DE3685562T2

DE3685562T2 - Solubilisierung von protein-aggregaten.

Info

Publication number: DE3685562T2
Application number: DE8686309603T
Authority: DE
Inventors: Malcolm Roy Brandon; Joseph John Patroni
Original assignee: Fidelity Food Tech
Current assignee: Nantinco Nv Willensted Curacao An
Priority date: 1985-12-11
Filing date: 1986-12-10
Publication date: 1992-12-24
Anticipated expiration: 2006-12-11
Also published as: JPH0660198B2; EP0226448A2; AU6687486A; ES2032194T3; ATE76878T1; NO864990L; DE3685562D1; JPS62223192A; AU597924B2; NZ218586A; EP0226448B1; GR3004903T3; US4797474A; MY101204A; CN86108729A; NO864990D0; DK592186D0; DK171331B1; DK592186A; CA1281849C

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Proteinsolubilisierung in Proteinreinigungsverfahren.
Die Technologie der rekombinanten DNA eröffnet potentiell sehr wertvolle Möglichkeiten, große Mengen eines gewünschten Eukaryontenproteins (normalerweise vom Säugetier) wie z.B. Hormone, Interferone und Enzyme zu synthetisieren. Obwohl es sich als relativ einfach erwiesen hat, Organismen, wie z.B. Bakterien, zu manipulieren, um das gewünschte Protein zu synthetisieren, scheidet der Wirtsorganismus das Proteinprodukt normalerweise nicht in das Kulturmedium ab. Daher ist im allgmeinen die Lyse der Organismen (z.B. der Bakterien), gefolgt von der Isolierung des gewünschten Proteins,notwendig.
Mit einigen Ausnahmen liegen Eukaryontenproteine, die in hohen Mengen in Escherichia coli (E. coli) exprimiert werden, in der Wirtszelle in Form von unlöslichen Proteinaggregaten vor (Marston, F.A.O., Lowe, P.A., Doel, M.T. Schoemaker, J.M., White, S., und Angal S., Bio/Technology,2(9), 1984, 729). Z.B. liegt Humaninsulin, das von E. coli produziert wird, in den Bakerienzellen als morphologisch charakteristische Einschlußkörper (inclusion bodies) vor. (Williams, D.C., Van Frank, R.M., Muth, W.L., und Burnett, J.P., Science 215, 1982, 687). Diese Einschlußkörper können einen großen Anteil des Zellvolumens einnehmen und sind anscheinend Orte einer lokalierten Anhäufung der Eukaryontenproteine, die durch Präzipitation und Aggregation innerhalb der Zelle entstehen (ibid).
Während die unlöslichen Aggregate mit mechanischen Mitteln in hoher Ausbeute gewonnen werden können, z.B. durch Zentrifugation oder Filtration, ist es danach normalerweise notwendig, diese Proteine vor einer weiteren Aufreinigung in eine lösliche Form zu bringen.
Nach dem Stand der Technik wurden zwei prinzipielle Verfahren verwendet, wobei beide eine Solubilisierung und gleichzeitige Denaturierung des Proteins beinhalten, gefolgt von einer graduellen Entfernung des denaturierenden Agens; das Protein kann sich dann langsam renaturieren. In einem dieser Verfahren wird die Solubilisierung und Denaturierung durch sehr hohe Konzentrationen (6-9 M) von Verbindungen, wie z.B. Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid, in Wasser bewirkt (Internationale Patentanmeldung WO 83/04418); bei dem anderen Verfahren wird das Protein durch Behandlung mit Alkali bei einem hohen pH-Wert solubilisiert und reversibel denaturiert und anschließend auf einen niedrigeren, nicht denaturierenden pH-Wert gebracht, um eine Renaturierung des Proteins zu ermöglichen. Die beiden Verfahren können kombiniert werden, um eine weitere Verbesserung bei der Rückgewinnung zu erzielen (GB 8407570). Jedoch selbst beim kombinierten Verfahren liegt die Rückgewinnungsrate nur in der Größenordnung von 30 % (GB 8407570).
