DE3911442A1 - Impfstoff-praeparation - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft eine Impfstoff-Präparation. Die Erfindung
betrifft insbesondere eine Impfstoff-Präparation, die ein
Toxin oder seine Subeinheit bzw. Untereinheit (diese Ausdrücke
werden synonym verwendet) als wirksamen Bestandteil enthält.
Impfstoffe werden zum Schutz verschiedener Arten von Krankheiten
verwendet und ergeben erfolgreiche Ergebnisse. Jedoch
wurden manchmal Nebenreaktionen oder eine ungenügende Wirkung
des Impfstoffes beobachtet, und daher besteht ein großer Bedarf
für Verbesserungen des Impfstoffs. Zur Beseitigung einer Neben
reaktion des Impfstoffes hat man versucht, gereinigtere Impf
stoffe herzustellen oder eine geringere Menge an Impfstoff
zu verabreichen. Jedoch haben diese Versuche zu einer geringeren
Wirkung des Impfstoffes geführt.
Derzeit werden Impfstoffe für Menschen aus Pathogenen oder
ihren Komponenten hergestellt. Daher kann eine Verunreinigung
mit Komponenten, welche das Pathogen ergeben, oder aus dem
Medium, welches zur Kultur des Pathogens verwendet wird, in
einem Impfstoff nicht vermieden werden, und dadurch werden
bei der Impfung mit einem Impfstoff Nebenwirkungen induziert.
Es sollte daher ein wirksamer Impfstoff entwickelt werden,
der eine verbesserte Immunpotenz ohne Nebenwirkung aufweist.
Zur Beseitigung der Nachteile hat man verschiedene Möglichkeiten
vorgeschlagen, wie eine Erhöhung in der Inokulumgröße des
Impfstoffs und eine Änderung der Verabreichungswege.
Die Anmelderin hat gefunden, daß die Immunpotenz von Impfstoff
verstärkt werden kann, wenn der Impfstoff zusammen mit einem
Bakterien-Toxin, insbesondere einem Cholera-Toxin, Staphylokokken-
α-Hämolysin, Staphylokokken-δ-Hämolysin, thermostabilem
direkten Vibrio-Hämolysin, Pertussis-Toxin oder E. coli-
wärmelabilem-Toxin oder einer Untereinheit davon, verabreicht
wird.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde,
eine Impfstoff-Präparation zur Verfügung zu stellen, welche
eine verbesserte Immunpotenz aufweist, wobei gleichzeitig die
Menge an Impfstoff, die verabreicht wird, erniedrigt wird,
ohne daß die Immunpotenz erniedrigt wird.
Erfindungsgemäß soll eine Impfstoff-Präparation zur Verfügung
gestellt werden, die als wirksame Komponente ein Toxin oder
seine Untereinheit enthält.
Erfindungsgemäß soll eine Impfstoff-Präparation zur Verfügung
gestellt werden, welche ein Bakterien-Toxin enthält.
Erfindungsgemäß soll eine Impfstoff-Präparation zur Verfügung
gestellt werden, welche ein Bakterien-Toxin, ausgewählt aus
der Gruppe Cholera-Toxin, Staphylokokken-α-Hämolysin, Staphylokokken-
δ-Hämolysin, thermostabiles direktes Vibrio-Hämolysin,
Pertussis-Toxin oder E. coli-wärmelabiles-Toxin, enthält.
Erfindungsgemäß soll eine Impfstoff-Präparation zur Verfügung
gestellt werden, in der die Untereinheit des Toxins die B-
Einheit ist.
Erfindungsgemäß soll ein Impfstoff zur Verfügung gestellt werden,
ausgewählt aus der Gruppe Influenza-Impfstoff, Pertussis-
Impfstoff, Diphtherie- und Tetanus-Toxoid, kombiniert mit
Pertussis-Impfstoff, Japan-Encephalitis-Impfstoff, Hepatitis-B-
Impfstoff, Rota-Impfstoff, Masern-Impfstoff, Rubella-Impfstoff
bzw. Röteln-Impfstoff, Mumps-Impfstoff, Kombinations-Impfstoff
für Masern, Rubella und Mumps und Mycoplasma-Impfstoff.
Erfindungsgemäß soll eine Impfstoff-Präparation zur Verfügung
gestellt werden, die ein Mischverhältnis von Impfstoff und
Toxin oder seiner Untereinheit von 1 : 0,0001∼1 : 10 000 (Gew./
Vol.) enthält.
Erfindungsgemäß soll eine Impfstoff-Präparation zur Verfügung
gestellt werden, die einen intranasalen Impfstoff enthält.
Erfindungsgemäß soll eine Impfstoff-Präparation zur Verfügung
gestellt werden, welche in injizierbarer Form, in Sprayform
oder in einer für die orale Verabreichung geeigneten Form
vorliegt.
Influenza-Impfstoff ist ein Beispiel eines Impfstoffs, und
Cholera-Toxin (welches im folgenden als CT bezeichnet wird)
und Cholera-Toxin-B-Subeinheit (welches im folgenden als CTB
bezeichnet wird) sind ein Beispiel für ein Bakterien-Toxin
und anhand dieser wird die vorliegende Erfindung erläutert.
Die Anmelderin hat das Cholera-Toxin untersucht, ein Protein-
Endotoxin, welches durch Vibrio cholera als lokaler Immunmodulator
gegen intranasal verabreichten Impfstoff gebildet wird.
Cholera-Toxin ist ein wirksames intestinales Immunogen und
ist für die Diarrhoe (den Durchfall) bei der Cholere verant
wortlich. Weiterhin ist es nicht nur als wirksames Immunogen,
welches die IgA-Antikörperbildung induziert, bekannt, sondern
ebenfalls als immunomodulierendes Mittel, welches die Immun-
Antwort bei der gleichzeitigen Verabreichung nichtverwandter
Protein-Antigene stimuliert, wenn CT und das nichtverwandte
Antigen gleichzeitig verabreicht werden. Eine Wirkung von CT
wurde als Wirkung definiert, welche den intrazellularen cAMP-
Gehalt in intestinalen mukosalen Zellen erhöht. Ein Mechanismus
der Wirkung von CT, welches aus A-Subeinheit und B-Subeinheit
besteht, ist der, daß CTB an GM₂-Gangliosid in einer
Zellmembran gebunden wird und daß die A-Subeinheit in die
Zelle eintritt und die Adenylatcyclase aktiviert. CTB, die
nichttoxische Komponente von CT, wurde ebenfalls als Darm-
Schleimhaut-Immunogen erkannt, wenn es gleichzeitig
mit nichtverwandtem Protein-Antigen verabreicht wird. Diese
Tatsachen lassen vermuten, daß sowohl CT als auch CTB an den
Atem-Schleimhäuten als auch an den intestinalen Schleimhäuten
wirken und die lokale Immun-Antwort gegenüber nichtverwandten
koexistierenden Antigenen stimulieren.
Die Anmelderin hat die Wirksamkeit von CT und CTB als Adjuvans
bei der lokalen und Serum-Antikörper-Herstellung bei nasaler
Impfung bei Mäusen unter Verwendung von Influenza-HA-Impfstoff
(im folgenden als HA-Impfstoff bezeichnet) untersucht. Weiterhin
wurde die Verwertbarkeit von CT und CTB als Adjuvans
bei der Impfungswirkung geprüft.
Die Wirkungen von CTB bei den Antikörper-Antworten gegenüber
HA-Impfstoff (A/Yamagata) wurden in Mäusen untersucht, welche
den Impfstoff zusammen mit CTB intranasal verabreicht bekamen.
Gleichzeitig wurde das Ergebnis der intranasalen Verabreichung
mit dem anderer Inokulationswege bzw. Impfwege verglichen.
Vier Wochen nach der nasalen Impfung, welche durch Eintropfen
von HA-Impfstoff (2 µg) alleine oder zusammen mit CTB (5 µg)
intranasal bei Mäusen erfolgte (oder die durch intraperitoneale
oder subkutane Verabreichung erfolgte), wurden die Hämagglutinin-
inhibierenden (im folgenden als HI bezeichnet) Anti
körpergehalte im Serum und die Influenza-spezifischen IgA-
Antikörper (im folgenden als Anti-HA-IgA-Antikörper bezeichnet)
und die CTB-spezifischen IgA-Antikörper (im folgenden
als Anti-CTB-IgA-Antikörper bezeichnet) in der nasalen Spülung
analysiert.
