PL187935B1 - Multiwalentna kompozycja immunogenna i jej zastosowanie - Google Patents

Abstract

1. Multiwalentna immunogenna kompozycja do nadawania ochrony gospodarzowi wo- bec choroby powodowanej przez infekcje Bordelella pertussis, Clostridium tetani, Corynebac- terium diphtheriae, wirusa polio, znamienna tym, ze zawiera: (a) toksoid krztuscowy, hemaglutynine filamentowa, pertaktyne i aglutynogeny w oczyszczo- nej postaci, (b) toksoid tezcowy, (c) toksoid bloniczy, i (d) inaktywowanego wirusa polio, ma postac szczepionki do podawania in vivo gospodarzowi, przy czym poszczególnym skladni- kom kompozycji nadaje sie postac w taki sposób, ze immunogennosc poszczególnych skladni- ków tej kompozycji pozostaje stala. 4. Kompozycja immunogenna wedlug zastrz. 1, albo 2, albo 3, znamienna tym, ze za- wiera toksoid krztuscowy w ilosci odpowiadajacej od okolo 5 do okolo 30 µg azotu, hemagluty- nine filamentowa w ilosci odpowiadajacej od okolo 5 do okolo 30 µg azotu, pertaktyne w ilosci odpowiadajacej od okolo 3 do okolo 15 µ g azotu i agiutynogeny w iiosci odpowiadajacej od okolo 1 do okolo 10 µg azotu, w pojedynczej dawce dla czlowieka. 9. Kompozycja immunogenna wedlug zastrz. 8, znamienna tym, ze zawiera mieszanine inaktywowanych wirusów polio typu 1, 2 i 3 w nastepujacych proporcjach: - 20 do 50 jednostek antygenu D wirusa polio typu 1 - 5 do 10 jednostek antygenu D wirusa polio typu 2 - 20 do 50 jednostek antygenu D wirusa polio typu 3, w pojedynczej dawce dla czlowieka. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest multiwalentna immunogenna kompozycja do nadawania ochrony gospodarzowi wobec choroby powodowanej przez infekcję Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacierium diphtheriae, wirusa poiio, charakteryzująca się tym, że zawiera:

(a) toksoid krztuścowy, hemaglutyninę filamentową, pertaktynę i aglutynogeny w oczyszczonej postaci, (b) toksoid tężcowy, (c) toksoid błoniczy, i

187 935 (d) ^aktywowanego wirusa polio, ma postać szczepionki do podawania in vivo gospodarzowi, przy czym poszczególnym składnikom kompozycji nadaje się postać w taki sposób, że immuorgeooość poszczególnych składników tej kompozycji pozostaje stała.

Korzystnie zawiera ponadto adiuwant.

Korzystniej jako adiuwant zawiera wodorotlenek glinowy lub fosforan glinowy. Korzystnie zawiera toksoid krztuścowy w ilości odpowiadającej od około 5 do około 30 pg azotu, hemaglutyninę filameotrwą w ilości odpowiadającej od około 5 do około 30 pg azotu, pertaktynę w ilości odpowiadającej od około 3 do około 15 pg azotu i aglutynogeny w ilości odpowiadającej od około 1 do około 10 pg azotu, w pojedynczej dawce dla człowieka.

Korzystniej zawiera 20 pg azotu toksoidu krztuścowego, 20 pg azotu hemaglutyniny filamentowej, 5 pg azotu pertaktyny i 3 pg azotu aglutynogenów, w pojedynczej dawce dla człowieka.

Korzystnie zawiera toksoid błoniczy w ilości od 10 do 20 Lf, a toksoid tężcowy w ilości od 1 do 10 Lf.

Korzystniej zawiera toksoid błoniczy w ilości 15 Lf a toksoid tężcowy w ilości 5 Lf.

Korzystnie inaktywowany wirus polio obejmuje mieszaninę inaktywowanych wirusów polio typu 1, 2 i 3.

Korzystniej zawiera mieszaninę inaktywowanych wirusów polio typu 1, 2 i 3 w następujących proporcjach:

do 50 jednostek antygenu D wirusa polio typu 1 5 do 10 jednostek antygenu D wirusa polio typu 2 do 50 jednostek antygenu D wirusa polio typu 3, w pojedynczej dawce dla człowieka.

Korzystniej zawiera mieszaninę inaktywowanych wirusów polio typu 1, 2 i 3 w następujących proporcjach:

jednostek antygenu D wirusa polio typu 1 8 jednostek antygenu D wirusa polio typu 2 jednostki antygenu D wirusa polio typu 3, w pojedynczej dawce dla człowieka.

Korzystnie kopozycja nadaje ponadto ochronę wobec choroby powodowanej przez infekcje Haemophilus influenzae i zawiera ponadto koniugat cząsteczki nośnikowej wybrany z grupy składającej się z toksoidu tężcowego i toksoidu błoniczego i polisacharydu otoczkowego Haemophilus influenzae typu b.

Korzystniej jako koniugat zawiera koniugat toksoidu tężcowego lub toksoidu błoniczego i fosforan polirybozorybitolu (PRP) Haemophilus influenzae typu b.

Korzystniej koniugat dostarcza się w postaci zlirfilizrwaoej i do podawania w kompozycji immunogennej rekonstytuuje się składnikami kompozycji.

Najkorzystniej zawiera koniugat w ilości 5 do 15 pg PRP skroiugrwaoego z około 15 do około 35 pg toksoidu tężcowego, w pojedynczej dawce dla człowieka.

Korzystniej zawiera koniugat w ilości 10 pg PRP skoniugowanego z około 20 pg toksoidu tężcowego, w pojedynczej dawce dla człowieka.

Przedmiotem wynalazku jest również multiwalentna kompozycja szczepionki, charakteryzująca się tym, że zawiera na dawkę o objętości 0,5 ml pg toksoidu krztuścowego 20 pg hemaglutyniny filamentowej pg fimbrii 2 i 3 jig białka błonowego pertaktyny 15 Lf toksoidu błoniczego 5 Lf toksoidu tężcowego 40 jednostek antygenu D wirusa polio typu 1 8 jednostek antygenu D wirusa polio typu 2

1,5 pg fosforanu glinowego.

Korzystnie zawiera ponadto na dawkę o objętości 0,5 ml pg oczyszczonego polisacharydu otoczkowego fosforanu prliaybozorybitolu (PRP) Haemophilus influenzae typu b kowalencyjnie związanego z 20 pg toksoidu tężcowego.

Korzystnie zawiera ponadto na dawkę o objętości 0,5 ml 0,6% 2-fenrksyetaorl.

187 935

Przedmiot wynalazku stanowi również multiwalentna immunogenna kompozycja do nadawania ochrony gospodarzowi wobec choroby powodowanej przez infekcje Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae i Haemophilus influenzae, charakteryzująca się tym, że zawiera:

(a) toksoid krztuścowy, hemaglutyninę filamentową, pertaktynę i aglutynogeny w oczyszczonej postaci, (b) toksoid tężcowy, (c) toksoid błoniczy, i (d) koniugat cząsteczki nośnikowej i polisacharydu otoczkowego Haemophilus influenzae typu b, ma postać szczepionki do podawania in vivo gospodarzowi, przy czym poszczególnym składnikom kompozycji nadaje się postać w taki sposób, że immunogenność poszczególnych składników tej kompozycji pozostaje stała.

Korzystnie zawiera cząsteczkę nośnikową wybraną spośród toksoidu tężcowego i toksoidu błoniczego.

Wynalazek dotyczy również zastosowania powyższych kompozycji do wytwarzania leku do immunizowania gospodarza przeciwko chorobie.

Zalety wynalazku obejmują multiwalentną szczepionkę, która może zapewnić ochronę przed szeregiem powszechnych chorób pediatrycznych w sposób bezpieczny i skuteczny. Korzystna jest zdolność do podania jednego szczepienia przeciwko wielu chorobom bez interferencji pomiędzy reakcjami odpornościowymi.

Krótki opis rysunków.

Wynalazek będzie lepiej zrozumiały na podstawie poniższego szczegółowego opisu i przykładów, w odniesieniu do dołączonych rysunków, w których:

Figura 1 jest schematem procedury izolowania preparatu aglutynogenu ze szczepu Bordetella.

Szczegółowy opis wynalazku.

Preparat aglutynogenu.

W odniesieniu do Figury 1, przedstawiono schemat sposobu wytwarzania preparatu aglutynogenu ze szczepu Bordetella. Jak widać na figurze 1, pastę komórek Bordetella zawierająca aglutynogeny, taką jak pastę komórek B. pertussis ekstrahuje się, przykładowo, buforem zawierającym mocznik, takim jak 10 mM fosforan potasu, 150 mM NaCl i 4 M mocznik, w celu wybiórczego ekstrahowania aglutynogenów z pasty komórkowej z wytworzeniem pierwszego nadsączu (supematantu) (sp1) zawierającego aglutynogeny i pierwszy resztkowy precypitat (ppt1). Pierwszy nadsącz (sp1) oddziela się do pierwszego resztkowego precypitatu (ppt1) np. przez wirowanie. Resztkowy precypitat (pptl) usuwa się. Sklarowany nadsącz (sp1) można następnie zatężać i diafiltrować wobec, przykładowo, 10 mM fosforanu potasu/l 50 mM NaCl/0,1% Triton Χ-100 przy użyciu, przykładowo, filtra membranowego o NMWL 100-300 kDa.

Następnie, pierwszy nadsącz inkubuje się w odpowiedniej temperaturze i przez odpowiedni czas w celu wytworzenia sklarowanego nadsączu (sp2) zawierającego aglutynogeny i drugi precypitat do usunięcia (ppt2) zawierający zanieczyszczenia nie będące aglutynogenem. Odpowiednie temperatury obejmują około 50°C do około 100°C, w tym od około 75°C do około 85°C, zaś odpowiedni czas inkubacji obejmuje od około 1 do około 60 minut. Następnie sklarowany nadsącz zatęża się przez, przykładowo, dodanie poliglikolu etylenowego o ciężarze cząsteczkowym około 8000 (PEG 8000) w stężeniu końcowym równym około 4,5 ± 0,2% i delikatnie miesza się przez minimum około 30 minut tworząc trzeci precypitat (ppt3), który można zebrać przez wirowanie. Pozostały nadsącz sp3 usuwa się.

Trzeci precypitat (ppt3) ekstrahuje się przy użyciu, przykładowo, bufora obejmującego 10 mM fosforan potasu/150 mM NaCl w celu otrzymania surowego roztworu zawierającego aglutynogen fimbrii. 1 M fosforan potasu można dodać do surowego roztworu fimbrii otrzymując roztwór 100 mM fosforanu potasu. Alternatywnie, sklarowany nadsącz aglutynogenów fimbrii traktowanych ciepłem można oczyścić bez precypitowania przez chromatograficzną filtrację żelową przy użyciu żelu takiego jak Sepharose CL6B. Aglutynogeny fimbrii w surowym roztworze oczyszcza się następnie przez chromatografię kolumnową, taką jak np. przepuszczenie przez kolumnę krzemionki PEI, w celu otrzymania preparatu aglutynogenu fimbrii w eluacie.

187 935

Eluat zawierający aglutynogen fimbrii można dalej zatężać i diafiltrować wobec, przykładowo, bufora zawierającego 10 mM fosforanu potasiTl 50 mM NaCl/0,1% Triton X-100 przy użyciu, przykładowo, filtra membranowego o NMWL 100-300 kDa. Preparat aglutynogenu można sterylizować przez filtrowanie przez filtr membranowy < 0,22 (pm, otrzymując końcowy oczyszczony preparat aglutynogenu fimbrii zawierający aglutynogen fimbrii 2 i 3, zasadniczo wolny od aglutynogenu 1. Stosunek wagowy Agg 2 do Agg 3 może wynosić od około 1,5:1 do około 2:1. Szczepionki mogą zawierać inne oczyszczone immunogeny Bordetella, w tym hemaglutyninę nitkowatą, białko błony zewnętrznej 69kDa i toksynę ksztuścową albo jej anatoksynę, w tym genetycznie detoksyfikowane analogi PT jak opisano, przykładowo w ref. 68.

Inne immunogeny Bordetella, toksyna ksztuścową (w tym jej detoksyfikowane genetycznie analogi jak opisane, przykładowo, w Klein i in., patent USA nr 5,085,862, do którego uprawnionym jest niniejszy zgłaszający i załączony tu jako odnośnik), FHA i białko 69 kDa można wytworzyć w postaci oczyszczonej różnymi sposobami, takimi jak opisane niżej.

Oczyszczanie PT.

PT można oczyszczać z nadsączu hodowlanego szczepu B. pertussis stosując metody konwencjonalne. Przykładowo, można zastosować sposób Sekura i in. (ref. 55). PT izoluje się przez absorpcję nadsączu hodowli na kolumnie zawierającej matrycę żelową barwnikaliganda, Afi-Gel Blue (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). PT eluuje się z tej kolumny wysokim stężeniem soli, takim jak np. 0,75 M chlorkiem magnezu, a następnie po usunięciu soli, przepuszcza się przez matryce powinowactwa fetuiny-Sepharose, składającą się z fetuiny przyłączonej do Sepharose aktywowanej bromkiem cyjanu. PT eluuje się z kolumny fetuiny stosując 4 M sól magnezową.

Alternatywnie, można zastosować sposób Ironsa i in. (ref. 56). Nadsącz hodowlany absorbuje się na kolumnie z Sepharose 4B aktywowanej CNBr, do której uprzednio przyłączono kowalencyjnie haptoglobinę. PT wiąże się z absorbentem w pH 6,5, a następnie jest eluowana z kolumny przy użyciu bufora 0,1 M Tris/0,5 M NaCl przez stopniową zmianę pH do 10.

Alternatywnie, można zastosować sposób opisany w patencie USA nr 4,705,686 przyznanym Scotfowi i in. 10 listopada 1987, załączony tu jako odnośnik. W sposobie tym nadsącze hodowlane albo komórkowe ekstrakty B. pertussis przepuszcza się przez kolumnę żywicy anionowymiennej o pojemności odpowiedniej do zaabsorbowania endotoksyny, ale umożliwiającej przepływ antygenów Bordetella, albo w inny sposób oddziela się endotoksynę.

Alternatywnie, PT można oczyszczać przez zastosowanie chromatografii perlitu, jak to opisano w patencie EP nr 336 736, do którego uprawnionym jest niniejszy zgłaszający i załączony tu jako odnośnik.

Detoksyfikacja PT.

PT detoksyfikuje się w celu usunięcia niepożądanych aktywności, które mogą spowodować efekty uboczne szczepionki. Można zastosować dowolną z konwencjonalnych metod chemicznej detoksyfikacji, takich jak traktowanie formaldehydem, nadtlenkiem wodoru, tetranitrometanem albo glutaraldehydem.

Przykładowo, PT można detoksyfikować glutaraldehydem stosując modyfikację procedury opisanej przez Munoz i in., (ref. 57). W tym procesie detoksyfikacji oczyszczoną PT inkubuje się w roztworze zawierającym roztwór soli buforowany 0,01 M fosforanem. Do roztworu dodaje się 0,05% glutaraldehyd i inkubuje się mieszaninę w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, a następnie dodaje się L-lizynę do stężenia 0,02 M. Mieszaninę dalej inkubuje się przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie dializuje przez dwa dni wobec 0,01 M PBS. W konkretnym wykonaniu, można zastosować proces detoksyfikacji według patentu EP nr 336 736. Pokrótce, PT można detoksyfikować glutaraldehydem w następujący sposób:

Oczyszczoną PT w 75 mM fosforanie potasu w pH 8,0, zawierającym 0,22 M chlorek sodu rozcieńcza się równą objętością gliceryny do stężenia białka równego około 50 do 400 pg/ml. Roztwór podgrzewa się do 37°C i detoksyfikuje przez dodanie glutaraldehydu w stężeniu końcowym 0,5% (wag./obj.). Mieszaninę trzyma się w 37°C przez 4 godziny, a następnie dodaje się kwas asparaginowy (1,5 M) w stężeniu końcowym 0,25 M. Mieszaninę inkubuje się

187 935 w temperaturze pokojowej przez godzinę, a następnie diafiltruje 10 objętościami 10 mM fosforanu potasu w pH 8,0 zawierającego 0,15 M chlorek sodu i 5% glicerynę, w celu zredukowania gliceryny i usunięcia glutaraldehydu. Anatoksynę PT filtruje się sterylnie przez membranę 0,2 μ.

Jeżeli stosuje się techniki rekombinacji do wytworzenia zmutowanęj cząsteczki PT, która wykazuje słabą toksyczność albo żadną, do zastosowania jako cząsteczka anatoksyny, chemiczna detoksyfikacja nie jest konieczna.

Oczyszczanie FHA.

FHA można oczyszczać z nadsączu hodowlanego zasadniczo jak to opisano w Cowell i in. (ref. 58). Promotory wzrostu, takie jak metylowane cyklodekstryny, można zastosować w celu zwiększenia uzysku FHA w nadsączu hodowlanym. Nadsącz hodowlany wprowadza się do kolumny z hydroksyapatytu. FHA adsorbuje się na kolumnie w przeciwieństwie do PT. Kolumnę intensywnie płucze się Triton X-100 w celu usunięcia endotoksyny. Następnie, FHA eluuje się stosując 0,5 M NaCl w 0,1 M fosforanie sodu i, jeżeli to konieczne, przepuszcza się przez kolumnę fetuiny-Sepharose w celu usunięcia zalegającej PT. Dodatkowe oczyszczanie może obejmować przepuszczenie przez kolumnę z Sepharose CL-6B.

Alternatywnie, FHA można oczyszczać stosując przeciwciała monoklonalne wobec antygenu, przy czym przeciwciała przytwierdzone są do kolumny powinowactwa aktywowanej CNBr (ref. 59).

Alternatywnie, FHA można oczyszczać przez zastosowanie kolumny perlitu, jak to opisano w wyżej wspomnianym EP 336 736.

Oczyszczanie białka błony zewnętrznej 69 kDa (pertaktyna).

Białko błony zewnętrznej (69K albo pertaktyna) można pozyskać z komórek bakteryjnych przez inaktywację komórek środkiem bakteriostatycznym, takim jak tiomersal, jak to opisano w publikacji EP 484 621 i załączonej tu jako odnośnik. Inaktywowane komórki zawiesza się w ośrodku wodnym, takim jak PBS (pH 7 do 8) i poddaje kolejnym ekstrakcjom w podwyższonej temperaturze (45 do 60°C) z ochłodzeniem do temperatury pokojowej albo 4°C. Ekstrakcje uwalniają białko 69K z komórek. Materiał zawierający białko 69K zbiera się przez precypitację i przepuszcza przez kolumnę Affi-gel Blue. Białko 69K eluuje się wysokim stężeniem soli, takim jak 0,5 M chlorek magnezu. Po dializie, przepuszcza się je przez podłoże ogniskujące chromatograficznie.

Alternatywnie, białko 69 kDa można oczyszczać z nadsączu hodowlanego B. pertussis, jak to opisano w opublikowanym zgłoszeniu PCT WO 91/15505, zgłoszonym w imieniu niniejszego zgłaszającego i załączone tu jako odnośnik. Sposób taki jest korzystny ponieważ pertaktyna otrzymywana jest w postaci wolnej od barwnych materiałów chromatograficznych, cyklazy adenylowej.

Inne odpowiednie sposoby oczyszczania białka błony zewnętrznej 69 kDa B. pertussis opisano w patencie USA nr 5,276,142, udzielonym Gotto i in. 4 stycznia 1984 oraz patencie USA nr 5,101,014, udzielonym Bums'owi i in. 31 marca 1992.

Inne składniki według wynalazku.

Szczepionki według wynalazku zawierają również immunogeny nie pochodzące z Bordetella, w tym anatoksynę tężcową, anatoksynę błoniczą, inaktywowany wirus nagminnego porażenia dziecięcego (IPV) i ewentualnie konjugat anatoksyny błoniczej albo anatoksyny tężca i otoczkowego polisacharydu Haemophilus influenzae typu b. Inne potencjalne składniki szczepionek wieloskładnikowych obejmują białka błony zewnętrznej Haemophilus, antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B, świnki, odry i różyczki.

Koniugaty anatoksyny tężca albo anatoksyny błoniczej i otoczkowego polisacharydu Hib można wytworzyć przez wyizolowanie fosforanu rybitolu polirybozy (PRP) wyizolowanego z H. influenzae typu b, derywatyzację PRP w celu otrzymania dihydrazydu kwasu adypinowego i konjugację kowalencyjną z anatoksyną tężca albo anatoksyną błoniczą w celu otrzymania konjugatów, odpowiednio PRP-T albo PRP-D.

Każdy z antygenów jest pojedynczo absorbowany na adiuwancie, takim jak fosforan glinu albo wodorotlenek glinu, zbiorczo określanych jako alum, zapewniając wygodne i szybkie wytwarzanie szczepionek zawierających wybrane względne ilości tych antygenów w dostarczonych tu szczepionkach.

187 935

Wybrane kompozycje szczepionki multiwalentnej.

W wybranych wykonaniach, wynalazek dostarcza szczepionek o poniższych cechach charakterystycznych (zastosowane pg białka opierają się na wynikach testu Kjedahla przeprowadzonego na oczyszczonych koncentratach i wyrażone są w pg azotu białkowego), które to szczepionki można podawać we wstrzyknięciach domięśniowych:

(a) CP20/20/5/3DT-mIPV (HYBRYDA):

Kompozycja obejmuje kombinację podjednostkowej szczepionki przeciwksztuścowej (CP) skojarzonej z anatoksyną błonicy (DI) i tężca (T) oraz inaktywowanym wirusem nagminnego porażenia dziecięcego (mIPV) i określana jest jako CP20/20/5/3DT-mIPV (HYBRYDA). Wirus nagminnego porażenia dziecięcego hodowany na komórkach MRC-5 określany jest jako mIPV, zaś hodowany na komórkach Vero oznaczony jest jako IPV albo vIPV. Oba inaktywowane wirusy polio stosowane są zamiennie w kompozycjach.

Wytworzono ludzkie dawki po 0,5 ml CP202o0/3DT-mIPV (HYBRYDA) zawierające około: 20 pg anatoksyny ksztuścowej (PT) pg hemaglutyniny nitkowatej (FHA) pg aglutynogenów fimbrii 2 i 3 (FIM) pg białka błony zewnętrznej, pertaktyny (69 kDa)

Lf anatoksyny błoniczej 5 Lf anatoksyny tężcowej jednostek antygenu D wirusa polio typu 1 8 jednostek antygenu D wirusa polio typu 2 jednostek antygenu D wirusa polio typu 3

1,5 mg fosforanu glinu 0,6% 2-fenoksyetanolu jako konserwant.

(b) αγήίύύυτ-πιΐρν (hybryda) + prp-t

Inna kompozycja obejmowała kombinację składnikowej szczepionki przeciwksztuścowej (CP) skojarzonej z anatoksyną błonicy (DI) i tężca (T) oraz inaktywowanym wirusem nagminnego porażenia dziecięcego (mIPV), określana jest jako CP20/20/s/3DT-mIPV (HYBRYDA) i stosuje się ją do odtworzenia liofilizowanego PRP-T. Powstała kompozycja zawiera, w dawce 0,5 ml:

pg anatoksyny ksztuścowej (PT) pg hemaglutyniny nitkowatej (FHA) pg aglutynogenów fimbrii 2 i 3 (FIM) pg białka błony zewnętrznej, pertaktyny (69 kDa)

Lf anatoksyny błoniczej 5 Lf anatoksyny tężcowej pg oczyszczonego polisacharydu otoczkowego, fosforanu rybitolu polirybozy (PRP) z Haemophilus influenzae typu b, połączonego kowalencyjnie z 20 pg anatoksyny tężcowej jednostek antygenu D wirusa polio typu 1 8 jednostek antygenu D wirusa polio typu 2 32 jednostek antygenu D wirusa polio typu 3

1,5 mg fosforanu glinu

0,6% 2-fenoksyetanolu.

(c) CP₂o/2o/5/3DT-PPR-T--PV (HYBRYDA):

Dodatkowa kompozycja obejmuje kombinację składnikowej szczepionki przeciwksztuścowej (CP) skojarzonej z anatoksyną błonicy (DI) i tężca (T), inaktywowanym wirusem nagminnego porażenia dziecięcego (mIPV) i PRP-T, określana jest jako CP00/20O//3DT-IPR--TIPV (HYBRYDA). Powstała kompozycja zawiera, w dawce ludzkiej 0,5 ml, około:

pg anatoksyny ksztuścowej (PT) pg hemaglutyniny nitkowatej (FHA) pg aglutynogenów fimbrii 2 i 3 (FIM) pg giałka atony yewnętrznej, jjerkrlityiy y69 9Daj 15 Lf anatoksyny błoniczej

187 935

Lf anatoksyny tężcowej gg oczyszczonego polisacharydu otoczkowego, fosforanu rybitolu polirybozy (PRp) z Haemophilus influenzae typu b, połączonego kowalencyjnie z 20 gg anatoksyny tężcowej jednostek antygenu D wirusa polio typu 1 8 jednostek antygenu D wirusa polio typu 2 jednostek antygenu D wirusa polio typu 3

1,5 mg fosforanu glinu 0,6% 2-fenoksyetanolu.

Badania kliniczne.

(a) Złożona szczepionka DTP przeciwko kokluszowi.

Jak tu opisano, przeprowadzono u ludzi wiele badań klinicznych w celu oceny bezpieczeństwa, braku reaktogenności i przydatności złożonych szczepionek przeciwko kokluszowi zawierających aglutynogeny fimbrii przygotowane jak tu opisano, dla zabezpieczenia przeciwko kokluszowi. Szczególnie uzyskano odpowiedzi immunologiczne na każdy z antygenów wchodzących w skład szczepionki (jak pokazano poniżej, na przykład w tabeli 3). Celem oceny skuteczności szczepionki przeciwko kokluszowi o typowym przebiegu analizowano konkretną multiwalentną szczepionkę przeciwko kokluszowi CP10/5/5/3DT w wielkim kontrolowanym placebo, wieloośrodkowym, podwójnie randomizowanym badaniu klinicznym populacji ryzyka.

Przypadki definiowane jako koklusz o typowym przebiegu: dwadzieścia jeden lub więcej dni spazmatycznego kaszlu i albo obecność B. pertussis potwierdzona hodowlą albo serologiczne potwierdzenie swoistego zakażenia

Bordetellą, na co wskazuje 100% wzrost poziomu przeciwciał IgG lub IgA wobec FHA lub Pt w teście ELISA w sparowanej surowicy albo w przypadku braku potwierdzenia serologicznego kontakt w środowisku domowym badanego dziecka z przypadkiem, u którego obecność B. pertussis potwierdzono hodowlą i, u którego początek kaszlu w ciągu 28 dni przed lub po początku kaszlu badanego dziecka.

Wyniki tego badania wskazują na około 85% skuteczność CP10/5/5/3DT w zapobieganiu kokluszowi zdefiniowanemu jak w definicji przypadku kokluszu o typowym przebiegu opisanemu powyżej. W tym samym badaniu dwuskładnikowa bezkomórkowa szczepionka przeciwko kokluszowi zawierająca jedynie PT i FHA była skuteczna jedynie w około 58% (PT25. FHA25.DT) a szczepionka przeciwko kokluszowi zawierająca całe komórki (DTP) była skuteczna jedynie w około 48% (patrz tabela 4 poniżej). Dodatkowo szczepionka CP10/5/5/3DT zapobiegała kokluszowi o łagodnym przebiegu, zdefiniowanemu jako kaszel trwający jeden dzień ze skutecznością około 77%. Zwłaszcza profil uzyskanej odpowiedzi immunologicznej był zasadniczo taki sam jak uzyskany po immunizacji szczepionką przeciwko kokluszowi zawierającą całe komórki, o której donoszono, że jest wysoce skuteczna przeciwko kokluszowi.

(b) Multiwalentna szczepionka DPT-PRP-T-IPV.

