DE69736709T2 - Vielwertige dtp-polio-impfstoffe - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft multivalente Impfstoffe, insbesondere zur pädiatrischen Verabreichung.
  • Keuchhusten oder Pertussis ist eine ernste, in hohem Maße ansteckende Infektion des oberen Atmungstraktes, die durch Bordetella pertussis verursacht wird. Die Weltgesundheitsorganisation schätzt, dass es 60 Millionen Fälle von Pertussis pro Jahr und 0,5 bis 1 Million damit verbundene Todesfälle gibt (Ref. 1. Über die gesamte Beschreibung hinweg werden verschiedene Referenzen in Klammern angegeben, um den Stand der Technik, auf welchen sich diese Erfindung bezieht, vollständiger zu beschreiben. Die vollständige bibliografische Information für jedes Zitat findet man am Ende der Beschreibung, worauf unmittelbar die Ansprüche folgen. Auf die Offenbarung dieser Referenzen wird hierdurch in der vorliegenden Offenbarung vollinhaltlich Bezug genommen). Bei nicht geimpften Populationen wurde bei Kindern unter 5 Jahren eine Häufigkeitsrate des Auftretens von Pertussis beobachtet, die so hoch wie 80% war (Ref. 2). Auch wenn Pertussis im Allgemeinen als eine Erkrankung der Kindheit betrachtet wird, gibt es zunehmende Beweise für eine klinische und asymptomatische Erkrankung bei Heranwachsenden und Erwachsenen (Ref. 3, 4 und 5).
  • Die Einführung von Ganzzellimpfstoffen, die aus chemisch und durch Wärme inaktivierten B. pertussis-Organismen zusammengesetzt waren, in den 1940er Jahren war für eine dramatische Verringerung bei der Häufigkeit des Auftretens von Keuchhusten, der durch B. pertussis hervorgerufen wird, verantwortlich. Die Wirksamkeitsraten für Ganzzellimpfstoffe wurden in Abhängigkeit von der Falldefinition auf bis zu 95% geschätzt (Ref. 6). Während eine Infektion mit B. pertussis eine lebenslange Immunität verleiht, gibt es zunehmende Beweise für einen nachlassenden Schutz nach der Immunisierung mit Ganzzellimpfstoffen (Ref. 3). Mehrere Berichte, die eine Beziehung zwischen der Ganzzellpertussisimpfung, der Reaktogenizität und ernsten Nebenwirkungen zitieren, führten zu einer Abnahme bei der Impfstoffakzeptanz und nachfolgenden erneuten Epidemien (Ref. 7). In letzter Zeit sind Pertussisimpfstoffe mit definierten Komponenten entwickelt worden.
  • Antigene für definierte Pertussisimpfstoffe
  • Verschiedene azelluläre Pertussisimpfstoffe sind entwickelt worden und beinhalten die Bordetella pertussis-Antigene, Pertussistoxin (PT), filamentöses Hämagglutinin (FHA), das Außenmembranprotein mit 69 kDa (Pertaktin) und Fimbrienagglutinogene (siehe Tabelle 1 unten. Die Tabellen erscheinen am Ende der Beschreibung).
  • Pertussistoxin
  • Pertussistoxin ist ein Exotoxin, welches ein Mitglied der A/B-Familie der bakteriellen Toxine mit ADP-Ribosyltransferaseaktivät ist (Ref. 8). Der A-Anteil dieser Toxine zeigt die ADP-Ribosyltransferaseaktivität, und der B-Teil vermittelt die Bindung des Toxins an Wirtszellrezeptoren und die Translokation von A zu seiner Wirkungsstelle. PT erleichtert ebenso die Haftung von B. pertussis an Flimmerepithelzellen (Ref. 9) und spielt ebenfalls eine Rolle bei der Invasion von Makrophagen durch B. pertussis (Ref. 10).
  • Alle azellulären Pertussisimpfstoffe haben PT beinhaltet, welches als ein Hauptvirulenzfaktor und ein Schutzantigen vorgeschlagen wurde (Ref. 11, 12). Eine natürliche Infektion mit B. pertussis erzeugt sowohl humorale als auch zellvermittelte Antworten auf PT (Ref. 13 bis 17). Säuglinge haben von der Plazenta abgeleitete anti-PT-Antikörper (Ref. 16, 18), und menschliches Kolostrum, welches anti-PT-Antikörper enthält, war bei dem passiven Schutz von Mäusen gegenüber einer Aerosolinfektion wirksam (Ref. 19). Eine zellvermittelte Immun(CMI)antwort auf PT-Untereinheiten wurde nach Immunisierung mit einem azellulären Impfstoff gezeigt (Ref. 20), und eine CMI-Antwort auf PT wurde nach Impfung mit ganzen Zellen erzeugt (Ref. 13). Chemisch inaktiviertes PT in Ganzzell- oder Komponentenimpfstoffen ist bei Tiermodellen und bei Menschen protektiv (Ref. 21). Weiterhin schützen monoklonale Antikörper, die für die Untereinheit S1 spezifisch sind, gegen eine B. pertussis-Infektion (Ref. 22 und 23).
  • Die wichtigsten pathophysiologischen Wirkungen von PT beruhen auf seiner ADP-Ribosyltransferaseaktivität. PT katalysiert die Übertragung von ADP-Ribose von NAD auf das Gi-Guaninnukleotid-Bindungsprotein, wodurch das zelluläre Adenylatcyclase-Regulationssystem gestört wird (Ref. 24). PT verhindert ebenso die Wanderung von Makrophagen und Lymphozyten zu Entzündungsstellen und stört die Neutrophilvermittelte Phagozytose und Tötung von Bakterien (Ref. 25). Eine Anzahl von in vitro- und in vivo-Assays wurde verwendet, um die enzymatische Aktivität von S1 und/oder PT festzustellen, einschließlich der ADP-Ribosylierung von Rindertransducin (Ref. 26), des Clusterassays mit Ovarienzellen des chinesischen Hamsters (CHO) (Ref. 27), der Histaminsensibilisierung (Ref. 28), der Leukozytose und NAD-Glycohydrolase. Wenn sie PT ausgesetzt werden, entwickeln CHO-Zellen eine charakteristische geclusterte Morphologie. Dieses Phänomen hängt von der Bindung von PT und der anschließenden Translokation und der ADP-Ribosyltransferaseaktivität von S1 ab, und somit wird der CHO-Zellen-Clusterassay weithin verwendet, um die Integrität und Toxizität von PT-Holotoxinen zu testen.
  • Filamentöses Hämagglutinin
  • Filamentöses Hämagglutinin ist ein großes (220 kDa) nicht toxisches Polypeptid, welches die Befestigung von B. pertussis an Flimmerzellen des oberen Atmungstraktes während der Kolonisation der Bakterien vermittelt (Ref. 9, 29). Eine natürliche Infektion induziert anti-FHA-Antikörper und eine zellvermittelte Immunität (Ref. 13, 15, 17, 30 und 31). Anti-FHA-Antikörper werden in menschlichem Kolostrum gefunden und werden ebenfalls über die Plazenta übertragen (Ref. 17, 18 und 19). Eine Impfung mit Ganzzell- oder azellulären Pertussisimpfstoffen erzeugt anti-FHA-Antikörper, und azelluläre Impfstoffe, die FHA enthalten, induzieren ebenfalls eine CMI-Antwort auf FHA (Ref. 20, 32). FHA ist nach aktiver oder passiver Immunisierung in einem Mausatembelastungsmodell ein Schutzantigen (Ref. 33, 34). Jedoch schützt FHA allein in dem Mausintrazerebralbelastungsstärkeassay nicht (Ref. 28).
  • Außenmembranprotein mit 69 kDa (Pertaktin)
  • Das 69 kDa-Protein ist ein Außenmembranprotein, welches ursprünglich aus B. bronchiseptica identifiziert wurde (Ref. 35). Das Protein ist ebenfalls als Pertaktin und P.69 bekannt. Es wurde gezeigt, dass es ein Schutzantigen gegenüber B. bronchiseptica ist, und wurde anschließend in sowohl B. pertussis als auch B. paraper tussis identifiziert. Das 69 kDa-Protein bindet direkt an eukaryotische Zellen (Ref. 36), und eine natürliche Infektion mit B. pertussis induziert eine humorale anti-P.69-Antwort (Ref. 14), und P.69 induziert ebenfalls eine zellvermittelte Immunantwort (Ref. 17, 37, 38). Eine Impfung mit Ganzzell- oder azellulären Impfstoffen induziert anti-P.69-Antikörper (Ref. 32, 39), und azelluläre Impfstoffe induzieren eine P.69 CMI (Ref. 39). Pertaktin schützt Mäuse gegen eine Aerosolbelastung mit B. pertussis (Ref. 40) und, in Kombination mit FHA, schützt es bei dem intrazerebralen Belastungstest gegen B. pertussis (Ref. 41). Eine passive Übertragung von polyklonalen oder monoklonalen anti-P.69-Antikörpern schützt ebenfalls Mäuse vor einer Aerosolbelastung (Ref. 42).
  • Agglutinogene
  • Die Serotypen von B. pertussis sind durch ihre agglutinierenden Fimbrien definiert. Die WHO empfiehlt, dass Ganzzellimpfstoffe die Agglutinogene (Aggs) der Typen 1, 2 und 3 beinhalten, da diese nicht kreuzprotektiv sind (Ref. 43). Agg 1 ist nicht fimbrial und wird auf allen B. pertussis-Stämmen gefunden, während die Aggs von Serotyp 2 und 3 fimbrial sind. Eine natürliche Infektion oder eine Immunisierung mit Ganzzell- oder azellulären Impfstoffen induziert anti-Agg-Antikörper (Ref. 15, 32). Eine spezifische zellvermittelte Immunantwort kann in Mäusen durch Agg 2 und Agg 3 nach einer Aerosolinfektion erzeugt werden (Ref. 17). Die Aggs 2 und 3 schützen in Mäusen gegen eine Atembelastung, und menschliches Kolostrum, welches anti-Agglutinogene enthält, wird ebenfalls in diesem Assay schützen (Ref. 19, 44, 45).
  • Azelluläre Pertussisimpfstoffe
  • Der erste azelluläre Pertussisimpfstoff, der entwickelt wurde, war der Zweikomponenten-PT + FHA-Impfstoff (JNIH 6) von Sato et al. (Ref. 46). Dieser Impfstoff wurde durch gemeinsame Reinigung von PT- und FHA-Antigenen aus dem Kulturüberstand des B. pertussis-Stammes Tohama hergestellt, worauf eine Toxoidierung mit Formalin folgte. Azelluläre Impfstoffe von verschiedenen Herstellern und mit verschiedenen Zusammensetzungen sind erfolgreich verwendet worden, um seit 1981 japanische Kinder gegen Keuchhusten zu immunisieren, was zu einer dramatischen Abnahme bei dem Auftreten der Krankheit führte (Ref. 47). Der JNIH 6-Impfstoff und ein Mono komponenten-PT-Toxoidimpfstoff (JNIH 7) wurden in einem großen klinischen Test in Schweden in 1986 getestet. Die anfänglichen Ergebnisse zeigten eine niedrigere Wirksamkeit als die berichtete Wirksamkeit eines Ganzzellimpfstoffes, aber Folgeuntersuchungen haben gezeigt, dass dieser gegenüber einer schwächeren Krankheit, die durch serologische Methoden diagnostiziert wurde, wirksamer war (Ref. 48, 49, 50, 51). Jedoch gab es bei diesen Impfstoffen Beweise für eine Rückkehr zur Toxizität von mit Formalin inaktiviertem PT. Bei diesen Impfstoffen wurde ebenfalls gefunden, dass sie eher gegen die Krankheit als vor einer Infektion schützen.
  • Eine Anzahl neuer azellulärer und Komponentenpertussisimpfstoffe wird derzeit getestet, welche Kombinationen von PT, FHA, P.69 und/oder Agglutinogenen einschließen, und diese sind in Tabelle 1 aufgelistet. Mehrere Techniken der chemischen Detoxifikation sind für PT verwendet worden, einschließlich einer Inaktivierung mit Formalin (Ref. 46), Glutaraldehyd (Ref. 52), Wasserstoffperoxid (Ref. 53) und Tetranitromethan (Ref. 54).
  • Tetanus
  • Tetanus ist eine akute Infektion, die durch Clostridium tetani verursacht wird. Die Krankheit ist gekennzeichnet durch schwere, schmerzhafte Muskelkontraktionen, die von Überempfindlichkeit, Hyperreflexie und einer erhöhten autonomen Stimulation des betroffenen Körperteils (Körperteile) begleitet sind. Schwache Reize können schwere Reflexmuskelspasmen hervorrufen. Fieber kann aufgrund von extremen Muskelspasmen vorliegen. Tetanus kann allgemein sein, was das Gesicht, den Hals, den Bauch und den Rumpf betrifft, oder auf einem bestimmten Körperteil (Verletzungsstelle) lokalisiert sein. Eine Beteiligung des Massetermuskels des Gesichts führt zu einem Trismus oder einer Kieferklemme, was den klassischen Gesichtsausdruck hervorruft, der als "risus sardonicus" bekannt ist (Ref. 78).
  • C. tetani existiert als ein nichtpathogener Organismus in den Eingeweiden von Menschen und Tieren. Der Organismus wird ebenfalls im Boden gefunden, der durch Fäzes kontaminiert ist, und kann im Boden über Jahre hinweg als infektiöse Sporen überleben (Ref. 79).
  • Tetanus resultiert aus dem anaeroben Wachstum von C. tetani und der Neurotoxinproduktion in kontaminierten Wunden. Die Infektion wird hervorgerufen durch die Einführung von Materialien, die mit Organismen oder Sporen kontaminiert sind, in das Gewebe. Das häufigste Szenario ist eine Infektion über eine penetrierende Verletzung. Jedoch ist in vielen Fällen keine Verletzungsvorgeschichte erhältlich. Das Vorliegen von nekrotischem oder ischämischem Gewebe erleichtert das Wachstum des Bacillus (Ref. 78).
  • Eine Prävention der Infektion erfolgt durch Impfung und durch gute Versorgung der Wunde, was eine sorgfältige Reinigung und eine Wundausschneidung von devitalisierten Geweben einschließt. Individuen mit kontaminierten Wunden und welche die Serienimpfung versäumt haben, sollten sowohl Tetanusimpfstoff als auch Tetanusimmunglobulin erhalten.
  • Die Behandlung des Syndroms ist hauptsächlich unterstützend und kann eine Atmungsunterstützung, eine Verabreichung von Tetanusantitoxin und eine sorgfältige Reinigung der infizierten Wunden beinhalten. Trotz einer modernen medizinischen Versorgung liegen die Todesfallraten immer noch bei soviel wie 30 bis 90% (Ref. 79). Dieses trifft insbesondere für die älteren Menschen zu. Eine natürliche Infektion erzeugt nicht immer eine Immunität vor einer weiteren Infektion.
  • Die Prävention einer Infektion durch Impfung ist die wirksamste Methode, um die Krankheit zu kontrollieren. Seit der Einführung der universellen Impfung ist Tetanus in entwickelten Ländern extrem selten geworden. Fälle treten fast ausschließlich bei Individuen auf, die ihre Serienimpfungen nicht abgeschlossen haben oder die keine geeigneten Auffrischungsdosen erhalten haben. Individuen sollten einmal alle zehn Jahre eine Auffrischungsdosis erhalten.
  • Diphtherie
  • Diphtherie ist eine akute Infektion, welche durch das Bakterium Corynebacterium diphtheriae hervorgerufen wird. Die Hauptinfektionsstelle ist der obere Atmungstrakt (Nase, Pharynx, Larynx und Luftröhre) (Ref. 80). Die charakteristische Läsion, welche ein Ergebnis des Bakteriencytotoxins ist, sind Flecken einer gräulichen Pseudo membran, die von einer Entzündung umgeben sind. Dieses wird begleitet von einer zervikalen Lymphadenopathie, einem Anschwellen und Ödemen des Halses. In schweren Fällen kann das Anschwellen bis zu dem Punkt der Verstopfung fortschreiten (laryngeale Diphtherie). Andere Komplikationen beinhalten Myocarditis, Auswirkungen auf das zentrale Nervensystem (kraniale, motorische und sensorische Neuropathien, wie z. B. aufsteigende Lähmung) und Thrombozytopenie. Andere Schleimhautmembranen können weniger häufig betroffen sein. Die klinische Darstellung kann von einer asymptomatischen Infektion bis hin zu einem fulminanten Multisystem und dem Tod variieren (Ref. 79). Infektionen der Haut und von Wunden mit Diphtherie sind in den Tropen häufig und sind oft von der armen Bevölkerung der USA berichtet worden. Das einzige Reservoir für C. diphtheriae ist der Mensch (Ref. 79).
  • Eine mutmaßliche Diagnose kann anhand der klinischen Beobachtung der charakteristischen Läsionen gemacht werden, sollte aber durch eine bakterielle Untersuchung der Läsionen bestätigt werden. Wenn es einen starken klinischen Verdacht auf Diphtherie gibt, sollte die Behandlung unmittelbar mit Antibiotika (Penicillin oder Erythromycin) und Diphtherieantitoxin begonnen werden, selbst wenn die Diagnose nicht bestätigt wurde. Die Mortalität steigt, je länger man nach dem Einsetzen der klinischen Symptome wartet (Ref. 80). Die Todesfallrate reicht von fünf bis zehn Prozent, trotz moderner medizinischer Versorgung (Ref. 79), und tritt hauptsächlich bei den sehr jungen und bei den älteren Menschen auf. Eine natürliche Infektion erzeugt nicht immer eine Immunität vor einer weiteren Infektion (Ref. 80).
  • Die Übertragung erfolgt durch direkten Kontakt mit Absonderungen oder Ausscheidungen von einem infizierten Individuum. Die Individuen sind ansteckend, solange wie Bakterien in den Absonderungen beobachtet werden. Dieses kann bis zu vier Wochen nach der Infektion dauern. Eine Übertragung kann ebenfalls bei infizierten Infektionsträgern auftreten (Ref. 79). Eine strikte Isolierung der Fälle wird empfohlen.
  • In seltenen Fällen können Individuen Träger werden und die Organismen bis zu sechs Monaten nach der Infektion verbreiten. Nicht immunisierte Träger sollten sofort mit der vollen Serie geimpft werden. Eine Behandlung mit Antibiotika eliminiert eine Trägerschaft und eine Infektiösität der Fälle innerhalb von 4 Tagen (Ref. 80).
  • Poliomyelitis
  • Sowohl inaktivierte (IPV) als auch lebende abgeschwächte (OPV) Poliovirusimpfstoffe waren wirksam, um die Poliomyelitis weltweit zu kontrollieren. Ein kombinierter DPT-IPV-Impfstoff ist derzeit in Europa und in Kanada zugelassen, und es wurde von ihm gezeigt, dass er bei Millionen von Kindern weltweit sicher und wirksam war.
  • Haemophilus influenzae Typ b
  • Vor der Verfügbarkeit wirksamer Impfstoffe war Haemophilus influenzae Typ b (Hib) eine Hauptursache für invasive durch Blut übertragene Meningitisinfektionen bei jungen Kindern und war die Hauptursache für Meningitis in den ersten 2 Lebensjahren (Ref. 81). Ungefähr 10% der Haemophilus influenzae-Meningitisopfer sterben trotz medizinischer Versorgung. Dauerhafte Folgeerscheinungen sind bei den Überlebenden häufig. Eine Immunisierung gegen Haemophilus influenzae begann in Kanada in 1987 mit einem Polysaccharidimpfstoff (Polyriboseribitolphosphat [PRP] aus Haemophilus influenzae Typ b). Eine verbesserte Immunogenität wurde bei Kindern im Alter von 18 Monaten und älter mit der Einführung in 1988 eines Impfstoffes erzielt, der aus PRP bestand, das mit Diphtherietoxoid konjugiert war (PRP-D). Seit 1992 wurde eine Immunisierung von Säuglingen mit der Zulassung von PRP-Konjugatimpfstoffen möglich, welche bei Säuglingen mit einem Alter von unter 1 Jahr immunogen waren (PRP konjugiert mit Tetanustoxoid oder PRP-T). Die Verwendung dieser Haemophilus influenzae-Konjugatimpfstoffe wurde mit einer dramatischen Abnahme bei dem Auftreten der invasiven Haemophilus-Infektion in Kanada und anderswo in Verbindung gebracht (Ref. 82). Zwei kanadische klinische Studien, an welchen nahezu 900 Kinder in British Columbia und Alberta beteiligt waren, zeigten, dass lyophilisiertes PRP-T mit DPT (COMBIPACK) (Ref. 83) oder mit DPT-Polio Adsorbed (PENTATM) (Ref. 84), zusätzlich zu dem üblichen Salzlösungsverdünnungsmittel, rekonstituiert werden kann. Klinische Studien, an denen mehr als 100.000 Kinder in der ganzen Welt beteiligt waren, haben die Wirksamkeit von lyophilisiertem PRP-T (ActHibTM) gezeigt. Über 90% erreichen anti-PRP-Spiegel, welche als protektiv angesehen werden (≥ 0,15 μg/ml), nach 3 Dosen PRP-T, beginnend mit 2 Monaten, oder nach einer einzigen Dosis PRP-T, die bei einem Alter von über 12 Monaten gegeben wird. Der Anteil, welcher Spiegel erreicht, die einen Langzeitschutz anzeigen (> 1,0 μg/ml), variiert in Abhängigkeit von der Studie von 70 bis 100%. Millionen Dosen PRP-T sind in Kanada seit 1992 verkauft worden. Fälle von Ausbrüchen einer invasiven Haemophilus-Infektion nach Impfung mit PRP-T sind selten und können mit Krankheiten wie beispielsweise Immundefizienz in Verbindung gebracht werden (Ref. 85).
  • Kombinationsimpfstoffe
  • Auch wenn es viele tatsächliche und potenzielle Nutzen von Impfstoffen gibt, welche Antigene kombinieren, um einen Schutz vor mehreren Pathogenen zu verleihen, können diese Kombinationen eine nachteilige Wirkung auf die Immunogenität der einzelnen Komponenten haben. Kombinationen von Diphtherie- und Tetanustoxoiden mit Ganzzellpertussisimpfstoff (DTP) waren für über 50 Jahre verfügbar, und die Antikörperantwort auf die Kombination ist der auf die einzelnen Komponenten überlegen, möglicherweise als ein Ergebnis einer förderlichen Wirkung des Ganzzellpertussisimpfstoffes. DTP-Kombinationen, die ebenfalls inaktivierten Poliovirusimpfstoff einschließen, sind in vielen Jurisdiktionen zugelassen, auch wenn die Antikörperantwort auf die Pertussisantigene durch diese Kombination abgeschwächt werden kann (Ref. 69 bis 71). Die Wirkung der Kombination von DTP-Impfstoffen mit Hib-Konjugatimpfstoff war variabel. Studien mit einem französischen DTP und PRPT zeigten eine ähnliche Sicherheit, aber eine verminderte Antikörperantwort auf PRP (Ref. 72 bis 73), wogegen Studien mit einem kanadischen DTP- und PRPT-Impfstoff keine Wirkung auf die PRP-Antwort, aber niedrigere Pertussisagglutinogene und eine erhöhte Empfindlichkeit der Injektionsstelle bei der Gruppe mit kombinierter Immunisierung zeigten (Ref. 74, 75).
  • Es werden nun Daten verfügbar über die Wirkung der Kombination von APDT-Impfstoffen mit Hib-Konjugatimpfstoff. Bei zwei Monate alten Säuglingen, denen drei Dosen eines azellulären Pertussis-Diphtherie-Tetanus-Impfstoffes (APDT), kombiniert mit einem Hib-Konjugatimpfstoff (PRP-T) gegeben wurden, war die Antikörperantwort auf PRP signifikant niedriger als bei der Gruppe, welcher getrennte Injektionen am selben Tag gegeben wurden (Ref. 76). Ähnliche Ergebnisse wurden mit einem anderen azellulären Pertussis-Diphtherie-Tetanus-Impfstoff berichtet, welcher mit PRP-T kombiniert wurde, welches bei den ersten drei Dosen gegeben wurde (Ref. 77).
  • Im Gegensatz zu anderen berichteten Untersuchungen wiesen Kinder, die mit dem kombinierten Impfstoff immunisiert wurden, eine überlegene Antikörperantwort auf PRP-, Diphtherie- und mehrere der Pertussisantigene auf, wenn sie mit Kindern, denen PRP bei einer separaten Visite gegeben wurde, verglichen wurden. Es kann mehrere Gründe geben für die entsprechende oder bessere Immunogenität für diese Impfstoffe, wenn sie als eine kombinierte Injektion gegeben werden, als die verminderte Immunogenität, die von anderen Produkten berichtet wird. Alle azellulären und Komponentenpertussisimpfstoffe sind im Hinblick auf ihren antigenen Gehalt, die Methode der Toxoidiierung, das Hilfsmittel oder Konservierungsmittel nicht identisch. Jedoch wurde eine verminderte Immunogenität mit azellulären Pertussisimpfstoffen, welche PT, FHA und 69K enthielten (Ref. 77) und welche PT, FHA, 69K und Fimbrien enthielten, berichtet (Ref. 76).
  • Bei dem Fünfkomponenten-APDT-Impfstoff, der in dieser Untersuchung untersucht wurde, wurde in einem klinischem Test der Phase III, welcher vor kurzem in Schweden abgeschlossen wurde, unter der Aufsicht der National Institutes of Health gefunden, dass dieser eine Schutzwirksamkeit von 85% (Beispiel 5) (95% CI 81/89) aufwies (Ref. 78).
  • Gegenwärtige kommerziell erhältliche Kombinationsimpfstoffe enthalten möglicherweise keine geeigneten Formulierungen von geeigneten Antigenen in geeigneten immunogenen Formen, um ein gewünschtes Wirksamkeitsniveau in einer für Pertussis anfälligen menschlichen Population zu erreichen.
  • Gryhrs et al., Abstract E-92, 95th General Meeting of the Society for Microbiology, Washington DC, USA (welches wie berichtet vom 21.-25. Mai 1995 stattfand) berichtet von einer T-Zellimmunität bei Kindern, die mit Wasserstoffperoxid-detoxifiziertem PT in einem DTaP-IPV-Kombinationsimpfstoff geimpft wurden. Die Zusammenfassung gibt keine Details über die Formulierung an, außer dem einfachen Vorliegen (presence simpliciter) der Antigene für D und T, azellulärer Pertussisantigene und IPV.
  • Mallet et al., Abstract 19, 14th Annual Meeting of the European Society for Paediatric Infectious Diseases, Elsinore, Dänemark (welches wie berichtet vom 18.-21. Juni 1996 stattfand) berichtet von einer primären Immunisierung mit kombiniertem, azellulärem DTaP-IPV-Act-HIB-Impfstoff, der im Alter von 2-3-4 oder 2-4-6 Monaten gegeben wird. Die Zusammenfassung gibt keine Details über die Formulierung an, außer dem einfachen Vorliegen der Antigene für D und T, azellulärer Pertussisantigene und IPV und des Antigens, das durch die Marke Act-HIB bezeichnet wird.
  • Begue et al., Abstract 20, 14th Annual Meeting of the European Society for Paediatric Infectious Diseases. supra berichtet über die Auswertung einer Auffrischungsdosis eines DTPa-IPV-Impfstoffes, mit oder ohne Hib, im Vergleich zu dem kommerziellen DTPw-IPV-Hib-Impfstoff. Die Zusammenfassung gibt kein Detail über die Formulierung an, außer dem einfachen Vorliegen der Antigene für D und T, azellulärer Pertussisantigene und oder IPV/Hib.
  • Hronowski et al., Abstract E78, 93rd General Meeting of the American Society for Microbiology, Atlanta, Georgia, USA (welches wie berichtet vom 16.-20. Mai 1993 stattfand) berichtet über die Immunogenität eines neuen Hib-Polysaccharid-TT-Konjugatimpfstoffes und die Immunogenitäten der einzelnen Komponenten in dem fünf-wertigen Hib-TT + DTaP + IPV-Impfstoff. Die Zusammenfassung gibt an, dass das Kapselpolysaccharid kovalent durch das Aminierungsverfahren an den Tetanustoxoid-Proteinträger gekoppelt wurde. Es werden keine Details offenbart, was die detaillierte antigene Zusammensetzung der betroffenen Impfstoffe betrifft.
  • Es wäre wünschenswert, wirksame Kombinationsimpfstoffe bereitzustellen, welche azelluläre Pertussiskomponenten umfassen, die ausgewählte relative Mengen an ausgewählten Antigenen enthalten.
  • Die vorliegende Erfindung ist, wie im Folgenden definiert wird, auf Kombinations- oder multivalente Impfstoffe, die azelluläre Pertussisimpfstoffkomponenten enthalten, sowie auf Verfahren zu deren Anwendung gerichtet.
  • Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine multivalente immunogene Zusammensetzung zum Verleihen von Schutz in einem Wirt gegenüber einer Krankheit bereitgestellt, welche durch eine Infektion mit Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Poliovirus und/oder Haemophilus influenzae verursacht wird, welche umfasst:
    • (a) Pertussistoxoid, filamentöses Hämagglutinin, Pertaktin und Agglutinogene in gereinigter Form,
    • (b) Tetanustoxoid,
    • (c) Diphtherietoxoid,
    • (d) inaktiviertes Poliovirus und gegebenenfalls
    • (e) ein gegebenenfalls lyophilisiertes Konjugat eines Trägermoleküls, das ausgewählt ist aus Tetanustoxoid und Diphtherietoxoid, und eines Kapselpolysaccharids des Haemophilus influenzae-Typs,
    welche als ein Impfstoff zur in vivo-Verabreichung an einen Wirt formuliert ist und wobei für jede Einzelhumandosis das Pertussistoxoid mit einer Menge von 5 bis 30 μg an Stickstoff vorliegt, das filamentöse Hämagglutinin in einer Menge von 5 bis 30 μg an Stickstoff vorliegt, das Pertaktin in einer Menge von 3 bis 15 μg an Stickstoff vorliegt und die Agglutinogene in einer Menge von 1 bis 10 μg an Stickstoff vorliegen.