Wie aus Tabelle 2 hervorgeht, wurde bei der Vergleichsgruppe
von Mäusen, welchen nur der HA-Impfstoff alleine intranasal
verabreicht wurde, nur ein niedriger Gehalt an Serum-Hi-Antikörpern
induziert. Die nasale Impfung von CTB zusammen mit
HA-Impfstoff führte zu einem 64fach höheren Gehalt an
Serum-HI-Antikörpern. Anti-HA-IgA- und Anti-CTB-IgA-Antikörper
wurden in der nasalen Spülung ebenfalls beobachtet. Die intra
peritoneale oder subkutane Impfung von HA-Impfstoff alleine
induzierte einen höheren Gehalt an Serum-HI-Antikörper, und
die Impfung von HA-Impfstoff zusammen mit CTB induzierte einen
wesentlich erhöhten Gehalt, wie einen um das 4-∼8fache höheren
Gehalt an Serum-HI-Antikörpern. Jedoch wurden keine nachweisbaren
nasalen Anti-HA-IgA- noch Anti-CTB-IgA-Antikörper
induziert.
Als Ergebnis kann festgestellt werden, daß CTB ein wirksames
Adjuvans ist, welches die nasale Anti-HA-IgA-Antikörper-Bildung
stimuliert, wenn es intranasal zusammen mit HA-Impfstoff
verabreicht wird.
Obgleich dies in Tabelle 2 nicht gezeigt wird, konnte kein
Serum-Anti-HA-IgA nachgewiesen werden.
Eine Erhöhung der Antikörperbildung in Mäusen, welche intranasal
HA-Impfstoff (A/Yamagata, 2 µg) zusammen mit CTB (5 µg)
erhielten, wurde untersucht.
Wie aus Fig. 1 hervorgeht, wurde die HI-Antikörperbildung
bei Serum-Impfstoff zusammen mit CTB während 1 bis 2 Wochen
stark erhöht, danach trat eine allmähliche Erhöhung bis zu
einer Zeit von 4 Wochen auf. Die Gesamtmenge von IgA in der
nasalen Spülung wurde schnell auf einen maximalen Wert nach
1 bis 2 Wochen nach der Impfung erhöht, wobei der Wert ungefähr
6mal so hoch ist wie bei der Vergleichsgruppe. Die Menge an
Anti-HA-IgA darin wurde allmählich nach 1 bis 4 Wochen
gesteigert.
Anti-HA-Antikörper konnte in der nasalen Spülung ungefähr
2 Wochen nach der gleichzeitigen Verabreichung von CTB als
auch Impfstoff nachgewiesen werden.
Die Wirkung von CTB (5 µg) und verschiedenen Mengen an HA-Impfstoff
(A/Yamagata) auf die HA-Antikörper-Antwort wurde untersucht.
Die primäre Antikörperbildung wurde in Mäusen untersucht, die
eine primäre intranasale Imfpung von verschiedenen Dosen von
HA-Impfstoff zusammen mit CTB erhielten. 4 Wochen nach der
Impfung wurde die sekundäre Antikörperbildung nachgewiesen,
wobei die Mäuse 2 Wochen später die zweite intranasale Impfung
von HA-Impfstoff (2 µg) alleine erhielten.
Aus Tabelle 3 folgt, daß ein niedriger Gehalt an primärer
Antikörperbildung selbst bei einer Impfung mit 8 µg HA-Impfstoff
alleine beobachtet wurde. Andererseits beobachtete man
sowohl einen hohen nasalen Anti-HI-IgA-Antikörpergehalt als
auch einen Serum-HI-Antikörpergehalt mit einer Steigerung in
der intranasalen Dosis von HA-Impfstoff selbst bei einer
0,03-µg-Impfung, wenn CTB gleichzeitig verabreicht wurde.
Bei Mäusen, die die zweite intranasale Impfung von HA-Impfstoff
alleine nach der primären Impfung erhielten, war der
Gehalt an Anti-HI- und Anti-HA-IgA-Antikörperbildung enorm
erhöht und unabhängig von der primären HA-Impfdosis, welche
mit CTB geimpft wurde. Mäuse, die eine primäre Impfung aus
CTB- und HA-Impfstoff erhielten, zeigten extrem hohe Gehalte
bei der Anti-HI- und Anti-HA-IgA-Antikörperbildung und waren
von der Menge der primären HA-Impfstoff-Impfung unabhängig.
Insbesondere war der Gehalt an nasalem Anti-HA-IgA-Antikörper
etwa 50- bis 100mal so hoch wie der nach der primären Impfung.
Diese Ergebnisse zeigen, daß das primär inokulierte CTB die
Antikörperbildung bei der sekundären Impfung stark stimuliert,
ohne daß die Menge von HA-Impfstoff gleichzeitig bestimmend
wirkt. Tatsächlich kann CTB eine immunologische Memory für
die Bildung von nasalen IgA-Antikörpern gegenüber HA-Impfstoff
bei relativ niedriger Konzentration wirksam erzeugen.
Die Immun-Antwort gegenüber HA-Impfstoff wird durch gleichzeitige
Verabreichung von CTB bei Mäusen verstärkt. Die Wirksamkeit
von CTB als Adjuvans wurde durch Produktionsexperimente
unter Verwendung eines der Maus angepaßten Influenza-Virus,
Stamm PR8, untersucht. Mäuse wurden intranasal sowohl mit
PR8-HA-Impfstoff (1,5 µg) als auch mit CTB (5 µg) geimpft und
4 Wochen später intranasal mit PR8-Virus infiziert. Drei Tage
nach der Infektion wurden die Lungenvirus-Titer als Index
für den Schutz bestimmt. Wie aus Tabelle 4 hervorgeht, erhielt
man einen vollständigen Schutz gegen die Herausforderungs-
Infektion ohne Nachweis von Viren in der Lunge der Mäuse bei
der Inokulation des Impfstoffes mit CTB und eine Bildung
von hohen Gehalten von sowohl Serum-HI-Antikörpern als auch
nasalen Anti-HA-IgA-Antikörpern bei Mäusen, und keine der
Mäuse war infiziert.
Zur Bestimmung des Lungenvirus-Titers nach 3 Tagen der Viren
infektion als Indikator für die Resistenz gegenüber der Infektion
gegenüber Vireninfektion bei Mäusen wurden die Mäuse
sowohl mit HA-Impfstoff als auch mit CTB geimpft, und 4 Wochen
später wurden sie intranasal mit dem Virus, Stamm PR8, geimpft.
Nach der Infektion wurde die Variation der Lungenvirus-
Titer bestimmt.
Wie aus Fig. 2 hervorgeht, zeigten Mäuse, welche Lungenvirus
<100,5 nach 3 Tagen der Infektion erhielten, keinen nachweisbaren
Virus einen Tag nach der Infektion, und der niedrige
Gehalt mit dem Überleben blieb mindestens 8 Tage erhalten.
Im Gegensatz dazu zeigten die Lungen von Mäusen der Vergleichs
gruppen, welche keine nachweisbaren Schutz-Antikörper bildeten,
das Anzeichen der Infektion, die einen Tag nach der Infektion
zunahm und ihr Maximum nach 3 Tagen erreichte. Der
Tod von Mäusen in der Vergleichsgruppe wurde 8 Tage nach der
Infektion beobachtet. In der nichtimmunisierten Gruppe starben
6 von 9 Mäusen nach 8 Tagen. Die überlebenden 3 Mäuse zeigten
starke Läsionen in der Lunge, und man beurteilte sie so, daß
sie innerhalb einiger Tage sterben würden. Ähnliche Ergebnisse
wie bei der nichtimmunisierten Gruppe wurden bei Mäusen
beobachtet, die mit HA-Impfstoff oder CTB alleine geimpft
worden waren. Daraus wird geschlossen, daß der Lungenvirus-
Titer 3 Tage nach der Infektion ein Indikator für die Resistenz
gegenüber der Infektion ist.
