JP3280675B2 - 多価ｄｔｐポリオワクチン - Google Patents

多価ｄｔｐポリオワクチン

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の属する技術分野 本発明は、多価ワクチン、特に小児への投与用のワク
チンに関する。
関連出願に関するリファレンス 本出願は、1995年７月12日出願の米国同時継続出願第
08/501,743の一部継続出願であり、この同時継続出願そ
のものは、1995年５月４日出願の米国同時継続出願第08
/433,646である。
発明の背景 百日咳は、百日咳菌（Bordetella pertussis）が原因
で起こる重篤で感染性の高い上部気道感染症である。WH
Oの調査では、年間６千万人が百日咳にかかり、50万人
から１千万人が百日咳関連で死亡していると推定してい
る（参考文献１）。この出願書では、本発明に関係があ
る技術をさらに詳しく説明した種々の参考文献を括弧内
に記載し、引用した各文献は、本明細書後部に記載して
いる。これらの文献で開示されている内容は、本発明の
開示内容の説明の中に参照文献の形で示してある）。
ワクチン接種をしていない５歳以下の小児における百
日咳の罹患率は80％と高い（文献２）。百日咳は一般的
には小児の病気であると考えられているが、無症候の状
態で青年および成人にもその罹患が増加しているという
臨床上の証拠がある（文献3,4,5）。
1940年代に、化学的に、および、熱により失活（無毒
化）させた百日咳菌を原料にした全細胞ワクチンが使用
導入されて、百日咳菌が原因となる百日咳の発症率は劇
的に減少した。症例の定義にもよるが、この全細胞ワク
チン接種の有効率は95％であると考えられている。但
し、ワクチンとして百日咳菌を感染させた場合の免疫持
続効果は長期に及ぶけれども、全細胞ワクチンを使用し
た場合には、その感染防御効果は弱いという証拠も増え
ている（文献３）。さらに、全細胞百日咳ワクチンの接
種と、その接種が原因となる身体への反応および副作用
との関係を示した数種の報告書が発表されたことが原因
で、ワクチンを接種する人口が減ってしまい、その結
果、百日咳の流行が再度増加してしまった（文献７）。
このために最近では、ワクチン成分を規定した成分性百
日咳ワクチン（コンポーネントワクチン）が開発されて
いる。
成分を規定した百日咳ワクチンのための抗原 多様な非細胞性の百日咳ワクチンが開発されており、
それらのワクチンには、その抗原として、百日咳菌（Bo
rdetella pertussis）抗原としての百日咳毒素（PT）、
線状赤血球凝集素（FHA）、69kDa外膜タンパク質（ペル
タクチン:pertactin）、線毛凝集原が使用されている
（下表１参照。表は本出願書の最後に記載）。
百日咳毒素 百日咳毒素（PT）は、ADPリボシル転移酵素活性を有
する細菌毒素のA/D毒素ファミリーの１種類である外毒
素である（文献８）。この毒素の半分を構成するＡ部分
は、ADPリボシル転移酵素活性を示し、別の半分を構成
するＢ部分は、毒素の細胞受容体への結合およびＡ部分
の作用部位への転移を仲介する。PTは、百日咳菌が線毛
状上皮細胞に接着することを促進させ（文献９）、百日
咳菌によるマクロファージの侵入にも関与している（文
献10）。全部の非細胞性百日咳ワクチンに、このPTが含
まれ、主要ビルレンス要素として、および感染防御抗原
として使用されている（文献11,12）。百日咳菌が自然
感染した場合は、このPTに対する体液性および細胞性免
疫応答が誘起されることになる（文献13〜17）。乳幼児
は、経胎盤的に獲得した抗−PT抗体を持っており（参考
文献16,18）、抗−PT抗体を含んでいるヒトの初乳は、
マウスでのエアロゾル感染に対する受動感染防御に有効
であることが認められている（文献19）。無細胞ワクチ
ンで免疫した後のPTサブユニットに対する細胞性免疫が
誘起されることが報告されており（文献20）、さらに、
全細胞ワクチンの接種の後もPTに対する細胞性免疫が誘
導されている。全細胞性ワクチンまたはコンポーネント
ワクチンに化学的に不活化されたPTを抗原として使用し
た場合、動物にもヒトにも感染防御作用が認められてい
る（文献21）。また、S1サブユニットに特異的であるモ
ノクローナル抗体が百日咳菌に対する感染防御作用を示
している（文献22,23）。
PTの病態生理学的な効果は、ADPリボシル転移酵素活
性によるものである。PTは、ADPリボースのNADからG1グ
アニン・ヌクレオチド結合タンパク質への転移反応を触
媒し、細胞のアデニル酸シクラーゼ制御系を破壊する
（文献24）。さらに、PTはマクロファージとリンパ球の
炎症部位への移動を阻止し、好中球が仲介する食作用と
細菌死滅作用を妨害する（文献25）。S1および／または
PTの酵素活性を評価するために、多数のin vitroおよび
in vivoの試験が実施されており、これにはウシトラン
スデューシンのADPリボシル化法（文献26）、チャイニ
ーズハムスター卵巣細胞（CHO）クラスタ分析法（文献2
7）、ヒスタミン感作法（文献28）、NADグリコヒドラー
ゼ分析などが含まれる。CHOはPTに曝されると、特別な
クラスター形態を示す。この現象は、PTの結合と、S1の
その後の転移とADPリボシル転移酵素活性によるもので
ある。そのために、CHO細胞クラスター分析は、PTホロ
毒素の特性と毒性を試験する場合に多用されるのであ
る。
線状赤血球凝集素 線状赤血球凝集素（FHA）は、細菌集落形成中に、百
日咳菌が上部気道の線手状細胞に付着する作用を仲介す
る非毒性の大型のタンパク質（220kDa）である（文献9,
29）。百日咳菌が自然感染をした場合には、抗−FHA抗
体の産生と細胞性免疫が現れる（文献13,15,17,30,3
1）、抗−FHA抗体は、ヒトの初乳に存在し、経胎盤によ
り移行する（文献17,18,19）。全細胞百日咳ワクチンま
たは無細胞性百日咳ワクチンを接種すると、抗−FHA抗
体を産生させ、FHAを含む無細胞性ワクチンの投与によ
り、FHAに対する細胞性免疫を誘発する（文献20,32）。
マウスの呼吸系チャレンジモデルにおいては、このFHA
は、能動免疫または受動免疫での感染防御抗原となる
（文献33,34）。しかし、マウスでの大脳内効果試験で
は、FHAだけでは効果がないことが判明している（文献2
8）。
69kDa外膜タンパク質（ペルタクチン） この69kDaの外膜タンパク質は、本来は、気管支敗血
症菌由来のものである（文献35）。このタンパク質は、
ペルタクチンまたはP.69として知られているものであ
る。これは、気管支敗血症菌に対する感染防御抗原とし
て認識されていたが、その後、百日咳菌およびパラ百日
咳菌にも存在することが判明している。この69kDaタン
パク質は、真核細胞に直接に結合し（文献36）、百日咳
菌の自然感染があると、抗−P.69体液性免疫応答（文献
14）および細胞性免疫応答を誘発される（文献17,37,3
8）。全細胞百日咳ワクチンまたは無細胞性ワクチンの
接種により抗−P.69抗体が産生し（文献32,39）、無細
胞性ワクチンの投与で抗−P.69に対する細胞性免疫を誘
発させる（文献39）。このペルタクチンは、マウスのエ
アロゾル試験では百日咳菌に感染防御作用を示し（文献
40）、FHAを組み合わせた投与では、大脳内での百日咳
菌感染を防御する（文献41）。ポリクローナルまたはモ
ノクローナル抗−P.69抗体の投与でもマウスのエアロゾ
ル試験における百日咳菌感染防御作用を示す（文献4
2）。
凝集原 百日咳菌の血清型は、その凝集線毛により規定され
る。WHOは、全細胞ワクチンに、血清型が1,2,3型の凝集
原（Agg）を含めることを勧めている。その理由は、こ
れらが交差防御性の抗原でないからである（文献43）。
Aggの血清型が１のものは、非線毛性のもので、すべて
の百日咳菌株に見つかっており、２型と３型のAggは線
毛性である。全細胞性または無細胞性のワクチンによる
免疫またはその自然感染では、抗−Agg抗体の産生を誘
発する（文献15,32）。マウスでは、Agg2とAgg3をエア
ロゾル感染させると、ある特定の細胞性免疫反応が起こ
る（文献17）。マウスでの実験では、このAgg2、３は、
呼吸系での感染防御作用を示し、さらに、抗−凝集素を
含むヒト初乳の場合にも感染防御作用がある（文献19,4
4,45）。
無細胞性百日咳ワクチン サトウらにより最初に開発された無細胞性ワクチン
は、PTとFHAの２成分を含むワクチン（JNIH6と呼ばれ
る）であった（文献46）。このワクチンは、百日咳菌To
hama株の培養物上清からPTとFHAを同時精製し、その後
ホルマリン処理をしてトキソイドを調整したものであっ
た。この無細胞性ワクチンを、種々のメーカが多様な成
分を使用して製造し、1981年以来、日本の小児に投与さ
れ成功を納め、その結果、日本での百日咳罹患率が劇的
に低下した（文献47）。このJNIH6とPTの単一成分トキ
ソイドワクチン（JNIH7）の臨床試験が1986年にスエー
デンで実施された。最初の臨床結果では、全細胞性ワク
チンの効果より劣るとの結果であったが、血清学的検査
では、軽度のものと診断された百日咳に対しては、この
無細胞性ワクチンのほうが有効であることが示された
（文献48、49、50、51）。しかし、これらのワクチンに
おいて、ホルマリン処理をして無毒化したPTの毒性が復
帰するという証拠が見つかった。さらに、これらのワク
チンは、感染防止というよりは、感染した後の発症を抑
えることに有効であることが判明した。
最近は、表１に示したように、PT、FHA、P.69、およ
び／または凝集原を組み合わせた多数の無細胞型のコン
ポーネントワクチンの有効性が評価されつつある。PTを
化学的に無毒化する技術として、ホルマリン処理（文献
46）、グルタルアルデヒド処理（文献52）、過酸化水素
処理（文献53）およびテトラニトロメタン処理（文献5
4）を使用した数種の方法がある。
破傷風 破傷風は、破傷風菌が原因菌である急性感染症であ
る。この疾患の特徴は、過敏症、反射亢進、自律神経刺
激の増加などを伴った重篤で痛みのある筋肉硬直であ
る。軽度の刺激により反射筋肉痙攣の原因となる。極度
の筋肉痙攣による発熱がある。破傷風は、顔、首、腹
部、躯幹に広がる系統性（全身性）の場合もあり、特定
の身体部分（創傷部位）に局在する局所性の場合もあ
る。顔部の咬筋がこの菌で侵されると開口障害または
「痙笑」として知られている顔面表現障害が発症する
（文献78）。破傷風菌は、ヒトおよび動物の消化管内に
も非病原性のものとして存在している。この微生物は糞
などで汚染した土壌中に生存し、感染性胞子として数年
に亘り土壌中で生き続ける（文献79）。
破傷風は、破傷風菌の嫌気性成長と汚染創傷での神経
毒素が原因となる疾病である。その菌またはその胞子を
含んだ物質が組織内に侵入することで感染が起こる。最
も普通に見られる感染は、貫通した創傷部位で起こる。
しかし、創傷歴のない場合にも感染が発生している。壊
死性または虚血性の組織が存在すると、このバチルス菌
の増殖を促進させる（文献78）。
感染の予防法は、ワクチンを使用するか、丹念に洗浄
して創傷部を清潔にするか、失活組織を切除するかであ
る。汚濁した創傷があり、その治療手当に失敗した場合
には、破傷風ワクチンと破傷風免疫グロブリンの両方を
投与する必要がある。呼吸系器官の保護、破傷風の抗毒
素の投与、創傷部の洗浄などの治療を行う。近代医療の
進歩にもかかわらず、破傷風による死亡率は依然として
30〜90％と高いのである（文献79）。特に、高齢者の場
合に死亡率が特に高い。さらに、自然感染では、必ずし
もその後の感染防御の免疫が成立する訳ではない。
破傷風に対する最も効果的な感染制御の方法は、ワク
チンを使用することである。ワクチンが世界中で使用さ
れるようになり、発展途上国での破傷風の発症も極めて
まれになった。発症するのは、ほとんどの場合、ワクチ
ンを所定どおり受けなかったり、受けても適当なブース
タ投与をしていない症例である。10年に一度はブースタ
投与を受けるべきである。
ジフテリア ジフテリアは、ジフテリア菌（Corynebacterium diph
theriae）が原因菌となる急性の感染症である。主な感
染部位は、上部気道（鼻、咽頭、喉頭、気管）である
（文献80）。細胞毒素が原因で起こる病変としては、炎
症で囲まれた緑色の偽膜の斑である。ジフテリアの合併
症として、頸部リンパ節症、咽頭の腫脹および浮腫が発
症する。重篤な場合には、腫脹が閉塞にまで進む（咽頭
ジフテリア）。その他の合併症として、心筋炎、中枢神
経系障害（頭蓋、上行性麻痺のような運動神経、感覚神
経障害）、血小板増加症がある。頻繁ではないが、その
他の粘膜が侵されることもある。臨床的発現としては、
無症候の感染症である場合もあり、劇症で死に至る場合
もある（文献79）。ジフテリアによる皮膚と創傷での感
染は熱帯地方や米国の貧困層住民に発生することが報告
されている。ジフテリア菌の感染の唯一の貯蔵庫はヒト
である（文献79）。
病変部の臨床的観察により推定的診断は可能ではある
が、ジフテリアであることの最終確認は、その病変部の
細菌学的検査が必要である。臨床的にジフテリアである
との強い疑いがある時には、その確認が取れない時であ
っても、直ちに抗生物質（ペニシリンまたはエリスロマ
イシン）やジフレリア抗毒素で治療すべきである。臨床
徴候の発生後、時間が経つにつれて死亡率が上昇するか
らである（文献80）。現代医療の進歩にもかかわらず、
ジフテリアの死亡率は５〜10％（文献79）であり、特
に、若年層と高齢者でその率が高い。自然感染の場合に
は、その後の感染を防御する免疫が成立するとは限らな
い（文献80）。ジフテリアは感染者の分泌物や排泄物に
直接接触することにより伝染する。分泌物に細菌の存在
が認められる限り、その感染者は接触感染性の保菌者で
ある。この保菌状態は感染後４週間に亘って続く。伝染
は感染した媒介物からも起こる（文献79）。感染者の厳
格な隔離が望ましい。
まれにではあるが、感染後に保菌者になってから６ヶ
月間に亘り、病原菌を排出し続けていることがある。免
疫されてない保菌者は直ちに完全なワクチン治療を受け
るべきである。抗生物質を投与することで、４日以内に
菌が減少し、非保菌者への感染の危険性を減らすことが
できる（文献80）。
ポリオ 不活化ポリオワクチン（IPV）と弱毒生ポリオワクチ