  • Die immunogene Zusammensetzung ist somit als ein Impfstoff zur in vivo-Verabreichung an den Wirt formuliert, so dass die Immunogenität der einzelnen Komponenten durch andere einzelne Komponenten der Zusammensetzung nicht beeinträchtigt wird.
  • Die immunogene Zusammensetzung kann weiterhin ein Hilfsmittel, insbesondere Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat, umfassen.
  • In einer speziellen Ausführungsform kann die immunogene Zusammensetzung Pertussistoxoid, Fimbrienhämagglutinin, das 69 kDa-Protein und filamentöse Agglutinogene von Bordetella pertussis in einem Gewichtsverhältnis von ca. 20:20:5:3 umfassen, wie sie durch ca. 20 μg Pertussistoxoid, ca. 20 μg filamentöses Hämagglutinin, ca. 5 μg Fimbrien Agglutinogene und ca. 3 μg des 69 kDa-Proteins in einer Einzel humandosis bereitgestellt werden. In einer anderen speziellen Ausführungsform kann der Impfstoff Pertussistoxoid, filamentöses Hämagglutinin, das 69 kDa-Protein und Fimbrienagglutinogen von Bordetella pertussis in einem Gewichtsverhältnis von 10:5:5:3 umfassen, wie sie durch ca. 10 μg Pertussistoxoid, ca. 5 μg filamentöses Hämagglutinin, ca. 5 μg Fimbrienagglutinogen und ca. 3 μg 69 kDa-Protein in einer Einzelhumandosis bereitgestellt werden. In einer Ausführungsform der hierin bereitgestellten immunogenen Zusammensetzung enthält der Impfstoff ca. 15 Lfs Diphtherietoxoid und ca. 5 Lfs Tetanustoxoid.
  • Das inaktivierte Poliovirus, das in der immunogenen Zusammensetzung der Erfindung eingesetzt wird, umfasst im allgemeinen eine Mischung von inaktiviertem Poliovirus der Typen 1, 2 und 3. Eine solche Mischung inaktivierter Poliovirustypen 1, 2 und 3 kann eingesetzt werden in den Zusammensetzungen:
    ca. 20 bis ca. 50 D Antigeneinheiten von Poliovirus Typ 1;
    ca. 5 bis ca. 10 D Antigeneinheiten von Poliovirus Typ 2;
    ca. 20 bis ca. 50 D Antigeneinheiten von Poliovirus Typ 3
    in einer Einzelhumandosis. In einer Formulierung können solche Mischungen inaktivierter Poliovirustypen umfassen:
    ca. 40 D Antigeneinheiten von Poliovirus Typ 1
    ca. 8 D Antigeneinheiten von Poliovirus Typ 2
    ca. 32 D Antigeneinheiten von Poliovirus Typ 3
    in einer Einzelhumandosis.
  • Die Konjugatmolekülkomponente der immunogenen Zusammensetzung kann ein Konjugat von Tetanustoxoid oder Diphtherietoxoid und Polyriboseribitolphosphat (PRP) von Haemophilus influenzae Typ b umfassen. Ein solches Konjugatmolekül kann in einer lyophilisierten Form bereitgestellt werden, welche zur Verabreichung durch Kombination mit den anderen Komponenten rekonstituiert wird. Die immunogene Zusammensetzung kann das Konjugat in einer Menge von ca. 5 bis ca. 15 μg PRP, konjugiert mit ca. 15 bis ca. 35 μg Tetanustoxoid, in einer Einzelhumandosis enthalten. In einer Formulierung wird das Konjugat in einer Menge von ca. 10 μg PRP, konjugiert mit ca. 20 μg Tetanustoxoid, eingesetzt.
  • Bei solchen besonderen Ausführungsformen liefern die immunogenen Zusammensetzungen ein Profil der Immunantwort auf jedes der Pertussisantigene, das darin enthalten ist, und das Antwortprofil, welches von den azellulären Komponenten geliefert wird, entspricht im Wesentlichen dem, das von einem Ganzzellpertussisimpfstoff erzeugt wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird eine multivalente Impfstoffzusammensetzung bereitgestellt, welche pro 0,5 ml-Dosis 20 μg Pertussistoxoid, 20 μg filamentöses Hämagglutinin, 5 μg Fimbrien 2 und 3, 3 μg Pertaktin-Membranprotein, 15 Lf Diphtherietoxoid, 5 Lf Tetanustoxoid, Poliovirus Typ 1 40 D Antigeneinheiten, Poliovirus Typ 2 8 D Antigeneinheiten, 1,5 μg Aluminiumphosphat umfasst.
  • Eine solche Zusammensetzung kann weiterhin pro 0,5 ml-Dosis 10 μg gereinigtes Polyriboseribitolphosphat-Kapselpolysaccharid (PRP) von Haemophilus influenzae Typ b umfassen, das kovalent an 20 μg Tetanustoxoid gebunden ist. Zusätzlich können solche Zusammensetzungen pro 0,5 ml-Dosis 0,6% 2-Phenoxyethanol enthalten.
  • Unter einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Immunisieren eines Wirtes gegen mehrere Krankheiten bereitgestellt, welches das Verabreichen an einen Wirt, welcher ein Mensch sein kann, einer immuneffektiven Menge der immunogenen Zusammensetzung oder des Impfstoffes, wie sie hierin bereitgestellt werden, umfasst.
  • Vorteile der vorliegenden Erfindung beinhalten einen multivalenten Impfstoff, welcher Schutz gegen eine Reihe von häufigen pädiatrischen Krankheiten in einer sicheren und wirksamen Weise verleihen kann. Die Möglichkeit, eine einzige Impfung gegen mehrere Krankheiten bereitzustellen, ohne Störungen zwischen den immunogenen Antworten auf die verschiedenen Immunogene, ist vorteilhaft.
  • Die vorliegende Erfindung wird ferner anhand der folgenden detaillierten Beschreibung und der Beispiele in Bezug auf die begleitende Zeichnung verstanden werden, in welcher:
  • 1 ein schematisches Fließschema eines Vorgangs zur Isolation einer Agglutinogenpräparation aus einem Bordetella-Stamm ist.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • Agglutinogenpräparation
  • Was 1 betrifft, so wird dort ein Fließschema eines Verfahrens zur Herstellung einer Agglutinogenpräparation aus einem Bordetella-Stamm dargestellt. Wie man in 1 sieht, wird eine Bordetella-Zellpaste, welche die Agglutinogene enthält, wie beispielsweise eine B. pertussis-Zellpaste, z.B. mit einem harnstoffhaltigen Puffer wie z.B. 10 mM Kaliumphosphat, 150 mM NaCl und 4 M Harnstoff extrahiert, um die Agglutinogene selektiv aus der Zellpaste zu extrahieren, um einen ersten Überstand (sp1), der die Agglutinogene enthält, und einen ersten Restniederschlag (ppt1) zu erzeugen. Der erste Überstand (sp1) wird von dem ersten Restniederschlag (ppt1) beispielsweise durch Zentrifugation getrennt. Der Restniederschlag (ppt1) wird verworfen. Der aufgeklarte Überstand (sp1) kann dann konzentriert werden und gegen beispielsweise 10 mM Kaliumphosphat/150 mM NaCl/0,1% Triton X-100 diafiltriert werden, indem beispielsweise ein 100 bis 300 kDa NMWL-Membranfilter verwendet wird.
  • Der erste Überstand wird dann bei einer Temperatur und für eine Dauer inkubiert, um einen aufgeklarten Überstand (sp2), der Agglutinogene enthält, und einen zweiten Abfallniederschlag (ppt2), der Nichtagglutinogenverunreingungen enthält, zu erzeugen. Geeignete Temperaturen beinhalten ca. 50°C bis ca. 100°C, einschließlich ca. 75° bis ca. 85°C, und geeignete Inkubationszeiten beinhalten ca. 1 bis 60 Minuten. Der aufgeklarte Überstand wird dann beispielsweise durch die Zugabe von Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von ca. 8000 (PEG 8000) bis zu einer Endkonzentration von ca. 4,5 ± 0,2% konzentriert und für ein Minimum von ca. 30 Minuten leicht gerührt, um einen dritten Niederschlag (ppt3) zu erzeugen, welcher durch Zentrifugation gesammelt werden kann. Der verbleibende Überstand sp3 wird verworfen.
  • Dieser dritte Niederschlag (ppt3) wird beispielsweise mit einem Puffer extrahiert, der 10 mM Kaliumphosphat/150 mM NaCl umfasst, um die rohe, Fimbrienagglutinogen enthaltende Lösung bereitzustellen. 1 M Kaliumphosphat kann zu der rohen Fimbrienlösung zugegeben werden, um diese bezogen auf Kaliumphosphat auf ca. 100 mM zu bringen. Alternativ kann der aufgeklarte Überstand der wärmebehandelten Fimbrienagglutinogene ohne Ausfällung durch Gelfiltrationschromatographie gereinigt werden, indem ein Gel wie z.B. Sepharose CL6B verwendet wird. Die Fimbrienagglutinogene in der rohen Lösung werden dann durch Säulenchromatographie gereinigt, beispielsweise indem sie durch eine PEI-Silicasäule geleitet werden, um die Fimbrienagglutinogenpräparation in dem Durchfluss zu erzeugen.
  • Dieser Fimbrienagglutinogen enthaltende Durchfluss kann weiter konzentriert und gegen beispielsweise einen Puffer diafiltriert werden, welcher 10 mM Kaliumphosphat/150 mM NaCl enthält, indem eine 100-300 kDa NMWL-Membran verwendet wird. Die Agglutinogenpräparation kann durch Filtration durch einen ≤ 0,22 μm Membranfilter sterilisiert werden, um die endgültige gereinigte Fimbrienagglutinogenpräparation, welche die Fimbrienagglutinogene 2 und 3 enthält, die im Wesentlichen frei ist von Agglutinogen 1, bereitzustellen. Das Gewichtsverhältnis von Agg 2 zu Agg 3 kann von ca. 1,5:1 bis ca. 2:1 betragen. Impfstoffe können andere gereinigte Bordetella-Immunogene enthalten, welche filamentöses Hämagglutinin, das 69 kDa-Außenmembranprotein und Pertussistoxin oder ein Toxoid von diesem, einschließlich genetisch detoxifizierter Analoga von PT, wie beispielsweise in Ref. 68 beschrieben wird, enthalten.
  • Die anderen Bordetella-Immunogene, Pertussistoxin (einschließlich genetisch detoxifizierter Analoga von diesen, wie beispielsweise in Klein et al., U.S.-Patent Nr. 5,085,862 beschrieben wird, welches dem Rechtsinhaber hiervon übertragen wurde und auf welches hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird), FHA und das 69 kDa-Protein können in gereinigter Form durch eine Vielzahl von Methoden erzeugt werden, wie beispielsweise nachstehend beschrieben wird.
  • Reinigung von PT
  • PT kann aus dem Kulturüberstand eines B. pertussis-Stammes unter Verwendung herkömmlicher Methoden isoliert werden. Beispielsweise kann die Methode von Sekura et al. (Ref. 55) verwendet werden. PT wird isoliert, indem zuerst der Kulturüberstand auf einer Säule absorbiert wird, welche die Farbstoffliganden-Gelmatrix, Affi-Gel Blue (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) enthält. PT wird von dieser Säule durch Hochsalz wie z.B. 0,75 M Magnesiumchlorid eluiert und, nachdem das Salz entfernt wurde, durch eine Säule einer Fetuin-Sepharose-Affinitätsmatrix geleitet, welche aus Fetuin, verknüpft mit Cyanogenbromid-aktivierter Sepharose, zusammengesetzt ist. PT wird von der Fetuinsäule unter Verwendung von 4 M Magnesiumsalz eluiert.
  • Alternativ kann die Methode von Irons et al. (Ref. 56) verwendet werden. Der Kulturüberstand wird auf einer CNBr-aktivierten Sepharose 4B-Säule, an welche zuerst Haptoglobin kovalent gebunden wird, absorbiert. Das PT bindet bei pH 6,5 an das Absorptionsmittel und wird von der Säule unter Verwendung eines 0,1 M Tris/0,5 M NaCl-Puffers durch eine schrittweise Änderung auf pH 10 eluiert.
  • Alternativ kann die Methode, die in dem U.S.-Patent Nr. 4,705,686, das am 10. November 1987 für Scott et al. erteilt wurde und auf welches hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, beschrieben wird, verwendet werden. Bei dieser Methode werden Kulturüberstände oder zelluläre Extrakte von B. pertussis durch eine Säule eines Anionenaustauscherharzes mit hinreichender Kapazität, um Endotoxin zu adsorbieren, aber Bordetalla-Antigenen zu erlauben, durchzufließen oder anderweitig von dem Endotoxin getrennt zu werden, geleitet.
  • Alternativ kann PT gereinigt werden, indem eine Perlit-Chromatographie verwendet wird, wie sie in dem EP-Patent Nr. 336 736 beschrieben wird, welches dem Rechtsinhaber hiervon übertragen wurde und auf welches hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird.
  • Detoxifikation von PT
  • PT wird detoxifiziert, um unerwünschte Aktivitäten zu entfernen, welche Nebenreaktionen in dem endgültigen Impfstoff hervorrufen könnten. Irgendeine von einer Vielzahl herkömmlicher chemischer Detoxifikationsmethoden kann verwendet werden, wie beispielsweise eine Behandlung mit Formaldehyd, Wasserstoffperoxid, Tetranitromethan oder Glutaraldehyd.
  • Beispielsweise kann PT mit Glutaraldehyd detoxifiziert werden, indem eine Modifikation der Prozedur verwendet wird, die in Munoz et al. (Ref. 57) beschrieben wird. In diesem Detoxifikationsverfahren wird gereinigtes PT in einer Lösung inkubiert, die 0,01 M phosphatgepufferte Salzlösung enthält. Die Lösung wird auf 0,05% Glutaraldehyd gebracht, und die Mischung wird bei Raumtemperatur für zwei Stunden inkubiert, und dann auf 0,02 M L-Lysin gebracht. Die Mischung wird weiter für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und dann für zwei Tage gegen 0,01 M PBS dialysiert. In einer besonderen Ausführungsform kann das Detoxifikationsverfahren aus dem EP-Patent Nr. 336 736 verwendet werden. Kurz gesagt kann PT mit Glutaraldehyd wie folgt detoxifiziert werden:
    Gereinigtes PT in 75 mM Kaliumphosphat bei pH 8,0, welcher 0,22 M Natriumchlorid enthält, wird mit einem gleichen Volumen an Glycerol auf Proteinkonzentrationen von ungefähr 50 bis 400 μg/ml verdünnt. Die Lösung wird auf 37°C erwärmt und durch die Zugabe von Glutaraldehyd bis zu einer Endkonzentration von 0,5% (w/v) detoxifiziert. Die Mischung wird für 4 Stunden bei 37°C gehalten, und dann wird Asparaginsäure (1,5 M) bis zu einer Endkonzentration von 0,25 M zugegeben. Die Mischung wird bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert und dann mit 10 Volumina 10 mM Kaliumphosphat bei pH 8,0, der 0,15 M Natriumchlorid und 5% Glycerol enthält, diafiltriert, um das Glycerol zu verringern und den Glutaraldehyd zu entfernen. Das PT-Toxoid wird durch eine 0,2 μm-Membran sterilfiltriert.
  • Wenn rekombinante Techniken verwendet werden, um ein PT-Mutantenmolekül herzustellen, welches keine oder eine geringe Toxizität zeigt, ist zur Verwendung als das toxoidierte Molekül eine chemische Detoxifikation nicht notwendig.
  • Reinigung von FHA
  • FHA kann aus dem Kulturüberstand gereinigt werden, wie im Wesentlichen von Cowell et al. (Ref. 58) beschrieben wird. Wachstumspromotoren wie z.B. methylierte beta-Cyclodextrine können verwendet werden, um die Ausbeute an FHA in Kulturüberständen zu erhöhen. Der Kulturüberstand wird auf eine Hydroxylapatitsäule aufgetragen. FHA wird an der Säule adsorbiert, PT aber nicht. Die Säule wird gründlich mit Triton X-100 gewaschen, um Endotoxin zu entfernen. FHA wird dann eluiert, indem 0,5 M NaCl in 0,1 M Natriumphosphat verwendet wird, und, wenn nötig, durch eine Fetuin-Sepharose-Säule geleitet, um restliches PT zu entfernen. Eine zusätzliche Reinigung kann eine Durchleitung durch eine Sepharose CL-6B-Säule beinhalten.
  • Alternativ kann FHA gereinigt werden, indem monoklonale Antikörper gegen das Antigen verwendet werden, wobei die Antikörper an einer CNBr-aktivierten Affinitätssäule befestigt werden (Ref. 59).
  • Alternativ kann FHA gereinigt werden, indem eine Perlit-Chromatographie verwendet wird, wie in der oben erwähnten EP 336 736 beschrieben wird.
  • Reinigung des 69 kDa-Außenmembranproteins (Pertaktin)
  • Das 69 kDa-Außenmembranprotein (69K oder Pertaktin) kann aus Bakterienzellen gewonnen werden, indem die Zellen zuerst mit einem bakteriostatischen Mittel wie z.B. Thimerosal inaktiviert werden, wie in der veröffentlichten EP 484 621 beschrieben wird, auf welche hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Die inaktivierten Zellen werden in einem wässrigen Medium wie z.B. PBS (pH 7 bis 8) suspendiert und einer wiederholten Extraktion bei erhöhter Temperatur (45 bis 60°C) mit anschließendem Abkühlen auf Raumtemperatur oder 4°C unterzogen. Die Extraktionen setzen das 69K-Protein aus den Zellen frei. Das Material, welches das 69K-Protein enthält, wird durch Ausfällen gesammelt und durch eine Affi-Gel Blue-Säule geleitet. Das 69K-Protein wird mit einer hohen Konzentration an Salz, wie z.B. 0,5 M Magnesiumchlorid, eluiert. Nach einer Dialyse wird es durch einen chromatofokussierenden Träger geleitet.
  • Alternativ kann das 69 kDa-Protein aus dem Kulturüberstand einer B. pertussis-Kultur gereinigt werden, wie in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 91/15505 beschrieben wird, welche auf den Namen des Rechtsinhabers hiervon läuft und auf welche hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Eine solche Methode ist bevorzugt, da das Pertaktin frei von Adenylatcyclase-Farbstoff-Chromatographiematerialien bereitgestellt wird.
  • Andere geeignete Methoden der Reinigung des 69 kDa-Außenmembranproteins aus B. pertussis werden in dem U.S.-Patent Nr. 5,276,142, das am 4. Januar 1984 für Gotto et al. erteilt wurde, und in dem U.S.-Patent Nr. 5,101,014, welches am 31. März 1992 für Burns erteilt wurde, beschrieben.
  • Andere Komponenten der Erfindung
  • Die Impfstoffe der Erfindung enthalten ebenfalls nicht-Bordetella-Immunogene einschließlich Tetanustoxoid, Diphtherietoxoid, inaktiviertem Poliovirus (IPV) und gegebenenfalls einem Konjugat von Diphtherietoxoid oder Tetanustoxoid und einem Kapselpolysaccharid von Haemophilus influenzae Typ b. Andere mögliche Komponenten der Mehrkomponentenimpfstoffe beinhalten Außenmembranproteine von Haemophilus, Hepatitis B-Oberflächenantigen, Mumps, Masern und Röteln.
  • Die Konjugate des Tetanustoxoids oder Diphtherietoxoids und des Kapselpolysaccharids von Hib können gebildet werden, indem Polyriboseribitolphosphat (PRP), welches aus H. influenzae Typ b isoliert wurde, isoliert wird, das PRP derivatisiert wird, um ein Adipinsäuredihydrazid bereitzustellen, und kovalent mit Tetanustoxoid oder Diphtherietoxoid konjugiert wird, um PRP-T- bzw. PRP-D-Konjugate bereitzustellen.
  • Jedes der Antigene wird einzeln an einem Hilfsmittel wie z.B. Aluminiumphosphat oder Aluminiumhydroxid, die zusammen Alaun genannt werden, absorbiert, um für eine bequeme und schnelle Produktion von Impfstoffen, die ausgewählte relative Mengen dieser Antigene enthalten, in den Impfstoffen, wie sie hierin bereitgestellt werden, zu sorgen.
  • Ausgewählte mulitivalente Impfstoffformulierungen
  • In ausgewählten Ausführungsformen stellt die Erfindung Impfstoffe mit den folgenden Charakteristika bereit (μg Proteine, die hierin verwendet werden, basieren auf den Kjedahl-Testergebnissen, die mit gereinigten Konzentraten durchgeführt wurden, und werden als μg an Stickstoff des Proteins ausgedrückt), welche allesamt durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden können:
  • a) CP20/20/5/3DT-mIPV (HYBRID):
  • Eine Formulierung umfasst eine Kombination des Komponentenpertussisimpfstoffes (CP), kombiniert mit Diphtherie (DI)- und Tetanus (T)-Toxoiden und inaktiviertem Poliovirus (mIPV), und wird CP20/20/5/3DT-mIPV (HYBRID) genannt. Das Poliovirus, welches auf MRC-5-Zellen wachsen gelassen wurde, wird mIPV genannt, während das Poliovirus, welches auf Vero-Zellen wachsen gelassen wurde, IPV oder vIPV genannt wird. Jedes der beiden inaktivierten Poliovirus-Materialien kann austauschbar in den Formulierungen verwendet werden.
  • Jede 0,5 ml-Humandosis von CP20/20/5/3DT-mIPV (HYBRID) wurde so formuliert, dass sie ungefähr enthielt:
    20 μg Pertussistoxoid (PT)
    20 μg filamentöses Hämagglutinin (FHA)
    5 μg Fimbrienagglutinogene 2 und 3 (FIM)
    3 μg Pertaktin-Außenmembranprotein (69 kDa)
    15 Lf Diphtherietoxoid
    5 Lf Tetanustoxoid
    40 D Antigeneinheiten Poliovirus Typ 1
    8 D Antigeneinheiten Poliovirus Typ 2
    32 D Antigeneinheiten Poliovirus Typ 3
    1,5 mg Aluminiumphosphat
    0,6% 2-Phenoxyethanol, als Konservierungsmittel.
  • (b) CP20/20/5/3DT-mIPV (HYBRID) + PRP-T:
  • Eine andere Formulierung umfasst eine Kombination des Komponentenpertussisimpfstoffs (CP), kombiniert mit Diphtherie (D)- und Tetanus (T)-Toxoiden und inaktiviertem Poliovirus (mIPV), die CP20/20/5/3DT-mIPV (HYBRID) genannt wird, und wird verwendet, um lyophylisiertes PRP-T zu rekonstituieren. Die resultierende Zusammensetzung enthält, pro 0,5 ml-Dosis, ca.:
    20 μg Pertussistoxoid (PT)
    20 μg filamentöses Hämagglutinin (FHA)
    5 μg Fimbrienagglutinogene 2 und 3 (FIM)
    3 μg Pertaktin-Außenmembranprotein (69 kDa)
    15 Lf Diphtherietoxoid
    5 Lf Tetanustoxoid
    10 μg gereinigtes Polyriboseribitolphosphat-Kapselpolysaccharid (PRP) von Haemophilus influenzae Typ b, kovalent gebunden an 20 μg Tetanustoxoid
    Poliovirus Typ 1 40 D Antigeneinheiten
    Poliovirus Typ 2 8 D Antigeneinheiten
    Poliovirus Typ 3 32 D Antigeneinheiten
    1,5 mg Aluminiumphosphat
    0,6% 2-Phenoxyethanol
  • (c) CP20/20/5/3DT-PRP-T-IPV (HYBRID):
  • Eine zusätzliche Formulierung umfasst eine Kombination des Komponentenpertussisimpfstoffes (CP), kombiniert mit Diphtherie (D)- und Tetanus (T)-Toxoiden, inaktiviertem Poliovirus (mIPV) und PRP-T, und wird CP20/20/5/3DT-PRP-T-IPV (HYBRID) genannt. Jede 0,5 ml-Humandosis dieser Zusammensetzung enthält ca.:
    20 μg Pertussistoxoid (PT)
    20 μg filamentöses Hämagglutinin (FHA)
    5 μg Fimbrienagglutinogene 2 und 3 (FIM)
    3 μg Pertaktin-Außenmembranprotein (69 kDa)
    15 Lf Diphtherietoxoid
    5 Lf Tetanustoxoid
    10 μg gereinigtes Riboseribitolphosphat-Kapselpolysaccharid (PRP) von Haemophilus influenzae Typ b, kovalent gebunden an 20 μg Tetanustoxoid
    Poliovirus Typ 1 40 D Antigeneinheiten
    Poliovirus Typ 2 8 D Antigeneinheiten
    Poliovirus Typ 3 32 D Antigeneinheiten
    1,5 mg Aluminiumphosphat
    0,6% 2-Phenoxyethanol.
  • Klinische Tests
  • (a) DTP-Komponentenpertussisimpfstoff
  • Eine Anzahl von klinischen Tests wurde wie hierin beschrieben bei Menschen durchgeführt, um die Sicherheit, Nichtreaktogenizität und Nützlichkeit der Komponentenpertussisimpfstoffe festzustellen, welche Fimbrienagglutinogene, die wie hierin beschrieben hergestellt wurden, zum Schutz vor Pertussis enthielten. Insbesondere wurden Immunantworten auf jedes der Antigene, die in den Impfstoffen enthalten waren (wie beispielsweise in Tabelle 3 unten gezeigt), erhalten. Ein besonderer multivalenter Pertussisimpfstoff CP10/5/5/3DT wurde in einem großen Placebo-kontrollierten doppelt randomisierten klinischen Test in mehreren Zentren mit einer menschlichen Population, die einem Risiko ausgesetzt war, analysiert, um die Wirksamkeit des Impfstoffes gegen typische Pertussis festzustellen.
  • Die Falldefinition für die typische Pertussiserkrankung war:
    Einundzwanzig Tage oder mehr spasmischer Husten und entweder durch Kultivierung bestätigte B. pertussis,
    oder
    ein serologischer Beweis einer Bordetella-spezifischen Infektion, welche durch einen IgG- oder IgA-Antikörper-Anstieg von 100% in einem ELISA gegenüber FHA oder PT in Serumpaaren angezeigt wurde,
    oder
    wenn serologische Daten fehlen, das Kind in der Studie in Kontakt mit einem Fall von durch Kultivierung bestätigten B. pertussis in dem Haushalt war, bei einem Einsetzen von Husten innerhalb von 28 Tagen vor oder nach dem Einsetzen von Husten bei dem Kind in der Studie.
  • Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass CP10/5/5/3DDT beim Verhindern von Pertussis, wie sie in der Falldefinition für eine typische Pertussiserkrankung, wie sie oben beschrieben ist, definiert ist, zu ca. 85% wirksam war. In derselben Studie war ein azellulärer Zweikomponentenpertussisimpfstoff, welcher nur PT und FHA enthielt, zu ca. 58% wirksam (PT25·FHA25·DT), und ein Ganzzellpertussisimpfstoff (DTP) war zu ca. 48% wirksam (siehe Tabelle 4 unten). Zusätzlich verhinderte der CP10/5/5/3DT-Impfstoff eine schwache Pertussis, welche als ein Husten von wenigstens einem Tag Dauer definiert war, bei einer Wirksamkeit von ca. 77%. Insbesondere war das Profil der erhaltenen Immunantwort im Wesentlichen dasselbe wie das, welches nach Immunisierung mit Ganzzellpertussisimpfstoffen erhalten wurde, von welchen berichtet wurde, dass diese in hohem Maße wirksam gegen Pertussis sind.
  • (b) Multivalenter DPT-PRP-T-IPV-Impfstoff
    • (I) Die Sicherheit und Immunogenität von Komponentenpertussisimpfstoffen in Kombination mit adsorbiertem Diphtherietoxoid und Tetanustoxoid, Haemophilus influenzae Typ b-Tetanustoxoid-Konjugatimpfstoff und inaktiviertem Poliomyelitisimpfstoff, welcher auf Vero-Zellen wachsen gelassen wurde (CP20/20/5/3DT-PRP-T-IPV), wurden mit Ganzzellpertussisimpfstoff (a) in Kombination mit adsorbierten Diphtherie- und Tetanustoxoiden und inaktiviertem Poliomyelitisimpfstoff, (b) in Kombination mit adsorbierten Diphtherie- und Tetanustoxoiden und inaktiviertem Poliomyelitisimpfstoff, der auf MRC-5-Zellen wachsen gelassen wurde (DPT-Polio adsorbiert), welcher verwendet wurde, um lyophilisierten Haemophilus influenzae Typ b-Tetanustoxoid-Konjugatimpfstoff (PENTATM) zu rekonstituieren, oder (c) Komponentenpertussisimpfstoff in Kombination mit adsorbierten Diphtherie- und Tetanustoxoiden, Haemophilus influenzae Typ b-Tetanustoxoid-Konjugatimpfstoff und inaktiviertem Poliomyelitisimpfstoff, welcher auf MRC-5-Zellen wachsen gelassen wurde (CP20/20/5/3DT-mIPV), welcher separat davon gegeben wurde oder verwendet wurde, um lyophilisierten Haemophilus influenzae Typ b-Tetanustoxoid-Konjugatimpfstoff (PRP-T) zu rekonstituieren, bei Kindern im Alter von 2, 4, 6 und 18 Monaten verglichen.