Die Wirkungen der CT- oder CTB-Dosis, welche intranasal mit
dem PR8-HA-Impfstoff (1,5 µg) geimpft wurden, beim Schutz
gegenüber dem Angriff von PR8-Virus und die Antikörperbildung
wurden untersucht. Wie aus Tabelle 5 hervorgeht, wurde eine
mäßige Resistenz gegenüber der Infektion bei einer Dosis von
CTB (0,05 µg) beobachtet, und ein vollständiger Schutz gegen
die Angriffsinfektion wurde bei der Impfung von Impfstoff
mit 5 µg CTB erhalten. Der Grad der Resistenz gegenüber der
Infektion scheint direkt dem Gehalt von Anti-HA-IgG-Antikörpern
in der nasalen Spülung und dem Gehalt an HI-Antikörpern
im Serum nach 4 Wochen nach der Inokulation des Impfstoffes
mit CTB proportional zu sein.
Ein vollständiger Schutz gegenüber der Infektion wurde bei
Gehalten von CT über 0,05 µg beobachtet, und bei diesen Bedingungen
wurde eine Erhöhung der HI-Antikörper im Serum und
der Anti-HA-IgA-Antikörper in der nasalen Spülung entsprechend
der Erhöhung im Gehalt an CT beobachtet.
Diese Ergebnisse zeigen, daß CT um das 10fache oder mehrfache
wirksamer ist als CTB auf Dosisbasis bei der Erhöhung der
HI-Antikörperbildung im Serum und der Anti-HA-IgA-Antikörperbildung
in der nasalen Spülung, die für den Schutz gegenüber
der Infektion erforderlich sind.
CT kann als wirksames Adjuvans bei niedrigen Dosismengen,
verglichen mit CTB, verwendet werden, wenn keine Nebenwirkung
auftritt.
Man nimmt an, daß der HI-Antikörper um das 32fache der Antikörper-
Titer im Serum höher ist und daß die lokalen Antikörper
mit mehr als 2 Einheiten von Anti-HA-IgA-Antikörpern für
einen Schutz gegenüber PR8-Virusinfektion erforderlich sind.
In der Tabelle 1 werden die Adjuvans-Aktivitäten der verschiedenen
Bakterien-Toxine erläutert.
Wie es oben erläutert wurde, wurden die folgenden Tatsachen
festgestellt:
- (1) Die Verabreichung von Influenza-HA-Impfstoff zusammen mit CT oder CTB verstärkt die Immunproduktion.
- (2) Die Verstärkung der Serum-HI-Antikörperproduktion und
der lokalen intranasalen Anti-HA-IgA-Produktion wurde durch
intranasale Impfung von HA-Impfstoff mit CTB vergrößert.
Fast keine lokale intranasale HA-IgA-Antikörperproduktion
wurde nicht beobachtet, wenn eine intraperitoneale und subkutane
Impfung erfolgte, es wurden jedoch hohe Gehalte an
Antikörperproduktion im Serum festgestellt.
Als Folge besitzt CTB eine Verstärkungsaktivität bei der Antikörperbildung bei allen Inokulationswegen bzw. bei allen Arten der Verabreichung des Impfstoffes.
Diese Tatsache bedeutet, daß die kombinierte Verabreichung von CT, CTB, Staphylokokken-α-Hämolysin, Staphylokokken-δ- Hämolysin, thermostabilem direkten Vibrio-Hämolysin, Pertussis- Toxin oder E. coli-wärmelabilem-Toxin mit Pertussis-Impfstoff, Diphtherie- und Tetanus-Toxoid, kombiniert mit Pertussis- Impfstoff, Hepatitis-B-Impfstoff, Japan-Encephalitis- Impfstoff, Masern-Impfstoff, Rubella-Impfstoff, Mumps-Impfstoff, Rubella- und Mumps-Kombinations-Impfstoff, Rota-Impfstoff oder Mycoplasma-Impfstoff höhere Titerwerte ergibt, verglichen mit der einfachen Dosis des Impfstoffes.
In anderen Worten kann die Impfstoffmenge beim Impfen verringert werden, wenn der Impfstoff gleichzeitig mit Toxin und/oder einer Untereinheit davon verabreicht wird. - (3) Der Gehalt an lokalem nasalen Anti-HA-IgA-Antigen wird 2 bis 4 Wochen bei der intranasalen Impfung des Impfstoffes mit CTB erhöht.
- (4) Die Antikörperbildung nach 4 Wochen nach der intranasalen Impfung des Impfstoffes mit CTB ist der Dosismenge an Impfstoff beim Impfen proportional.
- (5) Bei Mäusen, welche die zweite intranasale Impfung des Impfstoffes alleine 4 Wochen nach der primären Impfung des Impfstoffes mit CTB erhielten, wurde der Gehalt an sekundärer Antikörperproduktion 2 Wochen nach der zweiten Impfung stark erhöht und war von der primären Impfstoffdosis, die beim Impfen mit CTB verwendet wurde, unabhängig. Daher kann CTB wirksam eine immunologische Memory ergeben.
- (6) Ein vollständiger Schutz gegenüber Influenza-Virusinfektion
wurde bei der intranasalen Inokulation des Impfstoffes
mit CTB in Mäusen erhalten, bei denen die Bildung von hohen
Gehalten sowohl an Serum-Antikörper-Titern als auch an nasalen
Anti-HA-IgA-Antikörpern beobachtet wurde.
Bei den derzeitigen Versuchsbedingungen konnte bei Mäusen, welche Serum-HI-Antikörper über dem 32fachen des Antikörper- Titers und lokale nasale Antikörper über 2 Einheiten zeigten, ein vollständiger Schutz gegenüber PR8-Virusinfektion erhalten werden. - (7) Die Impfstoffmenge von CTB, die für die Induzierung der Antikörperbildung für einen vollständigen Schutz gegenüber der Infektion erforderlich ist, wenn eine intranasale Impfung mit Impfstoff erfolgt, liegt in der Größenordnung von µg. CT kann die Antikörperbildung induzieren, welche für einen vollständigen Schutz gegenüber der Infektion erforderlich ist, bei Mengen unter ¹/₁₀, wie CTB.
Die Toxine oder ihre Untereinheit, die bei der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, wie CT oder CTB, können nach an
sich bekannten Verfahren hergestellt werden und sind ebenfalls
im Handel erhältlich. CT ist, wenn es in großer Menge
verabreicht wird, toxisch, es ist jedoch nicht toxisch, wenn
es intranasal oder intraperitoneal verabreicht wird, inokuliertes
CTB ist weniger toxisch als CT und ergibt bei der
intranasalen Verabreichung keine Schwierigkeiten. Beispiele
weiterer Toxine sind Staphylokokken-α-Hämolysin, Staphylokokken-
δ-Hämolysin, thermostabiles direktes Vibrio-Hämolysin,
Pertussis-Toxin und E. coli-wärmelabiles-Toxin.
Beispiele für Impfstoffe sind Influenza-Impfstoff, Pertussis-
Impfstoff, Diphtherie- und Tetanus-Toxoid, kombiniert mit
Pertussis-Impfstoff, Hepatitis-B-Impfstoff, Japan-Encephalitis-
Impfstoff, Masern-Impfstoff, Rubella-Impfstoff, Mumps-
Impfstoff, Kombinations-Impfstoff für Masern, Rubella und
Mumps, Rota-Impfstoff und Mycoplasma-Impfstoff und andere.
Diese können auf an sich bekannte Weise hergestellt werden.
Die Produktion und ihre Herstellungsverfahren werden im
folgenden erläutert.
Influenza-Impfstoff:
ein Impfstoff, welcher Hämagglutinin (HA), Neuraminidase (NA), Nucleoprotein (NP) und Matrixprotein (M) vollständig oder teilweise enthält, die durch Reinigung des Virus, welcher auf embryonierten Eiern gezüchtet wurde, mit Ether und Detergens oder durch Genetic-Engineering-Verfahren oder durch chemische Synthese erhalten wurden.
ein Impfstoff, welcher Hämagglutinin (HA), Neuraminidase (NA), Nucleoprotein (NP) und Matrixprotein (M) vollständig oder teilweise enthält, die durch Reinigung des Virus, welcher auf embryonierten Eiern gezüchtet wurde, mit Ether und Detergens oder durch Genetic-Engineering-Verfahren oder durch chemische Synthese erhalten wurden.