ン（OPV）の両方のワクチンが世界のポリオ拡散の制御
に大きく寄与した。DPT−IPV組み合わせワクチンの特許
がヨーロッパとカナダで認められ、世界の数百万の小児
に投与されてポリオ予防に有効で、安全であることが示
された。
インフルエンザ菌ｂ型 有効なワクチンが使用できるようになる前に、インフ
ルエンザ菌ｂ型（Hib）（Haemophilus influenzae type
b）が若干小児における侵襲性血液感染性の髄膜炎の主
要原因であり、生後２才までの幼児の髄膜炎の原因であ
った（文献81）。インフルエンザ菌による髄膜炎の患者
の10％が死亡している。治癒後にも永久後遺症が残る。
このインフルエンザ菌に対する免疫治療として、インフ
ルエンザ菌ｂ型由来の多糖ワクチン（硫酸ポリリボース
・リビトール、PRP）を使用したワクチン投与がカナダ
において1987年に開始された。PRPをジフテリアトキソ
イドに結合させた複合体（コンジュゲート）（PRP−
Ｄ）から成るワクチンを、生後18カ月前後の小児に接種
することで免疫原性が改善された。1992年以来、１才以
下の幼児に免疫原性を示すPRP結合ワクチン（破傷風ト
キソイド結合PRP:PRP−Ｔ）の使用が認可されて、幼児
に対するこのワクチンの接種が開始された。これらのイ
ンフルエンザ菌由来の結合ワクチンを使用しているカナ
ダその他の国での侵襲性インフルエンザ感染症の発症率
は減少している（文献82）。英国のコロンビアおよびカ
ナダのアルバータで実施された約900例の小児を対象と
した２つの臨床研究により、凍結乾燥したPRP−Ｔを、
通常の生理食塩水希釈液の他に、DPT（COMBIPACK）（文
献83）またはDPT−ポリオアーアドゾーブド（PENTA）
（文献84）を使用して、液体状に戻せることが示され
た。世界の10万人の小児が参加した臨床試験において
も、凍結乾燥PRP−Ｔ（ActHib ）接種の有効性が確認
されている。生後２カ月からPRP−Ｔを３回投与する
か、あるいは、生後12カ月後のPRP−Ｔを一回投与する
ことにより、臨床試験の対象の90％以上において、感染
防御作用があるレベルとされる抗−PRPレベル（≧0.15
μg/ml）を達成している。長期感染防御ができるレベル
（≧1.0μg/ml）を達成する割合については、各試験に
より70〜100％の幅でバラツキがあった。1992年以来、
数百万の用量のPRP−Ｔが販売された。PRP−Ｔを使用し
たワクチン接種により侵襲性インフルエンザ感染症を根
絶することは無理であるが、これは、おそらく、この疾
患が免疫不全が関連しているものと考えられる（文献8
5）。
組み合わせワクチン 多様な病原菌に対して同時に防御作用を示すように抗
原を組み合わせたワクチンには実際上は多くの潜在的な
長所があるけれど、組み合わせることによりそれぞれの
成分の免疫原性に悪い影響を与えることもあり得る。ジ
フテリアと破傷風と全細胞性百日咳の３種の組み合わせ
ワクチン（DTP）が50年以上も使用されており、これら
の組み合わせワクチンに対する全体の綜合的な抗体産生
は、個々のワクチン成分に対する個別の抗体産生よりも
優れており、これは多分、全細胞性百日咳ワクチンのア
ジュバント効果が寄与しているためであろう。さらに、
不活化ポリオウイルスワクチンも含んだDTP・ポリオ組
み合わせワクチンが、この組み合わせにしたことによ
り、ワクチンの中の百日咳抗原に対する抗体応答が減少
するにもかかわらず、多くの国で認可されている（文献
69〜71）。DTPワクチンをHib結合ワクチンと組み合わせ
ることによる有効性には変動がある。フランスで実施さ
れたDTPとPRPTを使用した治験では、安全性においては
同じような効果を示したが、PRPに対する抗体産生は減
少してしまった（文献72〜73）。カナダでのDTPとPRPT
ワクチンを使用した研究では、PRPに対する抗体産生効
果はないが、百日咳凝集素に対しては少しの抗体産生が
あり、副作用として、この組み合わせたワクチン使用群
での注射部位に痛みが発生した（文献74,75）。
APDTワクチンとHib結合ワクチンを組み合わせること
による影響については現在データを集めているところで
ある。Hib結合ワクチン（PRP−Ｔ）を組み合わせた無細
胞百日咳・ジフテリア・破傷風ワクチン（APDT）の用量
を３回投与した２才の幼児群においては、同じ日に別々
に注射した群よりも、PRPに対する抗体産生が有意に低
いという結果が示された（文献76）。PRP−Ｔと組み合
わせた無細胞百日咳・ジフテリア・破傷風ワクチンを３
回投与した例でも類似の結果が報告された（文献77）。
その他の報告とは違って、組み合わせワクチンで免疫
した小児においてPRP、ジフテリア、百日咳抗原に対す
る抗体産生が、別々の日にPRPを投与した小児群に較べ
て優れているという結果が出ている。別々のワクチンに
よる免疫原性が減少したのに、これらの組み合わせたワ
クチンを接種した際には、同等またはそれより優れた免
疫原性を示したことにはいくつかの理由があるかもしれ
ない。すべての無細胞性百日咳ワクチン、コンポーネン
ト百日咳ワクチンにおいて、その抗原の内容や、トキソ
イド化の方法、使用するアジュバントまたは保存剤など
の種類や量が同一ということはあり得ない。しかし、P
T、FHA、69kを含んだ無細胞性百日咳ワクチン（文献7
7）とPT、FHA、69kおよび線毛を含んだ無細胞性百日咳
ワクチン（文献76）においては、その免疫原性がともに
低下しているのである。
スエーデンの国立医療研究所の支援の下で実施された
臨床試験のフェーズIIIにおいて、５種類の成分を含むA
PDTワクチンが85％（例５）（95％・CI・81/89）の防御
有効性を示した（文献78）。
最近市販されている組み合わせワクチンでは、適切な
免疫原性を有する適切な抗原が、適切に組み合わされて
調剤されていないために、百日咳にかかり易いヒトで望
まれるような有効レベルの抗体を産生できるワクチンと
なっていない。
このような状況の中で、選択された抗原の選択された
量を含んだ無細胞性百日咳成分から成る有効な組み合わ
せ成分ワクチンの提供が望まれるのである。
発明の概要 本発明の目的は、無細胞性ワクチン成分を含む組み合
わせまたは多価ワクチンと、その使用法を提供すること
である。
本発明の態様の１つによれば、本発明は、 （ａ）精製品としての、百日咳トキソイド、線状赤血球
凝集、ペルタクチン及び凝集原、 （ｂ）破傷風トキソイド （ｃ）ジフテリアトキソイド （ｄ）不活化ポリオウイルス、およびオプションで、 （ｅ）破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、イン
フルエンザ菌ｂ型の莢膜多糖の担体分子の複合体から成
る、百日咳菌、破傷風菌、ジフテリア菌、ポリオウイル
スおよび／またはインフルエンザ菌の感染が原因となる
疾病に対しての免疫防御性を宿主に賦与する多価免疫原
性成分を提供する。
本発明にかかる免疫原性の成分は、宿主へのin vivo
での投与用に使用可能なワクチンとして調製されてお
り、その個々の抗原成分の免疫原性が、その同じワクチ
ンに含まれる他の個々の抗原成分により害されることが
ないように個々の成分を調剤している。
この免疫原性の成分として、さらに、アジュバント、
特に、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムも
含まれる。
この免疫原性成分には、窒素換算で約５〜30μｇの百
日咳トキソイド、窒素換算で約５〜30μｇの線上赤血球
凝集素、窒素換算で約３〜15μｇのペルタクチン、窒素
換算で約１〜10μｇの凝集原を含む。
別の実施例の１つによれば、この免疫原性成分は、百
日咳トキソイド、線毛赤血球凝集素、69kDaタンパク
質、百日咳の線状凝集素から成り、ヒトにおける単回投
与量は、百日咳トキソイドが約20μｇ、線状赤血球凝集
素が約20μｇ、線毛凝集原が約５μｇ、69kDaタンパク
質が約３μｇであり、それぞれの重量比が約20:20:5:3
となっている。さらに別の実施例によれば、このワクチ
ンは、百日咳トキソイド、線状赤血球凝集素、69kDaタ
ンパク質、百日咳の線毛状凝集素から成り、ヒトにおけ
る単回投与量は、百日咳トキソイドが約10μｇ、線状赤
血球凝集素が約５μｇ、線毛凝集原が約５μｇ、69kDa
タンパク質が約３μｇであり、それぞれの重量比は約1
0:5:5:3となっている。ここで提供される免疫原性成分
から成る１つの実施例では、このワクチンには、約15Lf
のジフテリアトキソイドが約5Lfの破傷風トキソイドが
含まれる。本発明の免疫原性成分に含まれる不活化ポリ
オウイルスには、不活化ポリオウイルス１型、２型、３
型の混合物から成る。この不活化ポリオウイルスの1,2,
3型の構成は、ヒトの単回投与量として、ポリオウイル
ス１型が約20〜50D抗原ユニット、ポリオウイルス２型
が約５〜10D抗原ユニット、ポリオウイルス３型が約20
〜50D抗原ユニットである。別の調剤では、ヒトの単回
投与量として、ポリオウイルス１型が約40D抗原ユニッ
ト、ポリオウイルス２型が約8D抗原ユニット、ポリオウ
イルス３型が約32D抗原ユニットである。
この免疫原性成分の複合分子は、破傷風トキソイドま
たはジフテリアトキソイドおよびインフルエンザｂ型の
硫酸ポリリボース・リビトール（PRP）の複合体から成
っている。そのような複合体分子は凍結乾燥の状態で提
供され、これは投与の時に他の成分と組み合わせて投与
することで液体状に戻されるようになっている。この免
疫原性成分は、ヒトにおける単回投与量として、約５〜
約15μｇのPRPを約15〜約35μｇの破傷風トキソイドと
結合させた複合体を含む。そのような調剤例の１つとし
て、約10μｇのPRPを約20μｇの破傷風トキソイドと結
合させた複合体を含むものも可能である。さらに特別な
実施例では、この免疫原性成分は、百日咳抗原のそれぞ
れに免疫応答を示し、無細胞性の成分による免疫応答
が、全細胞性百日咳により誘導された免疫応答と実質的
に同等である。
本発明の好適な実施例では、この免疫原性成分の0.5m
l用量当たり、20μｇの百日咳トキソイド、20μｇの線
状赤血球凝集素、５μｇの線毛凝集原２及び３、３μｇ
のペルタクチン膜タンパク質、15Lfのジフテリアトキソ
イド、5Lfの破傷風トキソイド、ポリオウイルス１型の4
0D抗原ユニット、ポリオウイルス２型の8D抗原ユニッ
ト、1.5μｇのリン酸アルミニウムから成る多価ワクチ
ン成分が提供される。さらに、この成分は、0.5ml用量
当たり、20μｇの破傷風トキソイドと共有結合したイン
フルエンザ菌ｂ型の精製硫酸ポリリボースリビトール莢
膜多糖（PRP）を10μｇ含む。さらに、この成分には0.5
ml用量当たり、0.6％２−フェノキシエタノールを含ま
せてもよい。
本発明のさらに別の態様によれば、本発明により提供
される免疫原成分またはワクチンの免疫成立に有効な量
を、ヒトなどの宿主に投与する手段から成る、多数の疾
病に対して宿主を免疫する方法が提供される。
本発明の長所は、この成分が、通常の幼児の疾病に対
する免疫防御を与えることのできる、安全で有効な多価
ワクチンであることである。多糖類の疾病に対して、そ
の多様な抗原のそれぞれに対しての免疫応答を互いに妨
害することなく、単一の接種で免疫に有効な方法を提供
できることは利点である。
図面の簡単な説明 本発明は、以下の詳しい説明と添付図面を参照するこ
とでより理解できるであろう。
図１は、凝集原のボルデテラ菌株からの分離手順の流
れ図である。
発明の詳しい説明 凝集原の調製 図１には、ボルデテラ菌から凝集原を調製する法が図
示されている。図１に示されたように、百日咳菌細胞の
ような凝集原を含むボルデテラ菌細胞ペーストを、例え
ば、10mMのリン酸カリウム、150mM塩化ナトリウム、4M
尿素のような緩衝液で抽出するが、その場合、細胞ペー
ストから凝集原をまず選択的に抽出して、凝集素を含む
最初の上清（sp1）と最初の残留沈殿物（ppt1）を作製
する。最初の上清（sp1）は、遠心分離などの方法によ
り、最初の残留沈殿物から分離する。その後、その残留
沈殿物（ppt1）は廃棄する。その後、精製した上清（sp
1）を遠心分離して、例えば、100〜300kDa・NMWL膜フィ
ルタを使用して、10mMリン酸カリウム/150mM塩化ナトリ
ウム/0.1％トリトン（Triton）Ｘ−100で濾過してもよ
い。その後、最初の上清は、ある温度で、ある一定の時
間、インキュベートして、凝集原を含む精製した上清
（sp2）と非凝集原汚濁物を含む第２の沈澱物（ppt2）
を生産する。適当な温度としては、約70℃〜約85℃の範
囲を含む約50℃〜約100℃であり、適当なインキュベー
ション時間は、約１〜約60分である。精製した上清は、
その後、例えば、分子量約8000（PEG8000）のポリエチ
レングリコールを添加して遠心分離して、最終濃度を約
4.5±0.2％にした後、少なくとも30分間はゆっくり撹拌
して、第３の沈殿物（ppt3）を遠心分離で集めて作製す
る。残りの上清（sp3）を廃棄する。
この第３の沈殿物（ppt3）を、例えば、10mMリン酸カ
リウム/150mM塩化ナトリウムを含む緩衝液で抽出し、線
毛粗凝集原含有溶液を作製する。1Mリン酸カリウムを粗
線毛溶液に添加して、その容量を約100mMにする。代替
法として、熱処理した線毛凝集原の精製上清を、セファ
ロースCL6Bのようなゲルを使用したゲルクロマトグラフ
ィにより、沈澱させることなく精製してもよい。その
後、粗溶液内の線毛凝集原を、例えば、PEIシリカのカ
ラム内を通過させるカラムクロマトグラフィーにより精
製して、線毛凝集原を作製する。流入体を含む線毛凝集
原をさらに遠心分離し、例えば、100−300kDa・NMWL膜
を使用して、10mMリン酸カリウム/150塩化ナトリムを含
む緩衝液で濾過する。その凝集原調製液を、≦0.22μＭ
膜フィルタによる濾過により滅菌して、凝集原１を実質
的に含んでいない線毛凝集原2,3最終精製線毛凝集原調
製液を提供する。Agg2のAgg3に対する重量比は、約1.5:
1から約2:1とする。ワクチンには、線状赤血球凝集素、
69kDa外膜タンパク質、百日咳毒素またはそのトキソイ
ドを含むその他の精製ボルデテラ菌抗原および、例え
ば、文献68などに記載されているPTの遺伝子的に無毒化
させた類似体を含むようにしてもかまわない。
例えば、クレイン（Klein）らの特許代5,085,862（こ
