DE2829089A1 - Subunit-vakzine - Google Patents

Description

Subunit-Vak zine

809865VO728

. SANDOZ-PATENT-GMBH 785O Lörrach Case 900-9187

_ 6 _ 900-9187

Die vorliegende Erfindung betrifft Vakzinen, insbesondere Subunit-Vakzinen, gegen durch Pararayxoviren verursachte Erkrankungen und deren Herstellung durch selektive Ablösung und Isolierung der immunogenen Komponenten, eines Paramyxovirus.

Das genetische Material eines Paramyxovirusteilchens Ribonucleinsäure (RNS) zusammen mit dem gruppenspezifischen Nucleoprofcein ist von einer doppelten Membran umgeben, die aus einer inneren Proteinschicht und einer äußeren Schicht

809885/0728

900-9187

vom Wirt abstammenden Lipidmaterials besteht. Die Glycoproteine erscheinen als Stachel auf der Oberfläche der Virusumhüllung.

Es ist bekannt,daß die Glykoproteine für den Schutz die wichtigsten Komponenten des Paramyxovirus sind, während alle anderen Komponenten, inbegriffen andere Virusproteine, Nucleinsäuren und Lipide für die Entstehung einer Immunität nicht wesentlich sind. Die Anwesenheit dieses nicht wesentlichen Materials in einer Vakzine kann jedoch zu unerwünschten Nebenwirkungen führen. So wurden z.B. in früheren Untersuchungen Komplikationen in Form atypischer Verlaufsformen der Erkrankung bei mit Ganzvirus geimpften Kindern gefunden In jedem Fall werden durch die Anwesenheit des nicht wesentlichen Materials die Menge an Vakzine, die verabreicht werden kann, und dementsprechend auch die Höhe der Immunität, die erreicht werden kann, beschränkt.

Die ideale Vakzine sollte deshalb aus den essentiellen

Immunogenen bei Abwesenheit oder

bei substantieller Abwesenheit der nicht wesentlichen Komponenten des Virusteilchens bestehen. Vorhergehende Versuche, die Immunogene abzuscheiden, bestanden darin, daß man zunächst versuchte, das Virusteilchen vollständig zu spalten oder zu solubilisieren, beispielsweise mit Hilfe von anionischen oder nichtionischen Detergentien, wie Natriuradesoxycholat, Natriumdodecylsulfat oder Tween. Hierbei werden alle oder die wesentlichsten Anteile der Viruskomponenten freigesetzt und gehen mit den Immunogenen in Lösung. Überdies ist eine nachfolgende Reinigung oder teilweise Reinigung der erwünschten Immunogene notwendig, die sehr viel Aufwand erfordert, und die erhaltenen Ausbeuten sind üblicherweise niedrig.

809885/0728

- 8 - 9OO-91S7

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung der Glycoproteine von Paramyxoviren durch selektive Solubilisierung dieser Komponenten, wobei subvirale Partikel, die aus intakten Lipid/Proteinmembranen bestehen, die alle anderen nicht wesentlichen Anteile des Virus enthalten, zurückbleiben. Der Unterschied in der Größe und Dichte der solubilisierten Immunogene und der zurückbleibenden subviralen Partikel erlaubt eine Abtrennung der Immunogene mit Hilfe von übliehen Abtrennungsmethoden, die auf dem Unterschied in den physikalischen Eigenschaften beruhen.

Es wurde nunmehr gefunden, daß diese selektive Solubilisierung der Glykoproteinkomponenten durch Behandlung von Paramyxoviren mit einem kationischen Detergens erreicht werden kann.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung der Glykoproteinkomponenten aus Paramyxoviren durch Behandlung des Virus mit einem kationischen Detergens zwecks selektiver Solubilisierung dieser Komponenten und Abtrennung der so erhaltenen solubilisierten Komponenten von den verbleibenden subviralen Partikeln.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise unter Verwendung von Paramyxoviren der Typen Parainfluenza (human) (Typ 1, Typ 2, Typ 3), Newcastle Disease Virus (NDV), Sendaivirus, Masern, Mumps, Rubella oder Respiratorisches Synctial Virus (RSV). Stämme dieser Viren sind wohlbekannt und frei erhältlich, z.B. bei der American Type Culture Collection (ATCC). Stämme, die benützt werden können, sind z.B. solche, die bei der ATCC unter den folgenden Nummern erhältlich sind:

.809885/0728

- 9 - 900-9187

VR-94, VR-105, VR-92 und VR-93 (Parainfluenza-Stämme)

VR-IO8, VR-IO7, VR-IO9, VR-699 und VR-623 (Newcastle Disease Stämme)

VR-24 (Masern)
VR-IO6 und VR-107 (Mumps).