Pertussis-Impfstoff:
ein Impfstoff, der Pertussis-Toxin (PT), Hämagglutinin (FHA) und K-Agglutin vollständig oder teilweise enthält, die aus einem avirulenten Toxin mit Formalin erhalten werden, wobei das Toxin durch Auswalzen oder Ultrazentrifugation aus der Kulturbrühe oder Bakterienzellen von Bordetella pertussis erhalten wurde oder durch Genetic- Engineering-Verfahren oder chemische Synthese erhalten wurden.
ein Impfstoff, der Pertussis-Toxin (PT), Hämagglutinin (FHA) und K-Agglutin vollständig oder teilweise enthält, die aus einem avirulenten Toxin mit Formalin erhalten werden, wobei das Toxin durch Auswalzen oder Ultrazentrifugation aus der Kulturbrühe oder Bakterienzellen von Bordetella pertussis erhalten wurde oder durch Genetic- Engineering-Verfahren oder chemische Synthese erhalten wurden.
Diphtherie- und Tetanus-Toxoid, kombiniert mit Pertussis-Impfstoff:
ein Kombinations-Impfstoff aus Pertussis-Impfstoff, Diphtherie- und Tetanus-Toxoid.
ein Kombinations-Impfstoff aus Pertussis-Impfstoff, Diphtherie- und Tetanus-Toxoid.
Japan-Encephalitis-Impfstoff:
ein Impfstoff, der ein antigenes Protein vollständig oder teilweise enthält, welches durch Züchtung eines Virus intracerebral in Mäusen und Reinigung der Virusteilchen durch Zentrifugieren oder mit Ethyl alkohol und Inaktivierung oder durch Genetic-Engineering-Verfahren oder durch chemische Synthese erhalten wurde.
ein Impfstoff, der ein antigenes Protein vollständig oder teilweise enthält, welches durch Züchtung eines Virus intracerebral in Mäusen und Reinigung der Virusteilchen durch Zentrifugieren oder mit Ethyl alkohol und Inaktivierung oder durch Genetic-Engineering-Verfahren oder durch chemische Synthese erhalten wurde.
Hepatitis-B-Impfstoff:
ein Impfstoff, der ein antigenes Protein vollständig oder teilweise enthält, welches durch Isolierung und Reinigung des HBs-Antigens unter Auswalzung oder durch Ultrazentrifugation aus Hepatitis B enthaltendem Blut erhalten wurde oder der durch Genetic-Engineering-Verfahren oder chemische Synthese erhalten wurde.
ein Impfstoff, der ein antigenes Protein vollständig oder teilweise enthält, welches durch Isolierung und Reinigung des HBs-Antigens unter Auswalzung oder durch Ultrazentrifugation aus Hepatitis B enthaltendem Blut erhalten wurde oder der durch Genetic-Engineering-Verfahren oder chemische Synthese erhalten wurde.
Masern-Impfstoff:
ein Impfstoff, der den Virus, welcher in kultivierten Küken-Embryozellen oder embryonierten Eiern gezüchtet wurde, oder ein Schutz-Antigen vollständig oder ganz enthält, wobei der Impfstoff gemäß Genetic-Engineering-Verfahren oder durch chemische Synthese erhalten wurde.
ein Impfstoff, der den Virus, welcher in kultivierten Küken-Embryozellen oder embryonierten Eiern gezüchtet wurde, oder ein Schutz-Antigen vollständig oder ganz enthält, wobei der Impfstoff gemäß Genetic-Engineering-Verfahren oder durch chemische Synthese erhalten wurde.
Rubella-Impfstoff:
ein Impfstoff, der den Virus, der in kultivierten Küken-Embryozellen oder embryonierten Eiern gezüchtet wurde, oder ein Schutz-Antigen vollständig oder teil weise enthält und der gemäß Genetic-Engineering-Verfahren oder nach der chemischen Synthese erhalten wurde.
ein Impfstoff, der den Virus, der in kultivierten Küken-Embryozellen oder embryonierten Eiern gezüchtet wurde, oder ein Schutz-Antigen vollständig oder teil weise enthält und der gemäß Genetic-Engineering-Verfahren oder nach der chemischen Synthese erhalten wurde.
Mumps-Impfstoff:
ein Impfstoff, der ein Virus, der in gezüchteten Kaninchenzellen oder embryonierten Eiern gezüchtet wurde, oder ein Schutz-Antigen vollständig oder ganz enthält und der gemäß Genetic-Engineering-Verfahren oder durch chemische Synthese erhalten wurde.
ein Impfstoff, der ein Virus, der in gezüchteten Kaninchenzellen oder embryonierten Eiern gezüchtet wurde, oder ein Schutz-Antigen vollständig oder ganz enthält und der gemäß Genetic-Engineering-Verfahren oder durch chemische Synthese erhalten wurde.
Kombinations-Impfstoff für Masern, Rubella und Mumps:
ein Impfstoff, der kombiniert Masern-, Rubella- und Mumps- Impfstoffe enthält.
ein Impfstoff, der kombiniert Masern-, Rubella- und Mumps- Impfstoffe enthält.
Rota-Impfstoff:
ein Impfstoff, der einen Virus, der in MA-104-Zellen gezüchtet wurde oder aus Faeces der Patienten isoliert wurde, oder ein Schutz-Antigen vollständig oder teil weise enthält, die durch Genetic-Engineering-Verfahren oder durch chemische Synthese erhalten wurden.
ein Impfstoff, der einen Virus, der in MA-104-Zellen gezüchtet wurde oder aus Faeces der Patienten isoliert wurde, oder ein Schutz-Antigen vollständig oder teil weise enthält, die durch Genetic-Engineering-Verfahren oder durch chemische Synthese erhalten wurden.
Mycoplasma-Impfstoff:
ein Impfstoff, der Mycoplasma-Zellen, die in einem flüssigen Kulturmedium für Mycoplasma gezüchtet wurden, oder ein Schutz-Antigen vollständig oder teilweise enthält, die durch Genetic-Engineering-Verfahren oder durch chemische Synthese erhalten wurden.
ein Impfstoff, der Mycoplasma-Zellen, die in einem flüssigen Kulturmedium für Mycoplasma gezüchtet wurden, oder ein Schutz-Antigen vollständig oder teilweise enthält, die durch Genetic-Engineering-Verfahren oder durch chemische Synthese erhalten wurden.
Die oben erläuterten Impfstoffe liegen in flüssiger oder
pulverförmiger Form vor.
Die flüssige Form des Impfstoffes liegt bevorzugt für die
intranasale Verabreichung, wie als intranasales Spray, zum
Eintropfen oder für die Anwendung oder als Injektion zusammen
mit dem Toxin oder seiner Untereinheit, vor. Ein intranasales
Versprühen eines Pulvers kann ebenfalls durchgeführt werden.
Die Menge der Dosis kann 5 µl∼50 µl intranasal bei Mäusen
betragen, und sie beträgt vorzugsweise 0,1∼0,5 ml bei der
intranasalen Verwendung oder bei der Injektion bei Menschen.
Diese Verabreichungsmengen können je nach Bedarf modifiziert
werden.
Das Kombinationsverhältnis von Impfstoff und Toxin oder seiner
Untereinheit beträgt 1 : 0,001∼1 : 10 000 (Gew./Vol.-%) und
hängt von der Dosismenge beim Menschen ab.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffe können durch Mischen der
oben erläuterten Impfstoffe mit dem Toxin oder der Untereinheit
in dem gewünschten Verhältnis hergestellt werden. Die
Präparation sollte strikt aseptisch hergestellt werden, und
jedes Material sollte ebenfalls aseptisch sein. Pyrogen oder
Allergen sollten natürlich so vollständig wie möglich entfernt
werden.
Die Impfstoff-Herstellung gemäß der vorliegenden Erfindung
kann durchgeführt werden, indem man den Impfstoff per se und
das Toxin oder seine Untereinheit getrennt herstellt und vor
der Impfung vermischt oder indem man beide Stoffe getrennt
impft.
Das folgende Bezugsbeispiel erläutert einen erfindungsgemäßen
Impfstoff, welcher Influenza-Impfstoff und CT oder CTB enthält,
und seine Wirkung.
Tier: weibliche Balb/c-Mäuse, 6 bis 8 Wochen alt.
