Alkalisubstanzen
der Fall ist. Zusätzlich kann eine höhere Rate der Faltung
erwartet werden, wenn eine wäßrige Lösung von mindestens
einer organischen Base eingesetzt wird, welche ausgewählt wird
aus der Gruppe bestehend aus Monoethanolamin,
Diethylentriamin, Triethylentetramin und Tetraethylenpentamin. Der
Grund, weshalb eine wäßrige Lösung einer organischen Phase
eine hohe Rate der Faltung von fusioniertem heterogenen
Protein bewirkt, ist nicht klar. Ferner führen von den
organischen Basen Monoethanolamin, Diethylentriamin,
Triethylentetramin und Tetraethylenpentamin zu einer Faltung mit einer
höheren Rate. Der Grund dafür ist ebenfalls nicht klar, aber
vermutlich trägt die geradkettige Struktur dieser
Verbindungen dazu bei.
-
Wie für Behandlung (2) erläutert worden ist, sollte der pH
in einen Bereich angehoben werden, in dem das fusionierte
Protein reversibel durch Alkali denaturiert wird. Für ein
fusioniertes Protein, das aus NGF und hGH zusammengesetzt
ist, ist ein pH von weniger als 10 nicht ausreichend zur
Denaturierung in einer alkalischen Lösung und ein pH größer
als 13 kann zu einer irreversiblen Denaturierung führen.
Deshalb ist ein pH im Bereich 10-13 vorzuziehen. Ein pH im
Bereich 11-12 ist mehr bevorzugt, um eine höhere Rate der
Faltung zu erhalten. Vermutlich liegt dies daran, daß der pH
die Faltung sowie die Solubilisierung in einem alkalischen
Medium sehr fein beeinflußt.
-
Durch die oben beschriebenen Arbeitsschritte kann eine
alkalische Lösung erhalten werden, welche das fusionierte
heterogene Protein stabil darin gelöst enthält. Das fusionierte
heterogene Protein, das aus NGF und hGH zusammengesetzt ist,
kann, wenn es nur mit einer wäßrigen alkalische Lösung
solubilisiert
ist, ausgefällt werden, wenn der pH der Lösung zur
Faltung erniedrigt wird, aber durch die oben beschriebenen
Arbeitsschritte bleibt es in der Lösung, ohne ausgefällt zu
werden, und außerdem können Verunreinigungen entfernt
werden. Die Entfernung von Verunreinigungen kann auf der Stufe
durchgeführt werden, bei der der pH erhöht ist, wie in (2)
erläutert ist.
-
Die Erniedrigung des pH-Werts kann durch Dialyse und
dergleichen ausgeführt werden, aber unter dem Gesichtspunkt der
Leichtigkeit der Durchführung ist es mehr bevorzugt,
entweder eine anorganische Säure, wie Chlorwasserstoffsäure und
Schwefelsäure, oder eine organische Säure, wie Essigsäure
und Glycin, zuzugeben. Wie oben festgestellt wurde, ist
jedoch die Dialyse der Lösung insbesondere dann brauchbar,
wenn die Lösung nach der Faltung immer noch ein
Denaturierungsmittel in einer Konzentration enthält, die hoch genug
ist, um ein fusioniertes heterogenes Protein zu
denaturieren, und deshalb die Erniedrigung der Konzentration
erforderlich ist. Die Dialyse erreicht gleichzeitig die
Verringerung sowohl des pH-Werts als auch der Konzentration des
Denaturierungsmittels. Der pH sollte auf einen niedrigeren
Wert im Vergleich zu dem einer alkalischen Lösung
eingestellt werden. Der bevorzugte Bereich ist 7-9, aber mehr
bevorzugt 7-8, im Bereich von neutral bis schwach alkalisch.
In diesem Bereich von neutral bis schwach alkalisch können
die fusionierten heterogenen Proteine existieren und stabil
bleiben.
-
Vor der Erniedrigung des pH-Werts der alkalischen Lösung
wird die Zugabe einer Sulfhydrylverbindung wie Glutathion in
der reduzierten Form, Cystein, 2-Mercaptoethanol,
Dithiothreitol, Schwefelwasserstoff und dergleichen empfohlen, um
zu verhindern, daß in dem fusionierten heterogenen Protein
Disulfidbindungen ausgebildet werden, und folglich die Rate
der Faltung zu verbessern.
-
Der Schritt der Solubilisierungsbehandlung dieser Erfindung
erlaubt es, unlösliches fusioniertes heterogenes Protein in
einfachen und leichten Arbeitsgängen zu solubilisieren. Auch
der Schritt der Reinigungsbehandlung dieser Erfindung macht
es durch einen einfachen und leichten Arbeitsgang der Zugabe
einer Alkalisubstanz möglich, Verunreinigungen zu entfernen,
welche in der Säurelösung enthalten sind, die das
fusionierte heterogene Protein enthält, welche durch die
Solubilisierungsbehandlung dieser Erfindung erhalten worden ist.
