DE69113991T2 - Impfstoff. - Google Patents
Impfstoff.Info
- Publication number
- DE69113991T2 DE69113991T2 DE69113991T DE69113991T DE69113991T2 DE 69113991 T2 DE69113991 T2 DE 69113991T2 DE 69113991 T DE69113991 T DE 69113991T DE 69113991 T DE69113991 T DE 69113991T DE 69113991 T2 DE69113991 T2 DE 69113991T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- pertussis
- antigen
- solution
- detoxified
- vaccine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 62
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 claims abstract description 60
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 claims abstract description 17
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 claims abstract description 17
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 67
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 40
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 37
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 34
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 34
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 34
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 26
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 23
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 23
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 19
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 17
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 17
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 claims description 15
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 12
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229940066827 pertussis vaccine Drugs 0.000 claims description 8
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 claims description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 4
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 claims description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 abstract description 26
- 238000003860 storage Methods 0.000 abstract description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 19
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 11
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 9
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 9
- 101710154643 Filamentous hemagglutinin Proteins 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 8
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 5
- 231100000563 toxic property Toxicity 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- -1 Formalin amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 229930184655 PT Toxin Natural products 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 3
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- SGNXVBOIDPPRJJ-PSASIEDQSA-N 1-[(1r,6r)-9-azabicyclo[4.2.1]non-4-en-5-yl]ethanone Chemical compound CC(=O)C1=CCC[C@@H]2CC[C@H]1N2 SGNXVBOIDPPRJJ-PSASIEDQSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- DZTHIGRZJZPRDV-LBPRGKRZSA-N N-acetyl-L-tryptophan Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)C)C(O)=O)=CNC2=C1 DZTHIGRZJZPRDV-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- DZTHIGRZJZPRDV-UHFFFAOYSA-N Nalpha-Acetyltryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C)C(O)=O)=CNC2=C1 DZTHIGRZJZPRDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000003948 anatoxin Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229940116191 n-acetyltryptophan Drugs 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 2
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 2
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCDWFXQBSFUVSP-UHFFFAOYSA-N 2-phenoxyethanol Chemical compound OCCOC1=CC=CC=C1 QCDWFXQBSFUVSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 229940032024 DPT vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011795 OF1 mouse Methods 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229940124832 acellular pertussis vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000004880 explosion Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229960005323 phenoxyethanol Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/099—Bordetella
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K2039/10—Brucella; Bordetella, e.g. Bordetella pertussis; Not used, see subgroups
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren zur Entgiftung eines toxischen Antigens eines ausgewahlten Pathogens oder dessen Überführung in ein Toxoid, wobei ein sicherer, zur Verabreichung an Menschen geeigneter Impfstoff erhalten wird. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Entgiftung eines Pertussis-Toxins und die Verwendung des erhaltenen Toxoids als Bestandteil eines Bordetella pertussis-Impfstoffs.
- Keuchhusten oder Pertussis ist eine stark ansteckende Krankheit, die primär Kinder betrifft. Außer Atembeschwerden kann Keuchhusten eine Nervenschädigung und eine hohe Sterblichkeit bewirken, besonders bei sozioökonomisch benachteiligten Kindern und bei Neugeborenen ohne anti-Pertussis-Antikörper der Mutter. Der ätiologische Wirkstoff von Pertussis ist der gramnegative Kugelbacillus Bordetella pertussis. Es wird vermutet, daß die Bakterien in den Atemtrakt eindringen und einen toxischen Zustand induzieren, der selbst nach dem Verschwinden der Bakterien erhalten bleibt.
- Obwohl die Weltgesundheitsorganisation gegenwärtig die Immunisierung von Kindern zur Verhinderung des Auftretens und der Verbreitung von Pertussis empfielt, sind die negativen Wirkungen verschiedener Impfstofformen ein großes Problem. Die Toxizität von üblichen B. pertussis-Impfstofformulierungen führt zu Nebenwirkungen, die von einer einfachen Rötung bis zu einem neurologischen Dauerschaden und/oder Tod reichen. Die seltenere Verwendung von üblichen B. pertussis-Impfstoffen bewirkte jedoch ein erneutes explosionsartiges Auftreten von Pertussis-Fällen. Der am häufigsten verwendete Impfstoff enthält vollständige B. pertussis-Organismen, die durch eine 30- minütige Behandlung bei 56ºC inaktiviert wurden. Da die Bakterien nicht entgiftet werden, sind alle gegen die erhöhte Temperatur resistenten toxischen Substanzen im Impfstoff enthalten und tragen zum Auftreten von Nebenwirkungen bei. Durch Verabreichung dieses Impfstoffs wird ferner ein breites Antikörperspektrum induziert. Den von derartigen Impfstoffen induzierten Seren fehlt die hohe Spezifität und das hohe Schutzpotential, so daß sie nicht zur präventiven oder therapeutischen Behandlung und als Diagnostika überhaupt nicht verwendet werden können.
- Bei den wichtigsten Verfahren werden als Impfstoff verwendete Pathogene durch eine Behandlung mit Wärme und chemischen Substanzen wie Formaldehyd oder Glutaraldehyd entgiftet. Unterschiede bei der Züchtung des Kulturüberstandes von B. pertussis bewirken jedoch eine Veränderung der Endzusammensetzung des Mikroorganismus, und die Inaktivierungsmittel Glutaraldehyd und Formaldehyd bewirken gelegentlich eine Aggregation von Materialien, die sich bei der Aufbewahrung in aktive toxische Substanzen umwandeln können.
- US-Patent Nr. 3,983,229 von Relyveld betrifft beispielsweise ein Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen, wobei ein Virus ein bis drei Stunden mit Glutaraldehyd in einer Konzentration von 0,00131 M bis 0,0526 M in Kontakt gebracht wird. Dieses Verfahren wird bei Temperaturen von 35ºC bis 40ºC durchgeführt, und die Reaktion kann durch Zugabe eines Wirkstoffs, der Glutaraldehyd blockieren oder mit Glutaraldehyd im freien Zustand reagieren kann, beendet werden. Das Blockierungsmittel kann eine Aminosäure oder ein anorganisches Salz sein. US-Patent Nr. 4,070,454 von Relyveld offenbart ein weiteres Verfahren zur Herstellung eines viralen Impfstoffs, wobei das Virus 1,5 Stunden bis etwa 5 Tage mit Glutaraldehyd in einer Konzentration von 0,00263 M inaktiviert wird.
- US-Patent Nr. 4,075,321 offenbart ferner eine Verbesserung dieses Verfahrens zur Inaktivierung bakterieller Toxine, indem man vollständige Bakterien mit Glutaraldehyd in einer Konzentration von etwa 0,00131 bis 0,0526 M reagieren läßt.
- Gupta, J. Biol. Stand. 15 (1987), 159-164, vergleicht Impfstoffe aus vollständigen Zellen, die durch die klassische Hitzebehandlung erhalten wurden, mit den Impfstoffen, die durch die Glutaraldehyd-Entgiftungsreaktion des Relyveld-Verfahrens erhalten wurden. Beide Impfstoffe verlieren nach einer Aufbewahrung von 30 Tagen bei 35ºC deutlich 30 bis 50 % ihrer Potenz. Diese Präparationen weisen ferner im Vergleich zu neueren azellulären oder zusammengesetzten Impfstoffen wichtige Nachteile auf, z. B. eine niedrige Immunogenität und ernste Nebenwirkungen aufgrund einer Resttoxizität nach der Verabreichung. Diese Impfstoffe lieferten anscheinend einen viel geringeren Schutz, als die aus virulenten Stämmen hergestellten. Vgl. Wardlaw et al., J. Med. Micro. Biol. 9 (1976), 89-100.