HA-Impfstoff: HA-Impfstoffe wurden aus Influenza-Virus durch
Behandlung mit Ether zur Entfernung der Lipid-Bestandteile
hergestellt. Die HA-Komponente, ungefähr 30%, ist in dem HA-
Impfstoff enthalten. Die Impfstoffmenge, die in den Tabellen 2
bis 5 angegeben wird, wird als Menge an HA angegeben.
CT und CTB: Cholera-Toxin (CT) und seine B-Subeinheit (CTB)
wurden von Sigma Chemical Co., USA, gekauft. Die bei den
vorliegenden Experimenten verwendete CTB-Präparation zeigt keine
nachweisbare Kontamination mit A-Subeinheit, bestimmt gemäß
SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese.
Eine Impfstoff-Präparation wird durch Verdünnung von HA-Impfstoff
oder Adjuvans mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS)
hergestellt. Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion
von Amobarbital-natrium anästhetisiert und dann durch intranasales
Eintropfen mit 20 µl der Impfstoff-Präparation geimpft.
Alternativ wurden sie durch subkutane oder intraperitoneale
Injektion von 100 µl des Impfstoffes immunisiert.
Die Serumproben wurden von Mäusen gesammelt, indem Gesamtblut
aus ihren Herzen abgezogen wurde. Die nasalen Wasch- bzw.
Spülproben wurden durch Waschen der Nasalhöhlen jeweils
zweimal mit insgesamt 1 ml PBS erhalten.
Serum für den HI-Titerassay wurde nach Entfernung der nicht
spezifischen Inhibitoren durch Rezeptor-Zerstörungsenzym
(RED) hergestellt. Das Serum wurde mit der 2fachen Verdünnung
auf einer U-Typ-Mikrotiterplatte verdünnt und dann mit Virus
von 16 HA-Einheiten vermischt. Die Probe wurde 30 Minuten bei
Raumtemperatur stehengelassen. Dann wurden rote Kükenzellen
für die Analyse zugegeben.
Die Ergebnisse wurden nach dem Stehenlassen bei Raumtemperatur
während 1 Stunde erhalten.
Antivirales IgA, Anti-CTB-Antikörper und Gesamt-IgA in der
nasalen Spülung und in dem Serum wurden gemäß ELISA gemessen.
Die Vertiefungen einer EIA-Platte mit 96 Vertiefungen (halbe
Fläche, Costar, Cambridge, MA) werden mit entweder 50 µl HA-
Impfstoff (5 µg/ml) oder mit CTB (5 µg/ml) beschichtet. Die
Platte wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und dann
dreimal mit PBS-Tween gewaschen. Die PBS-Lösung (100 µl), welche
1% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% NaN₃ enthielt, wurde
in die Vertiefungen zum Beschichten gegeben und über Nacht
bei 4°C inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS-Tween wurde jede
Probe von entweder den Serum- oder nasalen Spülungsproben
in die Vertiefungen gegeben. Die Platten wurden 2 Stunden bei
Raumtemperatur inkubiert und dann mit PBS-Tween gewaschen.
Alkalisches-Phosphatase-gekuppeltes Ziegen-Anti-Maus-IgA
(α-Kette spezifisch, 1 : 1000, Zymed Laboratories, Inc., USA;
50 µl) wurde in jede Vertiefung gegeben. Die Platte wurde bei
Raumtemperatur 1 Stunde inkubiert und dann mit PBS-Tween
gewaschen. Schließlich wurde p-Nitrophenylphosphat (1 mg/ml,
Sigma Co.) in 10%igem Diethanolamin-Puffer bei einem pH-Wert
von 9,8 (100 µl) in jede Vertiefung gegeben.
Nach 20 bis 30 Minuten wurde die Absorption der Platten bei
410 nm (OD₄₁₀) in einem SJeia-Auto-Reader (Modell ER-8000,
Sanko Junyaku Co., Tokyo) abgelesen. Eine Standardkurve wurde
für jede Platte hergestellt. Eine Standard-Regressionskurve,
welche durch Logit-Log-Gleichung aufgestellt wurde, wurde für
jeden Assay aufgestellt, und die unbekannten Proben wurden
unter Verwendung eines Programms an dem SJeia-Auto-Reader
interpoliert.
Eine Standard-Anti-HA-IgA-Meßlösung wird als 8-Einheitsstandard
für antivirale IgA-Antikörper definiert, die eine nasale
Probe von Mäusen ist, welche 5fach wiederholte nasale Impfungen
des HA-Impfstoffes mit 2wöchigen Intervallen erhielten.
Eine Standard-Anti-CTB-IgA-Meßlösung wird als 8-Einheits
standard für antivirale IgA-Antikörper definiert, die nasale
Proben von Mäusen 4 Wochen nach der nasalen Impfung mit
CTB (5 µg) sind.
Das gesamte IgA wurde wie oben erläutert bestimmt, ausgenommen,
daß das Ziegen-Anti-Maus-IgA (50 µl, 1 µg/ml) in jede
Vertiefung zugegeben wurde. Mäuse-gereinigtes-IgA-Myeloma
(Miles Labs. USA) wurde als Standardlösung für die Gesamt-
IgA-Messung verwendet.
Die Mäuse wurden anästhetisiert und dann durch intranasales
Eintropfen von 20 µl Virussuspension, welche 0,01% BSA enthielt,
in die linke Nasenhöhle infiziert. Die Virussuspension
wurde als 1/5000-∼10 000-Suspension des ursprünglichen Viruspools
mit 108,5 EID₅₀ hergestellt, welches durch Inokulation
von 148 Übertragungen in Frettchen, 596 Übertragungen in
Mäusen und 72 Übertragungen in Mäusen und 72 Übertragungen
in embryonierten Eiern hergestellt wurde. Bei diesen Infektions
bedingungen starben mehr als 90% der nichtimmunisierten
Tiere innerhalb von 14 Tagen oder bildeten Konsolidierungen
in den Lungen.
Drei Tage nach der Infektion wurden die Lungen der Mäuse entfernt,
homogenisiert, wobei man eine 10%ige Suspension in PBS
erhielt, und dann bei 2500 Upm zentrifugiert. Reihenverdünnungen
(1 : 10) des Überstands der einzelnen Lungenhomogenate
wurden hergestellt, und jede Verdünnung wurde in 5 embryonierte
Eier injiziert. Der Lungenvirus-Titer von jeder Maus
wurde gemäß der Hämagglutinationskapazität des allantoischen
Fluids bestimmt und durch die niedrigste Verdünnung des Lungen
homogenats mit EDI₅₀, welches eine Infektion von Eiern ergab,
ausgedrückt.
Der Lungenvirus-Titer wurde durch den mittleren ± SD-Wert
angegeben. In einigen Versuchen wurden die Lungen von 5 Mäusen
in einer Gruppe zur Herstellung der Lungensuspension vereinigt.
Die Häufigkeit bzw. das Auftreten der Infektion erfolgt durch
Werte, die die Zahl der infizierten Mäuse angeben, bei denen
der Virus mit <10¹ in dem Lungenhomogenat (10%) pro 5 getesteten
Mäusen vorhanden war.
Die Wahrscheinlichkeitswerte wurden gemäß dem Studenten-t-Test
berechnet.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Influenza-HA-Impfstoff (1 mg HA/ml) und CTB, welches in PBS
gelöst und aseptisch filtriert war, wurden unter Herstellung
einer Influenza-HA-Impfstoff-CTB intranasalen Lösung (20 µl),
welche Influenza-HA-Impfstoff (1,5∼2 µg) und CTB (3,5∼250 µg)
zusammen mit zugegebenen Konservierungsstoffen und Stabilisatoren
enthielt, vermischt und in Flaschen gefüllt. Die Impfstoff-
Präparation wurde an einem dunklen und kalten Ort unter
10°C gelagert. Die Wirkung der Impfstoff-Präparation wird im
folgenden erläutert.
Influenza-HA-Impfstoff (1 mg HA/ml) und CTB, welches in PBS
gelöst und aseptisch filtriert war, wurden vermischt, wobei
eine Influenza-HA-Impfstoff-CTB injizierbare Lösung (0,5 ml)
erhalten wurde, welche Influenza-HA-Impfstoff (1,5∼2 µg)
und CTB (2,5∼250 µg) zusammen mit zugesetzten Konservierungs
stoffen und Stabilisatoren enthielt. Die Lösung wurde in
Ampullen abgefüllt. Die Impfstoff-Präparation wird an einem
dunklen und kühlen Ort unter 10°C gelagert. Die Wirkung der
Impfstoff-Präparation wird im folgenden erläutert.