の特許はすでに譲受人に譲渡されている。それについて
は、本申請では参考文献の形で記載している）に記載さ
れているようなその他のボルデテラ菌抗原、百日咳毒素
（遺伝子的に無毒化した類似体を含む）、FHA、69kDaタ
ンパク質を下記に述べるような種々の方法により精製し
た形で作製してもよい。
PTの精製 PTは、従来の方法により、百日咳株の培養上清から分
離することができる。例えば、セクラ（Sekura）らの方
法を使用できる（文献55）。それによれば、まず最初
に、その培養上清を色素リガンド・ゲル・マトリックス
であるアフィゲル・ブルー（Affi−Gel Blue）（Bio−R
ad Laboratories社、リッチモンド、CA）を含むカラム
に吸収させることによりPTを分離する。次に、そのPTを
0.75M・塩化マグネシウムのような濃度の高い塩を使用
してこのカラムから溶出させ、その塩を除去した後、臭
化シアン活性化セファロースに結合させたフェチインを
含むフェチュイン・セファロース・アフィニティマトリ
ックスのカラム内を通過させる。4Mマグネシウム塩を使
用してフェチイン・カラムからPTを溶出させる。代替法
として、アイロン（Iron）らの方法（文献56）も使用可
能である。培養上清をCNBr活性化セファロース4Bカラム
上に吸収させる（この時、ヘプタグロブリンが最初に共
有結合する）。PTはpH6.5で吸収剤に結合し、pHを少し
づつ10になるまで変えることにより、0.1Mトリス/0.5M
塩化ナトリム緩衝液から溶出する。
代替法として、スコット（Scott）らに1987年11月10
に認められた米国特許4,705,686（本申請では参考文献
として記載）に記載されている方法も使用できる。この
方法では、百日咳菌の培養上清または細胞抽出物を、外
毒素を吸収し、ボルデテラ菌抗原を流れさせるだけの十
分な機能のある陰イオン交換部を有するカラムを通過さ
せるか、または、その外毒素から分離させる。
代替法として、PTをEP特許番号336,736（この特許は
譲受人に譲渡されており、本出願では、参考文献として
記載）に開示されたパーライト・クロマトグラフィーを
使用して精製してもよい。
PTの無毒化（不活化） PTを、ワクチンの副作用の原因となるかもしれない好
ましくない活性を除去するために無毒化する。ホルムア
ルデヒド、過酸化水素、テトラニトロメタンまたはグル
タルアルデヒドのような多様な従来の化学的無毒化法の
いずれも使用してもよい。
例えば、PTは、ムノズ（Munoz）らの提唱した修飾法
を使用し、グルタルアルデヒドでも無毒化できる（文献
57）。この無毒化手順では、精製したPTを、0.01Mリン
酸緩衝生理食塩水の溶液内でインキュベートする。溶液
の濃度をグルタルアルデヒドにより0.05％にして、その
混合液を室温で２時間インキュベートし、その後、濃度
をＬリシンで0.02Mにする。その混合物をさらに室温で
２時間インキュベートして、0.01MPBSで２日間透析す
る。別の実施例では、EP特許番号336736に開示されてい
る無毒化プロセスも使用できることを示している。簡単
に説明すると、PTを以下のようにグルタルアルデヒドで
も無毒化できる。
0.22M塩化ナトリウムを含むpH8.0の75mMリン酸カリウ
ム中で、精製したPTを、約50〜400μg/mlのタンパク質
濃度と同量のグリセロールで溶出させる。その溶液を37
℃で加熱し、グルタルアルデヒドを添加して最終濃度を
0.5％（w/w）にして、無毒化する。この混合物を37℃で
４時間放置して、その後、アスパラギン酸（1.5M）を添
加して最終濃度を0.25Mとする。その混合物を室温で１
時間インキュベートし、その後、0.15M塩化ナトリウム
を含む10容量の10mMリン酸カリウム（pH8.0）と５％グ
リセロールで透析してグリセロールを減らし、グルタル
アルデヒドを除去する。PTトキソイドを0.2μＭ膜を使
用して滅菌濾過する。毒性を全く示さないか、ほとんど
示さないPT突然変異体分子を作製するために遺伝子組換
え技術をトキソイド処理に使用する場合には、化学的無
毒化処理は必要ではない。
FHAの精製 FHAを、オウエル（Cowell）らが報告したような、培
養上清から精製する方法でもよい（文献58）。メチル化
ベータシクロデキストリンのような成長促進剤を、培養
物上清内のFHAの収量を増加させるために使用可能であ
る。この培養物の上清をヒドロイシアパタイト・カラム
に移して、その中のFHAをカラム上に吸収させる。これ
にはPTは存在しない。外毒素を除去するために、トリト
ン（Triton）Ｘ−100で、カラムを全体的に洗浄する。
その後、0.5M塩化ナトリウムの0.1Mリン酸ナトリウム溶
液を使用してFHAを溶出させ、必要な場合には、残留し
ているPTを除去するために、フェチイン・セファロース
カラムを通過させる。追加的な精製プロセスとして、セ
ファロースCL−6Bカラムを通過させてもよい。
代替法として、抗原を対象とするモノクローナル抗体
法を使用してFHA精製を行ってもよい。この場合には、F
HAに対する抗体がCNBr活性化アフィニティカラムに付着
する（文献59）。
代替法として、FHAを、上記特許EP336,736に開示され
たパーライトカラムを使用して精製してもよい。
69kDa外膜タンパク質の精製（ペルタクチン） この69kDa外膜タンパク質（69Kまたはペルタクチンと
呼ぶ）を細菌細胞から回収する。EP特許484621（本出願
では文献として記載）で開示されている方法で、最初に
チメルゾル（thimerosal）のような細菌発育阻止剤を使
用し細菌細胞を不活化させる。不活化した細胞を、PBS
（pH7〜８）のような液体培地に懸濁させ、加温して（4
5〜60℃）、反復抽出させ、その後、さらに室温または
４℃まで冷却させる。この抽出法により細胞から69Kタ
ンパク質が放出される。69Kタンパク質を含む物質を沈
澱させて集めて、それをアフィゲルブルー（Afffi−gel
Blue）のカラム内を通過させる。この69Kタンパク質を
0.5M塩酸マグネシウムのような濃度の高い塩類を使用し
て溶出させる。透析した後、クロマトフォーカシングの
支持体を通過させて精製する。
代替法として、公開PCT・WO91/155005（すでに譲受人
名になっており、これは本出願に参考文献として記載）
で開示されているように、69Kタンパク質を百日咳菌培
地の上清から精製してもよい。この方法が好ましい。そ
の理由は、アデニレート・シクラーゼ色素・クロマトグ
ラフィ物質が混入していないペルタクチンが含まれてい
ないからである。
その他の適当な、69kDa外膜タンパク質の百日咳菌か
らの精製方法が、1984年１月４日取得の米国特許番号5,
276,142［ゴトー（Gotto）ら］および1992年３月31日取
得の米国特許番号5,101,014［バーンズ（Burns）］に開
示されている。
本発明にかかるその他の成分 本発明のワクチンは、破傷風トキソイド、ジフテリア
トキソイド、不活化ポリオウイルス（IVP）および、オ
プションで、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソ
イドのインフルエンザｂ型の莢膜多糖（capsular polys
accharide）との複合体のようなボルデテラ菌でない菌
由来の免疫原性物質も含む。多糖類成分のワクチンに含
まれるその他の成分としては、ヘモフィルス属菌の外膜
タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原や流行性耳下腺炎（あた
ふくかぜ）菌、麻疹菌、風疹菌などの抗原が含まれる。
インフルエンザ菌ｂ型由来の硫酸ポリリボース・リビト
ール（PRP）を分離し、これを誘導してアジピン酸ジヒ
ロラジドが得られるようにし、これを破傷風トキソイド
またはジフテリアトキソイドに共有結合させて、それぞ
れの複合体であるPRP−ＴまたはPRP−Ｄ複合体を作製す
ることにより、破傷風トキソイドまたはジフテリアトキ
ソイドおよびHib（インフルエンザ菌ｂ型）の莢膜多糖
の複合体を含ませてもよい。
各抗原を、個別にリン酸アルミニウムまたは水酸化ア
ルミニウム（これらをミョウバンと総称する）のような
アジュバントに吸収させることで、これらの抗原を選択
した相対的な量を含む本発明のワクチンを迅速に生産す
ることが可能となる。
選択された多価ワクチン調剤 選択的実施例の１つでは、本発明は、下記の特性（こ
こで使用されているμｇタンパク質という表示は、精製
した濃縮物で実施したギジェダール（Kjedahl）試験結
果を基礎にしたもので、タンパク質窒素のμｇ数として
表現されている）を有するワクチンを提供する。これら
のワクチンはすべて筋肉内投与が可能である。
（ａ）CP20/20/5/3DT−mIPV（ハイブリッド） 調剤の１つは、百日咳ワクチン（CP）とジフテリアト
キソイド（DI）と破傷風トキソイド（Ｔ）、不活化ポリ
オウイルス（mIPV）を組み合わせ成分のもので、「CP
20/20/5/3DT−mIPV（ハイブリッド）」と呼ぶ。MRC−５
細胞内で増殖させたポリオウイルスを「mIPV」と呼び、
ベロ細胞内で増殖させたポリオウイルスを「IPVまたはv
IPV」と呼んでいる。どちらも不活化したポリオウイル
スであり、製剤ではどちらのウイルスも代替的に使用で
きる。
ヒトに対する１回用量である0.5mlのCP20/20/5/3DT−
mIPV（ハイブリッド）には、以下の成分量が含まれるよ
うに製剤する。
20μｇ百日咳トキソイド（PT） 20μｇ線状赤血球凝集素（FHA） ５μｇ線毛凝集原２および３（FIM） ３μｇペルタクチン外膜タンパク質（69kDa） 15Lfジフテリアトキソイド 5Lf破傷風トキソイド 40D 抗原ユニット ポリオウイルス１型 8D 抗原ユニット ポリオウイルス２型 32D 抗原ユニット ポリオウイルス３型 1.5mg リン酸アルミニウム 0.6％ ２−フェノキシエタノール（保存剤として） （ｂ）CP20/20/5/3DT−mIPV（ハイブリッド）＋PRP−Ｔ 別の調剤として、百日咳ワクチン（CP）、ジフテリア
トキソイド（Ｄ）、破傷風トキソイド（Ｔ）、不活化ポ
リオウイルス（mIPV）の組み合わせたワクチンがあり、
これを「CP20/20/5/3DT−mIPV（ハイブリッド）」と呼
び、さらに、凍結乾燥させたPRP−Ｔを液体状に戻す調
剤が使用される。その結果、調剤される成分には、0.5m
l用量当たり、以下の成分量を含む。
20μｇ百日咳トキソイド（PT） 20μｇ線状赤血球凝集素（FHA） ５μｇ線毛凝集原2,3（FIM） ３μｇ外膜タンパク質（69kDa） 15Lfジフテリアトキソイド 5Lf破傷風トキソイド 20μｇの破傷風トキソイドと共有結合させた、インフ
ルエンザ菌ｂ型の精製硫酸ポリリボース・リビトール莢
膜多糖（PRP）の10μｇ ポリオウイルス１型 40D抗原ユニット ポリオウイルス２型 8D抗原ユニット ポリオウイルス３型 32D抗原ユニット 1.5mg リン酸アルミニウム 0.6％ ２−フェノキシエタノール （ｃ）CP20/20/5/3DT−PRP−Ｔ−IPV（ハイブリッド） さらに別の調剤として、百日咳ワクチン（CP）、ジフ
テリアトキソイド（Ｄ）、破傷風トキソイド（Ｔ）不活
化ポリオウイルス（mIPV）、PRP−Ｔを組み合わせたも
ので、これを「CP20/20/5/3DT−PRP−Ｔ−IPV（ハイブ
リッド）」と呼ぶ。この成分の、ヒトにおける0.5ml用
量当たりの成分量は以下の通りである。
20μｇ百日咳トキソイド（PT） 20μｇ線状赤血球凝集素（FHA） ５μｇ線毛凝集原2,3（FIM） ３μｇ外膜タンパク質（69kDa） 15Lfジフテリアトキソイド 5Lf破傷風トキソイド 20μｇの破傷風トキソイドと共有結合させた、インフ
ルエンザ菌ｂ型の精製硫酸ポリリボース・リビトール莢
膜多糖（PRP）の10μｇ ポリオウイルス１型 40D抗原ユニット ポリオウイルス２型 8D抗原ユニット ポリオウイルス３型 32D抗原ユニット 1.5mg リン酸アルミニウム 0.6％ ２−フェノキシエタノール 臨床試験 （ａ）DTPコンポーネント百日咳ワクチン 下記の方法で調製した、百日咳の感染防御のための線
毛凝集原の安全性、非反応性、有用性を確認するため
に、かなりの数のヒト対象における臨床試験が実施され
た。この試験では、ワクチンに含まれる各抗原に対する
免疫応答が得られた（例えば、第３表に示された例）。
特別な多価百日咳ワクチンの１つであるCP10/5/5/3DTに
ついて、その百日咳に対するワクチン効果を評価するた
めに、リスクをもっているヒトを対象に、大規模なプラ
セボ・コントロール、多施設、二重・無作為の臨床試験
を実施した。
典型的な百日咳の症例の定義は以下の通りである 23日以上の痙攣性の咳があること、または、百日咳菌
（B.pertussis）の存在が培養で確認されること、ある
いは、ペアとして得た血清において、ELISA検査によ
り、FHAまたはPTに対する100％IgGまたはIgA抗体産生の
増加が認められ、ボルデデル菌感染を示す血清学的証拠
があること、あるいは、血清学的データが不足している
場合には、試験対象の小児が、その試験対象小児の咳の
発症前後の28日以内に、咳の発症のあった家庭内におい
て培養により百日咳菌の存在が確認されている患者に接
触していること。
この試験の結果として、このCP10/5/5/3DTが、上記の
症例定義で規定された百日咳感染防御において、85％の
有効性を有することが示された。同じ研究において、PT
とFHAの２成分だけを含む百日咳無細胞性ワクチンの有
効性は約58％であり（PT25・FHA25・DT）、全細胞百日
咳ワクチン（DTP）が48％の有効性であった（下表４参
照）。さらに、このCP10/5/5/3DTワクチンは、軽度（咳
が少なくとも１日続く場合を「軽度」と定義する）の百
日咳の感染を有効率で77％まで防御した。特に、このワ
クチンで得られた免疫応答の状態は、百日咳に対して高
い有効性を示すと報告されている全細胞性百日咳ワクチ
ンで免疫した場合と実質的に同じ程度であった。
（ｂ）多価DPT−PRP−Ｔ−IPVワクチン （Ｉ）吸着ジフテリアトキソイド及び破傷風トキソイ
ド、インフルエンザ菌ｂ型破傷風トキソイド複合ワクチ
ン及び不活性化ポリオウイルスワクチン（ベロ細胞上で
増殖）と、百日咳コンポーネントワクチンとの組合せ
（CP20/20/5/3DT−PRP−Ｔ−IPV）の安全性と免疫原性