Ein bevorzugtes Newcastle Disease Virus ist der Stamm Queensland V4 (Queensland) , der 1966 isoliert w.urde und bei Dr. D.J. Alexander, Central Veterinary Labs., Weybridge, England erhältlich ist. Ein bevorzugtes Parainfluenzavirus ist der Stamm Sendai/52 (ATCC VR-105).

Der erfindungsgemäss verwendete Paramyxovxrusstamm wird zweckmäßigerweise auf an sich bekannte Weise vermehrt, konzentriert und gereinigt. Die Konzentration des Ausgangsvirus ist nicht kritisch.

Der pH-Wert des Viruskonzentrats kann durch Puffer, wie Phosphatpuffer, eingestellt werden, die vor der Zugabe des kationischen Detergens zugesetzt werden, und das Konzentrat kann ebenfalls, beispielsweise durch Zugabe von Formaldehyd inaktiviert werden. Danach wird das kationische Detergens zum Viruskonzentrat zweckmäßigerweise in Form einer wäßrigen Lösung zugefügt. Die benötigte Menge des kationischen Detergens, das zugefügt werden soll, hängt beispielsweise vom verwendeten Detergens ab. Im allgemeinen soll jedoch das verwendete kationische Detergens in solch einer Menge zugesetzt werden, daß das Gewichtsverhältnis von Detergens zum Protein in dem erhaltenen Gemisch von 1:2 bis 1:10, insbesondere von 1:3 bis 1:5 beträgt. Nach Zugabe des Detergens soll das Gemisch.zweckmäßigerweise stehen gelassen

809885/0728

- 10- 900-9187

werden, beispielsweise während 30 Minuten bis 16 Stunden bei einer Temperatur von beispielsweise 4 bis 37° C. Höhere Temperaturen erfordern normalerweise kürzere Zeiten. Vorzugsweise läßt man jedoch das Gemisch während 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur oder während der Nacht bei 4° C stehen.

Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendbare kationische Detergens kann jedes kationische Detergens sein, das genügend aktiv ist, um die Glykoproteinkomponenten zu solubilisieren, jedoch unter den Reaktionsbedingungen nicht genügend aktiv ist, um das ganze Virusteilchen zu zerstören.

Die erfindungsgemäß verwendbaren kationischen Detergentien können aus einer bekannten Klasse von Verbindungen der Formel

^R2

ausgewählt werden, worin R. für Alkyl, Aralkyl oder Aryl steht, R,, R₂ und R gleich oder verschieden sind und jeweils Alkyl oder Aryl bedeuten oder R, und R₂ zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 5- oder 6-gliedrigen gesättigten heterocyclischen Ring bilden und R_ Alkyl oder Aryl bedeuten, oder R-, R₂ und R- zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Ring, der am Stickstoffatom ungesättigt ist, bilden und X für ein Anion steht.

809885/0728

11" 900-9187

Bevorzugte Verbindungen der Formel I sind die Verbindungen der Formel

R 0 CH

N JP Ia

\_r.

^R4 ·

worin X obige Bedeutung besitzt, und R' für Alkyl mit 8-22 Kohlenstoffatomen steht und entweder R' und R' gleich 5. oder verschieden sind und jeweils Methyl oder eine Alkylgruppe mit 8-22 Kohlenstoffatomen bedeuten, oder Rl für Methyl steht und R' Benzyl bedeutet, insbesondere jedoch Verbindungen der Formel

N 3T Iaa

CH₀ R*

worin R' und X obige Bedeutung besitzen, oder der Formel

CH;

i N

N' Χ"-* lab

Ht-C,..H„C

worin Rl und χ obige Bedeutung besitzen.

Weitere bevorzugte Verbindungen der Formeln I sind diejenigen der Formel

809885/0728

_ 12-

900-9187

Ib

worin X obige Bedeutung besitzt, und RJj für eine Alkylgruppe mit 12-18 Kohlenstoffatomen und R₅ für Wasserstoff oder Methyl, vorzugsweise jedoch für Wasserstoff stehen.