Hepatitis-B-Impfstoff-CTB für die Injektion wurde durch Ver
mischen von Hepatitis-B-Impfstoff und CTB, welches in PBS gelöst
und aseptisch filtriert war, hergestellt. Es wurde ein
Gemisch hergestellt, welches HBs-Antigen (40 µg Protein) und
CTB (2,5∼250 µg) in 20 µl Lösung zusammen mit zugegebenen
Konservierungsstoffen und Stabilisatoren enthielt. Das Gemisch
wurde in Ampullen abgefüllt. Die Impfstoff-Präparation wird
an einem dunklen und kühlen Ort unter 10°C gelagert.
Die so hergestellte Hepatitis-B-Impfstoff-Präparation und CT
werden zum Inokulieren von Mäusen verwendet, und der Serum-
Titer wurde 3 Wochen nach der Impfung gemessen.
Aus der Tabelle folgt, daß Mäuse, welche Hepatitis-B-Impfstoff
erhielten, einen passiven Hämagglutinations-(PHA)-Titer von
25,6 Einheiten zeigten und Mäuse, welche zusätzlich CT er
hielten, einen PHA-Titer von 26,6 Einheiten zeigten, und
daraus folgt, daß die Antikörperbildung verstärkt war.
Der Antikörper-Titer wurde durch den passiven Hämagglutinationstest
gemessen. Die Antikörper-Titer sind von durchschnittlich
5 Mäusen angegeben.
Pertussis-Impfstoff und CTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert,
wurden vermischt, wobei eine Pertussis-Impfstoff-CTB-
Präparation für die intranasale Verabreichung erhalten wurde.
Das Gemisch aus Pertussis-Impfstoff (14 µg Protein-Stickstoff)
und CTB (25∼250 µg) in 20 µl wurde zusammen mit Konservierungs
stoffen und Stabilisatoren in eine Flasche abgefüllt.
Das Produkt wurde an einem dunklen und kühlen Platz unter 10°C
gelagert.
CTB oder CT wurden zu dem Pertussis-Impfstoff, 20 µl (13 µg
Protein-Stickstoff), zugegeben, und dann wurden Mäuse intranasal
inokuliert. Nach 4 Wochen wurde die gleiche Impfstoffmenge
Mäusen intranasal verabreicht, und die Antikörper-Titer
wurden bestimmt.
Wie es aus der Tabelle folgt, zeigen Mäuse, welche Pertussis-
Impfstoff alleine erhalten haben, einen Anti-PT-Antikörper
von <4,1 Einheiten und welche Pertussis-Impfstoff zusammen
mit CTB oder CT erhalten haben, zeigen einen Anti-PT-Antikörper
von 140,3 Einheiten bzw. 232,5 Einheiten. Anti-FHA-
Antikörper von Mäusen, welche mit Impfstoff alleine unter
Zugabe von CTB oder CT inokuliert waren, betrugen <2,6 Einheiten,
<32,0 Einheiten bzw. 43,9 Einheiten. Die Antikörperbildung
wurde bei Mäusen verstärkt, wenn Impfstoff und CTB oder
CT verabreicht wurden.
Eine Diphtherie- und Tetanus-Toxoid-Pertussis-Impfstoff-CTB-
Kombinationspräparation für die intranasale Anwendung wurde
durch Vermischen eines Diphtherie- und Tetanus-Toxoids mit
einem Pertussis-Impfstoff (im folgenden als Kombinations-
Impfstoff bezeichnet) mit CTB, gelöst in PBS und aseptisch
filtriert, hergestellt. Es wurde ein Gemisch (20 µl) des
Kombinations-Impfstoffs (50 µg Protein-Stickstoff) und CTB
(2,5∼250 µg) und zugesetzten Konservierungsstoffen und
Stabilisatoren hergestellt und in eine Flasche abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter
10°C gelagert.
CTB wurde dem Kombinations-Impfstoff zugegeben, dann wurden
Mäuse intranasal inokuliert bzw. geimpft, und nach 4 Wochen
wurde die gleiche Menge Impfstoff verabreicht, dann wurden
die Antikörper-Titer gemessen.
Aus der Tabelle folgt, daß Mäuse, die den Kombinations-
Impfstoff alleine erhielten, Anti-Pertussis-Toxin-(PT)-Antikörper-
<2,0-Einheiten, Anti-Diphtherie-(DT)-Antikörper-<1,5-Einheiten
und Anti-Tetanus-Toxoid-(TT)-<1,5-Einheiten enthielten.
Die Antikörperbildung wurde durch Zugabe von CTB zu 150,0,
110,5 bzw. 120,0 Einheiten, wie oben angegeben, verstärkt.
Japan-Encephalitis-Impfstoff-CTB (für die Injektion) wurde
hergestellt durch Vermischen von Japan-Encephalitis-Virus-
Impfstoff mit CTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert.
Es wurde ein Gemisch (1 ml) aus inaktivierten Virusteilchen
entsprechend Japan-Encephalitis 107,0 PFU und CTB (10,0∼0 µg)
und Konservierungsstoffen und Stabilisatoren hergestellt, und
dieses wurde in Ampullen abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter
10°C gelagert.
Japan-Encephalitis-Impfstoff zusammen mit oder ohne CTB oder
CT wurde zum 2fachen Impfen von Mäusen mit 1wöchigen Intervallen
verwendet, und der Serum-Antikörper-Titer wurde gemessen.
Die Neutralisations-Antikörper-Titer von Japan-Encephalitis-
Virus mit oder ohne CTB oder CT betrugen 101,88, <102,58 bzw.
<102,20, und die Antikörperbildung wurde durch Zugabe von
CTB oder CT zu dem Impfstoff verstärkt.
Eine Präparation aus Masern-Impfstoff-CTB für die intranasale
Anwendung wurde durch Mischen von Masern-Impfstoff mit CTB,
gelöst in PBS und aseptisch filtriert, hergestellt. Es wurde
ein Gemisch (20 µl) aus Virusteilchen entsprechend Masern-
Impfstoff (20 µl) und CTB (5 µg) und zugegebenem Konservierungs
mittel und Stabilisatoren hergestellt. Das Gemisch wurde
in eine Flasche abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Platz unter
10°C gelagert.
Der Masern-Impfstoff mit oder ohne CTB wurde zum 2fachen
Inokulieren von Mäusen in einem Intervall von 3 Wochen verwendet.
Die Serum-Antikörperbildung wurde gemessen.
Der ELISA-Antikörper-Titer beträgt, wenn der Masern-Impfstoff
alleine verwendet wird, 0,144 und der von Impfstoff und
zugegebenem CTB beträgt <0,209. Die Verstärkung der Antikörper
bildung wurde beobachtet, wenn der Impfstoff mit CTB verabreicht
wurde.
Eine Rubella-Impfstoff-CTB-Präparation für die intranasale
Anwendung wurde durch Vermischen von Rubella-Impfstoff mit
CTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert, hergestellt. Es
wurde ein Gemisch (20 µl) aus Virusteilchen entsprechend
Rubella-Impfstoff (20 µl) und CTB (5 µg) und unter Zugabe von
Konservierungsstoffen und Stabilisatoren hergestellt. Das
Gemisch wurde in eine Flasche abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter
10°C gelagert.
Rubella-Impfstoff mit oder ohne CTB wurde zum zweimaligen
Impfen von Mäusen mit einem 3wöchigen Intervall verwendet.
Es wurde die Serum-Antikörperbildung gemessen.
Der gemäß ELISA bestimmte Antikörper-Titer betrug bei der
Verabreichung von Rubella-Impfstoff alleine 0,095, und bei
der Zugabe von CTB zu dem Impfstoff betrug er <0,920. Die
Verstärkung der Antikörperproduktion wurde beobachtet, wenn der
Impfstoff mit CTB verabreicht wurde.