について、 全細胞百日咳ワクチンの（ａ）吸着ジフテリアトキソ
イドおよび破傷風トキソイド、及び不活化ポリオワクチ
ンと組み合わせ、または（ｂ）吸着ジフテリアトキソイ
ド及び破傷風トキソイド、及び不活性化ポリオワクチン
との組合せ（吸着DPT−ポリオ;MRC−５細胞上で増殖）
を、凍結乾燥したインフルエンザ菌ｂ型破傷風トキソイ
ド複合体ワクチン（PENTA）を液体状に戻して復元す
るために使用して得たワクチンとの組合せ、あるいは、 （ｃ）ジフテリアトキソイド及び破傷風トキソイド吸着
インフルエンザ菌ｂ型破傷風トキソイド複合ワクチン、
並びにMRC−５細胞上で増殖させたポリオウイルスを不
活化させて得たポリオワクチンの百日咳コンポーネント
ワクチンとの組合せ（CP20/20/5/3DT−mIPV）を、凍結
乾燥したインフルエンザｂ型破傷風トキソイド複合体ワ
クチン（PRP−Ｔ）と個別に与えるか、またはその液状
化に使用した場合について 生後2,4,6,18カ月の小児にへの投与により比較した。
この無作為コントロール試験には、897例の２カ月齢
の幼児が組み入れられ、８種類の異なるワクチンアーム
の１つを投与した。投与したワクチンは、CP20/20/5/3D
T−PRP−Ｔ−IPV（液体）;PRP−Ｔと同時ではあるが異
なった部位に投与したCP20/20/5/3DT;対照ワクチン、PR
P−Ｔ（PENTA）を液体状に戻すために使用される全細
胞性DPTポリオワクチンであった。治験を行った対象は
すべて投与したワクチンに耐えた。組み換え百日咳菌を
組み合わせた２つの型の間には免疫応答において有意な
差異は認められなかった。
PRP−Ｔを液状に戻すために使用した組合せワクチンC
P20/20/5/3DT−mIPVを投与した小児では、これらを別個
に異なった部位に投与した群に較べて、わずかに高い局
所的反応が認められた。すべての組合せコンポーネント
百日咳ワクチンでは、全細胞組合せワクチンに較べて全
身的にも局所的にも反応は低かった。コンポーネント百
日咳ワクチンと全細胞ワクチンとの反応発生率の差異
は、ワクチン接種直後の24時間以内に顕著であった。組
合せコンポーネント百日咳ワクチンは両方ともすべての
抗原に対して優れた免疫応答を示した。すべての状況に
おいて、百日咳PT、FHA、ペルタクチンを使用したコン
ポーネントワクチンは、全細胞組合せワクチンに較べて
優れた免疫応答を示した。しかし、コンポーネントワク
チンと全細胞ワクチンとの間には、その免疫応答に有意
な差異は認められなかった。抗−PRP、ジフテリア、ポ
リオ1,2に関しては、コンポーネントワクチンと全細胞
調剤との間には、その免疫応答において、有意な差異は
認められなかった。コンポーネント百日咳調剤は、両方
ともPENTAよりは高い破傷風に対する免疫応答を示し
た。コンポーネントワクチンは両方とも、ポリオ３以外
のすべての抗原に対して同じような血清学的反応を示し
た。このポリオ３に対しては、PRP−Ｔを液状に戻すた
めに使用したCP20/20/5/3DT−mIPVのほうが、CP
20/20/5/3DT−PRP−Ｔ−IPVに較べて高い免疫応答を示
した。投与法により、破傷風抗原以外の抗原に対する血
清学応答に影響が出ることはなかった。組み合わせた群
においても、分離して投与した群においても、３回の接
種後に、100％の小児において、破傷風に対しての感染
防御が認められた（＞0.01EU/ml）。ここでより重要な
ことは、PRP−Ｔに対しては、すべてのワクチン投与群
でよい免疫応答が認められ、98.3％の小児が、＞0.15μ
g/mlのレベルを達成し、86.1％の小児が、＞1.0μg/ml
のレベルを達成した。これらの数字は、以前の試験にお
いて全細胞百日咳ワクチンをPRP−Ｔに使用した際に観
察された数字に匹敵するものである。
得られた血清学的応答については表５〜７までに記載
した（表の中で「Ｈ」とはハイブリッドのことであ
る）。
（II）吸着ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイ
ドと不活性化ポリオワクチン（MRC−５細胞上で増殖）
とコンポーネント百日咳ワクチンの組合せ（CP
20/20/5/3DT−mIPV）を、凍結乾燥したインフルエンザ
菌ｂ型破傷風トキソイド複合体ワクチン（PRP−Ｔ）と
別個に与えるか、あるいはその液状化に用いた場合につ
いての安全性と免疫原性を、吸着ジフテリアトキソイド
および破傷風トキソイドと不活性化ポリオワクチン（MR
C−５細胞上で増殖）を全細胞百日咳ワクチンと組合せ
たもの（DPT−ポリオ吸着）を、凍結乾燥したインフル
エンザ菌ｂ型破傷風トキソイド複合体ワクチン（PENTA
）の液状化に使用した場合と、生後18〜19カ月の小児
への投与において比較した。
この５群のアーム試験には、PRP−Ｔを液体状に戻す
ために使用された全細胞PENTAコントロール・アーム
とCP20/20/5/3DTPmIPVが含まれる。第５群では、CP
20/20/5/3DT−mIPVはPRP−Ｔと同時にではあるが、別々
の部位に接種された。生後18〜19カ月の489例の対象に
ワクチンを投与し、その内の466（95％）例がプロトコ
ルに従った試験を完了した。PRP−Ｔを液体状に戻すた
めに使用したCP20/20/5/3DT−mIPVは、特に接種後の最
初の24時間以内において、PENTAに較べて有意に非反
応性であった。局所における反応性は、液体状に戻した
ワクチンのほうが別々に投与したワクチンに較べてわず
かに高い率であった。PENTAは、PRP−Ｔを液体状に戻
すために使用したCP20/20/5/3DT−mIPVよりも、ポリオ
１に対する免疫応答が高かった。抗−PRP、ジフテリ
ア、百日咳凝集素、線毛、ポリオ２またはポリオ３に対
する免疫応答には、有意な差異が認められなかった。PR
P−Ｔを液体状に戻すために使用したCP20/20/5/3DT−mI
PVは、百日咳PT、FHA、ペルタクチンに対して有意に高
い血清学的応答を示した。PRP−Ｔを液体状に戻すため
に使用したCP20/20/5/3DT−mIPVは、試験をしたすべて
の抗原に対して一定の一貫した血清学的応答を示した。
PRP−Ｔを液体状に戻すために使用したCP20/20/5/3DT−
mIPVと、PRP−Ｔとは別に投与されたCP20/20/5/3DT−mI
PVとの間には、その免疫応答において、破傷風抗毒素に
対して以外は、有意な差異は認められなかった（4.91:
6.78EU/ml）。
この試験では、PRP−Ｔを液体状に戻すために使用し
たCP20/20/5/3DT−mIPVが、３個のロットにおいて一貫
した血清学的応答を示し、百日咳に対しては、PENTA
よりも高い免疫原性を示しことが判明した。さらに、CP
20/20/5/3DT−mIPVは、PENTAに較べて有意に低い局所
的、系統的（全身性）反応を示した。
（III）吸着ジフテリアトキソイド及び破傷風トキソイ
ドと不活化ポリオワクチン（MRC−５細胞上で増殖）と
コンポーネント百日咳ワクチンの組合せ（CP20/20/5/3D
T−mIPV）の安全性及び免疫原性を、吸着ジフテリアト
キソイドと破傷風トキソイド、不活化ポリオワクチン
（MRC−５細胞上で増殖）と全細胞百日咳ワクチンとの
組合せにおけるものと、４才〜６才の小児において比較
した。
CP20/20/5/3DT−mIPV（ｎ＝131）またはDTT−ポリオ
（ｎ＝33）のいずかを投与するために、164例の対象を
無作為に4:1の割合に割り当てた。この試験では、有意
または重篤な副作用は発生しなかった。CP20/20/5/3DT
−mIPVは、特に、接種後０〜24時間の間に有意に低い局
所的、系統的（全身性）反応を示した。この局所反応
は、接種後０〜24時間の間、DPT−ポリオワクチンを投
与した群の97％に、CP20/20/5/3DT−mIPVを投与した群
の76.9％に普通に認められた。CP20/20/5/3DT−mIPVに
よる局所反応は、通常の場合、軽度または中等のもので
あった。それとは対照的に、DPT−ポリオワクチンを投
与した対象の半分以上に重篤と見られる局所反応が現れ
た。ワクチンを注射した部位の痛みは、通常72時間まで
に消えたが、発赤または脹大は、24〜72時間に亘り残る
傾向にあった。
投与後０〜24時間での全身反応は、DPT−ポリオワク
チン投与群（90.9％）に較べて、CP20/20/5/3DT−mIPV
投与群では少なかった（38.5％）。24〜72時間における
全身反応は両群ともに見られなかった。
ジフテリア、破傷風、ポリオ2,3に対する免疫応答は
両ワクチン間では類似していた。DPT−ポリオワクチン
投与群（15,462）では、CP20/20/5/3DT−mIPV投与群（1
0,903）に較べて、ポリオ１に対する免疫応答が有意に
高いものであった。対象すべてが優れた免疫応答を示
し、それぞれの疾病に対して感染防御が可能であると判
断された。百日咳抗原の全部に対しての血清学的応答
は、CP20/20/5/3DT−mIPVの投与群において有意に高い
ものであった。
（IV）吸着ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイ
ドとインフルエンザｂ型破傷風トキソイド複合ワクチン
と、MRC−５細胞上で増殖させたポリオウイルスを不活
性させたポリオワクチンと、コンポーネント百日咳ワク
チンとの組合せ（CP20/20/5/3DT−PRP−TPmIPV）の安全
性と免疫原性を、 吸着ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドと
不活化ポリオワクチン（MCR−５細胞上で増殖）と全細
胞百日咳ワクチンとの組合せ（DPT−ポリオ吸着）を、
凍結乾燥したインフルエンザｂ型破傷風トキソイド複合
体ワクチン（PENTA）を液体状に戻すために使用して
得たものと、あるいは 吸着ジフテリアトキソイド及び破傷風トキソイドと不
活性化ポリオワクチン（MCR−５細胞上で増殖）とコン
ポーネント百日咳ワクチンとの組合せ（CP20/20/5/3DT
−mIPV）を、凍結乾燥したインフルエンザｂ型破傷風ト
キソイド複合体ワクチン（PRP−Ｔ）を液体状に戻すた
めに使用して得たもののにおける安全性と免疫原性と
を、生後18〜19カ月の小児への投与において比較した。
この３つのアーム・無作為コントロール・単一盲検の
目的は、生後18〜19カ月に小児にける、組み合わせた２
つの無細胞性百日咳ワクチンであるCP20/20/5/3DT−PRP
−Ｔ−IPVと、PRP−Ｔを液体状に戻すために使用したCP
20/20/5/3DT−mIPVの安全性と免疫原性を、PENTA（PR
P−Ｔを液体状に戻すために使用した全細胞百日咳DPTポ
リオワクチン）と比較して評価することであった。
合計で99例の小児のうち、97例（98％）がプロトコル
に従って試験を完了した（３種類のワクチン群にはそれ
ぞれ33例を割り当てた）。この研究では、特に重篤な反
応は認められなかった。PENTA投与群では、他の２つ
のワクチンの投与群に較べて、有意に、中等または重篤
な局所および全身反応が発生する傾向があった。
24時間目に差異は最も顕著であり、発熱、発赤、脹
大、痛み、神経過敏、活動低下、食欲減退の点で、統計
的な有意性を示した。組合せコンポーネント百日咳ワク
チンを投与した小児において、反応性が軽度になる傾向
があった。この２種類のコンポーネントワクチンの投与
群間には、その反応発生率には有意な差異は認められな
かったが、24時間目に、PRP−Ｔを液体状に戻すために
使用したCP20/20/5/3DT−mIPVの投与群において、CP
20/20/5/3DT−PRP−Ｔ−IPVの投与群に較べて、より頻
繁に神経過敏が見られた（18％:3％）。血清学的応答は
満足なもので、ワクチンを受けた治験参加者の100％が
ジフテリア抗毒素（≧0.01IU/ml）、破傷風抗毒素（≧
0.01IU/ml）、抗PRP（≧1.0μg/ml）に対する防御作用
を示すレベルを達成した。ポリオ1,2,3に対する検出可
能な中和抗体が、接種後のすべての治験参加者に認めら
れた。
ジフテリアに対する免疫応答は、ワクチン内の高い抗
原含有量（25Lf:15Lf）を反映して、PENTA投与群にお
いて高かった。
百日咳抗体は、PENTA投与群に較べて、組み合わせ
た２種類の百日咳ワクチン群においてかなり高く、その
抗−PT、抗−FAH、抗−ペルタクチン・GMT応答は統計的
に有意のレベルに達した。抗−線毛および抗−百日咳凝
集抗体も、コンポーネント百日咳ワクチンの投与群にお
いて高いものであったが、その差異は、統計的に有意で
あるものではなかった。
要約すれば、この治験の結果は、２つの組み合わせ無
細胞性百日咳ワクチンであるCP20/20/5/3DT−mIPV（こ
れはPRP−Ｔを液体状に戻すために使用されたもの）とC
P20/20/5/3DT−PRP−Ｔ−IPVとは同等のものであり、18
〜19カ月の小児にブースターとして投与した場合には、
共に、その反応発生率は低いものであり、しかも高い血
清応答を示すことを示している。
（Ｖ）吸着させたジフテリアトキソイドおよび破傷風ト
キソイドを組み合わせたコンポーネント百日咳ワクチン
（CP20/20/5/3DT）のみ、または、MRC−５細胞上で増殖
させた１種類または２種類の不活化ポリオウイルス、mI
PV、ベロ細胞上で増殖させて得たその他のvIPVを組み合
わせたワクチン、または経口ポリオワクチン（OPV）の
安全性と免疫原性について、生後17〜19カ月の小児に投
与した評価した。
CP20/20/5/3DTと２種類のIPV（ベロ細胞またはMRC−
５細胞上で増殖させたもの）間の相互作用を試験するた
めに、５群から成るアーム試験計画を立てた。この両方
のIPVを、CP20/20/5/3DT−mIPVとCP20/20/5/3DT−vIPV
の両方を含む単一の液体製品として、あるいは、これら
が同時に投与されるが、その注射部位が異なるようにCP
20/20/5/3DT＋mIPVおよびCP20/20/5/3DT＋vIPVと組み合
わせたものとして分けた。第５番目の群には、CP
20/20/5/3DTとOPVを同時に投与した。すべての対象者
に、免疫後の血液採取の時に、PRP−Ｔを投与した。こ
の研究では、抗−PRP応答についての評価は行っていな
い。
一般的に、ワクチンが別々に注射されたか、または、