- Zur Vermeidung der durch Impfstoffe aus vollständigen Viren verursachten Nebenwirkungen wurden in der Forschung die in azellulären und zusammengesetzten Impfstoffen verwendeten toxischen Bestandteile der B. pertussis-Bakterien untersucht. Ein wichtiges B. pertussis-Antigen ist das Pertussis-Toxin (PT), ein Protein-Exotoxin, das zur Pathogenese von Keuchhusten wesentlich beiträgt und das vermutlich das wichtigste Schutzantigen von B. pertussis ist [A. A. Weiss et al., Ann. Rev. Microbiol. 40 (1986), 661]. PT induziert, allein oder zusammen mit anderen antigenen Faktoren dieses Organismus, verschiedene ernste biopathologische Veränderungen selbst in einer so geringen Menge, daß es die Verabreichung von B. pertussis-Zellen oder -Zellextrakten als Impfstoffbestandteile in zur Bereitstellung eines guten Schutzniveaus ausreichenden Mengen unmöglich macht. Daher müssen B. pertussis-Zellen oder -Zellextrakte vor ihrer Verwendung in einer Impfstoffpräparafion entgiftet werden.
- Zur Entgiftung von PT (oder eines PT enthaltenden Gemisches eines azellulären oder zusammengesetzten Impfstoffs) wurden drei Hauptverfahren beschrieben. In der europäischen Patentanmeldung EP-A-0 121 249 wird die Hämagglutininfraktion, die aus einem B. pertussis-Kulturüberstand gereinigt wird und PT enthält, in Gegenwart einer Aminosäure mit Formalin entgiftet und anschließend zur Formulierung eines Impfstoffs verwendet. Die Immunogenität und der erreichte Entgiftungsgrad sind ausgezeichnet, die Toxizität stellt sich nach einer 30tägigen Aufbewahrung der Impfstoffpräparation bei 37ºC jedoch partiell wieder ein.
- Munoz, Infect. Immunol. 32 (1981), 243-250, verwendet ein zum Verfahren von Relyveld analoges Entgiftungsverfahren für PT, das jedoch in Gegenwart von Salz durchgeführt wird. Nach einer zweistündigen Inkubation bei Raumtemperatur in Gegenwart von 0,05 % Glutaraldehyd, einer anschließenden Zugabe von Lysin bis zu 0,02 M, einer weiteren zweistündigen Inkubation und einer abschließenden Dialyse, wurde ein Anatoxin mit hoher Immunogenität produziert. Dieses Anatoxin war stabil. Es wurde nach einer 30tägigen Aufbewahrung bei 37ºC nicht wieder toxisch. Der Grad der Entgiftung war jedoch niedriger als beim Formalin/Aminosäure-Verfahren.
- In der europäischen Patentanmeldung EP-A-0 202 947 werden Carbodiimide als effiziente Reagenzien zur Entgiftung von PT und PT enthaltenden B. pertussis- Fraktionen offenbart. Die erhaltenen Toxoide sind jedoch bei einer Aufbewahrung von 30 Tagen bei 37ºC nicht stabil.
- Es gibt daher im Stand der Technik weiter einen Bedarf an wirksamen und sicheren Impfstoffen gegen Keuchhusten, die ihre Aktivität behalten und während der Aufbewahrung ihre Toxizität nicht wiedergewinnen.
- Ein erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft die Bereitstellung eines Verfahrens zur Entgiftung eines ausgewählten toxischen Antigens aus einem pathogenen Mikroorganismus. Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt die Schritte der partiellen Entgiftung des ausgewählten Toxins oder einer das toxische Antigen enthaltenden Zusammensetzung mit Glutaraldehyd, wonach das partiell entgiftete Toxin in Gegenwart ausgewahlter Aminosauren mit Formalin zur Reaktion gebracht wird. Das erhaltene Toxoid oder die das Toxoid enthaltende Präparation ist gegen eine Rückkehr der Toxizität unter dem Einfluß von Temperaturen oberhalb von etwa 23ºC, d. h. Raumtemperatur, stabil.
- Ein exemplarisches Antigen, das die Verwendung dieses Verfahrens erläutern soll, ist das B. pertussis-Toxin. Beispiele für weitere im erfindungsgemäßen Verfahren verwendbare Toxine sind das Tetanus- oder Diphtherie-Toxin. Dieses Verfahren kann zur Inaktivierung des Toxins verwendet werden, z. B. des Pertussis-Toxins (PT), das als Hauptbestandteil oder nur als Verunreinigung in Präparationen enthalten ist, die antigene Faktoren enthalten, die per se nicht toxisch sind, z. B. die anderen B. pertussis-Antigene FHA, 69K und Agglutinogene. Das erfindungsgemäße Verfahren kann die Toxizität des ausgewählten Toxins, allein oder in Zusammensetzungen mit anderen antigenen Faktoren des gleichen Pathogens, auf für Impfstofformulierungen verträgliche Mengen verringern.
- Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft die Bereitstellung eines durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen entgifteten Pertussis-Toxins, das gegen eine Rückkehr zur Toxizität bei Temperaturen von 23ºC oder darüber stabil ist. Dieses erfindungsgemäße Toxoid ist ferner durch einen hohen Grad an Immunogenität gekennzeichnet, wie es durch die Fähigkeit des Toxoids zur Induzierung von neutralisierenden Antikörpern gezeigt wird. Die Gegenwart von neutralisierenden Antikörpern wird durch spezifische Tests nachgewiesen, d. h., durch die Histamin-Sensibilisierung von Mäusen oder Zusammenlagerung von Ovarialzellen des chinesischen Hamsters. Die erfindungsgemäßen Toxoide sind stabil genug, um ihre Immunogenität mehr als einen Monat unter nachteiligen Aufbewahrungsbedingungen bei 37ºC zu erhalten. Diese Toxoide sind nützliche Ausgangsmaterialien für die Zusammenstellung von B. pertussis- Impfstoffen von hoher Qualität und können außerdem für gemischte Impfstoffe oder zur Herstellung von Hyperimmunseren verwendet werden.
- Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft die Bereitstellung von Zusammensetzungen von antigenen Faktoren von B. pertussis, z. B. filamentöses Hämagglutinin (FHA), den 69K-Faktor oder andere B. pertussis-Agglutinine, die zur Herstellung von Impfstoffen für den Organismus verwendet werden können und mindestens Spurenmengen von entgiftetem PT-Toxin, wie vorstehend beschrieben, enthalten.
- Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft die Bereitstellung von Impfstoffen gegen eine B. pertussis-Infektion, die bei Temperaturen von bis zu 56ºC stabil bleiben und keine speziellen Transportbedingungen bei niedrigen Temperaturen erfordern. Die erfindungsgemäßen Impfstoffe sind durch eine einfache Handhabung und die Möglichkeit der Aufbewahrung bei nicht optimalen Bedingungen gekennzeichnet. Die Impfstoffe, die unter Verwendung der erfindungsgemaßen Toxoide entwickelt werden, ermöglichen Impfstoffprogramme, die in isolierten oder unterentwickelten Regionen durchgeführt werden sollen, in denen üblicherweise zur Erhaltung von anderen entgifteten Impfstoffen erforderliche Aufbewahrungsbedingungen bei niedrigen Temperaturen nicht gewährleistet werden können und die klimatischen Bedingungen extrem sind. Selbst bei derartigen Bedingungen sind die erfindungsgemäßen Impfstoffe stabil und von hoher Qualität.
- Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft ein Verfahren zur Herstellung von mono- oder multifunktionellen Impfstoffen, die eine wirksame Menge des erfindungsgemaßen Toxoids enthalten. Weitere erfindungsgemäße Gesichtspunkte und Vorteile sind nachstehend genauer beschrieben.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Entgiftung ausgewählter pathogener toxischer Antigene bereit, z. B. des B. pertussis-Toxins, zur Verwendung in Impfstofformulierungen, verbesserten Impfstofformulierungen, die das ausgewählte Toxoid enthalten, und Präparationen, die das in ein Toxoid überführte (entgiftete) Antigen enthalten.
- Es wird daher erwartet, daß das erfindungsgemäße Verfahren zahlreiche toxische Antigene von einigen pathogenen Mikroorganismen, für die Impfstoffe wünschenswert sind, z. B. das Tetanus- oder Diphtherie-Toxin, entgiften kann. Zur einfacheren Beschreibung und Versuchsdurchführung wird hier jedoch das Pertussis-Toxin vom pathogenen Bordetella pertussis zur Veranschaulichung der Effizienz dieses Entgiftungsverfahrens verwendet.
- Kurz gesagt wird das erfindungsgemaße entgiftete PT durch partielle Entgiftung des Toxins unter Verwendung von Glutaraldehyd als Reagens und anschließender Reaktion des PT mit Formaldehyd in Gegenwart von Aminosäuren produziert.
- PT-Extrakte werden erfindungsgemäß aus der Fermentationsbrühe oder Kultur von Bordetella pertussis erhalten. Mehrere B. pertussis-Stämme zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren werden beschrieben. Diese sind aus kommerziellen Sammlungen, beispielsweise der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, leicht erhältlich. Alle diese Stämme können in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, sofern sie den gewünschten antigenen Faktor PT in geeigneten Mengen in einem flüssigen Kulturmedium produzieren können.
- Beispiele für Stämme, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind, ohne Beschränkung darauf, B. pertussis Phase I, B. pertussis Phase II, B. pertussis Phase I CS, B. pertussis Tohama, B. pertussis-Stamm 185-30, B. pertussis-Stamm 18-323, B. pertussis-Stamm 134, B. pertussis-Stamm 509, B. pertussis- Stamm "Wellcome 28" und B. pertussis-Stamm 165 vom "Office of Biologics". Ein bevorzugter Stamm zur erfindungsgemäßen Verwendung ist B. pertussis Phase I, Tohama, der vom Institute of Fermentation, Osaka, Japan, unter der Hinterlegungsnummer IFO- 14073, erhältlich ist.
- Zur erfindungsgemäßen Verwendung kann der ausgewählte B. pertussis- Stamm durch mehrere dem Fachmann bekannte Verfahren gezüchtet werden. Es sind mehrere Züchtungsverfahren bekannt, in denen unterschiedliche Züchtungsschritte und flüssige oder feste Medien verwendet werden, die von der Menge und der Herkunft oder dem Konservierungsverfahren der Saatkultur abhängen. Es sind jedoch alle bekannten Verfahren, die ein Inokulum in einer zur Großproduktion verwendbaren, üblicherweise geeigneten Menge liefern, zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet.
- Ein geeignetes Medium zur Züchtung von B. pertussis zur Gewinnung eines Inokulums kann vom Fachmann gewählt werden. Dazu gehören, jedoch ohne Beschränkung darauf, "Gengou"-Medium [EP-B1-0 077 646; Medien, die von N. Andorn et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 28 (1988), 356-360, beschrieben werden und unter den dort zitierten Verweisen; "Verway"-Medium [US-Patent 4,784,589]; synthetisches Medium B2 [P. Van Hemert, Proq. Indust. Microbiol., (M. J. Bull, Hrsg.), Bd. 13, S. 151, Elsevier Sci., Amsterdam (1977)] oder beschriebene Modifikationen davon.
- Zur Züchtung der B. pertussis-Kultur, die das erfindungsgemäße Ausgangsmaterial ist, wird ein Inokulum einem geeigneten Flüssigmedium zugesetzt und die Fermentation unter Verwendung von üblichen Fermentationsverfahren und im Stand der Technik bekannten Fermentertypen durchgeführt. Dem Fachmann ist bekannt, daß je nach Wahl einer bestimmten Kombination aus einer üblichen Fermenterart, einem Fermentationsmedium, Verfahren und den Parametern unterschiedliche Ergebnisse erhalten werden. Zur erfindungsgemäßen Verwendung werden Kombinationen bevorzugt, die zur Verwendung in der Großproduktion geeignet sind. Beispiele für derartige Kombinationen von Verfahren, Fermentertypen und Medien sind in der europäischen Patentanmeldung EP-A-0 077 646, der europäischen Patentanmeldung EP-A-0 121 249, der europäischen Patentanmeldung EP-A-0 239 504, von Andorn et al., Sato et al. (1983), Sekura et al. und Svoboda et al., alle vorstehend zitiert, erläutert. Die Verfahren, die in der europäischen Patentanmeldung EP-A-0 121 249, von Andorn et al., vorstehend zitiert, und in der europaischen Patentanmeldung EP-A-0 239 504 beschrieben sind, werden am meisten bevorzugt.
- Zur Durchführung dieser Erfindung wird nach Fermentationsende die B. pertussis-Fermentationsbrühe zur Vermeidung einer Denaturierung und/oder eines Abbaus des gewünschten PT-Faktors unter sterilen Bedingungen gehalten.
- In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsförm wird die Brühe auf 1 bis 10ºC abgekühlt und bei dieser Temperatur gehalten. Der pH-Wert wird auf weniger als 7,0 eingestellt und wird mit Phosphor- oder Essigsäure vorzugsweise auf einen Bereich von etwa 6,0 bis 6,4 eingestellt. Gegebenenfalls wird der Brühe ein Konservierungsmittel zugesetzt, z. B. Natriumthimerosal zu einer Endkonzentration von bis zu 0,2 g/l oder 2-Phenoxyethanol zu einer Endkonzentration von 0,5 bis 1 %. Gegebenenfalls kann auch den in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Pufferlösungen ein Konservierungsmittel zugesetzt werden.