Eine Präparation für die intranasale Verabreichung aus Mumps-
Impfstoff-CTB wurde durch Mischen von Mumps-Impfstoff mit
CTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert, hergestellt. Es
wurde ein Gemisch (20 µl) aus Virusteilchen entsprechend dem
Mumps-Impfstoff (20 µl) und CTB (5 µg) unter Zugabe von Konservierungs
stoffen und Stabilisatoren hergestellt. Das Gemisch
wurde in eine Flasche abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter
10°C gelagert.
Der Mumps-Impfstoff mit oder ohne CTB wurde zum zweimaligen
Impfen von Mäusen mit einem 3wöchigen Intervall verwendet,
und dann wurde die Serum-Antikörperproduktion gemessen.
Der gemäß ELISA bestimmte Antikörper-Titer betrug bei der Ver
abreichung von Mumps-Impfstoff alleine 0,028, und bei der
Zugabe von CTB zu dem Impfstoff betrug er <0,045. Die Verstärkung
der Antikörperbildung wurde beobachtet, wenn Impfstoff
mit CTB verabreicht wurde.
Eine Präparation für die intranasale Anwendung aus einem Kombinations-
Impfstoff für Masern-, Rubella- und Mumps-CTB wurde
durch Mischen des Kombinations-Impfstoffes mit CTB, gelöst
in PBS und aseptisch filtriert, hergestellt. Es wurde ein
Gemisch (20 µl) aus Virusteilchen entsprechend einem Masern-
Impfstoff (7 µg), Rubella-Impfstoff (1 µg) und Mumps-Impfstoff
(7 µg) und CTB (5 µg) unter Zugabe von Konservierungs
stoffen und Stabilisatoren hergestellt. Das Gemisch wurde
in eine Flasche abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter
10°C gelagert.
Der Impfstoff mit oder ohne CTB wurde zum zweimaligen Impfen
von Mäusen mit einem 3wöchigen Intervall verwendet, und dann
wurde die Serum-Antikörperbildung gemessen.
Der gemäß ELISA bestimmte Antikörper-Titer betrug bei der Ver
abreichung des Impfstoffes alleine 0,14, 0,09 bzw. 0,15 für
Masern, Rubella und Mumps, und der des Impfstoffes mit zugegebenem
CTB betrug 0,29, 0,30 bzw. 0,24. Die Verstärkung der
Antikörperbildung wurde beobachtet, wenn der Impfstoff mit
CTB verabreicht wurde.
Eine Präparation aus Rota-Impfstoff und CTB für die orale und
intranasale Anwendung wurde durch Mischen von Rota-Impfstoff
mit CTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert, hergestellt.
Es wurde ein Gemisch (20 µl) aus Virusteilchen entsprechend
Rota-Impfstoff (3,3 µl) und CTB (5 µg) unter Zugabe von
Stabilisatoren hergestellt, und das Gemisch wurde in eine Flasche
abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter
10°C gelagert.
Rota-Impfstoff mit oder ohne CTB wurde zum zweimaligen Inokulieren
von Mäusen mit einem 3wöchigen Intervall verwendet,
und dann wurde die Antikörperproduktion gemessen.
Der ELISA-Antikörper-Titer betrug für den verabreichten Impfstoff
alleine 0,089 bei der intranasalen Anwendung, und unter
Zugabe von CTB zu dem Impfstoff betrug er 0,281 und 0,018 bei
der oralen Verabreichung und 0,277 bei der Zugabe von CTB zu
dem Impfstoff bei oraler Verabreichung.
Die Verstärkung der Antikörperbildung wurde beobachtet, wenn
der Impfstoff mit CTB verabreicht wurde.
Eine injizierbare Präparation aus Mycoplasma-Impfstoff und
CTB wurde durch Vermischen von Mycoplasma-Impfstoff mit CTB,
gelöst in PBS und aseptisch filtriert, hergestellt. Es wurde
ein Gemisch (1 ml) aus Mycoplasma entsprechend dem Impfstoff
(2,0 × 10¹⁰ CFU) (koloniebildende Einheit) und CTB (10 µg)
unter Zugabe von Stabilisatoren hergestellt, und das Gemisch
wurde in eine Ampulle abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter
10°C gelagert.
Der Impfstoff mit oder ohne CTB wurde zum dreimaligen Inokulieren
von Küken mit 2wöchigen Intervallen verwendet. Es
wurde die Zahl der Läsionen nach dem Angriff von Mycoplasma-
Infektion beobachtet.
Die Verabreichung von Impfstoff und CTB zeigte eine ausgeprägte
Schutzwirkung, verglichen mit der Verabreichung von Impfstoff
alleine.
Eine Präparation aus Pertussis-Impfstoff-LTB für die intranasale
Verabreichung wurde durch Vermischen von Pertussis-Impfstoff
mit LTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert, hergestellt.
Es wurde ein Gemisch (20 µl) aus Pertussis-Impfstoff
(14 µg Protein-Stickstoff) und LTB (2,5∼250 µg) unter Zugabe
von Konservierungsstoffen und Stabilisatoren hergestellt. Das
Gemisch wurde in eine Flasche abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Platz unter
10°C gelagert.
LTB oder LT wurde zu dem Pertussis-Impfstoff, 20 µl, (13 µg
Protein-Stickstoff) zugegeben, und dann wurden Mäuse intranasal
geimpft. Nach 4 Wochen wurde die gleiche Impfstoffmenge
intranasal den Mäusen verabreicht, und die Antikörper-Titer
wurden bestimmt.
Aus der Tabelle ist erkennbar, daß Mäuse, welche Pertussis-
Impfstoff alleine erhielten, einen Anti-PT-Antikörper von
<4,2 Einheiten zeigten und solche, welche Pertussis-Impfstoff
zusammen mit CTB oder CT erhielten, zeigten einen Anti-PT-
Antikörper von 150,3 Einheiten bzw. 230,5 Einheiten. Die Anti-FHA-
Antikörper von Mäusen, die mit dem Impfstoff alleine bzw.
unter Zugabe von CTB oder CT geimpft wurden, betrugen <2,3
Einheiten, <30,0 Einheiten bzw. 40,5 Einheiten. Die Antikörper
bildung wurde bei Mäusen verstärkt, wenn der Impfstoff und
LTB oder LT verabreicht wurden.
Diphtherie- und Tetanus-Toxoid, kombiniert mit Pertussis-Impfstoff-
LTB-Präparation für die intranasale Anwendung wurde
durch Vermischen eines Diphtherie- und Tetanus-Toxoids, kombiniert
mit Pertussis-Impfstoff (im folgenden als Kombinations-
Impfstoff bezeichnet) mit LTB, gelöst in PBS und aseptisch
filtriert, hergestellt. Es wurde ein Gemisch (20 µl) aus
Kombinations-Impfstoff (50 µg Protein-Stickstoff) und LTB
(2,5∼250 µg) unter Zugabe von Konservierungsmitteln und
Stabilisatoren hergestellt. Das Gemisch wurde in eine Flasche
abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter
10°C gelagert.
LTB wurde zu dem Kombinations-Impfstoff zugegeben, dann wurden
Mäuse intranasal inokuliert, und nach 4 Wochen wurde die gleiche
Impfstoffmenge erneut verabreicht, und dann wurden die
Antikörper-Titer gemessen.
Aus der Tabelle folgt, daß Mäuse, die den Kombinations-Impfstoff
alleine erhielten, Anti-Pertussis-Toxin-(PT)-Antikörper
von <1,8 I.E., Anti-Diphtherie-(DT)-Antikörper von <1,4 Einheiten
und Anti-Tetanus-Toxoid-(TT) von 1,2 Einheiten zeigten.
Die Antikörperbildung wurde um 0,3 durch Zugabe von LTB
auf 140,0, 80,5 bzw. 100,5 I.E. vergrößert.
Eine Präparation für die intranasale Anwendung aus Rubella-
Impfstoff und LTB wurde durch Mischen von Rubella-Impfstoff
mit LTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert, hergestellt.
Es wurde ein Gemisch (20 µl) aus Virusteilchen entsprechend
dem Rubella-Impfstoff (3 µg) und LTB (5 µg) unter Zugabe von
Stabilisatoren hergestellt. Das Gemisch wurde in eine Flasche
abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter
10°C gelagert.
Rubella-Impfstoff mit oder ohne LTB wurde zum zweimaligen Inokulieren
von Mäusen mit 3wöchigen Intervallen verwendet. Es wurde
die Serum-Antikörperbildung gemessen.