Diese Verfahren haben schwerwiegende Nachteile. Bei der Verwendung von Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid werden Reagenzien benutzt, die sehr teuer, umständlich und gefährlich handzuhaben, schwierig zu entfernen und umweltschädlich sein können und die in sehr großen Mengen gebraucht werden. Lösungen dieser Reagenzien müssen unter zusätzlichen Kosten entweder wiederverwertet oder entsorgt werden. Diese Nachteile beeinträchtigen folglich die künftige Anwendung im großen Maßstab (Emtage, J.S., Nature, 317, 1985, 185). Darüber hinaus kann Guanidinhydrochlorid nachteilig für die Immunogenizität des Proteins sein.
Eine alkalische Solubilisierung, z.B. unter Verwendung von Natrium- oder Kaliumhydroxid, ist eine billigere Alternative, bietet aber kaum wirkliche Vorteile im Hinblick auf eine bequeme Handhabung; darüber hinaus sind alkalische wäßrige Lösungen bei einem hohen pH-Wert reaktiv und führen zu irreparablen Schäden an dem gelösten Proteinmolekül. Bei beiden Verfahren kann die Renaturierung des gewünschten Proteins unvollständig sein und zu einer geringen Ausbeute führen. Die Prozeduren sind langsam und zeitaufwendig.
Es sind auch Verfahren zur Solubilisierung von Proteinaggregaten, insbesondere Einschlußkörpern, mit anionischen Tensiden bekannt (US 4 462 940).
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine oder mehrere der Schwierigkeiten im Zusammenhang mit dem Stand der Technik zu beseitigen oder zumindest zu verringern.
Nach einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Solubilisierung eines Proteins im Rahmen eines Protein-Reinigungsverfahrens vorgestellt, wonach eine Proteinquelle in unlöslicher Form und mindestens eine Quelle eines kationischen Tensids bereitgestellt werden; und das unlösliche Protein mit mindestens einem kationischen Tensid in einer Konzentration von ungefähr 2,5 bis 50 Gewicht/Volumen-% behandelt wird.
Erwünschterweise liegt die Menge des mindestens einen kationischen Tensids über der kritischen Mizellenkonzentration. Die Menge sollte ausreichend sein, um eine Solubilisierung ohne wesentliche Modifikation des strukturellen Rückgrats des Proteins zu erreichen. Der Ausdruck "strukturelles Rückgrat" bezieht sich hierbei auf die Primärund Sekundärstruktur der Proteins.
Die vorliegende Erfindung ist insbesondere anwendbar auf die Solubilisierung und Rückgewinnung von biologisch aktiven Proteinen, die durch Mikroorganismen und eukaryontische Zellinien synthetisiert worden sind, welche mit Hilfe der rekombinanten DNA-Technologie modifiziert wurden. Das Proteinaggregat kann einen Einschlußkörper enthalten, der durch Aufbrechen oder Lyse einer Wirtszelle isoliert wurde, wobei die Zelle mit einem Vektor einschließlich des für das Protein kodierenden Gens transformiert oder transfiziert worden sein kann. Die Erfindung ist aber nicht auf diesen Fall beschränkt. Sie ist weiterhin anwendbar auf die natürlich vorkommenden aggregierten Proteinkomplexe, die in vielen biologischen Systemen weit verbreitet sind.
Zu den Proteinaggregaten, die gemäß der vorliegenden Erfindung rückgewonnen werden können, zählen Einschlußkörper und zytoplasmatische Aggregate. Die Einschlußkörper können biologisch aktive Polypetide und Peptide, einschließlich Wachstumshormone, Interferone, Immunogene und Lymphokine, sein.
Vorzugsweise ist das mindestens eine kationische Tensid in einer Menge von ungefähr 2,5 bis 20 Gewicht/Volumen-% vorhanden. Die obere Grenze des Tensidanteils kann je nach den Löslichkeitsgrenzen des gewählten Tensids variieren.
Wir haben nun gefunden, daß es möglich ist, Aggregate der gewünschten Proteine, inklusive Einschlußkörper zu solubilisieren, wobei die unlösliche Form mit einem kationischen Tensid in Wasser, entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit eines polaren Lösungsmittels oder mit dem polaren Lösungsmittel allein behandelt wird. Das Verfahren ist schnell (5-60 Min), und die Rückgewinnung des solubilisierten Proteins kann sehr einfach optimal beeinflußt werden. Es werden nur kleine Mengen billiger Reagenzien, die leicht erhältlich und wiederverwendbar sind, benötigt. Z.B. kann der Großteil des solubilisierenden Agens Wasser sein.