CP20/20/5/3DT（ハイブッド）ワクチンと組み合わされ
て注射されたかどうかに関係なく、MRC−５またはベロ
細胞上で増殖させたウイルスを不活化して得たポリオワ
クチンを投与した後の副作用の発生率に差異はなかっ
た。
群間では、PT、FHA、ペルタクチンに対する免疫応答
における有意な差異は認められなかった。CP20/20/5/3D
T（ハイブッド）とOPVを投与した小児における、FIM、
百日咳凝集素、ジフテリア、破傷風に対する免疫応答
は、CP20/20/5/3DT（ハイブッド）およびベロ細胞由来I
PVを投与した小児におけるよりもわずかに高いものであ
ったけれども、有意に高いということではなかった。一
般的には、ポリオワクチンに対する免疫応答は、IPVを
投与した小児の場合は、OPVを投与した小児の場合と同
等かまたは高かった。１例を除いて、すべて対象におい
て、百日咳凝集素に対して、＞1:64のレベルを達した。
さらに、１例を除いてすべての対象において、ジフテリ
ア抗毒素に対して、≧0.1U/mlレベルを達した。破傷風
抗毒素に対しては、すべて≧0.1EU/mlレベルを達した。
この試験の結果により、IPV（MRC−５細胞またはベロ
細胞由来）と組み合わせたCP20/20/5/3DT（ハイブッ
ド）は、生後17〜19カ月の小児に使用した場合にも、安
全で、免疫原性を発揮することが示された。コンポーネ
ント組合せワクチンは、少なくとも、成分が個別に注射
されたワクチンと同じくらい免疫原性があり、場合によ
っては、より強力な免疫原性を発揮する場合もある。複
数のワクチンを、単一の注射液にまとめて組み合わせて
使用しても、局所における副作用の有意な増加となるこ
とはなかった。２種類のIPVワクチンをそれぞれ単独で
投与した場合でも、一緒にまとめて注射した場合でも、
その副作用発生または免疫応答に実質的な差異は認めら
れなかった。IPVを含めた場合でも、CP20/20/5/3DT（ハ
イブッド）を単独で投与した場合に較べて、副作用発生
率を増加させるということはなかった。
本試験で得られた血清学的結果は、表８に概説してい
る（表において、Ｈ＝ハイブリッド）。
（VI）ジフテリアトキソイドと破傷風トキソイドだけを
吸着させて組み合わせたコンポーネント百日咳ワクチン
（CP20/20/5/3DTおよびCP10/5/5/3DT）または、それに
インフルエンザｂ型複合物ワクチンも組み合わせたコン
ポーネント百日咳ワクチンを17〜19カ月の小児に使用し
た場合の、安全性と免疫原性について評価した。
生後18〜19カ月の小児における、クラシックなコンポ
ーネント百日咳ワクチン（CP10/5/5/3DT）およびハイブ
リッド百日咳ワクチン（CP20/20/5/3DT）と、インフル
エンザｂ型複合ワクチン（PRP−Ｔ）との間の相互作用
を評価すべく、６アーム試験を計画した。
３種類のスケジュールを使用した。以下の通りであ
る。
（ａ）PRP−Ｔを液体状に戻すためにコンポーネント百
日咳ワクチンの１つを使用すること、 （ｂ）コンポーネント百日咳ワクチンとPRP−Ｔの両方
を同時に投与するが、一方は、PRP−Ｔを投与する部位
とは別の部位に投与すること、および （ｃ）PRP−Ｔをコンポーネント百日咳ワクチンを接種
した後１カ月に投与すること である。全部の小児に最初の来院時にOPVを投与し、生
後2,4,6カ月の時に、同じコンポーネント百日咳ワクチ
ンを投与した。すべての小児は、以前において、これら
の２種類のワクチンに関する大規模な安全試験に参加し
ていた。
合計で545例の対象が試験に参加し、うち542例（99
％）が試験を完了した。
血清学的応答は、コンポーネント百日咳ワクチンを、
PRP−Ｔと同じ日に投与した場合には、別々の日に投与
した場合に較べて全体的に、大抵の抗原に対してより高
いレベルを示した（表９参照）。
より重要なことは、コンポーネント百日咳ワクチンと
PRP−Ｔを別々の日に投与した時には、コンポーネント
百日咳ワクチンをPRP−Ｔと同じ日に投与した場合に較
べて、抗−PRP応答が低下しなかったことである。
別々の日にワクチンを投与した小児における免疫後の
GMTは、有意に低いものであった。対象を層化（グルー
プ分け）した場合、同時に投与したケースと別々の日に
投与したケース間では、抗−PRP応答での差異が認めら
れた。CP20/20/5/3DT（ハイブリッド）を受けた者（レ
シピエント）は、別々の日に投与された場合よりも、同
時に投与された場合に低い抗−PRPレベルを示した。こ
れらの差異は、CP10/5/5/3DTを受けた者には認められ
ず、群を組み合わせると、これらの差異は消えた。すべ
てのレシピエントの抗−PRPレベルは、≧0.15μg/mlで
あり、各群の98％以上の対象のレベルは、≧1.0μg/ml
であった。このレベルに達しなかったのは、わずかに４
例のレシピエント（0.7％）だけであり、それは、別々
のワクチン注射を別の日に投与した３例と、組み合わせ
ワクチンを投与した群の１例である。各群の82％以上に
おいて、抗−PRP抗体の抗体価は10μg/mlであった。ワ
クチン投与により引き起こされた局所反応のうち、痛み
だけが、別々の日に投与を受けた群（16.7％）に較べ
て、組み合わせワクチン投与を受けた群（27.8％）によ
り頻繁に認められた。この発生率は、同じ日に別々のワ
クチン注射を受けた群（24.2％）のそれと差異がなかっ
た。全体では、全身的な反応がワクチン投与を受けた各
群のそれぞれに同じ頻度（60〜62.1％）で認められた。
レシピエントの約３分の１には、発熱はほとんど認めら
れなかった。神経過敏だけが、別々のワクチンを別々に
受けた群（22.0％）または、ワクチンを別々の日に受け
た群（22.8％）に較べて、組み合わせワクチン注射を受
けた群（33.3％）のほうに頻繁に認められた。
これらの試験結果を要約すると、CP10/5/5/3DTまたは
CP20/20/5/3DTとPRP−Ｔとの同日同時投与は、抗−PRP
−Ｔ応答を妨害するものではなく、実際にはそれを増強
し得るものである。その他の抗原に対する血清学的応答
も優れた結果が認められた。２種類のワクチンを一緒に
混合した場合には、破傷風が影響を受けた唯一の抗原で
あったが、全小児において、高いレベルの防御効果を得
ることができた。
後期の臨床試験の準備として、アクトヒブ（ActHib）
（PRP−Ｔ）を液体状に戻すために使うための、CP
10/5/5/3DT−IPV（MBC5細胞上で増殖）と、A5I（CP
10/5/5/3DT−PRP−Ｔ−IPV（ベロ細胞上で増殖）、３μ
g/ml）を調製した。コンポーネント百日咳抗原は、保存
剤のない状態で、3mg/mlの割合で、個別にリン酸アルミ
ニウムに吸着させた。
これに関して、PTは、10mM・リン酸カリウム、0.15M
・NaCl、５％グリセロールに入れ、FHAは、10mM・リン
酸カリウム、0.5M・NaClに、69Kは、10mM・リン酸カリ
ウム、0.15M・NaClに、線毛は、10mM・リン酸カリウ
ム、0.15M・NaClに入れた。Ｄを濃度が300Lf/mlとし
て、リン酸アルミニウムに吸着させた（6.25mg/ml）。
２−フェノキシエタノールを保存剤として、その容量が
全体の0.6％になるように添加した。Ｔを、濃度300Lf/m
Lで、リン酸アルミニウムに吸着させた（6.25mg/ml）。
２−フェノキシエタノールを保存剤として、その容量が
全体の0.6％になるように添加した。吸着させたコンポ
ーネント百日咳抗原を、濃度を3.65投与量/mlまたは最
終容量の55％になるように、吸着させたＤ、吸着させた
Ｔと組み合わせた。２−フェノキシエタノールの容量は
0.6％であった。mIPVまたはｖ−IPV/PRP−Ｔと組み合わ
せる前に、殺菌状態、アルミニウム容量、２−フェノキ
シエタノールの容量を確認した。5mlのｍ−IPVおよび２
−フェノキシエタノールを添加して最終の濃度になるよ
うに希釈した。A51、ｖ−IPV、PRP−Ｔ、２−フェニキ
シエタノールを添加して最終強度になるように希釈し
た。
多価ワクチンの臨床試験の結果を概略すれば、PRP−
Ｔを液体状に戻すために使用したCP20/20/5/3DT−mIPV
を、PENTA（全細胞百日咳ワクチンを含む）と同等
の、ジフテリア、破傷風、ポリオ1,2,3に対する血清学
的応答を発生するということが判明した。抗−PRP応答
の程度は、幼児に投与した場合でも、ブースターとして
投与した場合でも、PENTAで観察されたと同等かそれ
より高い。破傷風応答は、PRP−Ｔとは別々に投与され
たCP20/20/5/3DT−mIPVに較べて、PRP−Ｔを液体状に戻
すために使用するCP20/20/5/3DT−mIPVよりも低いもの
であったが、このことは臨床的に重要なことではない。
他の試験結果にも同じことが言えるが、全細胞性ワクチ
ンは、コンポーネント百日咳ワクチンと同等かまたは高
い線毛および凝集素応答を示したが、使用されている全
細胞性ワクチンには高い免疫原性の線毛成分を含んでい
ることが知られている。その他のすべての百日咳の免疫
応答の程度は、一貫して、PRP−Ｔを液体状に戻すため
に使用されたCP20/20/5/3DT−mIPVのほうがPENTAより
強い。このように、本発明は、他の成分またはその多価
ワクチンの別々の内容物により、各抗原に対する免疫応
答が低下したり減退することのない多価免疫原成分を提
供する。減退した免疫応答のことを時々干渉と呼ぶこと
がある。
ワクチンの調製と使用法 このように、ワクチンとして使用できる免疫原性成分
を、以下に記載するような免疫原から調製してもよい。
ワクチンは免疫応答を誘発し、投与した対象は抗体を産
生する。ワクチンを含む免疫成分を、液体成分またはエ
マルジョンのような注射可能な状態に調製してもよい。
免疫原を、免疫原と混和可能で、薬学的に受け入れ可能
な医薬品添加物と混合してもよい。そのような医薬品添
加物としては、水、生理食塩水、デキストロース、グリ
セロール、エタノール、およびそのこれらの組み合わせ
物質がある。免疫成分およびワクチンには、さらに湿潤
剤、乳化剤、pH緩衝剤のような補助物質、または効果を
補強するためのアジュバントを含めてもよい。免疫原性
成分およびワクチンを、非経口で、あるいは、皮下によ
る注射、筋肉内投与してもよい。免疫原性調剤およびワ
クチンをそのワクチンの形態に合わせて投与し、しか
も、治療上効果があり、免疫原性があり、免疫防御でき
る量を使用する。
投与する量は、治療対象により異なり、例えば、個人
の免疫系の抗体を合成する能力や、必要な場合には、細
胞性免疫応答を成立させる能力により違ってくる。投与
で要求される有効成分の正確な量も、医者の判断により
違ってくる。しかし、当業者には、適当な投与量の決定
は容易であり、抗原をμｇのオーダーで用いることがで
きる。最初の投与およびその後のブースタ量に関する適
当な治療法は多様であるが、これには最初の投与後に続
けて投与する方法が含まれる得る。投与量は投与経路や
宿主の大きさにより違ってくる。
本発明にかかる免疫原性成分の免疫原濃度は、一般的
には、約１〜95％である。抗原を、通常は、リン酸緩衝
生理食塩水に0.005〜0.5％の濃度で溶かされたアジュバ
ントと一緒に投与することにより、その免疫原性を有意
に改善できる。アジュバントは、抗原の免疫原性を強化
するが、それ自体に免疫原性をもっている必要はない。
アジュバントの作用は、投与部位の近くに抗原を保持す
ることにより貯蔵効果を発揮する、つまり、免疫系細胞
に抗原する除放する効果がある。さらに、アジュバント
は、免疫系細胞を抗原貯蔵部に引き寄せ、それらを刺激
して免疫応答を誘発する。
免疫刺激剤またはアジュバントは、例えば、ワクチン
などの宿主の免疫応答を改善させるために長年使用され
ている。リポ多糖のような内因性アジュバントは、通
常、ワクチンとして使用される。死滅させたか、弱毒化
させた細菌の成分である。外因性アジュバントは、典型
的な場合では抗原に非共有的に結合している免疫調節剤
であり、宿主の免疫応答を強化するように調剤されてい
る。このように、アジュバントは、非経口で投与された
抗原に対する免疫応答を強化させる作用がある。しか
し、これらのアジュバントの中には、有毒で、好ましく
ない副作用を発生させ、そのために、ヒトおよび多くの
動物に使用するには適当でないものもある。実際、現在
では、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウム（これ
らを総称して、ミョウバンという）だけが、ヒトおよび
動物用ワクチン用の通常アジュバントとして使用されて
いる。ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドに
対する抗体応答を増加させるミョウバンの有効性は確認
されている。抗原に対する潜在的な免疫応答を誘発する
広範囲の外因性アジュバントがある。そのようなアジュ
バントとして、膜タンパク質抗原とコンプレックス結合
させたサポニン（免疫刺激複合体）、鉱物油結合プルロ
ニク（非イオン性）ポリマー、鉱物油中で死滅させたミ
コバクテリア、フロイント完全アジュバント、ムラミル
ジペプチド（MDP）やリポ多糖（LPS）のような細菌産生
物、リピッドＡ、リポソームがある。体液性免疫応答
（HIR）と細胞性免疫応答（CMI）を有効に誘導するため
に、しばしば、免疫原をアジュバント内で乳化させる。
多くのアジュバントは、有毒であり、肉芽腫、急性およ
び慢性炎症（フロイント完全アジュバント、FCA）、細
胞溶解（サポニン及び非イオン性ポリマー）、発熱性、
関節炎、前部ブドウ膜炎（LPSおよびMDP）を引き起こ
す。FCAは優れたアジュバントで研究用に広く使用され
ているが、その毒性のために、ヒトおよび動物にはその
使用は承認されていない。
理想的なアジュバントの望ましい特性として、以下の
ことがあげられる。
（１）毒性がないこと。
（２）長期間持続する免疫応答を誘導する作用があるこ
と。
（３）製造が簡単であること、長期の貯蔵でも安定して
いること。
（４）種々の経路で投与された抗原に対してCMIとHIRを
誘起すること。
（５）他のアジュバントとの相乗効果があること。
（６）抗原提示細胞（APC）の多数と選択的に相互作用
すること。
（７）適当なTH1またはTH2細胞特異的免疫応答を特に誘
導する作用があること。
（８）抗原に対する適当な抗体イソタイプレベル（例え
ば、IgA）を選択的に増加する作用があること。