(I) Bezpieczeństwo i immunogenność złożonych szczepionek przeciwko kokluszowi w połączeniu z adsorbowanymi anatoksynami błoniczą i tężcową szczepionką koniugatu Haemophilus influenzae b i anatoksyny tężcowej i inaktywowaną szczepionką przeciwko nagminnemu porażeniu dziecięcemu hodowaną na komórkach vero (CPoo/oOsĄDT-PPR-T-IPY) porównywano z szczepionką przeciwko kokluszowi zwierającą całe komórki (a) w połączeniu z adsorbowanymi anatoksynami błoniczą i tężcową i inaktywowaną szczepionką przeciwko nagminnemu porażeniu dziecięcemu (b) w połączeniu z adsorbowanymi anatoksynami błoniczą i tężcową i inaktywowaną szczepionką przeciwko nagminnemu porażeniu dziecięcemu

187 935 hodowaną na komórkach MRC-5 (adsorbowane DTP-polio) wykorzystanymi do rozpuszczenia liofilizowanej szczepionki koniugatu Haemophilus influenzae b i anatoksyny tężcowej (PENTA™), albo (c) złożonej szczepionki przeciwko kokluszowi w połączeniu z adsorbowanymi anatoksynami błoniczą i tężcową szczepionkę koniugatu Haemophilus influenzae b i anatoksyny tężcowej i inaktywowaną szczepionką przeciwko nagminnemu porażeniu dziecięcemu hodowaną na komórkach MR.C-5 (CP2o/W5wDT-mIPV) podawanymi oddzielenie lub wykorzystywanymi do rozpuszczenia liofilizowanej szczepionki koniugatu Haemophilus influenzae b i anatoksyny tężcowej (PRP-T) u dzieci w wieku 2, 4, 6 i 18 miesięcy.

To randomizowane, kontrolowane badanie włączyło 897 dwumiesięcznych dzieci do jednego z ośmiu grup otrzymujących różne szczepionki: CP20/20/5/3DT-PRP-T-IPV (płynna); CP20/20/5/3DT podawana jednocześnie, lecz w różne miejsce z PRP-T; albo szczepionka kontrolna, zawierająca cełe komórki DTP-Polio wykorzystana do rozpuszczenia PRP-T (PENTA™).

Wszystkie badane szczepionki były dobrze tolerowane. Nie występowały znaczące różnice w częstości występowania odczynów pomiędzy dwoma rodzajami kombinacji rekombinowanej szczepionki przeciwko kokluszowi. Dzieci otrzymujące złożoną CP2(oW5/3DT-mIPV wykorzystywaną do rozpuszczenia PRP-T miały nieznacznie większą częstość występowania odczynów miejscowych w porównaniu z tymi samymi produktami podawanymi w różne miejsca. Wszystkie składniki kombinacji szczepionki przeciwkr-ztuścowej miały konsekwentnie mniejszą częstość występowania miejscowych i uogólnionych odczynów w porównaniu z kombinacją zawierającą całe komórki. Różnice w częstości występowania odczynów między złożoną szczepionką przeciw kokluszowi a szczepionkami zawierającymi całe komórki były najbardziej widoczne w ciągu pierwszych 24 godzin po zaszczepieniu.

Obie kombinacje złożonych szczepionek przeciwkrztuścowych wywoływały powstanie doskonałych odpowiedzi na wszystkie antygeny. W wszystkich przypadkach odpowiedzi na krztuścowe PT, FHA i pertaktynę przewyższały odpowiedzi uzyskiwane w przypadku kombinacji obejmujących szczepionki zawierające całe komórki. Nie było znaczących różnic w odpowiedzi przeciwko PRP, błonicy i polio typu 1 i 2 pomiędzy kombinacjami szczepionek złożonych a zawierających całe komórki. Obie kombinacje złożonej szczepionki przeciwkrztuścowej powodują powstanie silniejszej odpowiedzi przeciwko tężcowi niż PENTA™. Obie kombinacje złożonej szczepionki wywołują podobną odpowiedź serologiczną na wszystkie antygeny za wyjątkiem polio 3, dla którego CP2o/2^V3DT-mIPV zastosowany do rozpuszczenia PRP-T wywołuje silniejszą odpowiedź niż CP20/20/5/3DT-PRP-T-IPV. Sposób podawania nie wpływa na powstanie odpowiedzi serologicznej wobec któregokolwiek antygenu za wyjątkiem tężca. W obu grupach otrzymujących szczepionkę złożoną i pojedynczą, 100% dzieci otrzymało ochronę przeciwko tężcowi (>0.01 EU/ml) po trzeciej dawce szczepionki.

Najważniejsze, że wszystkie grupy osiągnęły dobrą odpowiedź wobec PRP-T z 98,3% dzieci, które osiągnęły poziom >0,15 pg/ml i ponad 86,1% dzieci, które osiągnęły poziom >1,0 pg/ml. Wyniki te są porównywalne do obserwowanych w poprzednich badaniach, w których szczepionki przeciw kokluszowi zawierające całe komórki stosowano z PRP-T.

Odpowiedzi serologiczne uzyskane i opisane powyżej pokazano w tabelach od 5 do 7(H=hybryda).

(II) Bezpieczeństwo i immunogenność złożonej szczepionki przeciwko kokluszowi w połączeniu z adsorbowanymi anatoksynami błoniczą i tężcową i inaktywowaną szczepionką przeciwko nagminnemu porażeniu dziecięcemu hodowaną na komórkach MRC-5 (CP20/20/5/3DTmIPV) podawanymi oddzielenie lub wykorzystywanymi do rozpuszczenia liofilizowanej szczepionki koniugatu Haemophilus influenzae b i anatoksyny tężcowej (PRP-T) porównywano ze szczepionką przeciwko kokluszowi zawierającą całe komórki w połączeniu z adsorbowanymi anatoksynami błoniczą i tężcową i inaktywowaną szczepionką przeciwko nagminnemu porażeniu dziecięcemu hodowaną na komórkach MRC-5 (adsorbowane DTP-polio) wykorzystaną do rozpuszczenia liofilizowanej szczepionki koniugatu Haemophilus influenzae b i anatoksyny tężcowej (PENTA™) u dzieci w wieku od 18 do 19 miesięcy.

Badanie składające się z pięciu grup obejmowało grupę kontrolną zawierającą szczepionkę opartą o cale komórki PENTA™ i grupę, w której podawano CIToTiPśTDT-mIPy sto16

187 935 sowane do rozpuszczenia PRP-T. Piąta grupa otrzymywała CP2o/2o/f/fDT-mlPV jednocześnie z PRP-T, lecz w różne miejsce. 489 pacjentów otrzymało szczepionkę w wieku 18-19 miesięcy z czego 466 (95%) ukończyło badanie zgodnie z protokołem. Cp2r/2O^/5/3DT-mIPV zastosowany do rozpuszczenia PRP-T powodował znacząco mniej odczynów niż PENTA™ szczególnie w ciągu pierwszych 24 godzin po szczepieniu. Rozpuszczony produkt wykazywał nieznacznie wyższy odsetek odczynów miejscowych w porównaniu z produktami podawanymi oddzielnie.

PENTA™ wywoływała silniejszą odpowiedź wobec polio 1 niż CP2o/2o/5/3DT-mIPV zastosowany do rozpuszczenia PRP-T. Nie obserwowano znaczących różnic odpowiedzi wobec PRP¹, błonicy, aglutyninie krztuścowej, fimbriom, polio 2 albo polio 3. CP2o/2(/5/3DT-mIPV zastosowany do rozpuszczenia PRP-T wywołuje znacząco silniejsze odpowiedzi serologiczne wobec krztuścowej PT, FHA i pertaktyny. CPa/WsóDT-m^y zastosowany do rozpuszczenia PRP-T wywołuje zgodne odpowiedzi serologiczne na wszystkie badane antygeny. Nie obserwowano znaczących różnic pomiędzy CP2o/2o^/5/3DT-mIPV podawaną oddzielnie, a stosowaną do rozpuszczenia PRP-T za wyjątkiem odpowiedzi antytoksyny tężcowej (6,78 wobec 4,91 EU/ml).

Badanie to wykazało, że CP2r/2r^,5/3DT-mIPV zastosowany do rozpuszczenia PRP-T wywołuje zgodną odpowiedź serologiczną w trzech seriach i jest bardziej immunogenny niż PENTA™ w stosunku do odpowiedzi przeciwko Bordetella. CP2o/2()/5/3DT-mIPV wywołuje również znacząco mniejszy odsetek miejscowych i uogólnionych odczynów niż PENTA™.

(HI) Bezpieczeństwo i immunrgeoorść złożonej szczepionki przeciwko kokluszowi w połączeniu z adsorbowanymi anatoksynami błoniczą i tężcową i inaktywowaną szczepionką przeciwko nagminnemu porażeniu dziecięcemu hodowaną na komórkach MRC-5 (CP20/20/5/3DT-mIPV) porównywano ze szczepionką przeciwko kokluszowi zawierającą całe komórki w połączeniu z adsorbowanymi anatoksynami błoniczą i tężcową i inaktywowaną szczepionką przeciwko nagminnemu porażeniu dziecięcemu hodowaną na komórkach MRC-5 (adsorbowane DTP-prlir) u dzieci w wieku od 4 do 6 lat.

164 pacjentów aandrmizrwaor w stosunku 4 do 1 do grup otrzymujących albo CP2r/2<)/5/3pT-mIPV (n=131) albo DTR-polio (n-33). W badaniu nie wystąpiły znaczące i poważne objawy niepożądane. CP2r/2r/5/3DT-mIPV wykazywała zgodnie mniejszy odsetek zarówno odczynów miejscowych jak i uogólnionych szczególnie w okresie od 0 do 24 godzin. Odczyny miejscowe były częste w obu grupach, 97% otrzymujących DTP-polio i 76,9% otrzymujących CP2r'2r^,5/3DT-mIPV wykazała pewne odczyny miejscowe w okresie od 0 do 24 godzin. Odczyny miejscowe po CP2r/2r/5/3DT-mIPV były zwykle łagodne lub umiarkowane. W przeciwieństwie do tego więcej niż połowa otrzymujących DTP-prlio wykazywała odczyny miejscowe określane jak ciężkie. Wrażliwość miejsca po wkłuciu zwykle zanikała w ciągu 72 godzin lecz zaczerwienienie i obrzmienie miały tendencję do utrzymywania się przez okres od 24 do 72 godzin.

Odczyny uogólnione w okresie od 0 do 24 godzin były rzadsze u otrzymujących CP2r^/2(^/5ÓÓT-tnIPV (38,5%) niż u otrzymujących DTP-Polio (90,9%). W obu grupach odczyny uogólnione nie były częste w okresie od 24 do 72 godzin.

Odpowiedzi wobec błonicy, tężca, polio 2 i 3 były porównywalne pomiędzy obiema szczepionkami. Otrzymujący DIT-polio wykazywali znacząco wyższą odpowiedź wobec polio 1 (15,462) niż otrzymujący CP2o/2o/5/3DT-mIPV (10,903). Wszyscy osobnicy wykazywali doskonałe odpowiedzi i można ich uważać za chronionych przed odpowiednimi chorobami. Odpowiedzi serologiczne wobec wszystkich antygenów krztuścowych były znacząco silniejsze u otrzymujących CCtyjNiŃŃDT-mIPk'.

(IV) Bezpieczeństwo i immunogenność złożonych szczepionek przeciwko kokluszowi w połączeniu z adsorbowanymi anatoksynami błoniczą i tężcową, szczepionką koniugatu Haemophilus influenzae b i anatoksyny tężcowej i inaktywowaną szczepionka przeciwko nagminnemu porażeniu dziecięcemu hodowaną na komórkach MRC-5 (CP20/20/5/3DT-PRP-T-mIPV) porównywano z szczepionką przeciwko kokluszowi zwierającą całe komórki w połączeniu z adsorbowanymi anatoksynami błoniczą i tężcową i inaktywowaną szczepionką przeciwko nagminnemu porażeniu dziecięcemu hodowaną na komórkach MRC-5 (adsorbowane DTP-prlir) wykorzystywaną do rozpuszczenia liofilizowanej szczepionki koniugatu Ha187 935 emophilus influenzae b i anatoksyny tężcowej (PENTA™) albo ze złożoną szczepionką przeciwko kokluszowi w połączeniu z adsorbowanymi anatoksynami błoniczą i tężcową i inaktywowaną szczepionką przeciwko nagminnemu porażeniu dziecięcemu hodowaną na komórkach MRC-5 (CP2o/2o/s/3DT-mIPV) wykorzystywanymi do rozpuszczenia liofilizowanej szczepionki koniugatu Haemophilus influenzae b i anatoksyny tężcowej (PRP-T) u dzieci w wieku od 18 do 19 miesięcy.

Celem tego trójodnogowego randomizowanego, kontrolowanego badania była ocena bezpieczeństwa i immunogenności dwu nowych, bezkomorkowych kombinacji szczepionki przeciwko kokluszowi, Cd^Ató/jDT-PRP-T-mIIW i CP20/20/5/3DT-mIPV wykorzystywanych do rozpuszczenia PRP-T w porównaniu do PENTA™ (przeciwkrztuścowa szczepionka DPT polio zawierająca całe komórki stosowane do rozpuszczenia PRP-T) u dzieci w wieku od 18 do 19 miesięcy. W badaniu brało udział 99 dzieci, po 33 w każdej z trzech grup otrzymujących szczepionki, z których 97 (98%) ukończyło badanie zgodnie z protokołem.

Nie obserwowano poważnych odczynów w tym badaniu. U pacjentów otrzymujących PENTA™ występowało znacząco więcej umiarkowanych i ciężkich miejscowych i uogólnionych odczynów niż u osób otrzymujących dwie pozostałe szczepionki. Różnice były bardziej wyraźne w ciągu 24 godzin i osiągały poziom znaczący statystycznie w przypadku gorączki, zaczerwienienia, opuchlizny, tkliwości uciskowej, ogólnego rozbicia, zmniejszonej aktywności i utraty apetytu. Bardziej łagodne odczyny występowały u dzieci otrzymujących kombinację złożonej szczepionki przeciwkrztuścowej. Nie obserwowano znaczących różnic w występowaniu odczynów pomiędzy dwoma kombinacjami złożonej szczepionki przeciwkrztuścowej, jednakże ogólne rozbicie w ciągu 24 godzin występowało częściej u tych, którzy otrzymywali CP2o/2o/5/3DT-mIPV wykorzystywaną do rozpuszczenia PRP-T w odróżnieniu do tych, którzy otrzymywali CP2o/2o^/5^/,3DT-PRP-T-mIPV (18% wobec 3%).

Odpowiedzi serologiczne były zadowalające u 100% biorących udział i osiągały poziomy zapewniające ochronę; dla antytoksyny błoniczej (>0,01 IU/ml), antytoksyny tężcowej (>0,01 IU/ml) i anty PRP (>1,0 pg/ml). Wykrywalne poziomy przeciwciał neutralizujących antygeny polio typu 1, 2 i 3 obserwowano u wszystkich biorących udział po immunizacji.

W grupie otrzymującej PENTA™ odpowiedzi w stosunku do antygenów błoniczych były wyższe i zależały od większej zawartości antygenu w tej szczepionce (25 Lf w stosunku do 15 Lf).

Przeciwciała przeciwkrztuścowe były zgodnie wyższe w grupach otrzymujących kombinacje złożonej szczepionki przeciwkrztuścowej w porównaniu z PENTA™ i osiągały znaczącą statystycznie różnicę w stosunku do odpowiedzi GMT anty-PT, anty-FHA i antypertaktyna. Poziomy przeciwciał przeciwko fimbriom i krztuścowych aglutynujących były również wyższe u otrzymujących złożoną szczepionkę przeciwkrztuścową. jednakże różnice nie osiągnęły poziomu istotnego statystycznie.

W skrócie, badanie to wykazało, że dwie bezkomórkowe kombinacje szczepionek przeciwkrztuścowych CP?o^/,2o^/5/3DT-mIPV wykorzystywanej i CP20/20/5/3DT-PRP-T-mIPV są porównywalne i ich stosowanie powoduje satysfakcjonująco niski odsetek występowania odczynów i wysoki poziom odpowiedzi serologicznej, gdy są stosowane jako dawki przypominające u dzieci w wieku 18 do 19 miesięcy.

(V) Bezpieczeństwo i immunogenność złożonej szczepionki przeciwko kokluszowi w połączeniu z adsorbowanymi anatoksynami błoniczą i tężcową (CP20/20/5/3DT) stosowaną pojedynczo lub w kombinacji z jednym lub dwoma inaktywowanymi wirusami nagminnego porażenia dziecięcego, jednym mIPV hodowanym na komórkach MRC-5 i innym vIPV hodowanym na komórkach vero lub doustną szczepionką przeciwko nagminnemu porażeniu dziecięcemu (OPV) u dzieci w wieku od 17 do 19 miesięcy.

bada elu zbadania wzajemnych oddziaływań zaprojektowano pomiędzy CP20/20/5/3DT dwoma IPV (hodowanymi na komórkach Vero i na komórkach MRC-5). Oba IPV zostały połączone jako pojedynczy płynny produkt w CP2&/20/5/3lTT-miPV i CP₂(32o353DTvIPV albo były podawane jednocześnie lecz w różne miejsca (CP2wW3/339TTmiPV i CPo/2o353 -DT+vIPV). Piąta badana grupa otrzymywała jednocześnie CP20/20/5/3DT i OPV. Wszyscy osobnicy otrzymywali PRP-T w trakcie pobierania krwi po immunizacji. Odpowiedzi anty-PRP nie oceniano w tym badaniu.

187 935

Projekt badania

LICZBA	WIZYTA 1(17-19 miesięcy)	WIZYTA 2 (+1 miesiąc)
85	l.CP2O/2o/5/3DT+mIPV (jedno wstrzyknięcie)	PRP-T
85	2.CP2o/2<0V3DT+mIPV (dwa wstrzyknięcia)	PRP-T
85	3,CP2o/2o/5/3DT+vIPV (jedno wstrzyknięcie)	PRP-T
85	4.CP2o/2(/5/3DT+vIPV (dwa wstrzyknięcia)	PRP-T
85	5.CP20/ 2O s^DT+OPY (jedno wstrzyknięcie)	PRP-T

Zasadniczo nie było różnic w odsetku występowania reakcji niepożądanych po zastosowaniu inaktywowanych szczepionek przeciwko nagminnemu porażeniu dziecięcemu pochodzących z komórek MRC-5 albo Vero, ani wtedy gdy szczepionka była podawana jako oddzielne wstrzyknięcie, ani gdy była podawana w połączeniu ze szczepionką CP20/20/5/3DT (HYBRID).

Nie obserwowano znaczących różnic między odpowiedziami w grupach wobec PT, FHA i pertaktyny. Odpowiedzi wywołane u dzieci otrzymujące CP20/20/5/3DT (HYBRID) i OPV były niewiele, lecz nieistotnie wyższe niż u dzieci otrzymujących CP20/20/5/3DT (HYBRID) i IPV z komórek Vero wobec FIM, aglutyniny krztuścowej, błonicy i tężca. Odpowiedzi wobec antygenu polio były zasadniczo porównywalne lub wyższe u dzieci otrzymujących szczepionkę IPV niż OPV. Wszyscy za wyjątkiem jednego osobnika mieli poziom aglutyniny krztuścowej >1:64. Wszyscy za wyjątkiem jednego osobnika osiągnęli poziomy antytoksyny >0,1 U/ml i wszyscy osiągnęli poziomy antytoksyny tężcowej >0,1 EU/ml.

Wyniki tego badania wskazują, że CP20/20/5/3DT (HYBRID) w połączeniu z EPV (zarówno z komórek MRC-5, jak i z komórek Vero) są bezpieczne i wywołują odpowiedź odpornościową u dzieci w wieku od 17 do 19 miesięcy. Połączenie szczepionek jest przynajmniej tak immunogenne jak szczepionka podawana jako osobne wstrzyknięcie, a w niektórych przypadkach jest bardziej immunogenne. Połączenie szczepionki w pojedyncze wstrzyknięcie nie jest związane ze znaczącym wzrostem miejscowych odczynów niepożądanych. Nie wykryto zasadniczych różnic w występowaniu odczynów niepożądanych w przypadku stosowania dwóch preparatów IPV zarówno w osobnych wstrzyknięciach, jak i jako złożone produkty. Włączenie IPV nie zwiększa częstości występowania odczynów niepożądanych w porównaniu z CP20/20/5/3DT (HYBRID) podawanym samodzielnie (tj. z OPV).

Wyniki serologiczne uzyskane w badaniu podsumowano w tabeli 8 (H=hybryda).

(VI) Bezpieczeństwo i immunogenność złożonej szczepionki przeciwko kokluszowi w połączeniu z adsorbowanymi anatoksynami błoniczą i tężcową (CP20/20/5/3DT i CP10/5/5/3DT) stosowaną pojedynczo lub w kombinacji z koniugowaną szczepionką Heamophilus influenzae typ b oceniano u dzieci w wieku od 17 do 19 miesięcy.

Sześcioodnogowe badanie zaprojektowano w celu sprawdzenia wzajemnych oddziaływań pomiędzy oboma klasyczną (CP10/5/5/3DT) i Hybrid (CP20/20/5/3DT) kombinacją złożonej szczepionki przeciwkrztuścowej i koniugowaną szczepionką przeciwko Heamophilus influenzae typ b u dzieci w wieku od 17 do 19 miesięcy. .

Zastosowano trzy schematy; w których (a) każdą ze złożonych szczepionek przeciwko kokluszowi wykorzystano do rozpuszczenia PRP-T, (b) podawano jednocześnie, lecz w inne miejsce niż PRP-T albo (c) PRP-T podawano w miesiąc po złożonej szczepionce przeciwko kokluszowi. Wszystkie dzieci otrzymywały OPV w trakcie pierwszej wizyty i podawano im składającą się z takich samych składników szczepionkę przeciwkrztuścową w wieku 2, 4 i 6 miesięcy. Wszystkie dzieci brały wcześniej udział w wielkim badaniu oceniającym bezpieczeństwo tych dwóch kombinacji szczepionek.

187 935

Do badania włączono 545 osobników, z których 542 (99%) ukończyło badanie.

LICZBA	WIZYTA 1		WIZYTA 2	WIZYTA 3
154	CP2O2O5/3DT wykorzystane do rozpuszczenia PRP-T		krew	-
152	CP20/20/5/3DT podawana jednocześnie z PRP-	KREW +	krew	-
	TOPV	OPV
159	CP20/20/5/3DT		PRP-T	krew
27	CP10/5/5/3DT wykorzystane do rozpuszczenia PRP-T		krew	-
29	CP10/5/5/3DT podawana jednocześnie z PRP-T OPV	KREW + OPV	krew	-
21	CP^WT		PRP-T	krew

Odpowiedzi serologiczne wobec większości antygenów były większe gdy kombinacje złożonej szczepionki przeciwkrztuścowej i PRP-T podawano tego samego dnia w porównaniu z podawaniem w różnych dniach (patrz tabela 9).

Ważne jest, że odpowiedzi anty-PRP nie zmniejszały się gdy PRP było podawane oddzielnie w porównaniu z połączeniem kombinacji złożonej szczepionki przeciw kokluszowi tego samego dnia.

GMT po immunizacji u dzieci otrzymujących szczepionkę w osobne dni były istotnie niższe. Różnice w reakcjach przeciwko PRP pomiędzy wstrzyknięciami skojarzonymi i osobnymi obserwowano gdy osobników podzielono pod względem kompozycji składnikowej szczepionki przeciwksztuścowej. Biorcy CP20/20/5/3DT (HYBRYDA) wykazywali niższy poziom reakcji przeciwko PRP gdy szczepionka była podawana w kombinacji niż gdy podawana była osobno. Różnic tych nie obserwowano w przypadku biorców CP10/5/5/3DT i różnice zanikały gdy grupy łączono. Wszyscy uczestnicy osiągnęli poziom reakci przeciwko PRP > 0,15 pg/ml i ponad 98% każdej z grup wykazywało poziom >1,0 pg/ml. Jedynie czterech (0,7%) uczestników badania nie osiągnęło tego poziomu; trzech w grupie wstrzyknięć pojedynczych w osobnych dniach i jeden w grupie wstrzyknięć skojarzonych. Ponad 82% każdej grupy przekroczyło miana 10 pg/ml przeciwciał przeciwko PRP.

Wśród wywołanych objawów miejscowych najczęściej zgłaszano jedynie tkliwość w grupie skojarzonej (27,8%) w porównaniu z grupą szczepioną w osobne dni (16,7%). Odsetek ten nie różnił się od obserwowanego w grupie otrzymującej szczepionki w tym samym dniu jako osobne wstrzyknięcia (24,2%).

Ogólnie, reakcje układowe zgłaszano z podobną częstością (60 do 62,1%) u uczestników każdej z grup badanych. Gorączkę zgłaszało około 1/3 uczestników. Jedynie ogólne rozbicie zgłaszano częściej w grupie wstrzyknięć skojarzonych (33,3%) w porównaniu z grupą osobnych wstrzyknięć (22,0%) i grupa wstrzyknięć w osobne dni (22,8%).

Podsumowując wyniki tego badania, równoczesne podanie CP10/5/5/3DT albo CP20/20/5/3-DT i PRP-T tego samego dnia nie interferuje z reakcjami przeciwko PRP, ale może je wła20

187 935 ściwie zwiększyć. Reakcje serologiczne wobec innych antygenów były również doskonałe. Tężec był jedynym antygenem poszkodowanym gdy zmieszano obie szczepionki, ale wszystkie dzieci miały wysoki poziom ochrony.

Do tego ostatniego testu klinicznego wytworzono CP2o/2o/5/3DT-IPV hodowanego na komórkach MRC5 do odtworzenia przy użyciu ActHib (PRP-T) i A5I (CP20/20/5/3DT-PRP-TIPV hodowanego na komórkach Vero 3 gg/ml). Składnikowe antygeny ksztuśca pojedynczo adsorbowano na fosforanie glinu 3 mg/ml pod nieobecność konserwanta. W tym celu PT była wlO mM fosforanie potasu, 0,15 M NaCl, 5% glicerynie, FHA była w 10 mM fosforanie potasu, 0,5 M NaCl, 69K było w 10 mM fosforanie potasu, 0,15 M NaCl, zaś fimbrie były w 10 mM fosforanie potasu, 0,15 M NaCl. D adsorbowano na fosforanie glinu (6,25 mg/ml) w stężeniu 300 Lf/ml. 2-fenoksyetanol dodawano jako konserwant w stężeniu 0,6%. T adsorbowano na fosforanie glinu (6,25 mg/ml) w stężeniu 300 Lf/ml. 2-fenoksyetanol dodawano jako konserwant w stężeniu 0,6%.

Adsorbowane antygeny składowe ksztuśca połączono z adsorbowaną D i adsorbowaną T w stężeniu 3,65 dawki/ml albo 55% objętości końcowej. Zawartość 2-fenoksyetanolu wynosiła 0,6%. Przed połączeniem mIPV albo v-IPV/PRP-T potwierdzono sterylność, zawartość glinu i zawartość 2-fenoksyetanolu. Do 5 ml, dodano m-IPV i 2-fenoksyetanolu i rozcieńczono do stężenia końcowego. Dla A5I, dodano v-IPV, PRP-T i 2-fenoksyetanol i rozcieńczono do stężenia końcowego.

W streszczeniu wyników badania klinicznego szczepionek multiwalentnych można zauważyć, że CP2oW5/3DT-mIPV zastosowana do odtworzenia PRP-T daje porównywalną reakcję serologiczną wobec błonicy, tężca i wirusów nagminnego porażenia dziecięcego typu 1, 2 i 3 porównywalną z PENTA™ (zawierającą komórkową szczepionkę ksztuśca). Reakcje przeciwko PRP są porównywalne albo wyższe z obserwowanymi dla PENTA™ zarówno dla dawek niemowlęcych jak i przypominających. Reakcje przeciwtężcowe są niższe w przypadku CP2o/2o/5/3DT-mIPV zastosowanej do odtworzenia PRP-T w porównaniu z CP20/20/5/3DTmIPV zastosowaną osobno z PRP-T, ale zmniejszenie to nie jest istotne klinicznie. Zgodnie z innymi badaniami, szczepionka całokomórkowa daje porównywalne albo wyższe reakcje wobec fimbrii i aglutynin w porównaniu ze szczepionką składnikową przeciwksztuścową, jednakże zastosowana szczepionka całokomórkowa znana jest z tego, że zawiera niezwykle immunogenny składnik fimbrii. Wszystkie inne reakcje przeciwksztuścowe były zgodnie wyższe w przypadku CP2o/2o/5/3DT-mIPV zastosowanej do odtworzenia PRP-T w porównaniu z PENTA™. Tak więc, niniejszy wynalazek dostarcza multiwalentnej kompozycji immunogennej, w której reakcje odpornościowe na antygeny nie są zmniejszone albo zaburzone przez inne składniki albo przez ich włączenie do szczepionki multiwalentnej. Zmniejszenie reakcji odpornościowej określane jest czasem jako interferencja.

Wytwarzanie szczepionki i zastosowanie.

Tak więc, kompozycje immunogenne przydatne do zastosowania jako szczepionki można wytworzyć z immunogenów jak to tu ujawniono. Szczepionka wywołuje reakcję odpornościową u osobnika, który wytwarza przeciwciała.