Verfahren zur Solubilisierung von Proteinen im Rahmen eines Protein-Reinigungsverfahrens vorgestellt, wonach eine Proteinquelle in unlöslicher Form, mindestens eine Quelle eines kationischen Tensids und eine Quelle mindestens eines polaren organischen Lösungsmittels bereitgestellt werden, das unlösliche Protein mit einer Mischung aus etwa 5 bis 70 Volumen/Volumen-% des mindestens einen polaren organischen Lösungsmittels und etwa 2,5 bis 50 Gewicht/Volumen-% des mindestens einen kationischen Tensids behandelt wird, und das solubilisierte Protein von der resultierenden Lösung abgetrennt wird.
Das Protein kann in einer wäßrigen Lösung, die ein polares organisches Lösungsmittel und geeignete Puffersalze enthält, gehalten werden. Die Gegenwart eines polaren organischen Lösungsmittels, wie z.B. Acetonitril, vorzugsweise in einer Konzentration von 5 bis 70 %, verändert die Wechselwirkung zwischen dem unlöslichen Protein und dem wäßrigen Lösungsmittel und erhöht damit die Löslichkeit der hydrophoben Regionen des Proteins. Besonders vorzuziehen ist eine Konzentration des organischen Lösungsmittels zwischen 10 und 20 %.
Darüber hinaus ist die Einbeziehung eines kationischen Tensids, wie beispielsweise einer quaternären Ammoniumverbindung, in einer Menge oberhalb der kritischen Mizellenkonzentration und ausreichend, um die Assoziationskräfte zu überwinden, in hohem Maße vorteilhaft und fördert die Aufspaltung, Abtrennung und Solubilisierung der Bestandteile des Einschlußkörpers.
Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist auch die Zugabe einer wäßrigen Lösung eines geeigneten Tensids zu einem getrockneten Pulver oder einer wäßrigen Suspension von Proteinaggregaten ein in hohem Maße anzustrebender und wirkungsvoller Weg der Solubilisierung, insbesondere von ganzen Einschlußkörpern. Die Zugabe des mindestens einen kationischen Tensids erfolgt in einer Menge oberhalb der kritischen Mizellenkonzentration und innerhalb der Grenzen seiner Löslichkeit und Wirtschaftlichkeit. Dieses Verfahren ist besonders wegen seiner Einfachheit erstrebenswert; darüber hinaus, im Gegensatz zu einigen der bisherigen Verfahren, kann das Protein auch unter milden, fast neutralen Bedingungen solubilisiert werden. Aufgrund der Beschaffenheit des solubilisierenden Agens ist das Rückgewinnungsverfahren mit den späteren Aufbereitungsschritten kompatibel, im Gegensatz zu den nach dem Stand der Technik verwendeten Solubilisierungsverfahren. Das solubilisierende Agens erwies sich als mit den übrigen Zusatzstoffen, die bei der betreffenden Verarbeitung von Proteinaggregaten verwendet werden, wie z.B. Dithiothreit, Mercaptoethanol, reduziertem Glutathion, Dimethylsulfon, Harnstoff, Natrium- und Kaliumhydroxid, verträglich.
Der Umfang der Erfindung beinhaltet die Verwendung aller geeigneten einzel- oder mehrkettigen quaternären Stickstoff- oder Phosphorverbindungen mit verschiedenen Kopfgruppen, Gegenionen und verzweigten oder derivatisierten Kohlenstoffketten.
Vorzugsweise wird das mindestens eine kationische Tenid aus Cetyltrimethylhalogenid, z.B. -bromid, Cetylpyridiniumhalogenid, z.B. -chlorid, Tetradecyl-trimethylammoniumhalogenid, z.B. -bromid, Dodecyltrimethylammoniumhalogenid, z.B. -bromid, gemischtem N-Alkyl-dimethyl-benzylammoniumhalogenid, z.B. -chlorid (50 % C-14, 40 % C-12, 10 % C-16), N,N-dimethyl-N-[2-[2-[4-(1,1,3,3,-tetramethylbutyl)-phenoxy]ethoxy]ethyl]-(benzolmethaminhalogenid, z.B. -chlorid, ausgewählt.