  • Dieser randomisierte kontrollierte Test registrierte 897 zwei Monate alte Säuglinge, welche einen von acht verschiedenen Impfstoffarmen (vaccine arms) erhielten: C20/20/5/3DT-PRP-T-IPV (flüssig); CP20/20/5/3DT, welcher gleichzeitig mit PRP-T aber an anderer Stelle gegeben wurde; oder den Kontrollimpfstoff, Ganzzell-DPT-Polio, welcher verwendet wurde, um PRP-T zu rekonstituieren (PENTATM).
  • Alle Impfstoffe der Studie wurden gut vertragen. Man beobachtete keine signifikanten Unterschiede bei den Reaktionsgeschwindigkeiten zwischen den zwei Typen von rekombinanten Pertussiskombinationen. Kinder, welche den kombinierten CP20/20/5/3DT-mIPV erhielten, der verwendet wurde, um PRP-T zu rekonstituieren, wiesen etwas höhere Raten an lokalen Reaktionen auf im Vergleich zu denselben Produkten, die an verschiedenen Stellen verabreicht wurden. Alle Komponentenpertussiskombinationen wiesen beständig niedrigere Raten von lokalen und systemischen Reaktionen auf als die Ganzzellkombination. Unterschiede bei den Reaktionsraten zwischen Komponentenpertussis- und Ganzzellimpfstoffen waren in den 24 Stunden unmittelbar nach der Impfung am deutlichsten sichtbar.
  • Beide Komponentenpertussiskombinationen erzeugten ausgezeichnete Antworten auf alle Antigene. In allen Situationen waren die Pertussis PT-, FHA- und Pertaktin-Antworten den Antworten überlegen, die man mit Ganzzellkombinationen beobachtete. Es wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet zwischen Komponenten- und Ganzzellkombinationen. Es wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet zwischen Komponenten- und Ganzzellformulierungen für anti-PRP, Diphtherie und Polio 1 und 2. Beide Komponentenpertussisformulierungen erzeugten höhere Tetanusantworten als PENTATM. Beide Komponentenformulierungen erzeugten ähnliche serologische Antworten auf alle Antigene außer Polio 3, für welches CP20/20/5/3DT-mIPV, das verwendet wurde, um PRP-T zu rekonstituieren, höhere Antworten erzeugte als CP20/20/5/3DT-PRP-T-IPV. Die Methode der Verabreichung beeinflusste die serologischen Antworten auf beliebige Antigene, außer Tetanus, nicht. In beiden kombinierten und separaten Gruppen waren 100% der Kinder nach 3 Dosen des Impfstoffes gegen Tetanus geschützt (> 0,01 EU/ml).
  • Am wichtigsten ist, dass alle Impfstoffgruppen gute Antworten auf PRP-T aufwiesen, wobei 98,3% der Kinder Spiegel > 0,15 μg/ml erreichten und über 86,1% der Kinder Spiegel > 1,0 μg/ml erreichten. Diese Zahlen sind vergleichbar mit jenen, die in vorhergehenden Studien beobachtet wurden, bei welchen Ganzzellpertussisimpfstoffe mit PRP-T verwendet wurden.
  • Die serologischen Antworten, die erhalten wurden und oben beschrieben sind, werden in den Tabellen 5 bis 7 gezeigt (H = Hybrid).
    • (II) Die Sicherheit und Immunogenität des Komponentenpertussisimpfstoffes in Kombination mit adsorbierten Diphtherie- und Tetanustoxoiden und inaktiviertem Poliomyelitisimpfstoff, der auf MRC-5-Zellen wachsen gelassen wurde (CP20/20/5/3DT-mIPV), welcher separat gegeben wurde oder verwendet wurde, um lyophilisierten Haemophilus influenzae Typ b-Tetanustoxoid-Konjugatimpfstoff (PRP-T) zu rekonstituieren, wurden mit Ganzzellpertussisimpfstoff in Kombination mit adsorbierten Diphtherie- und Tetanustoxoiden und inaktiviertem Poliomyelitisimpfstoff, der auf MRC-5-Zellen wachsen gelassen wurde (DPT-Polio adsorbiert), welcher verwendet wurde, um lyophilisierten Haemophilus influenzae Typ b-Tetanustoxoid-Konjugatimpfstoff (PENTATM) zu rekonstituieren, bei Kindern im Alter von 18 bis 19 Monaten verglichen.
  • Diese fünfarmige Studie beinhaltete einen Ganzzell-PENTATM-Kontrollarm und CP20/20/5/3DT-mIPV, welcher verwendet wurde, um PRP-T zu rekonstituieren. Der fünften Gruppe wurde CP20/20/5/3DT-mIPV gleichzeitig mit PRP-T aber an anderer Stelle gegeben. Vierhundertundneunundachtzig Versuchspersonen erhielten Impfstoff im Alter von 18 bis 19 Monaten, von welchen 466 (95%) die Studie gemäß dem Protokoll abschlossen. CP20/20/5/3DT-mIPV, welcher verwendet wurde, um PRP-T zu rekonstituieren, war signifikant weniger reaktogen als PENTATM, insbesondere innerhalb der ersten 24 Stunden nach der Impfung. Das rekonstituierte Produkt wies geringfügig höhere Raten der lokalen Reaktionen auf als das separat verabreichte Produkt.
  • PENTATM erzeugte höhere Polio 1-Antworten als CP20/20/5/3DT-mIPV, welches verwendet wurde, um PRP-T zu rekonstituieren. Keine signifikanten Unterschiede wurden für anti-PRP, Diphtherie, Pertussisagglutinin, Fimbrien, Polio 2 oder Polio 3 beobachtet. CP20/20/5/3DT-mIPV, welches verwendet wurde, um PRP-T zu rekonstituieren, erzeugte signifikant höhere serologische Pertussis PT-, FHA- und Pertaktin-Antworten. CP20/20/5/3DT-mIPV, welches verwendet wurde, um PRP-T zu rekonstituieren, erzeugte beständige serologische Antworten auf alte getesteten Antigene. Es wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet zwischen CP20/20/5/3DT-mIPV, das separat gegeben wurde, gegenüber der Verwendung, um PRP-T zu rekonstituieren, außer im Hinblick auf das Tetanusantitoxin (6,78 gegenüber 4,91 EU/ml).
  • Diese Studie zeigte, dass CP20/20/5/3DT-mIPV, welches verwendet wurde, um PRP-T zu rekonstituieren, beständige serologische Antworten in drei Proben erzeugte und stärker immunogen war als PENTATM bei den Pertussisantworten. CP20/20/5/3DT-mIPV erzeugte ebenfalls signifikant niedrigere Raten der lokalen und systemischen Reaktionen als PENTATM.
    • (III) Die Sicherheit und Immunogenität des Komponentenpertussisimpfstoffes, kombiniert mit adsorbierten Diphtherie- und Tetanustoxoiden und inaktiviertem Poliomyelitisimpfstoff, welcher auf MRC-5-Zellen wachsen gelassen wurde (CP20/20/5/3DT-mIPV), wurden mit Ganzzellpertussisimpfstoff in Kombination mit adsorbierten Diphtherie- und Tetanustoxoiden und inaktivierten Poliomyelitisimpfstoff, welcher auf MRC-5-Zellen wachsen gelassen wurde (DPT-Polio adsorbiert), bei Kindern im Alter von 4 bis 6 Jahren verglichen.
  • Einhundertundvierundsechzig Versuchspersonen wurden zufällig in einem Verhältnis von 4 zu 1 eingeteilt, um entweder CP20/20/5/3DT-mIPV (n=131) oder DPT-Polio (n=33) zu erhalten. Bei der Studie traten keine signifikanten oder ernsten nachteiligen Ereignisse auf. CP20/20/5/3DT-mIPV wies insbesondere in dem Zeitraum von 0 bis 24 Stunden beständig niedrigere Raten von sowohl den lokalen als auch den systemischen Reaktionen auf. Die lokalen Reaktionen waren für beide Gruppen häufig, wobei 97% der DPT-Polio- und 76,9% der CP20/20/5/3DT-mIPV-Empfänger in dem Zeitraum von 0 bis 24 Stunden eine gewisse lokale Reaktion aufwiesen. Die lokalen Reaktionen von CP20/20/5/3DT-mIPV waren gewöhnlich schwach oder mäßig. Im Gegensatz dazu wies mehr als die Hälfte der DPT-Polio-Empfänger lokale Reaktionen auf die als schwer eingestuft wurden. Die Empfindlichkeit der Injektionsstelle verschwand gewöhnlich in 72 Stunden, aber eine Rötung oder Schwellung neigte dazu, bis in den Zeitraum von 24 bis 72 Stunden hinein deutlich anzuhalten.
  • Systemische Reaktionen in dem Zeitraum von 0 bis 24 Stunden waren bei den CP20/20/5/3DT-mIPV-Empfängern weniger häufig (38,5%) als bei den DPT-Polio-Empfängern (90,9%). Systemische Reaktionen in dem Zeitraum von 24 bis 72 Stunden waren für beide Gruppen selten.
  • Die Diphtherie-, Tetanus-, Polio 2- und 3-Antworten waren bei den zwei Impfstoffen vergleichbar. DPT-Polio-Empfänger wiesen eine signifikant höhere Polio 1-Antwort auf (15.462) als es die CP20/20/5/3DT-mIPV-Empfänger taten (10.903). Alle Versuchspersonen wiesen ausgezeichnete Antworten auf und würden als gegen die entspre chenden Krankheiten geschützt betrachtet werden. Die serologischen Antworten auf alle Pertussisantigene waren bei den CP20/20/5/3DT-mIPV-Empfängern signifikant höher.
    • (IV) Die Sicherheit und Immunogenität des Komponentenpertussisimpfstoffes in Kombination mit adsorbierten Diphtherie- und Tetanustoxoiden, Haemophilus influenzae Typ b-Tetanustoxoid-Konjugatimpfstoff und inaktiviertem Poliomyelitisimpfstoff, welcher auf MRC-5-Zellen wachsen gelassen wurde (CP20/20/5/3DT-PRP-T-mIPV), wurden mit Ganzzellpertussisimpfstoff in Kombination mit adsorbierten Diphtherie- und Tetanustoxoiden und inaktiviertem Poliomyelitisimpfstoff, welcher auf MRC-5-Zellen wachsen gelassen wurde (DPT-Polio adsorbiert), welcher verwendet wurde, um lyophilisierten Haemophilus influenzae Typ b-Tetanustoxoid-Konjugatimpfstoff (PENTATM) zu rekonstituieren, oder Komponentenpertussisimpfstoff in Kombination mit adsorbierten Diphtherie- und Tetanustoxoiden und inaktiviertem Poliomyelitisimpfstoff, welcher auf MRC-5-Zellen wachsen gelassen wurde (CP20/20/5/3DT-mIPV), welcher verwendet wurde, um lyophilisierten Haemophilus influenzae Typ b-Tetanustoxoid-Konjugatimpfstoff (PRP-T) zu rekonstituieren, bei Kindern im Alter von 18 bis 19 Monaten verglichen.
  • Der Zweck dieser dreiarmigen randomisierten kontrollierten Einzelblindstudie war es, die Sicherheit und Immunogenität der zwei neuen azellulären Pertussiskombinationen, CP20/20/5/3DT-PRP-T-IPV und CP20/20/5/3DT-mIPV, welches verwendet wurde, um PRP-T zu rekonstituieren, mit PENTATM (Ganzzellpertussis-DPT-Polio, welcher verwendet wurde, um PRP-T zu rekonstituieren) bei Kindern im Alter von 18 bis 19 Monaten festzustellen. Eine Gesamtzahl von 99 Kindern, 33 in jeder der drei Impfstoffgruppen, nahmen teil, von denen 97 (98%) die Studie gemäß dem Protokoll abschlossen.
  • Bei dieser Studie wurden keine schweren Reaktionen beobachtet. Bei PENTATM-Empfängern war es signifikant wahrscheinlicher, dass diese mäßige oder schwere lokale und systemische Reaktionen erfuhren, als bei Empfängern der anderen zwei Impfstoffe. Die Unterschiede waren am deutlichsten nach 24 Stunden und erreichten eine statistische Signifikanz für Fieber, Rötung, Schwellung, Empfindlichkeit, Aufregung (fussiness), verminderte Aktivität und weniger Essen. Die Reaktionen neigten bei Kindern, welche die Komponentenpertussiskombinationen erhielten, dazu, schwach zu sein. Es wurden keine signifikanten Unterschiede bei den Reaktionsraten zwischen den zwei Komponentenpertussisformulierungen beobachtet, auch wenn die Aufregung nach 24 Stunden häufiger bei denen, welche CP20/20/5/3DT-mIPV erhielten, das verwendet wurde, um PRP-T zu rekonstituieren, gegenüber CP20/20/5/3DT-PRP-T-IPV beobachtet wurde (18% gegenüber 3%).
  • Die serologischen Antworten waren zufrieden stellend, wobei 100% der Teilnehmer Spiegel erreichten, die für Diphtherieantitoxin (≥ 0,01 IU/ml), Tetanusantitoxin (≥ 0,01 IU/ml) und anti-PRP (≥ 1,0 μg/ml) als protektiv angesehen wurden. Nachweisbare neutralisierende Antikörper gegen die Poliotypen 1, 2 und 3 wurden bei allen Teilnehmern nach der Immunisierung beobachtet.
  • Die Diphtherieantworten waren bei PENTATM-Empfängern höher, was den höheren Antigengehalt dieses Impfstoffes widerspiegelt (25 Lf gegenüber 15 Lf).
  • Die Pertussisantikörper waren bei den Zweikomponentenpertussiskombinationen gegenüber PENTATM beständig höher, wobei eine statistische Signifikanz für die anti-PT-, anti-FHA- und anti-Pertaktin-GMT-Antworten erreicht wurde. Anti-Fimbrien- und Pertussisagglutinierungsantikörper waren ebenfalls bei den Empfängern von Komponentenpertussis höher, auch wenn die Unterschiede keine statistische Signifikanz erreichten.
  • Zusammengefasst zeigte diese Studie, dass die zwei azellulären Pertussiskombinationen CP20/20/5/3DT-mIPV, welches verwendet wurde, um PFP-T zu rekonstitutieren, und CP20/20/5/3DT-PRP-T-IPV vergleichbar waren und zufrieden stellend niedrige Reaktionsraten und hohe serologische Antworten erzeugten, wenn sie Kindern im Alter von 18 bis 19 Monaten als eine Auffrischung gegeben wurden.
    • (V) Die Sicherheit und Immunogenität des Komponentenpertussisimpfstoffes in Kombination mit adsorbiertem Diphtherie- und Tetanustoxoid (CP20/20/5/3DT), allein oder in Kombination mit einem oder zwei inaktivierten Polioviren, eines mIPV, welches auf MRC-5-Zellen wachsen gelassen wurde, und das andere vIPV, welches auf Vero-Zellen wachsen gelassen wurde, oder oralem Poliomyelitisimpfstoff (OPV) bei Kindern im Alter von 17 bis 19 Monaten.
  • Diese fünfarmige Studie wurde geplant, um die Wechselwirkung zwischen CP20/20/5/3DT und zwei IPVs (die auf Vero-Zellen oder auf MRC-5-Zellen wachsen gelassen wurden) zu untersuchen. Beide IPVs wurden mit CP20/20/5/3DT-mIPV und CP20/20/5/3DT-vIPV zu einem einzigen flüssigen Produkt kombiniert oder gleichzeitig, aber an einer separaten Injektionsstelle, gegeben (CP20/20/5/3DT+mIPV und CP20/20/5/3DT+vIPV). Eine fünfte Studiengruppe erhielt gleichzeitig CP20/20/5/3DT und OPV. Alle Versuchspersonen erhielten PRP-T bei der Blutentnahme nach der Immunisierung. Anti-PRP-Antworten wurden in dieser Studie nicht bewertet.
  • Planung der Studie
    Figure 00310001
  • Im Allgemeinen gab es keine Unterschiede bei den Raten der Gegenreaktionen (adverse reactions), welche nach den von MRC-5- oder Vero-Zellen abgeleiteten inaktivierten Poliomyelitisimpfstoffen berichtet wurden, egal ob der Impfstoff als eine separate Injektion oder kombiniert mit dem CP20/20/5/3DT (HYBRID)-Impfstoff gegeben wurde.
  • Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen für PT, FHA und Pertaktin beobachtet. Die Antworten bei Kindern, welche CP20/20/5/3DT (HYBRID) und OPV erhielten, waren für FIM, Pertussisagglutinin, Diphtherie und Tetanus leicht aber nicht signifikant höher als bei Kindern, welche CP20/20/5/3DT (HYBRID) und Vero-Zell-IPV erhielten. Die Polioantworten waren im Allgemeinen vergleichbar oder höher bei Kindern, die einen IPV erhielten, gegenüber einem OPV-Impfstoff. Alle außer einem Individuum wiesen Pertussisagglutinin > 1:64 auf. Alle außer einem Individuum erreichten Diphtherieantitoxinspiegel ≥ 0,1 U/ml, und alle erreichten Tetanusantitoxinspiegel ≥ 0,1 EU/ml.
  • Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass CP20/20/5/3DT (HYBRID) in Kombination mit IPV (entweder MRC-5- oder Vero-Zellen) bei Kindern im Alter von 17 bis 19 Monaten sicher und immunogen ist. Die Kombinationsimpfstoffe waren wenigstens genauso immunogen wie der Impfstoff, der in Form von separaten Injektionen gegeben wurde, und in manchen Fällen immunogener. Das Kombinieren des Impfstoffes zu einer einzigen Injektion war nicht mit einer signifikanten Zunahme bei lokalen Gegenreaktionen verbunden. Es wurden keine substantiellen Unterschiede bei den Gegenreaktionen oder der Immunantwort auf die zwei IPV-Präparationen, entweder als separate Injektionen oder als kombinierte Produkte, nachgewiesen. Die Aufnahme von IPV erhöhte nicht die Rate der Gegenreaktionen im Vergleich zu CP20/20/5/3DT (HYBRID), das allein gegeben wurde (d. h. mit OPV).
  • Die serologischen Ergebnisse, die in dieser Studie erhalten wurden, sind in Tabelle 8 zusammengefasst (H = Hybrid).
    • (VI) (Zum Vergleich) Die Sicherheit und Immunogenität der Komponentenpertussisimpfstoffe in Kombination mit adsorbierten Diphtherie- und Tetanustoxoiden (CP20/20/5/3DT und CP10/5/5/3DT) allein oder in Kombination mit Haemophilus influenzae Typ b-Konjugatimpfstoff wurden bei Kindern im Alter von 17 bis 19 Monaten bestimmt.
  • Die sechsarmige Studie wurde geplant, um die Wechselwirkung zwischen sowohl klassischen (CP10/5/5/3DT) als auch Hybrid (CP20/20/5/3DT)-Komponentenpertussisformulierungen und dem Haemophilus influenzae Typ B-Konjugatimpfstoff (PRP-T) bei Kindern im Alter von 18 bis 19 Monaten zu untersuchen.
  • Drei Zeitpläne wurden verwendet, bei welchen (a) jeder der Komponentenpertussisimpfstoffe verwendet wurde, um PRP-T zu rekonstituieren, (b) diese gleichzeitig mit PRP-T aber an einer separaten Stelle gegeben wurden, oder (c) PRP-T 1 Monat nach dem Komponentenpertussisimpfstoff gegeben wurde. Alle Kinder erhielten OPV bei der ersten Visite und wurden im Alter von 2, 4 und 6 Monaten mit demselben Komponentenpertussisimpfstoff versorgt (primed). Alle Kinder hatten vorher an der großen Sicherheitsstudie mit diesen zwei Impfstoffformulierungen teilgenommen.
  • Eine Gesamtzahl von 545 Versuchspersonen war in der Studie registriert, von welchen 542 (99%) die Studie beendeten.
  • PLANUNG DER STUDIE
    Figure 00330001
  • Die serologischen Antworten waren im Allgemeinen für die meisten Antigene höher, wenn ein Komponentenpertussiskombinationsimpfstoff und PRP-T am gleichen Tag gegeben wurden, im Vergleich zu getrennten Tagen (siehe Tabelle 9).
  • Wichtig ist, dass die anti-PRP-Antworten, wenn PRP-T separat gegeben wurde, gegenüber einer Kombination mit einem Komponentenpertussiskombinationsimpfstoff am selben Tag nicht verringert wurden. Nach der Immunisierung waren die GMTs bei Kindern, welchen die Impfstoffe an separaten Tagen gegeben wurden, signifikant niedriger. Unterschiede bei den anti-PRP-Antworten zwischen kombinierten und separaten Injektionen wurden beobachtet, wenn die Versuchspersonen nach der Komponentenpertussisimpfstoffformulierung gruppiert wurden. Empfänger von CP20/20/5/3DT (HYBRID) zeigten niedrigere anti-PRP-Spiegel, wenn der Impfstoff kombiniert und nicht separat gegeben wurde. Diese Unterschiede wurden bei den CP10/5/5/3DT-Empfängern nicht beobachtet, und die Unterschiede verschwanden, wenn die Gruppen kombiniert wurden. Alle Teilnehmer erreichten anti-PRP-Spiegel ≥ 0,15 μg/ml, und über 98% jeder Gruppe hatten einen Spiegel ≥ 1,0 μg/ml. Nur vier (0,7%) Teilnehmer in der Studie erreichten diesen Spiegel nicht; drei in der Gruppe mit separaten Injektionen an separaten Tagen und einer in der Gruppe mit kombinierter Injektion. Über 82% von jeder Gruppe überschritten Titer von 10 μg/ml anti-PRP-Antikörper.
  • Von den hervorgerufenen lokalen Reaktionen wurde nur bei der Empfindlichkeit berichtet, dass sie in der kombinierten Gruppe (27,8%) im Vergleich zu der Gruppe mit Impfung an separaten Tagen (16,7%) häufiger war. Diese Rate war nicht verschieden von der, die in der Gruppe beobachtet wurde, wo die Impfstoffe am selben Tag als separate Injektionen gegeben wurden (24,2%).
  • Insgesamt wurde eine systemische Reaktion mit ähnlicher Häufigkeit (60 bis 62,1%) bei Teilnehmern von jeder der Impfstoffgruppen berichtet. Fieber wurde bei ungefähr einem Drittel der Teilnehmer berichtet. Nur Aufgeregtheit wurde häufiger in der Gruppe mit kombinierter Injektion (33,3%) im Vergleich zu den Gruppen mit separater Injektion (22,0%) oder an separaten Tagen (22,8%) berichtet.
  • Um die Ergebnisse dieses Tests zusammenzufassen, störte eine gleichzeitige Verabreichung von CP10/5/5/3DT oder CP20/20/5/3DT und PRP-T am selben Tag nicht die anti-PRP-Antworten, sondern könnte diese tatsächlich erhöht haben. Die serologischen Antworten auf andere Antigene waren ebenfalls ausgezeichnet. Tetanus war das einzige Antigen, das beeinträchtigt wurde, wenn die zwei Impfstoffe zusammengemischt wurden, aber alle Kinder wiesen hohe Schutzspiegel auf.
  • Für die letzteren klinischen Tests wurden CP10/5/5/3DT-IPV, welcher auf MRC-5-Zellen wachsen gelassen wurde, zur Rekonstitution mit ActHib (PRP-T) und A5I (CP10/5/5/3DT-PRP-T-IPV, welcher auf Vero-Zellen wachsen gelassen wurde, 3 μg/ml) hergestellt. Komponentenpertussisantigene wurden in Abwesenheit eines Konservierungsmittels einzeln an 3 mg/ml Aluminiumphosphat adsorbiert. In dieser Hinsicht lag PT in 10 mM Kaliumphosphat, 0,15 M NaCl, 5% Glycerol vor, FHA lag in 10 mM Kaliumphosphat, 0,5 M NaCl vor, 69 K lag in 10 mM Kaliumphosphat, 0,15 M NaCl vor und Fimbrien lagen in 10 mM Kaliumphosphat, 0,15 M NaCl vor. D war in einer Konzentration von 300 Lf/ml an Aluminiumphosphat absorbiert (6,25 mg/ml). 2-Phenoxyethanol wird als ein Konservierungsmittel bis auf 0,6% zugegeben. T war in einer Konzentration von 300 Lf/ml an Aluminiumphosphat adsorbiert (6,25 mg/ml). 2-Phenoxyethanol wird bis auf 0,6% zugegeben.
  • Die adsorbierten Komponentenpertussisantigene wurden mit adsorbiertem D und adsorbiertem T in einer Konzentration von 3,65 Dosen/ml oder 55% des Endvolumens kombiniert. Der 2-Phenoxyethanolgehalt betrug 0,6%. Vor der Kombination mit mIPV oder v-IPV/PRP-T wurden die Sterilität, der Aluminiumgehalt und der 2-Phenoxyethanolgehalt bestätigt. Für 5 ml wurden m-IPV und 2-Phenoxyethanol zugegeben und zu der Endstärke verdünnt. Für A5I wurden v-IPV, PRP-T und 2-Phenoxyethanol zugegeben und auf die Endstärke verdünnt.
  • Als Zusammenfassung der Ergebnisse des klinischen Tests mit multivalenten Impfstoffen kann man beobachten, dass CP20/20/5/3DT-mIPV, welches verwendet wird, um PRP-T zu rekonstituieren, vergleichbare serologische Antworten auf Diphtherie, Tetanus und Polio 1, 2 und 3 im Vergleich zu PENTATM (enthaltend Ganzzellpertussisimpfstoff) erzeugt. Die anti-PRP-Antworten sind vergleichbar oder höher als jene, die mit PENTATM sowohl bei Säuglings- als auch Auffrischungsdosen beobachtet werden. Die Tetanusantworten sind niedriger als bei CP20/20/5/3DT-mIPV, das verwendet wird, um PRP-T zu rekonstituieren, wenn es mit CP20/20/5/3DT-mIPV verglichen wird, das separat von PRP-T gegeben wird, aber diese Verringerung ist klinisch nicht relevant. In Übereinstimmung mit anderen Studien erzeugt der Ganzzellimpfstoff vergleichbare oder höhere Fimbrien- und Agglutininantworten als der Komponentenpertussisimpfstoff, jedoch ist von dem verwendeten Ganzzellimpfstoff bekannt, dass dieser eine in hohem Maße immunogene Fimbrienkomponente enthält. Alle anderen Pertussisantworten waren mit CP20/20/5/3DT-mIPV, das verwendet wurde, um PRP-T zu rekonstituieren, beständig höher als mit PENTATM. Somit stellt die vorliegende Erfindung multivalente immunogene Zusammensetzungen bereit, bei welchen die Immunantworten auf die Antigene durch die anderen Komponenten oder durch deren Aufnahme in den multivalenten Impfstoff nicht verringert oder verschlechtert werden. Abgeschwächte Immunantworten werden manchmal als Störung bezeichnet.
  • Impfstoffherstellung und Verwendung
  • So können immunogene Zusammensetzungen, die zur Verwendung als Impfstoffe geeignet sind, wie hierin offenbart aus den Immunogenen hergestellt werden. Der Impfstoff ruft eine Immunantwort in einer Versuchsperson hervor, welche Antikörper erzeugt.
  • Immunogene Zusammensetzungen, die Impfstoffe einschließen, können als injizierbare Formen, als flüssige Lösungen oder Emulsionen hergestellt werden. Die Immunogene können mit pharmazeutisch verträglichen Trägern, welche mit den Immunogenen kompatibel sind, gemischt werden. Solche Träger können Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glycerol, Ethanol und Kombinationen von diesen beinhalten. Die immunogenen Zusammensetzungen und Impfstoffe können weiterhin Hilfssubstanzen wie z.B. Befeuchtungs- oder Emulgiermittel, pH-Puffermittel oder Hilfsmittel enthalten, um deren Effektivität zu erhöhen. Immunogene Zusammensetzungen und Impfstoffe können parenteral durch subkutane oder intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Die immunogenen Präparationen und Impfstoffe werden in einer Weise, die mit der Dosisformulierung kompatibel ist, und in einer solchen Menge, dass sie therapeutisch wirksam, immunogen und protektiv sein werden, verabreicht.
  • Die zu verabreichende Menge hängt von der Person, die behandelt wird, ab, einschließlich z.B. der Fähigkeit des Immunsystems des Einzelnen, Antikörper zu synthetisieren und wenn nötig eine zellvermittelte Immunantwort zu erzeugen. Die genauen Mengen an aktivem Bestandteil, die zur Verabreichung benötigt werden, hängen von der Beurteilung des praktizierenden Arztes ab. Jedoch können geeignete Dosierungsbereiche leicht von einem Fachmann bestimmt werden und können in der Größenordnung von Mikrogramm der Immunogene liegen. Die geeigneten Therapien für die anfängliche Verabreichung und Auffrischungsdosen sind ebenfalls variabel, können aber eine anfängliche Verabreichung einschießen, auf welche anschließende Verabreichungen folgen. Die Dosierung kann ebenfalls von dem Verabreichungsweg abhängen und wird entsprechend der Größe des Wirtes variieren.