- Als optionaler erster Schritt im erfindungsgemäßen Verfahren kann die Fermentationsbrühe zur Entfernung größerer Partikel und Pellets durch ein Filter geleitet werden, vorrausgesetzt, daß ein Kontakt mit möglichen Verunreinigungen aus der Umgebung vermieden wird. Die erhaltene Brühe kann den nachstehend beschriebenen Verfahrensschritten unterzogen werden. In einer anderen Ausführungsform kann eine stärker gereinigte, PT enthaltende Lösung durch die nachstehend beschriebenen Schritte behandelt werden. Zum besseren Verständnis wird in dem Verfahren der Begriff "Lösung eines antigenen Faktors" verwendet, die als Präparation definiert ist, die PT und gegebenenfalls weitere antigene Faktoren von B. pertussis, beispielsweise FHA, enthält. Diese Präparation kann eine Fermentationsbrühe einschließen, die primär PT enthält, oder eine gereinigte Lösung, die primär andere B. pertussis-Antigene mit nur verunreinigenden PT-Mengen enthält.
- Die Lösung des antigenen Faktors wird erfmdungsgemaß auf eine Toxinkonzentration von etwa 0,02 bis 2 mg/ml, vorzugsweise 0, 1 bis 0,25 mg/ml, verdünnt, wobei ein wäßriges Medium, das im Bereich des Neutralpunktes, d. h., bei einem pH-Wert von 5 bis etwa 9, gepuffert ist, verwendet wird. Der pH-Bereich ist vorzugsweise 7,5 bis 7,7. Ein bevorzugter wäßriger Puffer zur Verdünnung ist phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS). Ein Puffer enthält beispielsweise 50 mM Phosphat und 0,5 M NaCl. Dieser wird hier nachstehend als Puffer D bezeichnet.
- Nach der Verdünnung kann die Lösung gegebenenfalls durch Filtration, z. B. durch eine sterile 0,22 nm-Membran, sterilisiert werden. Die Lösung des antigenen Faktors wird mit 0,03 bis 0,07 % einer wäßrigen 25 Gew.-% Glutaraldehydlösung behandelt. Stärker bevorzugt wird eine Verdünnung, die 0,55 % der wäßrigen 25 Gew.-% Glutaraldehydlösung in diesem Behandlungsschritt verwendet. Dazu ist in diesem Schritt das Glutaraldehyd mit 0,55 Gew. % vorzugsweise im vorstehend beschriebenen Puffer D vorhanden.
- Die Lösung des antigenen Faktors wird etwa 1 bis 4 Stunden mit der Glutaraldehydlösung behandelt. Stärker bevorzugt dauert der Behandlungsschritt mit Glutaraldehyd 1 bis 3 Stunden, wobei gegenwärtig 2 Stunden bevorzugt sind. Die Temperatur des Glutaraldehydbehandlungsschritts ist vorzugsweise Umgebungstemperatur von etwa 20 bis 25ºC. Gegebenenfalls können kürzere Reaktionszeiten in Kombination mit höheren Temperaturen oder längere Zeiten mit niedrigeren Temperaturen verwendet werden. Die Inaktivierung kann ferner bei unterschiedlichen Reaktionstemperaturen und passend modifizierten Kontaktzeiten erhalten werden, beispielsweise kann eine Temperatur von 10ºC 2 bis 8 Stunden, stärker bevorzugt 4 Stunden, verwendet werden. Eine Temperatur von 30ºC kann 30 Minuten bis 2 Stunden, stärker bevorzugt 1 Stunde, verwendet werden. Alternativ kann eine Temperatur von 37ºC 15 Minuten bis 1 Stunde, stärker bevorzugt 30 Minuten, verwendet werden. Dieser Behandlungsschritt mit Glutaraldehyd kann eine partielle Entgiftung des antigenen Faktors je nach Reaktionszeit und Konzentration der Reagenzien bewirken. Eine Glutaraldehydbehandlung mit der vorstehend beschriebenen Konzentration für 2 Stunden bei 20 bis 25ºC liefert beispielsweise eine Erniedrigung der toxischen Aktivität auf 0,003 %. Die weiteren Behandlungsbedingungen können eine größere Verringerung der toxischen Aktivität bewirken.
- Nach diesem Entgiftungsschritt wird mindestens eine ausgewählte Aminosäure dem partiell entgifteten antigenen Faktor in der Lösung zugesetzt. Die Aminosäure wird zu einer Endkonzentration von etwa 0,05 bis 2 Gew.-% zugesetzt. Eine bevorzugte Konzentration der Aminosäure ist 0,8 Gew.-%.
- Beispiele für ausgewählte Aminosäuren zur Verwendung in diesem Schritt sind Tryptophan, Glycin, Lysin und Derivate davon oder andere, beispielsweise in Proteinhydrolysaten, vorhandene Aminosäuren. Die Aminosäuren sind vorzugsweise Tryptophan, Lysin und Glycin oder Derivate davon. Die Aminosäuren werden vorzugsweise in Lösung, z. B. im vorstehend beschriebenen Puffer D, hergestellt und können der Lösung des antigenen Faktors getrennt oder als Gemisch von zwei oder mehr Aminosäuren zugesetzt werden. In einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform werden drei Lösungen in Puffer D hergestellt, die 10 % (Gew./Vol.) Tween 80-Lösung, 33 ml 57,4 mM N-Acetyltryptophan und 11 ml 2,2 M Glycin enthalten. Diese drei Lösungen werden durch Filtration durch eine sterile 0,22 nm Membran sterilisiert.
- Das Formalin wird der Lösung des antigenen Faktors und der Aminosäuren in einer Konzentration von 1 bis 10 Gew.-% und stärker bevorzugt 2 bis 4 Gew.-% zugesetzt. Das Formalin kann auch im Puffer D oder einem ähnlichen Puffer hergestellt werden. Das Formalin wird der Lösung aus antigenem Faktor/Aminosäure in etwa äquivalenten Mengen über einen Zeitraum von 3 bis 10 Tagen, stärker bevorzugt 7 Tagen, zugesetzt. Während der Formalinbehandlung werden die Toxine bei einer Temperatur von 37 bis 45ºC gehalten. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Toxine während dieses Schritts bei 39 bis 41ºC gehalten. Die Toxine werden während dieses Zeitraums vorzugsweise auch periodisch geschüttelt und unter sterilen Bedingungen gehalten. Am Ende des Behandlungsschritts mit Formalin/Aminosäure kann die Lösung aus entgiftetem B. pertussis-Toxoid bei niedrigen Temperaturen, vorzugsweise über Nacht bei 2 bis 6ºC, aufbewahrt werden. Alle während des Entgiftungsverfahrens gebildeten Aggregate werden anschließend zerstört, indem das Toxoid mit Ultraschall behandelt wird. Die Lösung kann beispielsweise mit einer Frequenz von etwa 16 bis 18 KHz mit einer Leistung von bis zu 1 000 Watt über einen Zeitraum von 1 bis 30 Sekunden mit Ultraschall behandelt werden. Der Ultraschall weist vorzugsweise eine Frequenz von etwa 20 KHz auf. Der Leistungsbereich kann stärker bevorzugt zwischen 600 und 800 Watt liegen. Die Dauer der Ultraschallbehandlung ist vorzugsweise zwischen 5 und 15 Sekunden. Die erhaltene Lösung wird vorzugsweise durch eine 50 nni Membran filtriert.