Der gemäß ELISA bestimmte Antikörper-Titer betrug bei der Ver
abreichung von Rubella-Impfstoff alleine 0,133, und bei der
Zugabe von LTB zu dem Impfstoff betrug er <0,854. Die Verstärkung
der Antikörperbildung wurde beobachtet, wenn Impfstoff
mit LTB verabreicht wurde.
Eine Präparation für die intranasale Anwendung aus Masern-
Impfstoff und LTB wurde durch Mischen von Masern-Impfstoff
mit LTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert, hergestellt.
Es wurde ein Gemisch (20 µl) aus Virusteilchen entsprechend
Masern-Impfstoff (20 µg) und LTB (5 µg) unter Zugabe von
Stabilisatoren hergestellt. Das Gemisch wurde in eine Flasche
abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter
10°C gelagert.
Der Masern-Impfstoff mit oder ohne LTB wurde zum zweimaligen
Impfen von Mäusen mit 3wöchigen Intervallen verwendet, und
dann wurde die Serum-Antikörperbildung gemessen.
Der gemäß ELISA bestimmte Antikörper-Titer betrug bei der Ver
abreichung von Masern-Impfstoff alleine 0,182, und bei der
Zugabe von LTB zu dem Impfstoff betrug er <0,332. Die Verstärkung
der Antikörperbildung wurde beobachtet, wenn der Impfstoff
mit LTB verabreicht wurde.
Eine Präparation für die intranasale Verabreichung von Mumps-
Impfstoff und LTB wurde hergestellt durch Mischen von Mumps-
Impfstoff mit LTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert. Es
wurde ein Gemisch (20 µl) aus Virusteilchen entsprechend Mumps-
Impfstoff (20 µg) und LTB (5 µg) unter Zugabe von Stabilisatoren
hergestellt. Das Gemisch wurde in eine Flasche abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter
10°C gelagert.
Mumps-Impfstoff mit oder ohne LTB wurde zum zweimaligen Inokulieren
von Mäusen mit 3wöchigen Intervallen verwendet, und
dann wurde die Serum-Antikörperbildung gemessen.
Der gemäß ELISA bestimmte Antikörper-Titer betrug bei der Ver
abreichung von Mumps-Impfstoff alleine 0,023, und bei der Zugabe
von LTB zu dem Impfstoff betrug er <0,074. Die Verstärkung
der Antikörperbildung wurde beobachtet, wenn der Impfstoff
mit LTB verabreicht wurde.
Es wurde eine Präparation aus einem Kombinations-Impfstoff
für Masern, Rubella und Mumps und LTB für die intranasale Ver
abreichung hergestellt, indem der Kombinations-Impfstoff mit
LTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert, vermischt wurde.
Es wurde ein Gemisch (20 µl) aus Virusteilchen entsprechend
Masern-Impfstoff (7 µg), Rubella-Impfstoff (1 µg) und Mumps-
Impfstoff (7 µg) und LTB (5 µg) unter Zugabe von Stabilisatoren
hergestellt, und das Gemisch wurde in eine Flasche abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter
10°C gelagert.
Der Impfstoff mit oder ohne LTB wurde zum zweimaligen Impfen
von Mäusen mit 3wöchigen Intervallen verwendet, und dann wurde
die Serum-Antikörperbildung gemessen.
Der gemäß ELISA bestimmte Antikörper-Titer betrug bei der Ver
abreichung des Impfstoffes alleine 0,18, 0,07 bzw. 0,13 für
Masern, Rubella und Mumps, und bei der Zugabe von LTB zu dem
Impfstoff betrug er 0,34, 0,27 bzw. 0,28. Die Verstärkung der
Antikörperbildung wurde beobachtet, wenn der Impfstoff mit
LTB verabreicht wurde.
Es wurde eine Präparation aus Rota-Impfstoff und LTB für die
orale und intranasale Verabreichung hergestellt durch Ver
mischen von Rota-Impfstoff mit LTB, gelöst in PBS und aseptisch
filtriert. Es wurde ein Gemisch (20 µl) aus Virusteilchen
entsprechend dem Rota-Impfstoff (3,3 µg) und LTB (5 µg)
unter Zugabe von Stabilisatoren hergestellt und in eine Flasche
abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter
10°C gelagert.
Der Rota-Impfstoff mit oder ohne LTB wurde zum zweimaligen
Impfen von Mäusen mit 3wöchigen Intervallen verwendet, und
dann wurde die Serum-Antikörperbildung gemessen.
Der gemäß ELISA bestimmte Antikörper-Titer betrug bei der Ver
abreichung des Impfstoffes alleine 0,063 bei der intranasalen
Verabreichung, und bei der Zugabe von LTB zu dem Impfstoff
betrug er 0,348. Bei der oralen Verabreichung betrug er 0,024
für den Impfstoff alleine
0,177 für den Impfstoff unter Zugabe von LTB bei der oralen
Verabreichung.
Die Verstärkung der Antikörperbildung wurde bei der Verabreichung
des Impfstoffes mit LTB beobachtet.
Eine injizierbare Präparation aus Mycoplasma-Impfstoff und
LTB wurde durch Mischen von Mycoplasma-Impfstoff mit LTB,
gelöst in PBS und aseptisch filtriert, hergestellt. Es wurde
ein Gemisch (1 ml) aus Mycoplasma entsprechend dem Impfstoff
(2,0 × 10¹⁰ CFU) (koloniebildende Einheit) und LTB (10 µg)
unter Zugabe von Stabilisatoren hergestellt. Das Gemisch wurde
in eine Ampulle abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter
10°C gelagert.
Der Impfstoff mit oder ohne LTB wurde zum dreimaligen Impfen
von Küken mit 2wöchigen Intervallen verwendet. Es wurde die
Zahl der Läsionen nach dem Angriff der Mycoplasma-Infektion
beobachtet.
Die Verabreichung von Impfstoff unter Zugabe von LTB zeigte
eine verbesserte Schutzwirkung, verglichen mit der von dem
Impfstoff alleine.
Erläuterung der Zeichnungen:
Fig. 1A∼1D: Zeitverlauf der primären Antikörperbildung
bei der Verabreichung des erfindungsgemäßen Impfstoffes;
und
Fig. 2: Zahl der Infektions-Läsionen in der Lunge
nach der Verabreichung des erfindungsgemäßen Impfstoffes.
Claims (8)
1. Impfstoff-Präparation, dadurch gekennzeichnet,
daß sie als wirksame Komponente ein Toxin oder seine
Subeinheit enthält.
2. Impfstoff-Präparation nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß das Toxin ein Bakterien-
Toxin ist.
3. Impfstoff-Präparation nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß das Bakterien-Toxin Cholera-
Toxin, Staphylokokken-α-Hämolysin, Staphylokokken-δ-Hämolysin,
thermostabiles direktes Vibrio-Hämolysin, Pertussis-Toxin oder
E. coli-wärmelabiles-Toxin ist.
4. Impfstoff-Präparation nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die Subeinheit eine B-Subeinheit
oder ein Teil einer B-Subeinheit ist.
5. Impfstoff-Präparation nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß der Impfstoff ein Influenza-
Impfstoff, ein Pertussis-Impfstoff, ein Japan-Encephalitis-
Impfstoff, ein Kombinations-Impfstoff für Pertussis-, Diphtherie-
und Tetanus-Toxoid, ein Hepatitis-B-Impfstoff, ein Rota-Impfstoff,
ein Masern-Impfstoff, ein Rubella- bzw. Röteln-Impfstoff,
ein Mumps-Impfstoff, ein Kombinations-Impfstoff für
Masern, Rubella und Mumps oder ein Mycoplasma-Impfstoff ist.
6. Impfstoff-Präparation nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß das Mischverhältnis von Impfstoff
und Toxin oder seiner Subeinheit 1 : 0,0001∼1 : 10 000
(Gew./Vol.) beträgt.
7. Impfstoff-Präparation nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß sie als intranasaler Impfstoff
vorliegt.
8. Impfstoff-Präparation nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß sie in injizierbarer Form,
in Sprayform oder in einer für die orale Verabreichung
geeigneten Form vorliegt.
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