  • Die Konzentration der Immunogene in einer immunogenen Zusammensetzung gemäß der Erfindung beträgt im Allgemeinen ca. 1 bis ca. 95%. Die Immunogenität kann signifikant verbessert werden, wenn die Antigene zusammen mit Hilfsmitteln verabreicht werden, die oft als eine 0,005 bis 0,5%ige Lösung in phosphatgepufferter Salzlösung verwendet werden. Hilfsmittel verstärken die Immunogenität eines Antigens, sind aber selbst nicht notwendigerweise immunogen. Hilfsmittel können wirken, indem sie das Antigen lokal neben der Stelle der Verabreichung zurückhalten, um eine Depotwirkung zu erzeugen, welche eine langsame, verzögerte Freisetzung des Antigens an die Zellen des Immunsystems erleichtert. Hilfsmittel können ebenfalls Zellen des Immunsystems zu dem Antigendepot hinziehen und solche Zellen stimulieren, damit sie Immunantworten hervorrufen.
  • Immunstimulatorische Mittel oder Hilfsmittel sind über viele Jahre hinweg verwendet worden, um die Immunantworten von Wirten auf beispielsweise Impfstoffe zu verbessern. Intrinsische Hilfsmittel, wie z.B. Lipopolysaccharide, sind normalerweise die Komponenten der getöteten oder abgeschwächten Bakterien, die als Impfstoffe verwendet werden. Extrinsische Hilfsmittel sind Immunmodulatoren, welche typischerweise nicht kovalent mit Antigenen verknüpft sind und so formuliert sind, dass sie die Immunantworten des Wirts verstärken. So sind Hilfsmittel identifiziert worden, welche die Immunantwort auf Antigene, die parenteral gegeben werden, verstärken. Einige dieser Hilfsmittel sind jedoch toxisch und können unerwünschte Nebenwirkungen verursachen, was diese zur Verwendung bei Menschen und vielen Tieren ungeeignet macht. Tatsächlich werden nur Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat (zusammen üblicherweise als Alaun bezeichnet) routinemäßig als Hilfsmittel in Human- und Veterinärimpfstoffen verwendet. Die Wirksamkeit von Alaun bei der Verstärkung der Antikörperantworten auf Diphtherie- und Tetanustoxoide ist gut etabliert.
  • Ein weiter Bereich extrinsischer Hilfsmittel kann starke Immunantworten auf Antigene hervorrufen. Diese beinhalten Saponine, welche mit Membranproteinantigenen komplexiert sind (immunstimulierende Komplexe), pluronische Polymere mit Mineralöl, abgetötete Mykobakterien in Mineralöl, Freund's vollständiges Adjuvans, Bakterienprodukte wie z.B. Muramyldipeptid (MDP) und Lipopolysaccharid (LPS), wie auch Lipid A und Liposomen.
  • Um effizient humorale Immunantworten (HIR) und eine zellvermittelte Immunität (CMI) hervorzurufen, werden Immunogene oft in Hilfsmitteln emulgiert. Viele Hilfsmittel sind toxisch, induzieren Granulome, akute und chronische Entzündungen (Freund's vollständiges Adjuvans, FCA), Zytolyse (Saponine und pluronische Polymere) und Pyrogenizität, Arthritis und Uveitis anterior (LPS und MDP). Auch wenn FCA ein ausgezeichnetes Hilfsmittel ist und in der Forschung weithin verwendet wird, ist es zur Verwendung in Human- oder Veterinärimpfstoffen aufgrund seiner Toxizität nicht zugelassen.
  • Wünschenswerte Charakteristika idealer Hilfsmittel beinhalten:
    • (1) Fehlen von Toxizität;
    • (2) die Fähigkeit, eine lang andauernde Immunantwort zu stimulieren;
    • (3) Einfachheit der Herstellung und Stabilität bei der Langzeitlagerung;
    • (4) die Fähigkeit, sowohl eine CMI als auch HIR auf Antigene hervorzurufen, welche über verschiede Wege verabreicht werden;
    • (5) Synergie mit anderen Hilfsmitteln;
    • (6) die Fähigkeit, selektiv mit Populationen von Antigen-präsentierenden Zellen (APC) zu wechselwirken;
    • (7) die Fähigkeit, spezifisch geeignete TH1- oder TH2-zellspezifische Immunantworten hervorzurufen; und
    • (8) die Fähigkeit, selektiv die Spiegel von geeigneten Antikörperisotopen (z. B. IgA) gegen Antigene zu erhöhen.
  • Das U.S.-Patent Nr. 4,855,283, welches am 8. August 1989 für Lockhoff et al. erteilt wurde, auf welches hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, lehrt Glycolipidanaloge einschließlich N-Glycosylamiden, N-Glycosylharnstoffen und N-Glycosylcarbamaten, welche jeweils in dem Zuckerrest durch eine Aminosäure substituiert sind, als Immunmodulatoren oder Hilfsmittel. So berichteten Lockhoff et al. (U.S.-Patent Nr. 4,855,283 und Ref. 60), dass N-Glycolipidanaloge, die strukturelle Ähnlichkeiten mit den natürlich vorkommenden Glycolipiden wie z.B. Glycosphingolipiden und Glycoglycerolipiden zeigen, in der Lage sind, starke Immunantworten sowohl bei Herpes-Simplex-Virus-Impfstoff als auch Pseudorabies-Virus-Impfstoff hervorzurufen. Einige Glycolipide sind aus langkettigen Alkylaminen und Fettsäuren, die direkt mit den Zuckern über das anomere Kohlenstoffatom verknüpft sind, synthetisiert worden, um die Funktionen der natürlich vorkommenden Lipidreste nachzuahmen.
  • Das U.S.-Patent Nr. 4,258,029, welches für Moloney erteilt wurde, welches dem Rechtsinhaber hiervon übertragen wurde und auf welches hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, lehrt, dass Octadecyltyrosinhydrochlorid (OTH) als ein Hilfsmittel fungiert, wenn es mit Tetanustoxoid und Formalin-inaktiviertem Typ I, II und III Poliomyelitis-Virus-Impfstoff komplexiert wird. Ebenso berichteten Nixon-George et al. (Ref. 61), dass Octadecylester von aromatischen Aminosäuren, welche mit einem rekombinanten Hepatitis B-Oberflächenantigen komplexiert waren, die Immunantworten des Wirts auf das Hepatitis B-Virus verstärkten.
  • BEISPIELE
  • Die obige Offenbarung beschreibt die vorliegende Erfindung allgemein. Ein vollständigeres Verständnis kann durch Bezug auf die folgenden spezifischen Beispiele erhalten werden. Diese Beispiele werden lediglich zu Zwecken der Veranschaulichung beschrieben und sind nicht dazu gedacht, den Umfang der Erfindung zu beschränken. Änderungen in der Form und Austausch von Äquivalenten sind umfasst, wie es die Umstände nahe legen oder geeignet erscheinen lassen. Auch wenn hierin spezielle Begriffe eingesetzt wurden, sind solche Begriffe in einem beschreibenden Sinn und nicht zu Zwecken der Beschränkung gedacht.
  • Methoden der Proteinbiochemie, Fermentation und Immunologie, die verwendet werden, aber in dieser Offenbarung und diesen Beispielen nicht explizit beschrieben werden, werden in der wissenschaftlichen Literatur reichlich angegeben und liegen gut innerhalb der Fähigkeiten der Fachleute auf dem Gebiet.
  • Beispiel 1:
  • Dieses Beispiel beschreibt die Kultivierung von Bordetella pertussis.
  • Masterkeim:
  • Masterkeimkulturen eines Bordetella pertussis-Stammes wurden als gefriergetrocknete Keimchargen bei 2°C bis 8°C gehalten.
  • Arbeitskeim:
  • Die gefriergetrocknete Kultur wurde in Hornibrook-Medium wiederhergestellt und verwendet, um Bordet-Gengou-Agar (BGA)-Platten anzuimpfen. Hornibrook-Medium weist die folgende Zusammensetzung auf:
    Komponente für 1 Liter
    Caseinhydrolysat (mit Holzkohle behandelt) 10,0 g
    Nikotinsäure 0,001 g
    Calciumchlorid 0,002 g
    Natriumchlorid 5,0 g
    Magnesiumchloridhexahydrat 0,025 g
    Kaliumchlorid 0,200 g
    Kaliumphosphat, zweibasig 0,250 g
    Stärke 1,0 g
    destilliertes Wasser auf 1,0 Liter
  • Der pH wird mit 1%iger Natriumcarbonatlösung auf 6,9 ± 0,1 eingestellt. Das Medium wird in Röhrchen verteilt und durch Dampfbehandlung in dem Autoklaven für 20 Minuten und Autoklavieren für 20 Minuten bei 121 °C bis 124°C sterilisiert. Der Keim wurde zweimal subkultiviert, zuerst auf BGA-Platten, dann auf Komponentenpertussisagar (CPA). Komponentenpertussisagar (CPA) weist die folgende Zusammensetzung auf:
    NaCl 2,5 g/L
    KH2PO4 0,5 g/L
    KCl 0,2 g/L
    MgCl2 (H2O)6 0,1 g/L
    Trisbase 1,5 g/L
    Casaminosäuren 10,0 g/L
    NaHGlutamat 10,0 g/L
    Konz. HCl auf pH 7,2
    Agar 15,0 g/L
    Wachstumsfaktoren (CPGF) 10,0 ml/L
  • Komponentenpertussiswachstumsfaktoren (CPGF) – 100 X weisen die folgende Zusammensetzung auf:
    L-Cystein HCL 4,0 g/L
    Niacin 0,4 g/L
    Ascorbinsäure 40,0 g/L
    Glutathion, reduziert 15,0 g/L
    Fe2SO4 (H2O)7 1,0 g/L
    Dimethyl-β-cyclodextrin 100 g/L
    CaCl2 (H2O)2 2,0 g/L
  • Die endgültige Kultur wurde in Pertussiskeimsuspensionspuffer (CPSB) suspendiert, in 2 bis 4 ml-Aliquots aufgeteilt und eingefroren bei –60°C bis –85°C gelagert. Der Pertussiskeimsuspensionspuffer (PSSB) weist die folgende Zusammensetzung auf:
    Casaminosäuren 10,0 g/L
    Trisbase 1,5 g/L
    wasserfreies Glycerol 100 ml/L
    Konz. HCl auf pH 7,2
  • Diese Glycerolsuspensionen lieferten das Ausgangsmaterial für die Herstellung des Arbeitskeims.
  • Kultivierungsprozess:
  • Die Vermehrung des Arbeitskeims wurde in Roux-Flaschen mit Komponentenpertussisagar für 4 bis 7 Tage bei 34°C bis 38°C durchgeführt. Nach dieser Kultivierung wurden die Zellen von dem Agar mit Komponentenpertussisnährlösung (CPB) abgewaschen. Proben wurden durch eine Gramfärbung im Hinblick auf Kulturreinheit und Lichtundurchlässigkeit beobachtet.
  • Die Zellen wurden auf konische 4 Liter-Kolben überführt, welche CPB enthielten, und bei 34°C bis 38°C für 20 bis 26 Stunden unter Schütteln inkubiert. Die Proben wurden durch Gramfärbung beobachtet, und die Reinheit der Kultur wurde überprüft. Die Kolben wurden vereinigt, und die Suspension wurde verwendet, um 2 Fermenter anzuimpfen, welche CPB enthielten (10 Liter Volumen, ausgehend von OD600 0,1-0,4). Der Keim wurde bis zu einer endgültigen OD600 von 5,0 bis 10,0 wachsen gelassen. Die Proben wurden durch Gramfärbung, im Hinblick auf die Reinheit der Kultur, durch Antigen-spezifische ELISAs und im Hinblick auf Sterilität getestet.
  • Beispiel 2:
  • Dieses Beispiel beschreibt die Reinigung von Antigenen aus der Bordetella pertussis-Zellkultur.
  • Erzeugung der Nährlösung und von Zellkonzentraten:
  • Eine Bakteriensuspension wurde in zwei Produktionsfermentern bei 34°C bis 37°C für 35 bis 50 Stunden wachsen gelassen. Aus den Fermentern wurden Proben für einen Test der Sterilität des Mediums entnommen. Die Suspension wurde zu einer Durchflusstellerstapelzentrifuge (12.000 × g) zugeführt, um die Zellen von der Nährlösung abzutrennen. Die Zellen wurden gesammelt, um die Extraktion der Fimbrienkomponente zu erwarten. Die aufgeklarte Flüssigkeit wurde durch einen Membranfilter ≤ 0,22 μm geführt. Die filtrierte Flüssigkeit wurde durch Ultrafiltration konzentriert, indem eine Membran mit einer nominalen Molekulargewichtsgrenze (NMWL) von 10 bis 30 kDa verwendet wurde. Das Konzentrat wurde gelagert, um die Trennung und Reinigung der Pertussistoxin (PT)-, filamentösen Hämagglutinin (FHA)- und 69 kDa (Pertaktin)-Komponenten zu erwarten.
  • Trennung der Komponenten der Nährlösung:
  • Die Komponenten der Nährlösung (69 kDa, PT und FHA) wurden durch Perlit-Chromatographie und selektive Elutionsschritte getrennt und gereinigt, wie im Wesentlichen in dem EP-Patent Nr. 336 736 und der veröffentlichten PCT-Anmeldung Nr. WO 91/15505 der Anmelder, die oben beschrieben wurden, beschrieben wird. Die spezifischen durchgeführten Reinigungsvorgänge werden nachstehend beschrieben.
  • Pertussistoxin (PT):
  • Die Perlitsäule wurde mit 50 mM Tris, 50 mM Tris/0,5% Triton X-100 und 50 mM Trispuffern gewaschen. Die PT-Fraktion wurde von der Perlitsäule mit 50 mM Tris/0,12 M NaCl-Puffer eluiert.
  • Die PT-Fraktion aus der Perlit-Chromatographie wurde auf eine Hydroxylapatitsäule geladen und dann mit 30 mM Kaliumphosphatpuffer gewaschen. PT wurde mit 75 mM Kaliumphosphat/225 mM NaCl-Puffer eluiert. Die Säule wurde mit 200 mM Kaliumphosphat/0,6 M NaCl gewaschen, um die FHA-Fraktion zu erhalten, welche verworfen wurde. Glycerol wurde zu dem gereinigten PT bis auf 50% zugegeben, und die Mischung wurde bei 2°C bis 8°C bis zu der Detoxifikation innerhalb einer Woche gelagert.
  • Filamentöses Hämagglutinin (FHA):
  • Die FHA-Fraktion wurde von der Perlitsäule mit 50 mM Tris/0,6 M NaCl eluiert. Filamentöses Hämagglutinin wurde durch Chromatographie über Hydroxylapatit gereinigt. Die FHA-Fraktion von der Perlitsäule wurde auf eine Hydroxylapatitsäule geladen und dann mit 30 mM Kaliumphosphat, das 0,5% Triton X-100 enthielt, gewaschen, worauf 30 mM Kaliumphosphatpuffer folgte. Die PT-Fraktion wurde mit 85 mM Kaliumphosphatpuffer eluiert und verworfen. Die FHA-Fraktion wurde dann mit 200 mM Kaliumphosphat/0,6 M NaCl eluiert und bis zur Detoxifikation innerhalb einer Woche bei 2°C bis 8°C gelagert.
  • 69 kDa (Pertaktin):
  • Das Nährlösungskonzentrat wurde mit Wasser zur Injektion (WFI) verdünnt, um eine Leitfähigkeit von 3 bis 4 mS/cm zu erreichen, und bei einer Beladung von 0,5 bis 3,5 mg Protein pro ml Perlit auf eine Perlitsäule geladen. Der Durchfluss (69 kDa Komponenten-Fraktion) wurde durch Ultrafiltration unter Verwendung einer 10 bis 30 kDa NMWL-Membran konzentriert. Ammoniumsulfat wurde zu dem Durchflusskonzentrat bis auf 35% ± 3% (w/v) zugegeben, und die resultierende Mischung bei 2°C bis 8°C für 4 ± 2 Tage gelagert oder sofort zentrifugiert (7.000 × g). Überschüssiger Überstand wurde dekantiert und der Niederschlag durch Zentrifugation (7.000 × g) gesammelt. Das 69 kDa-Pellelt wurde entweder eingefroren bei –20°C bis –30°C gelagert oder in Tris- oder Phosphatpuffer gelöst und unmittelbar verwendet.
  • Das 69 kDa-Außenmembranprotein, welches durch die 35% (w/v) Ammoniumsulfatfällung des konzentrierten Perlitdurchflusses erhalten wurde, wurde für die Reinigung verwendet. Ammoniumsulfat (100 ± 5 g pro Liter) wurde zu der 69 kDa-Fraktion zugegeben und die Mischung für wenigstens 2 Stunden bei 2°C bis 8°C gerührt. Die Mischung wurde zentrifugiert (7.000 × g), um den Überstand zurückzugewinnen. Ammoniumsulfat (100 bis 150 g pro Liter) wurde zu dem Überstand zugegeben und die Mischung für wenigstens 2 Stunden bei 2°C bis 8°C gerührt. Die Mischung wurde zentrifugiert (7.000 × g), um das Pellet zurückzugewinnen, welches in 10 mM Tris, HCl, pH 8, gelöst wurde. Die Ionenstärke der Lösung wurde auf das Äquivalent von 10 mM Tris HCl (pH 8), welcher 15 mM Ammoniumsulfat enthält, eingestellt.
  • Das 69 kDa-Protein wurde auf eine Hydroxylapatitsäule aufgetragen, die hintereinander (in tandem) mit einer Q-Sepharosesäule verbunden war. Das 69 kDa-Protein wurde in dem Durchfluss gesammelt, wurde mit 10 mM Tris, HCl (pH 8), welcher 15 mM Ammoniumsulfat enthielt, von den Säulen gespült und mit dem 69 kDa-Protein in dem Durchfluss vereinigt. Der 69 kDa-Proteinpool wurde mit 6 bis 10 Volumina 10 mM Kaliumphosphat (pH 8), welcher 0,15 M NaCl enthielt, auf einer 100 bis 300 kDa-NMWL-Membran diafiltriert. Das Ultrafiltrat wurde gesammelt und das 69 kDa-Protein in dem Ultrafiltrat konzentriert.
  • Das 69 kDa-Protein wurde einem Lösungsmittelaustausch in 10 mM Tris HCl (pH 8) unterzogen und auf Q-Sepharose adsorbiert, welche mit 10 mM Tris HCl (pH 8)/5 mM Ammoniumsulfat gewaschen wurde. Das 69 kDa-Protein wurde mit 50 mM Kaliumphosphat (pH 8) eluiert. Das 69 kDa-Protein wurde mit 6 bis 10 Volumina 10 mM Kaliumphosphat (pH 8), welche 0,15 M NaCl enthielten, auf einer 10 bis 30 kDa-NMWL-Membran diafiltriert. Das 69 kDa-Protein wurde durch einen Filter mit ≤ 0,22 μm sterilfiltriert. Diese sterile Masse (bulk) wurde bei 2°C bis 8°C gelagert, und eine Adsorption wurde innerhalb von drei Monaten durchgeführt.
  • Fimbrienagglutinogene:
  • Die Agglutinogene wurden aus der Zellpaste nach Abtrennung von der Nährlösung gereinigt. Die Zellpaste wurde auf einen Volumenanteil der Zellen von 0,05 in einem Puffer, welcher 10 mM Kaliumphosphat, 150 mM NaCl und 4 M Harnstoff enthielt, verdünnt und wurde für 30 Minuten gemischt. Das Zelllysat wurde durch Zentrifugation (12.000 × g) aufgeklart und konzentriert und dann gegen 10 mM Kaliumphosphat/150 mM NaCl/0,1% Triton X-100 unter Verwendung eines 100 bis 300 kDa-NMWL-Membranfilters diafiltriert.
  • Das Konzentrat wurde bei 80°C für 30 Minuten wärmebehandelt und dann durch Zentrifugation (9.000 × g) wieder aufgeklart. PEG 8000 wurde zu dem aufgeklarten Überstand bis zu einer Endkonzentration von 4,5% ± 0,2% zugegeben und für ein Minimum von 30 Minuten leicht gerührt. Der resultierende Niederschlag wurde durch Zentrifugation (17.000 × g) gesammelt und das Pellet mit 10 mM Kaliumphos phat/150 mM NaCl-Puffer extrahiert, um eine rohe Fimbrienagglutinogenlösung bereitzustellen. Die Fimbrienagglutinogene wurden durch Durchleiten über PEI-Silica gereinigt. Die rohe Lösung wurde bezogen auf Kaliumphosphat auf 100 mM gebracht, indem 1 M Kaliumphosphatpuffer verwendet wurde, und durch die PEI-Silicasäule geleitet.
  • Der Durchfluss von den Säulen wurde konzentriert und gegen einen 10 mM Kaliumphosphat/150 mM NaCl-Puffer diafiltriert, indem ein 100 bis 300 kDa-NMWL-Membranfilter verwendet wurde. Diese sterile Masse wird bei 2°C bis 8°C gelagert, und eine Adsorption wird innerhalb von drei Monaten durchgeführt. Die Fimbrienagglutinogenpräparation enthielt Fimbrien-Agg 2 und Fimbrien-Agg 3 in einem Gewichtsverhältnis von ca. 1,5 bis ca. 2:1, und es wurde gefunden, dass diese im Wesentlichen frei von Agg 1 war.
  • Beispiel 3:
  • Dieses Beispiel beschreibt die Toxoidierung der gereinigten Bordetella pertussis-Antigene, PT und FHA.
  • PT, welches in reiner Form wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt wurde, wurde toxoidiert, indem die Glutaraldehydkonzentration in der PT-Lösung auf 0,5% ± 0,1% eingestellt wurde und bei 37°C ± 3°C für 4 Stunden inkubiert wurde. Die Reaktion wurde gestoppt, indem L-Aspartat auf 0,21 ± 0,02 M zugegeben wurde. Die Mischung wurde dann für 1 ± 0,1 Stunden bei Raumtemperatur und dann für 1 bis 7 Tage bei 2°C bis 8°C gehalten.
  • Die resultierende Mischung wurde gegen 10 mM Kaliumphosphat/0,15 M NaCl/5% Glycerolpuffer auf einem 30 kDa-NMWL-Membran-Filter diafiltriert und dann durch Durchleiten durch einen Membranfilter mit ≤ 0,22 μm sterilisiert. Diese sterile Masse wurde bei 2°C bis 8°C gelagert, und eine Adsorption wurde innerhalb von drei Monaten durchgeführt.
  • Die FHA-Fraktion, welche in reiner Form wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt wurde, wurde toxoidiert, indem die L-Lysin- und Formaldehyd-Konzentration auf 47 ± 5 mM bzw. 0,24 ± 0,05% eingestellt wurde und für 6 Wochen bei 35°C bis 38°C inkubiert wurde. Die Mischung wurde dann gegen 10 mM Kaliumphosphat/0,5 M NaCl unter Verwendung eines 30 kDa-NMWL-Membranfilters diafiltriert und durch Durchleiten durch einen Membranfilter sterilisiert. Diese sterile Masse wurde bei 2°C bis 8°C gelagert, und eine Adsorption wurde innerhalb von drei Monaten durchgeführt.
  • Beispiel 4:
  • Dieses Beispiel beschreibt die Adsorption der gereinigten Bordetella pertussis-Antigene.
  • Für die einzelne Adsorption von PT, FHA, Agg und 69 kDa auf Aluminiumphosphat (Alaun) wurde eine Stammlösung von Aluminiumphosphat in einer Konzentration von 18,75 ± 1 mg/ml hergestellt. Ein geeignetes Gefäß wurde vorbereitet und jedes der Antigene aseptisch in das Gefäß abgegeben. 2-Phenoxyethanol wurde aseptisch zugefügt, um eine Endkonzentration von 0,6% ± 0,1% v/v zu ergeben, und gerührt, bis es homogen war. Das geeignete Volumen an Aluminiumphosphat wurde aseptisch in das Gefäß zugegeben. Ein geeignetes Volumen an sterilem destilliertem Wasser wurde zugegeben, um die Endkonzentration auf 3 mg Aluminiumphosphat/ml zu bringen. Die Behälter wurden abgedichtet und markiert und für 4 Tage bei Raumtemperatur rühren gelassen. Das Gefäß wurde dann gelagert, um die endgültige Formulierung zu erwarten.
  • Beispiel 5:
  • Dieses Beispiel beschreibt die Formulierung eines Komponentenpertussisimpfstoffes, welcher mit Diphtherie- und Tetanustoxoiden kombiniert ist.
  • Die B. pertussis-Antigene, welche wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben hergestellt wurden, wurden mit Diphtherie- und Tetanustoxoiden formuliert, um mehrere Komponentenpertussis (CP)-Impfstoffe wie nachstehend beschrieben bereitzustellen.
  • Die Pertussiskomponenten wurden aus Bordetella pertussis erzeugt, welche in Tauchkultur wie im Detail in den Beispielen 1 bis 4 oben beschrieben wachsen gelassen wurden. Nach Abschluss des Wachstums wurden die Kulturnährlösung und die Bakterienzellen durch Zentrifugation getrennt. Jedes Antigen wurde einzeln gereinigt. Pertussistoxin (PT) und filamentöses Hämagglutinin (FHA) wurden aus der Nährlösung durch sequenzielle Chromatographie über Perlit und Hydroxylapatit gereinigt. PT wurde mit Glutaraldehyd detoxifiziert, und jegliches restliche PT (ungefähr 1%), das in der FHA-Fraktion vorlag, wurde mit Formaldehyd detoxifiziert. Fimbrienagglutinogene (2+3) (AGG) wurden aus den Bakterienzellen präpariert. Die Zellen wurden mit Harnstoff aufgebrochen und wärmebehandelt, und die Fimbrienagglutinogene wurden durch Ausfällung mit Polyethylenglycol und Chromatographie über Poyethylenimin-Silica gereinigt. Die 69 kDa-Protein (Pertaktin)-Komponente wurde aus dem Durchfluss von dem Perlit-Chromatographieschritt (Beispiel 2) durch Ammoniumsulfatfällung isoliert und durch sequenzielle Chromatographie über Hydroxylapatit und Q-Sepharose gereinigt. Alle Komponenten wurden durch Filtration durch einen Membranfilter mit 0,22 μm sterilisiert.
  • Diphtherietoxoid wurde aus Corynebacterium diphtheriae präpariert, das in Tauchkultur durch Standardmethoden wachsen gelassen wurde. Die Produktion von Diphtherietoxoid ist in fünf Stufen unterteilt, nämlich Aufrechterhaltung des Arbeitskeims, Wachstum von Corynebacterium diphtheriae, Ernte des Diphtherietoxins, Detoxifikation des Diphtherietoxins und Konzentrierung des Diphtherietoxoids.
  • Herstellung von Diphtherietoxoid
  • (I) Arbeitskeim
  • Der Stamm von Corynebacterium diphtheriae wurde als eine gefriergetrocknete Keimcharge aufrechterhalten. Der rekonstituierte Keim wurde für 18 bis 24 Stunden bei 35°C ± 2°C auf Loefflerplatten wachsen gelassen und dann auf Kolben mit Diphtheriemedium überführt. Die Kultur wurde dann im Hinblick auf Reinheit und Lf-Gehalt getestet. Der verbleibende Keim wurde verwendet, um einen Fermenter zu inokulieren.
  • (II) Wachstum von Corynebacterium diphtheriae
  • Die Kultur wurde bei 35°C ± 2°C inkubiert und in dem Fermenter geschüttelt. Vorher festgelegte Mengen an Eisensulfat-, Calciumchlorid- und Phosphatlösungen wurden zu der Kultur zugegeben. Die tatsächlichen Mengen jeder Lösung (Phosphat, Eisensulfat, Calciumchlorid) wurden experimentell für jede Charge des Mediums bestimmt. Die ausgewählten Spiegel sind jene, welche den höchsten Lf-Gehalt ergaben. Am Ende des Wachstumszyklus (30 bis 50 Stunden) wurden den Kulturen Proben für Reinheit und Lf-Gehalt entnommen.
  • Der pH wurde mit Natriumbicarbonat eingestellt, und die Kultur wurde mit 0,4% Toluol für 1 Stunde bei einer beibehaltenen Temperatur von 35°C ± 2°C inaktiviert. Dann wurde ein Sterilitätstest durchgeführt, um das Fehlen von lebenden C. diphtheriae zu bestätigen.
  • (III) Ernte des Diphtherietoxins
  • Die mit Toluol behandelten Kulturen aus einem oder mehreren Fermentern wurden in einem großen Tank vereinigt. Ungefähr 0,12% Natriumbicarbonat, 0,25% Holzkohle und 23% Ammoniumsulfat wurden zugegeben, und der pH wurde getestet.
  • Die Mischung wurde für ca. 30 Minuten gerührt. Diatomeenerde wurde zugegeben und die Mischung in einen Tiefenfilter gepumpt. Das Filtrat wurde rezirkuliert, bis es klar war, dann gesammelt und Proben für einen Test des Lf-Gehalts entnommen. Zusätzliches Ammoniumsulfat wurde zu dem Filtrat zugegeben, um eine Konzentration von 40% zu ergeben. Diatomeenerde wurde ebenfalls zugegeben. Diese Mischung wurde für 3 bis 4 Tage bei 2°C bis 8°C gehalten, um dem Niederschlag zu ermöglichen, sich abzusetzen. Ausgefälltes Toxin wurde gesammelt und in 0,9% Salzlösung gelöst. Die Diatomeenerde wurde durch Filtration entfernt und das Toxin gegen 0,9% Salzlösung dialysiert, um das Ammoniumsulfat zu entfernen. Dialysiertes Toxin wurde vereinigt, und es wurden Proben zum Testen des Lf-Gehalts und der Reinheit entnommen.