- Als Endschritt im erfindungsgemäßen Entgiftungsverfahren wird das inkubierte Produkt gegen PBS in üblicher Weise dialysiert, um überschüssige Reagenzien zu entfernen. Der Dialysepuffer wird so oft gewechselt und die Dialyse so lange fortgesetzt, bis die Konzentration des verbliebenen Formalins unter 200 ppm ist. Stärker bevorzugt wird die Formalinkonzentration bei etwa 20 ppm gehalten. Diese Konzentration reicht aus, um die Konzentration der anderen im Inaktivierungsverfahren verwendeten Mittel auf nicht-nachweisbare oder unbedeutende Konzentrationen zu verringern.
- Das erhaltene gereinigte B. pertussis-Toxin oder ein Gemisch aus anderen antigenen Faktoren von B. pertussis, die das durch das erfindungsgemäße Verfahren entgiftete PT enthalten, ist durch vollständige und irreversible Inaktivierung der Toxizität gekennzeichnet. Diese Stabilität gegen eine Reversion zu einer toxischen Form wird selbst unter Aufbewahrungsbedingungen, bei denen die Temperatur oberhalb der Raumtemperatur, etwa 23ºC, ist, beibehalten. Diese Stabilität wurde in experimentellen Tests über mindestens eine Woche bei 56ºC und mindestens vier Wochen bei 37ºC gezeigt. Ferner wird angenommen, daß die erfindungsgemäßen entgifteten Antigene mehr als zwei Jahre bei niedrigen Aufbewahrungstemperaturen von 4 bis 8ºC stabil bleiben. Dieses erhaltene Toxoid bzw. der entgiftete antigene Faktor können anschließend als Bestandteil in B. pertussis-Antigenpräparationen verwendet werden, die für eine spätere Präparation von Impfstoffen oder in Impfstofformulierungen verwendet werden können.
- Daher stellt diese Erfindung auch Impfstoffe bereit, die eine eine schützende Immunantwort induzierende Menge der erfindungsgemäßen Toxoide oder entgifteten antigenen Faktoren enthalten, d. h., es werden ausreichende Mengen des entgifteten PT oder der anderen antigenen Faktoren verabreicht, um eine schützende Antikörperantwort gegen eine B. pertussis-Infektion ohne ernste Nebenwirkungen zu induzieren. Derartige Impfstoffe können durch übliche Verfahren hergestellt werden. Ein Impfstoff zur Stimulierung eines Schutzes gegen eine B. pertussis-Infektion in Menschen kann beispielsweise vorstehend beschriebene stabile Toxoide und entgiftete antigene Faktoren und einen geeigneten üblichen Träger enthalten. Ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Toxoide oder entgifteten antigenen Faktoren können in einer zur direkten Verwendung auf einen physiologischen pH-Wert gepufferten wäßrigen Lösung enthalten sein. Alternativ können die entgifteten Antigene mit einem üblichen Adjuvans, beispielsweise Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat, vermischt oder daran adsorbiert sein. Ein derartiges Toxoid von B. pertussis kann ferner mit anderen Immunogenen kombiniert werden, um eine Kombination oder multifunktionale Impfstoffe, die einen Schutz gegen mehr als ein Pathogen induzieren können, herzustellen. Vgl. z. B. "New Trends and Developments in Vaccines", Voller et al., University Park Press, Baltimore, MD (1978).
- Derartige Impfstoffe können auf einem geeigneten Weg, z. B. subkutan, intravenös oder intramuskulär, verabreicht werden. Die Menge des ausgewählten erfindungsgemäßen Toxoids, die in jeder Impfstoffdosis enthalten ist, wird durch den behandelnden Arzt unter Berücksichtigung des Alters, Gewichts, Geschlechts, allgemeinen physischen Zustands etc. des Patienten ausgewählt. Die Menge, die zur Induzierung einer schützenden Immunantwort im Patienten ohne signifikante Nebenwirkungen erforderlich ist, kann je nach verwendetem Immunogen und eines gegebenenfalls vorhandenen Adjuvans variieren. Üblicherweise wird für das Toxoid bzw. den antigenen Faktor eine Dosis aus jeweils 2 bis 50 u/gs Antigen, vorzugsweise 5 bis 25 u/gs, für ausreichend gehalten. Nach anfänglichen Dosen können gegebenenfalls wiederholte Auffrischungsimpfungen erfolgen. Die nachstehend beschriebenen Beispiele erläutern die Verfahren zur Herstellung eines exemplarischen erfindungsgemäßen Toxoids und Bewertungen ihrer Immunogenität und Resistenz gegen eine Reversion zur Toxizität während der Aufbewahrung. Eine exemplarische Impfstoffpräparation, die das erfindungsgemäße Toxoid enthält, wird ebenfalls erläutert.
- Das B. pertussis-Toxin wurde, wie in der europäischen Patentanmeldung EP- A-0 352 250, die hier durch Bezugnahme mit eingeschlossen ist, beschrieben, aus den Fermenterkulturen extrahiert und gereinigt. Ein Liter des gereinigten PT-Toxins wurde zunächst bei Raumtemperatur, z. B. 25ºC, mit 100 ml einer in Puffer D hergestellten 0,55 % (Gew./Vol.) Glutaraldehydlösung behandelt. Die Lösung wurde zu einer Proteinendkonzentration von 0,2 mg/ml im vorstehend beschriebenen Puffer D bei einem neutralen pH-Wert verdünnt, sterilisiert und durch eine sterile 0,22 nm-Membran filtriert. Der Behandlungsschritt mit Glutaraldehyd dauert 2 Stunden. Anschließend wurden 4,4 ml 10 % (Gew./Vol.) Tween 80-Lösung, 33 ml 57,4 mM N- Acetyltryptophan und 11 ml 2,2 M Glycin zugesetzt. Diese 3 Lösungen wurden in D- Puffer hergestellt und durch Filtration durch eine sterile 0,22 nm-Membran sterilisiert. Eine 3,7 % (Gew./Vol.) Formalinlösung in D-Puffer wurde anschließend in 3 Portionen gemäß dem nachstehenden Schema zugesetzt, wobei am ersten Tag 33 ml, am zweiten Tag 33 ml und am dritten Tag 22 ml Formalin zugesetzt wurden. Die Formalin- Endkonzentration betrug 0,26 % (Gew./Vol.). Während der 7 Tage dauernden Formalinbehandlung wurde das PT-Toxin bei 40ºC ± 1ºC unter Schütteln und sterilen Bedingungen gehalten. Am Ende des Verfahrens wurde die entgiftete PT-Stammlösung vor der Ultraschallbehandlung über Nacht bei 2 bis 6ºC aufbewahrt. Die Lösung wurde mit Ultraschall behandelt und die erhaltene Antigenlösung durch eine 50 nm-Sieb filtriert.
- Die Toxoidpräparation von Beispiel 1 wird mit Produkten verglichen, die nur durch Entgiftung mit Glutaraldehyd, nur mit Formalin und Aminosäuren und mit Glutaraldehyd und Formalin/Aminosäuren, wie hier beschrieben, hergestellt wurden, um die Vorteile der erfindungsgemäßen Produkte und Verfahren aufzuzeigen.