Dabei sollte aber betont werden, daß die Auswahl der Halogenidionen nur der Illustration dient. Die Identität des Anions ist unwichtig. Z.B. können die Halogenide durch andere Ionen, z.B. Sulfonate, wie p-Toluolsulfonate ersetzt werden.
Besonders ist Cetyltrimethylammoniumbromid oder Cetylpyridiniumchlorid als kationisches Tensid vorzuziehen.
Das kationische Tensid wird vorzugsweise so ausgewählt, daß es nicht in der Region des ultravioletten Spektrums absorbiert, wo die Absorption der Polypetide maximal ist, z.B. Cetyltrimethylammoniumbromid.
Die Erfindung eröffnet erhebliche wirtschaftliche Vorteile in Reinigungssystemen großen Maßstabs. Da man kationischen Tensiden eine Aktivität gegen Bakterien, Pilze und Viren zuschreibt (Goodman, L.S., und Gilman, S., "The Pharmacolocial Basis of Therapeutics", 5. Auflage, Macmillan Publishing Co. Inc., N.Y., 1975 , Seite 1001), werden die Gefahren einer Kontamination, einer Degradation der Probe und die Notwendigkeit von komplexen und teuren Aufbewahrungseinrichtungen allesamt reduziert. Darüber hinaus werden nur geringe Konzentrationen an solubisierenden Agentien benötigt, und diese können ohne weiteres durch Chromatographie, Dialyse, Krafft-Punkt-Kristallisation, oder, zusätzlich, im Fall eines organischen Lösungsmittels durch Destillation, aus der Lösung entfernt werden.
Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung kann einen weiteren Schritt zur Abtrennung des solubilisierten Proteins von der resultierenden Lösung beinhalten.
Der Abtrennungsschritt kann ein differentielles Eluieren des solubilisierten Proteins durch eine chromatographische Säule, Dialyse, Ultrafiltration, differentielle Präzipitation, oder ligandenspezifische Isolierung beinhalten. Die chromatographische Säule kann eine Hochdruckflüssigkeitschromatographie(HPLC)-Säule oder auch eine Phasenumkehr-Hochdruckflüsigkeitschromatographie-(RP/HPLC)Säule sein. Die unter den Handelsbezeichnungen TSK-GEL (LC) vom der Toyo Soda Manufacturing Co. Ltd. (Japan) bzw. Ultrapore RSPC von Beckman Instruments Inc. (Kalifornen, U.S.A.) vertriebenen Säulen haben sich als geeignet erwiesen. Aufgrund der Beschaffenheit des solubilisierenden Agens kann der Abtrennungsschritt auch unter Anwendung anderer bekannter Formen der Chromatographie, einschließlich der Molekularsieb-Chromatographie, z.B. der Gelfiltrationschromatographie, Anionenaustauschchromatographie, hydrophoben Wechselwirkungschromatographie und ligandenspezifischen Chromatographie ausgeführt werden. Vorzugsweise ist der bei der Chromatographie verwendete Eluent eine wäßrige Lösung eines kationischen Tensids. Es kann eine verdünnte Lösung verwendet werden. Das kationische Tensid kann in einer Konzentration von ungefähr 0,25 Gewicht/Volumen-% bis ungefähr 2,0 Gewicht/Volumen-% verwendet werden, vorzugsweise jedoch von 0,4 Gewicht/Volumen-%.
Es ist zu betonen, daß die chromatographische Abtrennung auch eine Reinigung des Proteinprodukts bewirkt.
Es ist zu betonen, daß das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung in einem Verfahren zur Analyse einer Polypeptidprobe benutzt werden kann, wobei die zu testende Probe wiedergewonnen wird. Die Ergebnisse können eine quantitative Analyse der Zusammensetzung einer Polpeptidprobe liefern.
Es werden nun Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung anhand der folgenden nicht einschränkenden Beispiele und der beigefügten Figuren erläutert.
In den folgenden Beispielen wurden die transmissionselektronenmikroskopischen Aufnahmen wie folgt hergestellt:
Ein kleiner Anteil der feuchten Pille (Sediment) wurde fixiert und in L.R. White-Harz (London Resin Co., England) eingebettet; aus dem Block wurden Schnitte für eine elektronenmikroskopische Untersuchung unter Verwendung eines Philips-EM-300-Transmissions-Elektronenmikroskops angefertigt.