  • (IV) Detoxifikation von Diphtherietoxin
  • Die Detoxifikation findet unmittelbar nach der Dialyse statt. Zur Detoxifikation wurde das Toxin so verdünnt, dass die endgültige Lösung enthielt:
    • a) Diphtherietoxin mit 1000 ± 10% Lf/ml
    • b) 0,5% Natriumbicarbonat
    • c) 0,5% Formalin
    • d) 0,9% w/v L-Lysin-Monohydrochlorid
  • Die Lösung wurde mit Salzlösung auf das Volumen gebracht und der pH auf 7,6 ± 0,1 eingestellt.
  • Das Toxoid wurde durch Zellulose-Diatomeenerde-Filterkissen und/oder einen Membranvorfilter und einen 0,2 μm-Membranfilter in das Sammelgefäß filtriert und für 5 bis 7 Wochen bei 34°C inkubiert. Eine Probe wurde zum Testen der Toxizität entnommen.
  • (V) Konzentrierung des gereinigten Toxoids
  • Die Toxoide wurden vereinigt, dann durch Ultrafiltration konzentriert und in einem geeigneten Behälter gesammelt. Proben wurden zum Testen des Lf-Gehalts und der Reinheit entnommen. Das Konservierungsmittel (2-Phenoxyethanol) wurde zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,375% zu ergeben, und der pH wurde auf 6,6 bis 7,6 eingestellt.
  • Das Toxoid wurde durch Filtration durch einen Vorfilter und einen 0,2 μm-Membranfilter (oder etwas Entsprechendes) sterilisiert und gesammelt. Von dem sterilen Toxoid wurden dann zum Testen der Irreversibilität des Toxoids, des Lf-Gehalts, des Konservierungsmittelgehalts, der Reinheit (Stickstoffgehalt), der Sterilität und der Toxizität Proben entnommen. Das sterile konzentrierte Toxoid wurde bis zur endgültigen Formulierung bei 2°C bis 8°C gelagert.
  • Herstellung von Tetanustoxoid
  • Tetanustoxoid (T) wurde aus Clostridium tetani präpariert, welches in Tauchkultur wachsen gelassen wurde.
  • Die Herstellung von Tetanustoxoid kann in fünf Stufen aufgeteilt werden, nämlich Aufrechterhalten des Arbeitskeims, Wachstum von Clostridium tetani, Ernte von Tetanustoxin, Detoxifikation von Tetanustoxin und Reinigung von Tetanustoxoid.
  • (I) Arbeitskeim
  • Der Stamm von Clostridium tetani, welcher bei der Herstellung von Tetanustoxin zur Umwandlung in Tetanustoxoid verwendet wurde, wurde in der lyophilisierten Form in einer Keimcharge aufrechterhalten. Der Keim wurde in Thioglycolatmedium inokuliert und für ungefähr 24 Stunden bei 35°C ± 2°C wachsen gelassen. Eine Probe wurde zum Testen der Reinheit der Kultur entnommen.
  • (II) Wachstum von Clostridium tetani
  • Das Tetanusmedium wurde in einen Fermenter abgegeben, wärmebehandelt und abgekühlt. Der Fermenter wurde dann angeimpft, und die Kultur wurde für 4 bis 9 Tage bei 34°C ± 2°C wachsen gelassen. Eine Probe wurde zum Testen der Reinheit der Kultur und des Lf-Gehalts entnommen.
  • (III) Ernte des Tetanustoxis
  • Das Toxin wurde durch Filtration durch Zellulose-Diatomeenerde-Kissen abgetrennt, und das aufgeklarte Toxin dann unter Verwendung von Membranfiltern filtersterilisiert. Proben wurden zum Testen des Lf-Gehalts und der Sterilität entnommen. Das Toxin wurde durch Ultrafiltration konzentriert, wobei eine Porengröße von 30.000 Dalton verwendet wurde.
  • (IV) Detoxifikation von Tetanustoxin
  • Von dem Toxin wurden zum Testen des Lf-Gehalts vor der Detoxifikation Proben entnommen. Das konzentrierte Toxin (475 bis 525 Lf/ml) wurde durch die Zugabe von 0,5% w/v Natriumbicarbonat, 0,3% v/v Formalin und 0,9% w/v L-Lysin-Monohydrochlorid detoxifiziert und mit Salzlösung auf das Volumen gebracht. Der pH wurde auf 7,5 ± 0,1 eingestellt, und die Mischung bei 37°C für 20 bis 30 Tage inkubiert. Proben wurden zum Testen der Sterilität und Toxizität entnommen.
  • (V) Reinigung des Toxoids
  • Das konzentrierte Toxoid wurde durch Vorfilter, worauf Membranfilter mit 0,2 μm folgten, sterilisiert. Proben wurden zum Testen der Sterilität und des Lf-Gehalts entnommen.
  • Die optimale Konzentration an Ammoniumsulfat basierte auf einer Fraktionierungs-"S"-Kurve, welche anhand der Proben des Toxoids bestimmt wurde. Die erste Konzentration wurde zu dem Toxoid (verdünnt auf 1.900-2.100 Lf/ml) zugegeben. Die Mischung wurde für wenigstens 1 Stunde bei 20°C bis 25°C gehalten und der Überstand gesammelt und der Niederschlag, welcher die Fraktion mit hohem Molekulargewicht enthielt, verworfen.
  • Eine zweite Konzentration von Ammoniumsulfat wurde zu dem Überstand für die zweite Fraktionierung zugegeben, um die Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen. Die Mischung wurde für wenigstens 2 Stunden bei 20°C bis 25°C gehalten und konnte dann für ein Maximum von drei Tagen bei 2°C bis 8°C gehalten werden. Der Niederschlag, welcher das gereinigte Toxoid darstellt, wurde durch Zentrifugation und Filtration gesammelt.
  • Ammoniumsulfat wurde aus dem gereinigten Toxoid durch Diafiltration entfernt, indem Amicon- (oder entsprechende) Ultrafiltrationsmembranen mit PBS verwendet wurden, bis kein Ammoniumsulfat mehr in der Toxoidlösung nachgewiesen werden konnte. Der pH wurde auf 6,6 bis 7,6 eingestellt und 2-Phenoxyethanol zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,375% zu ergeben. Das Toxoid wurde durch Mem branfiltration sterilisiert, und es wurden Proben zum Testen (Irreversibilität des Toxoids, Lf-Gehalt, pH, Konservierungsmittelgehalt, Reinheit, Sterilität und Toxizität) entnommen.
  • Formulierung des multivalenten Impfstoffes
  • Eine Formulierung eines Komponentenpertussisimpfstoffes, kombiniert mit Diphtherie- und Tetanustoxoiden, wurde CP10/5/5/3DT genannt (manchmal CLASSIC genannt). Jede 0,5 ml-Humandosis von CP10/5/5/3DT wurde so formuliert, dass diese enthielt:
    10 μg Pertussistoxoid (PT)
    5 μg filamentöses Hämagglutinin (FHA)
    5 μg Fimbrienagglutinogene 2 und 3 (FIMB)
    3 μg 69 kDa-Außenmembranprotein
    15 Lf Diphtherietoxoid
    5 Lf Tetanustoxoid
    1,5 mg Aluminiumphosphat
    0,6% 2-Phenoxyethanol als Konservierungsmittel
  • Eine andere Formulierung des Komponentenpertussisimpfstoffes, kombiniert mit Diphtherie- und Tetanustoxoiden, wurde CP10/5/5DT genannt (manchmal HYBRID genannt). Jede 0,5 ml-Humandosis von CP10/5/5DT wurde so formuliert, dass sie enthielt:
    10 μg Pertussistoxoid (PT)
    5 μg filamentöses Hämagglutinin (FHA)
    5 μg Fimbrienagglutinogene 2 und 3 (FIMB)
    15 Lf Diphtherietoxoid
    5 Lf Tetanustoxoid
    1,5 mg Aluminiumphosphat
    0,6% 2-Phenoxyethanol als Konservierungsmittel
  • Eine andere Formulierung des Komponentenpertussisimpfstoffes, kombiniert mit Diphtherie- und Tetanustoxoiden, wurde CP20/20/5/3DT genannt. Jede 0,5 ml-Humandosis von CP20/20/5/3DT wurde so formuliert, dass diese enthielt:
    20 μg Pertussistoxoid (PT)
    20 μg filamentöses Hämagglutinin (FHA)
    5 μg Fimbrienagglutinogene 2 und 3 (FIMB)
    3 μg 69 kDa-Außenmembranprotein
    15 Lf Diphtherietoxoid
    5 Lf Tetanustoxoid
    1,5 mg Aluminiumphosphat
    0,6% 2-Phenoxyethanol als Konservierungsmittel
  • Eine weitere Formulierung eines Komponentenpertussisimpfstoffes, kombiniert mit Diphtherie- und Tetanustoxoiden, wurde CP20/10/10/6DT genannt. Jede 0,5 ml-Humandosis von CP20/10/10/6DT wurde so formuliert, dass sie enthielt:
    20 μg Pertussistoxoid (PT)
    10 μg filamentöses Hämagglutinin (FHA)
    10 μg Fimbrienagglutinogene 2 und 3 (FIMB)
    6 μg 69 kDa-Außenmembranprotein
    15 Lf Diphtherietoxoid
    5 Lf Tetanustoxoid
    1,5 mg Aluminiumphosphat
    0,6% 2-Phenoxyethanol als Konservierungsmittel
  • Beispiel 6:
  • Dieses Beispiel beschreibt die klinische Bewertung der azellulären Komponentenpertussisimpfstoffe.
  • (a) Studien bei Erwachsenen
  • Studien bei Erwachsenen und Kindern im Alter von 16 bis 20 Monaten zeigten, dass die Multikomponentenimpfstoffe, die Fimbrienagglutinogene enthielten, sicher und immunogen waren (Tabelle 2).
  • Eine klinische Studie der Phase I wurde bei 17 und 18 Monate alten Kindern in Calgary, Alberta, mit dem Fünfkomponentenpertussisimpfstoff (CP10/5/5/3DT) durchgeführt und die Gegenreaktion berichtet. 33 Kinder erhielten den Impfstoff, und zusätzlich erhielten 35 denselben Impfstoff ohne die 69 kDa-Proteinkomponente.
  • Lokale Reaktionen waren selten. Systemische Gegenreaktionen, die hauptsächlich aus einer Reizbarkeit bestanden, waren bei ungefähr der Hälfte der Teilnehmer der Studie vorhanden, unabhängig davon, welcher Impfstoff gegeben wurde. Signifikante Antikörperanstiege wurden für anti-PT-, anti-FHA-, anti-Fimbrienagglutinogen- und anti-69 kDa-IgG-Antikörper durch Enzymimmunassay und anti-PT-Antikörper in dem CHO-Zellenneutralisationstest gemessen. Keine Unterschiede wurden bei der Antikörperantwort in Kindern nachgewiesen, welche die vier Komponenten (CP10/5/5DT) oder fünf Komponenten (CP10/5/5/3DT) erhielten, außer bei dem anti-69 kDa-Antikörper. Kinder, welche den Fünfkomponentenimpfstoff erhielten, der das 69 kDa-Protein enthielt, wiesen nach der Immunisierung einen signifikant höheren anti-69 kDa-Antikörperspiegel auf.
  • Eine Dosis-Antwort-Studie wurde mit dem Vierkomponentenimpfstoff in Winnipeg, Manitoba, Kanada durchgeführt. Zwei Komponentenimpfstoffformulierungen wurden verwendet: CP10/5/5/3DT und CP20/10/10/6DT. Ein Ganzzell-DPT-Impfstoff wurde ebenfalls als eine Kontrolle eingeschlossen.
  • Diese Studie war eine Doppelblindstudie bei 91 17 bis 18 Monate alten Säuglingen, zu der Zeit ihrer Auffrischungspertussisdosis. Sowohl CP10/5/5/3DT als auch CP20/10/10/6DT wurde von diesen Kindern gut vertragen. Es wurden keine Unterschiede bei der Anzahl der Kinder gezeigt, die irgendwelche lokalen Reaktionen oder systemischen Reaktionen nach einem der beiden Komponentenimpfstoffe aufwiesen. Im Gegensatz dazu wiesen signifikant mehr Kinder, die den Ganzzellimpfstoff erhielten, als jene, welche die CP20/10/10/6DT-Komponentenimpfstoffe erhielten, lokale und systemische Reaktionen auf.
  • Studien bei Säuglingen:
  • Phase II:
  • Eine Studie wurde unter Verwendung des CP10/5/5/3DT-Impfstoffes in Calgary, Alberta und British Columbia, Kanada, durchgeführt. In dieser Studie erhielten 432 Säuglinge den Komponentenpertussisimpfstoff oder den Ganzzellkontrollimpfstoff DPT im Alter von 2, 4 und 6 Monaten. Der CP10/5/5/3DT-Impfstoff wurde von diesen Säuglingen gut vertragen. Lokale Reaktionen waren nach jeder Dosis bei dem Komponentenimpfstoff weniger häufig als bei dem Ganzzellimpfstoff.
  • Eine signifikante Antikörperantwort auf alle Antigene wurde nach Impfung mit dem Komponentenpertussisimpfstoff gezeigt. Empfänger des Ganzzellimpfstoffes wiesen eine heftige Antikörperantwort auf Fimbrienagglutinogene, D und T auf. Nach sieben Monaten wiesen 82% bis 89% der Empfänger des Komponentenimpfstoffes und 92% der Empfänger des Ganzzellimpfstoffes einen vierfachen Anstieg oder mehr bei dem Antikörpertiter gegen Fimbrienagglutinogene auf. Im Gegensatz dazu betrug die Antikörperantwort auf FHA 75% bis 78% bei den Komponentenimpfstoffen im Vergleich zu 31% bei den Ganzzellempfängern. Ein vierfacher Anstieg bei dem anti-69 kDa-Antikörper wurde bei 90% bis 93% der Komponentenimpfstoffe und 75% der Ganzzellempfänger beobachtet. Ein vierfacher Anstieg bei dem Antikörper gegen PT wurde anhand eines Enzymimmunassays bei 40% bis 49% der Komponentenimpf stoffe und 32% der Ganzzellimpfstoffe beobachtet; ein vierfacher Anstieg beim PT-Antikörper anhand einer CHO-Neutralisation wurde bei 55% bis 69% der Komponenten- und 6% der Ganzzellimpfstoffe gefunden (Tabelle 2).
  • Phase IIB:
  • Die CP20/20/5/3DT- und CP10/5/5/3DT-Impfstoffe wurden in einer randomisierten Blindstudie gegenüber einer D15PT-Kontrolle mit einem niedrigeren Diphtheriegehalt von 15 Lf im Vergleich zu einer 25 Lf-Formulierung bei 100 Säuglingen im Alter von 2, 4 und 6 Monaten bewertet. Es wurden keine Unterschiede bei den Raten der Gegenreaktionen zwischen den zwei Komponentenformulierungen nachgewiesen; beide waren signifikant weniger reaktogen als die Ganzzellkontrolle. Höhere Antikörpertiter gegen PT anhand eines Enzymimmunassays und einer CHO-Neutralisation und FHA wurden bei Empfängern des CP20/20/5/3DT-Impfstoffes mit erhöhtem Antigengehalt erzielt. Nach 7 Monaten betrug der geometrische mittlere Titer für anti-FHA 95,0 bei CP20/20/5/3DT-Empfängern, 45,2 bei CP10/5/5/3DT-Empfängern und nur 8,9 bei D15PT-Empfängern. Die anti-PT-Titer waren 133,3, 58,4 und 10,4 beim Immunassay und 82,4, 32,7 bzw. 4,0 bei der CHO-Neutralisation (Tabelle 2).
  • Diese Studie zeigte, dass der Komponentenpertussisimpfstoff, verbunden mit adsorbierten Diphtherie- und Tetanustoxoiden, mit einem erhöhten Antigengehalt bei Säuglingen sicher und immunogen war und dass der erhöhte Antigengehalt die Immunantwort auf die hergestellten Antigene (PT und FHA) ohne eine Erhöhung bei der Reaktogenizität verstärkte.
  • NIAID, Phase II, vergleichender U.S.-Test:
  • Eine Phase II-Studie wurde in den Vereinigten Staaten unter der Schirmherrschaft des National Institute of Allergy und Infectious Diseases (NIAID) als ein Auftakt zu einem Wirksamkeitstest im großen Maßstab von azellulären Pertussisimpfstoffen durchgeführt. Ein Komponentenpertussisimpfstoff der Erfindung in Kombination mit adsorbierten Diphtherie- und Tetanustoxoiden (CP10/5/5/3DT) wurde zusammen mit 12 anderen azellulären Impfstoffen und 2 Ganzzellimpfstoffen in diesen Test aufge nommen. Sicherheitsergebnisse wurden für 137 Kinder berichtet, welche im Alter von 2, 4 und 6 Monaten mit dem CP10/5/5/3DT-Komponentenimpfstoff immunisiert wurden.
  • Wie in vorausgehenden Studien beobachtet wurde, wurde gefunden, dass der Komponentenimpfstoff sicher ist, eine niedrige Reaktogenizität aufweist und von den Geimpften gut vertragen wird.
  • Nach 7 Monaten waren die anti-PT-Antikörper, anti-FHA-Antikörper, anti-69 kDa-Antikörper und anti-Fimbrienagglutinogen-Antikörper alle höher oder gleichwertig mit den Spiegeln, die nach Ganzzellimpfstoffen erreicht wurden (Ref. 71 und Tabelle 2). Es wurde eine Doppelblindstudie durchgeführt, bei welcher Kinder zufällig eingeteilt wurden, um entweder die CP20/20/5/3DT- oder die CP10/5/5/3DT-Impfstoffformulierung zu erhalten. Eine Gesamtzahl von 2.050 Säuglingen war in den Vereinigten Staaten und Kanada registriert; 1.961 Säuglinge beendeten die Studie. Beide Impfstoffformulierungen waren sicher, wiesen eine niedrige Reaktogenizität auf und waren bei diesen Säuglingen immunogen. Die Immunogenität wurde in einer Untergruppe von 292 beurteilt. Ein Antikörperanstieg wurde für alle Antigene, die im Impfstoff enthalten waren, durch beide Impfstoffformulierungen hervorgerufen. Die CP20/20/5/3DT-Formulierung induzierte höhere Antikörpertiter gegen FHA, nicht aber PT. Die CP10/5/5/3DT-Formulierung rief höhere Titer gegen Fimbrien und höhere Agglutinogentiter hervor.
  • Eine weitere Sicherheits- und Immunogenitätsstudie wurde in Frankreich durchgeführt. Die Planung der Studie war ähnlich wie bei der Studie in Nordamerika, die oben beschrieben wurde, außer dass die Impfstoffe im Alter von 2, 3 und 4 Monaten verabreicht wurden. Die lokalen und systemischen Reaktionen waren im Allgemeinen unbedeutend. Insgesamt wurde der Impfstoff von den Teilnehmern der französischen Studie gut vertragen, wenn diese Verabreichungsvorschrift verwendet wurde.
  • Placebo-kontrollierter Wirksamkeitstest mit zwei azellulären Pertussisimpfstoffen und einem Ganzzellimpfstoff bei 10.000 Säuglingen
  • Nach den Ergebnissen des NIAID Phase II-U.S.-Vergleichstests wurden ein azellulärer Zweikomponenten- und ein Fünfkomponentenimpfstoff für einen kontrollierten doppelt randomisierten Placebo-kontrollierten Wirksamkeitstest in mehreren Zentren ausgewählt. Der klinische Test wurde in Schweden durchgeführt, wo es ein hohes Vorkommen von Pertussis gibt. Der Zweikomponentenimpfstoff enthielt Glyceraldehyd und formalininaktiviertes PT (25 μg), formalinbehandeltes FHA (25 μg) und Diphtherietoxoid, 17 Lf, und Tetanustoxoid, 10 Lf. Der Fünfkomponentenpertussisimpfstoff war CP10/5/5/3DT. Für diesen Test wurden zehntausend Säuglinge, welche ungefähr eine Hälfte der Säuglinge dieser Altersgruppe in Schweden darstellten, in 14 geografisch definierten Studienorten unter Verwendung des Geburtenregisters rekrutiert.
  • Kinder, die im Januar und Februar 1992 geboren wurden, wurden in einem dreiarmigen Test zufällig eingeteilt. Nach Zustimmung der Eltern erhielten zwei Drittel der Säuglinge eine der zwei azellulären Diphtherie-Tetanus-Pertussis-Präparationen im Alter von zwei, vier und sechs Monaten. Die Kontrollgruppe erhielt nur DT. Im Mai 1992 wurde ein in den USA zugelassener im Handel erhältlicher Ganzzell-DTP-Impfstoff eingeführt, und Kinder, die von März bis Dezember 1992 geboren wurden, wurden in einem vierarmigen Test zufällig eingeteilt. Nach Zustimmung der Eltern erhielten drei Viertel der Säuglinge eine der drei DTP-Präparationen im Alter von 2, 4 und 6 Monaten. Die Kontrollgruppe erhielt nur DT.
  • Jeder Impfstoff wurde ca. 2.500 Kindern verabreicht. Die Impfstoffe wurden in drei Dosen verabreicht. Die erste Dosis wurde im Alter von 2 Monaten und nicht später als im Alter von 3 Monaten gegeben. Die anschließenden Dosen wurden in 8 Wochen-Intervallen gegeben. Die Impfstoffe wurden durch intramuskuläre Injektion gegeben.
  • Die Kinder und deren Haushalte wurden für 30 Monate nachbeobachtet. Wenn ein Verdacht von Pertussis bestand, wurden klinische Daten gesammelt und nach einer Bestätigung im Labor durch Nasenaspirate für bakteriologische Kulturen und eine Diagnose über die Polymerasekettenreaktion (PCR) gesucht. Akute Blutproben und solche nach der Genesung wurden zur serologischen Diagnose gesammelt.
  • Vor dieser Studie war das Ausmaß von Pertaktin, das von den Komponentenpertussisimpfstoffen der vorliegenden Erfindung geliefert wurde, bei menschlichen Risikopopulationen (insbesondere Neugeborenen) unbekannt. Insbesondere waren der Beitrag der verschiedenen Bordetella-Komponenten und deren Vorliegen in Pertussisimpfstoffen in ausgewählten relativen Mengen zu der Wirksamkeit der Impfstoffe nicht bekannt.
  • Das Hauptziel des Tests war es, das Vermögen der azellulären Pertussisimpfstoffe und des Ganzzellimpfstoffes, gegen eine typische Pertussis zu schützen, im Vergleich zu einem Placebo abzuschätzen.
  • Ein sekundärer Endpunkt bestand darin, die Wirksamkeit des Impfstoffes gegen eine bestätigte Pertussisinfektion von unterschiedlicher Schwere zu erforschen.
  • Die Wirksamkeit des Impfstoffes ist definiert als die prozentuale Verringerung der Wahrscheinlichkeit bei den Impfstoffempfängern, sich Pertussis zuzuziehen, bezogen auf nicht geimpfte Kinder.
  • Das relative Pertussisrisiko in zwei Impfstoffgruppen wird ausgedrückt als das Verhältnis der Wahrscheinlichkeit der Krankheit in den zwei Gruppen.
  • Die Wahrscheinlichkeit, sich Pertussis zuzuziehen, welche ebenfalls Befallsrate genannt wird, kann auf verschiedenen Wegen abgeschätzt werden. Bei den Berechnungen der Probengröße wird die Wahrscheinlichkeit, sich Pertussis zuzuziehen, in einer gegebenen Studiengruppe durch den Quotienten zwischen der Anzahl von Kindern mit Pertussis und den Kindern, welche am Ende der Nachfolgestudie in der Studiengruppe verbleiben, abgeschätzt.
  • Die Wirksamkeit des Komponentenimpfstoffes CP10/5/5/3DT in diesem Test bei der Verhinderung von typischer Pertussis ist in Tabelle 4 gezeigt und betrug ca. 85%. In demselben Test war ein azellulärer Zweikomponentenpertussisimpfstoff, welcher nur PT und FHA enthielt, zu ca. 58% wirksam, und ein Ganzzellimpfstoff war zu ca. 48% wirksam. Der CP10/5/5/3DT war ebenfalls bei der Verhinderung einer schwachen Pertussis wirksam, bei einer geschätzten Wirksamkeit von ca. 77%.
  • Beispiel 7 (zum Vergleich)
  • Dieses Beispiel beschreibt die Formulierung und Immunogenität eines multivalenten Kombinationsimpfstoffes, welcher ein Kapselpolysaccharid von Haemophilus influenzae enthält.
  • (a) Herstellung der PRP-T-Komponente
  • Das Kapselpolysaccharid (PRP) von H. influenzae wurde in der folgenden Weise gereinigt und mit Tetanustoxoid konjugiert. Aus lyophilisierten Ampullen der Charge des Arbeitskeims von H. influenzae wurden drei aufeinander folgende Vorkulturen durchgeführt. Die erste Vorkultur erfolgte auf festem Medium. Die Ampullen wurden auf Schalen mit Holzkohleagar + gekochtem Blut (10% Pferdeblut, für 15 min bei 80°C erhitzt) inokuliert und für 20 ± 4 Stunden bei 36°C bis 37°C unter CO2 inkubiert.
  • Die zweite Vorkultur erfolgte in flüssigem Medium für 8 Stunden bei 37°C. Das flüssige Medium wies die folgende Zusammensetzung pro Liter auf:
    1. Casaminosäuren Difco 10 g
    Mononatriumphosphat 2H2O 2,03 g
    Dinatriumphosphat 12H2O 31,14 g
    Natriumlactat (60%ige Lösung) 1,5 ml
    L-Cystin 0,07 g
    L-Tryptophane 0,02 g
    CaCl2, 2H2O 0,02 g
    (NH4)2 SO4 1 g
    MgSO4, 7H2O 0,4 g
    Antischaummittel Dow Corning M.S.A mit 25% in Paraffinöl 0,15 ml
    • 2. Ultrafiltrat von Hämin + Dextrose in einem Verhältnis von 20 g Dextrose und 1 mg Hämin. Diese Lösung wird mit 5 mg Nikotinamidadenindinukleotid zugegeben, filtersterilisiert.
    3. Hefeextrakt Difco, filtersterilisiert. 5 g
  • Die dritte Vorkultur erfolgte in flüssigem Medium unter Rühren für 4 Stunden bei 37°C. Die dritte Vorkultur wurde verwendet, um den Fermenter zu inokulieren, und die Kultur wurde unter Rühren bei 37°C für 12 bis 14 Stunden aufrechterhalten. Die Kultur wurde in einem gekühlten Tank gesammelt. Formalin wurde in einer Konzentration von 10 ml/Liter zugegeben. Die Kultur wurde bei leichtem Rühren für 2 bis 24 Stunden bei +4°C gehalten und dann zentrifugiert. Das zugegebene Formalin war nicht dazu gedacht, die Bakterien vollständig zu inaktivieren, sondern das Wachstum anzuhalten und den Metabolismus zu hemmen. Diese Zugabe verringerte die Zelllyse mit einer folgenden Kontamination durch intrazelluläre Komponenten. Die Dauer dieser Fixierung lag zwischen 2 und 24 Stunden, und typischerweise wird die Kultur über Nacht stehen gelassen, bevor sie zentrifugiert wird. Der Überstand, welcher das Polysaccharid enthielt, wurde geerntet, und das Bakterienpellet wurde verworfen. Das Reinigungsverfahren wurde im Allgemeinen in einem kalten Raum oder unter solchen Bedingungen, dass die Temperatur der Produkte und Reagenzien weniger oder gleich +10°C betrug, durchgeführt, außer für den Phenolreinigungsschritt, welcher bei Raumtemperatur durchgeführt wurde. Nach der Zentrifugation der Kultur wurde der Überstand der Kultur konzentriert. Das Kapselpolysaccharid wurde aus dem resultierenden Konzentrat durch die Zugabe von Centrimid, um eine Endkonzentration von 5% W/V zu ergeben, ausgefällt. Centrimid fällte PS aus der konzentrierten Flüssigkeit (SNF) aus. Etwas Protein, Nukleinsäure und Lipopolysaccharid (LPS) wurden ebenfalls zusammen damit ausgefällt. Die Niederschläge wurden durch Zentrifugation gesammelt, wobei einige andere Verunreinigungen und Protein in dem SNF zurückgelassen wurden. Das resultierende Pellet wurde durch Zentrifugation gesammelt und bei ≤ –20°C gelagert.
  • Die Pellets wurden in 0,3 M NaCl-Lösung resuspendiert und die Suspension wieder zentrifugiert. NaCl dissoziierte selektiv Polysaccharid-Centrimid-Komplexe. Einige Verunreingungen (Nukleinsäure, LPS, Protein) wurden in dem Verfahren ebenfalls dissoziiert. Zu dem Überstand wurde vorgekühltes absolutes Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 60% zugegeben. Der resultierende Niederschlag wurde durch Zentrifugation gesammelt und mit kaltem absolutem Ethanol gewaschen. Der Nie derschlag wurde unter Vakuum bei 0-4°C getrocknet und war das Zwischenprodukt. Das Zwischenprodukt wurde in Natriumacetatpuffer und mit Phenol bei Raumtemperatur gelöst. Die wässrige Phase wurde durch kontinuierliche Zentrifugation gesammelt. Die Phenolextraktion und Zentrifugation können mehrere Male wiederholt werden, und die wässrige Phase wurde dialysiert und diafiltriert. Das Kapselpolysaccharid aus der diafiltrierten Lösung wurde durch Zugabe des vorgekühlten Ethanols bis auf eine Endkonzentration von 60% in der Gegenwart von NaCl, 0,3 M, ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation gesammelt, mit vorgekühltem absolutem Ethanol, Aceton und Ether gewaschen und unter Vakuum bei 4°C getrocknet. Der getrocknete Niederschlag wurde dann bei geringer Feuchtigkeit zu einem feinen Pulver gemahlen, und dieses Produkt stellt das gereinigte Haemophilus influenzae Typ b-Polysaccharid dar.