ロックホフ（Lockhoff）らが取得した米国特許第4,85
5,282（1989年８月出願）（本出願では、参考文献とし
て記載されている）には、Ｎ−グルコシルアミド、Ｎ−
グルコシルウレア、Ｎ−グルコシルカーバメイトのよう
なグリコリピド類似体の糖残基をアミノ酸で置換させ
て、免疫調節剤またはアジュバントとして使用できるこ
とを開示している。ロックホフら（米国特許第4,855,28
3および参考文献60）は、グルコスフィンゴ脂質および
グリコグリセロール糖脂質のような天然のグリコリピド
との構造的類似性を有するＮ−グルコリピド類似体が、
単純疱疹ウイルスワクチンおよび仮性狂犬病ウイルスの
両方において、強力な免疫応答を誘導する能力があるこ
とを開示している。天然の脂質残基の機能を模倣するた
めに、２・３のグリコリピドは、アノマー炭素原子によ
り糖と直接に結合した長鎖アルキルアミドおよび脂肪酸
から合成されている。
モラニー（Moloney）らの米国特許4,258,029（譲受済
み、本出願では参考文献として記載）には、オクタデシ
ルチロシン塩酸塩（OTH）が、それを破傷風トキソイド
およびホルマリン処理による不活化ポリオウイルスＩ、
II、III型ウイルスワクチンと複合化させた場合、アジ
ュバントとして作用することを開示している。また、ニ
クソン−ジョージら（文献61）は、組み換えＢ型肝炎表
面抗原と複合化させた芳香族アミノ酸のオクタデシルエ
ステルが、Ｂ型肝炎ウイルスの宿主免疫応答を強化する
ことを報告している。
例 上記の説明により本発明の内容を概略的に述べたが、
以下の例を参照することにより、さらに完全な理解が得
られるであろう。これらの例は単に説明のために記載さ
れてものであって、本発明の範囲を限定するものではな
い。周囲の状況により、内容の形式を変更したり、他の
同等物で代替してもよい。本出願には特別な用語が使用
されているが、それらは記述上の目的で使用したもので
あって、その用語のために発明の範囲が限定されるよう
なことはない。
本特許で使用されているが、明白に記載されていない
タンパク質生化学、発酵学、免疫学の方法や例について
は、関連科学文献に十分報告されており、当業者には分
かる範囲のものである。
例１ この例は、百日咳菌（Bordetella pertussis）の培養
について記載している。
マスター・シード 百日咳菌のマスターシード培養菌は、凍結乾燥ロット
として２℃〜８℃の温度で保管した。
ワーキング・シード（使用原料菌） 凍結乾燥した培養菌を、ホーニブルーク（Hornibroo
k）培地で復元し、ボーデットジンゴー（Bordet−Gengo
u）寒天（BGA）プレートに植菌した。ホーニブルーク
（Hornibrook）培地の成分は以下の通りである。成分 １リットル当たり カゼイン加水分解物（チャーコール処理済み） 10.0g ニコチン酸 0.001g 塩化カルシウム 0.002g 塩化ナトリウム 5.0g 塩化マグネシウム・ヘキサヒドレート 0.025g 塩化カリウム 0.200g 二塩基リン酸カリウム 0.250g デンプン 1.0g 蒸留水 １リットル以内 １％炭酸ナトリウム溶液を使用して、pHを6.9±0.1に
調製する。培地をチューブの中で懸濁させ、20分間、加
圧蒸気滅菌して、その後、20分間、121℃〜124℃でオー
トクレーブにかけた。菌を２回継代培養した。最初は、
BGAプレート上で行い、次にコンポーネント百日咳寒天
（CPA）で実施した。ここで使用したコンポーネント百
日咳寒天（CPA）の成分は以下の通りである。
NaCl 2.5g/L KH2PO4 0.5g/L KCl 0.2g/L MgCl2（H2O）６ 0.1g/L Tris塩基 1.5g/L Casamino酸 10.5g/L NaHglutamate 10.0g/L 濃塩酸 pH7.2まで 寒天 15.0g/L 成長因子（CPGF） 10.0ml/L コンポーネント百日咳成長因子（CPGF）−100Xの成分は
以下の通りである。
Ｌ−システインHCl 4.0g/L ナイアシン 0.4g/L アスコルビン酸 40.0g/L グルタチオン（還元） 15.0g/L Fe2SO4、（H2O）７ 1.0g/L ジメチル−β−シクロデキストリン 100 g/L CaCl2（H2O）２ 2.0g/L 最終培養物を、百日咳菌懸濁緩衝液（CPSB）に懸濁さ
せ、２〜4mlに分液し、−60℃〜−85℃で凍結保存し
た。百日咳菌懸濁緩衝液（PSSB）の成分は以下の通りで
ある。
Casamino酸 10.0g/L Tris塩基 1.5g/L 無水グリセロール 100mL/L 濃塩酸 pH7.2まで これらのグリセロール懸濁液は、ワーキング・シード
（使用菌）の調製のための出発材料を提供する。
培養プロセス コンポーネント百日咳寒天ラックスボトル（Roux bot
tle）の中で、使用菌の増殖を４〜７日間、34℃〜38℃
で実施した。この培養の後、コンポーネント百日咳培養
液（CPB）を使用して、細胞を寒天から洗い流した。試
料をグラム染色して、その培養した菌の純度と不透明度
について観察を行った。細胞を、CPBが入った４リット
ル三角フラスコに移し、振とうしながら、34℃〜38℃で
20〜26時間インキュベートした。試料をグラム染色し
て、培養した菌の純度について点検した。フラスコをプ
ールして、懸濁液を使用して、CPBを含む２個の発酵槽
に植菌した（OD6000.1〜0.4での出発容量は10リット
ル）。最終のOD600が5.0〜10.0になるように増殖させ
た。試料をグラム染色して培養の純度について試験し、
抗原特異的ELISAにより滅菌結果を点検した。
例２ この例では、百日咳菌細胞培養物からの抗原の精製に
ついて記載している。
培養液の作製と細胞濃度 細菌懸濁液を２個の発酵槽に入れて、34℃〜37℃で35
〜50時間培養して菌を増殖させた。発酵槽から試料を取
って、培地の無菌性試験を行った。懸濁液を連続流入デ
ィスクスタック遠心機で遠心して（12,000×ｇ）細胞を
培養液から分離した。細胞を集めて線毛成分の抽出を行
った。上清溶液を、≦0.22μｍの膜フィルタを通過させ
た。濾過された溶液を、10〜30kDa分子量限界（NMWL:NO
MINAL MOLECULAR WEIGHT LIMIT）膜を使用した限外濾過
により濃縮した。濃縮物を貯蔵した後、百日咳毒素（P
T）、線状赤血球凝集素（FHA）、69kDa（ペルタクチ
ン）成分の分離精製を行った。
培養液成分の分離 培養液成分（69kDa、PT、FHA）を、パーライトクロマ
トグラフィと選択的溶出ステップにより分離して精製し
た。この方法は、実質的には、EP特許番号336,736およ
び上記で述べたPCT番号WO91/15505に記載されている。
この特別な精製法は以下の通りである。
百日咳毒素（PT） パーライトカラムを、50mMトリス（Tris）、50mMトリ
ス/0.5％トリトン（Triton）Ｘ−100および50mMトリス
緩衝液で洗浄した。PT分画を、50mMトリス/0.12NaCl緩
衝液を使用して、パーライトカラムから溶出させた。パ
ーライトクロマトグラフィから取ったPT分画を、ヒドロ
キシルアパタイト・カラムに移して、30mMリン酸カリウ
ム緩衝液を使用して洗浄した。PTを、75mMリン酸カリウ
ム/225mM NaCl緩衝液を使用して溶出させた。カラムを2
00mMリン酸カリウム/0.6M NaClを使用して洗浄し、FHA
分画を取り出し、それを廃棄した。グリセロールを50％
の濃度になるまで精製PTに添加し、その混合物が、無毒
化されるまで、２℃〜８℃で１週間以内の期間で貯蔵し
た。
線状赤血球凝集素（FHA） FHA分画を、50mMトリス/0.6M・NaClを使用して、パー
ライトカラムから溶出させた。線状赤血球凝集素をヒド
ロキシアパタイトを使用したクロマトグラフィにより精
製した。パーライトカラムから得たFHA分画をヒドロキ
シアパタイトカラムに移し、0.5％トリトンＸ−100を含
んだ30mMリン酸カリウムおよびその後30mM・リン酸カリ
ウム緩衝液で洗浄した。PT分画を85mMリン酸カリウム緩
衝液を使用して溶出させ、廃棄した。FHA分画を200mM・
リン酸カリウム/0.6NaClを使用して溶出させ、無毒化さ
れるまで、２℃〜８℃で１週間以内の期間で貯蔵した。
69kDa（ペルタクチン） 培養液濃縮液を、注射（WFI）ができる状態にするた
めに、水で希釈して、伝達率が３〜4mS/cmとなるように
し、さらに、パーライトカラムに、1mlのパーライト当
たり0.5〜3.5mgのタンパク質が負荷されるように搭載さ
せた。素通し流出分（69kDa成分分画）を、10〜30kDa・
NMWL膜を使用した限外濾過により濃縮した。その流出分
濃縮液に、その濃度が35％±３％になるように硫酸アル
ミニウムを添加し、その結果できた混合物を、２℃〜８
℃で４±２日間で貯蔵するか、またはすぐに遠心分離に
かけた（7,000xg）。余分な上清を注いで、さらに遠心
分離（7,000xg）により沈殿物を集めた。69kDaペレット
を、−20℃〜−30℃で凍結保存するか、またはトリスま
たはリン酸緩衝液で溶解させるか、あるいは、すぐに使
用した。
パーライト素通し流出分の濃縮物の35％（w/v）硫酸
アンモニア沈澱により得られた69kDa外膜タンパク質を
精製した。硫酸アンモニア（リットル当たり100±5g）
を69kDa分画に添加し、その混合物を２℃〜８℃で少な
くとも２時間撹拌した。上清を回収するために、その混
合物を遠心分離（7,000xg）した。リン酸アルミニウム
（１リットル当たりを100±150g）をその上清に添加
し、その混合物を２℃〜８℃で少なくとも２時間撹拌し
た。ペレットを回収するために、その混合物を遠心分離
した（7,000xg）。回収したペレットを10mMトリス、HCl
（pH8）中で溶解させた。溶液のイオン強度を、15mM硫
酸アンモニウムを含む10mM・トリスHCl（pH8）と等しく
なるように調整した。
69kDaタンパク質を、Ｑ−セファロース・カラムと直
列に連結されているヒドロキシルアパタイトに入れた。
69kDaを素通し流出分中に集め、さらに15mM硫酸アンモ
ニアを含む10mM・トリス・HCl（pH8）を使用してカラム
から洗浄分離したものを、素通し流出分中の69kDaと一
緒にプールした。69kDaタンパク質プールを、100〜300k
Da・NMWLの膜上で0.15M・NaClを含む10mMリン酸カリウ
ム（pH8）６〜10容量を使用して濾過した。限外濾過に
よる濾過物を集め、その限外濾過物内の69kDaタンパク
質を濃縮した。
69kDaタンパク質を10mMトリスHCl（pH8）で溶剤交換
をして、Ｑ−セファロースに吸着させた後、10mM・トリ
スHCl（pH8）/5mM硫酸アンモニウムで洗浄した。69kDa
タンパク質を50mMリン酸カリウム（pH8.0）で溶出させ
た。69kDaタンパク質を、10〜30kDa・NMWL膜上で0.15M
・NaClを含む10mMリン酸カリウム（pH8.0）の６〜10容
量で濾過した。69kDaタンパク質を、≦0.22μｍフィル
タを使用して滅菌濾過した。滅菌後の溶液を２℃〜８℃
で保存し、３カ月以内に吸着をさせた。
線毛凝集原 凝集原を、培養液の分離後に得られた細胞ペーストよ
り精製した。細胞ペーストを10mMリン酸カリウム、150m
M NaCl、4M尿素を含む緩衝液内で0.05容量の細胞分画に
希釈し、30分間混合した。細胞融解液を遠心分離（12,0
00xg）により清澄化し、その後、濃縮を行い、100〜300
kDa・NMWLの膜を使用して10mMリン酸カリウム/150mM・N
aCl/0.1％トリトンＸ−100で濾過した。
濃縮物を80℃で30分間熱処理をして、遠心分離（9,00
0xg）により再清澄化した。PEG8000を、その最終濃度が
4.5％±0.2％になるまで清澄化上清に添加して、最小で
も30分間ゆっくりと撹拌した。その結果生成した沈澱物
を遠心分離（17,000xg）により集め、そのペレットを10
mMリン酸カリウム/150mM NaCl緩衝液で抽出して、線毛
凝集原の粗溶液を作製した。線毛凝集原をPEIシリカを
通過させることで精製した。粗溶液のリン酸の濃度を、
1Mリン酸カリウム緩衝液を使用して100mMにし、PEIシリ
カカラム内を通過させた。
カラムからの流出液を濃縮し、100〜300kDa・NMWLの
膜を使用して、10mM・リン酸カリウム/150mM・NaCl緩衝
液で濾過した。
滅菌後の溶液を２℃〜８℃で保存し、３カ月以内に吸
着をさせた。線毛凝集原溶液には、線毛Agg2及び３を、
重量比で約1.5〜2:1を含み、事実上、Agg1を含んでいな
いことが判明した。
例３ この例は、精製した百日咳抗原PTとFHAのトキソイド
化について記載している。
例２で記載したような純粋な形のPTを、そのPT溶液内
のグルタルアルデヒド濃度を0.5％±0.1％に調整し、37
℃±３℃で４時間インキュベートすることによりトキソ
イド化させた。濃度が0.21±0.02Mになるまで、Ｌ−ア
スパラギン酸を添加することにより停止させた。その
後、混合物を室温で１±0.1時間放置し、さらに温度２
℃〜８℃で１〜７日間放置した。
その結果生成する混合物を、30kDa・NMWL膜フィルタ
を使用して、10mMリン酸カリウム/0.15M・NaCl/5％グリ
セロール緩衝液で濾過し、≦0.22μｍフィルタを使用し
て滅菌濾過した。滅菌後の溶液を２℃〜８℃で保存し、
３カ月以内に吸着をさせた。
例２で記載したような純粋な形のFHAを、Ｌ−リシン
とホルムアルデヒド濃度を47±5mMと0.24％±0.05％に
それぞれ調整し、35℃〜38℃で６週間インキュベートす
ることによりトキソイド化させた。その結果生成する混
合物を、30kDa・NMWL膜フィルタを使用して、10mMリン
酸カリウム/0.5M・NaClで濾過し、膜フィルタを通過さ
せて滅菌濾過した。滅菌後の溶液を２℃〜８℃で保存
し、３カ月以内に吸着をさせた。
例４ この例は精製した百日咳抗原の吸着について記載した
ものである。
PT、FHA、Agg、69kDaのリン酸アルミニウム（ミョウ
バン）上への個別の吸着のために、濃度が18.75±1mg/m
lのリン酸アルミニウムの原液を作製した。適当な容器
を用意し、抗原のどれかを無菌的にその容器に分けた。
最終濃度を0.6％±0.1％v/vにするために、２−フェノ
キシエタノールを無菌的に添加し、全体が均一になるま