Unter den Alkylgruppen mit 8-22 Kohlenstoffatomen sind diejenigen mit 12-18 Kohlenstoffatomen bevorzugt. Bevorzugte Alkylgruppen mit 12-18 Kohlenstoffatomen sind insbesondere die Lauryl-, Myristyl-, Cetyl- und Stearylgruppe.

In den obigen Formeln bedeutet X vorzugsweise ein Chlorid-, Bromid-, Sulfat- oder Acetat-, insbesondere jedoch ein Chlorid- oder Bromidanion.

Die bevorzugten Verbindungen der Formel laa umfassen insbesondere Myristyltrimethylammonium- und Cetyltrimethylammoniumsalze, insbesondere deren Chloride oder Bromide, ganz besonders jedoch Bromide. Bevorzugte Verbindungen der Formel lab umfassen Stearyldimethylbenzylammoniumsalze, insbesondere deren Chloride oder Bromide, ganz besonders jedoch Bromide. Die bevorzugten Verbindungen der Formel Ib umfassen Cety!pyridiniumsalze, insbesondere deren Chloride oder Bromide, ganz besonders Bromide.

Andere" kationische Detergentien, die zweckmäßigerweise verwendet werden können, sind Benzalkoniumchloride und bromide beispielsweise Benzethoniumchlorid oder Methylbenzethoniumchlorid oder auch solche Agentien wie Decamethoniumchlorid.

809885/0728

-13- 900-9187

Das erfindungsgemäß bevorzugte kationische Detergens ist Cetyltrimethylaramoniumbromid.

Nach Beendigung des obigen Verfahrens können die Glyko— proteinkomponenten von den zurückbleibenden intakten subviralen Partikeln auf an sich bekannte Weise abgetrennt werden. Diese Abtrennung beruht auf der verschiedenen Größe oder Dichte der zu trennenden Teilchen und kann beispielsweise mit Hilfe einer Gradientenzentrifugation unter Verwendung von Rohrzucker- oder Natriumglutamatmedien unter nachfolgender Fraktionierung der Gradienten, durch Sedimentation, durch Molekularsiebchromatographie oder durch Pelletierung in einer Ultrazentrifuge durchgeführt werden.

Das erfindungsgemäß hergestellte Gemisch von Immunogenen kann zweckmäßigerweise in Vakzinen verwendet werden.

Hierfür werden die oben beschriebenen isolierten Glykoproteinkomponenten zweckmäßigerweise in einem üblichen Lösungsmittel resuspendiert, beispielsweise in einer physiologischen isotonischen Lösung, beispielsweise einer 0,9 %igen Natriumchloridlösung, die gegebenenfalls beispielsweise mit einem Phosphatpuffer abgepuffert ist. Der Anteil des zurückbleibenden kationischen Detergens kann vor der Vakzinebereitung herabgesetzt werden, beispielsweise auf weniger als 0,01 %, beispielsweise durch Dialyse, Gelchromatographie oder Ionenaustauschchromatographie,

Falls erwünscht,können Konservierungsmittel oder Inaktivierungsmittel, wie Formaldehyd den Vakzinen in üblichen Mengen, beispielsweise in einem Gewichtsverhältnis von einem Teil zu 10.000 Teilen zugesetzt werden.

· Die immunogene Wirkung der erfindungsgemäßen Vakzine kann

809885/0728

- 14- 900-9187

zweckmäßigerweise verbessert werden durch Zugabe von üblichen immunologischen Zusätzen (Adjuvantien), wie Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat in üblichen Mengen. Bevorzugt wird die Zugabe von 0,2 % Aluminiumhydroxid.

In einer Testreihe wurde der Schutz der Maus zu verschiedenen Zeiten nach Immunisierung mit Subunit-Vakzine und mit Ganzvirus-Vakzine bei Belastung mit virulentem Virus untersucht. Dieses Modell umfaßt alle spezifischen und unspezifischen Abwehrmechanismen. Gruppen von je 30 Mäusen v/erden hierbei 0,25 ml Antigen/Maus i.p. appliziert. Die Tiere werden mit lebendem Virus infiziert und die Schutzwirkung wird aus dem Grad der Lungenläsionen, dem Virustiter in den Lungen und der Zunahme des Lungengewichts im Vergleich zu Kontrolltieren bewertet. Dabei zeigt sich,

daß die mit der erfindungsgemäßen Vakzine immunisierten Tiere gleich gut wie die mit Ganzvirusvakzine behandelten Tiere geschützt sind.