BEISPIEL 1

Solubilisierung des natürlichen Schweinewachstumshormons

50 mg wasserunlösliches, lyophilisiertes natürliches Schweinewachstumshormon, das ähnlich wie nach der kürzlich beschriebenen Methode (i) isoliert wurde, wurden mit einer wäßrigen Lösung von Cetyltrimethylammoniumbromid (1,0 ml einer 10 %igen Lösung) und ß-Mercapthoethanol (1 %) kräftig geschüttelt (30 Min. 25ºC.). Die klar gewordene Lösung wurde dann in einer Beckman Mikrofuge II (WZ) zentrifugiert (13.000 U/min.), um einen klaren Überstand zu erhalten. Eine 1,0 ml-Probe dieser Lösung gab eine UV-Absorption von 72 (A 1cm/280mm), und zeigte somit an, daß eine Solubilisierung stattgefunden hatte.

BEISPIEL 2A

Solubilisierung des synthetischen Schweinewachstumshormons

Ein Experiment wurde mit Einschlußkörpern von transformierten E. coli-Zellen durchgeführt. Die Einschlußkörper, die Methionin-Schweinewachstumshormon (Aminosäuren 1-190), abgeleitet vom Plasmid pMG935, enthielten, wurden nach Aufbrechen der Zellen durch Zentrifugiern isoliert. Das unlösliche Proteinsediment wurde zweimal mit einer wäßrigen Triton-X-100-Lösung (0,5 %) und EDTA (10 mM) und zweimal mit einer wäßrigen EDTA-Lösung (5 mM) gewaschen; das letzte Sediment wurde dann zur Aufbewahrung lyophilisiert.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt.
Fig. 1 stellt eine transmissions-elektronenmikroskopische Aufnahme von Einschlußkörpern des Methionin-Schweinewachstumshormons dar. Wie klar zu erkennen ist, waren Einschlußkörper mit einem Durchmesser von etwa 0,2 bis 0,5 Mikrometer zusammen mit einigen faserförmigen Verunreinigungen, wahrscheinlich Zelltrümmern, vorhanden. Die Vergrößerung ist 6.000-fach.
Eine Portion der lyopholisierten Einschlußkörper (50 mg) wurde dann in einem Teströhrchen mit einer wäßrigen Cetyltrimethylammoniumbromid-Lösung (1 ml einer 10 %igen Lösung) behandelt, und die Mischung wurde eine Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Mischung wurde in einer Beckman-Mikrofuge II zentrifugiert (2.000 U/min., 10 Min.), um einen klaren Überstand und ein kleines unlösliches Sediment zu erhalten. Ein kleiner Teil des Sediments wurde fixiert und in "L.R. White"-Harz eingebettet; aus dem Block wurden Schnitte für einen Vergleich mit dem unbehandelten Material unter dem Elektronenmikroskop angefertigt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt. Fig. 2 stellt eine transmissions-elektronenmikroskopische Aufnahme des nach der Solubilisierungsbehandlung verbleibenden unlöslichen Sediments dar. Die Vergrößerung ist 4.460-fach. Im klaren Gegensatz zu dem unbehandelten Material konnten nach dem Solubilisierungsverfahren keine Einschlußkörper festgestellt werden.