Kompozycje immunogenne, w tym szczepionki, można wytworzyć jako postaci do wstrzykiwania, jako roztwory wodne albo emulsje. Immunogeny można zmieszać z zaróbkami dopuszczalnymi farmaceutycznie, które są zgodne z immunogenami. takie zarobki mogą obejmować wodę, roztwór soli, dekstrozę, glicerynę, etanol i ich kombinacje. Kompozycje immunogenne i szczepionki mogą dalej zawierać substancje dodatkowe, takie jak środki zwilżające albo emulgujące, bufory pH albo adiuwanty w celu zwiększenia ich skuteczności. Kompozycje immunogenne i szczepionki można podawać pozajelitowe, przez wstrzyknięcie podskórne albo domięśniowe. Preparaty immunogenne i szczepionki podaje się w sposób zgodny z postacią dawkowania, oraz w ilości, która będzie skuteczna terapeutycznie, immunogenna i ochronna. Podawana ilość zależy od leczonego osobnika, w tym, przykładowo, zdolności układu odpornościowego osobnika do syntetyzowania przeciwciał oraz, jeżeli to konieczne, do wytwarzania reakcji komórkowej. Dokładne ilości składników czynnych konieczne do podawania zależą od oceny lekarza praktyka. Jednakże, odpowiednie dawki są łatwe do określenia dla specjalisty i zawierają się w ilościach mikrogramowych immunoge187 935 nów. Odpowiednie schematy do początkowego podawania i dawek przypominających są również zmienne, ale mogą obejmować początkowe podawanie poprzedzające kolejne podania. Dawki również mogą zależeć od wielkości gospodarza.

Stężenie immunogenów w kompozycji immunogennej według wynalazku wynosi ogólnie od około 1 do około 95%. Immunogenność może być istotnie zwiększona, jeżeli antygeny są podawane równocześnie z adiuwantem, zwykle stosowanym jako 0,005 do 0,5% roztwór w roztworze soli buforowanym fosforanem. Adiuwant zwiększa immunogenność antygenu, choć sam nie koniecznie jest immunogenny. Adiuwanty mogą działać przez zatrzymywanie antygenu miejscowo w pobliżu miejsca podania wywołując efekt złoża ułatwiający powolne, przedłużone uwalnianie antygenu do komórek układu odpornościowego. Adiuwanty potrafią również przyciągać komórki układu odpornościowego do złoża antygenów i pobudzają te komórki do wywoływania reakcji odpornościowych.

Czynniki immunostymulujące albo adiuwanty stosuje się od wielu lat w celu polepszania reakcji odpornościowej gospodarza na, przykładowo, szczepionki. Adiuwanty wewnątrzpochodne takie jak lipopolisacharydy, stanowią normalnie składniki zabitych albo atenuowanych bakterii stosowanych w szczepionkach. Adiuwanty zewnątrzpochodne są immunomodulatorami, które są zwykle połączone niekowalencyjnie z antygenami i są włączane do kompozycji w celu zwiększenia reakcji odpornościowych gospodarza. Tak wiec, zidentyfikowano adiuwanty, które zwiększają reakcje odpornościową na antygeny podane pozajelitowo. Jednakże, niektóre z tych adiuwantów są toksyczne i mogą powodować niepożądane efekty uboczne, czyniące je nieprzydatnymi do zastosowania u ludzi i wielu zwierząt. Rzeczywiście, jedynie wodorotlenek glinu i fosforan glinu (określane zbiorczo jako alum) są rutynowo stosowane jako adiuwanty w szczepionkach ludzkich i zwierzęcych. Skuteczność alumu w zwiększaniu reakcji przeciwciał na anatoksynę błoniczą i tężcową jest dobrze znana.

Szereg adiuwantów zewnątrzpochodnych może wywołać silną reakcję odpornościową na antygeny. Obejmują one saponiny skompleksowane z antygenami białkowymi błony (kompleksy pobudzające odporność), polimery pluronowe z olejami mineralnymi, zabite prątki w oleju mineralnym, kompletny adiuwant Freund'a, produkty bakteryjne takie jak muramylodipeptyd (MDP) i lipopolisacharyd (LPS), jak również lipid A i liposomy.

W celu skutecznego zwiększenia humoralnej reakcji odpornościowej (HIR) i odporności komórkowej (CMI) immunogeny często emulguje się w adiuwantach. Wiele adrnwantów jest toksycznych, wywołuje ziaminiaki, ostre i przewlekłe stany zapalne (kompletny adiuwant Freund'a, FCA), cytolizę (saponiny i polimery pluronowe) oraz pirogenność, zapalenie stawów i zapalenie jagodówki (LPS i MDP). Jakkolwiek FCA jest doskonałym adiuwantem, szeroko stosowanym w badaniach, nie jest dopuszczony do stosowania u ludzi albo w weterynarii ze względu na swą toksyczność.

Pożądane charakterystyczne cechy idealnego adiuwantu obejmują:

(1) brak toksyczności;

(2) zdolność do pobudzania długotrwałej reakcji odpornościowej;

(3) prostota wytwarzania i stabilność podczas długotrwałego przechowywania;

(4) zdolność do wywoływania zarówno HIR jak i CMI wobec antygenów podawanych różnymi drogami;

(5) synergizm z innymi adłuwkntamł;

(6) zdolność do wybiórczego oddziaływania z populacjami komórek prezentujących antygen (APC);

(7) zdolność do swoistego wywoływania odpowiednich reakcji TH1 albo TH2 i (8) zdolność do wybiórczego zwiększania poziomu przeciwciał odpowiedniego izotypu (przykładowo IgA) wobec antygenów.

Patent USA nr 4,855,283 udzielony Lockhoff i in. 8 sierpnia 1989, załączony tu jako odnośnik ujawnia analogi glikolipidowe w tym N-glikozyloamidy, N-glikozylomoczniki i N-glikozylokarbaminiany, w których reszty cukrowcowe podstawiono aminokwasem, jako immunomodulatory albo adiuwanty. Tak więc, Lockhoff i in., (patent USA nr 4,855,283 i ref. 60) donoszą że analogi N-glikolipidowe wykazujące podobieństwo strukturalne do naturalnie występujących glikolipidów, takich jak glikosfingolipidy i glicerololipidy, są zdolne do wywo22

187 935 ływania silnych reakcji odpornościowych zarówno w szczepionkach przeciwko wirusowi opryszczki pospolitej jak i w szczepionkach przeciwko wirusowi pseudowścieklizny. Niektóre glikolipidy wytworzono z długiego łańcucha alkiloamin i kwasów tłuszczowych, które są połączone bezpośrednio z cukrami przez anomeryczny atom węgla, w celu naśladowania funkcji naturalnie występujących reszt lipidowych.

Patent USA nr 4,258,029 udzielony Moloney'owi do którego uprawnionym jest niniejszy zgłaszający i załączony tu jako odnośnik, ujawnia, że chlorowodorek oktadecylotyrozyny (OTH) działa jako adiuwant po skompleksowaniu z anatoksyną tężca i szczepionką przeciwko wirusowi nagminnego porażenia dziecięcego typu I, II i III inaktywowaną formaliną. Również, Nixon-George i in. (ref. 61) donoszą, że estry oktodecylowe aminokwasów aromatycznych skompleksowane z rekombinowanym antygenem powierzchniowym wirusa zapalenia wątroby typu B zwiększają reakcję odpornościową gospodarza przeciwko temu wirusowi.

PRZYKŁADY

Powyższe ujawnienie opisuje ogólnie niniejszy wynalazek. Pełniej można go zrozumieć w odniesieniu do poniższych specyficznych przykładów. Przykłady te opisano jedynie w celu ilustracji, i nie jest zamiarem, aby ograniczały zakres wynalazku. Rozważa się zmiany dotyczące postaci i zastępowania równoważników jakie mogą się nasuwać i okazać korzystne. Chociaż w niniejszym opisie wykorzystuje się specyficzne terminy, terminy te wprowadzono w celach opisowych, a nie ograniczających.

Metody biochemii białek, fermentacji i immunologii, stosowane, ale nie opisane dokładnie w tym ujawnieniu i tych przykładach, są obszernie opisane w literaturze naukowej i pozostają w zakresie umiejętności specjalistów w tej dziedzinie.

Przykład 1

Przykład ten opisuje hodowlę Bordetella pertussis.

Materiał podstawowy:

Podstawowe hodowle szczepu Bordetella pertussis przechowywano jako zliofilizowane partie materiału w temperaturze od 2°C do 8°C.

Materiał roboczy:

Zliofilizowaną hodowlę reaktywowano w podłożu Homibrooka i stosowano do posiewu płytek z podłożem agarowym Bordeta-Gengou (BGA). Podłoże Homibrooka posiada następujący skład:

Składnik	na 1 litr
Hydrolizat kazeiny
(traktowany węglem drzewnym)	10,0 g
Kwas nikotynowy	0,001 g
Chlorek wapniowy	0,002 g
Chlorek sodowy	•5,0 g
Sześciowodzian chlorku magnezowego	0,025 g
Chlorek potasowy	0,200 g
Fosforan potasowy dwuzasadowy	0,250 g
Skrobia	i,0g
Woda destylowana	do 1,0 litra
pH doprowadza się do 6,9 1% roztworem węglanu sodowego. Podłoże rozmieszcza się

do probówek i wyjaławia przez ogrzewanie parą w autoklawie w ciągu 20 minut i autoklawowanie w ciągu 20 minut w temperaturze 121°C do 124°C. Materiał poddaje się 2-etapowej hodowli, najpierw na płytkach BGA, a następnie na podłożu agarowym do otrzymywania składników pałeczki krztuśca (CPA). Podłoże agarowe do otrzymywania składników pałeczki krztuśca (CPA) posiada następujący skład:

NaCl 2.5 g/litr

KH2P04 0,5 g/litr

KCl 0,2 g/litr

MgCl2 (H20)6 0,1 g/litr

Zasada Tris 1.5 g/litr

Hydrolizat kazeiny 10,0 g/litr

187 935 wodoroglutaminian sodowy

Stężony HC1

Agar

Czynniki wzrostowe (CPGF)

1001 gliitr do pH 7,2

15,0 glitrr 10,0 πιΙΙΙΠγ

Czynniki wzrostowe do otrzymywania składników pałeczki krztuśca (CPGF) - 100X posiadają następujący skład:

L-cysteina HC1 4,0 g/litr

Niacyna 0,4 g//itr

Kwas askorbinowy 440) g/Kli

Glutation, zredukowany 11,0 gg/lr

Fe2S04 -(H20)7 LOgglitr

Dimetylo-P-cyklodekstryna 100 g/litr

CaCl2 · (H20)2 2,0 ^/lit

Ostateczną hodowlę zawieszano w buforze do zawieszania pałeczek krztuśca (CPSB), rozdzielono na próbki o objętości 2 do 4 ml i przechowywano zamrożoną w temperaturze -60°C do -85°C. Bufor do zawieszania pałeczek krztuśca (PSSB) posiada następujący skład:

Hydrolizat kazeiny 10,0 g/hh·

Zasada Tris 1 ig/lir

Bezwodny glicerol 100 m/mr·

Stężony HCl do pH 7,2

Te glicerolowe zawiesiny zapewniały materiał wyjściowy do przygotowywania materiału roboczego.

Sposób hodowli:

Namnażanie materiału roboczego prowadzono w butelkach Rouxa z podłożem agarowym do otrzymywania składników pałeczki krztuśca w ciągu 4 do 7 dni w temperaturze 34°C do 38°C. Po tej hodowli komórki odmywano od agaru bulionem do otrzymywania składników pałeczki krztuśca (CBP). Z próbek hodowli wykonywano barwienie Grama i obserwowano je pod względem czystości i gęstości hodowli.

Komórki przenoszono do zawierających CPB kolb stożkowych o pojemności 4 litrów i inkubowano z wytrząsaniem w temperaturze 34°C do 38°C w ciągu 20 do 26 godzin. Z próbek wykonywano barwienie Grama i sprawdzano czystość hodowli. Zawartość kolb połączono i zawiesinę stosowano do zaszczepienia dwóch fermentorów zawierających CPB (objętość 10 litrów; wyjściowa gęstość optyczna: OD600 0,1-0,4). Materiał namnażano do końcowej gęstości optycznej, OD600 wynoszącej 5,0 do 10,0. Próbki testowano pod względem czystości hodowli przez barwienie Grama, testy ELISA specyficzne wobec i pod względem jałowości.

Przykład 2:

Przykład ten opisuje oczyszczanie antygenów z hodowli komórek Bordetella pertussis.

Wytwarzanie koncentratów brzeczki i komórek:

Zawiesinę bakteryjną namnażano w dwóch fermentorach produkcyjnych w temperaturze 34°C do 37°C w ciągu 35 do 50 godzin. Z fermentorów pobrano próbki do testowania jałowości podłóż. Zawiesinę podawano do piętrowej wirówki talerzowej o ciągłym przepływie (12000 x g) w celu oddzielenia komórek od brzeczki. Komórki zbierano do ekstrakcji składnika fimbrii. Sklarowany płyn przepuszczano przez sączek błonowy o średnicy porów < 0,22 gm. Przesączony płyn zatężano przez ultrafihrację stosując membranę o nominalnej granicy przepuszczalności masy cząsteczkowej (NMLW) 10 do 30 kDa. Koncentrat przechowywano do momentu rozdziału i oczyszczania składników toksyny krztuścowej (PT), hemaglutynina filamentowa (FHA) i białka 69 kDa (pertaktyny).

Rozdział składników brzeczki:

Składniki brzeczki (białko 69 kDa, PT i FHA) rozdzielano i oczyszczano przez chromatografię na perlicie i etapy selektywnej elucji, zasadniczo jak opisano w europejskim opisie patentowym numer 336 736 i opublikowanym przez zgłaszających zgłoszeniu PCT numer

187 935

WO 91/15505, opisanym powyżej. Wykonane szczegółowe operacje oczyszczania opisano poniżej.

Toksyna krztuścową (PT):

Kolumnę perlitu przemywano buforami 50 mM Tris, 50 mM Tris/0,5% Triton K-100 i 50 mM Tris. Frakcję PT eluowano z kolumny buforem 50 mM Tris/0,12 M NaCl.

Frakcję PT uzyskaną w wyniku chromatografii na perlicie nakładano na kolumnę hydroksyloapatytu i następnie przemywano 30 mM buforem fosforanów potasowych. PT eluowano buforem 75 mM fosforan potasowy/225 mM NaCl. Kolumnę przemywano 200 mM fosforanem potasowym/0,6 M NaCl dla otrzymania frakcji FHA, którą odrzucono. Do oczyszczonej PT dodawano glicerol do 50% i mieszaninę przechowywano w temperaturze 2°C do 8°C do czasu detoksykacji w ciągu jednego tygodnia.

Hemaglutynina filamentowa (FHA):

Frakcję FHA eluowano z kolumny perlitu 50 mM Tris/0,6 M NaCl. Hemaglutyninę filamentową oczyszczano przez chromatografię na hydroksyloapatycie. Frakcję FHA z kolumny perlitu nakładano na kolumnę hydroksyloapatytu i następnie przemywano 30 mM fosforanem potasowym zawierającym 0,5% Triton Χ-100, po czym 30 mM buforem fosforanów potasowych. Frakcję PT eluowano 85 mM buforem fosforanów potasowych i odrzucono. Następnie frakcję FHA eleuowano 200 mM fosforanem potasowym/0,6 M NaCl i przechowywano w temperaturze 2°C do 8°C do czasu detoksykacji, w ciągu jednego tygodnia.

Białko 69 kDa (pertaktyna):

Koncentrat brzeczki rozcieńczano wodą do iniekcji (WFI) do uzyskania przewodności 3 do 4 mS/cm i nakładano na kolumnę perlitu w ilości 0,5 do 3,5 mg białka na ml perlitu. Frakcję niezwiązaną (frakcję składnika 69 kDa) zatężano przez ultrafiltrację stosując membranę 0 NMWL 10 do 30 kDa. Do koncentratu frakcji niezwiązanej dodawano siarczan amonowy do 35% ± 3% (w/v) i otrzymywaną mieszaninę przechowywano w temperaturze 2°C do 8°C w ciągu 4 ± 2 dni lub natychmiast wirowano (7000 x g). Nadmiar supematantu dekantowano i wytrącony materiał zbierano przez odwirowanie (7000 x g). Osad białka 69 kDa albo przechowywano zamrożony w temperaturze -20°C do -30°C, albo rozpuszczano w buforze Tris lub fosforanowym i natychmiast stosowano.

Białko błony zewnętrznej 69 kDa otrzymane przez wytrącanie 35% (w/v) siarczanem amonowym zatężonej frakcji niezwiązanej na perlicie stosowano do oczyszczania. Do frakcji białka 69 kDa dodawano siarczan amonowy (100 ± 5 g na litr) i mieszaninę mieszano w ciągu co najmniej 2 godzin w temperaturze 2°C do 8°C. Mieszaninę odwirowywano (7000 x g) w celu odzyskania supematantu. Do supematantu dodawano siarczan amonowy (od 100 do 150 g na litr) i mieszaninę mieszano w ciągu co najmniej 2 godzin w temperaturze 2°C do 8°C. Mieszaninę odwirowywano (7000 x g) w celu odzyskania osadu, który rozpuszczano w 10 mM Tris HCl, pH 8. Siłę jonową roztworu doprowadzano do równoważnej 10 mM Tris HCl (pH 8) zawierającemu 15 mM siarczan amonowy.

Białko 69 kDa nakładano na kolumnę hydroksyloapatytu połączoną w układzie tandemowym z kolumną Q-Sepharose. Białko 69 kDa zbierano w wypływającej frakcji niezwiązanej, wypłukiwano z kolumn 10 mM Tris HCl (pH 8) zawierającym 15 mM siarczan amonowy i łączono z białkiem 69 kDa w wypływającej frakcji niezwiązanej. Pulę białka 69 kDa poddano diafiltracji 6 do 10 objętościami 10 mM fosforanu potasowego (pH 8) zawierającego 0,15 M NaCl na membranie o NMWL 100 do 300 kDa. Zbierano przesącz po ultrafiltracji i zatężano znajdujące się w nim białko 69 kDa.

Wymieniono rozpuszczalnik białka 69 kDa na 10 mM Tris HCl (pH 8) i adsorbowano na Q-Sepharose, przemywano 10 mM Tris HCl (pH 8)/5 mM siarczanem amonowym. Białko 69 kDa eluowano 50 mM fosforanem potasowym (pH 8). Białko 69 kDa poddano diafiltracji 6 do 10 objętościami 10 mM fosforanu potasowego (pH 8) zawierającego 0,15 M NaCl na membranie o NMWL 10 do 30 kDa. Białko 69 kDa przesączono w sterylnych warunkach przez sączek o średnicy porów < 0,22 pm. Ten jałowy materiał przechowywano w temperaturze 2°C do 8°C i w ciągu trzech miesięcy przeprowadzono adsorpcję.

187 935

Aglutynogeny fimbrii:

Aglutynogeny oczyszczano z masy komórkowej po wydzieleniu z brzeczki. Masę komórkową rozcieńczano do 0,05 objętości frakcji komórek w buforze zawierającym 10 mM fosforan potasowy, 150 mM NaCl i 4 M mocznik i mieszano w ciągu 30 minut. Lizat komórkowy klarowano przez wirowanie (12000 x g), następnie zateżano i poddawano diafiltracji wobec 10 mM fosforanu potasowego/150 mM NaCl/0,1% Triton-100 stosując sączek błonowy o NMWL 100 do 300 kDa.

Koncentrat ogrzewano w temperaturze 80°C w ciągu 30 minut, a następnie ponownie klarowano przez wirowanie (9000 x g). Do sklarowanego supematantu dodawano PEG 8000 do stężenia końcowego 4,5% ± 2% i delikatnie mieszano w ciągu minimum 30 minut. Uzyskany wytrącony materiał zbierano przez wirowanie (17000 x g) i osad ekstrahowano buforem 10 mM fosforan potasowy/150 mM NaCl w celu otrzymania nieoczyszczonego roztworu aglutynogenów fimbrii. Aglutynogeny fimbrii oczyszczano przez przepuszczanie przez PEIkrzemionkę. Stosując 1 M bufor fosforanów potasowych przygotowano 100 mM, w odniesieniu do fosforanu potasowego, nieoczyszczony i przepuszczano go przez kolumnę PEI-krzemionki.

Frakcje niezwiązane z kolumn zatężano i poddawano diafiltracji wobec buforu 10 mM fosforan potasowy/150 mM NaCl stosując sączek błonowy o NMWL 100 do 300 kDa. Ten jałowy materiał przechowuje się w temperaturze 2°C do 8°C i adsorpcję przeprowadzono w ciągu trzech miesięcy. Preparat aglutynogenów fimbrii zawierał Agg 2 fimbrii i Agg 3 fimbrii w stosunku wagowym od około 1,5 do około 2:1 i, jak stwierdzono, był zasadniczo wolny od Agg 1.

Przykład 3:

Przykład ten opisuje otrzymywania toksoidów oczyszczonych antygenów Bordetella pertussis, PT i FHA.

PT, przygotowaną w czystej postaci jak opisano w przykładzie 2, przeprowadzono w toksoid przez doprowadzanie stężenia glutaraldehydu w roztworze PT do 0,5% ± 0,1% i ^^owa^e w temperaturze 37°C ± 3°C w ciągu 4 godzin. Reakcję zatrzymywano przez dodanie L-asparaginianu do 0,21 ± 0,02 M. Mieszaninę utrzymywano następnie w temperaturze pokojowej w ciągu 1 ± 0,1 godziny, a następnie w temperaturze 2°C do 8°C w ciągu 1 do 7 dni.

Otrzymaną mieszaninę poddano diafiltracji wobec buforu 10 mM fosforan potasowy/0,15 M NaCl/5% glicerol na sączku błonowym o NMWL 30 kDa, a następnie wyjaławiano przez przepuszczanie przez sączek błonowy o średnicy porów < 0,22 pm. Ten jałowy materiał przechowywano w temperaturze 2°C do 8°C i adsorpcję przeprowadzono w ciągu trzech miesięcy.

Frakcję FHA, przygotowaną w czystej postaci jak opisano w przykładzie 2, przeprowadzono w toksoid przez doprowadzanie stężenia L-lizyny i formaldehydu odpowiednio do 47 ± 5 mM oraz 0,24 ± 0,05% i inkubowanie w temperaturze 37°C do 38°C w ciągu 6 tygodni. Następnie mieszaninę poddano diafiltracji wobec buforu 10 mM fosforan potasowy/0,5 M NaCl stosując sączek błonowy o NMWL 30 kDa i wyjaławiano przez przepuszczanie przez sączek błonowy. Ten jałowy materiał przechowywano w temperaturze 2°C do 8°C i adsorpcję przeprowadzono w ciągu trzech miesięcy.

Przykład 4:

Przykład ten opisuje adsorpcję oczyszczonych antygenów Bordetella pertussis.

W celu przeprowadzenia oddzielnej adsorpcji PT, FHA, Agg i białka 69 kDa na fosforanie glinowym (ałunie), przygotowano roztwór podstawowy fosforanu glinowego o stężeniu 18,75 + 1 mg/ml. Przygotowywano odpowiedni pojemnik i każdy z antygenów aseptycznie umieszczano w pojemniku. Aseptycznie dodawano 2-fenoksyetanol do osiągnięcia stężenia końcowego 0,6% ± 0,1% v/v i mieszano do homogenności. Do pojemnika aspeptycznie dodawano odpowiednią objętość fosforanu glinowego. Dodawano odpowiednią objętość jałowej wody destylowanej, aby doprowadzić stężenie końcowe do 3 mg fosforanu glinowego/ml. Pojemniki zatapiano oraz oznaczano i mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu 4 dni. Następnie pojemnik przechowywano do etapu tworzenia ostatecznej postaci preparatu.

Przykład 5:

Przykład ten opisuje tworzenie składnikowej szczepionki przeciw krztuścowi połączonej z toksoidami błoniczym i tężcowym.

187 935

Antygeny B. pertussis, przygotowane jak opisano w poprzednich przykładach, łączy się z toksoidami błoniczym i tężcowym w celu zapewnienia kilku składnikowych szczepionek przeciw krztuścowi (CP), jak opisano poniżej.

Składnik krztuścowy wytworzono z Bordetella pertussis namnażanej we wgłębnej hodowli, jak szczegółowo opisano w przykładach od 1 do 4 powyżej. Po zakońceniu wzrostu, brzeczkę hodowlaną i komórki bakteryjne rozdzielono przez wirowanie. Każdy antygen oczyszczono oddzielnie. Toksynę krztuścową (PT) i hemaglutyninę filamentową (FHA) oczyszczono z brzeczki przez kolejne chromatografie na perlicie i hydroksyloapatycie. PT detoksyfikowano glutaraldehydem, a wszelkie pozostałości PT (około 1⁰%) obecne we frakcji FHA detoksyfikowano formaldehydem. Aglutynogeny fimbrii (2+3) (AGG) przygotowano z komórek bakteryjnych. Komórki niszczono mocznikiem oraz ogrzewaniem i aglutynogeny fimbrii oczyszczono przez wytrącenie glikolem polietylenowym i chromatografię na polietylenoiminokrzemionce. Składnik białko 69 kDa (pertaktynę) wyizolowano z frakcji niezwiązanej z etapu chromatografii na perlicie (przykład 2) przez wytrącenie siarczanem amonowym i oczyszczono przez kolejne chromatografie na hydroksyloapatycie i Q-sepharose. Wyszystkie składniki wyjałowiono przez sączenie przez sączek błonowy o średnicy porów 0,22 μιη.

Toksoid błoniczy przygotowano z Corynebacterium diphtheriae namnażonego we wgłębnej hodowli standardowymi metodami. Wytwarzanie toksoidu błoniczego podzielone jest na pięć etapów, mianowicie utrzymywanie materiału roboczego, namnażanie Corynebacterium diphtheriae, zbieranie toksyny błoniczej, detoksyfikacja toksyny błoniczej i zatężanie toksoidu błoniczego.

Przygotowywanie toksoidu błoniczego:

(I) Materiał roboczy.

Szczep Corynebacterium diphtheriae utrzymywano jako zliofilizowane partie materiału. Zreaktywowany materiał namnażano na skosach agarowych z podłożem Loefflera w ciągu 18 do 24 godzin w temperaturze 35°C ± 2°C, a następnie przenoszono do kolb z podłożem dla maczugowca błonicy. Następnie hodowlę testowano pod względem czystości i zawartości Lf. Pozostały materiał bakteryjny stosowano do zaszczepienia fermentora.

(II) Namnażanie Corynebacterium diphtheriae.

Hodowlę inkubowano w temperaturze 35°C ± 2°C i mieszano w fermentorze. Do hodowli dodawano uprzednio określone ilości roztworów siarczanu żelazawego, chlorku wapniowego i fosforanu. Aktualne ilości każdego roztworu (fosforanu, siarczanu żelazawego, chlorku wapniowego) określano doświadczalnie dla każdej partii podłoża. Wybranymi poziomami są te, które dają najwyższą zawartość Lf. Po zakończeniu każdego cyklu namnażania (30 do 50 godzin), z hodowli pobierano próbki w celu określenia czystości i zawartości Lf.

pH doprowadzano wodorowęglanem sodowym i hodowlę inaktywowano 0,4% toluenem w ciągu 1 godziny utrzymując temperaturę 35°C ± 2°C. Następnie przeprowadzano test jałowości w celu potwierdzenie nieobecności żywych C. diphtheriae.

(III) Zbieranie toksyny błoniczej.

Traktowane toluenem hodowle z jednego lub kilku fermentorów łączono w dużym tanku. Dodawano około 0,12% dwuwęglanu sodowego, 0,25% węgla drzewnego i 23% siarczanu amonowego i testowano pH.

Mieszaninę mieszano w ciągu około 30 minut. Dodawano ziemię okrzemkową, i mieszaninę pompowano na filtr do głębokiej filtracji. Przesącz poddawano recylkulacji do sklarowania, następnie zbierano i pobierano próbki do testowania zawartości Lf. Do przesączu dodawano dodatkowy siarczan amonowy w celu uzyskania stężenia 40%. Dodawano również ziemię okrzemkową. Mieszaninę tę utrzymywano w ciągu 3 do 4 dni w temperaturze 2°C do 8°C dla umożliwienia osadzenia się wytrąconego materiału. Wytrąconą toksynę zbierano i rozpuszczano w 0,9% soli. Ziemię okrzemkową usuwano przez sączenie i toksynę dializowano wobec 0,9% soli w celu usunięcia siarczanu amonowego. Dializowaną toksynę łączono i pobierano próbki do testowania zawartości Lf i czystości.

(IV) Detoksyfikacja toksyny błoniczej.

Detoksyfikacja ma miejsce bezpośrednio po dializie. Do detoksyfikacji toksynę rozcieńczano tak, aby roztwór końcowy zawierał:

187 935

a) toksynę błoniczą w stężeniu 1000 ± 10% Lf/ml.

b) 0,5% wodorowęglan sodowy

c) 0,5% formalinę

d) 0,9% w/v mroochloaowrdoaek L-lizyny

Objętość roztworu uzupełniano solą fizjologiczną i pH doprowadzano do 7,6 ± 0,1.