Für solchen Gebrauch wird die zu verabreichende Dosis verständlicherweise variieren. Im allgemeinen werden jedoch befriedigende Resultate erzielt, wenn eine einmalige Dosis von 0,1 bis 1 mg Eiweiss verabreicht wird. In manchen Fällen ist jedoch - z.B. etwa 3 oder 4 Wochen später - eine Zusatzdosis zur Verstärkung erforderlich.

Die Vakzine werden vorteilhaft sub-kutan oder intramuskulär verabreicht.

809885/0728

- 15 - 900-9187

Beispiel 1:

Parainfluenzavirus vom Typ Sendai (der Stamm Sendai/52, bei der ATCC unter der Depotnummer ATCC VR-105 erhältlich) wird durch Inkubation

in einem embryonierten Hühnerei bei 35° C während 2 Tagen vermehrt. Die Eier werden danach auf 4° C abgekühlt und über Nacht stehen gelassen. Die erhaltenen infizierten Allantoisflüssigkeiten werden vereinigt. Das Virus wird anschließend aus der Allantoisflüssigkeit durch Zentri-r fugation in der Durchflußzonalzentrifuge (Modell RK, Elektro-Nucleonics) unter Verwendung eines Rohrzuckergradienten in einer durch Phosphat gepufferten Kochsalzlösung konzentriert und gereinigt. Das nach der Herabsetzung des Rohrzuckergehaltes auf weniger als 5 % durch Dialyse gegen eine durch Phosphat gepufferte Kochsalzlösung in der Kälte erhaltene Viruskonzentrat hat einen Hämagglutinationstiter von 1:2 und einen Proteingehalt von 0,8 mg/ml. Zur Abspaltung der Immuncgene wird die Virussuspension mit 1/50 ihres Volumens einer wäßrigen Detergenslösung (Cetyltrimethylammoniumbromid, l%ige Lösung) versetzt.

Nach 30 bis 60 Minuten (Zimmertemperatur) wird das Reaktionsgemisch durch Gradientenzentrifugation aufgearbeitet unter Verwendung eines vorgebildeten linearen Rohrzuckergradienten und nachfolgende Fraktionierung des Gradienten.

Die Glykoproteine werden dabei quantitativ solubilisiert und befinden sich im oberen Teil des Gradienten gut getrennt vom wesentlich rascher sedimentierenden Virusrestpartikel.

809885/0728

16 - 900-9187

Beispiel 2:

Vermehrung, Konzentrierung und Spaltung des Virus werden, wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Die Aufarbeitung erfolgt durch Gleichgewichtszentrxfugation in einem vorgeformten Rohrzuckergradienten. Nach Gleichgewichtseinstellung wird der Gradient fraktioniert und ausgetestet. Die Glykoproteine befinden sich im leichteren Teil des Gradienten gut getrennt vom dichteren Virusrestpartikel.

Beispiel 3:

Man verfährt wie in den Beispielen 1 oder 2, verwendet aber Newcastle Disease Virus [Stamm Queensland oder Scrubbs - speziell der Stamm Queensland V4 (Queensland), 1966 isoliert und bei Dr. D.J. Alexander, Central Veterinary Labs., Weybridge, England erhältlich],

Beispiel 4:

Man verfährt wie in den Beispielen 1 oder 3, arbeitet jedoch das Spaltgemisch durch Pelletierung in der Ultrazentrifuge auf. Dies kann beispielsweise durch Zentrifugation in der Beckmann L-2-65 B Zentrifuge erfolgen (Rotor 60 Ti, 35000 UpM 90 Minuten). Die solubilisierten Immunogene sind in der überstehenden Fraktion enthalten.

Beispiel 5;

Man verfährt wie in einem der Beispiele 1 bis 4, verwendet jedoch anstelle von einer Cetyltrimethylammoniumbromidlösung eine l%ige Lösung von Myristyltrimethylammonium-

809885/0728

- 17 - 900-9187

bromid, Benzethoniumchlorid, Methylbenzethoniumchlorid,-. Decamethoniumchlorid oder Stearyldimethylbenzylammoniumbromid. Hierbei erhält man vergleichbare Resultate.