  • Das gereinigte Polysaccharid wurde in Wasser gelöst, um 5 mg Polysaccharid pro ml Lösung zu erhalten, und der pH wurde mit NaOH auf 10,8 ± 0,2 eingestellt. Cyanogenbromid als eine Lösung in Wasser wurde in dem Verhältnis von 0,5 mg CNBr/mg Polysaccharid zugegeben. Der pH der Reaktionsmischung wurde mit NaOH für 35 bis 40 Minuten bei 23° ± 3°C bei 10,8 ± 0,2 gehalten. Der pH wurde durch die Zugabe von HCl auf pH 9 erniedrigt. Adipinsäuredihydrazid wurde bis zu einer Endkonzentration von 3,5 mg ADH/mg Polysaccharid zugegeben und der pH auf 8,5 eingestellt. Die Reaktionsmischung wurde für 15 Minuten bei 23 ± 3°C inkubiert (der pH wurde bei 8,5 gehalten), und dann wurde die Lösung über Nacht bei +4°C unter leichtem Rühren inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde gegen NaCl-Lösung dialysiert und dann konzentriert. Die Lösung wurde dann durch einen 0,45 μ-Filter filtriert und bei ≤ –40°C eingefroren. Dieses bildet das AH-Polysaccharid und wurde bei einer Temperatur ≤ –40°C gelagert.
  • Um die Tetanustoxinkomponente zu erzeugen, wurde ein Stamm von Clostridium tetani in einer Serie von Röhrchen inokuliert, welche 10 ml Rosenow-Medium oder Thioglycolat-Medium enthielten. Rosenow-Medium weist die folgende Zusammensetzung auf: Formel (in Gramm pro Liter an destilliertem Wasser)
    Pepton 10
    Fleischextrakt 3
    Glucose 2
    Natriumchlorid 5
    "Andrade"s Indikator (5% Fuchsinsäure) 10 ml
    Weißes Calciumcarbonat 1 Stück
    Hirn 1 Stück
  • Das Medium, welches unmittelbar vor der Verwendung aus anwendungsfertigen Produkten hergestellt wurde, wurde in Röhrchen gefüllt und bei 120°C für 20 Minuten sterilisiert.
  • Eine 5 Liter-Flasche, welche 3 Liter "Massachusetts"-Medium enthielt, wurde mit C. tetani inokuliert und für 16 bis 18 Stunden bei 35°C ± 1°C [für 16 Stunden] inkubiert. Der Inhalt wurde dann auf eine 20 Liter-Flasche überführt, welche 15 Liter steriles "Massachusetts"-Medium enthielt, und 8 Stunden bei 35°C ± 1°C inkubiert. Jede Flasche wurde verwendet, um einen Fermenter zu inokulieren, welcher 582 Liter "Massachusetts"-Medium enthielt, und dieser wurde 5 bis 6 Tage unter Belüftung bei 35°C inkubiert. Die Fermenter wurden abgekühlt, und zu der Kultur wurden 12 kg Natriumchlorid, 8 kg Trinatriumcitrat zugegeben. Das Schütteln wurde für einen Tag beibehalten, dann gestoppt, und dieses Verfahren erlaubt die Extraktion des restlichen Toxins aus den Bakterien am Ende der Kultivierung. Das Toxin wurde entweder durch Filtration oder durch Durchleiten durch eine kontinuierliche Zentrifuge aufgeklart.
  • Der Überstand von 1200 l Kultur wurde durch Ultrafiltration konzentriert und das konzentrierte Toxin gegen 0,07 M Dinatriumphosphatlösung, pH 8,2, diafiltriert. Das Endvolumen wurde auf 500 Lf/m eingestellt.
  • Eine doppelte Ausfällung mit Ammoniumsulfat wurde durchgeführt, um das gereinigte Tetanustoxin zu erhalten. So werden Ammoniumsulfat und 10 g Holzkohle langsam pro Liter des vorher erhaltenen diafiltrierten Toxins zugegeben. Nach 16 bis 24 Stunden Inkubation bei +4°C wurde das Toxin auf Kartuschen filtriert, um den Niederschlag zu eliminieren. Dann wurde eine Menge an Ammoniumsulfat, die aus reichte, um 320 gm/L auszumachen, langsam pro Liter des vorher erhaltenen Überstands zugegeben. Nach ca. 48 Stunden bei +4°C wurde das Pellet durch Zentrifugation gesammelt und in einer 0,05 M Dinatriumphosphatlösung, pH 8,2, gelöst. Die Lösung wurde gegen 0,05 M Dinatriumphosphatlösung, pH 8,2, diafiltriert und auf 300 Lf/ml eingestellt. Die Lösung wurde dann filtersterilisiert. 7,5 μMol (0,225%) Formaldehyd wurden pro ml der Toxinlösung zugegeben. Eine Detoxifikation wurde nach Inkubation für 24 Tage bei +37°C, einschließlich Zwischenperioden bei +4°C und +22°C, erreicht. Eine Sterilisation durch Filtration (0,22 μ) wurde durchgeführt, um das Tetanustoxoid zu erhalten. Das Tetanustoxoid wurde unter Verwendung einer Membran mit einem Grenzwert des Molekulargewichts ≤ 50.000 gegen NaCl dialysiert und konzentriert. Das konzentrierte Protein wurde dann aseptisch filtriert und bei +4°C gelagert.
  • Gleiche Mengen an AH-Polysaccharid und Tetanustoxoid (± 20%) wurden mit 0,05 M NaCl gemischt, um eine Konzentration von 7,5 mg Polysaccharid pro ml zu ergeben. Der pH der Lösung wurde mit HCl auf pH 5,7 + 0,2 eingestellt, und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDAC) wurde zugegeben, um eine Endkonzentration von 19,17 mg EDAC/ml Reaktionsmischung zu ergeben. Die Carboxylgruppen des Tetanusproteins werden durch Bindung an EDAC aktiviert. Unter den leicht sauren Bedingungen der Reaktion folgt eine Kondensationsreaktion, in welcher das AH-PS und das EDAC-aktivierte Tetanusprotein kovalent gebunden werden. Die Mischung wurde bei konstantem pH (5,7) für 60 Minuten bei +4°C inkubiert, und dann wurde der pH mit NaOH auf pH 6,9 ± 0,2 eingestellt, und die Reaktionsmischung gegen NaCl bei +4°C dialysiert. Das Konjugat wurde durch Zonenzentrifugation auf einem Sucrosegradienten (4% bis 60%) gereinigt, um EDAC, freies AH-Polysaccharid, freies Tetanusprotein und Konjugat mit niedrigem Molekulargewicht zu eliminieren. Zu der Fraktion, welche das Polysaccharidkonjugat enthielt, wurden dann pyrogenfreies Wasser, Sucrose, Tris-HCl-Puffer zugegeben, um eine Konjugatlösung mit der folgenden Zusammensetzung zu erhalten:
    Sucrose 8,5% W/V ± 0,5%
    Polysaccharid konz. ungefähr 200 μg/ml
    Tris-HCl-Puffer 10 mM pH 7,0 ± 0,5.
  • Die Lösung wurde dann aseptisch filtriert, indem ein 0,2 μ-Filter verwendet wurde, und bei –40°C gelagert.
  • Die Masse des Haemophilus influenzae Typ b-Polysaccharid-Konjugats wurde unter sterilen Bedingungen mit einem Verdünnungsmittel verdünnt, um die folgende Endzusammensetzung zu erhalten:
    Figure 00660001
  • Die endgültige Masse wurde in Fläschchen gefüllt und lyophilisiert. (Der lyophilisierte Impfstoff wurde zur Anwendung mit 0,5 ml oder 0,4% NaCl rekonstituiert).
  • (b) Formulierung
  • Zwei Formulierungen des multivalenten Komponentenimpfstoffes (APDT) wurden getestet. Die erste (APDT-niedrig) enthielt 10 μg Pertussistoxoid (PT), 5 μg filamentöses Hämagglutinin (FHA), 5 μg Fimbrien 2 und 3 μg 69 K-Protein (69 K) pro 0,5 ml-Dosis (CLASSIC). Die zweite Formulierung (APDT-hoch) enthielt zweimal die Menge von PT (20 μg) und identische Mengen von FIM und 69 K (HYBRID). Beide Formulierungen enthielten 15 Lf (Flockungsgrenze) Diphtherietoxoid, 5 Lf Tetanustoxoid, 1,5 mg Aluminiumphosphat als Hilfsmittel und 0,6% 2-Phenoxyethanol als Konservierungsmittel. Der Hib-Tetanustoxoid-Konjugatimpfstoff (PRPT) wurde in der oben beschriebenen Weise von der Connaught Laboratories Inc. (Swiftwater, U.S.A.) hergestellt.
  • Population
  • Gesunde 17 bis 21 Monate alte Kinder, die mit drei Dosen von entweder APDT-niedrig oder PRPT in separaten Injektionen im Alter von 2, 4 und 6 Monaten in einem vorhergehenden klinischen Test immunisiert worden waren, wurden für die Studie rekrutiert. Nach einer schriftlichen informierten Zustimmung wurden die Kinder durch eine computergenerierte ausgewogene Blockliste von Zufallszahlen eingeteilt, um entweder PRP-T als eine separate Injektion am selben Tag, als eine separate Injektion, wobei das PRP-T einen Monat nach dem APDT-Impfstoff gegeben wurde, oder als eine einzige Injektion (lyophilisiertes PRP-T, rekonstituiert in APDT) zu erhalten. Die APDT-Formulierung (hoch oder niedrig) blieb für jedes Kind dieselbe, wie sie für die ersten drei Dosen gegeben worden war (Einteilungsverhältnis 6:1 ADPT-hoch; ADPT-niedrig). Die Impfstoffe wurden i. m. mit einer 25 mm-Nadel in den Deltamuskel des Arms oder den Vastus lateralis-Muskel des Oberschenkels gegeben, wenn der Deltamuskel eine unzureichende Masse aufwies. Wenn eine zweite Injektion für PRPT benötigt wurde, wurde in das gegenüberliegende Glied injiziert.
  • Klinische und Laborüberwachung
  • Die Teilnehmer wurden im Hinblick auf lokale und systemische Gegenreaktionen unmittelbar nach der Immunisierung und durch die Eltern für 72 Stunden nach der Immunisierung überwacht. Daten wurden über ein strukturiertes Telefongespräch nach 24 und 72 Stunden gesammelt. Die Körpertemperatur wurde wenigstens einmal täglich oder immer, wenn die Eltern annahmen, dass das Kind fiebrig war, gemessen. Die Empfindlichkeit und systemische Reaktionen (Reizbarkeit, verminderte Aktivität, verminderte Ernährung) wurden entsprechend vorher aufgestellten Kriterien als schwach, mäßig oder schwer eingestuft, wobei das Elternteil die Schwere auf der Basis von strukturierten Beispielen auswählte. Gemessene lokale Reaktionen wurden durch deren Größe und ein anhaltendes Weinen während ihrer Dauer eingestuft.
  • Blutproben wurden vor und 28 Tage nach der Immunisierung durch Venenpunktion oder durch einen Stich in den Finger bei Kindern, welchen die PRP-T-Injektion gegeben wurde, gesammelt (daher 2 Monate nach APDT). Antikörper gegen das Kapselpolysaccharid von Hib (PRP) wurden durch einen RIA gemessen. IgG-Antikörper gegen PT wurden durch einen ELA und PT-neutralisierende Antikörper durch eine Cytotoxizitätsneutralisation mit Ovarienzellen des chinesischen Hamsters (CHO) gemessen. IgG anti-FHA-, anti-FIM- und anti-69 K-Antikörper wurden durch einen EIA gemessen; Einheiten wurden berechnet, indem das US FDA-Referenzantiserum (# 3) verwendet wurde. Pertussisagglutinine wurden ebenfalls gemessen. Diphthe rieantitoxin wurde durch den Mikroneutralisationsassay gemessen und Tetanusantitoxin durch einen EIA. Antikörpertiter wurden als geometrische mittlere Titer ausgedrückt; Serumproben mit Titern, die unter der Testnachweisgrenze lagen, wurde zu dem Zweck von statistischen Berechnungen ein Wert von einer Hälfte der unteren Nachweisgrenze zugeordnet.
  • Statistische Analyse
  • Gegenreaktionen wurden nach einer Eingruppierung im Hinblick auf die klinische Signifikanz analysiert. Die Raten der Gegenreaktionen wurden durch Mantel-Haenszel-Schätzungen des relativen Risikos unter Verwendung des Mittelpunkts und der Impfstoffformulierung als den Schichtungsvariablen verglichen. Punktschätzungen und 95% Cl der RR wurden in jedem Fall geschätzt. Cl, welche 1,00 nicht beinhalten, sind statistisch signifikant.
  • Geometrische mittlere Antikörpertiter und 95% Cl wurden für den Antikörpertiter auf jedes Impfstoffantigen vor und nach der Immunisierung berechnet. Mittlere logarithmische Titer wurden durch eine Dreifaktoranalyse der Varianz verglichen. Der Anteil an Versuchspersonen, welche in jeder Gruppe vorher festgelegten Spiegel erreichten, wurde durch logistische Regression verglichen. Es wurden keine Bereinigungen für Mehrfachvergleiche vorgenommen.
  • Eine Gesamtzahl von 545 Kindern (44% weiblich) wurden in der Studie registriert, von welchen 74% die Säuglingsreihenstudie abgeschlossen hatten. Der Anteil der Teilnehmer in dieser Studie, welche die zwei Formulierungen erhalten hatte, blieb 6:1 (468 APDT-hoch, 77 APDT-niedrig). Das mittlere Alter betrug 18,9 Monate (Bereich 17-21 Monate); alle bis auf 3 Kinder (99,4%) beendeten die Studie.
  • Gegenreaktionen
  • Die Raten der Gegenreaktionen unterschieden sich nicht in den Gruppen, die mit APDT-hoch oder APDT-niedrig immunisiert wurden; die Raten waren ebenfalls ähnlich, wenn die Immunisierungen separat bei einer Visite, bei separaten Visiten oder in einer einzigen kombinierten Injektion gegeben wurden.
  • Antikörperantwort
  • Vor der Immunisierung waren die Antikörperspiegel gegen alle Antigene außer FHA bei Kindern, welche bei ihren ersten drei Dosen APDT-hoch oder APDT-niedrig erhalten hatten, ähnlich. Kinder, denen APDT-hoch mit seinem vierfachen FHA-Gehalt versorgt wurde, wiesen signifikant höhere FHA-Titer auf als Kinder, die mit APDT-niedrig immunisiert wurden (p-0,0001). Nach der Immunisierung induzierte APDT-hoch höhere Antikörpertiter als APDT-niedrig (p=0,0001). Im Gegensatz dazu waren anti-PT-Titer vor der Immunisierung, welche durch CHO-Neutralisation oder EIA gemessen wurden, in den zwei Gruppen ähnlich. Paradoxerweise waren trotz des zweifachen Antigengehalts die anti-PT-Titer nach der Immunisierung mit APDT-hoch niedriger als mit APDT-niedrig (p = 0,038). In ähnlicher Weise waren die anti-FIM-Antikörper und Agglutinin nach der Immunisierung höher bei der APDT-niedrig-Gruppe (p = 0,01 bzw. p = 0,04), trotz identischer Mengen an Fimbrienantigen in beiden Impfstoffformulierungen.
  • Vor der Immunisierung gab es wenige Unterschiede bei den anti-Pertussis-Antikörpern bei der Gruppe, die zufällig eingeteilt wurde, um das PRPT, kombiniert mit APDT, als eine einzige Injektion oder gegeben als separate Injektionen am selben oder separaten Tagen, zu erhalten (Tabelle 9). Die Daten werden getrennt für Empfänger von APDT-hoch oder APDT-niedrig angegeben; jedoch werden wegen der kleinen Anzahl an Kindern in der APDT-niedrig-Gruppe diese Ergebnisse nicht weiter diskutiert. Die Gruppe, die zufällig eingeteilt wurde, um separate Injektionen am selben Tag zu erhalten, wies höhere anti-PT-Antikörper bei der CHO-Neutralisation auf als die Gruppe, welche die zwei Injektionen an separaten Tagen erhielt (6,14 gegenüber 4,80 Einheiten; p < 0,05). Die Antikörperspiegel nach der Immunisierung waren bei dieser Gruppe ebenfalls höher (176 Einheiten) als bei der Gruppe mit separater Injektion an separaten Tagen (122 Einheiten; p < 0,01), auch wenn in ähnlicher Weise höhere Spiegel bei der Gruppe gefunden wurden, denen eine einzige kombinierte Immunisierung gegeben wurde (171 Einheiten; p < 0,01). Anti-69 K-Antikörperantworten wurden in dieser Gruppe nach der Immunisierung nachgewiesen, auch wenn Kinder, die mit zwei Injektionen am selben Tag immunisiert wurden, eine höhere Antikörperantwort aufwiesen als Kinder, die mit dem kombinierten einzelnen Impfstoff immunisiert wurden, und Kinder, die mit zwei Injektionen am selben Tag immunisiert wurden, eine höhere Antikörperantwort aufwiesen als Kinder, die an getrennten Tagen immunisiert wurden (243 gegenüber 190 Einheiten; p < 0,001) [und] als Kinder, die mit zwei Injektionen an separaten Tagen immunisiert wurden.
  • Anti-PRP-Antikörperspiegel waren vor der Immunisierung bei den drei Gruppen ähnlich. Die Titer nach der Immunisierung waren bei Kindern höher, die mit separaten Injektionen am selben Tag immunisiert wurden (66,0 μg/ml), als bei Kindern, die an separaten Tagen immunisiert wurden (28,4 μg/ml; p < 0,001) oder bei Kindern, denen die einzige kombinierte Immunisierung gegeben wurde (47,1; p < 0,05). Die kombinierte Immunisierung rief ebenfalls signifikant höhere Antikörperspiegel hervor als die Impfstoffe, die an getrennten Tagen gegeben wurden (p < 0,05). Es wurden keine Unterschiede bei den Gruppen bezüglich des Prozentsatzes nachgewiesen, welcher ein "protektives" Niveau erreichte; alle Teilnehmer wiesen nach der Immunisierung Titer über 0,15 μg/ml auf, und nur 4 Teilnehmer (0-0,7%) erreichten nicht einen Titer über 1 μg/ml (3 in der Gruppe, denen separate Injektionen an separaten Tagen gegeben wurden, und einer in der Gruppe, denen eine einzige kombinierte Injektion gegeben wurde). Über 82% der Kinder in jeder Gruppe überschritten einen Spiegel von anti-PRT-Antikörper von 10 μg/ml.
  • Eine heftige Antikörperantwort wurde ebenfalls gegenüber den Diphtherie- und Tetanustoxoiden hervorgerufen. Im Vergleich zu der Gruppe, welcher die Immunisierung an getrennten Tagen gegeben wurde (2,1 IU/ml), wurden signifikant höhere anti-Diphtherie-Antikörperspiegel bei Kindern hervorgerufen, die mit zwei Injektionen am selben Tag (3,1; p < 0,01 IU/ml) oder der kombinierten einzelnen Injektion (3,3 IU/ml; p < 0,001) immunisiert wurden. Die anti-Tetanus-Antikörper waren höher bei den Empfängern der zwei Injektionen am selben Tag (6,7 IU/ml) als bei Kindern, die an getrennten Tagen immunisiert wurden (5,2 IU/ml; p < 0,01) oder Kindern, denen die kombinierte einzige Injektion gegeben wurde (4,8 IU/ml; p < 0,001). Alle Kinder hatten nach der Immunisierung anti-Diphtherie- und anti-Tetanus-Antikörpertiter über 0,1 IU/ml, ein Spiegel, welcher 10fach über dem vorgegebenen Schutzspiegel liegt. Über 96% der anti-Tetanus-Titer und über 74% der anti-Diphtherie-Titer überschritten einen Spiegel von 1,0 IU/ml; es gab keine Unterschiede zwischen den Immunisierungsgruppen.
  • Beispiel 8
  • Dieses Beispiel beschreibt die Formulierung und Immunogenität eines multivalenten Kombinationsimpfstoffes, welcher inaktivierten Polioimpfstoff enthält.
  • (a) Herstellung von inaktiviertem Poliovirus
  • (i) Wachstum auf MRC-5-Zellen
  • Inaktiviertes Poliovirus, welches in MRC-5-Zellen wachsen gelassen wurde, wurde wie folgt erzeugt. Die Zellen stammten aus Nierenzellen einer grünen Meerkatze (Ceropithacus aethiops):
    Der inaktivierte dreiwertige Poliovirusimpfstoff enthielt Komponenten vom Typ I (Mahoney), Typ II (MEF) und Typ III (Saukett), welche auf MRC-5-Zellen auf Mikroträgerkügelchen wachsen gelassen wurden, verarbeitet und getrennt inaktiviert wurden, bevor sie zu einem dreiwertigen Poliovirusimpfstoff kombiniert wurden.
  • Eine MRC-5-Zellsuspension wurde zu Zellwachstumsmedium in einem Fermenter bei pH 7,2 (6,9 bis 7,6) und einer Temperatur von 37°C ± 0,5°C zugegeben. Das Zellwachstumsmedium wies die folgende Zusammensetzung auf:
    CMRL-Medium 1969
    Natriumbicarbonat 0,15%
    Adultes Rinderserum 5,00%–7,00%
    Neomycinsulfat (μg an Aktivität) 10 IU/ml
    Polymyxin B 200 IU/ml
  • CMRL-Medium wies die folgende Zusammensetzung auf: TROCKENPULVER
    Bestandteile mg/Liter
    Aminosäure
    L-Alanin 25,0
    L-Arginin (freie Base) 58,0
    L-Asparaginsäure 30,0
    L-Cystein·HCl 0,1
    L-Cystin Dinatrium 24,0
    L-Glutaminsäure·H2O 67,0
    L-Glutamin 200,0
    L-Glycin 50,0
    L-Histidin (freie Base) 16,2
    L-Hydroxyprolin 10,0
    L-Isoleucin 20,0
    L-Leucin 60,0
    L-Lysin·HCl 70,0
    L-Methionin 15,0
    L-Phenylalanin 25,0
    L-Prolin 40,0
    L-Serin 25,0
    L-Threonin 30,0
    L-Tryptophan 10,0
    L-Tyrosin 40,0
    L-Valin 25,0
    Vitamine
    p-Aminobenzoesäure 0,05
    Ascorbinsäure 0,05
    d-Biotin 1,00
    Calciumpantothenat 1,00
    Cholindihydrogencitrat 2,12
    Folsäure 1,00
    Glutathion 0,05
    i-Inositol 2,00
    Nikotinamid 1,00
    Pyridoxal·HCl 1,00
    Riboflavin-5-phosphat 0,10
    Thiamin HCl 1,00
    Bestandteile mg/Liter
    Komponente
    Natriumchlorid 8000,0
    Kaliuimchlorid 400,0
    Calciumchlorid (wasserfrei) 140,0
    Magnesiumsulfat·7H2O 200,0
    Natriumphosphat, zweibasig, wasserfrei 180,0
    Natriumphosphat, nicht basisch 70,0
    D-Glucose (wasserfrei) 1000,0
    Phenolrot 20,0
    • 10.852 g ergeben 1 Liter Medium CMRL 1969.
  • Das Medium wurde wie folgt hergestellt:
    450 Liter destilliertes pyrogenfreies Wasser werden zu 905 ml 1 N Salzsäure zugegeben. Zu dieser Mischung werden 5426,5 g des CMRL 1969-Trockenpulvers unter kontinuierlichem Rühren zugegeben, bis sie zu einer klaren Lösung aufgelöst sind.
  • Die folgenden Chemikalien wurden in der angegebenen Reihenfolge unter kontinuierlichem Rühren zugegeben, wobei man bei jeder Chemikalie wartete, dass sie sich auflöste, bevor die nächste zugegeben wurde:
    Neomycin 10 mcg/ml
    Polymyxin B 200 Einheiten/ml
    TES Pufferlösung 5000,0 ml
    Natriumbicarbonat 750,0 g
    Rinderserum 30,0 l
  • Das Volumen wurde mit frischem destilliertem Wasser auf 500 l gebracht und gerührt, bis es gleichmäßig gemischt war.
  • Das Zellwachstum wurde überwacht, und wenn festgestellt wurde, dass die Zellen in der logarithmischen Phase waren, wurde das verbrauchte Wachstumsmedium verworfen und durch Viruswachstumsmedium ersetzt. Das Viruswachstumsmedium wies die folgende Zusammensetzung auf:
    Chemikalien des Mediums 199 mit Earle's Salzen
    Natriumbicarbonat 0,26%
    Tween 80 20 ppm
    Neomycinsulfat (μg an Aktivität) 10 IU/ml
    Polymyxin B 200 IU/ml
    L-Glutamin 100 mg/l
    L-Arginin 29 mg/l
    L-Leucin 30 mg/l
    L-Isoleucin 10 mg/l
    L-Methionin 7,5 mg/l
    L-Serin 12,5 mg/l
    L-Threonin 15 mg/l
    L-Cystin 10 mg/l
    Cholin-diH-citrat 107 mg/l
  • Das CMRL 199-Medium wies die folgende Zusammensetzung auf: TROCKENPULVER
    Bestandteile mg/Liter
    L-Alanin 25,0
    L-Arginin (freie Base) 58,0
    L-Asparaginsäure 30,0
    L-Cystein·HCl·H2O 0,1
    L-Cystin Dinatrium 24,0
    L-Glutaminsäure H2O 67,0
    L-Glutamin 100,0
    L-Glycin 50,0
    L-Histidin (freie Base) 16,2
    L-Hydroxyprolin 10,0
    L-Isoleucin 20,0
    L-Leucin 60,0
    L-Lysin 70,0
    L-Methionin 15,0
    L-Phenylalanin 25,0
    L-Prolin 40,0
    L-Serin 25,0
    L-Threonin 30,0
    L-Tryptophan 10,0
    L-Tyrosin 40,0
    L-Valin 25,0
    p-Aminobenzoesäure 0,050
    Ascorbinsäure 0,050
    d-Biotin 0,010
    Calciumpantothenat 0,010
    Cholindihydrogencitrat 1,060
    Folsäure 0,010
    Glutathion 0,050
    i-Inositol 0,050
    Menadion 0,010
    Nikotinamid (Niacinamid) 0,025
    Nikotinsäure (Niacin) 0,025
    Pyridoxal·HCl 0,025
    Pyridoxin·HCl 0,025
    Riboflavin-5-phosphat 0,010
    Thiamin HCl 0,010
    Vitamin-A-acetat 0,100
    Vitamin D (Calciferol) 0,100
    Vitamin E (Tocopherolphosphat) 0,010
    Adeninsulfat 10,000
    Adenosintriphosphat 1,000
    Adenosin-5-phosphorsäure 0,200
    Deoxy-2-ribose 0,500
    d-Ribose 0,500
    Cholesterol 0,200
    Guanin 0,300
    Hypoxanthin 0,300
  • Die Kulturen wurden bei einer Multiplizität der Infektion mit dem geeigneten Impfvirus infiziert. Die Infektion ging bei 36°C ± 1°C vonstatten. Wenn die Virus-C.P.E. vollständig war, wurde die Kultur auf 2°C bis 15°C abgekühlt.
  • Die Virusernte wurde durch Filtration aufgeklart. Das Viruserntevolumen wurde durch Membranultrafiltration verringert, bei einem nominalen Molekulargewichtscutoff von 100.000, zu einem Volumen, das zur Diafiltration gegen 0,04 M Phosphatpuffer geeignet war. Nach der Diafiltration wurde das Volumen weiter auf ein Volumen konzentriert, welches zur Gelfiltration geeignet war. Von dem Lebendviruskonzentrat wurden Proben genommen und bei 2°C bis 8°C gelagert.
  • Das Lebendviruskonzentrat wurde auf eine Gelfiltrationssäule aufgetragen und von der Säule mit 0,04 M Phosphatpuffer eluiert. Die Virusfraktion wurde durch Überwachen der optischen Dichte des Säuleneluats bei 254 und 280 nm gesammelt.
  • Ein zweiter Reinigungsschritt wurde durchgeführt, wobei ein DEAE-Ionenaustauschermedium mit 0,04 M Phosphat als dem Elutionspuffer verwendet wurde. Dieser Schritt kann zweimal wiederholt werden, wenn die Menge des verwendeten Ionenaustauschermediums unzureichend war, wie durch Überwachen bei 254 und 280 nm festgestellt wird.