で撹拌した。適当な量のリン酸アルミニウムを無菌的に
容器に添加した。最終濃度を3mgリン酸アルミニウム/ml
にするために、適当な量の滅菌蒸留水を添加した。容器
を密閉しラベルを付け、室温で４時間撹拌されるように
した。その容器を最終調整時まで放置貯蔵した。
例５ この例は、ジフテリアトキソイドと破傷風トキソイド
とを組み合わせたコンポーネント百日咳ワクチンの製剤
を記載することである。上記の例で記載したような百日
咳抗原を、以下に述べるような数種類のコンポーネント
百日咳（CP）ワクチンを提供するために、ジフテリアト
キソイドおよび破傷風トキソイドを一緒に調製した。
例１から例４において詳しく述べているような培養に
より増殖させた百日咳菌から百日咳菌成分を調製した。
増殖が完了した後、培養液および細菌細胞を遠心分離に
より分離した。各抗原を個別に精製した。百日咳毒素
（PT）、線状赤血球凝集原（FHA）を培養液からパーラ
イトとヒドロキシアパタイトを使用した連続クロマトグ
ラフィにより精製した。PTをグルタルアルデヒドを使用
して無毒化させ、FHA分画に存在している残留PT（約１
％）をホルムアルデヒドを使用して無毒化させた。線毛
凝集原（AGG2,3）を細菌細胞から用意した。細胞を尿素
で破壊し、熱処理をして、線毛凝集原をポリエチレング
リコールを使用して沈澱させ、ポリエチレンイミン・シ
リカを使用したクロマトグラフィにより精製した。69kD
aタンパク質（ペルタクチン）成分をパーライトクロマ
トグラフィーからの流出物（例２）から硫酸アンモニウ
ムによる沈澱をさせて分離し、ヒドロキシルアパタイト
とＱ−セファロースを使用した連続クロマトグラフィに
より精製した。0.22μｍ膜フィルタを使用して、全部の
成分を濾過により滅菌した。
標準的な方法で、培養により増殖させたジフレリア菌
（Corynebacterium diphteriae）ジフテリアトキソイド
を調製した。ジフテリアトキソイドの生産プロセスを５
段階に分けた。使用菌（working seed）の保管維持、ジ
フテリア菌の増殖、ジフテリア毒素の収集、ジフテリア
毒素の無毒化、ジフテリアトキソイドの濃縮の５ステッ
プである。
ジフテリアトキソイドの調製 （Ｉ）使用菌 ジフテリア菌を凍結乾燥した状態で保管した。復元菌の
ロットをロッフェラー・スロープ（Loeffler slope）に
より、温度35℃±２℃で18〜24時間増殖させ、ジフテリ
ア培地の入ったフラスコに移した。培養した菌につい
て、純粋であるかどうか、Lf価について検査した。残り
の菌を発酵槽に移して増殖させた。
（II）ジフテリア菌の増殖 培養菌を35℃±２℃でインキュベートし、発酵槽で撹拌
した。硫酸第一鉄、塩化カルシウム、リン酸溶液の予め
決めておいた量を培養菌に添加した。各溶液（リン酸、
硫酸第一鉄、塩化カルシム）の実際の量を実験的に各培
地ごとに測定した。選択されたレベルは、最高のLf価と
になるものであった。増殖周期（30〜50時間）の最後に
おいて、その培養菌をサンプリングして、その純度、Lf
価を検査した。
pHを重炭酸ナトリウムを使用して調整し、その培養菌
を、温度を35℃±２℃に保温したまま、0.4％トルエン
を一時間使用して不活化させた。生きたジフテリア菌が
存在しないことを確認するために、滅菌性試験を実施し
た。
（III）ジフテリア毒素の収集 一個の発酵槽または２・３の発酵槽から取り出した、
トルエンで処理した培養菌を一個の大きなタンクにプー
ルした。およそ0.12％の重炭酸ナトリウム、0.25％チャ
ーコール、23％硫酸アンモニウムを添加して、pHを検査
した。
混合物を約30時間撹拌した。珪藻土を添加し、その混
合物をデプス・フィルタに入れた。液が透明になるまで
濾過物を再還流させ、その後収集してサンプリングをし
てLf価を検査した。濃度を40％にするために、濾過物に
追加の硫酸アンモニウムを添加した。珪藻土も添加し
た。この混合物を、２℃〜８℃で３〜４時間放置して沈
澱物を固化させた。珪藻土を濾過により除去し、硫酸ア
ンモニウムを取り除くために、毒素を0.9％生理食塩水
で透析した。透析した毒素をプールして、サンプリング
によりLf価と純度を試験した。
（IV）ジフテリア毒素の無毒化 透析の後のすぐに無毒にされる。無毒化のために、毒
素を、最終溶液に以下のものを含むように希釈する。
ａ）濃度が1000±10％Lf/mlのジフテリア毒素 ｂ）0.5％重炭酸ナトリウム ｃ）0.5％ホルマリン ｄ）0.9％w/vL−リシン・モノ塩酸塩 この溶液を生理食塩水を加えて容量を増やし、pHを7.
6±0.1％に調整した。
トキソイドをセルロース珪藻土フィルター、及び／ま
たは膜フィルタ及び0.2μｍ膜フィルタで濾過して収集
容器に集め、34℃で５〜７週間インキュベートした。サ
ンプリングをして毒性を試験した。
（Ｖ）精製したトキソイドの濃縮 トキソイドをプールし、その後、限外濾過により濃縮
させ、それを集めて適当な容器に入れた。サンプリング
をして、Lf価と純度を試験した。保存剤（２−フェノキ
シエタノール）を、最終濃度が0.375％になるように添
加し、pHを6.6〜7.6になるように調整した。
トキソイドを前置フィルタと0.22μｍ膜フィルタ（ま
たはその同等品）を使用した濾過により滅菌した後、濾
過物を収集した。滅菌したトキソイドをサンプリングし
て、トキソイドのLf価、保存剤容量、純度（窒素含有
量）、滅菌性、毒性に関しての非可逆性を検査した。滅
菌した濃縮トキソイドを、最終製剤まで２℃〜８℃で保
存した。
破傷風トキソイドの調製 培地増殖させた破傷風菌（Clostridium tetani）から
破傷風トキソイド（Ｔ）を調製した。
破傷風トキソイドの作製プロセスを５ステップに分け
ることができる。使用菌の保管維持、ジフテリア菌の増
殖、ジフテリア毒素の収集、ジフテリア毒素の無毒化、
ジフテリアトキソイドの精製の５ステップである。
（Ｉ）使用菌 破傷風毒素のトキソイドへの変換に使用する破傷風菌
を菌ロットの中で凍結乾燥した状態で保存した。この菌
をチオグリレート培地に植菌して、35±２℃で約24時間
増殖させた。サンプリングをして、培養物の純度を試験
した。
（II）破傷風菌の増殖 破傷風培地を発酵槽に移し、熱処理をした後、冷却し
た。発酵槽に菌を入れ、その培養物を４〜９日、34±２
℃で増殖させた。サンプルを採取して培養の純度および
Lf価を検査した。
（III）破傷風菌の収集 毒素をセルロース珪藻土パットを使用した濾過により
分離した後、清澄化した毒素を膜フィルタを使用して滅
菌した。サンプルを採取して、Lf価の測定と滅菌性試験
を行った。毒素を30,000ダルトンのポアサイズフィルタ
を使用した限外濾過により濃縮した。
（IV）破傷風毒素の無毒化 毒素のサンプルを採取して、無毒化の前に、そのLf価
を測定検査した。濃縮した毒素（475〜525Lf/ml）を、
0.5％w/v重炭酸ナトリウム、0.3％w/vホルマリン、0.9
％w/v Ｌ−リシンモノ塩酸塩を添加し、生理食塩水に
より容量を増加させて無毒化した。pHを7.5±0.1に調整
し、その混合物を20〜30日間、37℃でインキュベートし
た。サンプリングをして、滅菌と毒性について試験をし
た。
（Ｖ）トキソイドの精製 濃縮したトキソイドを前置フイルタおよびその後0.2
μｍ膜フィルタにより滅菌した。サンプリングをして、
滅菌性とLf価について検査した、硫酸アンモニウムの最
適濃度は、トキソイドの試料から決定された「Ｓ」カー
ブの分画化を基礎にしている。最初の濃縮液をトキソイ
ド（1900〜2100Lf/mlに希釈）に添加した。その混合物
を少なくとも一時間20℃〜25℃で放置し、収集した上清
と高分子量の分画を含む沈澱物を廃棄した。硫酸アンモ
ニウムの第２の濃縮液を第２分画が低分子量の不純物を
除去するように上清に添加した。混合物を少なくとも２
時間20℃〜25℃で放置し、さらに、最大３日間２℃〜８
℃で放置した。精製トキソイドである沈殿物を遠心分離
と濾過で収集した。
硫酸アンモニウムを、アミコン（Amicon）（または、
同等物）限外濾過膜とPBSを使用して、トキソイド溶液
からすべて完全に除去した。pHを6.6〜7.6に調整し、２
−フェノキシエタノールを加えて、その最終濃度を0.37
5％になるようにした。トキソイドを膜濾過で滅菌し
て、サンプルを採取して試験をした（トキソイド、Lf
価、pH、保存剤容量、純度、滅菌、毒性に関する不可逆
性）。
多価ワクチンの調整 ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドと組み合わ
せたコンポーネント百日咳ワクチンを含んだ一方の調剤
をCP10/5/5/3DT（時には、クラシック:CLASSICと呼
ぶ）。CP10/5/5/3DTのヒトに対する0.5mlの一回投与量
には、以下の成分が含まれるように調剤する。
10μｇ 百日咳トキソイド（PT） ５μｇ 線状赤血球凝集素（FHA） ５μｇ 線毛凝集原2,3（FIMB） ３μｇ 69kDa外膜タンパク質 15 Lf ジフテリアトキソイド ５ Lf 破傷風トキソイド 1.5 mg リン酸アルミニウム 0.6％ ２−フェノキシエタノール（保存剤） ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドと組み合わ
せたコンポーネント百日咳ワクチンを含んだもうひとつ
の調剤をCP10/5/5DT（時には、ハイブリッドHYBRIDと呼
ぶ）。このCP10/5/5DTのヒトに対する0.5mlの一回投与
量には、以下の成分が含まれるように調剤する。
10μｇ 百日咳トキソイド（PT） ５μｇ 線状赤血球凝集素（FHA） ５μｇ 線毛凝集原2,3（FIMB） 15 Lf ジフテリアトキソイド ５ Lf 破傷風トキソイド 1.5 mg リン酸アルミニウム 0.6％ ２−フェノキシエタノール（保存剤） ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドと組み合わ
せたコンポーネント百日咳ワクチンを含んださらに別の
もうひとつの調剤をCP20/20/5/3DTと呼ぶ。このCP
20/20/5/3DTのヒトに対する0.5mlの一回投与量には、以
下の成分が含まれるように調剤する。
20μｇ 百日咳トキソイド（PT） 20μｇ 線状赤血球凝集素（FHA） ５μｇ 線毛凝集原2,3（FIMB） ３μｇ 69kDa外膜タンパク質 15 Lf ジフテリアトキソイド ５ Lf 破傷風トキソイド 1.5 mg リン酸アルミニウム 0.6％ ２−フェノキシエタノール（保存剤） ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドと組み合わ
せたコンポーネント百日咳ワクチンを含んださらに別の
もうひとつの調剤をCP20/20/10/6DTと呼ぶ。このCP
20/20/10/6DTのヒトに対する0.5mlの一回投与量には、
以下の成分が含まれるように調剤する。
20μｇ 百日咳トキソイド（PT） 10μｇ 線状赤血球凝集素（FHA） 10μｇ 線毛凝集原2,3（FIMB） ６μｇ 69kDa外膜タンパク質 15 Lf ジフテリアトキソイド ５ Lf 破傷風トキソイド 1.5 mg リン酸アルミニウム 0.6％ ２−フェノキシエタノール（保存剤） 例６ この例は、コンポーネント無細胞百日咳ワクチンの臨
床評価を記載したものである。
（ａ）成人における試験 成人および生後16〜20カ月の小児における試験では、
線毛凝集原を含む５多成分ワクチンが安全で免疫原性で
あることを示している（表２）。
カルガリー、アルバートにおいて、５成分コンポーネ
ント百日咳ワクチン（CP10/5/5/3DT）とその使用による
副作用に関して、フェーズＩ臨床試験が生後17及び18カ
月の小児に実施された。33例にワクチンの投与を行い、
さらに、追加的に35例に対して、同じワクチンである
が、69kDaタンパク質成分の含まれていないワクチンを
投与した。
局所反応の発生はまれであった。主として被刺激性が
内容である全身的な副作用が、どのワクチンを投与した
かに関係なく、試験対象者の約半数に認められた。有意
な抗体の上昇が認められた。すなわち、エンザイム・イ
ムノアッセイにより抗−PT、抗−FHA、抗−線毛凝集
原、抗−69kDa・IgG抗体の上昇が測定され、CHO細胞中
和試験において、抗−PT抗体の上昇が測定された。４成
分ワクチン（CP10/5/5DT）を投与した小児と、５成分ワ
クチン（CP10/5/5/3DT）を投与した小児において、抗−
69kDa抗体以外の抗体応答には、差異は検出されなかっ
た。69kDaタンパク質を含む５成分ワクチンを投与した
小児では、免疫後の抗−69kDa抗体レベルが有意に高い
ものであった。
４成分ワクチンを使用した用量応答試験が、カナダの
ウインペグ、マニトバにおいて実施された。この試験で
は、二種類のコンポーネント百日咳調剤、つまり、CP
10/5/5/3DTとCP20/10/10/6DTが使用された。全細胞DPT
ワクチンも対照として接種された。この試験は、ブース
ター投与をした時に、生後17〜18カ月の91例において実
施した幼児における二重盲検試験であった。対象は、CP
10/5/5/3DTとCP20/10/10/6DTの両方によく耐えた。いず
れのワクチンを投与した場合にも、局所反応または全身
反応を示した対象数に差異は認められなかった。対照的
なことは、CP20/10/10/6DTワクチンを投与した小児より
も、全細胞性ワクチンを投与した小児において、有意に
多く、局所および全身的反応が認められた。
幼児における試験 フェーズII CP10/5/5/3DTを使用した試験が、カナダのカルガリ
ー、アルバータ、ブリティッシュコロンビアにおいて実
施された。この試験において、生後2,4,6カ月の432例の
幼児にコンポーネント百日咳ワクチンまたは全細胞性対
照ワクチンDPTが投与された。対象幼児はこのCP
10/5/5/3DTによく耐えた。投与後において、全細胞性ワ
クチンを投与した場合よりも、コンポーネントワクチン
を投与した例のほうが局所性反応が少なかった。コンポ
ーネント百日咳ワクチンを接種した場合には、全抗原に
対して有意な抗体応答が認められた。全細胞性ワクチン
のレシピエントは、線毛凝集原、ＤおよびＴに対して顕
著な抗体応答を示した。投与後７カ月に、コンポーネン
トワクチンのレシピエントの82％〜89％、全細胞ワクチ