Toksoid sączono przez filtry z celulozy i ziemi okrzemkowej i/lub prefiltr błonowy oraz sączek błonowy o średnicy porów 0,2 pm do naczynia zbiorczego i inkubowano w ciągu 5 do 7 tygodni w temperaturze 34°C. Pobierano próbkę do testowania toksyczności.

(V) /attężannie oczyszczonego toksoidu.

Toksoidy łączono, następnie zatężano przez ultrafiltrację i zbierano w odpowiednim pojemniku. Pobierano próbki do testowania zawartości Lf i czystości. Dodawano środek konserwujący (2-0eooksyetaool) do uzyskania stężenia końcowego 0,375% i pH doprowadzano do wartości od 6,6 do 7,6.

Toksoid wyjaławiano przez sączenie przez prefiltr i filtr błonowy o średnicy porów 0,2 pm (lub równoważny) i zbierano. Z jałowego toksoidu pobierano następnie próbki do testowania nieodwracalności zawartości Lf toksoidu, zawartości środka konserwującego, czystości (zawartości azotu), jałowości i toksyczności. Jałowy zatężony toksoid przechowywano w temperaturze 2°C do 8°C do etapu tworzenia ostatecznej postaci preparatu.

Przygotowywanie toksoidu tężcowego.

Toksoid tężcowy (T) przygotowywano z Clostridium tetani namnażanego we wgłębnej hodowli.

Wytwarzanie toksoidu tężcowego można podzielić na pięć etapów, mianowicie utrzymywanie materiału roboczego, namnażanie Clostridium tetani, zbieranie toksyny tężcowej, detoksyfikacja toksyny tężcowej i oczyszczanie toksoidu tężcowego.

(I) Materiał roboczy.

Szczep Clostridium tetani stosowany do wytwarzania toksyny tężcowej do przekształcania w toksoid tężcowy utrzymywano w postaci /.liofilizowanych partii materiału. Materiałem zaszepiano podłoże tioglikrlaorwe i umożliwiano wzrost w ciągu około 24 godzin w temperaturze 35°C ± 2°C. Pobierano próbkę do testowania czystości hodowli.

(II) Namnażanie Clostridium tetani.

Podłoże dla laseczki tężca umieszczano w fer-mentorze, poddawano obróbce cieplnej i schładzano. Fermentor następnie iookulrwano i hodowli umożliwiano wzrost w ciągu 4 do 9 dni w temperaturze 34°C ± 2°C. Pobierano próbkę do testowania czystości hodowli i zawartości Lf.

(III) Zbieranie toksyny tężcowej.

Toksynę wydzielano przez sączenie przez filtry z celulozy i ziemi okrzemkowej i sklarowaną toksynę następnie wyjaławiano przez sączenie stosując sączki błonowe. Pobierano próbki do testowania zawartości Lf i jałowości. Toksynę zatężano przez ultrafiltrację stosując sączek o wielkości porów 30000 daltonów.

(IV) Detoksyfikacja toksyny tężcowej.

Przed detoksyfikacją pobierano próbki toksyny do testowania zawartości Lf. Zatężoną toksynę (475 do 525 Lf/ml) detoksyfikowano przez dodanie 0,5% w/v wodorowęglanu sodowego, 0,3% v/v formaliny i 0,9% w/v monochlrrowodorku L-lizyny i uzupełnienie objętości solą fizjologiczną. pH doprowadzano do 7,5 ± 0,1 i mieszaninę inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu 20 do 30 dni. Pobierano próbki do testowania jałowości i toksyczności.

(V) Oczyszczanie toksoidu.

Zatężony toksoid wyjaławiano przez sączenie przez prefiltry, a następnie sączki błonowe o średnicy porów 0,2 pm. Pobierano próbki do testowania jałowości i zawartości Lf.

Optymalne stężenie siarczanu amonowego określano na podstawie krzywej frakcjonowania „S” dla toksoidu. Do toksoidu (rozcieńczonego do 1900-2100 Lf/ml) dodawano pierwsze stężenie. Mieszaninę utrzymywano w ciągu co najmniej 1 godziny w temperaturze 20°C do 25°C i zbierano supernatant, a wytrącony materiał zawierający frakcję o wysokich masach cząsteczkowych odrzucano.

Do supematantu dodawano drugie stężenie siarczanu amonowego w celu drugiego frakcjonowania dla usunięcia zanieczyszczeń o niskich masach cząsteczkowych. Mieszaninę

187 935 utrzymywano w ciągu co najmniej 2 godzin w temperaturze 20°C do 25°C, a następnie można ją było utrzymywać w temperaturze 2°C do 8°C w ciągu maksimum trzech dni. Wytrącony materiał, który stanowił oczyszczony toksoid, zbierano przez wirowanie i sączenie.

Siarczan amonowy usuwano z oczyszczonego toksoidu przez diafiltrację stosując membrany ultrafiltracyjne Amicon (lub równoważne) PBS dotąd, aż w roztworze toksoidu nie można było więcej wykryć siarczanu amonowego. pH doprowadzano do wartości od 6,6 do 7,6 i dodawano 2-fenoksyetanol do stężenia końcowego 0,375%. Toksoid wyjaławiano przez filtrację membranową i pobierano próbki do testowania (nieodwracalności toksoidu, zawartości Lf, pH, zawartości środka konserwującego, czystości, jałowości i toksyczności).

Tworzenie multiwalentnej szczepionki.

Jedną z postaci składnikowej szczepionki przeciw krztuścowi połączoną z toksoidami błoniczym i tężcowym nazwano CP10/5/5/3DT (niekiedy nazywaną KLASYCZNĄ). Każdą dawkę dla człowieka o objętości 0,5 ml utworzono tak, aby zawierała:

pg toksoidu krztuścowego (PT) pg hemaglutyniny filamentowej (FHA) pg aglutynogenów fimbrii 2 i 3 (FIMB) pg białka błony zewnętrznej 69 kDa

Lf toksoidu błoniczego

Lf toksoidu tężcowego

1.5 mg fosforanu glinowego

0,6% 2-fenoksyetanolu jako środka konserwującego.

Inną postać składnikowej szczepionki przeciw krztuścowi połączoną z toksoidami błoniczym i tężcowym nazwano CP10/5/5DT (niekiedy nazywaną. HYBRYDOWĄ). Każdą dawkę CP10/5/5DT dla człowieka o objętości 0,5 ml utworzono tak, aby zawierała:

pg toksoidu krztuścowego (PT) pg hemaglutyniny filamentowej (FHA) pg aglutynogenów fimbrii 2 i 3 (FIMB)

Lf toksoidu błoniczego

Lf toksoidu tężcowego

1.5 mg fosforanu glinowego

0,6% 2-fenoksyetanolu jako środka konserwującego.

Inną postać składnikowej szczepionki przeciw krztuścowi połączoną z toksoidami błoniczym i tężcowym nazwano CP2c/2c/5/3DT. Każdą dawkę 0^20/20/5/307^- dla człowieka o objętości 0,5 ml utworzono tak, aby zawierała:

pg toksoidu krztuścowego (PT) pg hemaglutyniny filamentowej (FHA) pg aglutynogenów fimbrii 2 i 3 (FIMB) pp giaika błony yewnętrtnej 6 9 kDa 15 Lf toksoidu błoniczego

Lf toksoidu łężcowego

1.5 mg fosforanu glinowego

0,6% 2-fengksyetknolu jako środka konserwującego.

187 935

Kolejną postać składnikowej szczepionki przeciw krztuścowi połączoną z toksoidami błoniczym i tężcowym nazwano CP20/10/K06DT. Każdą dawkę CP20/10/10/6DT dla człowieka o objętości 0,5 ml utworzono tak, aby zawierała:

pg toksoidu krztuścowego (PT) pg hemaglutyniny filamentowej (FHA) pg aglutynogenów fimbrii 2 i 3 (FIMB) pg Nidka błony zeewiętrznej 66) kDa

Lf toksoidu błoniczego 5 Lf toksoidu tężcowego

1,5 mg fosforanu glinowego 0,6% 2-fenoksyetanolu jako środka konserwującego

Przykład 6:

Przykład ten opisuje kliniczną ocenę składnikowych bezkomórkowych szczepionek przeciw krztuścowi.

(a) Badania na dorosłych.

Badania na dorosłych i dzieciach w wieku 16 do 20 miesięcy wskazywały, że wieloskładnikowe szczepionki zawierające aglutynogeny fimbrii są bezpieczne i immunogenne (tabela 2).

Badania kliniczne I fazy przeprowadzono na dzieciach w wieku 17 i 18 miesięcy w Calgary, Alberta stosując pięcioskładnikową szczepionką przeciw krztuścowi (CP10/5/53DT) i rejestrowano reakcję uboczną. Szczepionkę otrzymało trzydzieści troje dzieci, a dodatkowych 35 otrzymało tę samą szczepionkę bez składnika białka 69 kDa.

Reakcje miejscowe były rzadkie. Ogólnoustrójowe reakcje uboczne, przede wszystkim polegające na pobudliwości występowały u około połowy uczestników badań, bez względu na podawaną szczepionkę. W enzymatycznym oznaczeniu immunologicznym stwierdzono znaczące wzrosty ilości przeciwciał IgG skierowanych przeciw PT, FHA, aglutynogenom fimbrii i białku 69 kDa, a w teście neutralizacji komórek CHO przeciwciał skierowanych przeciw PT. Nie stwierdzono żadnych różnic w odpowiedzi humoralnej, z wyjątkiem przeciwciał skierowanych przeciw białku 69 kDa, u dzieci, które otrzymały czteroskładmkową(CPio/5/5DT) lub pięcioskładnikową szczepionkę (CP10/5/5/3DT). Dzieci, które otrzymały pięcioskładnikową szczepionkę zawierającą białko 69 kDa posiadały po immunizacji znacząco wyższy poziom przeciwciał skierowanych przeciw białku 69 kDa.

Badania dawka-odpowiedź dla czteroskładnikowej szczepionki podjęto w Winnipeg, Manitoba, Kanada. Zastosowano dwie postacie szczepionki składnikowej: CP10/5/5/3DT i CP20/10/10/6DT. Jako kontrolę włączono również pełnokomórkową szczepionkę DPT.

Badania te były badaniami z podwójnie ślepą próbą przeprowadzonymi na 91 niemowlętach w wieku 17 do 19 miesięcy w czasie ich dawki przypominającej szczepionki przeciw krztuścowi. Dzieci te dobrze tolerowały zarówno CP10/5/5/3DT, jak i CP20/10/10/6DT. Nie wykazano żadnych różnic w liczbie dzieci, które wykazywały jakąkolwiek reakcję miejscową lub reakcje ogólnoustrójowe po żadnej z szczepionek składnikowych. W przeciwieństwie, znacząco więcej dzieci, które otrzymały szczepionkę pełnokomórkową, wykazywało reakcje miejscowe i ogólnoustrojowe, niż te, które otrzymały szczepionki składnikowe CP20/10/10/6DT.

Badania na niemowlętach:

Fazaj I1: f tza α i

Badania przeprowadzono stosując szczepionkę CP1035/5/3OT w Calgary, Alberta i British Columbia, Kanada. W badaniach tych 432 dzieci otrzymało składnikową szczepionkę przeciw krztuścowi lub pełnokomórkową szczepionkę kontrolną DPT w 2, 4 i 6 miesiącach życia. Niemowlęta te dobrze tolerowały szczepionkę CP o/f/ADT. Po każdej dawce reakcje miejscowe były mniej powszechne dla szczepionki składnikowej niż szczepionki pełnokomórkowej.

187 935

Po szczepieniu składnikową szczepionką przeciw krztuścowi wykazano znaczącą odpowiedź humoralną na wszystkie antygeny. Biorcy szczepionki pełnokomórkowej wykazywali silną odpowiedź humoralną na aglutynogeny fimbrii, D i T. W siódmym miesiącu 82% do 89% biorców szczepionki składnikowej i 92% biorców szczepionki pełnokomórkowej wykazywało czterokrotny lub wyższy wzrost miana przeciwciał skierowanych przeciw aglutynogenom fimbrii. W przeciwieństwie, odpowiedź humoralna na FHA wynosiła 75% do 78% u biorców szczepionek składnikowych w porównaniu z 31% u biorców szczepionki pełnokomórkowej. Czterokrotny wzrost przeciwciał skierowanych przeciw białku 69 kDa był widoczny u 90% do 93% biorców szczepionek składnikowych i 75% biorców szczepionek pełnokomórkowych. Czterokrotny wzrost przeciwciał skierowanych przeciw PT w enzymatycznym oznaczeniu imunologicznym był widoczny u 40% do 49% biorców szczepionek składnikowych i 32% biorców szczepionek pełnokomórkowych; czterokrotny wzrost pod względem neutralizacji CHO stwierdzono u 55% do 69% biorców szczepionek składnikowych i 6% biorców szczepionek pełnokomórkowych. (tabela 2).

Faza IIB:

Szczepionki CP20/20/5/3DT i CP10/10/5/3DT oceniano na 100 niemowlętach w 2, 4 i 6 miesiącach życia, w losowych badaniach ze ślepą próbą w stosunku do kontroli D15PT o niższej zawartości toksoidu błoniczego - 15 Lf w porównaniu z preparatem zawierającym 25 Lf. Nie wykryto żadnych różnic w częstości reakcji ubocznych pomiędzy dwiema postaciami szczepionki składnikowej; obie były znacząco mniej reaktogenne od pełnokomórkowej kontroli. Wyższe miana przeciwciał skierowanych przeciw PT w enzymatycznym oznaczeniu immunologicznym i neutralizacji CHO oraz skierowanych przeciw FHA uzyskano u biorców szczepionki CP2o/2o/5/3DT o podwyższonej zawartości antygenów W 7 miesiącu średnia geometryczna miana przeciwciał skierowanych przeciw FHA wynosiła 95,0 u biorców szczepionki CP20/20/5/3DT, 45,2 u biorców CP10/5/5/3DT i tylko 8,9 u biorców D15PT. Miana przeciwciał skierowanych przeciw PT wynosiły odpowiednio 133,3, 58,4 i 10,4 w oznaczeniu immunologicznym i 82,4, 32,7 i 4,0 w oznaczeniu neutralizacji CHO (tabela 2).

Badania te wykazały, że składnikowa szczepionka przeciw krztuścowi połączona z zadsorbowanymi toksoidami błoniczym i tężcowym, o zwiększonej zawartości antygenów, była bezpieczna i immunogenna u niemowląt, oraz że zwiększona zawartość antygenów powodowała wzrost odpowiedzi immunologicznej na przygotowane antygeny (PT i FHA) bez zwiększenia reaktogenności.

NIAID, FAZA IL, próba porównawcza w Stanach Zjednoczonych Ameryki:

Badania fazy II przeprowadzono w Stanach Zjednoczonych Ameryki pod patronatem National Institute of Allergy and Infectious Tiseases (NIAID) jako wstęp do prób skuteczności bezkomórkowych szczepionek przeciw krztuścowi na dużą skalę. Do tej próby włączono jedną, składnikową szczepionkę przeciw krztuścowi według wynalazku połączoną z zadsorbowanymi toksoidami błoniczym i tężcowym (CP10/5/5/3DT), wraz z 12 innymi szczepionkami bezkomórkowymi i 2 szczepionkami pełnokomórkowymi. Wyniki bezpieczeństwa rejestrowano dla 137 dzieci immunizowanych w 2, 4 i 6 miesiącach życia szczepionką składnikową CP10/5/5/3DT.

Jak wykazano w poprzednich badaniach, stwierdzono, że szczepionka składnikowa jest bezpieczna, o niskiej reaktogenności i jest dobrze tolerowana przez biorców.

W 7 miesiącu, wszystkie przeciwciała skierowane przeciw PT, przeciwciała skierowane przeciw FHA, przeciwciała skierowane przeciw białku 69 kDa i przeciwciała skierowane przeciw aglutynogenom fimbrii były wyższe lub równoważne poziomom osiąganym po szczepionkach pełnokomórkowych (odnośnik 71 i tabela 2). Przeprowadzono badania z podwójnie ślepą próbą, w których dzieci losowo wyznaczono do otrzymania albo szczepionki CP20/20/5/3DT albo CP10/5/5/3DT. Łącznie w badaniach w Stanach Zjednoczonych Ameryki i Kanadzie wzięło udział 2050 niemowląt; 1961 niemowląt ukończyło badania. Obie postacie szczepionki okazały się dla tych niemowląt bezpieczne, o niskiej reaktogenności i immunogenne. Immunogenność oceniano w podgrupie liczącej 292 niemowlęta. Obie postacie szczepionki wywoływały wzrost przeciwciał dla wszystkich antygenów zawartych w szczepionce. Preparat szczepionki CP20/20/5/3DT indukował wyższe miana przeciwciał skierowanych przeciw FHA,

187 935 ale nie PT. Preparat szczepionki CP105/5/3DT wywoływał wyższe miana przeciw fmbriom i wyższe miana przeciw aglutynogenom.

Dalsze badania bezpieczeństwa i immunogenności przeprowadzono we Francji. Plan badań był podobny do opisanych powyżej badań w Ameryce Północnej z wyjątkiem tego, że szczepionki podawano w 2, 3 i 4 miesiącach życia. Miejscowe i ogólnoustrojowe reakcje były na ogół bardzo niewielkie. Ogólnie rzecz biorąc szczepionka była dobrze akceptowana przez uczestników badań we Francji, przy stosowaniu tego reżimu podawania.

Próba skuteczności z kontrola placebo dwóch bezkomórkowych szczepionek przeciw krztuścowi i pełnokomórkowei szczepionki u 10000 niemowląt.

Na podstawie wyników próby porównawczej fazy II przeprowadzonej pod patronatem NIAID w Stanach Zjednoczonych Ameryki, do wieloośrodkowych, kontrolowanych, podwójnie losowych prób skuteczności z kontrolą placebo wybrano dwuskładnikową i pięcioskładnikową bezkomórkową szczepionkę. Próbę kliniczną przeprowadzono w Szwecji, gdzie występuje wysoka zachorowalność na krztusiec. Dwuskładnikowa szczepionka zawierała PT inaktywowaną aldehydem glicerynowym i formaliną (25 pg), FHA traktowaną formaliną (25 pg) oraz 17 Lf toksoidu błoniczego i 10 Lf toksoidu tężcowego, pięcioskładnikową szczepionką przeciw krztuścowi była CPk)/5/5/3DT. Do próby włączono dziesięć tysięcy niemowląt, co stanowi około połowy niemowląt w tej grupie wiekowej w Szwecji, w 14 geograficznie określonych miejscach badań, wykorzystując rejestr urodzeń.

Dzieci urodzone w styczniu i lutym 1992 r. wzięły udział w 3-kierunkowej losowej próbie. Po zgodzie rodziców, dwie trzecie niemowląt otrzymało jeden z dwóch bezkomórkowych preparatów przeciw błonicy, tężcowi i krztuścowi w drugim, czwartym i szóstym miesiącach życia. Grupa kontrolna otrzymywała tylko DT. W maju 1992 r. wprowadzono licencjonowaną amerykańską komercjalnie dostępną pełnokomórkową szczepionkę DTP i dzieci urodzone od marca do grudnia 1992 r. wzięły udział w 4-kierunkowej losowej próbie. Po zgodzie rodziców, trzy czwarte niemowląt otrzymało jeden z trzech preparatów DTP w drugim, czwartym i szóstym miesiącach życia. Grupa kontrolna otrzymywała tylko DT.

Każdą szczepionkę podano około 2500 dzieciom. Szczepionki podawano w trzech dawkach. Pierwszą dawkę podawano w 2 miesiącu życia i nie później niż w 3 miesiącu życia. Kolejne dawki podawano w 8-tygodniowych odstępach. Szczepionki podawano przez iniekcje domięśniowe.

Dzieci i ich rodziny obserwowano w ciągu 30 miesięcy. Jeśli podejrzewano krztusiec, zbierano dane kliniczne i przeprowadzano konieczną weryfikację laboratoryjną przez aspirację nosową do hodowli bakteriologicznej i diagnozy metodą łańcuchowej reakcji polimerazy. Do diagnozy serologicznej zbierano próbki krwi zarówno pobierano w ostrym stadium choroby jak i podczas rekonwalescencji.

Przed tymi badaniami, nie była znana ilość pertaktyny dostarczanej przez składnikowe szczepionki przeciw krztuścowi według niniejszego wynalazku w ludzkiej populacji grupy ryzyka (szczególnie noworodków). W szczególności, nie był znany udział różnych składników Bordetella i ich obecności w szczepionkach przeciw krztuścowi w wybranych względnych ilościach do uzyskania skutecznych szczepionek.

Głównym celem próby było oszacowanie zdolności bezkomórkowych szczepionek przeciw krztuścowi i szczepionki pełnokomórkowej do ochrony przeciw typowemu krztuścowi w porównaniu z placebo.

Drugim celem było zbadanie skuteczności szczepionki w przypadku potwierdzonej infekcji krztuścowej o różnym stopniu ciężkości.

Skuteczność szczepionki określa się jako procent zmniejszenia prawdopodobieństwa zachorowania na krztusiec wsrod biorcow w stosunku do dzieci meszczepionych.

Względne ryzyko wystąpienia krztuśca w dwóch grupach szczepionek wyraża się jako stosunek prawdopodobieństwa choroby w dwóch grupach.

Prawdopodobieństwo zachorowania na krztusiec, nazywane również częstością ataku choroby, można oceniać na różne sposoby. W obliczeniach wielkości próbki prawdopodobieństwo zachorowania na krztusiec w danej badanej grupie określa się jako iloraz liczby dzieci z krztuścem i dzieci pozostających w badanej grupie w chwili zakończenia badania.

187 935

Skuteczność składnikowej szczepionki CP10/5/5/3DT w tej próbie w zapobieganiu typowemu krztuścowi przedstawiono w tabeli 4 i wynosiła ona około 85%. W tej samej próbie dwuskładnikowa bezkomórkowa szczepionka przeciw krztuścowi zawierająca tylko PT i FHA była skuteczna tylko w koło 58%, a szczepionka pełnokomórkowa była skuteczna w około 48%. CP10/5/5/3DT była również skuteczna w zapobieganiu krztuścowi o łagodnym przebiegu i jej skuteczność oszacowano na około 77%.

Przykład 7:

Przykład ten opisuje tworzenie i immunogenność multiwalentnej kombinacji szczepionki zawierającej otoczkowy polisacharyd Haemophilus influenzae.

(a) Przygotowywanie składnika PRI+T.

Otoczkowy polisacharyd (RPR) z H. influenzae oczyszczono i skoniugowano z toksoidem tężcowym w następujący sposób. Z ampułek ze zliofilizowanym materiałem roboczym H. influenzae, wykonano trzy kolejne hodowle wstępne. Pierwszą hodowlę wstępną przeprowadzono na podłożu stałym. Zawartością ampułek zaszczepiono szalki z podłożem agarowym z węglem drzewnym i zagotowaną krwią (10% krew końska ogrzewana w ciągu 15 minut w temperaturze 80°C) i inkubowano w ciągu 20 ± 4 godzin w temperaturze 36°C do37°C w atmosferze CO₂. Drugą hodowlę wstępną prowadzono w podłożu płynnym w ciągu 8 godzin w temperaturze 37°C. Podłoże płynne posiadało następujący skład na litr:

Hydrolizat kazeiny Difco	10 g
Fosforan monosodowy 2H2O	2,03 g
Fosforan disodowy 12H2	31,14 g
Mleczan sodowy (60% roztwór)	15 ml
L-cysteina	0,07 g
L-tryptofany	0,02 g
CaCl2, 2H20	0,02 g
(NH4)2S04	1 g
MgS(04, 7H20 Środek przeciwpieniący Dow Corning M.S.A.	0,4 g
25% stężeniu w oleju parafinowym	0,15 ml

2. Przesącz po ultrafiltracji heksaminy + dekstrozy w stosunku 20 g dekstrozy i 1 mg heksaminy. Roztwór ten dodaje się z 5 mg dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego. Sterylizowany przez filtrację.

3. Ekstrakt drożdżowy Difco 5 g

Sterylizowany przez filtrację.

Trzecią hodowlę wstępną prowadzono w podłożu płynnym z mieszaniem w ciągu 4 godzin w temperaturze 37°C. Trzecią hodowlę wstępną stosowano do inokulacji fermentora i hodowlę utrzymywano, z mieszaniem, w temperaturze 37°C w ciągu 12 do 14 godzin. Hodowlę zbierano w chłodzonym tanku. Dodawano formalinę w stężeniu 10 ml/litr. Hodowlę utrzymywano, z delikatnym mieszaniem, w temperaturze + 4°C w ciągu 2-24 godzin, a następnie wirowano. Formalinę dodawano nie w zamiarze całkowitej inaktywacji bakterii, ale dla powstrzymania wzrostu i zahamowania metabolizmu. Dodawanie to zmniejszało lizę komórek z powstającym w konsekwencji zanieczyszczaniem składnikami wewnadrzyomórkonymi. Czas trwania tego utrwalania wynosił pomiędzy 2 a 24 godzinami, a zazwyczaj hodowlę pozostawia się na noc przed wirowaniem. Supernatant zawierający polisacharyd zbierano, a osad bakteryjny odrzucano. Proces oczyszczania prowadzono generalnie w chłodni lub w takich warunkach, aby temperatura produktów i odczynników była niższa lub równa + 10°C, z wyjątkiem etapu oczyszczania fenolem, który prowadzono w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu hodowli zatężano supernatant hodowlany. Polisacharyd otoczkowy wytrącano z powstającego w wyniku koncentratu przez dodanie centrimidu do uzyskania stężenia końcowego 5% w/v. Wytrącono PS centrimidem z zatężonego płynu (SNF). Część białek, kwasów nukleinowych i lipopolisacharydów (LPS) również ulegała wytrąceniu. Wytrącony materiał zbierano przez wirowanie, pozostawiając niektóre inne zanieczyszczenia i białka w SNF. Otrzymywany w wyniku osad zbierano przez wirowanie i przechowywano w temperaturze < -20°C.

187 935

Osady zawieszano ponownie w 0,3 M roztworze NaCl i zawiesinę ponownie wirowano. NaCl selektywnie dysocjował kompleksy polisacharyd-centrimid. W procesie tym dysocjacji ulegały również niektóre inne zanieczyszczenia (kwasy nukleinowe, LPS, białka). Do supernatantu dodawano uprzednio schłodzony etanol bezwodny do 60% stężenia końcowego. Powstający w wyniku wytrącony materiał zbierano przez wirowanie i przemywano zimnym etanolem bezwodnym. Wytrącony materiał suszono pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 0-4°C i był on produktem pośrednim. Produkt pośredni rozpuszczano w buforze octanu sodowego z fenolem w temperaturze pokojowej. Fazę wodną zbierano przez ciągłe wirowanie. Ekstrakcję fenolem i wirowanie można powtarzać kilka razy i fazę wodną dializowano i poddawano diafiltracji. Polisacharyd otoczkowy z roztworu po diafiltracji wytrącano przez dodanie uprzednio schłodzonego etanolu do 60% stężenia końcowego w obecności 0,3 M NaCl. Wytrącony materiał zbierano przez wirowanie, wytrącano uprzednio schłodzonym etanolem bezwodnym, acetonem i eterem i suszono pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 4°C. Wysuszony wytrącony materiał następnie rozcierano na drobny proszek w warunkach niskiej wilgotności i produkt ten stanowi oczyszczony polisacharyd typu b Haemophilus influenzaa.

Oczyszczony polisacharyd rozpuszczano w wodzie w celu uzyskania 5 mg polisacharydu na ml roztworu i pH doprowadzano NaOH do 10,8 ± 0,2. Dodawano bromku cyjanu w postaci roztworu w wodzie w stosunku 0,5 mg CNBr/ mg polisacharydu. pH mieszaniny reakcyjnej utrzymywano NaOH na poziomie 10,8 ± 0,2 w ciągu 35 do 40 minut w temperaturze 23°C ± 3°C. pH obniżano do 9 przez dodanie HC1. Dodawano dwuhydrazyd kwasu adypinowego do uzyskania stężenia końcowego 3,5 mg ADH/mg polisacharydu i pH doprowadzano do 8,5. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 23°C ± 3°C w ciągu 15 minut (utrzymując pH 8,5), a następnie roztwór inkubowano przez noc w temperaturze + 4°C z delikatnym mieszaniem. Mieszaninę reakcyjną dializowano wobec roztworu NaCl, a następnie zatężano. Roztwór filtrowano następnie przez sączek o średnicy porów 0,45 μ i zamrażano w temperaturze < -40°C. Stanowi on AH-polisacharyd i przechowywano go w temperaturze < -40°C.