Beispiel 6:

Ein erfindungsgemässes Paramyxovirusvakzin wird gemäss folgender Formulierungsvorschrift hergestellt:

Immunogenes Gemisch: 0,3 g (Gewicht des

■ Eiweisses)

Thiomerosal 1 Teil, bezogen auf

10.000 Teile *

Phosphatpuffer in

99 %iger physiologischer bis zu 0,5 ml

Salzlösung

Das immunogene Gemisch kann, wie in den vorangehenden Beispielen beschrieben, hergestellt werden wie das Gemisch des Parainfluenzavirus gemäss Beispiel 1.

SR/wg

809885/0728

Claims (14)

900-9187 Patentansprüche:

1. Verfahren zur Isolierung der Glykoproteinkomponenten aus Paramyxoviren, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Paramyxovirus mit einem kationischen Detergens zwecks selektiver Solubilisierung dieser Komponenten behandelt und die so erhaltenen solubilisierten Komponenten von den verbleibenden Subvirusteilchen abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Paramyxovirus ein Paramyxovirus vom Typ.Parainfluenza (human) (Typ 1, Typ 2, Typ 3), Newcastle Disease Virus (NDV), Sendaivirus, Masern, Mumps, Rubella oder Respiratorisches Syncytial Virus (RSV) oder ein Gemisch von zwei oder mehr dieser Viren verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Viruskonzentrat vorgängig der Zugabe eines kationischen Detergens mit Formaldehyd inaktiviert wurde.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß man das kationische Detergens in Form seiner wäßrigen Lösung verwendet.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das kationische Detergens in solchen Anteilen zugesetzt wird, daß im erhaltenen Gemisch das Gewichtsverhältnis von Detergens zum Protein von 1:2 bis 1:10 beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, • daß das Gewichtsverhältnis von 1:3 bis 1:5 beträgt.

809885/0728

ORIÖfNAL INSPECTED

900-9187

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Zugabe des kationischen Detergens das erhaltene Gemisch während 30 Minuten bis 16 Stunden bei 4 bis 37° C stehen gelassen wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein kationisches Detergens der Formel

^Rl /3

N-JC^ I

^R2 ^R4

verwendet, worin R₄ für Alkyl oder Aryl steht, R. , R~ und R- gleich oder verschieden sind und jeweils Alkyl oder Aryl bedeuten, oder R, und R„ zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 5- bis 6-gliedrigen gesättigten heterocyclischen Ring bilden und R₃ Alkyl oder Aryl bedeutet, oder R,, R₂ und R₃ zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Ring bilden, der am Stickstoffatom ungesättigt ist, und X für ein Anion steht.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß das kationische Detergens die Formel

^Ri ^CH3

809885/0728

_ ^ _· 900-9187

besitzt, worin X die im Anspruch 8 angegebene Bedeutung besitzt, und R' eine Alkylgruppe mit 8-22 Kohlenstoffatomen bedeutet, und entweder R.! und R' gleich oder verschieden sind und jeweils Methyl oder eine Alkylgruppe mit 8-22 Kohlenstoffatomen bedeuten, oder R' für Methyl und R' für Benzyl stehen.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das kationische Detergens die Formel

CH₃

N X^ Iaa

^CH3 ^R4

besitzt, worin RV und X die im Anspruch 9 angegebene Bedeutung besitzen.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das kationische Detergens die Formel

CH₃ CH₃

^N 3^ lab

^H5^C6'^CH2 ^R4

besitzt, worin R\ und X die im Anspruch 9 angegebene Bedeutung besitzen.

80 9885/0728

-P-

900-9187

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das kationische Detergens die Formel

Ib

besitzt, worin X die im Anspruch 8 angegebene Bedeutung besitzt, R^ eine Alkylgruppe mit 12-18 Kohlenstoffatomen und R₅ Wasserstoff oder Methyl, vorzugsweise Wasserstoff» bedeuten.

13. Eine Vakzine bestehend aus den Glykoproteinkomponenten eines Paramyxovirus bei substanzieller Abwesenheit anderer Komponenten des Viruspartikels zusammen mit einem inerten flüssigen Verdünnungsmittel*

14. Ein Verfahren zum Herbeiführen einer Immunität gegen ein Paramyxovirus, dadurch gekennzeichnet, daß man eine immunologisch wirksame Menge der Vakzine gemäß Anspruch verwendet. . ...

809885/0728