Ferner wird bei der Faltungsbehandlung dieser Erfindung der
pH der alkalischen Lösung, die das fusionierte heterogene
Protein enthält, welche durch die Solubilisierungs- und
Reinigungsbehandlungen erhalten worden ist, erniedrigt, um das
angestrebte heterogene Protein in der Form zu erhalten, in
welcher die Aktivität vorhanden ist. Der Behandlungsschritt
gemäß der vorliegenden Erfindung eignet sich dazu, rasch und
bequem auch eine solche große Menge von fusioniertem
heterogenen Protein zu behandeln, wie sie durch die früheren
Verfahren nicht behandelt werden konnte. Insbesondere wenn
Harnstoff als Proteindenaturierungsmittel verwendet wird,
können Abfallflüssigkeiten in einem einfachen Arbeitsgang
entsorgt werden.
Ausführliche Beschreibung des erfindungsgemäßen Verfahrens
-
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgende
Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen besser verständlich.
-
Im folgenden ist ein Beispiel angegeben, welches sich auf
ein fusioniertes heterogenes Protein bezieht, das aus NGF
und hGH zusammengesetzt ist, welches von Escherichia coli
hergestellt wird, um die vorliegende Erfindung ausführlicher
zu erläutern, aber der Umfang dieser Erfindung ist nicht auf
das Beispiel beschränkt.
-
Das fusionierte heterogene Protein, das aus NGF und hGH
zusammengesetzt ist ( im folgenden als NGF-hGH bezeichnet),
welches in den folgenden Beispielen vorkommt, hat ein
Molekulargewicht von etwa 30.000 Dalton. Die stromaufwärts
gelegene Region (N-terminale Seite) ist ein Teil von hGH,
zusammengesetzt aus 140 Aminosäuren, und in der stromabwärts
gelegenen Region liegt NGF, welcher aus 118 Aminosäuren
zusammengesetzt ist. Da diese beiden Teile nach der Faltung
getrennt werden, sind sie über eine spezifische
Erkennungssequenz von Aminosäuren (Ile-Glu-Gly-Arg) verknüpft. Dieses
NGF-hGH wurde von Escherichia coli als Wirtszellen gemäß dem
Verfahren, wie es in der japanischen
Patentoffenlegungsschrift Sho 61-205485 offenbart ist, hergestellt.
BEISPIEL 1
-
Nach der Kultur von Wirtszellen wurden 10 g Bakterienmasse
in 100 ml einer 20 mM
Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH = 8), welche 5% Glycerin und 2 mM EDTA enthielt,
suspendiert. Die Bakterienmasse wurde in einem
Ultraschallzellmischer aufgebrochen und zentrifugiert. Das NGF-hGH
wurde in Form eines Niederschlags von 8 g zusammen mit
unlöslichen Fragmenten der Bakterienmasse erhalten. Dieser
Niederschlag wurde in 200 ml einer 0,1 M wäßrigen
Essigsäurelösung (pH = 4), welche 7 M Harnstoff enthielt,
suspendiert. Anschließend wurde eine Solubilisierungsbehandlung
durchgeführt und ein Teil des Niederschlags mit Ausnahme der
Fragmente der Bakterienmasse und dergleichen wurde
solubilisiert.
BEISPIEL 2
-
Zu der wäßrigen Essigsäurelösung, welche das NGF-hGH
enthielt, das in Beispiel 1 solubilisiert wurde, wurden 200 ml
10 Vol.-%iges Monoethanolamin zugegeben und der pH wurde auf
12 eingestellt. In der so hergestellten alkalischen Lösung
wurde Protein ausgefällt. Der gebildete Niederschlag wurde
durch Zentrifugation zusammen mit den Verunreinigungen, die
nicht in Beispiel 1 solubilisiert wurden, entfernt.
BEISPIEL 3
-
400 ml einer Alkalilösung, die NGF-hGH enthielt, welches in
Beispiel 2 enthalten wurde, wurden gegen 10 1 einer 0,15 M
Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH = 8,5)
dialysiert, um gleichzeitig die Konzentration von Harnstoff und
den pH auf 8,5 zu erniedrigen. Es wurde keine Ausfällung von
Protein auf dieser Stufe der Dialyse beobachtet. Nach der
Dialyse wurde eine Lösung von rohem Protein, welche 500 mg
NGF-hGH enthielt, erhalten. Zu einer Lösung, die 1 mg
Rohextrakt des erhaltenen NGF-hGH enthielt, wurden 10 ug Faktor
Xa (hergestellt von Sigma Co.) zugegeben und das Gemisch
wurde bei 37ºC eine Stunde lang behandelt.