W celu wytworzenia składnika - toksoidu tężcowego, szczepem Clostridium tetani zaszczepiono szereg probówek zawierających 10 ml podłoża Rosenowa lub podłoża tioglikolanowego. Podłoże Rosenowa posiada następujący skład:

Skład (w gramach na litr wody destylowanej)

Pepton 10

Ekstrakt mięsny 3

Glukoza 2

Chlorek sodowy 5

Wskaźnik „Andrade” (5% fuksyna kwasowa) 1010 1

Biały marmur 1 kawaaek

Mózg 1 Isaawuałe:

Podłoże, przygotowane bezpośrednio przed stosowaniem z produktów gotowych do użycia rozmieszczono do probówek i wyjaławiano w temperaturze 120°C w ciągu 20 minut.

Butelki o pojemności 5 litrów, zawierającą 3 litry podłoża „Massachusetts”, inokulowano C. tetani i inkubowano w ciągu 16 do 18 godzin w temperaturze 35°C ± 1°C. Następnie zawartość przenoszono do butelki o pojemności 20 litrów, zawierającej 15 litrów jałowego podłoża „Massachusetts” i inkubowano w ciągu 8 godzin w temperaturze 35°C ± 1°C. Każdą z butelek stosowano do inokulacji fermentora zawierającego 582 litry podłoża „Massachusetts” i inkubowano w temperaturze 35°C w ciągu 5 do 6 dni z napowietrzaniem. Fermentory ochładzano i do hodowli dodawano 12 kg chlorku sodowego i 8 kg cytrynianu trójsodowego. Mieszanie utrzymywano w ciągu jednego dnia, a następnie zatrzymywano i proces ten umożliwiał ekstrakcję pozostałej toksyny z bakterii w końcowym etapie hodowli. Toksynę klarowano albo przez sączenie, albo przez przepuszczanie przez wirówkę o ciągłym przepływie.

Supernatant z hodowli o objętości 1200 litrów zatężano przez ultrafiltrację i zatężoną toksynę poddawano diafiltracji wobec 0,07 M roztworu fosforanu dwusodowego o pH 8,2. Objętość końcową doprowadzano do 500 Lf/m.

187 935

W celu otrzymania oczyszczonej toksyny tężcowej prowadzono dwukrotne wytrącanie siarczanem amonowym. A zatem, powoli dodawano siarczan amonowy i 10 g węgla drzewnego na litr uzyskanej uprzednio w wyniku diafiltracji tosyny. Po inkubacji w ciągu 16 do 24 godzin w temperaturze +4°C, toksynę sączono przez wkłady filtrujące w celu wyeliminowania wytrąconego materiału. Następnie powoli dodawano na litr uprzednio uzyskanego supematantu ilość siarczanu amonowego wystarczającą do uzyskania stężenia 320 g/litr. Po 48 godzinach w temperaturze +4°C osad zbierano przez wirowanie i rozpuszczano w 0,05 M roztworze fosforanu dwusodowego o pH 8,2. Roztwór poddawano diafiltracji wobec 0,05 M roztworu fosforanu dwusodowego o pH 8,2 i doprowadzano do 300 Lf/ml. Następnie roztwór sterylizowano przez filtrację. Na ml roztworu toksyny dodawano 7,5 umoli (0,225%) formaldehydu. Detoksyfikację uzyskiwano po inkubacji w ciągu 24 dni w temperaturze +37°C, obejmującej okresy przejściowe w temperaturach +4°C i +22°C. W celu uzyskania toskoidu tężcowego prowadzono wyjaławianie przez sączenie. Toksoid tężcowy dializowano i zatężano wobec NaCl stosując membranę o granicy przepuszczalności masy cząsteczkowej < 50 000. Zatężone białko następnie aseptycznie sączono i przechowywano w temperaturze +4°C.

Równe ilości AH-polisacharydu i toksoidu tężcowego (± 20%) mieszano z 0,05 M NaCl do uzyskania stężenia 7,5 mg polisacharydu na ml. pH roztworu doprowadzano HCl do 5,7 + 0,2 i dodawano l-etylo-3-(3-dlmetyloamlngpropylo)kbrbodiimid (EDAC) do uzyskania stężenia końcowego 19,17 mg EDAC/ml mieszaniny reakcyjnej. Wiązanie EDAC aktywuje grupy karboksylowe białka toksoidu tężcowego. W warunkach nieznacznej kwasowości reakcji zachodziła reakcja kondensacji, w której AH-PS i białko toksoidu tężcowego aktywowane EDAC stawały się kowalencyjnie związane.

Mieszaninę inkubgwbno przy stałym pH (5,7) w ciągu 60 minut w temperaturze +4°C, a następnie pH doprowadzano NaOH do 6,9 ± 0,2 i mieszaninę reakcyjną dializowano w temperaturze +4°C wobec NaCl. Koniugat oczyszczano przez wirowanie strefowe w gradiencie sacharozy (4% do 60%) w celu usunięcia EDAC, wolnego AH-polisacharydu, wolnego białka toksoidu tężcowego i koniugatu o niskiej masie cząsteczkowej. Do frakcji zawierającej koniugat polisacharydowy dodawano następnie wodę wolną od pyrogenów, sacharozę i bufor Tris-HCl w celu uzyskania roztworu koniugatu o następującym składzie:

sacharoza 8,5% w/v ± 0,5% stężenie polisacharydu około 200 pg/ml bufor Tris-HCl 10 mM, pH 7,0 ± 0,5.

Następnie roztwór aseptycznie sączono stosując sączek o średnicy porów 0,2 p i przechowywano w temperaturze -40°C.

Zgromadzony materiał koniugatu polisacharydowego typu b Haemophilus influenzae rozcieńczano rozcieńczalnikiem w jałowych warunkach w celu uzyskania składu końcowego: Zatężony materiał koniugatu.

polisacharydu typu b Haemophilus do 200 mg

Bufor Tris-HCl 200 mM do pH 7,2 do 110 mM

Sacharoza do 850 g

Woda do iniekcji do 10 litrów

Końcowym materiałem napełniano fiolki i liofilizowano (zliofilizowaną szczepionkę rekonstytuowano do stosowania 0,5 ml lub 0,4% NaCl).

(b) Preparat.

Testowano dwia preparaty multiwalentnej szczepionki składnikowej (APDT). Pierwsza szczepionka (APDT-niska) zawierała 10 pg toksoidu krztuścowego (PT), 5 pg hemaglutyniny filamentowej (FHA), 5 pg fimbrii 2 oraz 3 pg białka 69 K (69K) na dawkę 0,5 ml (KLASYCZNA). Druga szczepionka (ARDT-wysoka) zawierała dwukrotnie większą, ilość PT (20 pg) i identyczne ilości FIM i 69K (HYBRYDOWA). Oba preparaty szczepionki zawierały 15 jednostek flokulacyjnych (Lf) toksoidu błoniczego, 5 Lf toksoidu tężcowego, 1,5 mg fosforanu glinowego jako adiuwanta i 0,6% 2-fenoksyetangl jako środek konserwujący. W opisany powyżej sposób wytworzono koniugat szczepionki Hib-toksoid tężcowy (PRPT) w Connaught Laboratories Inc. (Swiftwater, Stany Zjednoczone Ameryki).

187 935

Populacja.

Do badań tych włączono zdrowe dzieci w wieku 17 do 21 miesięcy, które immunizowano trzema dawkami albo APDT-niska, albo PRPT w postaci oddzielnych iniekcji w 2, 4 i 6 miesiącach życia w uprzedniej próbie klinicznej. Po wyrażeniu pisemnej zgody, dzieci wybierano za pomocą utworzonej komputerowo zrównoważonej listy blokowej liczb losowych do otrzymywania PRT-T albo jako osobnej iniekcji tego samego dnia, jako oddzielnej iniekcji z podawaniem PRP-T jeden miesiąc po szczepionce APDT, albo jako pojedynczej iniekcji (zliofilizowana PRP-T rekonstytuowana w APDT). Szczepionka APDT (wysoka lub niska) dla każdego dziecka pozostawała taka sama jak podawana w pierwszych trzech dawkach (wyznaczony stosunek 6:1 APDT-wysoka: APDT-niska). Szczepionki podawano domięśniowo 25 mm igłą do na^miennego mięśnia ramienia lub, jeśli mięsień naramienny miał niewystarczającą masę, do mięśnia obszernego bocznego uda. Jeśli dla PRPT wymagana była druga iniekcja, wykonywano ją w przeciwną kończynę.

Monitorowanie kliniczne i laboratoryjne.

Uczestników monitorowano pod względem miejscowych i ogóloruftrojowych reakcji ubocznych bezpośrednio po immunizacji i przy udziale rodziców w ciągu 72 godzin po immunizacji. Dane zbierano przez telefoniczny wywiad według utworzonego schematu w 24 i 72 godzinie. Temperaturę ciała mierzono co najmniej raz dziennie lub jeśli rodzice uważali, że dziecko ma gorączkę. Tkliwość uciskowa i reakcje ogólnoustaoj owe (pobudliwość, obniżona aktywność, obniżone łaknienie) były klasyfikowane jako łagodne, umiarkowane lub ciężkie zgodnie z uprzednio ustalonymi kryteriami, zgodnie z którymi rodzice wybierali stopień ciężkości objawów w oparciu o utworzone schematyczne przykłady. Pomiar reakcji miejscowych opierał się na podstawie ich wielkości i przedłużonego płaczu podczas ich trwania.

Próbki krwi pobierano przez nakłucie żyły lub palca przed i 28 dni po immunizacji; u dzieci otrzymujących iniekcję PRP-T (dlatego też, 2 miesiące po APDT). Przeciwciała skierowane przeciw polisacharydowi otoczkowemu Hib (PRP) mierzono przez RLA. Przeciwciała IgG skierowane przeciw PT mieazrno przez ELA, a przeciwciała neutralizujące PT przez neutralizację cytotoksyczności wobec komórek jajnika chomika chińskiego (CHO). Przeciwciała IgG skierowane przeciw FHA, przeciw FIM i przeciw 69K mierzono przez EIA; liczbę jednostek obliczano stosując antyfurrwicę odniesienia FDA (#3). Mier/ror również aglutyniny krztuścowe. Antytoksynę błoniczą mierzono w oznaczeniu mikaooeutaalizacji, a antytoksynę tężcową przez EIA. Miana przeciwciał wyrażano jako średnie geometryczne mian; do celów obliczeń statystycznych próbkom surowic o mianach niższych od granicy wykrywalności testu przypisywano wartość połowy najniższej granicy wykrywalności.

Analiza statystyczna.

Reakcje uboczne analizowano po podzieleniu ich na grupy pod względem istotności klinicznej. Częstość reakcji ubocznych porównywano przez ocenę Maotela-Haeoszel względnego ryzyka stosując ośrodek i preparat szczepionki jako zmienne warstwowe. W każdym przypadku określano oceny punktowe i przedział ufności 95% dla RR. Przedziały ufności, które nie obejmują 1,00, są istotne statystycznie.

Średnie geometryczne mian przeciwciał i przedziały ufności 95% obliczano dla miana przeciwciała dla każdego antygenu szczepionki przed i po immunizacji. Średni logarytm mian porównywano przez trój czynnikową analizę wariancji. Proporcje osobników, którzy osiągnęli wstępnie określone poziomy w każdej grupie porównywano przez regresję logistyczną. Dla wielokrotnych porównań nie dokonywano żadnych poprawek.

Łącznie do badań włączono 545 dzieci (44% płci żeńskiej), z których 74% ukończyło badania serii niemowlęcej. Stosunek uczestników tych badań, którzy otrzymali te dwa preparaty wynosił 6:1 (468 APDT-wyfoka, 77 ARDT-niska). Średni wiek wynosił 18,9 miesięcy (zakres 17-21 miesięcy; wszystkie, oprócz trojga dzieci (99,4%) ukończyło badania.

Reakcje uboczne.

Częstość reakcji ubocznych nie różniła się w grupach immunizowa^iych AŁDT-wysoka i APDT-nifka; częstości były również podobne niezależnie od tego, czy immunizację były przeprowadzone oddzielnie podczas jednej wizyty, podczas oddzielnych wizyt, czy w jednej łącznej iniekcji.

187 935

Odpowiedź humoralna.

Przed immunizacją poziomy przeciwciał skierowanych przeciw wszystkim antygenom, poza FHA, były podobne u dzieci, które otrzymywały w pierwszych trzech dawkach szczepionkę APDT-wysoka lub APDT-niska. Dzieci szczepione APDT-wysoka o czterokrotnie wyższej zawartości FHA posiadały znacząco wyższe miana przeciwciał skierowanych przeciw fHa niż dzieci immunizowane APDT-niska (p=0,0001). Po immunizacji APDT-wysoka indukowała wyższe miana przeciwciał niż APDT-niska (p=0,0001). W przeciwieństwie, przed immunizacją miana przeciwciał skierowanych przeciw PT mierzone przez neutralizację CHO lub EIA, były podobne w obu grupach. Paradoksalnie, pomimo dwukrotnie wyższej zawartości antygenu, miana przeciwciał skierowanych przeciw PT były niższe po immunizacji APDTwysoka niż APDT-niska (p=0,038). Podobnie, przeciwciała skierowane przeciw FIM oraz aglutyniny po immunizacji były wyższe w grupie APDT-niska (odpowiednio p=0,01 i p=0,04) pomimo identycznych ilości antygenu fimbrii w obu preparatach szczepionki.

Przed immunizacją występowały niewielkie różnice pod względem przeciwciał skierowanych przeciw krztuścowi pomiędzy grupami losowo wybranymi do otrzymania PRPT połączonej z APDT w postaci pojedynczej iniekcji lub w postaci oddzielnych iniekcji tego samego lub oddzielnych dni (tabela 10). Dane przedstawiono oddzielnie dla biorców APDT-wysoka i APDT-niska; jednakże, z powodu małej liczby dzieci w grupie APDT-niska, wyniki te nie będą dalej dyskutowane. Grupa losowo wybrana do otrzymania oddzielnych iniekcji tego samego dnia posiadała więcej przeciwciał skierowanych przeciw PT, jak oceniano przez neutralizację CHO, niż grupa, która otrzymała dwie iniekcje w oddzielnych dniach (6,14 w stosunku do 4,80 jednostek; p<0,05). Poziomy przeciwciał po immunizacji były również wyższe w tej grupie (176 jednostek) niż w grupie z oddzielnymi iniekcjami w oddzielnych dniach (122 jednostek; p<0,01), chociaż podobne wyższe poziomy stwierdzono w grupie, która otrzymała pojedynczą łączoną immunizację (171 jednostek; p<0,01). Odpowiedź przeciwciał skierowanych przeciw 69K wykryto w tej grupie po immunizacji, chociaż dzieci immunizowane dwoma iniekcjami tego samego dnia posiadały wyższą odpowiedź humoralną, niż dzieci immunizowane łączoną pojedynczą szczepionką, a dzieci immunizowane dwiema iniekcjami tego samego dnia posiadały wyższą odpowieź humoralną, niż dzieci immunizowane w oddzielnych dniach (343 w strosunku do 190 jednostek; p<0,001) niż dzieci immunizowane dwiema iniekcjami w oddzielnych dniach.

Poziomy przeciwciał skierowanych przeciw PRP przed immunizacją były podobne wśród trzech grup. Miana po immunizacji były wyższe u dzieci immunizowanych oddzielnymi iniekcjami tego samego dnia (66,0 gg/ml) niż u dzieci immunizowanych w oddzielnych dniach (28,4 gg/ml; p<0,001) lub u dzieci, które otrzymały pojedynczą łączoną immunizację (47,1; p<0,05). Łączona immunizacja wywoływała również znacząco wyższe poziomy przeciwciał niż szczepionki podane w oddzielnych dniach (p 0,05). Nie wykryto żadnych różnic pomiędzy grupami pod względem procentu, który uzyskiwał poziomy „ochronne”; wszyscy uczestnicy posiadali po immunizacji miana powyżej 0,15 ug/ml, a tylko 4 uczestników (0-0,7%) nie osiągnęło miana powyżej 1 g g/ml (3 w grupie, która otrzymała oddzielne iniekcje w oddzielnych dniach i jeden w grupie, która otrzymała pojedynczą łączoną iniekcję). Ponad 82% dzieci w każdej grupie przekroczyło poziom 10 gg/ml przeciwciał skierowanych przeciw PRP.

Silna odpowiedź humoralna wywoływana była także przeciw toksoidom błoniczemu i tężcowemu. W porównaniu z grupą, która otrzymała immunizację w oddzielnych dniach (2,1 IU/ml), znacząco wyższe poziomy przeciwciał przeciwbłoniczych wywoływane były u dzieci immunizowanych dwiema iniekcjami tego samego dnia (3,1; p<0,01 IU/ml) lub łączonymi pojedynczymi iniekcjami (3,3 IU/ml; p<0,001). Poziom przeciwciał przeciwtężcowych był wyższy u biorców dwóch iniekcji tego samego dnia (6,7 IU/ml) niż u dzieci immunizowanych w oddzielnych dniach (5,2 IU/ml; p<0,01) lub dzieci, które otrzymały łączoną pojedynczą iniekcję (4,8 IU/ml; p<0,001). Wszystkie dzieci posiadały po immunizacji miana przeciwciał przeciwbłoniczych i przeciwtężcowych powyżej 0,1 IU/ml, poziom 104αΌΡώ przekraczający poziom ochronny. Ponad 96% mian przeciwtężcowych i ponad 74% mian przeciwbłoniczych przekraczało poziom 1,0 IU/ml; nie występowały żadne różnice pomiędzy grupami imnunizacyjnyni.

187 935

Pr zy kł ad 8:

Przykład ten opisuje tworzenie i immunogenność multiwalentnej łączonej szczepionki obejmującej szczepionkę inaktywowanego wirusa polio.

(a) Przygotowywanie inaktywowanego wirusa polio.

(i) Namnazanic na komórkach MRC-5.

Inaktywowanego wirusa polio namnażanego w komórkach MRC 5 przygotowano jak

podano poniżej. Komórki były komórkami nerki koczkodana zielonosiwego (Ceropithacus
aethiops).
Inaktywowana triwalentna szczepionka przeciw wirusowi polio zawierała składniki Ty-
pu I (Mahoney), Typu II (MEF) i Typu III (Saukett),	które oddzielnie namnażano na komór-
kach MRC-5 na perełkach mikronośnikowych, poddawano obróbce i	inaktywowano przed
połączeniem w triwalentna szczepionkę przeciw wirusowi polio.
Zawiesinę komórek MRC-5 dodano do fermentom z podłożem wzrostowym dla komó-
rek o pH 7,2 (6,9 do 7,6) i temperaturze 37°C ± 0,5°C	. Podłoże wzrostowe dla komórek miało
następujący skład:
podłoże CMRL 1969
wodorowęglan sodowy	0,15%
surowica dorosłego bydła	5,70% -	7,00%
siarczan neomycyny (pg składnika aktywnego)	10 IU/ml
polimyksyna B	200 IU/ml
Podłoże CMRL miało następujący skład:
SUCHY PROSZEK
Składniki aminokwasowe		mg/litr
L-alanina		22,0
L-arginina (wolna zasada)		55,0
kwas L-asparaginowy		30,0
L-cysteina · HCl		0,1
L-cystna dwusodowa		24,0
kwas L-glutaminowy · H20		67,0
L-glutamina		22^,0
L-glicyna		50,0
L-histydyna (wolna zasada)		H,2
L-hydroksyprolina		10,0
L-izoleucyna		22,0
L-leucyna		66,0
L-lizyna HCl		77,0
L-metionina		11,0
L-fenyloalanina		22,0
L-prolina		44,0
L-seryna		22,0
L-treonina		33,0
L-tryptofan		W
L-tyrozyna		4000
L-walina		220,
Witaminy
kwas p-aminobenzoesowy		00,5
kwas askorbinowy		0,05
d-biotyna		1,00
pantotenian wapniowy		1,00
dwuwodorocytrynian choliny		2,11
kwas foliowy		1,00
glutation		0,00

187 935 i-inozytol 2,00 nikotynoamid 1,00 pirydoksal · HCl 1,00

5-fosforan ryboflawiny 0,10 tiamina · HCl 1,00

Składniki mg/litr chlorek sodowy 8000,0 chlorek potasowy 400,0 chlorek wapniowy (bezwodny) 140,0 siarczan magnezowy · H2O 200,0 fosforan sodowy, dwuzasadowy bezwodny 180,0 fosforan sodowy, niezasadowy 70,0

D-glukoza (bezwodna) 1000,0 czerwień fenolowa 20,0

10,852 gram daje 1 litr podłoża CMRL 1969.

Podłoże przygotowuje się w następujący sposób: 450 litrów destylowanej wolnej od pyrogenów wody dodaje się do 905 ml IN kwasu solnego. Do tej mieszaniny dodaje się 5426,5 g CMRL 1969 w postaci suchego proszku, ciągłe mieszając do rozpuszczenia w celu uzyskania klarownego roztworu.

Następujące odczynniki chemiczne dodaje się, przy ciągłym mieszaniu, w podanej kolejności, czekając aż każdy odczynnik rozpuści przed dodaniem następnego:

neomycyna 10 mcg/ml polimyksyna B 200 jednostek/ml roztwór buforu TES 5000,0 ml wodorowęglan sodowy 750,0 g surowica bydlęca 30 litrów

Objętość uzupełniono do 500 litrów świeżą wodą destylowaną i mieszano do jednolitego zmieszania.

Monitorowano wzrost komórek i kiedy określono, że komórki są w fazie logarytmicznej usunięto zużyte podłoże wzrostowe i zastąpiono je podłożem wzrostowym dla wirusów. Podłoże wzrostowe dla wirusów miało następujący skład:

Odczynniki chemiczne podłoża 199 z solami Earle'go wodorowęglan sodowy 0,26%

Tween 80 20 ppm siarczan neomycyny (pg składnika aktywnego) 10 IU/ml polimyksyna B 200 IU/ml

L-glutamina 100 mg/litr

L-arginina 29 mg/litr

L-leucyna 30 mg/litr

L-izoleucyna 10 mg/litr

L-metionina 7,5 mg/litr

L-seryna 12,5 mg/litr

L-treonina 15 mg/litr

L-cystyna 10 mg/litr dwuwodorocytrynian choliny 107 mg/litr

Podłoże CMRL 199 miało następujący skład:

SUCHY PROSZEK

Składniki

L-alanina

L-arginina (wolna zasada) mg/litr

25,0

58,0

187 935 kwas L-asparaginowy 30,0

L-cysteina · HCl · H2O 0,1

L-cystyna dwusodowa 24,0 kwas L-glutaminowy · H2O 67,0

L-glutamina 100,0 glicyna 50,0

L-histydyna (wolna zasada) 16,2

L-hydroksyprolina 10,0

L-izoleucyna 20,0

L-leucyna 60,0

L-lizyna 70,0

L-metionina 11^,0

L-fenyloalanina 25,0

L-prolina 40,0

L-seryna 25,0

L-treonina 30,0

L-tryptofan 10,0

L-tyrozyna 40,0

L-walina 25,0 kwas p-aminobenzoesowy 0,050 kwas askorbinowy 0,050 d-biotyna 0,010 pantotenian wapniowy 0,(^10 dwuwodorocytrynian choliny 1,0(6) kwas foliowy 0,010 glutation 0,000 i-inozytol 0,000 witamina K3 0,010 nikotynoamid (niacynoamid) 0,005 kwas nikotynowy (niacyna) 0,002 pirydoksal HCl 0,002 pirydoksyna · HCl 0,002

5-fosforan ryboflawiny 0,(00 tiamina · HCl 0,000 octan witaminy A 0,100 witamina D (kalciferol) OJOO witamina E (fosforan tokoferolu) 0,0,0 siarczan adeniny 10,000 trój fosforan adenozyny 11.)00 kwas adenozyno-5-fosforowy 0,220 deoksy-2-ryboza 0,500 d-ryboza 0,K)0 cholesterol 0,200 guanina 0,300 hipoksantyna 0,33)0

Hodowle infekowano odpowiednim materiałem wirusowym, w ilości prowadzącej do wielokrotnej infekcji. Infekcję prowadzono w temperaturze 36°C ± 1°C. Kiedy C.P.E. wirusa było zakończone, hodowle schładzano do temperatury 2°C do 15°C.

Zebranego wirusa klarowano przez filtrację. Zebraną objętość wirusa zmniejszono przez ultrafiltację przez membranę o nominalnej granicy przepuszczalności masy cząsteczkowej 100000, do objętości odpowiedniej do diafiltracji wobec 0,04 M buforu fosforanowego. Po diafiltracji, objętość dalej zatężano do objętości odpowiedniej do filtracji żelowej. Pobierano próbki koncentratu żywego wirusa i przechowywano w temperaturze 2°C do 8°C.

187 935

Koncentrat żywego wirusa nakładano na kolumnę do filtracji żelowej i eluowano z kolumny 0,04 M buforem fosforanowym. Frakcję wirusa zbierano monitorując gęstość optyczną eluatu z kolumny przy długości fali 254 i 280 nm.

Drugi etap oczyszczania przeprowadzano stosując jonowymienne podłoże DEAE z 0,04 M fosforanem jako buforem eluującym. Ten etap można powtórzyć, jeśli ilość zastosowanego podłoża jonowymiennego była niewystarczająca, jak oceniono przez monitorowanie przy fali o długości 254 i 280 nm.

Zebraną frakcję wirusa zatężano i dializowano wobec specjalnego podłoża Hanka w celu zmniejszenia zawartości fosforanu. Specjalne podłoże Hanka ma następujący skład:

AMINOKWASY mg/litr

D,L-alanina 25,00

L-arginina · HCl 58,00 kwas D,L-asparaginowy 30,00

L-cysteina •HCl · H₂O 0,10

L-cystyna 2- HCl 26,00 kwas D,L-glutaminowy 67,00

L-glutamina 100,00 glicyna 50,00

L-histydyna · HCl · H20 16,20

L-hydroksyprolina 10,00

D,L-izoleucyna 20,00

D,L-leucyna 60,00

L-lizyna · HCl 70,00

D,L-metionina 15,00

D,L-fenyloalknlna 25,00

L-prolina 40,00

D,L-seryna 25,00

D,L-treonina 30.00

D,L-tryptofan 10,00

L-tyrozyna (sól dwusodowa) 40,00

D,L-walina 25,00

WITAMINY kwas askorbinowy 0,050 d-biot^a 0,010 witamina D (kalciferol) 0,100

D-pantotenian wapniowy 0,010 chlorek choliny 1,060 kwas foliowy 0,010 i-inozytol 0,050

Sole mineralne mg/hir chlorek wapniowy (bezwodny) 40,(^0 azotan żelazowy ·9 H₂O 0,00 chlorek potasowy 400,00 chlorek sodowy 8000,00 siarczam magnezowy · H₂O 200,00

Inne składniki siarczan adeniny 10,(^(^0 trójfosforan adenozyny (sól dwusodowa) 1TOO kwas adenylowy 0,200 kwas d α tokoferolofosforowy (sól sodowa) 0,010 cholesterol 0,200

187 935

deoksyryboza	0,500
glukoza	1000,000
glutation	0,050
guanina · HCl	0300
ryboza	0,55)0
octan sodowy · 3 H2O
tymina	0,300
Tween 80	22,000
uracyl	0,330
ksantyna (sól sodowa)	0,33^00
witamina K3	0,010
kwas nikotynowy
nikotynoamid	0,005
kwas p-amonobenzoesowy	0,005
pirydoksal · HCl	0,002
pirydoksyna · HCl
5-fosforan ryboflawiny	0,010
tiamina · HCl	0,000
witamina A (octan)	0,1440
Oczyszczoną frakcję wirusa przesączono przez filtr o	wielkości porów 0,2 g.
Jedną lub więcej oczyszczonych frakcji koncentratu wirusa można zebrać do inaktywa-

cji. W oparciu o wyniki testu ELISA, monowalentną pulę wirusa rozcieńczono specjalnym podłożem Hanka do:

Typ I: 1750 ± 250 DU/ml Typ II: 1500 ±250 DU/ml i Typ III: 1250 ± 250 DU/ml.

Monowalentną pulę ogrzano do temperatury 37°C ± 1°C, a następnie sączono przez filtr o wielkości porów 0,2 g.

Dodano formaliny w ilości konieczne do uzyskania stężenia 1:4000. Pulę wirusa i formalinę zmieszano i mieszano w sposób ciągły w temperaturze 37°C ± 1°C. Pobrano próbkę z monowalentnej puli wirusa do oceny żywotności. Szóstego dnia, inaktywowćmąpulę wirusa przesączono przez sączek o wielkości porów 0,2 g i utrzymywano w temperaturze 37°C ± 1°C. Trzynastego dnia inaktywacji, pulę wirusa przesączono przez sączek o wielkości porów 0,2 g.