- Eine Untersuchung der verbliebenen Toxizität der Toxoide wurde durchgeführt, nachdem jede Probe 1 Monat bei 4ºC oder 37ºC aufbewahrt worden war. Der Test schloß eine Untersuchung der Morphologie der Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO) ein, in der gegen aktives PT ausgesetzte Zellen Cluster bilden, die vom Fachmann leicht von normal wachsenden Zellen unterschieden werden können. Vgl. z. B. Gillenius et al., J. Biol. Stand. 13 (1985), 61-66. Der Test wird durchgeführt, indem eine Verdünnungsreihe des zu untersuchenden Toxoids oder entgifteten antigenen Faktors mit einer Suspension von 2 x 10&sup4; CHO-Zellen in 200 ul Kulturbrühe in Mikrotiterplatten vermischt wird, wobei die Zellen absitzen und 2 Tage bei 37ºC wachsen können. Nach Inkubationsende werden die Cluster durch eine mikroskopische Untersuchung gezählt. Die Empfindlichkeit dieses Tests erlaubt einen Nachweis bis etwa 100 Picogramm an aktivem Toxin.
- Die nachstehend in Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die Behandlung mit Formalin/Aminosäuren allein eine vollständige Inaktivierung bewirkt, die jedoch instabil ist. Nach 4 Wochen bei 37ºC wird wieder eine Toxizität festgestellt. Eine Glutaraldehydbehandlung allein liefert eine unvollständige, jedoch stabile Inaktivierung. Durch das erfindungsgemäße Verfahren, das Glutaraldehyd- und Formalin/Aminosäure-Behandlungen umfaßt, wird sowohl eine vollständige als auch stabile Inaktivierung erhalten. Tabelle 1 Toxische Eigenschaften des behandelten B. pertussis-Toxins Test der Morphologie von CHO-Zellen Antigenpräparation Tage (1) Formalin-Aminosäuren (2) Glutaraldehyd
- * Entspricht der Nachweisgrenze des Tests. 1 CPU (zytopathische Einheit) ist die kleinste Antigendosis, die eine Veränderung der Morphologie bei allen Zellen induziert. Bei nativem Toxin entspricht 1 CPU einer Konzentration von etwa 3 ng/ml.
- Die Untersuchung schloß ferner einen Histamin-Sensibilisierungstest in Mäusen mit einem an Aluminiumhydroxid adsorbierten Impfstoffen. Gruppen von 10 Mäusen (Swiss OF1) wurden eine Dosis Impfstoff, der 6 ug Pertussis-Toxoid und 25 ug behandeltes FHA enthielt, intravenös inokuliert. Nach 4 Tagen wurde den Mäusen 1 mg Histamin in gepufferter Kochsalzlösung intraperitoneal verabreicht. Zwei Stunden danach wurde die Sterblichkeit in jeder Gruppe aufgezeichnet. Vgl. z. B. Munoz et al., Infect. Immunol. 33 (1981), 820-826. Die Empfindlichkeit des Histamintests erlaubt den Nachweis bis etwa 30 ng aktives Toxin/Maus.
- Die Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle 2 dargestellt und zeigen wie der CHO-Test, daß die Formalin/Aminosäurebehandlung eine vollständige, jedoch reversible Inaktivierung nach einer einmonatigen Inkubation des Impfstoffs bei 37ºC lieferte. Durch diesen Test konnte jedoch kein Nachweis einer Toxizität oder Reversion zur Toxizität in sowohl den mit Glutaraldehyd als auch mit Glutaraldehyd und Formalin/Aminosäuren behandelten Präparationen erbracht werden. Dieses Ergebnis widerspricht nicht den CHO-Testergebnissen, da der Histamin-Nachimmunisierungstest weniger empfindlich als der CHO-Test ist und nicht die verbliebene Toxizität in Glutaraldehyd-behandelten Proben nachweist. Tabelle 2 Toxische Eigenschaften von adsorbiertem B. pertussis Impfstoffpräparationen Histamin-Sensibllisierungstest in Mäusen Sterblichkeit Antigenpräparation Tage (1) Formalin-Aminosäuren (2) Glutaraldehyd
- Die Toxoid-Präparationen, die nur durch Inaktivierung durch eine Formalin/Aminosäure-Behandlung, nur durch Glutaraldehyd-Behandlung oder durch Behandlung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten wurden, wurden in einem Enzyminimuntest unter Verwendung eines spezifischen anti-PT-Kaninchen-Antikörpers getestet. Dieser Antikörper wurde durch Immunisierung von Kaninchen mit durch Formalin/Aminosäuren inaktiviertem Toxoid erhalten.
- Dieser Antikörper wurde an Biotin konjugiert, um mit einem Streptavidin:Peroxidase-Reagens durch Messung der Absorption bei 490 nm gebundene Antikörper nachweisen zu können.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Sie zeigen, daß das native Toxin am besten erkannt wird. Das nur durch Glutaraldehyd-Inaktivierung hergestellte Toxoid zeigt die geringste Reaktivität. Die durch Formalin/Aminosäure-Behandlung oder Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Toxoide zeigen eine mittlere Reaktivität. Tabelle 3 Antigene Eigenschaften des entgifteten PT bei der Reaktion mit Kaninchen-anti-PT Antigenpräparation Natives Toxin Formalin/Aminosäuren Glutaraldehyd
- Gruppen von 12 Mäusen (BALB/c) wurden mit 2 ug der Toxoid- Präparationen, die zweimal im Abstand von 7 Tagen verabreicht worden waren, immunisiert. 14 Tage nach der zweiten Injektion wurde ihnen ein hypervirulenter B. pertussis-Stamm [(18-323 Ac+); vgl. z. B. Brezin et al., FEMS Microbiol. Lett. 42 (1987), 75-80)] intranasal zur Untersuchung der Schutzwirkung verabreicht. Die Sterblichkeit wurde 6 Tage nach dieser Verabreichung ermittelt.
- Die nachstehend in Tabelle 4 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß das erfindungsgemäße Verfahren ein B. pertussis-Toxoid mit der besten Schutzwirkung liefert. Tabelle 4 Schutzwirkung des entgifteten PT in Mäusen Antigenpräparation Zahl der getöteten Tiere Keine Formalin/Aminosäuren Glutaraldehyd
- Zur Formulierung von Impfstoffen dürfen die B. pertussis-Antigene keine toxischen Eigenschaften aufweisen, während die immunologischen Eigenschaften ausreichend erhalten bleiben müssen. Dieses Ziel wird durch Entgiftung des B. pertussis- Toxins und/oder durch eine ähnliche Behandlung von anderen Antigenen, die üblicherweise verunreinigende Mengen des PT-Toxins enthalten, durchgeführt. Eine Behandlung mit Glutaraldehyd, wie im US-Patent Nr. 4,075,321 offenbart, eine unvollständige Inaktivierung. Eine Behandlung nur mit Formalin, wie in der europäischen Patentanmeldung EP-A-0 121 249 beschrieben, bewirkt eine vollständige, allerdings partiell reversible Inaktivierung und eine bleibende Immunogenität. Die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, z. B. eine Behandlung der PT enthaltenden Lösung mit Glutaraldehyd und Formalin/Aminosäuren, wie hier beschrieben, bewirkt jedoch überraschenderweise sowohl eine vollständige als auch irreversible Inaktivierung. Die erhaltene Lösung ist ferner durch eine bleibende Immunogenität gekennzeichnet. Somit sind die erfindungsgemäßen Produkte und Verfahren wertvoll, da sie einen Beitrag zur Sicherheit und Immunogenität der diese Antigene enthaltenden B. pertussis-Impfstoffe leisten.