  • Die gesammelte Virusfraktion wurde konzentriert und gegen Hank's Spezialmedium dialysiert, um den Phosphatgehalt zu verringern. Hank's Spezialmedium weist die folgende Zusammensetzung auf:
    AMINOSÄUREN mg/Liter
    D,L-Alanin 25,00
    L-Arginin·HCl 58,00
    D,L-Asparaginsäure 30,00
    L-Cystein HCl H2O 0,10
    L-Cystin 2HCl 26,00
    D,L-Glutaminsäure 67,00
    L-Glutamin 100,00
    Glycin 50,00
    L-Histidin HCl·H2O 16,20
    L-Hydroxyprolin 10,00
    D,L-Isoleucin 20,00
    D,L-Leucin 60,00
    L-Lysin·HCl 70,00
    D,L-Methionin 15,00
    D,L-Phenylalanin 25,00
    L-Prolin 40,00
    D,L-Serin 25,00
    D,L-Threonin 30,00
    D,L-Tryptophan 10,00
    L-Tyrosin (Dinatriumsalz) 40,00
    D,L-Valin 25,00
    VITAMINE
    Ascorbinsäure 0,050
    d-Biotin 0,010
    Vitamin D (Calciferol) 0,100
    D-Calciumpantothenat 0,010
    Cholinchlorid 1,060
    Folsäure 0,010
    i-Inostitol 0,050
    Mineralsalze mg/Liter
    Calciumchlorid (wasserfrei) 40,00
    Eisennitrat·9H2O 0,10
    Kaliumchlorid 400,00
    Natriumchlorid 8.000,00
    Magnesiumsulfat·7H2O 200,00
    Andere Bestandteile
    Adeninsulfat 10,000
    Adenosintriphosphat (Dinatriumsalz) 1,000
    Adenylsäure 0,200
    d α Tocopherol-Phosphorsäure (Natriumsalz) 0,010
    Cholesterol 0,200
    Deoxyribose 0,500
    Glucose 1.000,000
    Glutathion 0,050
    Guanin·HCl 0,300
    Hypoxanthin (Natriumsalz) 0,300
    Ribose 0,500
    Natriumacetat·3H2O 81,500
    Thymin 0,300
    Tween 80 20,000
    Uracil 0,300
    Xanthin (Natriumsalz) 0,300
    Menadion 0,010
    Nikotinsäure 0,025
    Nikotinamid 0,025
    p-Aminobenzoesäure 0,050
    Pyridoxal·HCl 0,025
    Pyridoxin·HCl 0,025
    Riboflavin-5-phosphat 0,010
    Thiamin·HCl 0,010
    Vitamin A (Acetat) 0,140
  • Die gereinigte Virusfraktion wurde durch einen Filter mit 0,2 μ Porosität filtriert.
  • Eine oder mehrere gereinigte Viruskonzentratfraktionen können zur Inaktivierung vereinigt werden. Auf der Basis von ELISA-Testergebnissen wurde der monovalente Viruspool verdünnt auf:
    Typ I: 1750 ± 250 DU/ml
    Typ II: 1500 ± 250 DU/ml und
    Typ III: 1250 ± 250 DU/ml mit Hank's Spezialmedium.
  • Der monovalente Pool wurde auf 37°C ± 1°C aufgewärmt, dann durch einen Filter mit 0,2 μ Porosität filtriert.
  • Die benötigte Menge an Formalin, um eine Konzentration von 1:4000 zu erreichen, wurde zugegeben. Der Viruspool und Formalin wurden gemischt und kontinuierlich bei 37°C ± 1°C gerührt. Von dem monovalenten Viruspool wurden Proben für die Lebensfähigkeit entnommen. Am sechsten Tag wurde der inaktivierende Viruspool durch einen 0,2 μ-Filter filtriert und bei 37°C ± 1°C gehalten. Am dreizehnten Tag der Inaktivierung wurde der Viruspool durch einen 0,2 μ-Filter filtriert.
  • Eine oder mehrere inaktivierte monovalente Komponenten wurden ausgewählt und aseptisch mit einem Sammeltank verbunden. Der monovalente Pool wurde weiter durch Membranultrafiltration mit einem nominalen Molekulargewichtscutoff von 100.000 konzentriert. Eine Dialyse gegen RIV-PBS-Verdünnungsmittel:
    Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4), 0,346 g/CCmL
    Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4), 0,187 g/CCmL
    mit Tween wurde dann durchgeführt, um eine Gleichförmigkeit des Endprodukts zu erreichen.
  • Albumin (human) wurde zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,5% zu erreichen. Das gepoolte monovalente Konzentrat wurde dann durch einen 0,2 μ-Filter filtriert. RIV-PBS-Verdünnungsmittel mit Tween wurde zugegeben, um eine geschätzte (durch Berechnung) Konzentration von 10 bis 15 Dosen pro 0,5 ml zu erreichen. Das gepoolte Konzentrat wurde bei 2°C bis 8°C gelagert, bis es benötigt wurde.
  • Die geeigneten Volumina der monovalenten Typ I-, II- und III-Komponenten wurden berechnet und kombiniert. Der dreiwertige Impfstoff sollte enthalten:
    Typ I: 40 DU/0,5 ml-Dosis
    Typ II: 8 DU/0,5 ml-Dosis
    Typ III: 32 DU/0,5 ml-Dosis
  • Das dreiwertige Konzentrat wurde bei 2°C bis 8°C gelagert, bis es verwendet wurde. Formaldehyd und 2-Phenoxyethanol wurden zugegeben und gemischt. Albumin (human) wurde zugegeben, nach Berechnung, um eine Endkonzentration von 0,5% zu ergeben.
  • (ii) Wachstum auf Vero-Zellen
  • Ampullen der Vero-Arbeitszellbank wurden bis zu dem Grad der ausgewählten Zellpassage subkultiviert. Die Zellampullen wurden in flüssigem Stickstoff konserviert. Die Zellen wurden unter Verwendung von Mikroträgerkügelchen kultiviert, welche kugelförmige Kügelchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von ca. 100 Mikrometern waren, die aus Dextranpolymeren mit Gruppen von DEAE, welche auf ihre Oberfläche gepfropft waren (Diethylaminoethyl), was diesen eine positive Ladung verlieh, aufgebaut waren.
  • Das Grundmedium für das Zellwachstum war das "Minimum Essential Medium" (MEM) von Eagle in Earle-Salzlösung, angereichert mit 0,2% Lactalbuminhydrolysat, 0,1% Dextrose, 5% Kalbsserum. Jeder ml Medium enthält die folgenden Antibiotika:
    Streptomycin: 75 Einheiten pro ml
    Neomycin: 14 Einheiten pro ml
    Polymyxin B Sulfat: 35 Einheiten pro ml
  • Die Vero-Zellen wurden schrittweise in Biogeneratoren von zunehmender Größe subkultiviert. Dann wurden das Kulturmedium und das ausreichende Volumen an Mikroträgerkügelchen pro Liter Medium in den industriellen Biogenerator eingeführt. Die Temperatur wurde bei +37°C stabil gehalten. Die Zellen, welche durch Trypsi nierung gesammelt wurden, wurden zugegeben und unter Rühren gesetzt. Die Kultur wurde für 4 bis 7 Tage bei +37°C fortgesetzt, wobei das Rühren schrittweise erhöht wurde. Gewöhnlich wurde am Ende der Kultur eine Zunahme von 6- bis 20mal bei dem Zellwachstum beobachtet. Das Medium, welches für das Viruswachstum verwendet wurde, war das Medium 199 (Parker) in Earle-Salzlösung, angereichert mit 0,1% Dextrose. Dieses Medium enthält dieselben Antibiotika in derselben Konzentration wie das Medium für das Zellwachstum, es enthält aber kein Kalbsserum. Am 4./7. Tag des Zellwachstums wurde der Biogenerator, welcher auf der industriellen Stufe rührte, gestoppt; die Kügelchen setzten sich am Boden des Tanks ab, das alte Medium wurde entfernt. Dann wurde etwas Medium 199, welches frei von Serum war, in jeden Biogenerator eingeführt und gerührt. Dieses Medium wurde dann abgezogen, was eine Wäsche der Kügelchen und Zellen bewirkte. Etwas Medium 199, das frei von Serum war, wurde zusammen mit dem notwendigen Volumen einer Impfcharge in den Biogenerator überführt. Das Virus wurde durch leichtes Rühren in den Zellen adsorbiert. Am Ende der Viruskultur wurde das Rühren gestoppt. Die Virussuspension wurde abgezogen und gesammelt, und die Kügelchen wurden durch Filtration zurückgehalten. Die Virussuspension wurde homogenisiert. Die Ernte, welche auf einer organischen Membran mit Poren einer mittleren Größe von 0,20 mm filtriert wurde, wurde bei +4°C gelagert. Das Virus wurde durch Ultrafiltration konzentriert.
  • Das Virus wurde weiter durch Ionenaustauscherchromatographie unter Verwendung eines DEAE-Dextran-Spherosil-Trägers, welcher mit Phosphatpuffer, 0,04 M, pH = 7,00, äquilibriert war, gereinigt. Das Virus wurde weiter durch Gelfiltrationschromatographie gereinigt, wobei eine Säule verwendet wurde, die ein Agarosegel, Sepharose CL-6B, gepuffert mit Phosphat, 0,04 M, pH = 7,00, enthielt. Das Virus wurde weiter durch Chromatographie unter Verwendung von DEAE-Dextran-Spherosil, gepuffert mit einem Phosphatpuffer, 0,04 M, pH = 7,00, gereinigt. Sobald die letzte Reinigung durchgeführt wurde, wurde die Virussuspension mit etwas Medium M-199, pH = 7,0 ohne Phosphat, auf das benötigte Volumen eingestellt, zehnmal in EDTA 5 mm, Glycin bei 0,5% und Tween 80 bei einer Endkonzentration von 50 mg/Liter (Inaktivierungsmedium) konzentriert. Diese Mischung stellt eine "Konzentrierte Virusmischung" dar und wird auf einer Membran von 0,2 μm filtriert. Die konzentrierte Virussuspension wurde bis zur Inaktivierung bei +4°C gelagert.
  • Eine oder mehrere Chargen der "Konzentrierten Virusmischung" desselben Typs wurden gemischt und möglicherweise mit etwas "Inaktivierungsmedium" in einem geeigneten Tank verdünnt oder eingestellt. Die Verdünnung wurde entsprechend den Typen auf das richtige Volumen eingestellt, um einen D-Antigen-Titer zwischen:
    • – 1500 und 2000 D Einheiten bei Typ 1
    • – 800 und 1000 D Einheiten bei Typ 2
    • – 1000 und 1500 D Einheiten bei Typ 3
    und eine Proteinrate von:
    • – ≤ 40 μg/ml bei Typ 1
    • – ≤ 70 μg/ml bei Typ 2
    • – ≤ 30 μg/ml bei Typ 3
    zu erhalten.
  • Die eingestellte gereinigte konzentrierte Virussuspension wurde höchstens 72 Stunden vor dem Beginn der Inaktivierung auf einer 0,22 μm-Membran filtriert. Die Virussuspension wurde dann wieder auf +37°C erwärmt. Zur Inaktivierung wurde eine Formaldehydlösung zugegeben, um eine Konzentration von 1/4000 zu erhalten. Um die Inaktivierungskinetik nach 24, 48, 72 und 96 Stunden zu verfolgen, wurden während der ersten vier Tage Proben entnommen. Es wurden Proben von 10 ml entnommen, mit einer unmittelbaren Neutralisation des Formaldehyds durch Wirkung von Natriumbisulfit und direkter Lagerung bei –20°C bis zur Titration.
  • Am 6. Tag wurde die Virussuspension während der Inaktivierung unter Verwendung eines 0,22 μm-Filters filtriert. Nach der Filtration wird die Inkubation der Flüssigkeit bei +37°C für 6 weitere Tage unter konstantem Rühren durchgeführt. Am 9. Tag der Inaktivierung wurden 3mal das Volumen, welches 3000 Humandosen entsprach, und mindestens 500 ml der individuellen Rohernte abgenommen. Dieses Volumen wurde entsprechend dem Titer beim D-Antigen der "Konzentrierten Virusmischung" berechnet. Die Probennahme wurde direkt mit etwas Natriumbisulfit neutralisiert, um die Wirkung des restlichen Formaldehyds zu stoppen. Die homogenisierte und inaktivierte Virussuspension wurde dann bei +37°C nach 12 Tagen Inaktivierung aus dem Inkubator herausgenommen. Das Volumen wurde direkt mit etwas Natriumbisulfit neutralisiert und bei +4°C gelagert.
  • Um eine konzentrierte dreiwertige Charge von IPV herzustellen, wurden monovalente Präparationen kombiniert, um bereitzustellen:
    Typ 1 (Mahoney) 400 Antigen D Einheiten
    Typ 2 (MEF-1) 80 Antigen D Einheiten
    Typ 3 (Saukett) 320 Antigen D Einheiten
    Medium 199- pH 7,2 q. s. auf 1 ml
  • Die Mischung wurde gerührt, um zu homogenisieren, auf einer Membran mit einer Porosität von 0,22 Mikron filtriert.
  • Das endgültige Massenprodukt wurde aus den konzentrierten dreiwertigen Massenchargen, wie beispielsweise den beschriebenen, durch Verdünnung mit Medium 199, pH 7,2, ohne Phenolrot erhalten, so dass die Einheitsdosis pro 0,5 ml enthält:
    40 Einheiten D-Antigen für Typ 1
    8 Einheiten D-Antigen für Typ 2
    32 Einheiten D-Antigen für Typ 3.
  • (b) Formulierungen
  • Eine multivalente Impfstoffformulierung (APDT) enthielt fünf Pertussisantigene (10 μg PT, 5 μg FHA, 5 μg FIM 2 und 3, 3 μg 69K), 15 Lf Diphtherietoxoid, 5 Lf Tetanustoxoid, 1,5 mg Aluminiumphosphat als Hilfsmittel und 0,6% 2-Phenoxyethanol als Konservierungsmittel pro 0,5 ml (CLASSIC). Dieser Impfstoff wurde allein oder in Kombination mit entweder IPV, das auf MRC-5-Zellen erzeugt wurde (mIPV), welches wie oben beschrieben hergestellt wurde, IPV, das auf Vero-Zellen hergestellt wurde (vIPV), das wie oben beschrieben hergestellt wurde, oder mit OPV (Connaught Laboratories Limited) verwendet. Um ihren routinemäßigen Immunisierungs zeitplan nicht zu stören, wurde der Haemophilus influenzae b-Tetanustoxoid-Konjugatimpfstoff zum Zeitpunkt der Folgevisite verabreicht.
  • Population
  • Gesunde 17 bis 19 Monate alte Kinder, die mit 3 Dosen DTP und 2 Dosen OPV oder 3 Dosen DTP-IPV vor einem Alter von 8 Monaten immunisiert worden waren, wurden für diese Studie rekrutiert. Nach einer schriftlichen informierten Zustimmung von den Eltern oder Pflegern wurden die Kinder durch eine computergenerierte ausgewogene Blockliste von Zufallszahlen eingeteilt, um eine von fünf Impfstofftherapien zu erhalten (Tabelle 10?). Kombinationsimpfstoffe, die A3DT enthielten, wurden über den intramuskulären Weg mit einer 25 mm-Nadel in den Deltamuskel des Arms oder den Vastus lateralis-Muskel des Oberschenkels gegeben, wenn der Deltamuskel eine unzureichende Masse aufwies. IPV (0,5 ml; mIPV oder vIPV) wurden, wenn sie allein gegeben wurden, über den subkutanen Weg verabreicht, wobei eine Nadel mit 1/2 bis 5/8 Inch (12,5 bis 16 mm) in der Länge verwendet wurde; APDT enthaltende Impfstoffe wurden in das linke Glied gegeben; das rechte Glied wurde für die inaktivierten Poliovirusimpfstoffe verwendet, wenn diese separat gegeben wurden, und für alle Haemophilus influenzae b-Konjugatimpfstoffe bei der zweiten Visite.
  • Klinische und Laborüberwachung
  • Blutproben wurden durch Venenpunktion oder durch einen Stich in den Finger vor und 28 Tage nach der Immunisierung gesammelt. IgG-Antikörper gegen PT wurden durch einen Enzymimmunassay und PT-neutralisierende Antikörper durch CHO-Neutralisation gemessen. IgG anti-FHA-, anti-FIM- und anti-69 K-Antikörper wurden durch einen Enzymimmunassay gemessen; Einheiten wurden berechnet, indem das US FDA-Referenzantiserum (# 3) verwendet wurde. Pertussisagglutinine wurden ebenfalls gemessen. Diphtherieantitoxin wurde durch einen Mikroneutralisierungsassay und Tetanusantitoxin durch einen Immunassay gemessen. Antikörper Poliovirus Typ 1-, 2- und 3-Antikörper wurden durch Virusneutralisation gemessen. Antikörpertiter wurden als geometrische mittlere Titer ausgedrückt; Serumproben mit Titern, die unter der Testnachweisgrenze lagen, wurde zum Zwecke statistischer Berechnungen ein Wert von einer Hälfte der unteren Nachweisgrenze zugeordnet.
  • Geometrische mittlere Antikörpertiter und 95%-Vertrauensintervalle wurden für den Antikörpertiter für jedes Impfstoffantigen vor und nach der Immunisierung berechnet. Mittlere logarithmische Titer und mittlere mehrfach logarithmische (log-fold) Anstiege des Antikörpertiters wurden durch Profilanalyse und Analyse der Varianz verglichen. Der Anteil der Versuchspersonen, welche in jeder Gruppe vorher festgelegte Spiegel erreichten, wurde durch logistische Regression verglichen. Vergleiche wurde durchgeführt zwischen jedem Poliovirusimpfstoff, der separat oder als eine kombinierte Injektion gegeben wurde, zwischen mIPV und vIPV (beide separat und kombiniert) und zwischen den kombinierten IPV-Impfstoffen und OPV. Es wurden keine Bereinigungen für Mehrfachvergleiche vorgenommen.
  • Eine Gesamtzahl von 425 Kindern (52% weiblich) war in der Studie registriert und erhielt die Auffrischungsimmunisierung (Tabelle 10). Das mittlere Alter bei der Registrierung betrug 17,8 Monate (Bereich 17,0 bis 20,0). Serumproben nach der Immunisierung wurden von 422 (99,3%) Teilnehmern im Mittel 29,2 Tage nach der Immunisierung (Bereich 28 bis 41 Tage) erhalten. Nachteilige Ereignisse, die als ernst kategorisiert wurden, waren bei der Studie selten.
  • Vor der Immunisierung entsprachen sich die Antikörperspiegel bei den Gruppen für die meisten Antigene. Ausnahmen waren, dass Teilnehmer, die so eingeteilt waren, dass sie APDT und mIPV als separate Injektionen erhielten, signifikant niedrigere anti-FIM-, Agglutinin-, anti-Diphtherie- und anti-Tetanus-Antikörperspiegel aufwiesen als die Gruppe, die so eingeteilt war, dass sie den konbinierten APDT-mIPV-Impfstoff erhielt. In ähnlicher Weise wies die Gruppe, welche zufällig eingeteilt war, um separate Injektionen von APDT und vIPV zu erhalten, niedrigere anti-Tetanus-Antikörperspiegel auf als die Gruppe, welche das kombinierte APDT-vIPV erhielt.
  • Nach der Immunisierung gab es einen signifikanten Antikörperanstieg bei allen Impfstoffgruppen gegen alle Antigene, die in den Impfstoffen eingeschlossen waren. Es gab wenige Unterschiede bei der Antikörperantwort auf Pertussisantigene, welche von der Polioimpfstoffgruppe abhingen. Es gab keine Unterschiede bei dem anti-PT-Antikörper in einem Enzymimmunassay oder einer CHO-Neutralisation oder bei anti-FHA-Antikörpern. Anti-69 K-Antikörper waren signifikant höher in der Gruppe, wel cher der mIPV-Impfstoff kombiniert mit APDT (77,7 Einheiten) gegeben wurde, als in der Gruppe, welcher mIPV als eine separate Injektion (37,9 Einheiten; p < 0,001) gegeben wurde, oder in der Gruppe, welcher OPV (47,7; p < 0,05) gegeben wurde. Anti-FIM-Antikörper und Agglutinine waren ebenfalls höher in der Gruppe, welcher das kombinierte APDT-mIPV gegeben wurde, als in der Gruppe, welcher separate Injektionen gegeben wurden; jedoch wurden dieselben Unterschiede ebenfalls in den Seren vor der Immunisierung nachgewiesen.
  • Es wurden Unterschiede bei den anti-Poliovirus-Antikörperantworten nachgewiesen. Sowohl APDT-mIPV als auch APDT-vIPV riefen höhere anti-Poliovirus Typ 1- und Typ 3-Antikörper hervor (P < 0,001 für alle Vergleiche). Die anti-Poliovirus Typ 2-Antikörperspiegel waren ebenfalls höher nach APDT-mIPV (10.633 reziproke Verdünnung) und APDT-vIPV (10.256) als OPV (7185); dieses erreichte jedoch nur für APDT-mIPV statistische Signifikanz (p < 0,05). Die anti-Poliovirus-Antikörpertiter, die mit kombiniertem APDT-MIPV erreicht wurden, waren ebenfalls höher als wenn das mIPV als eine separate Injektion gegeben wurde (6620-1 p < 0,05).
  • Die anti-Tetanus-Antikörpertiter waren bei Empfängern von OPV höher als bei jeder der IPV-Kombinationen (p < 0,05). Die anti-Diphtherie-Titer waren bei OPV-Empfängern ebenfalls höher, dieses erreichte aber nur eine statistische Signifikanz im Vergleich zu der APDT-vIPV-Gruppe (p < 0,05). Nach der Immunisierung wiesen alle Kinder Antikörperspiegel gegen Diphtherie und Tetanus oberhalb von 0,01 IU/ml auf, und alle außer einem Kind wiesen Spiegel oberhalb von 0,1 IU/ml auf.
  • Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass ein Komponentenpertussisimpfstoff, welcher PT, FHA, 69K und FIM kombiniert mit Diphtherie- und Tetanustoxoiden enthält, ebenfalls ohne eine signifikante Zunahme bei der Reaktogenizität oder einen Verlust von Immunogenität mit inaktiviertem Poliovirusimpfstoff kombiniert werden kann. Im Gegensatz zu den Ergebnissen mit dem Ganzzell-DTP gab es keine Verringerung der Antikörperantwort auf Bordetella pertussis-Antigene. Es gab keine substantiellen Unterschiede zwischen den IPV-Impfstoffen, die entweder mit MRC-5- oder Vero-Zelllinien hergestellt wurden; beide Impfstoffe induzierten höhere Serum-anti-Poliovirus-Antikörperspielgel als OPV. Die Demonstration der Gleichwertigkeit von mIPV und vIPV erleichtert die Implementierung des azellulären Pertussisimpfstoffes bei Jurisdiktionen mit einer Vorliebe für einen IPV, der von einer bestimmten Zelllinie abgeleitet ist.
  • Als Schlussfolgerung der Experimente, die in diesem Beispiel berichtet wurden, zeigt dieses, dass ein azellulärer Fünfkomponentenpertussisimpfstoff sicher mit jedem der zwei IPV-Impfstoffe für die vierte Impfstoffdosis in einem Alter zwischen 17 und 19 Monaten kombiniert werden kann.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER OFFENBARUNG
  • Als Zusammenfassung dieser Offenbarung liefert die vorliegende Erfindung, welche durch die angefügten Ansprüche definiert ist, neue Präparationen von Bordetella- und Nicht-Bordetella-Antigenen, um Mehrkomponentenpertussisimpfstoffe herzustellen. Solche Impfstoffe sind bei Menschen sicher, nicht reaktogen, immunogen und protektiv.
  • Figure 00880001
  • Figure 00890001
  • Figure 00900001
  • TABELLE 4 – Wirksamkeit von Azellulären Pertussisimpfstoffen
    Figure 00910001
    • A: Falldefinition: 21 Tage spasmischer Husten und Kultur positiv
    • B: Falldefinition: schwacher Pertussis-Husten von wenigstens einem Tag.
    • Anmerkung 1: Vertrauensgrenzen
    • Anmerkung 2: Ganzzellpertussisimpfstoff
  • Figure 00920001
  • Figure 00930001
  • Figure 00940001
  • Figure 00950001
  • Figure 00960001
  • REFERENZEN
    • 1. Muller, A.S. Leeuwenburg, J. und Pratt, D.S. (1986) Pertussis: epidemiology and control. Bull WHO 64: 321-331.
    • 2. Fine, P.E.M. und Clarkson, J.A. (1984). Distribution of immunity to pertussis in the population of England and Wales. J. Hyg. 92: 21-26.
    • 3. Mortimer, E.A. Jr. (1990). Pertussis and ist prevention: a family affair. J. Infect. Dis. 161: 473-479.
    • 4. Addiss, D.G., Davis, I.P., Meade, B.D., Burstyn, D.G., Meissner, M., Zastrow, J.A., Berg, J.L., Drinka, P. und Phillips, R. (1991). A pertussis outbreak in a Wisconsin nursing home. J. Infect. Dis. 164: 704-710.
    • 5. Halperin, S.A. und Marrie, T.J. (1991a). Pertussis encephalopathy in an adult: case report and review. Rev. Infect. Dis. 13: 1043-1047.
    • 6. Onorato, I.M., Wassilak, S.G. und Meade, B. (1992). Efficacy of whole-cell pertussis vaccine in preschool children in the United States. JAMA 267: 2745-2749.
    • 7. Miller, D.L., Ross, E.M., Alderslade, R., Bellman, M.H. und Brawson, N.S.B. (1981). Pertussis immunization and serious acute neurological illness in children. Brit Med. J. 282: 1595-1599.
    • 8. Tamura, M., Nogimori, K., Murai, S., Yajima, M., Ito, K., Katada, T., Ui, M. und Ishii, S. (1982). Subunit structure of islet-activating protein. pertussis toxin, in conformity with the A-B model. Biochemistry 21: 5516-5522.
    • 9. Tuomanen, E. und Weiss, A. (1985). Characterization of two adhesins of Bordetella pertussis for human ciliated respiratory epithelial cells. J. Infect. Dis. 152: 118-125.
    • 10. Friedman, R-L., Nordensson, K., Wilson, L., Akporiaye, E.T. und Yocum D.E. (1992). Uptake and intracellular survival of Bordetella pertussis in human macrophages. Infect. Immun. 60: 4578-4585
    • 11. Pittman, M (1979). Pertussis toxin: the cause of the harmful effects and prolonged immunity of whooping cough. A hypothesis. Rev. Infect. Dis., 1: 401-402
    • 12. Granstrom, M. und Granstrom G. (1993). Serological correlates in whooping cough. Vaccine 11: 445-448.
    • 13. Gearing, A.J.H., Bird, C.R., Redhead, K. und Thomas, M. (1989). Human cellular immune responses to Bordetella pertussis infection. FEMS Microbial. Immunol. 47: 205-212.
    • 14. Thomas, M.G., Redhead, K. und Lambert, H.P. (1989a). Human serum antibody responses to Bordetella pertussis infection and pertussis vaccination. J. Infect. Dis. 159: 211-218.
    • 15. Thomas, M.G., Ashworth, L.A.E., Miller, E. und Lambert, H.P. (1989b). Serum IgG, IgA, and IgM responses to pertussis toxin, filamentous haemagglutonin, and agglutinogens 2 and 3 after infection with Bordetella pertussis and immunization with whole-cell pertussis vaccine. J. Infect. Dis. 160: 838-845.
    • 16. Tomoda, T., Ogura, H. und Kurashige, T. (1991). Immune responses to Bordetella pertussis infection and vaccination. J. Infect. Dis. 163: 559-563.
    • 17. Petersen, J.W., Ibsen. P.H., Haslov, K., Capiau, C. und Heron, I. (1992a). Proliferative responses and gamma interferon and tumor necrosis factor production by lymphocytes isolated from trachcobroncheal lymph nodes and spleens of mice aerosol infected with Bordetella pertussis. Infect. Immun. 60: 4563-4570
    • 18. Englund, J.A., Reed, G.F., Edwards, K.M., Decker, D., Pichichero, M.E., Ronnels, M.B., Steinhoff, M.C., Anderson, E.L., Meade, B.D., Deloria, M.A., und die NIAID Acellular Pertussis Vaccine Group. (1992b). Effect of transplacental antibody and development of pertussis toxin (PI) and filamentous haemagglutonin (FHA) antibody after acellular (AC) and whole cell (WC) pertussis vaccines in infants. Pediat. Res. 31: 91A.
    • 19. Oda, M., Cowell, J.L., Burstyn, D.G., Thaib, S. und Manclark, C.R. (1985). Antibodies to Bordetella pertussis in human colostrum and their protective activity against aerosol infection of mice. Infect. Immun. 47: 441-445.
    • 20. Petersen, J.W., P.H. Bentzon, M.W., Capiau, C. und Heron, I. (1991). The cell mediated and humoral immune response to vaccination with acellular and whole cell pertussis vaccine in adult humans. FEMS Microbiol Lett. 76: 279-288.
    • 21. Oda, M., Cowell, J.L., Burstyn, D.G. und Manclark, C.R. (1984). Protective activities of the filamentous haemagglutonin and the lymphocytosis-promoting factor of Bordetella pertussis in mice. J. Infect. Dis. 150: 823-833.
    • 22. Sato, H., Ito, A., Chiba, J. und Sato, Y. (1984b). Monoclonal antibody against pertussis toxin: effect on toxin activity and pertussis infections. Infect. Immun. 46: 422-428.
    • 23. Sato, H. und Sato, Y. (1990). Protective activities in mice of monoclonal antibodies against pertussis toxin. Infect. Immun. 58: 3369-3374.
    • 24. Weiss, A.A. und Hewlett, E.L. (1986). Virulence factors of Bordetella pertussis. Ann. Rev. Microbiol 40: 661-668.