Wybrano jeden lub więcej inaktywowanych monowalentnych składników i połączono je aseptycznie w tanku zbiorczym. Monowalentną pulę zatężano następnie przez utirafitirację membranową z zastosowaniem membrany o nominalnej granicy przepuszczalności masy cząsteczkowej 100000. Następnie prowadzono dializę, wobec rozcieńczalnika RTV-PBS:

wodorofosforan dwusodowy (Na2HPO4), 0,346 g/CCml dwuwodorofosforan potasowy (KH0PO4), 0,187 g/CCml z Tweenem w celu uzyskania jednolitości produktu końcowego.

Dodano albuminę (ludzką) do uzyskania 0,5% stężenia końcowego. Zebrane pule monowalentnego koncentratu przesączono przez sączek o wielkości porów 0,2 g. Dodano rozcieńczalnik RIY-PBS z Tweenem do uzyskania oszacowanego (przez obliczenia) stężenia 10 do 15 dawek na 0,5 ml. Zebrane pule koncentratu przechowywano w temperaturze 2°C do 8°C do momentu aż były potrzebne.

Wyliczono i połączono odpowiednie objętości monowalentnych składników Typu I, Π i III. Celem było, aby iriwalenina szczepionka zawierała:

Typ I: 40 DU/dawkę 0,5 ml

Typ II: 8 DU/dawkę 0,5 ml

Typ III: 32 DU/dawkę 0,5 ml

Triwalentny koncentrat przechowywano do momentu wykorzystania w temperaturze 2°C do 8°C. Dodano formaldehyd i 2-fenoksyeianol i wymieszano. Dodano wyliczoną ilość albuminy (ludzkiej) do uzyskania 0,5% stężenia końcowego.

(ii) Namażanie na komórkach Vero.

187 935

Robocze komórki Vero z ampułek pochodzących z banku namnażano do poziomu wybranego pasażu komórkowego. Ampułki z komórkami przechowywano w ciekłym azocie. Komórki hodowano stosując perełki mikronośnikowe, które były sferycznymi perełkami o przeciętnej średnicy około 100 mikrometrów, utworzone z polimerów dekstranowych, posiadającymi na swojej powierzchni przyłączone grupy DEAE (dietyloaminoetylgwe), nadające im ładunek dodatni.

Podstawowym podłożem wzrostowym komórek było podłoże minimalne „Minimum Essential Medium” (MEM) Eagle'a w roztworze soli Earle, wzbogacone o 0,2% hydrolizatu laktoalbuminy, 0,1% dekstrozy, 5% surowicy cielęcej. Każdy ml podłoża zawiera następujące antybiotyki:

Streptomycyna: 75j jdnooteknaml

Noemycyna: 14 j jeim-otek na nR siarczan polimyksyty B: 35 j ednoostk na mk

Komórki Vero narażano stopniowo hodując w biggeodratorach o wzrastającej wielkości. Następnie podłoże hodowlane i dostateczną objętość perełek mikrooośnikowych na litr wprowadz^o do alogeoerαtgra przemysłowego. Temperaturę stabilizowano na poziomie +37°C. Dodawano komórki zebrane przez działanie trypsyną i mieszano. Hodowlę kontynuowano w ciągu 4 do 7 dni w temperaturze + 37°C, stopniowo zwiększając mieszanie. Zazwyczaj przy zakończeniu hodowli obserwowano 6 do 20 zwiększenie wzrostu komórkowego. Podłożem stosowanym do oamnażaoia wirusa było podłoże 199 (Parker) w roztworze soli Earle wzbogacone o 0,1% dekstrozy. Podłoże to zawiera te same antybiotyki, i w tych samych stężeniach, co podłoże do wzrostu komórek, ale oie zawiera surowicy cielęcej. W 4/7 dniu wzrostu komórkowego, zatrzymywano mieszanie w aiggeodratorze przemysłowym; perełki osiadały na dnie zbiornika, usuwano stare podłoże. Następoie do każdego biogdoeratora wprowadzano pewną ilość wolnego od surowicy podłoża 199 i mieszano. Podłoże to następnie odciągano, uzyskując przemywanie perełek i komórek. Pewną ilość wolnego od surowicy podłoża 199 przenoszono do alggdoeratgra razem z konieczną objętością partii materiału. Wirusa adsorbowαog na komórkach przez delikatne mieszanie. Po zakończeniu hodowli wirusa zatrzymywano mieszanie. Zawiesinę wirusa odciągano i zbierano, a perełki zatrzymywano przez sączenie. Zawiesinę wirusa homogenizowano. Zgromadzoną zawiesinę przesączoną przez membranę o średniej wielkości porów 0,20 mm, przechowywano w temperaturze +4°C. Wirusa zatężaoo przez ultrafiltrację.

Wirusa oczyszczano dalej przez chromatografię jonowymienną z zastosowaniem złoża DEAE-nextrao-Spherosil, zrównoważonego 0,04 M buforem fosforanowym, pH = 7,00. Wirusa oczyszczano dalej przez chromatografię sączenia molekularnego, stosując kolumnę zawierającą żel agarozowy, Sepharosil CL-6B, zbuforowkoy 0,04 M fosforanem, pH 7 = 00. Wirusa oczyszczano dalej przez chromatografię z zastosowaniem DEAE nextran-Spherosil, zrównoważonego 0,04 M buforem fosforanowym, pH = 7,00. Bezpośrednio po przeprowadzeniu ostatniego etapu oczyszczania, zawiesinę wirusa doprowadzano do wymaganej objętości pewoą iością podłoża M-199, pH = 7,0 bez fosforanu, zatężaoo 10 razy w 5 mM EDTA, 0,5% glicynie i Tween 80 w stężeniu końcowym 50 mg/litr (podłoże do inaktywacji). Mieszanina ta stanowi „zatężoną mieszaninę wirusową” i sączy się ją przez membranę o średnicy porów 0,2 pm. Zatężooą zawiesinę wirusową przechowywano w temperaturze +4°C do czasu inaktywacji.

Jedną z kilku partii „zatężonej mieszaniny wirusowej” tego samego typu mieszano i ewentualnie rozcieńczano lub uzupełniano pewoą ilością „podłoża do inaktywacji” w odpowiednim zbiorniku. Rozcieńczenie doprowadzano do właściwej objętości w zależności od typu w celu otrzymania miao antygenu D pomiędzy:

- 1500 a 2000 jednostek D dla typu 1

- 800 a 1000 jednostek D dla typu 2

- 1000 a 1500 jednostek D dla typu 3 i stężenia białka:

- <40 pg/ml dla typu 1

- <70 pg/ml dla typu 2

187 935

- <3 O pg/ml dla ayyp 3.

Doprowadzoną oczyszczoną zatężoną zawiesinę wirusową sączono przez membranie o średnicy porów 0,22 pm najwyżej 72 godziny przed rozpoczęciem inaktywacji. Następnie zawiesinę wirusową ponownie ogrzewano w temperaturze +O7°C. W celu inaktywacji, dodawano roztwór formaldehydu do uzyskania stężenia 1/4000. W celu śledzenia kinetyki inaktywacji, podczas pierwszych czterech dni pobierano próbki po 24, 48, 72 i 96 godzinach. Prowadzono pobieranie próbek o objętości 10 ml z natychmiastową neutralizacją formaldehydu działaniem wodorosiarczynu sodowego i bezpośrednim przechowywaniu w temperaturze -20°C do czasu miareczkowania.

dnia inaktywacji zawiesinę wirusową sączono stosując sączek o średnicy porów 0,22 pm. Po sączeniu prowadzi się inkubację płynu w temperaturze 37°C przez dalszych 6 dni z ciągłym mieszaniem. 9 dnia inaktywacji pobierano 3-krotną objętość odpowiadającą 3000 dawek dla ludzi, a minimum 500 ml, nieoczyszczonego danego materiału. Objętość tę obliczano zgodnie z mianem antygenu D w „zatężonej mieszaninie wirusowej”. Próbki bezpośrednio neutralizowano pewną ilością wodorosiarczynu sodowego w celu zatrzymania działania pozostałości formaldehydu. Homogenizowaną i inaktywowaną zawiesinę wirusową pobierano z inkubatora przy temperaturze 37°C po 12-dniowej inaktywacji. Objętość bezpośrednio neutralizowano pewną ilością wodorosiarczynu sodowego i przechowywano w temperaturze +4°C.

W celu przygotowania zatężonej triwalentnej partii IPV, monowalentne preparaty łączono, aby uzyskać:

Typ 1 (Mahoney) 400 jednostek antygenu D

Typ 2 (MEF-1 ) 80 j ednostek antygenu D

Typ 3 (Saukett) 3 320 jednostek antygenu D

Podłoże 199 - pH 7,2 do 1 ml

Mieszaninę mieszano w celu uzyskania jednorodności i sączono przez membranę o średnicy porów 0,22 mikrona.

Końcowy produkt otrzymywano z zatężonych triwalentnych partii, takich jak te opisane, przez rozcieńczanie podłożem 199, pH 7,2, bez czerwieni fenolowej, tak że dawka jednostkowa zawiera na 0,5 ml:

jednostek antygenu D dla typu 1 8 jednossek antyyenu D dla tty^u 2 jednostki antygenu D dla typu 3.

(b) Preparaty.

Multiwalentny preparat szczepionki (APDT) zawierał pięć antygenów krztuścowych (10 pg PT, 5 pg FHA, 5 pg FIM 2 i 3, 3 pg 69K), 15 Lf toksoidu błoniczego, 5 Lf toksoidu tężcowego, 1,5 mg fosforanu glinowego jako adiuwanta i 0,6% 2-fenoksyetanol jako środek konserwujący na 0,5 ml (KLASYCZNA). Szczepionkę stosowano samą lub w kombinacji z albo IPV wytworzonym na komórkach MRC-5 (mIPV), przygotowanym jak opisano powyżej, IPV wytworzonym na komórkach Vero (vIPV), przygotowanym jak opisano powyżej, albo z OPV (Connaught Laboratories Limited). Aby nie zmieniać rutynowego schematu immunizacji, szczepionkę koniugatu Haemophilus influenzae b-toksoid tężcowy podawano podczas powtórnej wizyty.

Populacja.

Do badań tych włączono zdrowe dzieci w wieku 17 do 19 miesięcy, które immunizowano trzema dawkami DTP i 2 dawkami OPV, bądź 3 dawkami DTP-IPV przed ukończeniem 8 miesięcy życia. Po pisemnej zgodzie rodziców, dzieci wybierano za pomocą utworzonej komputerowo zrównoważonej listy blokowej liczb losowych do udziału w jednym z pięciu schematów szczepień (tabela 10). Szczepionki łączone zawierające A3DT podawano drogą domięśniową 25 mm igłą do naramiennego mięśnia ramienia lub, jeśli mięsień naramienny miał niewystarczającą masę, do mięśnia obszernego bocznego uda. IPV (0,5 ml; mIPV lub vIPV), gdy podawano samą, podawano drogą podskórną stosując igłę o długości 1/2 do 5/8 cala (12,5 do 16 mm), szczepionki zawierające APDt podawano do lewej kończyny; prawą kończynę stosowano do szczepionek inaktywowanego wirusa polio, gdy podawano je osobno, oraz do wszystkich szczepionek koniugatu Haemophilus influenzae b podczas drugiej wizyty.

187 935

Monitorowanie kliniczne i laboratoryjne.

Próbki krwi pobierano przez nakłucie żyły lub palca przed i 28 dni po immunizacji. Przeciwciała IgG skierowane przeciw PT mierzono przez enzymatyczne oznaczenie immunologiczne, a przeciwciała neutralizujące PT przez neutralizację CHO. Przeciwciała IgG skierowane przeciw FHA, przeciw FIM i przeciw 69K mieazrno przez enzymatyczne oznaczenie immunologiczne; jednostki obliczano stosując antysurowicę odniesienia USA FDA (#3). Mierzroo również aglutyniny krztuścowe. Antytoksynę błoniczą mier/roo w oznaczeniu mikaoneutralizacji, a antytoksynę tężcową przez oznaczenie immunologiczne. Przeciwciała skierowane przeciw wirusowi polio typu 1, 2 i 3 mierzono neutralizację wirusa. Miana przeciwciał wyrażano jako średnie geometryczne mian; do celów obliczeń statystycznych próbkom surowic o mianach niższych od granicy wykrywalności testu przypisywano wartość połowy najniższej granicy wykrywalności.

Średnie geometryczne mian przeciwciał i przedziały ufności 95% rbliczaor dla miana przeciwciała dla każdego antygenu szczepionki przed i po immunizacji. Średni logarytm mian i średnie logarytmiczne pazyarfty miana przeciwciał porównywano przez analizę profilową i analizę wariancji. Proporcje osobników, którzy osiągnęli wstępnie określone poziomy w każdej grupie porównywano przez regresję logistyczną. Dokonano porównań pomiędzy każdą szczepionką przeciw wirusowi polio podawaną oddzielnie lub jako łączną injekcję, pomiędzy mIPV i vIPV (zarówno oddzielnie, jak i razem) oraz pomiędzy połączonymi szczepionkami IPV i OPV. Dla wielokrotnych porównań nie dokonywano żadnych poprawek.

Łącznie do badań włączono 425 dzieci (52% płci żeńskiej) i przeprowadzono u nich immunizację przypominającą (tabela 10). Średni wiek w chwili włączenia do badań wynosił 17,8 miesięcy (zakres 17,0 do 20,0). Poimmunizacyjne próbki surowicy uzyskano od 422 (99,3%) uczestników średnio 29,2 dni po immunizacji (zakres 28 do 41 dni). Skutki uboczne klasyfikowane jako ciężkie rzadkie w badaniu.

Przed immunizacją poziomy przeciwciał skierowanych przeciw większości antygenów były równoważne pomiędzy grupami. Wyjątki polegały na tym, że uczestnicy wybrani do otrzymania APDT i mIPV jako oddzielnych iniekcji posiadali znacząco niższe poziomy przeciwciał skierowanych przeciw FIM, aglutyninie, pr/eciwbłroiczych i przeciwrężcowych, niż grupa wybrana do otrzymania połączonej szczepionki APDT-młPV. Podobnie, grupa losowo wybrana do otrzymania oddzielnych iniekcji APDT i vIPV posiadała niższe poziomy przeciwciał przeciwtężcowych niż grupa, która otrzymała łącznie APDT-vIPV.

Po immunizacji występował znaczący wzrost poziomów przeciwciał we wszystkich grupach szczepionek wobec wszystkich antygenów zawartych w szczepionkach. Występowały nieznac/oe różnice w odpowiedzi humoralnej na antygeny krztuścowe w zależności od grupy szczepionki przeciw wirusowi polio. Nie było różnic w przeciwciałach skierowanych przeciw PT w enzymatycznym oznaczeniu immunologicznym lub neutralizacji CHO oraz w przeciwciałach skierowanych przeciw FHA. Poziomy przeciwciał skierowanych przeciw 69K były znacząco wyższe w grupie, która otrzymała szczepionkę mIPV połączoną z APDT (77,7 jednostek) niż w grupie, która otrzymała mIPV jako oddzielne iniekcje (37,9 jednostek; p<0,001) lub w grupie, która otrzymała OPV (47,7; p<0,5). Poziomy przeciwciał skierowanych przeciw FIM i aglutyninom były również wyższe w grupie, która otrzymała oddzielne iniekcje. Jednakże, te same różnice stwierdzono również w surowicach przed immunizacją.

Wykryto różnice w odpowiedziach humoralnych skierowanych przeciw wirusowi polio. Zarówno APDT-mIPV, jak i APDT- vIPV wywoływały wyższe poziomy przeciwciał skierowanych przeciw wirusowi polio typu 1 i typu 3 (P<0,001 dla wszystkich porównań). Poziom przeciwciał skierowanych przeciw wirusowi prlir typu 2 był również wyższy po APDT-mIPV (10633 odwrotne rózcieńczenie) i APDT-vIPV (10256) niż OPV (7185); jednakże, osiągnęło to istotność statystyczną tylko dla APDT-mIPV (p<0,05). Miana przeciwciał skierowanych przeciw wirusowi polio uzyskiwane przy łącznej szczepionce APDT-MIPV były również wyższe, niż gdy mIPV podawano jako oddzielną iniekcję (6620-1 p<0,05).

Miana przeciwciał przeciwtężcowych były wyższe u biorców OPV, niż przy każdej z kombinacji IPV (p<0,05). Miana pa/eciwbłooicze były również wyższe u biorców OPV, ale osiągało to istotność statystyczną tylko dla porównania z grupą APDT-vIPV (p<0,05) Po immuniza187 935 cji wszystkie dzieci posiadały poziomy przeciwciał przeciwbłoniczych i przeciwtężcowych powyżej 0,01 IU/ml, a wszystkie poza jednym dzieckiem miały poziomy powyżej 0,1 IU/ml.

Wyniki tych badań wykazują, że składnikową szczepionkę przeciwkrztuścową zawierającą PT, FHA, 69K i FIM połączone z toksoidami błoniczym i tężcowym można również łączyć ze szczepionką inaktywowanego wirusa polio bez jakiegokolwiek znaczącego wzrostu reaktogenności lub utraty immunogenności. W przeciwieństwie dla wyników otrzymanych dla pełnokomórkowej DTP, nie występowało zmniejszenie odpowiedzi humoralnej na antygeny Bordetella pertussis. Nie występowały zasadnicze różnice pomiędzy szczepionkami IPV przygotowanymi na liniach komórek MRC-5 lub Vero; obie szczepionki indukowały wyższe poziomy przeciwciał skierowanych przeciw wirusowi polio w surowicy, niż OPV.

Wykazanie równoważności mIPV i vIPV ułatwia wprowadzenie bezkomórkowej szczepionki przeciwkrztuścowej tam, gdzie obowiązuje prawodawstwo preferujące IPV pochodzącego z określonej linii komórkowej.

Podsumowując doświadczenia przedstawione w tym przykładzie, wskazują one, że pięcioskładnikową bezkomórkową szczepionkę przeciwkrztuścową można bezpiecznie łączyć z każdą z dwóch szczepionek IPV do otrzymania czwartej dawki szczepionki pomiędzy 17 a 19 miesiącem życia.

PODSUMOWANIE UJAWNIENIA.

Podsumowując to ujawnienie, niniejszy wynalazek zapewnia nowe preparaty antygenów Bordetella i niQ-Bordetella do wytwarzania wieloskładnikowych szczepionek przeciw krztuścowi. Takie szczepionki są bezpieczne, niereaktogenne, immunogenne i ochronne u ludzi. W zakresie tego wynalazku możliwe są modyfikacje.

187 935 φ

s ο

o

-μ

Ν μ

Λ!

f•Η ο

φ

Ν μ

0.

•μ

X

C ο

•Η

ο.

φ

Ν

Ο

Ν <0

Φ

Ο λ:

μ

Ό s

ο

Ν φ

η

X •s

Odnośnik I________________	62	63	64	32 32	Lf) kD	kD kD	1?ε 1	r* kD
AGG3	1	1	1	ł 1	+		4-	+
AGG2	1	!	1	1 1	4-	4-	4-	+
Białko 69 kDa	1	1	1	1 +		4-	1	+
fil	ł	1	4-	4- 4-	4-	4-	4-	+
Czynnik przeprowadza -jący w toksoid	10 O 2		T3 f—-1 O	1-1 __l O o x r1 fi. k·	L?1	iX fil	X 10	X O
H CU	4-	4-	4-	+ 4-	+	4-	4*	+
Szczepionka	AMCV	43 X X CU to co 03 2	X G X X G >1 Φ X X co X G 'Φ M S	Smith-Kline	ή Cź § u	| Leclerle/Takeda	| Connaught i

<ΰ

G <0

Ο >»

-U (0

C tO

Φ

X

Μ

Ο

-U (ΰ

Ui

Ο

X) <ΰ

X

X

-Μ rX

Φ

Φ χ

υ

X

CU to

4-1

X

Φ (Ο χ

υ φ

w to

Φ

G

X

O

Ό

O r4

G

Φ i—I 4-1 Ό to G

G

OJ

O

4-1 n3

G ra

Φ

Ul

X

C

Φ

U ftf

G (0 ε

Ul

Ο

X

Π3

G

Φ ο

>1

4-1 <0

G

Φ Ό >1 X Φ Ό <—t (0 U (O 4-» G X CT>

G fO

O x

Π3

G

X

O o

G fO

X

Φ fi

O

X

X

-H

G (0

X

X

Φ

X

X o

$4

Π}

Φ to

Φ pi

Ό

G

Φ cn

O

X

O

X

X

O

X □

X

Ό Φ X t—I

X*

187 935

Οι •Η η η q

Ό

Ν ο &

α, g <tf cl, m E-.

s <

•H □

Oα c o 0) X5 -H <U N O Ό nl

0OM u CU Π3 <

O

Ό ·?,

CU £ £ ?ο V) ΟΟ ο td LO co ο «η Ο co τ- ο

CO b* 00 to 05 θ 05 <£

OO

X CM m

oo co co co’

CO %

CM

O

O

N-g m

co

Ν'

CM co

CM

CM

O cń co co cm h- M ci Ά CM τCM

CO co

- CM t

co

M >1

Μ θ O ^υ ls ^H U 24 <η <η (0 CO* oo m

I cn τcm ιη (D

CO

M· co co o_ ιγ o CM ΟΟ Τco o

- co o

CO rL: in £ Q co -T CM

Γ-N.

Ο CO_ cn in m co co cń cm m m

O

CO cm

CM CM in oó τ- CM o

I 1 > CO 4J H 0 -H r-i M-ł Cn <0 <0 e c o —1 X c ιη <Ό

C0 Ο

ΓΠ '''Τ

CM 00 <Λ ιη

Ο CN rτ- TT <*» <

CM in h-_

M- cm CM_ CO o CO CM CO

CM CM hco’ ŃCM O co’ <0 co ν- <ο οο τ- fs. τ- 00 fto ιη

CO cń 3 τ- in o o -cf

CD (N co CM m co ν- Σ’ o ó tn

CO co_

M· in m -ςco ó rcm

CM ο ί§ <ο co οο ιη

CD

S θ θ' iJ ώ

Tf n

co o τ- o C- CM o «Λ b*

CM

CO l·- cm M- O Ν· V CM CO

CO

CM

	r-
	co
ίο		r-
m	co	co
cń	ιη v	τφ
00	io J-	o
o	® X.	co

CD cn co τ

in .3 ;Ś

CO o

Tt rιη ιη co co V cń cm (Ο

CM cn m oo r- cm co CM in to οο ιη

CM f< οο CD co ιη σ-' O * CM ^θΛ tn

CM μ- K co co co ó CM CM cm

CO

CM_

CO b~~ CM CO τ- tJCM τo c . >1 : 4J 3 ; r—i Cn <

rco co in h- vin co m

m o

CM

T~ ’Τ co

Ο in cn m 00 T< ó o rcn

CO o

τ- CO v- -φ - I τ- LO CM CO co cn co

I O O X υ

-η 24 'ΓΊ 0) υ u co o N £

Ό > -H 5 O O w υ fQ O -V Η P co co x: co υ χι

N C O <0 -Η Ό XI <0

O

187 935

Tablica 3. Wyniki serologiczna dla składnikowych szczepionek przeciwkrztuścowych u niemowląt _(w wieku 2, 4 i 6 miesięcy)_ _

Błonica 3

CO o‘

N* O*

i e'o

0,4

N o’

CN o

co o

I 0,33 0,38

co LO o

r- CN o

o Φ -fsl G> 1-

co

O

tf5

CN

o

co

o co

05

r-

LO

CN τ-

ł □ o <

Λ O* CO c

w co

co o-

CN Ν'

n CO

•

O CN r*- 05* O tco CN

LO 00

r- co

h- (O

CO co

1 75 □ φ

«o £ 3**0 β E N §

o X o

O co

o LO

O CO

o Γ-. CN

cd OJ* CN

CO CN

r- CN co

•Ν’ CN co

o_ •Ν’

r* <0~ 05 co co

<O oj o

o_ co

CO 05

Ν’ LO CN

Ν' IO

r*- CO

z

Jjf

C <0 Ε

ł 3* 3 O) <

>_ C *z Φ 12 Oł c O 1= C

σ> CN 04

N· CN

o h-

CO 05

CO 05 CO CN

CN co’ O CO

n

co co o CN-

05 co’ 05 CO

CO co co o’ io cn CO CN

O5~ O CO

O)_ co o cn

O CO

N- CO

co co

05 CN

C Ν Ο £ φ Ε ο φ Ο)

(O O o cn

co

CO

o

Ν’ CO

05 05 CN

N CD

co o’ N

r-«-~ co

CO_ CO’

τ— p1» CO

fO_ CO* O

C0_ <D

o U5

co Ν’

05

(O τ—

φ 'c Ό Φ 1 w h<0

< X U-

r- co

CO co

m

co

CN o LO

r*-_ •N

CN if5 N

o_ m 05

O) co

if5 θ5. CN £ CD

^T co CO

h-

n* r- co co

CO

CN

H 0.

co co

co co

o CN

r*· co

00

o CN

N co LO

CO co CO

N o’

•^co_ m τ-’ o o T“ y—

r--_ CN CN

δ

CN O Ν’ CO

CN

cD

CO X N U -J

«5 Φ Ό N -*

co o

CO

LO 05

CN CO

LO co

O

CN CO

CO CO

o co

CN ° 5* m CN

CO lf)

co m

o co

O CO

O CO

O co

Φ C (O TJ (O CD

1 T3 O 'cn o o o §

φ OJ C N £ § ·“ 1 φ £ 5‘g o S o.

d < z 2 <

_ cn — TJ CO ® n 5 φ CO U-

cn co N CO IL

co TJ co c co

2 <« — TJ CO CO N C co co IL X

Ό N) o c .2 75 c c co o tj sr

75 φ u. 7z °

CD c co TJ co 0Q

<D N O 5 co c o Ξ 3 •o JC §.&

< ω Z) o < z

** 3 Ό O Ur 0.

co 5 o jZ t-nc Q S ° § §j CL Q_ 35 O O CL

co 5 o £ ‘O E o 8° co -£= So.

3 Φ TJ Φ

co ? o H -o ω E S o £ Λ O Śc Cl ω O CL

3 O

CO $ o h-fe-o Q C E § o a§° ΓΜ ΙΟ- CL o O O CL

3 _1 o

Jj ΓΜ ś g CL CL O O

co $ o i|f o s ° Sc 0. Φ O o-

3 o

<0 $ o h-fc-o °!i 5 1§ Q_ CL q> ϋ O Ol

co 5 o £ Ό E o j*; o as

3 Φ T3 Φ _]

oba lini-

« C N

CN

co

rf

U)

co

Q_

cn

Φ

O

Φ

O (0

O

D

Q_ (Λ

Φ cn _c o

<σ cn cn

Φ cn cn (0 cn φ

c ο

φ

Uο

JQ

Φ

Φ •c φ

Ό

Φ

Φ ‘c (0 £

>.

cn c

Φ

a.

•σ φ

φ ο

ο.