- Die Impfstoffpräparation, die durch Inaktivierung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, wie in Beispiel 1 beschrieben, und dem in Beispiel 5 beschriebenen Herstellungsverfahren erhalten wird, wurde unterschiedlichen Wärmebehandlungen unterzogen: eine Woche bei 56ºC, 4 Wochen bei 37ºC oder 1 Jahr bei 4 bis 8ºC. Die Impfstoffrroben wurden anschließend durch das Histamin-Sensibilisierungsverfahren in Mäusen, wie in Beispiel 2 beschrieben, auf aktives PT getestet. Die in Tabelle 5 dargestellten Ergebnisse zeigen nach den vorstehend beschriebenen Behandlungen keine Reversion zur Toxizität. Tabelle 5 Toxische Eigenschaften der adsorbierten B. pertussis-Impfstoffpräparation Histamin-Sensibilisierungstest in Mäusen verabreichte Präparation Behandlung Dosis Sterblichkeitsrate Lösungsmittel Natives PT Impfstoff keine Tage Jahr
- Gemäß Beispiel 5 formulierte Antigenpräparationen wurden bei 4 bis 8ºC aufbewahrt und in zeitlichen Abständen auf die Histamin-Sensibilisierungsaktivität von PT, wie in Beispiel 2 beschrieben, und auf den ED50 der Immunantwort von Swiss OF1-Mäusen auf PT getestet, d. h., die Bestimmung der Dosis an inaktiviertem PT, die zur Induktion der Serokonversion von 50 % der Mäuse erforderlich ist. Ähnliche Tests wurden mit adsorbiertem trivalentem DTP-Impfstoff durchgeführt, der das Diphtherie- Toxoid, das Tetanus-Toxoid, das filamentöse Hämagglutinin des azellulären Pertussis- Impfstoffs und das gemäß Beispiel 1 hergestellte inaktivierte Pertussis-Toxin enthielt. Die Ergebnisse (Tabelle 6) zeigen keine Reversion und keine signifikanten Variationen des ED50. Tabelle 6: Immunogenitäts- und Stabilitätsuntersuchungen Impfstoff Charge Nr. Aufbewahrwig bei 4 bis 8ºC (Monate) HSF-Test Sterblichkeit ED50 ng/Maus
- (1) Inaktiviertes PT, 25 ug
- (2) Trivalentes DTP (Diphtherie-Toxoid, Tetanus-Toxoid, filamentöses B. pertussis-Hämagglutinin (FHA) und inaktiviertes PT, 25 ug)
- Das erfmdungsgemäße Verfahren kann für andere Antigene, beispielsweise das Diphtherietoxin, Tetanustoxin und ähnliche, verwendet werden. Derartige Modifikationen und Veränderungen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren sind in den Schutzbereich der angefügten Ansprüche eingeschlossen.
Claims (13)
1. Verfahren zur Entgiftung eines toxischen Antigens aus
einem teilweise oder intensiv gereinigten Präparat, das
dieses Antigen von einem pathogenen Mikroorganismus
enthält, umfassend die Behandlung des Präparats mit
Glutaraldehyd zur teilweisen Entgiftung des Antigens und die
Umsetzung des teilweise entgifteten Antigens mit
Formalin in Gegenwart ausgewählter Aminosäuren.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Antigen Pertussis-
Toxin ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuren
ausgewählt sind aus Tryptophan, Glycin, Lysin und Derivaten
davon.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die
Glutaraldehydbehandlung die Behandlung einer das Antigen in einer
Konzentration von 0,02 bis 2 mg/ml enthaltenden wäßrigen
Lösung mit 0,03 bis 0,07 % einer 25%igen wäßrigen
Glutaraldehydlösung, bezogen auf das Gewicht, umfaßt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Formalin- und
Aminosäurebehandlung die Zugabe von etwa 0,05 bis 2 Gew.-%
mindestens einer ausgewählten Aminosäure und von 1 bis
10 Gew.-% Formalin zur Glutaraldehyd-behandelten
Antigenlösung umfaßt, wobei die Lösung bei einer Temperatur
zwischen 37 und 45ºC gehalten wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, das weiterhin die fakultative
Ultraschallbehandlung der Lösung umfaßt, um während der
Entgiftung entstandene Aggregate zu entfernen.
7. Verfahren nach Anspruch 5, umfassend die Dialyse der
Lösung zur Entfernung von überschüssigem Reagens, wobei
die verbleibende Formalinkonzentration immer unter 200
ppm in der Lösung liegt.
8. Entgiftetes B. pertussis-Toxin, dadurch gekennzeichnet,
daß es durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1
bis 7 erhalten wurde, das seine Stabilität gegen ein
Wiederauf treten der Toxizität bei Temperaturen über etwa
23ºC behält.
9. Toxin nach Anspruch 8, gekennzeichnet durch eine
Stabilität für mehr als einen Monat, wenn es einer Temperatur
bis zu 37ºC ausgesetzt wird.
10. Pathogenes toxisches Antigen, das nach dem Verfahren von
Anspruch 1 entgiftet ist.
11. B. pertussis-Impfstoff, umfassend eine immunogene Menge
eines Pertussis-Toxins nach Anspruch 8, gekennzeichnet
durch eine Stabilität bei Temperaturen bis zu 37ºC.
12. Impfstoff nach Anspruch 11, der weiterhin eine
immunogene Menge eines entgifteten Toxins eines zweiten
pathogenen Organismus umf aßt, wobei der Impfstoff
multifunktionell ist.