BEISPIEL 2B

Es wurde ein Experiment ähnlich dem von Beispiel 2 A durchgeführt, wobei das von einem Plasmid pMG936 abgeleitete, abweichende (Aminosäuren 4-190) Schweinewachstumshormon (50 mg) in Form von lyopholisierten Einschlußkörpern mit Cetyltrimethylammoniumbromid (1,0 ml einer 10 %igen Lösung) behandelt wurde. Die Mischung wurde geschüttelt (1 Stunde, Raumtemperatur) und abzentrifugiert, um einen klaren Überstand und ein kleines unlösliches Sediment zu erhalten. Eine 1 ,0 ml- Probe des Überstandes gab eine geschätzte UV-Absorption von 60 (A 1cm/280 mm), was darauf hinwies, daß eine Solubilisierung stattgefunden hatte.

BEISPIEL 3

In einem anderen Experiment wurden die lyophilisierten Einschlußkörper, die entweder das Methionin-, (Aminosäuren 1 bis 190) oder das abweichende (Aminosäuren 4 bis 190) Schweinewachstumshormon (50 mg) enthielten, in einem Teströhrchen bei 25ºC mit einer Mischung von Acetonitril (0,2 ml), einem wäßrigen Puffer (0,1 M Glyzin, pH 8,5; 0,8 ml) und wässrigem Cetyltrimethlylammoniumbromid (0,5 ml einer 10 %igen Lösung) behandelt. Die Mischung wurde 1 Stunde geschüttelt. Wie in dem vorangegangenen Experiment wurde eine substantielle Solubilisierung der Einschlußkörper festgestellt.

BEISPIEL 4

Lypholisierte Einschlußkörper, die 50 mg des Methionin-Schweinewachstumshormons (Aminosäuren 1 bis 190) enthielten, wurden in einem Teströhrchen bei 25ºC zusammen mit einer wäßrigen Lösung eines der unten aufgelisteten kationischen Tenside (1,0 ml) einer 20 %igen Lösung in 0,1 M TRIZMA, pH 10,0) kräftig geschüttelt. Die Mischung wurde 30 Min. geschüttelt, und dann in einer Beckman Mikrofuge II 30 Min. abzentrifugiert, um in allen Fällen einen klaren, leicht gelblichen Überstand sowie ein unwesentliches Sediment zu erhalten. Wie in den vorangegangenen Versuchen wurde in allen Fällen eine substantielle Solubilisierung der Einschlußkörperchen erreicht.
< a) Cetylpyridiniumchlorid,
(b) Tetradecyltrimethylammoniumbromid,
(c) Dodecyltrimethylammoniumbromid,
(d) Gemischtes n-Alkyl-dimethyl-benzylammoniumchlorid (50 % C-14, 40 % C-12, 10 % C-16),
(e) N, N-Dimethyl-N-[2-[2-[4-(1,1,3,3,-tetramethylbutyl)-phenoxy]-ethoxy]-ethyl]-benzolmethanaminiumchlorid.

BEISPIEL 5

Solubilisierung eines Fusionsproteins des humanen Malaria- Parasiten-Antigens

Das ß-Galaktosidase-Fusionsprotein (Ag 13) mit einem Oberflächenantigen des humanen Malaria-Parasiten Plasmodium falciparum wurde in Form von ungewöhnlichen, fast transparenten Einschlußkörpern (Abbildung 3) in E.coli exprimiert und als Geschenk von Dr. R.F. Anders (ii) erhalten.
800 mg der feuchten Einschlußkörperpaste, die Ag13, ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 156kDa, enthielten, wurden bei Raumtemperatur mit einer wäßrigen Lösung von Cetyltrimethylammoniumbromid (1,0 ml einer 19 %igen Lösung in 50mM Dinatriumethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 0,15 M Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan (TRIZMA), pH 10,0), einem Cetylpyridiniumbromid (0,25 ml einer 10 %igen Lösung in 50mM EDTA und 0,15 M TRIZMA, pH 10,0) und Dithiothreit (5%) kräfitg geschüttelt.
Nach ungefähr 45 Min. erschien die anfangs trübe Mischung transparent. Die Mischung wurde dann in einer Beckman Mikrofuge II abzentrifugiert (13.000 U/min., 10 Min.), um einen klaren, leicht gelblichen Überstand und ein kleines, weißliches Sediment zu erhalten. Die elektronenmikroskopische Untersuchung des Sediments ergab keine sichtbaren Überreste der Einschlußkörper.