1_

Ο

Ο

JZ cn

Φ ς_

Ο φ

ο

XI φ

Ο

Φ

C

Ο φ

φ

TJ $

Ο φ

ο φ

ο

Xł φ

-C σ>

Ό

Φ

C

C ο

ο χ:

σ>

□ φ

c c

ο

Ο

187 935

TABLICA 4 - Skuteczność bezkomórkowych szczepionek przeciwkrztuścowych

Szczepionka % skuteczności

CP 10/5/5/3DT

84,7 (80 , 3-88 8 ,5 ) ¹

PTos .FHA05DT (49,8—-64,8)

DPTO

4*7_Z 9 (77,3-5-56 , 9 )

A: określenie przypadku: 21-dniowy kaszel spazmatyczny i wynik posiewu pozytywny

B: określenie przypadku: łagodny kaszel krztuścowy trwający co najmniej jeden dzień

Uwaga 1: granice ufności

Uwaga 2: pełnokomórkową szczepionka przeciwkrztuścowa

187 935

TABLICA

O rH ΛΙ σΡ	CD CD	n ’χΓ CD	88,9	81, 0
ιη T~f ο Λί σΡ	σι l> cn	CO σ	100	i—H «Κ Γ— σ
GMT (przedział ufności 95%)	o m - ? - ii	σ o - ? Γη	3, 83 (3, 05-4,80)	r- o S < ™ £ CN
Z	327	322	108	105
SZCZEPIONKA	>1 rM ft H 1 ft Pi ft 1 > ft M > I Em Q ft U X	HCPDT-mIPV do rekonstytucji PRP-T .J	HCPDT-mIPV i PRP-T (oddzielne)	DPT-IPV do rekonstytucji PRP-T

187 935

CO o

ł-l

POLIO 3	co KO CN r-4	(1 082-1 485)	|------ 1 938 1	(1 640-2 291)	1 837	(1 362-2 477)	2 726	(2 108-3,525)
				O		O		co
		r—ł		Γ		co		r-
CM		co		tn		co		co
	r-		CO		LO		n*
o	cn	CN	Γ	CN	cn	co	cn	co
Hf	CO	1	T“1	1	uo	i	uo	1
X		PO		Γ*		uo		o
O	<M		CM	co	CM	o	CM	o
CU		o		co		o		o
		CN		ł-ł		CM		CN
						X—»		tn
r-l		CN		uo		o		m
		CO		Γ-		co		CN
o		Γ-	CO	co	CN	σ\	cn
M	CM	1	1—f	1	O	1	ao	i—ł
J	CO	co	r-~	cn	r-	ΓΟ	co	1
o		co		co		r-ł		O
CU		m		LO		lf)		co
						—'		co
	co		co		co		tn
2	CM		CM		o		o
	CO		CO		r—1		T-1
			&H
			CU
			CC		.—.		Eh
			CU		a)		1
					3		CU
			•H		c-4		cc
			•ΓΊ		(U		CU
			υ		-H
			3		N		-r-ł
	.__		-P		•o		Ή
	c		>1		Ό		u
2	>.		-P		O		3
2	rH		to		T		-P
υ	ft		a
M			o				-P
CU			Λί		ł		w
ω	Ε-»		(V		04		c
N	I		P		04		o
o	CU				Oj		λ:
CM	a;		o				0)
ω	CU		Ό		-H		P
	>		>		>		o
	CU		CU		Oj		TJ
	H		ł—ł		W
	>		E		E		>
	1		i		l		CU
			H		H		M
	a		Q		a		1
	CU		CU		Ol,		Eh
	r i		r i		u		Oj
	w		X		X		a

187 935

TABLICA

DPT-IPV do rekonstytucj i PRP-T (n = 105)	15, 2 (12,2-19,0)	31, 4 (27,2-36,2)	332, 3 (264,6-417,3)	r-* ?! ro' i	0,29 (0,22-0,38)	0, 63 (0, 51-0,78)
HCPDT-mIPV i PRP- T (oddzielne) (n = 108)	102, 6 (90,5-116,4)	165,3 (148,4-184,3)	355,0 (279,4-451,1)	40, 5 (33,0-49,7)	0, 36 (0,28-0,46)	kO co γ ^3* i—t
HCPDT-mIPV do rekonstytucji PRP-T 1 (n = 322)	89, 1 (82,5-96,1)	152,5 (143,6-162,0)	244,5 (211,4-282,7)	'tr o 3 to ’ u) σι 'tT	0, 28 (0,24-0,33)	0, 88 (0,80-0,96)
E-< ł CU OC Λ > <c ?! CU > > ft 11 H “ 3 ci CU u SC	86, 7 (80,9-93,0)	Γ tr r- lD l lO CN rH Γ- 'tT t-1	276, 2 (242,2-315,1)	55, 2 (48,7-62,5)	0,29 (0,25-0,33)	1,09 (1,00-1,19)
ANTYGEN	PT		FIM	Pertaktyna	Błoniczy	Tężcowy

187 935

187 935

Połączenie PRP-T ze składnikową szczepionką przeciwkrztuścową podaniu łącznym lub oddzielnym tego samego lub w różnych dnia o

o.

	Ή
’ΓΊ	<
Φ	3
Ή	Ο
C	Ω
'Μ	>ι
ο	(Ź
a	CQ Ε-
	>« ι
υ	X CU
(θ’	\ οί
•Η	< CU
W	2
Φ	IS3
•Η	Ο
β	>*
	ω
t-H	<
	►J
	SŚ
>1
υ
α> Η	Ή
W	<
	3
β	Ο Ω

Φ

Ή ί

O

Ω

Ci

CQ

K

E-i

Q

Qi υ

N υ

w a

E-*

Q

CU

O tr

C\1 co

O) c

r-4

0) •H

N

Ό

Ό

O fU

Ή β

Ό

O σ» φ * * II (0 ^{11 w} £ ο

ζρ

Φ

-Ρ

Η <ϋ

-γί

CU υ

Λί φ ♦Η — ·Κ £ I—ι £ 3 σ)

4-* Ν U > Ο J-> C 3 >1 — Ό Φ γ0D

CU α;

(Χι •Η ϋ

Φ

Ν

Μ £Χ

Ν υ

•Η £

Ο γΜ ffl >1

Ο υ

Φ4 α>

Η <Ό

C

4J

4->

Μ

Φ

CU •Η β

>.

Ρ ι—I CP

187 935

PIŚMIENNICTWO

1. Muller, A.S., Ldeuweaaurg, J. i Pratt, D.S. (1986) Pertussis: epidemiology aod control. Buli WHO 64:^^1^331.

2. Fioe, P.E.M. i Clarkson, J.A. (1984) Di5trlautioa of immunity to pertussis ia the populatioo of Eaglaad and Wales. J. Hyg. 92: 21-26.

3. Mortimer, E.A. Jr. (1990) Pertussis aad its prdveatloo: a family affair. J. Infect. Dis. 161:473-479.

4. Addiss, D.G., Davis, I.P., Meade, B.P., Burstyn, D.G., Meissner, M., Zastrow, J.A., Berg, J.L., Drinka, P. i Phillips, R. (1991) A pertussis gutareak ia a Wisconsio aursiag home. J. Infect. Dis. 164: 704-710.

5. Halperin, S.A. i Marrie, T.J. (1991a) A pertussis encephalopathy ia aa adult: case report and ^iew. Rev. Infect. Dis. 13: 1043-1047.

6. Onorato, I.M., Wassilak, S.G. i Meade, B. (1992) Efficacy of whold-cdll pertussis vaccioe in pres^^l children ia the United States. Jama 267: 2745-2749.

7. Miller, D.L., Ross, E.M., Alndr5ladd, R., Bellman, M.H. i Brawson, N.S.B. (1981) Pertussis immunization and serious acute neurglogical iloess ia childreo. Brit Med. J. 282: 1595-1599.

8. Tamura, M., Nogimori, K., Murai, S., Yajima, M., Ito, K., Katada, T., Ui, M. i Ishii, S. (1982) Subunit structure of islet-activating protein, pertussis toKin, ia cooformity with A-B model. Biochemistry 21: 5516-5522.

9. Tuomaodn, E. i Weiss, A. (1985) Characterizatioo of two adhesios of Bor^tel^ pertussis for human ciliated respiratory epithelial cells. J. Iafect. Dis. 152: 118-125.

10. Friedman, R.-L., Nordeassoo, K., Wilson, L., Akporiaye, E.T. i Yocum, D.E. (1992) Uptake aod iotracellular survival of BoMete^ pertussis io humao macrophages. Infect. Iomuo. 60: 4578-4585.

11. Pittmao, M. (1979) Pertussis toxin: the cause of the harmful effects and prolongdn immunity of wboopiog cough. A hypothdsls. Rev. Infect. Dis. 1: 401-402.

12. Graostrom, M. i Granstrom, G. (1993) Serological correlates in whooping cough. Vaccind 11: 445-448.

13. Gearing, A.J.H., Bird, C.R., Readhead, K. i Thomas, M. (1989) Humao cellular immune responses to Bor^tel^ pertussis iafectioa. FEMS Mlcrgalαl. Iimunol. 47: 205-212.

14. Thomas, M.G., Redhead, K. i Lambert, H.P. (1989a) Humao serum bntiagdy respooses to Bordetella pertussis infectioa aod pertussis vaccioation. J. Iafect. Dis. 159:211-218.

15. Thomas, M.G., Ashworth, L.A.E., Miller, E. i Lambert, H.P. (1989b). Serum IgG, IgA and IgM rdspooeses to pertussis toKio, filamdntgus hadmagglutonin, and agglutinogdos 2 aod 3 after iofection with Bgrnetdlla pertussis and immuaizatioa with wRo^cell pertussis vaccine. J. Iafect. Dis. 160: 838-845.

16. Tomoda, T., Ogura, H. i Kurashige, T. (1991) Immuae responses to Bo^tel^ pertussis infectioa and vaccinatlgn. J. Infect. Dis. 163: 559-563.

17. Peterseo, J.W., Ibsen, P.H., Haskoe, K. Capiau, C. I Heron, I. (1992a). Prglifdrbtivd respoases aod gamma interferon and tumor necrosis factor production by lymphocytes isolated from trachcobrgnchdal lymp aodes and spleeas of mice xx aerosol, infe^d with Bordetella pertussis. Iofect. Immun. 60: 4563-4570.

18. Eogluod, J.A., Reed, G.F., Edwards, K.M., Decker, D., Pichichero, M.E., Ronoels, M.B., Steiahoff, M.C., Anderson, E.L., Meade, B.D., Delona, M.A. i NIAID Acellular Pertussis Vaccioe Group (1992b) Effect oo traasplacdntal aotibody aod development of pertussis toxia (PI) and filbmentgus haemagglutonia (FHA) aatiagny after acellular (AC) and whole celi (WC) pertussis ^ccines in infants. Pediat. Res. 31: 91 A.

19. Oda, M., Cowell, J.L., Burstyn, D.G., Thaib, S. I Maoclark, C.R. (1985) Aotlaonies to BoMete^ pertussis io human colostrum aod their protec^e activity agaiost aerosol infection of mice. Infect Imouo. 47: 441-445.

20. Peterseni, J.W., P.H. Beatzon, M.W., Capiau, C. I Heroa, I. (1991) The celi mediated aod humoral immune respoase to vkcclnatlon with acellular aod whole cell pertussis vaccine ia adult humans. FEMS Micrgalgl. Lett. 76: 279-288.

187 935

21. Oda, M., Cowell, J.L., Burstyn, D.G. i Manclark, C.R. (1984) Protective activities of the filamentous haemagglutonin and the lymphocytosis-promoting factor of Bordetella pertussis in mice. J. Infect. Dis. 150: 823-833.

22. Sato, H., Ito, A., Chiba, J. i Sato, Y. (1984b) Monoclonal anti0ody against pertussis toxin: effect on toxin activity and pertussis infections. Infect. Immun. 46: 422-428.

23. Sato, H. i Sato, Y. (1990) Protective activities in mice of monoclonal antibodies agains pertussis toxin. Infect. Immun. 58: 3369-3374.

24. Weiss, A.A. i Hewlett, E.L. (1986) Virulence factors of Bordetella pertussis. Ann. Rev. Microbiol. 40: 661-668.

25. Munoz, J.J. (1988) Action of pertussigen (pertussis toxin) on the host immune system. W: Pathogenesis and Immunity in Pertussis. A.C. Wardlaw i R. Parton, red., John Wiley & Sons Lid,, Toronto, str. 211-229.

26. Watkins, P.A., Burns, D.L., Kanaho, Y., Liu, T.Y., Hewlett, E.L. i Moss, J. (1985) ADP-riOosylation of transducin by pertussis toxin. J. Biol. Chem. 260: 13478-13482.

27. Bums, D.L., Kenimer, J.G. i Manclark, C.R. (1987) Role of the A subunit of pertussis toxin in alteration of Chinese hamster ovary cell morphology. Infect. Immun. 55: 24-28.

28. Munoz, J.J., Arai, H. i Cole, R.L. (1981) Mouseprotecting and histamine-sensitizing activities of pertussigen and flm0rial hemagglutinins from Bordetella pertussis. Infect. Imnun. 32: 243-250.

29. Reiman, D.A., Domenighini, M., Tuomanen, E., Rappuoli, R. i Falkow, S. (1989) Filamentous haemagglutonin of Bordetella pertussis: nucleotide seąuence and crucial role in adherence. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 2637-2641.

30. Di Tommaso, A., Domenighini, M., Bugnoli, M., Tagliabuc, A., Rappuoli, R. i De Magistris, M.T. (1991) Identification of subregions of Bordetella pertussis filamentous haemagglutonin that stimulate human T-cell responses. Infect. Immun. 59: 3313-3315.

31. Tomoda, T., Ogura, H. i Kurashige, T. (1992) The longevity of the immune response to filamentous haemagglutonin and pertussis toxin in patients with pertussis in a semiclosed community. J. Infect. Dis. 166: 908-910.

32. Edwards, K.M., Meade, B.D., Decker, M.D., Reed, G.F., Rennels, M.B., Steinhoff, M.C., Andersen, E.L., Englund, J.A., Pichichero, M.E., Deloria, M.A., Deforest, A. i NIAID Acellular Pertussis Yaccine Study Group (1992) Comparison of thirteen acellular pertussis vaccines: serological response. Pediatr. Res. 31: 91 A.

33. Kimura, A., Mountzoutos, K.T., Reiman, D.A., Falkow, S. i Cowell, J.L. (1990a) Bordetella pertussis filamentous haemagglutonin: evaluation as a protective antigen and colonization factor in a mouse respiratory infection model. Infect. Immun. 58: 7-16.

34. Shahin, R.D., Ams0augh, D.F. i Leef, M.F. (1992) Mucosal immunization with filamentous haemagglutonin protecs agains Bordetella pertussis respiratory infection. Infect. Imnun. 60: 1482-1488.

35. Montaraz, J.A., Novotny, P. i Ivanyi, J. (1985) Identification of 68-kilodalton protective protein antigen from Bordetella bronchiseptica. Infect. Immun. 161: 581-582.

36. Leininger, E., Roberts, M., Kenimer, J.G., Charles, I.G., Fairweather, M., Novotny. P. i Brennan, M. J. (1991) Pertactin, and Arg-Gly-Asp-containing Bordetella pertussis surface protein that promotes adherence of mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 345-349.

37. De Magistris, T., Romano, M., Nuti, S., Rappuoli, R. I Tagliabue, A. (1988) Dissecting human T responses against Bordetella species. J. Exp. Med. 168: 1351-1362.

38. Seddon, P.C., Novotny, P., Hall, C.A. i Smith, C. S. (1990) Systemie and mucosal antiąody response to Bordetella pertussis antigens in children with whooping cough. Serodiagnosis Imnunother. Inf. Dis. 3: 337-343.

39. Podda, A., Nencioni, L., Marsili, I., Peppoloni, S., Yolpini, G., Donati, D., Di Tommaso, A., De Magistris, M.T. i Rappuoli, R. (1991) Phase I clinical trial of an acellular pertussis vaccine composed of genetically detoxified pertussis toxin combined with Fha and 69 kDa. Yaccine 9: 741-745.

187 935

40. Roberts, M., Tite, J.P., Fairweather, N.F., Dougan, G. i Charles, I.G. (1992) Recombinant P.69/pertactin: immunogenicity and protection of mice against Bordetella pertussis infection. Vaccine 10: 43-48.

41. Novotay, P., Chubb, A.P., Cownley, K. i Charles, I.G. (1991) Biological and protective properties of the 69kDa outer membranę protein of Bordetella pertussis: a novel formulation for an acellular vaccine. J. Infect. Dis. 164: 114-155.

42. Shahin, R.D., Brennan, M.J., Li, Z.M., Meade, B.D. I Manclark, C.R. (1990b) Characterization of the proieciive capacity and immunogenicity of the 69kD outer membranę protein of Bordetella pertussis. J. Exp. Med. Ill: 63-73.

43. Robinson, A., Irons, L.I. i Ashworth, L.A.E. (1985a) Pertussis vaccine: present status and future prospects. Vaccine 3: 11-22.

44. Robinson, A., Ashworth, L.A.E., Baskerville, A. I Irons, L.I. (1985b) Proieciion against intranasal infection of mice wMi Bordetella pertussis. Develop. Biol. Stand. 61: 165-172.

45. Robinson, A., Gorrige, A.R., Funnell, S.G.P. I Fernandez, M. (1989b) Serospecific protection of mice against in infection with Bordetella pertussis. Vaccine 7: 051-354.

46. Sato, Y., Kimura, M. i Fukumi, H. (1984a) Development of a pertussis component vaccine in Japan. Lancet i: 125-156.

47. Kimura, M. (1991) japanese clinical experlmenis with acellular pertussis vaccin.es. Develop. Biol. Standard. 7.3: 5-9.

48. Ad Hoc Group for the Study of Pertussis Yaccines (1988) Placebo-contiolled trial of two acellular vaccines in Sweden-proieciive eficacy and adverse effects. Lancet i: 955-960.

49. Olin, P., Storsaeter, J. i Romanus, V. (1989) The efficacy of acellular pertussis vaccine. JAMA 261: 560.

50. Storsaeter, J., Hallander, H., Farrington, C.P., Olin, P., Moliby, R. i Miller, E. (1990) Secondary analyses of the efficacy of two acellular pertussis vaccines evaluated in a Swedish phase III trial. Yaccine 8: 457-462.

51. Storsaeter, J. i Olin, P. (1992) Relative efficacy of two acellular pertussis vaccines during three years of passive surveillence. Yaccine 10: 142-144.

52. Tan, L.U.T., Fahim, R.E.F., Jackson, G., Phillips, K., Wah, P., Alkema, D., Zobrist, G., Herbert, A., Boux, L., Chong, P., Harjee, N., Klein, M. i Vose, J. (1991) A novel provess for preparing an acellular pertussis vaccine composed of non-pyrogenic toxoids of pertussis toxin and filamentous haemagglutonin, Molec. Inmunol. 28: 55l-555.

53. Sekura, R.D., Zhang, Y., Roberson, R„ Acton, B., Trollfors, B., Tolson, N., Siloach, J., Bryła, D., Muir-Nash, J., Koeller, D., Schneerson, R. i Robbins, J.B. (1988) Clinical, metabolic and antibody responses of adult volunteers to an investigation vaccine composed of pertussis toxin inactivated by hydrogen peroxide. J. Pediatr. 113: 807-813.

54. Wlnberry, L., Walker, R., Cohen, N., Todd, C.,Sentissi, A. i Siber, G. (1988) Evaluation of a new method for lnactivating pertussis toxln with iciraniiromeihanc. JntemationaJ Workshop on Bordetella pertussis, Rocky Mountain Laboratories, Hamilton, Montana.

55. Sekura, R.D. i in. (1993) J. Biol. Chem. 258: 14647 - 14651.

56. Irons, L.I. i in. (1979) Biochim. Biophys Acta 580: 175-185. Munoz, J.J. i in. (1981) infect. Immun. 33: 825-826. Cowell, J.L. i in. (1980) Seminar on Infectious Diseases 4: 371-379.

59. Selmer, J.C. (1984) Acta Path. Microbial. Iwmunol. Scand. Sect. C, 92: 279-284.

60. Lockhoff, O. (1991) Glycolipids as Immunomodulators: Synthesis and Properties, Chem. Int. Ed. Engl. 30: 1611-162^.

61. Nixon-George, A., Moran, T., Dionne, G., Penney, C.L., Lafleur, D., Bona, C.A. (1990) The adjuvant effect of stearyl tyrosine on a recombinant subunit hepatitis B surface antigen. J. Immunol. 144: 4798-4802.

62. Siber, G.R., Thakrar, N., Yancey, B.A., Herzog, L., Todd, C., Cohen, N., Sekura, R.D., Lowe, C.U. (1991) Safety and immunogenicity of hydrogen peroxide-inactivated pertussis toxoid in 18-mont old children. Vaccine 9: 700-745.

63. Siber, G., Winberry, L., Todd, C., Samore, M., Sentissi, A. i Cohen, N. (1988) Safety and immunogenicity in adults of pertussis ioxoid inactivated with ieironiiromcihane. W: International Workshop on Bordetella pertussis, Rocky Mountain Laboratories, Hamilton, Montana.

187 935

64. Edwards, K.M., Bradley, R.B., Decker, M.D., Palmer, P.S., Van Savage, J., Taylor, J.C., Dupont, W.D., Hager, C.C. i Wright, P.F. (1989) Evaluation of a new highly purified pertussis vaccine in infants and children. J. Infect. Dis. 160: 832-837.

Rutter, D.A., Ashworth, L.A.E., Day, A., Funnell, S., Levell, F. i Robinson, A. (1988) Trial of new acellular pertussis vaccine in healthy adult vilunteers. Vaccine 6: 29-32.

66. Blumberg, D.A., Mink, C.A.M., Cherry, J.D., Johnson, C., Garber, R., Plotkin, S.A., Watson, B., Ballanco, G.A., Daum, R.S., Sullivan, B., Townsend, T.R., Brayton, J., Gooch, W.M., Nelson, D.B., Congeni, B.L., Prober, C.G., Hackell, J.G., Dekker, C.L., Christenson, P. D. i ApDT Yaccine Study Group (1991) Comparison of acellular and whole celi pertussiscomponent diphtheria-tetanus-pertussis vaccines in infants. J. Pediatr. 119: 194-204.

67. Englund, J.A., Glezen, W.P. i Barreto, L. (1992a) Controlled study of a new fivecomponent acellular pertussis vaccine in adults in young children. J. Inf. Dis. 166: 1436-1441.

68. Zealey, G., Loosmore, S., Yacoob, R., Klein, M., Yaccine Research, tom 1, str. 413-427.

69. Baker, J.D., Halperin, S.A., Edwards, K., Miller, B., Decker, M., Stephens, D. Antibody response to Bordetella pertussis antigens after immunization with American and Canadian whole cell vaccines. J. Pediatr., 1992, 121: 523-527.

70. Halperin, S.A., Eastwood, B.J., Langley, J.M. Immune responses to pertussis vaccines concurrently administered with viral vaccines. Ann. NY Acad. Sci. 1995, 754: 89-96.

71. Halperin, S.A., Langley, J.M., Eastwood, B. J. Effect of inactivated poliovirus vaccine on the antibody response to Bordetella pertussis antigens when combined with diphtheria-pertussis-tetanus vaccine. Glin. Infect. Dis. 1996; w druku.

72. Ferreccio, C., Clemens, J., Avendano i in. The clinical and immunogenic response of Chilean infants to Haemophilus influenzae type b polysaccharide tetanus protein conjugate vaccine coadministered in the same syringe with diphtheria-tetanus toxoide-pertussis vaccine at two, four and six months of agę. Pediatr. Infect. Dis. J. 1991; 10: 761-771.

73. Clemens, J., Ferreccio, C., Levine, M. i in. Impact of . Haemophilus influenzae typ b polysaccharide-tetanus protein conjugate vaccine on responses to concurrently administered diphtheria tetanus pertussis vaccine. JAMA 1992; 267: 673-8.

74. Scheifele, D., Barreto, L., Meekison, W. i in. Can Haemophilus influenzae vaccine be combined with diphtheria and tetanus toxoid. Can. Med. Assoc. J. 1993; 149: 1105-16.

Gold, R., Scheifele, D., Barreto, L. i in. Safety and immunogenicity of Haemophilus influnzae vaccine (tetanus toxoid conjugate) administered concurrently or combined with diphtheria and tetanus toxoids, pertussis vaccine and inactivated poliomyelitis vaccine to healthy infants at two, four and six months of agę. Pediatr. Infect. Dis. J. 1994; 13: 348-55.

76. Shinefield, H., Black, S., Ray, P., Lewis, E., Fireman, B., Hohenboken, Hackell, J.G. Safety of combined acellular pertussis vaccine in infants [sbstract no G72], W: Program and Abstracts of the 35°¹ Interscience Conference on Antimicrobiols and Chemotherapy. Washington, DC; American Society of Microbiology 1995: 171.

77. Greenberg, D.P., Wong, V.K., Partridge, S. Howe, B.J., Fing, J., Ward, J.L. Evaluation of a new combination vaccine that incorporates diphtheria-tetanus-acellular pertussis, hepatitis b and Haemophilus influenzae type b conjugate vaccines [abstract no G70], W: Program and Abstracts of the 35^ Interscience Conference on Antimicrobiols and Chemotherapy; Washington, DC; American Society of Microbiology 1995: 170.

78. Wassilak, S.G.F., Orenstein W.A., Tetanus, W: Plotkin, S.A., Mortimer, E.A., Jr., red., Vaccines, WB Saunders Company, Filadelfia, 1988; 45-73.

80. Mortmer, E.A., Jr., Diphtheria Toxoid, W: Plotkin, S.A., Mortimer, E.A., Jr., red., Vaccines, WB Saunders Company, Filadelfia, 1988; 31-44.

81. Varughese, P Haemophilus Influenzae infection in Canada, 1969-1985. Can. Dis. WklyRep. 1986; 12: 37-43.

82. Scheifele, D., Gold, R., Law, B. i in.: Decline in Haemophilus Influenzae type b invasive infections at five Canadian pediatrie centers. Can. Commun. Dis. Rep. 1993; 19: 88-91.

187 935

83. Scheifele, D., Barreto, L., Meekison, W. i in.: Can Haemophilus influenzae type btetanus toxoid conjugate vaccine be combined with diphtheria toxoid-pertussis vaccinetetanus toxoid? Can. Med. Assoc. J. 1993, 149: 1105-1112.

84. Gold, R., Scheifele, D., Barreto, L. i in.: Safety and Immunogenicity of Haemophilus Influenzae type b vaccine (tetanus toxoid conjugate) administered concurrently or combined with diphtheria and tetanus toxoids, pertussis vaccine and inactivated poliomyelitis vaccines to healthy infants at two, four and six months of agę. Pediatrie Infectious Diseases Journal 1994; 13: 348-55.

85. Scheifele, D., Gold, R. i in. Canada Communicable Diseases Report 22-3, F1-F3 Feb 1, 1996.

187 935

Masa komórkowa Bordetella

Pozostały wytrącony materiał pptl

Pierwszy supernatant

80*C 30 Minut

Sklarowany supernatant sp2

Drugi wytrącony materiał ppt2

Drugi supernatant sp3

Trzeci wytrącony materiał ' ppt3 nieoczyszczony rgztwór fimbrii_ i chromatografia — kolumnowa preparat aglutynogenów

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (23)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Multiwalentna immunogenna kompozycja do nadawania ochrony gospodarzowi wobec choroby powodowanej przez infekcję Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, wirusa polio, znamienna tym, że zawiera:

   (a) toksoid krztuścowy, hemaglutyninę filamentową, pertaktynę i aglutynogeny w oczyszczonej postaci, (b) toksoid tężcowy, (c) toksoid błoniczy, i (d) inaktywowanego wirusa polio, ma postać szczepionki do podawania in vivo gospodarzowi, przy czym poszczególnym składnikom kompozycji nadaje się postać w taki sposób, że immunogenność poszczególnych składników tej kompozycji pozostaje stała.
2. 2. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera ponadto adiuwant.
3. 3. Kompozycja immunogenna według zastrz. 2, znamienna tym, że jako adiuwant zawiera wodorotlenek glinowy lub fosforan glinowy.
4. 4. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1, albo 2, albo 3, znamienna tym, że zawiera toksoid krztuścowy w ilości odpowiadającej od około 5 do około 30 pg azotu, hemaglutyninę filamentową w ilości odpowiadającej od około 5 do około 30 pg azotu, pertaktynę w ilości odpowiadającej od około 3 do około 15 pg azotu i aglutynogeny w ilości odpowiadającej od około 1 do około 10 pg azotu, w pojedynczej dawce dla człowieka.
5. 5. Kompozycja immunogenna według zastrz. 4, znamienna tym, że zawiera 20 fig azotu toksoidu krztuścowego, 20 pg azotu hemaglutyniny filamentowej, 5 pg azotu pertaktyny i 3 pg azotu aglutynogenów, w pojedynczej dawce dla człowieka.
6. 6. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera toksoid błoniczy w ilości od 10 do 20 Lf, a toksoid tężcowy w ilości od 1 do 10 Lf.
7. 7. Kompozycja immunogenna według zastrz. 6, znamienna tym, że zawiera toksoid błoniczy w ilości 15 Lf a toksoid tężcowy w ilości 5 Lf.
8. 8. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1, znamienna tym, że inaktywowany wirus polio obejmuje mieszaninę inaktywowanych wirusów polio typu 1, 2 i 3.
9. 9. Kompozycja immunogenna według zastrz. 8, znamienna tym, że zawiera mieszaninę inaktywowanych wirusów polio typu 12 i 3 w następujących proporcjach:

   20 do 50 jednostek antygenu D wirusa polio typu 1 5 do 10 jednostek antygenu D wirusa polio typu 2

   20 do 50 jednostek antygenu D wirusa polio typu 3, w pojedynczej dawce dla człowieka.
10. 10. Kompozycja immunogenna według zastrz. 9, znamienna tym, że zawiera mieszaninę inaktywowanych wirusów polio typu 1, 2 i 3 w następujących proporcjach:

    40 jednostek antygenu D wirusa polio typu 1 8 jednostek antygenu D wirusa polio typu 2

    32 jednostki antygenu D wirusa polio typu 3, w pojedynczej dawce dla człowieka.
11. 11. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1, znamienna tym, że nadaje ponadto ochronę wobec choroby powodowanej przez infekcje Haemophilus influenzae i zawiera ponadto koniugat cząsteczki nośnikowej wybrany z grupy składającej się z toksoidu tężcowego i toksoidu błoniczego i polisacharydu otoczkowego Haemophilus influenzae typu b.
12. 12. Kompozycja immunogenna według zastrz. 11, znamienna tym, że jako koniugat zawiera koniugat toksoidu tężcowego lub toksoidu błoniczego i fosforan polirybozorybitolu (PRP) Haemophilus influenzae typu b.