-
Die Lösung wurde nach der Behandlung einer Elektrophorese
auf SDS-Polyacrylamid unterzogen, um die
Proteinzusammensetzung zu analysieren. Es wurde bestätigt, daß hGH mit
einem Molekulargewicht von etwa 15000 Dalton und NGF mit
einem Molekulargewicht von etwa 14000 Dalton vorhanden
waren. Aber die Anwesenheit von nichtabgebautem NGF-hGH
wurde nicht bestätigt, was auf eine ungenügende Faltung oder
eine hohe Konzentration eines Proteindenaturierungsmittels,
welches in der Lösung zurückblieb, zurückzuführen sein kann.
-
Die Lösung von rohem NGF, enthaltend NGF, welche wie oben
erwähnt erhalten wurde, wurde zu einer Kulturlösung von
Ratten-Pheochromocytoma PC12-Zellen zugegeben und es wurde die
Aktivität des NGF untersucht. Das Ergebnis war, daß die
Aktivität, die beobachtet wurde, wenn die NGF-Lösung zu dem
Kulturmedium zugegeben wurde, so daß eine
Proteinkonzentration von 1 ug/ml erhalten wurde, in der gleichen
Größenordnung lag, wie die, die beobachtet werden konnte, wenn ein
Kontroll-Maus-NGF (hergestellt von Sigma Co., 2,5 NGF)
zugegeben wurde, so daß sich 100 ng/ml ergaben. Diese Tatsache
bestätigte, daß der NGF in der resultierenden Lösung bis zu
dem Zustand gefaltet war, in dem der NGF die physiologische
Aktivität aufweisen konnte.
-
Mittlerweile wurde die Menge an Protein in Lösung durch die
Extinktion bei 280 nm in diesem und auch den nachfolgenden
Beispielen bestimmt.
BEISPIEL 4
-
Unter Befolgung der gleichen Arbeitsvorschrift wie in
Beispiel 1 wurden 10 g eines Niederschlags, der NGF-hGH aus
Wirtszellen enthielt, erhalten. Dieser Niederschlag wurde in
200 ml einer 0,1 M wäßrigen Essigsäurelösung (pH = 4),
welche 3,5 M Harnstoff enthielt, suspendiert und eine
Solubilisierungsbehandlung wurde durchgeführt. Dann wurden 200 ml
von 10 Vol.-%igem Monoethanolamin zugegeben und, nachdem der
pH auf 12 eingestellt worden war, wurde das gesamte Gemisch
zentrifugiert, um den abgeschiedenen Niederschlag zu
entfernen. Glutathion in der reduzierten Form wurde bis zu einer
Konzentration von 1 mM zugegeben, die Lösung wurde 90
Minuten lang in Bewegung gehalten und der pH der Lösung wurde
durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf 8,5 eingestellt.
So wurde eine Lösung erhalten, in welcher der NGF bis zu dem
Zustand gefaltet war, in dem die physiologische Aktivität
vorhanden war. Diese Lösung enthielt 450 mg Protein. Die
Aktivität von NGF wurde in der gleichen Weise wie in
Beispiel 3 bestätigt.
VERGLEICHSBEISPIEL 1
-
8 g des Niederschlags, der aus Wirtszellen in der gleichen
Weise wie in Beispiel 1 erhalten worden war, wurden
solubilisiert, wobei 200 ml einer Essigsäurelösung (pH = 4),
welche 3,5 M Harnstoff enthielt, verwendet wurden, und gegen
10 1 einer 0,15 M Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung
(pH = 8,5) ohne Zugabe einer Alkalisubstanz dialysiert. Der
größte Teil des in der Lösung gelösten Proteins fiel als
Niederschlag aus. 50 mg des Niederschlags wurden durch
Zentrifugation abgetrennt und in der Dialyselösung
suspendiert.
Es wurde versucht, NGF und hGH abzubauen, wobei
der Faktor Xa verwendet wurde, was sich aber als vergeblich
erwies. Die Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamid zeigte, daß
der größte Teil des NGF-hGH unverdaut blieb. Die
Untersuchung dieser Proteinlösung auf eine Aktivität von NGF
ergab ein negatives Ergebnis. Somit wurde keine Aktivität
des NGF bestätigt.
VERGLEICHSBEISPIEL 2
-
8 g eines Niederschlags, der aus Wirtszellen in einer
ähnlichen Weise wie in Beispiel 1 erhalten worden war, wurden mit
200 ml einer 10 Vol.-%igen Lösung von Monoethanolamin
(pH = 12), die 3,5 M Harnstoff enthielt, solubilisiert.
Diese Lösung wurde gegen 10 1 einer 0,15 M
Tris-Chlorwasserstoffsäure-Lösung (pH = 8,5) dialysiert. Dann wurde der
größte Teil des in der Lösung gelösten Proteins als
Niederschlag ausgefällt. Der Niederschlag wurde in ähnlicher Weise
wie in Vergleichsbeispiel 1 behandelt, aber ergab nur NGF
ohne Aktivität.