BEISPIEL 6

Solubilisierung des Fusionsproteins des Virusantigens der infektiösen bursalen Krankeit

Einschlußkörper (Fig. 4), die das D1-Fragment des 32kDa- Strukturproteins des Virus der infektiösen bursalen Krankheit enthielten, wurden als Geschenk von Dr. K.J. Fahey (iii) erhalten. Die Einschlußkörper wurden ähnlich wie nach der kürzlich beschriebenen Methode (iv)§aus transformierten E.coli- Zellen isoliert.
100 mg einer feuchten Paste der Einschlußkörper, die das exprimierte virale Fusionsprotein in Form einer nassen Paste enthielten, wurden mit einer wäßrigen Lösung von Cetyltrimethylammoniumbromid (0,75 ml einer 19 %igen Lösung in 50 mM EDTA und 0,15 M TRIZMA), Cetylpyridiniumchlorid (0,5 ml einer 10 %igen Lösung in 50 mM EDTA und 0,15 M TRIZMA) und Dithiothreit (5 %) bei Raumtemperatur kräftig geschüttelt. Nach ungefähr 30 Min. war die anfangs trübe Mischung vollständig transparent.
Die Mischung wurde dann in einer Beckman Mikrofuge II abzentrifugiert (13.000 U/min., 10 Min.) um einen klaren, gelben Überstand und ein unwesentliches Sediment zu erhalten, was eine fast vollständige Solubilisierung anzeigte. Eine Immuno-Dot-Blot-Analyse des Überstands unter Verwendung von Nitrocellulosepapier und einem monoklonalen Antikörper gegen das D1-Polypeptid bestätigte, daß die aktive antigene Region auf dem fusionierten Polypeptid erhalten geblieben war.

BEISPIEL 7

Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung von C3- oder C1-alkylgebundenen, großporigem Kieselgel. Die in den Figuren 5 und 6 dargestellten Chromatogramme wurden unter Befolgung der unten beschriebenen Arbeitsvorschrift erhalten.
Die Arbeitsparameter werden wie folgt beschrieben:
Die Elution wurde bei einer Durchflußrate von 0,8 ml/Min. bei Raumtemperatur mit Wasser/Acetonitril-Gemischen, die 0,1 % v/v Trifluoressigsäure als Modifizierer enthielten, durchgeführt: Ein stufenweise linearer Gradient wurde von 100 % Wasser 0,1 Min.) bis 75 % Wasser/Acetonitril über 5 Min., bis 45 % Wasser/Acetonitril über 15 Min., bis 100 % Acetonitril über 5 Min., hergestellt. Der 100 % Acetonitril-Eluent wurde für weitere 10 Min. und dann wieder vor der nächsten Injektion äquilibriert. Die Zusammensetzung des Lösungsmittels und die Durchflußrate können zur Erzielung der gewünschten Auflösung leicht variiert werden.
Die Lösungen wurden alle entgast und filtriert (0,45 um); für die Chromatogramme in den Abbildungen 5 und 6 wurden Injektionsvolumina von 3 Mikroliter verwendet. Das Injektionsvolumen kann aber im Rahmen der Nachweisgrenzen und der verfügbaren Proteinkonzentrationen passend variiert werden.
Die HPLC wurde auf einem System, bestehend aus zwei Beckman- 114M-System-Zuführungsmodulen, die an einen 20 ul-Schleifeneinspritzer und ein Beckman-421-Kontrollgerät angeschlossen waren, durchgeführt. Der Nachweis erfolgte unter Verwendung von UV-Licht mit einer festen Wellenlänge von 270 nm mit einem variablen Wellenlängendetektor (Beckman 165).
(i) Reichert, L.E., JR., Methods in Enzymology, XLIII, 1975, 360.
(ii) Coppel, R.L., Cowman, A.F., Anders, R.F., Bianco, A.E., Saint, R.B., Lingelbach, K.R., Kemp, D.H., und Brown, G.V., Nature, 310, 1984, 789.
(iii) Azad, A.A., Fahey, K.J., Barrett, S.A., Erny, K.M., und Hudson, P.J., Virology, 149, 1986, 190.
(iv) Stanley, K.K., und Luzio, J.P., The EMBO Journal 3, 1984, 1429.
Die folgenden, oben verwendeten Worte sind eingetragene Warenzeichen: TRITON, L.R. WHITE.
Es ist klar, daß die Erfindung in ihren generellen Aspekten nicht auf die vorstehend angesprochenen spezifischen Details beschränkt ist.