    187 935
13. 13. Kompozycja immunogenna według zastrz. 11, znamienna tym, że koniugat dostarcza się w postaci zliofilizowanej i do podawania w kompozycji immunogennej rekonstytuuje się składnikami kompozycji.
14. 14. Kompozycja immunogenna według zastrz. 11, znamienna tym, że zawiera koniugat w ilości 5 do 15 pg PRP skoniugowanego z około 15 do około 35 pg toksoidu tężcowego, w pojedynczej dawce dla człowieka.
15. 15. Kompozycja immunogenna według zastrz. 14, znamienna tym, że zawiera koniugat w ilości 10 pg PRP skoniugowanego z około 20 pg toksoidu tężcowego, w pojedynczej dawce dla człowieka.
16. 16. Zastosowanie kompozycji immunogennej opisanej w zastrz. 1, do wytwarzania leku do immunizowania gospodarza przeciwko chorobie.
17. 17. Multiwalentna kompozycja szczepionki, znamienna tym, że zawiera na dawkę o objętości 0,5 ml:

    20 pg toksoidu krztuścowego 20 pg hemaglutyniny filamentowej

    5 pg fimbrii 2 i 3

    3 pg białka błonowego pertaktyny 15 Lf toksoidu błoniczego

    5 Lf toksoidu tężcowego 40 jednostek antygenu D wirusa polio typu 1

    8 jednostek antygenu D wirusa polio typu 2 1,5 pg fosforanu glinowegg.
18. 18. Kompozycja według zastrz. 17, znamienna tym, że zawiera ponadto na dawkę o objętości 0,5 ml:

    10 pg oczyszczonego polisacharydu otoczkowego fosforanu poliaybozrrybitolu (PRP) Haemophilus influenzae typu b kowalencyjnie związanego z 20 pg toksoidu tężcowego.
19. 19. Kompozycja według zastrz. 17 albo 18, znamienna tym, że zawiera ponadto na dawkę o objętości 0,5 ml:

    0,6% 2-feooksyetαool.
20. 20. Zastosowanie kompozycji immunogennej opisanej w zastrz. 17 do wytwarzania leku do immunizowania gospodarza przeciwko chorobie.
21. 21. Multiwalentna immunogenna kompozycja do nadawania ochrony gospodarzowi wobec choroby powodowanej przez infekcje Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae i Haemophilus influenzae, znamienna tym, że zawiera:

    (a) toksoid krztuścowy, hemaglutyninę filameotrwą, pertaktynę i aglutynogeny w oczyszczonej postaci, (b) toksoid tężcowy, (c) toksoid błoniczy, i (d) koniugat cząsteczki nośnikowej i polisacharydu otoczkowego Haemophilus influenzae typu b, ma postać szczepionki do podawania in vivo gospodarzowi, przy czym poszczególnym składnikom kompozycji nadaje się postać w taki sposób, że immunrgeoorść poszczególnych składników tej kompozycji pozostaje stała.
22. 22. Kompozycja immunogenna według zastrz. 21, znamienna tym, że zawiera cząsteczkę nośnikową wybraną spośród toksoidu tężcowego i toksoidu błoniczego.
23. 23. Zastosowanie kompozycji immuoogeooej opisanej w zastrz. 21 do wytwarzania leku do immunizowania gospodarza przeciwko chorobie.

    Wynalazek dotyczy multiwalentnej kompozycji immunogennej do nadawania ochrony gospodarzowi wobec choroby powodowanej przez infekcje Bordetella pertussis, Clostridium

    187 935 tetani, Corynebacterium diphtheriae i wirusa polio lub Haemophilus influenzae, multiwalentnej kompozycji szczepionki, oraz ich zastosowania, szczególnie w pediatrii.

    Odnośniki do pokrewnych zgłoszeń.

    Zgłoszenie to jest kontynuacja w części równolegle rozpatrywanego zgłoszenia amerykańskiego nr 08/501,743, zgłoszonego 12 czerwca 1995, które samo jest kontynuacją w części równolegle rozpatrywanego zgłoszenia amerykańskiego nr 08/433,646 zgłoszonego 4 maja 1995.

    Podstawa wynalazku.

    Krztusiec albo koklusz jest ciężkim, wysoce zakaźnym zakażeniem górnych dróg oddechowych wywoływanych przez Bordetella pertussis. Światowa Organizacja Zdrowia oszacowała, że rocznie występuje około 60 milionów przypadków kokluszu i od 0,5 do 1 miliona związanych z nim zgonów (ref. 1). W niniejszym opisie w nawiasach powołane są różne odnośniki w celu pełniejszego opisu stanu techniki, którego dotyczy niniejszy wynalazek. Pełna informacja bibliograficzna do każdego cytowania znajduje się na końcu dokumentacji, bezpośrednio po zastrzeżeniach. Ujawnienia podawane w tych odnośnikach są włączone do niniejszego ujawnienia przez odnośniki. W populacjach nieszczepionych obserwowany współczynnik występowania kokluszu u dzieci poniżej 5 roku życia jest wysoki i sięga 80% (ref. 2). Mimo, że koklusz jest ogólnie rozpatrywany jako choroba wieku dziecięcego, rośnie częstość występowania choroby w postaci objawowej i bezobjawowej u młodzieży i dorosłych (ref. 3,4 i 5).

    Wprowadzenie w latach 40-tych XX wieku opartej na całych komórkach szczepionki wytworzonej z inaktywowanych chemicznie i ciepłem organizmów B. pertussis było odpowiedzialne za dramatyczne zmniejszenie częstości występowania spowodowanego przez B. pertussis krztuśca. Współczynniki skuteczności szczepionek opartych na całych komórkach oszacowano na powyżej 95% w zależności od definicji przypadku (ref. 6). Podczas gdy zakażenie B. pertussis daje ochronę immunologiczną na całe życie, to rośnie częstość występowania zanikającej ochrony po immunizacji szczepionkami opartymi na całych komórkach (ref.3). Wiele raportów donosi o związku między szczepieniem przeciwko kokluszowi szczepionką opartą na całych komórkach, a reaktywnością i poważnymi skutkami ubocznymi prowadzącymi do zmniejszenia akceptacji szczepionki i następowym wznawianiem epidemii (ref. 7). Ostatnio opracowano szczepionkę przeciwko kokluszowi na zdefiniowanym składniku.

    Antygeny dla zdefiniowanych szczepionek przeciwko kokluszowi.

    Opracowano różnorodne bezkomórkowe szczepionki przeciwko kokluszowi zawierające antygeny Bordetella pertussis, toksynę krztuścową (PT), hemaglutyninę filamentową (FHA), zewnątrzbłonowe białko 69kDa (pertaktyna) i aglutynogeny fimbrii (patrz tabela 1 poniżej. Tabele znajdują się na końcu opisu).

    Toksyna krztuścową.

    Toksyna krztuścową jest egzotoksyną należącą do rodziny toksyn bakteryjnych A/B posiadających aktywność rybozylotransferazy ADP (ref.8). Podjednostka A wykazuje aktywność rybozylotransferazy ADP, a podjednostka B pośredniczy w wiązaniu toksyny do receptorów komórek gospodarza i przemieszczeniu podjednostki A do miejsca jej działania. PT (toksyna krztuścową) ułatwia przyleganie B. pertussis do posiadających rzęski komórek nabłonkowych (ref.9) i odgrywa również rolę w atakowaniu makrofagów przez B. pertussis (ref. 10).

    Wszystkie komórkowe szczepionki zawierały PT, która była uważana za główny czynnik zjadliwy i antygen ochronny (ref. 11, 12). Naturalne zakażenie B. pertussis wywołuje zarówno odpowiedź humoralną, jak i komórkową na PT (ref.13, 14). Noworodki otrzymują przez łożysko matczyne przeciwciała przeciwko PT (ref. 16, 18) i matczyną siarę zawierającą przeciwciała przeciwko PT skuteczne w biernej ochronie myszy przed zakażeniem wziewnym (ref. 19). Wykazano odpowiedź komórkową (CMI) na podjednostki PT po immunizacji szczepionką bezkomórkową i odpowiedź CMI jest wywoływana po zaszczepieniu szczepionką zawierającą całe komórki (ref.13). Chemicznie inaktywowana PT w szczepionkach zawierających całe komórki i podjednostkowe, wywołuje ochronę w modelach zwierzęcych i u ludzi (ref.21). Następnie, przeciwciała monoklonalne swoiste w stosunku do podjednoski SI chronią przed zakażeniem B. pertussis (ref. 21 i 23).

    Podstawowe efekty patofizjologiczne PT zależą od jej aktywności rybozylotransferazy ADP. PT katalizuje przeniesienie ADP-rybozy z NAD na białko wiążące nukleotydy guani187 935 nowe G1 i przez to zaburza komórkowy układ regulacyjny cyklazy adenyłowej (ref. 24). PT zapobiega również migracji makrofagów i limfocytów do miejsc zapalenia i przeszkadza w fagocytozie zależnej od granulocytów obojętnochłonnych i w zabiciu bakterii (ref. 25). Stosuje się wiele testów in vitro i in vivo do oceny aktywności enzymatycznej S1 i/lub PT, w tym ADPrybozylację bydlęcej transducyny (ref. 26), test skupiania komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) (ref. 27), uczulanie histaminą (ref. 28), leukocytoza i NAD glikohydrolaza. Pod wpływem ekspozycji na PT komórki CHO tworzą charakterystyczną morfologię skupiska. Zjawisko to jest zależne od wiązania PT, następowej translokacji i aktywności rybozylotransferazy ADP SI, tak więc test skupiania komórek CHO jest szeroko stosowany do badania całości i toksyczności toksyn ogólnoustroj owych PT.

    Hemaglutynina filamentowa.

    Hemaglutynina filamentowa jest wielkim (220 kDa) nietoksycznym polipeptydem, który umożliwia przyleganie B. pertussis do komórek rzęskowych górnego odcinka dróg oddechowych w trakcie kolonizacji bakteryjnej (ref. 9, 29). Naturalne zakażenie indukuje powstanie przeciwciał przeciwko FHA i odpowiedzi komórkowej (ref. 13, 15, 17, 30 i 31). Przeciwciała przeciwko FHA znaleziono w ludzkiej siarze, również są przekazywane przez barierę łożyskową (ref. 17, 18 i 19). Szczepienie szczepionkami przeciwko kokluszowi zawierającymi całe komórki albo szczepionkami bezkomórkowymi wywołującymi powstanie przeciwciał przeciwko FHA i szczepionkami bezkomórkowymi zawierającymi FHA również wywołuje odpowiedź CMI na FHA (ref. 20, 32). FHA jest antygenem ochronnym w modelu prowokacji dróg oddechowych u myszy po czynnej lub biernej immunizacji (ref. 33, 34). Jednakże sam FHA nie chroni w teście siły wewnątrzczaszkowej prowokacji u myszy.

    Białko zewnątrzbłonowe 69 kDa (Pertaktyna).

    Białko 69 kDa jest białkiem zewnątrzbłonowym pierwotnie wyizolowanym z B. bronchoseptica. (ref. 35). Białko to znane jest również jako pertaktyna P.69. Wykazano, że jest antygenem ochronnym przeciwko B. bronchoseptica i kolejno zostało wyizolowane zarówno z B. pertussis jak i B. parapertussis. Białko 69 kDa wiąże się bezpośrednio z komórkami eukariotycznymi (ref. 36) i naturalne zakażenie B. pertussis wywołuje odpowiedź humoralną przeciwko P.69 (ref. 14) i P.69 powoduje powstawanie również odpowiedzi komórkowej (ref. 17, 37, 38). Szczepienie szczepionkami zawierającymi całe komórki i szczepionkami bezkomórkowymi wywołuje wytworzenie przeciwciał przeciwko P. 69 (ref. 32, 39), a szczepionka bezkomórkowa wywołuje powstanie odpowiedzi CMI przeciwko P.69 (ref. 39). Pertaktyna chroni myszy przed wziewną prowokacją B. pertussis (ref. 40) i w połączeniu z PHA wywołuje ochronę przeciwko B. pertussis w wewnątrzmózgowym teście prowokacyjnym (ref. 41). Również bierne przeniesienie poliklonalnych albo monoklonalnych przeciwciał przeciwko P.69 chroni myszy przed wziewną prowokacją (ref. 42).

    Aglutynogeny.

    Serotypy B. pertussis określa się w oparciu o ich aglutynujące fimbrie. WHO poleca szczepionki oparte na całych komórkach zawierających aglutynogeny typów 1, 2 i 3 (Agg) ponieważ nie zapewniają one krzyżowej ochrony (ref. 43). Agg 1 nie jest aglutynogenem fimbrii i stwierdza się go u wszystkich szczepów B. pertussis, podczas gdy serotypy 2 i 3 Agg są aglutynogenami fimbrii. Naturalne zakażenie albo immunizacja szczepionkami zawierającymi pełne komórki albo szczepionkami bezkomórkowymi wywołuje powstanie przeciwciał przeciwko Agg (ref. 15, 32). Swoista wywoływana przez komórki odpowiedź immunologiczna u myszy może zostać wywołana po zakażeniu wziewnym przez Agg 2 i 3 (ref. 17). Agg 2 i 3 chronią myszy przed prowokacją wziewną i ludzka siara zawierająca przeciwciała przeciwko aglutynogenom może mieć również działanie ochronne w tym teście (ref. 19, 44, 4^5).

    Bezkornórkowe szczepionki przeciwko kokluszowi.

    Pierwsza uzyskana przez Sato i in. bezkomórkowa szczepionka przeciwko kokluszowi była szczepionką dwuskładnikową PT+FHA (JNIH 6) (ref. 46). Szczepionkę tę uzyskano przez jednoczesne oczyszczenie antygenów PT i FHA z supematantu hodowli B. pertussis szczepu Tohama, po którym nastąpiło przeprowadzenie tych toksyn w postać anatoksyn przy użyciu formaliny. Bezkomórkowe szczepionki różnych producentów i o różnym składzie stosowane z powodzeniem do immunizacji dzieci japońskich przeciwko krztuścowi od 1981

    187 935 roku spowodowały dramatyczny spadek występowania choroby (ref. 47). Szczepionkę JNIH 6 i jednoskładnikową szczepionkę zawierającą anatoksynę PT (JNIH 7) testowano w wielkich badaniach klinicznych w Szwecji w 1986 roku. Wstępne wyniki wykazały niższą skuteczność niż szczepionki zawierającej całe komórki, lecz dalsza obserwacja szczepionych osób wykazała, że są bardziej skuteczne przeciwko łagodnym postaciom choroby wykrywanym jedynie metodami serologicznymi (ref. 48, 49, 50, 51). Jednakże zanotowano przypadek rewersji toksyczności inaktywowanej formaliną PT w tych szczepionkach. Stwierdzono również, że szczepionki te chronią raczej przed zachorowaniem niż przed zakażeniem. W tabeli 1 wymieniono szereg obecnie badanych nowych szczepionek przeciwko kokluszowi bezkomórkowego i składników zawierających kombinacje PT, FHA, P.69 i/lub aglutynogeny. Stosowano różne techniki chemicznej detoksykacji PT, w tym inaktywowanie formaliną (ref. 46), glutaraldehydem (ref. 52), nadtlenkiem wodoru (ref. 53) i tertranitrometanem (ref. 54).

    Tężec.

    Tężec jest ostrym zakażeniem powodowanym przez Clostridium tetani. Choroba charakteryzuje się silnym, bolesnym skurczem mięśniowym, któremu towarzyszy nadwrażliwość na bodźce, nadreaktywność i zwiększona stymulacja współczulna zajętych części organizmu. Łagodny bodziec może wywoływać nasilony odruch skurczu mięśniowego. Może być obecna gorączka zależna od maksymalnie nasilonego skurczu mięśniowego. Tężec może być uogólniony obejmujący twarz, szyję, brzuch i tułów albo umiejscowiony, obejmujący konkretną część ciała (miejsce urazu). Zajęcie mięśni mimicznych twarzy powoduje powstanie szczękościsku nadającego twarzy klasyczny wygląd znany jako „risus sardonicus” (ref. 78).

    C. tetani egzystuje jako niepatogenny drobnoustrój w przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt. Organizm ten również znajduje się w glebie zanieczyszczonej odchodami i może przeżyć w glebie przez lata w postaci zakaźnego przetrwalnika bakteryjnego (ref. 79).

    Tężec jest wynikiem beztlenowego wzrostu C. tetani i produkcji neurotoksyny w zanieczyszczonych ranach. Zakażenie jest wywoływane przez wniknięcie do tkanek zakażonych drobnoustrojami albo przetrwalnikami bakteryjnymi materiałów. Najpopularniejszym scenariuszem jest zakażenie poprzez penetrację skaleczenia. Jednakże w wielu przypadkach nie udaje się uzyskać wywiadu skaleczenia. Obecność martwiczych lub niedokrwionych tkanek przyspiesza wzrost bakterii (ref. 78).

    Zakażeniom zapobiega się przez szczepienie lub przez prawidłowe zaopatrzenie rany obejmujące ostrożne oczyszczenie i usunięcie martwych tkanek. Osobnicy, u których doszło do zakażenia rany i, którzy nie przyjęli serii szczepień powinni zostać zaszczepieni zarówno szczepionką przeciwtężcową, jak i otrzymać immunoglobulinę przeciwtężcową.

    Leczenie zespołu chorobowego jest przede wszystkim objawowe i obejmuje wspomaganie oddychania, podawanie anatoksyny tężcowej i ostrożne oczyszczanie zakażonych ran. Pomimo nowoczesnej opieki medycznej współczynnik przypadków śmiertelnych jest ciągle wysoki i sięga od 30 do 90% (ref. 79). Dotyczy to szczególnie osób starszych. Naturalne zakażenia nie zawsze wywołują odporność immunologiczną przeciwko dalszym infekcjom.

    Zapobieganie zakażeniom przez szczepienie jest najskuteczniejszym sposobem kontrolowania choroby. Od kiedy wprowadzono powszednie szczepienie przypadki tężca są wyjątkowo rzadkie w krajach rozwiniętych. Przypadki zachorowań występują niemal wyłącznie u osobników, którzy nie ukończyli serii szczepień, lub którzy nie otrzymali prawidłowych dawek przypominających. Osobnicy powinni otrzymywać dawkę przypominającą raz na dziesięć lat.

    Błonica.

    Błonica jest ostrą chorobą wywoływaną przez bakterię Corynobacterium diphteriae. Głównym miejscem zakażenia są górne drogi oddechowe (nos, gardziel, krtań i tchawica, ref.80). Charakterystyczne zmiany, wynik działania cytotoksyny bakteryjnej, są to szarawe pseudobłony otoczone przez obszary zapalenia. Towarzyszy temu powiększenie szyjnych węzłów chłonnych, opuchnięcie i obrzęk krtani. W ciężkich przypadkach opuchnięcie może doprowadzić do zamknięcia krtani (błonica krtaniowa). Inne powikłania obejmują zapalenie mięśnia serca, objawy ze strony ośrodkowego układu nerwowego (neuropatie nerwów czaszkowych, nerwów ruchowych i czuciowych, takie jak porażenie wstępujące) i małoplytkowość. Rzadziej zajęte są inne błony śluzowe. Stan kliniczny może być różny od zakażenia bezobjawowego do

    187 935 piorunującego zakażenia wieloukładowego i śmierci (ref. 79). Skórne i przyranne zakażenia błonicą są częste w krajach tropikalnych i w ubogiej populacji amerykańskiej. Jedynym rezerwuarem C. diphteriae jest człowiek.

    Wstępna diagnoza może być postawiona na podstawie klinicznej obserwacji charakterystycznych zmian, lecz musi zostać potwierdzona badaniem bakteriologicznym tych zmian. Jeśli istnieje poważne podejrzenie kliniczne błonicy, natychmiast należy włączyć leczenie antybiotykami (penicyliną lub erytromycyną) i anatoksyną błoniczą, nawet jeśli diagnoza jest nie potwierdzona. Śmiertelność rośnie wraz z czasem zwlekania z podjęciem leczenia od wystąpienia pierwszych objawów klinicznych (ref. 80). Współczynnik przypadków śmiertelnych waha się od pięciu do dziesięciu procent pomimo nowoczesnej opieki medycznej i przypadki zgonów występują przede wszystkim u osobników bardzo młodych i starszych. Naturalne zakażenie nie zawsze zapewnia ochronę immunologiczną przed następnymi zakażeniami (ref. 80).

    Przekazanie zakażenia następuje przez bezpośredni kontakt z wydzielinami albo wydalinami zakażonych osobników. Zakaźność osobników utrzymuje się tak długo jak długo obserwuje się bakterie w wydzielinach. Stan ten może trwać do czterech tygodni po zakażeniu. Przekazanie zakażenia może również wystąpić przez materiały przenoszące zarazki (ref. 79). Zalecana jest bezwzględna izolacja.

    Rzadziej osobnicy stają się nosicielami i rozsiewają drobnoustroje do 6 miesięcy po zakażeniu. Nieszczepieni nosiciele powinni być niezwłocznie zaszczepieni pełną serią szczepień. Leczenie antybiotykami likwiduje nosicielstwo i zakaźność osobników w ciągu 4 dni (ref. 80).

    Nagminne porażenie dziecięce.

    Zarówno inaktywowane (IPV) jak i żywe, atenuowane (OPV) szczepionki przeciwko wirusowi nagminnego porażenia dziecięcego skutecznie kontrolowały występowanie nagminnego porażenia dziecięcego w skali świata. Złożone szczepionki DPT-IPV mają obecnie wydane zezwolenia w Europie i w Kanadzie i wykazano, że są bezpieczne i skuteczne na milionach dzieci na całym świecie.

    Hemophilus influenzae typ B.

    Przed tym jak skuteczne szczepionki stały się dostępne Hemophilus influenzae typ B (Hib) był główna przyczyną krwiopochodnego zakaźnego zapalenia opon mózgowych u młodszych dzieci i jest główną przyczyną zapalenia opon mózgowych w ciągu pierwszych dwóch lat życia dziecka (ref. 81). Około 10% ofiar zapalenia opon mózgowych wywoływanego przez Hemophilus influenzae umiera pomimo opieki medycznej. Trwałe następstwa są powszechne u dzieci, które przeżyły. Szczepienie przeciwko Hemophilus influenzae rozpoczęło się w Kanadzie w 1987 roku polisacharydową szczepionką (fosforan rybitolu polirybozy [PRP] z Hemophilusa influenzae typ B. Poprawioną immunogenność osiągnięto u dzieci 18 miesięcznych i starszych po wprowadzeniu w 1988 roku szczepionki składającej się z konjugatu PRP z anatoksyną błoniczą (PRP-D). Od 1992 roku jest możliwe szczepienie noworodków licencjonowanymi szczepionkami konjugatu PRP immunogennego dla niemowląt poniżej roku (PRP koniugowana z anatoksyną tężcową albo PRP-T). Zastosowanie tych koniugowanych szczepionek Hemophilus influenzae jest związane z dramatycznym spadkiem występowania przypadków inwazji Hemophilus influenzae w Kanadzie i gdzie indziej (ref. 82). Dwa kanadyjskie badania kliniczne obejmujące blisko 900 dzieci w Kolumbii Brytyjskiej i Albercie wykazały, że liofilizowana PRP-T może być rozpuszczana z DPT (COMBIPACK) (ref. 83) albo z DPTNagminnego porażenia dziecięcego Adsorbed (PENTA™) (ref. 84) dodanymi do zwykłego rozpuszczalnika, soli fizjologicznej. Badania kliniczne przeprowadzone w wielu krajach świata obejmujące więcej niż 100000 dzieci wykazały skuteczność liofilizowanej PRP-T (ActHib™). Ponad 90% osiągnęło poziom anty-PRP uznany za poziom ochronny (>0,15 gg/ml) po trzech dawkach PRP-T, których podawanie rozpoczęto w drugim miesiącu życia lub po pojedynczej dawce PRP-T podanej po 12 miesiącu życia. Odsetek osiągniętych poziomów wskazujących na ochronę długoterminową (>0,1 gg/ml) wahał się w granicach od 70 do 100% zależnie od badania. Miliony dawek pRP-T sprzedano w Kanadzie od 1992 roku. Przypadki przełamania odporności przez zakażenie Hemophilus są rzadkie i mogą być związane z takimi chorobami jak niedobór odporności (ref. 85).

    187 935

    Szczepionki złożone.

    Mimo, że występuje wiele obecnych i potencjalnych pozytywnych skutków szczepionek, w których kombinacje antygenów zapewniają ochronę przeciwko różnorodnym patogenom kombinacje te mogą powodować zmniejszenie immunogenności poszczególnych składników. Kombinacja anatoksyny błoniczej i tężcowej ze szczepionką przeciwko kokluszowi zawierającą całe komórki (DTP) jest dostępna od ponad 50 lat i poziom przeciwciał powstałych w odpowiedzi na tę kombinację jest wyższy niż ten powstały w odpowiedzi na pojedyncze składniki, przypuszczalnie jako skutek efektu adiuwantu szczepionki przeciw kokluszowi opartej na całych komórkach. Kombinacje DTP zawierające również inaktywowaną szczepionkę przeciwko wirusowi nagminnego porażenia dziecięcego są zatwierdzone przez wiele systemów prawnych, jednakże poziom przeciwciał powstały w odpowiedzi na antygeny kokluszowe może być zmniejszony przez tą kombinację (ref. 69, 71). Skutek połączenia szczepionek DTP z koniugowąną szczepionką Hib był różny. Badania z francuską DTP i PRPT wykazały podobne bezpieczeństwo, ale zmniejszony poziom przeciwciał w odpowiedzi na PRP (ref. 72, 73), podczas gdy badania nad kanadyjską DTP i szczepionką PRPT nie wykazały istnienia jakiegokolwiek wpływu na odpowiedź na PRP, jednakże w grupie poddanej immunizacji szczepionką złożoną był niższy poziom aglutynogenów kokluszowych i zwiększona wrażliwość miejsca wstrzyknięcia (ref. 74, 75).

    Obecnie dostępne są dane dotyczące skutku działania kombinacji szczepionek APDT ze szczepionką koniugowąną Hib. Dwumiesięcznym niemowlętom podawano trzy dawki bezkomórkowej szczepionki ksztusiec-błonica-tężec (APDT) w kombinacji z koniugatem szczepionki Hib (PRP-T), odpowiedź przeciwciał na PRP była znacząco niższa niż w przypadku grupy, która otrzymała oddzielne wstrzyknięcia tego samego dnia (ref. 76). Doniesiono o podobnych wynikach z inną bezkomórkową szczepionką ksztusiec-błonica-tężec w kombinacji z PRP-T podawaną w pierwszych trzech dawkach (ref. 77).

    W przeciwieństwie do tego inne badania donosiły o tym, że dzieci immunizowane złożoną szczepionką miały lepszą odpowiedź przeciwciał na PRP, błonicę i wiele antygenów kokluszowych w porównaniu z dziećmi, które otrzymały pojedyncze wstrzyknięcie PRP. Może być wiele przyczyn podobnej lub lepszej immunogenności tych szczepionek podawanych w złożonym wstrzyknięciu w przeciwieństwie do zmniejszonej immunogenności uzyskiwanej z innymi produktami. Żadna z bezkomórkowych i złożonych szczepionek przeciwko kokluszowi nie jest identyczna pod względem zawartości antygenowej, sposobu uzyskiwania anatoksyny, adiuwantu albo konserwanta. Jednakże, o zmniejszonej immunogenności donoszono w przypadku bezkomórkowych szczepionek przeciwko kokluszowi zawierających PT, FHA i 69K (ref. 77) i zawierających PT, FHA, 69K i fimbrie (ref. 76).

    Stwierdzono, że pięć składników szczepionki APDT testowanych w tym badaniu zapewnia ochronę z 85% skutecznością (przykład 5) (95% CI 81/89) w ostatnio ukończonym w Szwecji badaniu klinicznym trzeciej fazy przeprowadzanym pod nadzorem National Institutes of Health (ref. 78).

    Obecnie dostępne na rynku złożone szczepionki mogą nie zawierać korzystnych formulacji korzystnych antygenów w korzystnych postaciach immunogennych wymaganych do osiągnięcia pożądanego poziomu skuteczności w populacji osób wrażliwej na koklusz.

    Pożądane będzie dostarczenie skutecznych złożonych szczepionek obejmujących bezkomórkowe składniki bakterii krztuśca zawierające wybrane względne ilości wybranych antygenów.

    Streszczenie wynalazku.