    • 25. Munoz, J.J. (1988). Action of pertussigen (pertussis toxin) on the host immune system. In: Pathogenesis and Immunity in Pertussis. A.C. Wardlaw und R. Parton, Herausg., John Wiley & Sons Ltd., Toronto, Seiten 211-229.
    • 26. Watkins, P.A., Burns, D.L., Kanaho, Y., Liu, T-Y., Hewlett E.L. und Moss, J. (1985). ADP-ribosylation of transducin by pertussis toxin. J. Biol. Chem. 260: 13478-13482.
    • 27. Burns, D.L., Kenimer, J.G. und Manclark, C.R. (1987). Role of the A subunit of pertussis toxin in alteration of Chinese hamster ovary cell morphology. Infect. Immun., 55: 24-28.
    • 28. Munoz, J.J., Arai, H. und Cole, R.L. (1981). Mouse-protecting and histaminesensitizing activities of pertussigen and fimbrial hemagglutinins from Bordetella pertussis. Infect. Immun. 32: 243-250.
    • 29. Relman, D.A., Domenighini, M., Tuomanen, E., Rappuoli, R. und Falkow, S. (1989). Filamentous haemagglutonin of Bordetella pertussis: nucleotide sequence and crucial role inadherence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2637-2641.
    • 30. Di Tommaso, A., Domenighini, M., Bugnoli, M., Tagliabuc, A., Rappuoli, R. und De Magistris, M.T. (1991). Identification of subregions of Bordetella pertussis filamentous haemagglutonin that stimulate human T-cell responses. Infect. Immun. 59: 3313-3315.
    • 31. Tomoda, T., Ogura, H. und Kurashige, T. (1992). The longevity of the immune response to filamentous haemagglutonin and pertussis toxin in patients with pertussis in a semiclosed community. J. Infect. Dis. 166: 908-910.
    • 32. Edwards, K.M., Meade, B.D., Decker, M.D., Reed, G.F., Rennels, M.B., Steinhoff, M.C., Anderson, E.L., Englund, J.A., Pichichero, M.E., Deloria, M.A., Deforest, A. und die NIAID Acellular Pertussis Vaccine Study Group (1992). Comparison of thirteen acellular pertussis vaccines: serological response. Pediatr. Res. 31: 91A.
    • 33. Kimura, A., Mountzoutos, K.T., Relman, D.A., Falkow, S. und Cowell, J.L. (1990a). Bordetella pertussis filamentous haemagglutonin: evaluation as a protective antigen and colonization factor in a mouse respiratory infection model. Infect. Immun. 58: 7-16.
    • 34. Shahin, R.D., Amsbaugh, D.F. und Leef, M.F. (1992). Mucosal immunization with filamentous haemagglutonin protects against Bordetella pertussis respiratory infection. Infect. Immun. 60: 1482-1488.
    • 35. Montaraz, J.A., Novotny, P. und Ivanyi, J. (1985). Identification of a 68-kilodalton protective protein antigen from Bordetella bronchiseptica. Infect. Immun. 161: 581-582.
    • 36. Leininger, E., Roberts, M., Kenimer, J.G., Charles, I.G., Fairweather, M., Novotny, P. und Brennan, M.J (1991). Pertactin, and Arg-Gly-Asp-containing Bordetella pertussis surface protein that promotes adherence of mammalian cells. Proc. Natl. Acad Sci. USA 88: 345-349.
    • 37. De Magistris, T., Romano, M., Nuti, S., Rappuoli, R. und Tagliabue, A. (1988). Dissecting human T responses against Bordetella species J. Exp. Med. 168: 1351-1362.
    • 38. Seddon, P.C., Novotny, P., Hall, C.A. und Smith, C.S. (1990). Systemic and mucosal antibody response to Bordetella perussis antigens in children with whooping cough. Serodiagnosis immunother. Inf. Dis. 3: 337-343.
    • 39. Podda, A., Nencioni, L., Marsili, I., Peppoloni, S., Volpini, G., Donati, D., Di Tommaso, A., De Magistris, M.T. und Rappuoli, R. (1991). Phase I clinical trial of an acellular pertussis vaccine composed of genetically detoxified pertussis toxin combined with FHA and 69 kDa. Vaccine 9: 741-745.
    • 40. Roberts, M., Tite, J.P., Fairweather, N.F., Dougan, G. und Charles, I.G. (1992). Recombinant P.69/pertactin: immunogenicity and protection of mice against Bordetella pertussis infection. Vaccine 10: 43-48.
    • 41. Novotny, P., Chubb, A.P., Cownley, K. und Charles, I.G. (1991). Biological and protective properties of the 69kDa outer membrane protein of Bordetella pertussis: a novel formulation for an acellular vaccine. J. Infect. Dis. 164: 114-122.
    • 42. Shahin, R. D., Brennan, M.J., Li, Z.M., Meade, B.D. und Manclark, C.R. (1990b). Characterization of the protective capacity and immunogenicity of the 69kD outer membrane protein of Bordetella pertussis. J. Exp. Med. 171: 63-73.
    • 43. Robinson, A., Irons, L.I. und Ashworth, L.A.E. (1985a). Pertussis vaccine: present status and future prospects. Vaccine 3: 11-22.
    • 44. Robinson, A., Ashworth, L.A.E., Baskerville, A. und Irons, L.I. (1985b). Protection against intranasal infection of mice with Bordetella pertussis. Develop. Biol. Stand. 61: 165-172
    • 45. Robinson, A., Gorrige, A.R., Funnell, S.G.P. und Fernandez, M. (1989b). Serospecific protection of mice against in infection with Bordetella pertussis. Vaccine 7: 321-324.
    • 46. Sato, Y., Kimura, M. und Fukumi, H. (1984a). Development of a pertussis component vaccine in Japan. Lancet i: 122-126.
    • 47. Kimura, M. (1991). Japanese clinical experiences with acellular pertussis vaccines. Develop. Biol. Standard. 73: 5-9.
    • 48. Ad Hoc Group for the Study of Pertussis Vaccines (1988). Placebo-controlled trial of two acellular vaccines in Sweden-protective eficacy and adverse effects. Lancet i: 955-960.
    • 49. Olin, P., Storsaeter, J. und Romanus, V. (1989). The efficacy of acellular pertussis vaccine. JAMA 261: 560.
    • 50. Storsaeter, J., Hallander, H., Farrington, C.P., Olin, P., Moliby, R. und Miller, E. (1990). Secondary analyses of the efficacy of two acellular pertussis vaccines evaluated in a Swedish phase III trial. Vaccine 8: 457-462.
    • 51. Storsaeter, J. und Olin, P. (1992). Relative efficacy of two acellular pertussis vaccines during three years of passive surveillance. Vaccine: 10: 142-144.
    • 52. Tan, L.U.T., Fahim R.E.F., Jackson, G., Phillips, K., Wah, P., Alkema, D., Zobrist, G., Herbert, A., Boux, L., Chong, P., Harjee, N., Klein, M. und Vose, J. (1991). A novel process for preparing an acellular pertussis vaccine composed of non-pyrogenic toxoids of pertussis toxin and filamentous haemagglutonin. Molec. Immunol. 28: 251-255.
    • 53. Sekura, R.D., Zhang, Y., Roberson, R., Acton, B., Trollfors, B., Tolson, N., Siloach, J., Bryla, D., Muir-Nash, J., Koeller, D., Schneerson, R. und Robbins, J.B. (1988). Clinical, metabolic, and antibody responses of adult volunteers to an investigation vaccine composed of pertussis toxin inactivated by hydrogen peroxide. J. Pediatr. 113: 807-813.
    • 54. Winberry, L., Walker, R., Cohen, N., Todd, C., Sentissi, A. und Siber, G. (1988). Evaluation of a new method for inactivating pertussis toxin with tetranitromethane. International Workshop on Bordetella pertussis, Rocky Mountain Laboratories, Hamilton, Montana.
    • 55. Sekura, R.D. et al. (1993), J. Biol. Chem. 258: 14647-14651.
    • 56. Irons, L.I. et al. (1979), Biochem. Biophys. Acta 580: 175-185.
    • 57. Munoz, J.J. et al. (1981). Infect. Immun. 33: 820-826.
    • 58. Cowell, J.L. et al. (1980), Seminar on Infectious Diseases 4: 371-379.
    • 59. Selmer, J.C. (1984) Acta Path. Microbial. Immunol. Scand. Sect. C, 92: 279-284.
    • 60. Lockhoff, O. (1991) Glycolipids as Immunomodulators: Synthesis and Properties, Chem. Int. Ed. Engl. 30: 1611-1620.
    • 61. Nixon-George, A., Moran, T., Dionne, G., Penney, C.L., Lafleur, D., Bona, C.A. (1990) The adjuvant effect of stearyl tyrosine on a recombinant subunit hepatitis B surface antigen. J. Immunol. 144: 4798-4802.
    • 62. Siber, G.R., Thakrar, N., Yancey, B.A., Herzog. L., Todd, C., Cohen, N., Sekura, R.D., Lowe, C.U. (1991). Safety and immunogenicity of hydrogen peroxide-inactivated pertussis toxoid in 18-month-old children. Vaccine 9: 735-740.
    • 63. Siber, G., Winberry, L., Todd, C., Samore, M., Sentissi, A. und Cohen, N. (1988). Safety and immunogenicity in adults of pertussis toxoid inactivated with tetronitromethane. In: International Workshop on Bordetella pertussis, Rocky Mountain Laboratories, Hamilton, Montana.
    • 64. Edwards, K.M., Bradley, R.B., Decker, M.D., Palmer, P.S., Van Savage, J., Taylor, J.C., Dupont, W.D., Hager, C.C. und Wright, P.F. (1989). Evaluation of a new highly purified pertussis vaccine in infants and children. J. Infect. Dis. 160: 832-837.
    • 65. Rutter, D.A., Ashworth, L.A.E., Day, A., Funnell, S., Lovell, F. und Robinson, A. (1988). Trial of new acellular pertussis vaccine in healthy adult volunteers. Vaccine 6: 29-32.
    • 66. Blumberg, D.A., Mink, C.A.M, Cherry, J.D., Johnson, C., Garber, R., Plotkin, S.A., Watson, B., Ballanco, G.A., Daum R.S., Sullivan B., Townsend, T.R., Brayton, J., Gooch, W.M., Nelson, D.B., Congeni, B.L., Prober, C.G., Hackell, J.G., Dekker, C.L., Christenson, P.D. und die APDT Vaccine Study Group (1991). Comparison of acellular and whole cell pertussis-component diphtheria-tetanus-pertussis vaccines in infants. J. Pediatr. 119: 194-204.
    • 67. Englund, J.A., Glezen, W.P. und Barreto, L. (1992a). Controlled study of a new five-component acellular pertussis vaccine in adults in young children. J. Inf. Dis. 166: 1436-1441.
    • 68. Zealey, G., Loosmore, S., Yacoob, R., Klein, M., Vaccine Research, Bd. 1, Seiten 413-427.
    • 69. Baker JD, Halperin SA, Edwards K, Miller B, Decker M, Stephens D. Antibody response to Bordetella pertussis antigens after immunization with American and Canadian whole cell vaccines. J. Pediatr. 1992, 121: 523-527.
    • 70. Halperin SA, Eastwood BJ, Langley JM. Immune responses to pertussis vaccines concurrently administered with viral vaccines. Ann NY Acad Sci. 1995, 754: 89-96.
    • 71. Halperin SA, Langley JM, Eastwood BJ. Effect of inactivated poliovirus vaccine on the antibody response to Bordetella pertussis antigens when combined with diphtheria-pertussis-tetanus vaccine. Clin. Infect. Dis. 1996; im Druck
    • 72. Ferreccio C., Clemens J., Avendano A. et al. The clinical and immunogenic response of Chilean infants to Haemophilus influenzae type b polysaccharide tetanus protein conjugate vaccine coadministered in the same syringe with diptheria-tetanus toxoide-pertussis vaccine at two, four and six months of age. Pediatr. Infect. Dis. J. 1991; 10: 761-771.
    • 73. Clemens J., Ferreccio C., Levine M. et al. Impact of Haemophilus influenzae typ b polysaccharide-tetanus protein conjugate vaccine on responses to concurrently administered diphetheria-tetanus pertussis vaccine. JAMA 1992; 267: 673-8.
    • 74. Scheifele D., Barreto L., Meekison W. et al. Can Haemophilus influenaze vaccine be combined with diptheria and tetanus toxoids. Can Med Assoc. J. 1993; 149: 1105-16.
    • 75. Gold R., Scheifele D., Barreto L. et al. Safety and immunogeniciy of Haemophilus influnzae vaccine (tetanus toxoid conjugate) administered concurrently or combined with diptheria and tetanus toxoids, pertussis vaccine and inactivated poliomyelitis vaccine to healty infants at two, four and six months of age. Pediatr. Infect. Dis J. 1994; 13: 348-55.
    • 76. Shinefield H., Black S., Ray P., Lewis E., Fireman B., Hohenboken, Hackell JG. Safety of combined acellular pertussis vaccine in infants [Abstract Nr. G72]. In: program and Abstracts of the 35th Interscience Conference on Antimicrobiols and Chemotherapy. Washington, DC; American Society of Microbiology 1995: 171.
    • 77. Greenberg DP, Wong VK, Partridge S, Howe BJ, Fing J, Ward JL. Evaluation of a new combination vaccine that incorporates diptheria-tetanus-acellular pertussis, hepatitis b, and Haemophilus influenzae type b conjugate vaccines [Abstract Nr. G70] In program and Abstracts of the 35th Interscience Conference on Antimicrobiols and Chemotherapy. Washington, DC; American Society of Microbiology 1995: 170.
    • 78. Wassilak SGF, Orenstein WA, Tetanus, In Plotkin SA, Mortimer EA, Jr., Herausg, Vaccines, WB Saunders Company, Philadelphia, 1988; 45-73.
    • 79. Gustaffson et al., New England J. Medicine, 1996, Bd. 334, Seiten 349-355.
    • 80. Mortimer EA Jr., Diphtheria Toxoid, In Plotkin SA, Mortimer EA, Jr., Herausg., Vaccines, WB Saunders Company, Philadelphia, 1988; 31-44.
    • 81. Varughese P: Haemophilus Influenzae infection in Canada, 1969-1985. Can Dis Wkly Rep 1986; 12: 37-43.
    • 82. Schelfele D, Gold R, Law B, et al.: Decline in Haemophilus Influenzae type b invasive infections at five Canadian pediatric centres. Can Commun Dis Rep 1993; 19: 88-91
    • 83. Scheifele D., Barreto L., Meekison W. et al.: Can Haemophilus influenzae type b-tetanus toxoid conjugate vaccine be combined with diphtheria toxoid-pertussis vaccine-tetanus toxoid? Can Med Assoc J 1993,149: 1105-1112
    • 84. Gold R, Scheifele D, Barreto L et al.: Safety and Immunogenicity of Haemophilus Influenzae type b vaccine (tetanus toxoid conjugate) administered concurrently or combined with diphtheria and tetanus toxoids, pertussis vaccine and inactivated poliomyelitis vaccines to healthy infants at two, four and six months of age. Pediatric Infectious Diseases Journal 1994; 13: 348-55
    • 85. Scheifele D, Gold R et al. Canada Communicable Disease Report 22-3, F1-F3 Feb 1, 1996.

Claims (19)

  1. Eine multivalente immunogene Zusammensetzung zum Verleihen von Schutz in einem Wirt gegenüber einer Krankheit, welche durch eine Infektion mit Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae und Poliovirus verursacht wird, wobei die Zusammensetzung umfasst: (a) Pertussistoxoid, filamentöses Hämagglutinin, Pertaktin und Agglutinogene in gereinigter Form, (b) Tetanustoxoid, (c) Diphtherietoxoid und (d) inaktiviertes Poliovirus, welche als ein Impfstoff zur in vivo-Verabreichung an einen Wirt formuliert ist und wobei für jede Einzelhumandosis das Pertussistoxoid in einer Menge von 5 bis 30 μg an Stickstoff vorliegt, das filamentöse Hämagglutinin in einer Menge von 5 bis 30 μg an Stickstoff vorliegt, das Pertaktin in einer Menge von 3 bis 15 μg an Stickstoff vorliegt und die Agglutinogene in einer Menge von 1 bis 10 μg an Stickstoff vorliegen.
  2. Eine Zusammensetzung wie in Anspruch 1 beansprucht, welche ein Hilfsmittel einschließt.
  3. Eine Zusammensetzung wie in Anspruch 2 beansprucht, wobei das Hilfsmittel Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat ist.
  4. Eine Zusammensetzung wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht und welche 20 μg Stickstoff von Pertussistoxoid, 20 μg Stickstoff von filamentösem Hämagglutinin, 5 μg Stickstoff von Pertaktin und 3 μg Stickstoff von Agglutinogenen in einer Einzelhumandosis enthält.
  5. Eine Zusammensetzung wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Diphtherietoxoid in einer Menge von 10 bis 20 Lfs vorliegt und das Tetanustoxoid in einer Menge von 1 bis 10 Lfs vorliegt.
  6. Eine Zusammensetzung wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 beansprucht, wobei das Diphtherietoxoid in einer Menge von 15 Lfs vorliegt und das Tetanustoxoid in einer Menge von 5 Lfs vorliegt.
  7. Eine Zusammensetzung wie in irgendeinem vorhergehenden Anspruch beansprucht, wobei das inaktivierte Poliovirus eine Mischung der inaktivierten Poliovirustypen 1, 2 und 3 umfasst.
  8. Eine Zusammensetzung wie in Anspruch 7 beansprucht, wobei die Mischung der inaktivierten Poliovirustypen 1, 2 und 3 in den folgenden Anteilen in einer Einzelhumandosis vorliegt: 20 bis 50 D Antigeneinheiten von Poliovirustyp 1 5 bis 10 D Antigeneinheiten von Poliovirustyp 2 20 bis 50 D Antigeneinheiten von Poliovirustyp 3.
  9. Eine Zusammensetzung wie in Anspruch 8 beansprucht, wobei die Mischung der inaktivierten Poliovirustypen 1, 2 und 3 in den folgenden Anteilen in einer Einzelhumandosis verwendet wird: 40 D Antigeneinheiten von Poliovirustyp 1 8 D Antigeneinheiten von Poliovirustyp 2 32 D Antigeneinheiten von Poliovirustyp 3.
  10. Eine Zusammensetzung wie in irgendeinem vorhergehenden Anspruch beansprucht, welche weiterhin bei der Verwendung einen Schutz gegenüber einer Krankheit verleiht, welche durch eine Infektion mit Haemophilus influenzae verursacht wird, wobei die Zusammensetzung ein Konjugat von einem Trä germolekül, das ausgewählt ist aus Tetanustoxoid und Diphtherietoxoid, und einem Kapselpolysaccharid von Haemophilus influenzae Typ b einschließt.
  11. Eine Zusammensetzung wie in Anspruch 10 beansprucht, wobei das Konjugat ein Konjugat von Tetanustoxoid oder Diphtherietoxoid und Polyriboseribitolphosphat (PRP) von Haemophilus influenzae Typ b umfasst.
  12. Eine Zusammensetzung wie in Anspruch 10 oder Anspruch 11 beansprucht, wobei das Konjugat in einer lyophilisierten Form bereitgestellt wird und zur Verabreichung in der immunogenen Zusammensetzung durch die Komponenten der Zusammensetzung rekonstituiert wird.
  13. Eine Zusammensetzung wie in irgendeinem der Ansprüche 10 bis 12 beansprucht, wobei die immunogene Zusammensetzung das Konjugat in einer Menge von 5 bis 15 μg PRP, konjugiert mit 15 bis 35 μg Tetanustoxoid, in einer Einzelhumandosis enthält.
  14. Eine Zusammensetzung wie in Anspruch 13 beansprucht, wobei die immunogene Zusammensetzung das Konjugat in einer Menge von 10 μg PRP, konjugiert mit 20 μg Tetanustoxoid, in einer Einzelhumandosis enthält.
  15. Eine multivalente Impfstoffzusammensetzung wie in Anspruch 1 beansprucht und umfassend, pro 0,5 ml-Dosis, das Folgende: 20 μg Pertussistoxoid 20 μg filamentöses Hämagglutinin 5 μg Fimbrae 2 und 3 3 μg Pertaktinmembranprotein 15 Lf Diphtherietoxoid 5 Lf Tetanustoxoid Poliovirus Typ 1 40 D Antigeneinheiten Poliovirus Typ 2 8 D Antigeneinheiten 1,5 μg Aluminiumphosphat.
  16. Eine Zusammensetzung wie in Anspruch 15 beansprucht und enthaltend, pro 0,5 ml-Dosis, das Folgende: 10 μg gereinigtes Polyriboseribitolphosphat-Kapselpolysaccharid (PRP) von Haemophilus influenzae Typ b, kovalent gebunden an 20 μg Tetanustoxoid.
  17. Eine Zusammensetzung wie in Anspruch 15 oder 16 beansprucht und enthaltend, pro 0,5 ml-Dosis, das Folgende: 0,6% 2-Phenoxyethanol.
  18. Eine Zusammensetzung nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch zur Verwendung als ein Medikament.
  19. Eine Zusammensetzung wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 17 beansprucht zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments zum Immunisieren eines Wirtes gegenüber einer Krankheit.
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Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4707097A (en) * 1997-09-15 1999-04-05 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Multivalent vaccines
EP1004314A1 (de) * 1998-11-26 2000-05-31 Pasteur Merieux MSD T.d.Polio Impstoff für einer primovakzinierter oder empfindlicher Population
GB0108364D0 (en) * 2001-04-03 2001-05-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine composition
KR100401423B1 (ko) * 2001-01-10 2003-10-17 주식회사 엘지생명과학 혼합 백신의 제조 방법
DK1556477T3 (en) * 2002-11-01 2017-10-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Process for drying
RU2240819C2 (ru) * 2003-01-04 2004-11-27 Государственное учреждение Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера СО РАМН Способ вакцинопрофилактики коклюша, дифтерии и столбняка на крайнем севере
RU2228200C1 (ru) * 2003-01-20 2004-05-10 Красноярская государственная медицинская академия Способ профилактики акдс-вакциной на крайнем севере
GB0313916D0 (en) 2003-06-16 2003-07-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine composition
EP1489092A1 (de) * 2003-06-18 2004-12-22 Institut Pasteur Modifizierte Bordetella Adenylatcyclase mit oder ohne CD11b/CD18 Interaktionsdomäne und seine Verwendungen
US7901921B2 (en) * 2004-10-22 2011-03-08 Oncolytics Biotech Inc. Viral purification methods
GB0616306D0 (en) * 2006-08-16 2006-09-27 Novartis Ag Vaccines
EP2491947A3 (de) * 2006-09-07 2012-10-17 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Impfstoff
GB0617602D0 (en) * 2006-09-07 2006-10-18 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
ZA200902155B (en) * 2006-09-29 2010-06-30 Japan Poliomyelitis Res Inst IPV-DPT vaccine
WO2009016651A1 (en) * 2007-07-31 2009-02-05 Panacea Biotec Limited Simplified means for obtaining prn from bordetella pertussis
CN102112153B (zh) 2008-06-04 2014-04-16 一般财团法人化学及血清疗法研究所 灭活日本脑炎病毒颗粒作为佐剂的用途
PE20100365A1 (es) 2008-10-24 2010-05-21 Panacea Biotec Ltd Novedosas vacunas de combinacion con tos ferina de celulas enteras y metodo para su elaboracion
PE20100366A1 (es) 2008-10-24 2010-05-21 Panacea Biotec Ltd Novedosas composiciones de vacuna con tos ferina acelular asi como el metodo para su elaboracion
US20100330158A1 (en) * 2009-03-31 2010-12-30 Innopharma, Llc Protein-assisted drug delivery system for the targeted administration of active agents
CN103442730B (zh) 2011-01-05 2016-08-17 巴拉特生物技术国际有限公司 组合七价疫苗
WO2012104821A1 (en) * 2011-02-04 2012-08-09 Pfizer Inc. Immunogenic bordetella bronchiseptica compositions
GB201106225D0 (en) * 2011-04-13 2011-05-25 Glaxosmithkline Biolog Sa Fermentation process
CN102861330B (zh) * 2012-06-29 2014-10-29 成都欧林生物科技股份有限公司 一种Hib多糖与精制破伤风类毒素偶联工艺
JP6440619B2 (ja) * 2012-10-12 2018-12-19 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 混合ワクチン用の架橋されていない無細胞百日咳抗原
CN103007264A (zh) * 2012-12-14 2013-04-03 北京民海生物科技有限公司 b型流感嗜血杆菌结合疫苗及其应用
JP2016501550A (ja) 2012-12-27 2016-01-21 グリコヴァキシン アーゲー Ｃｒｍ１９７に関する方法及び組成物
EP2863943B1 (de) * 2013-03-08 2016-07-13 Crucell Holland B.V. Nicht zellulärer pertussis-impfstoff
US9849066B2 (en) 2013-04-24 2017-12-26 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
AR101256A1 (es) 2014-07-21 2016-12-07 Sanofi Pasteur Composición vacunal que comprende ipv y ciclodextrinas
JP6755243B2 (ja) * 2014-10-07 2020-09-16 セラム インスティチュート オブ インディア プライベイト リミテッド エンテロウイルス不活化およびアジュバント吸着のための改良された方法、ならびに、それから得られる投与量減量ワクチン組成物
RU2596919C2 (ru) * 2015-01-16 2016-09-10 Федеральное государственное унитарное предприятие "Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам "Микроген" Министерства здравоохранения Российской Федерации Комбинированная вакцина для профилактики коклюша, дифтерии, столбняка
RU2626532C2 (ru) * 2015-01-16 2017-07-28 Федеральное государственное унитарное предприятие "Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам "Микроген" Министерства здравоохранения Российской Федерации Комбинированная вакцина для профилактики коклюша, дифтерии, столбняка, гепатита в и инфекции, вызываемой haemophilus influenzae тип в
CN104707134A (zh) * 2015-03-27 2015-06-17 成都欧林生物科技股份有限公司 一种无细胞百日破联合疫苗及其制备方法
CN108570098B (zh) * 2017-12-29 2021-09-07 武汉生物制品研究所有限责任公司 一种百日咳多种抗原成分的分离纯化方法
WO2020165920A1 (en) * 2019-02-12 2020-08-20 Biological E Limited Multivalent vaccine composition
CA3141460A1 (en) 2019-05-20 2020-11-26 Soligenix, Inc. Compositions and methods of manufacturing trivalent filovirus vaccines
CN111000994A (zh) * 2019-12-26 2020-04-14 北京科兴中维生物技术有限公司 一种液体疫苗组合物及其制备方法与应用
CN111053898B (zh) * 2019-12-26 2023-05-16 北京科兴中维生物技术有限公司 一种疫苗组合物及其应用
WO2021176409A1 (en) 2020-03-05 2021-09-10 Sanofi Healthcare India Private Limited Preservative combination for vaccine composition

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3097140A (en) 1958-10-31 1963-07-09 Merck & Co Inc Preparing a mixed polio, pertussis, tetanus, and diphtheria vaccine with benzethonium chloride
US4258029A (en) 1979-04-23 1981-03-24 Connaught Laboratories Limited Synthetic adjuvants for stimulation of antigenic responses
DE3521994A1 (de) 1985-06-20 1987-01-02 Bayer Ag N-(2-aminoacylamido-2-desoxy-hexosyl)-amide-, -carbamate und -harnstoffe, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung in arzneimitteln
US4705686A (en) 1986-05-09 1987-11-10 American Cyanamid Process for the preparation of acellular Bordetalla pertussis vaccine
GB8727489D0 (en) 1987-11-24 1987-12-23 Connaught Lab Detoxification of pertussis toxin
GB8807860D0 (en) 1988-04-05 1988-05-05 Connaught Lab Pertussis vaccine
US5101014A (en) 1989-02-10 1992-03-31 United States Of America Process for the purification of a 69,000 da outer membrane protein of Bordetella pertussis
US5276142A (en) 1989-12-11 1994-01-04 American Cyanamid Company Process for purification of a 69000 dalton antigenic protein from Bordetella pertussis
GB9007657D0 (en) 1990-04-04 1990-05-30 Connaught Lab Purification of a pertussis outer membrane protein(omp69)
EP0484621A3 (en) * 1990-07-11 1992-08-26 American Cyanamid Company Efficacious vaccines against bordetella pertussis comprising a combination of individually purified pertussis antigens
IL101692A0 (en) * 1991-05-03 1992-12-30 Amgen Inc Recombinant b oligomer of pertussis toxin
JP3626996B2 (ja) 1992-05-23 2005-03-09 グラクソスミスクライン・バイオロジカルス・ソシエテ・アノニム Ｂ型肝炎表面抗原および他の抗原からなる複合ワクチン
SG47725A1 (en) * 1992-10-27 1998-04-17 American Cyanamid Co Combination pediatric vaccine with enhanced immunogenicity of each vaccine component
CA2433502A1 (en) * 1995-05-04 1996-11-07 Aventis Pasteur Limited Acellular pertussis vaccines and methods of preparation thereof
DE69615362T3 (de) * 1995-06-07 2006-07-20 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Impfstoff mit einem polysaccharidantigen-trägerprotein-konjugat und einem trägerprotein
IL122588A (en) * 1995-06-23 2001-12-23 Smithkline Beecham Biolog A combination vaccine containing a polysaccharide conjugated antigen attached to a phosphate aluminum and one or more additional antibodies

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