Claims

1. Verfahren zum Solubilisieren von Proteinen in einem Proteinveredelungsprozess, wonach eine Proteinquelle in unlöslicher Form und eine Quelle mindestens eines kationischen Tensids bereitgestellt werden, und das unlösliche Protein mit dem mindestens einen kationischen Tensid in einer Menge von ungefähr 2.5 bis 50 Gewicht/Volumen-Prozent behandelt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Solubilisierung in einer wäßrigen Lösung durchgeführt wird.

3. Verfahren zum Solubilisieren von Proteinen in einem Proteinveredelungsprozess, wonach eine Proteinquelle in unlöslicher Form, eine Quelle von mindestens einem kationischen Tensid und eine Quelle von mindestens einem polaren organischen Lösungsmittel bereitgestellt werden, das unlösliche Protein mit einer Mischung von ungefähr 5 bis 70 Gewicht/Volumen-Prozent von dem mindestens einen kationischen Tensid behandelt wird, und das solubilisierte Protein von der resultierenden Lösung getrennt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, bei dem das mindestens eine kationische Tensid in einer Menge vorhanden ist, welche die kritische Micellenkonzentration übersteigt.

5. Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, bei dem das mindestens eine kationische Tensid eine quaternäre Ammoniumverbindung und das unlösliche Protein ein Proteinaggregat ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem das mindestens eine kationische Tensid von Tensiden ausgewählt ist, welche ein Kation enthalten, das ausgewählt wurde aus

Cetyltrimenthylammoniumkationen,

Cetylpyridiniumkationen,

Tetradecyltrimenthylammoniumkationen,

Dodecyltrimethylammoniumkationen,

gemischten n-Alkalidimethylbenzylammoniumkationen,

N,N-Dimethyl-N-[2-[2-[4-(1,1,3,3,tetramethylbutyl)-phenoxy]ethoxy]ethyl]benzolmethaminKationen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das mindestens eine kationische Tensid Cetyltrimethylammoniumbromid ist.

8. Verfahren nach Anspruch 3 oder 5, bei dem der Trennungsschritt in dem differentiellen Eluieren des solubilisierten Proteins durch eine chromatographische Säule besteht.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem das Extraktionsmittel eine verdünnte wäßrige Lösung des kationischen Tensids ist.

10. Verfahren nach Anspruch 3 oder 5, bei dem der Trennungsschritt aus der differentiellen Fällung, Dialyse, Ultrafiltration und/oder ligandenspezifischen Isolation besteht.

11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem das mindestens eine kationische Tensid Cetyltrimethylammoniumbromid ist und das mindestens eine polare organische Lösungsmittel Acetonitril ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem das Proteinaggregat ein durch Lyse aus der Wirtzelle isolierter Einschlußkörper ist.

13. Verfahren nach Anspuch 12, bei dem die Wirtzelle mit einem Vektor, einschließlich einem Gencode für Protein, transformiert oder umgeformt worden ist.

14. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem der Einschlußkörper aus den biologisch aktiven Polypeptiden und Peptiden, einschließlich Wachstumshormonen, Interferonen, Immunogenen und Lymphokinen ausgewählt worden ist.

15. Verfahren zur Analyse einer Polypeptidprobe, bei dem eine zu untersuchende Probe bereitgestellt wird und die Probe einem Verfahren nach Anspruch 2 unterworfen ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem der Trennschritt aus der Trennschritt aus der differentiellen Eluierung des solubilisierten Proteins durch eine chromatographische Säule besteht.