13. Impfstoff gegen ein ausgewähltes Pathogen, umfassend
eine immunogene Menge eines entgifteten Antigens nach
Anspruch 10.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US47909890A | 1990-02-12 | 1990-02-12 | |
PCT/EP1991/000257 WO1991012020A1 (en) | 1990-02-12 | 1991-02-07 | Novel vaccine and method therefor |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE69113991D1 DE69113991D1 (de) | 1995-11-23 |
DE69113991T2 true DE69113991T2 (de) | 1996-03-21 |
Family
ID=23902647
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE69113991T Expired - Lifetime DE69113991T2 (de) | 1990-02-12 | 1991-02-07 | Impfstoff. |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0515415B1 (de) |
JP (1) | JP3035712B2 (de) |
KR (1) | KR100202052B1 (de) |
AT (1) | ATE129159T1 (de) |
AU (1) | AU646019B2 (de) |
CA (1) | CA2075711C (de) |
CY (1) | CY1935A (de) |
DE (1) | DE69113991T2 (de) |
DK (1) | DK0515415T3 (de) |
ES (1) | ES2080941T3 (de) |
GR (1) | GR3018440T3 (de) |
HK (1) | HK1004524A1 (de) |
IE (1) | IE70672B1 (de) |
NZ (1) | NZ237069A (de) |
PT (1) | PT96723B (de) |
WO (1) | WO1991012020A1 (de) |
ZA (1) | ZA91947B (de) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0835663B1 (de) | 1992-05-23 | 2009-09-30 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Kombinierte Impfstoffe, die Hepatitis B oberfläche Antigen und andere Antigenen enthalten |
GB9216351D0 (en) * | 1992-07-31 | 1992-09-16 | Wellcome Found | Vaccine production |
ATE452651T1 (de) * | 1998-09-01 | 2010-01-15 | Merrion Res Iii Ltd | Orale impfstoff-zusammensetzung |
AU769539B2 (en) * | 1999-01-29 | 2004-01-29 | Zoetis Services Llc | Adjuvants for use in vaccines |
GB0313916D0 (en) | 2003-06-16 | 2003-07-23 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine composition |
ES2653261T3 (es) | 2012-02-01 | 2018-02-06 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Procedimiento de fermentación |
CA2879939A1 (en) | 2012-08-06 | 2014-02-13 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Novel method |
US20140037680A1 (en) | 2012-08-06 | 2014-02-06 | Glaxosmithkline Biologicals, S.A. | Novel method |
DK2863943T3 (en) | 2013-03-08 | 2016-11-07 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | acellular pertussis vaccines |
US9849066B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-12-26 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
KR20160040290A (ko) | 2013-08-05 | 2016-04-12 | 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. | 조합 면역원성 조성물 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4070454A (en) * | 1973-05-04 | 1978-01-24 | Agence Nationale De Valorisation De La Recherche (Anvar) | Vaccines, the process for preparing the same and the applications thereof |
JPS5750925A (en) * | 1980-09-12 | 1982-03-25 | Takeda Chem Ind Ltd | Preparation of pertussis toxoid |
GB8601279D0 (en) * | 1986-01-20 | 1986-02-26 | Public Health Lab Service | Purification of pertussis antigens |
US4888169A (en) * | 1986-10-14 | 1989-12-19 | Norden Laboratories, Inc. | Bordetella Bronchiseptica vaccine |
WO1990009444A1 (en) * | 1989-02-10 | 1990-08-23 | Genesit Oy | A method for producing pertussis toxin subunits |
-
1991
- 1991-02-07 DE DE69113991T patent/DE69113991T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-07 CA CA002075711A patent/CA2075711C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-07 ES ES91903336T patent/ES2080941T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-07 CY CY193591A patent/CY1935A/xx unknown
- 1991-02-07 AU AU72110/91A patent/AU646019B2/en not_active Expired
- 1991-02-07 EP EP91903336A patent/EP0515415B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-07 DK DK91903336.5T patent/DK0515415T3/da active
- 1991-02-07 JP JP03503734A patent/JP3035712B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-07 AT AT91903336T patent/ATE129159T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-02-07 WO PCT/EP1991/000257 patent/WO1991012020A1/en active IP Right Grant
- 1991-02-08 IE IE42491A patent/IE70672B1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-02-08 PT PT96723A patent/PT96723B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-02-08 ZA ZA91947A patent/ZA91947B/xx unknown
- 1991-02-11 NZ NZ237069A patent/NZ237069A/en unknown
-
1992
- 1992-08-11 KR KR1019920701931A patent/KR100202052B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-12-15 GR GR950403570T patent/GR3018440T3/el unknown
-
1998
- 1998-04-28 HK HK98103622A patent/HK1004524A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR100202052B1 (ko) | 1999-06-15 |
ZA91947B (en) | 1992-01-29 |
DK0515415T3 (da) | 1995-11-27 |
HK1004524A1 (en) | 1998-11-27 |
CA2075711C (en) | 2000-11-07 |
CY1935A (en) | 1991-02-07 |
DE69113991D1 (de) | 1995-11-23 |
PT96723A (pt) | 1991-10-31 |
WO1991012020A1 (en) | 1991-08-22 |
IE70672B1 (en) | 1996-12-11 |
AU646019B2 (en) | 1994-02-03 |
CA2075711A1 (en) | 1991-08-13 |
NZ237069A (en) | 1993-07-27 |
ES2080941T3 (es) | 1996-02-16 |
JP3035712B2 (ja) | 2000-04-24 |
AU7211091A (en) | 1991-09-03 |
ATE129159T1 (de) | 1995-11-15 |
EP0515415B1 (de) | 1995-10-18 |
JPH05503936A (ja) | 1993-06-24 |
EP0515415A1 (de) | 1992-12-02 |
GR3018440T3 (en) | 1996-03-31 |
PT96723B (pt) | 1998-07-31 |
KR920703099A (ko) | 1992-12-17 |
IE910424A1 (en) | 1991-08-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE69736709T2 (de) | Vielwertige dtp-polio-impfstoffe | |
DE69527202T3 (de) | Proteinartige adjuvantien | |
DE69531501T3 (de) | Kombinierte meningitis-vakzine | |
DE69829400T2 (de) | Passive immunisierung gegen durch clostridium difficile verursachte krankheit | |
DE3911442A1 (de) | Impfstoff-praeparation | |
DE69735191T2 (de) | Verfahren zur Herstellung multivalenter Impfstoffe | |
DE69724970T2 (de) | Verfahren zur behandlung von hypersensitivität typ i unter verwendung von monophosphoryl-lipid a | |
DE69124235T2 (de) | Reinigung und verwendung von pertactin, eines bordetella pertussis aussenmembranproteins | |
DE69113991T2 (de) | Impfstoff. | |
EP0220387A2 (de) | Konjugatimpfstoffe gegen Infektionen durch gramnegative Bakterien, Verfahren zu deren Herstellung sowie Verwendung derselben | |
EP0173241B1 (de) | Vakzine zur Behandlung der Harnwegsinfektionen | |
US5578308A (en) | Glutaraldehyde and formalin detoxified bordetella toxin vaccine | |
DE69432665T3 (de) | Multikomponentenimpfstoff aus clostridien, der saponin als adjuvans benutzt | |
US4888169A (en) | Bordetella Bronchiseptica vaccine | |
EP0363835B1 (de) | Verwendung von Zink- oder Eisenhydroxid zur Adjuvierung von Antigenlösungen und auf diese Weise adjuvierte Antigenlösungen | |
DE3787887T2 (de) | Verfahren zum Züchten von Bordetella-Pertussis, ein Pertussis-Toxoid und ein Pertussis-Impfstoff. | |
DE2704766A1 (de) | Toxoid-impfstoff gegen pseudomonas aeruginosa-infektionen | |
DE2445819A1 (de) | Verfahren zur herstellung stabiler, gegen seruminhibitoren resistenter h tief 3 n tief 2 -influenzavirusstaemme und diese virusstaemme enthaltende vakzinen | |
DE4447677C2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Impfserums zur Immunisierung gegen Pseudomonas Aeruginosa-Infektionen | |
DE69329922T3 (de) | Herstellung eines tetanusimpfstoffes | |
DE2212277B2 (de) | Verfahren zur Herstellung einer Totvaccine gegen infektiöse atrophische Rhinitis der Schweine | |
DE68917709T2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Pertussis-Toxin-Toxoides. | |
DE2845745C2 (de) | ||
US5019388A (en) | Bordetella bronchiseptica vaccine | |
DE68917972T2 (de) | Pertussistoxoid-Impfstoff. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8364 | No opposition during term of opposition |