ンのレシピエントの92％において、線毛凝集原に対する
抗体価が４倍またはそれ以上の上昇となった。これとは
対照的に、コンポーネントワクチンを投与した対象で
は、その75〜78％においてFHA抗体応答を示したが、全
細胞ワクチンの投与対象では、その31％において抗体応
答を示しただけであった。コンポーネントワクチンのレ
シピエントの90〜93％において、抗−69kDa抗体が４倍
の増加となったが、全細胞ワクチンのレシピエントにお
いては75％にすぎなかった。エンザイムイムノアッセイ
の検査の結果、コンポーネントワクチンのレシピエント
の40〜49％において、PTに対する抗体が４倍に上昇した
が、全細胞ワクチンのレシピエントにおいては32％であ
った。CHO中和試験の結果、コンポーネントワクチンの
レシピエントの55〜69％において、PT抗体の４倍の上昇
があったが、全細胞ワクチンのレシピエントでは６％で
あった（表２）。
フェーズII B 無作為盲検を実施して、CP20/20/5/3DTおよびCP
10/10/5/3DTの評価を行った。対象は、生後2,4,6カ月の
100例の幼児であり、対照は、D15PDとし、ジフテリア含
有量が15Lfの場合と25LFの場合について比較した。この
含有量の２種類のワクチン間には副作用の発生率に差異
はなかった。両方とも、対照である全細胞性ワクチンに
較べて有意に反応性は低いものであった。エンザイムイ
ムノアッセイ検査およびCHO中和試験の結果、抗原の含
有量を増加したCP20/20/5/3DTのレシピエントにおい
て、PTおよびFHAに対する高い抗体価が達成された。接
種後７カ月目において、抗−FHA幾何平均抗体価は、CP
20/20/5/3DPのレシピエントにおいて95.0、CP10/10/5/3
DTのレシピエントにおいて、45.2、D15PDのレシピエン
トにおいてわずかに8.9のみであった。抗−PT抗体価に
関しては、それぞれイムノアッセイ検査による結果では
133.3、58.4及び10.4で、中和試験では82.4、32.7及び
4.0であった。
本試験は、吸着ジフテリアトキソイドと吸着破傷風ト
キソイドを組み合わせ、しかも、抗原含量を増やしたコ
ンポーネント百日咳ワクチンが、幼児において、安全で
あり免疫原性を発揮するものであること、抗原を増加さ
せたことにより、副作用反応性を増加させることなく、
抗原（PT、FHA）に対する免疫応答を変化させることが
できることを示した。
米国国立アレルギー感染症研究所、フェーズII、比較試
験 米国において、米国国立アレルギー感染症研究所（NI
AID）の後援により、無細胞性百日咳ワクチンの大規模
な有効性治検の予備段階としての、フェーズII試験が実
施された。本発明にかかる、吸着させたジフテリアトキ
ソイドと破傷風トキソイドを組み合わせたコンポーネン
ト百日咳ワクチン（CP10/5/5/3DT）が、別の12種類の無
細胞性ワクチンと２種類の全細胞性ワクチンと一緒に使
用された。
コンポーネントワクチンであるCP10/5/5/3DTを投与し
た、生後2,4、６カ月の137例の小児における安全性に関
する結果が報告された。以前の試験で認められように、
このコンポーネントワクチンは安全であり、副作用反応
性が低いこと、対象がよく耐えるものであることが判明
している。
接種後７カ月では、コンポーネントワクチンにおける
抗−PT抗体、抗−FHA抗体、抗−69kDa抗体、抗−線毛凝
集原抗体が、全細胞ワクチンの抗体レベルよりも高いか
または同等であった（文献71,表２）。CP20/20/5/3DPま
たはCP10/5/5/3DTのいずれかを、小児に無作為で割り当
て投与する二重盲検試験が実施された。米国およびカナ
ダで実施された試験では、合計で2050例の幼児が組み入
れられ、1961例が試験を完了した。上記の両剤ともに安
全で、反応性は低く、免疫原性を発揮した。292例の群
で免疫原性が評価された。両ワクチンに含まれた全抗原
に対しての抗体の上昇が認められた。CP20/20/5/3DTワ
クチンはFHAに対してより高い抗体価を示したが、PTに
対しては示さなかった。CP10/5/5/3DTワクチンは、線毛
に対して、および凝集原に対して高い抗体価を誘起し
た。
さらに、フランスにおいても、安全性と免疫原性に関
する試験が実施された。試験方式は、生後2,3,4カ月の
小児に投与された点以外は、北アメリカで実施されたも
のと同じであった。局所および全身の副作用反応性は全
体的に軽微であった。このフランスの試験では経口のワ
クチン投与であったが、対象はそれによく耐えた。
10,000例幼児を対象とした、２種類の無細胞性百日咳ワ
クチンと１種類の全細胞ワクチンに関するプラセボコン
トロール有効性治験 米国でのNIAIDフェーズII比較試験に続いて実施され
た多施設コントロール、二重無作為プラセボコントロー
ル有効性治験では、２成分無細胞ワクチンと５成分無細
胞ワクチンが使用された。百日咳の発症率の高いスエー
デンにおいて、臨床治験が実施された。使用された２成
分ワクチンには、グリセルアルデヒドとホルマリンによ
り不活化させたPT（25μｇ）、ホルマリン処理したFHA
（25μｇ）、ジフテリアトキソイド17Lf、破傷風トキソ
イド10Lfが含まれていた。この５成分百日咳ワクチンは
CP10/5/5/3DTワクチンであった。
この治験では、スエーデンにおけるこの年齢層の幼児
の約半分に相当する10,000例の幼児が、出生届けを元に
治験場所を地理的に14の場所に分割して実施された治験
に参加した。
1992年１月、２日に生まれた小児を無作為に３つのア
ーム（集団）に分け、口頭による同意を得た後、それら
の幼児の３分の２に、２種類のジフテリア・破傷風・無
細胞性百日咳の調剤のうちの１つを、生後2,4,6カ月目
に投与した。対照群には、DTだけを投与した。1992年５
月に、米国で認可された市販の全細胞DTPワクチンを使
用して、1992年の３月から12月に生まれた小児を、無作
為に４つのアームに分けて治験を行った。口頭による同
意を得た後、幼児の４分の３に３種類のDTP調剤のうち
の１つを、2,4,6カ月目に投与した。対照にはDTだけを
投与した。
約2,500例の小児に対して各ワクチンを投与した。ワ
クチンを３回の用量に分けて投与した。生後２カ月目、
３カ月目以内に最初の用量のワクチンを投与した。その
後、８週間の間隔をおいて投与した。ワクチンは筋肉内
投与をした。
小児とその家族を数ヶ月に亘りフォローアップした。
百日咳が疑われる場合には、臨床データを集めて、鼻吸
引液を使用した細菌培養とポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）診断による検査をした。急性および回復期血液サン
プルを採取して血清学的診断を行った。
この治験の実施前には、本発明にかかるコンポーネン
ト百日咳ワクチンに含まれるペルタクチンのリスクを持
っているヒト（特に、新生児）に対する有効性の程度に
ついては不明であった。特に、百日咳菌成分の種類によ
る影響やその投与量がワクチン有効性に与える影響つい
ては不明であった。
この治験の主目的は、無細胞性百日咳ワクチンと全細
胞ワクチンの感染防御能力をプラセボと較べて評価する
ことであった。
第２の目的は、種々の症状の程度を有する百日咳感染
に対するワクチンの有効性を評価することであった。ワ
クチンの有効性とは、ワクチンを投与したレシピエント
における百日咳発症を抑える可能性を、投与していなレ
シピエントのそれと比較して百分率で示したものであ
る。
ワクチンを投与した２群における百日咳の相対的リス
クは、その２群での疾病発病の率を比較することで判明
する。百日咳発症を抑える可能性は、違った別の方法で
も示すことができる。つまり、サンプルサイズの計算に
おいて、ある特定の治験群での百日咳を抑える能力は、
百日咳に罹患した小児数で、治験の終了時点で治験群に
残っている小児の数を除した値として与えられる。
本治験でのコンポーネントワクチンであるCP10/5/5/3
DTの百日咳感染を防御する有効性は表４に示されている
通り、約85％である。同じ治験において、PTとFHAだけ
を含む２種類のコンポーネント百日咳無細胞ワクチンの
有効性は約58％であり、全細胞ワクチンの場合には約48
％である。このCP10/5/5/3DTの中程度の症状の百日咳を
感染防御する有効性は約77％であると考えられる。
例７ この例は、インフルエンザ菌（Haemophilus influenz
ae）の莢膜多糖を含む組み合わせ多価ワクチンの調剤と
免疫原性について記載している。
（ａ）PRP−Ｔ成分の調剤 インフルエンザ菌由来の莢膜多糖（PRP）を精製し、下
記の方法により、破傷風トイソイドと結合させた。イン
フルエンザ菌の使用菌ロットの凍結乾燥したアンプルか
ら、連続３回の前培養を行った。最初の前培養は個体培
地で行った。アンプルをチャーコール寒天と煮沸処理し
た血液（80℃で15分間加熱した10％の馬血液）中のシャ
ーレに接種して、CO2存在下で、36℃〜37℃で20±４時
間インキュベートした。第２の前培養は、液体培地にお
いて37℃で８時間実施した。液体培地における１リット
ル当たりの成分は以下の通りであった。
1.Casamino酸 Difco 10g リン酸ジナトリウム 2H2O 2.03g リン酸ジナトリウム 12H2O 31.14g 乳酸ナトリム（66％溶液） 1.5ml Ｌ−システイン 0.07g Ｌ−トリプトファン 0.02g CaCl2,2H2O 0.02g （NH4）2SO4 1g MgSO4,7H2O 0.4g ダウコーニング社・消泡剤 M.S.A パラフィンオイル中に25％ 0.15ml 2.ヘミン＋デキストロースの限外濾過物（デキストロー
ス20g:ヘミン1mg） この溶液に、5mgのニコチンアミド−アデニンジヌク
レオチドを添加した。フィルターで滅菌処理した。
3.酵母抽出物・Difco 5g （フィルタ滅菌） 第３回目の前培養を液体培地で、37℃で４時間実施し
た。第３回目の前培養を実施して発酵槽に接種し、培養
を37℃で14時間撹拌しながら維持した。培養物を冷却タ
ンク内で収集した。10ml/リットルの濃度にホルマリン
を添加した。培養物をゆっくり撹拌しながら、＋４℃で
２〜24時間撹拌して、その後、遠心分離を行った。ホル
マリンの添加の目的は、細菌を完全には不活化するため
のものではなく、増殖を抑止し、代謝を阻止するための
ものであった。この添加により、細胞内成分による汚染
を伴う細胞溶解を減少させた。この固定のための継続期
間は２〜24時間であり、遠心分離にかける前に、この培
養物を１液放置する。多糖類を含む上清を収集して、細
胞ペレットを廃棄した。精製は、フェノール精製の場合
を除いて、一般的には、冷室か、または、製品と薬剤の
温度が＋10℃またはそれ以下で実施した。培養物の濃縮
の後、その上清は濃縮した。濃縮物からの莢膜多糖を、
セントリイミド（Centrimide）を添加することにより、
その最終濃度が５％（w/v）になるように沈澱させた。
セントリイミドは、濃縮液（SNF）からのPSを沈澱させ
た。タンパク質、核酸、リポ多糖（LPS）も共沈澱させ
た。沈澱物を、SNFに他の汚染物とタンパク質を残す遠
心分離により収集した。この遠心分離により収集したペ
レットを、≦−20℃で保存した。そのペレットを0.3MNa
Cl溶液内で再縣濁して、その縣濁液を再度遠心分離し
た。NaClは、選択的に多糖セントリイミド複合体を溶解
した。その汚染物（核酸、LPS、タンパク質）をプロセ
ス中で解離させた。事前に冷却した無水エタノールを、
最終濃度が60％になるように、上清に添加した。この結
果発生した沈澱物を遠心分離により収集し、冷却した無
水エタノールで洗浄した。沈澱物を真空下で温度０〜４
℃で乾燥して、中間産物を得た。酢酸ナトリム中でフェ
ノールを使用し、室温で、この中間産物を溶解した。連
続遠心分離により、液相を収集した。フェノール抽出と
遠心分離を数回繰り返して、液体相を透析し濾過した。
濾過溶液からの莢膜多糖を、0.3M・NaClの存在下で、事
前に冷却したエタノールを最終濃度が60％になるように
添加することにより、沈殿させた。沈澱物を遠心分離で
収集して、事前に冷却した無水エタノール、アセトン、
エタノールで洗浄し、真空下４℃で乾燥させた。乾燥し
た沈澱物を低湿気下で微粉末に粉砕した。この沈澱物が
精製したインフルエンザ菌ｂ型の多糖を構成する。
溶液ml当たり、5gの多糖を得るために、精製した多糖
を水に溶解して、pHをNaOHを使用して10.8±0.2に調製
した。臭化シアンの水溶液を、0.5mg CNBr/mg−多糖の
割合で添加した。反応混合物のpHを、NaClにより、10.8
±0.2に維持して、23±３℃で35〜40分間放置した。さ
らに、このpHを、HClを添加することによりpH9まで下げ
た。最終濃度を3.5mg・ADH/mg−多糖にするために、ア
ジピン酸ジヒドラジドを添加し、pHを8.5にした。
反応混合物を23±３℃で15分間インキュベートした
（pHを8.5に維持した）。その後、その溶液をゆっくり
撹拌しながら、＋４℃で１夜インキュベートした。反応
混合物を、NaCl溶液で透析し、その後、濃縮した。その
溶液を0.45μフィルタで濾過し、≦−40℃で凍結した。
AH−ポリ多糖を構成するものであり、これを≦−40℃で
凍結した。
破傷風毒素成分を産生するために、破傷風菌（Clostr
idium tetani）を、10mlのロゼノー（Rosenow）培地と
チオグリコレート培地を含む直列に連結されたチューブ
に接種した。ロゼノー培地には下記の成分を含む。
式（蒸留水１リットル当たりのグラム数） ペプトン 10 肉抽出物 3 グルコース 2 塩化ナトリウム 5 「アンドレード」指示器 （５％フクシン酸） 10ml 白大理石 １個 脳 １片 使用直前に用意された培地をチューブに充填し、120
℃で20分間滅菌した。
３リットルの「マサチューセッツ」培地を含む５リッ
トルボトルに破傷風菌を接種し、16〜18時間、35±１℃
で16時間ンキュベートした。その後、その内容物を、15
リットルの滅菌「マサチューセッツ」培地を含む20リッ
トルボトルに移し、35±１℃で８時間インキュベートし
た。各ボトルから「マサチューセッツ」培地の582リッ
トルを含む発酵槽に接種し、35℃で５〜６日、通気をし
ながらインキュベートした。
発酵槽を冷やし、その培養物に12kgの塩化ナトリウ
ム、8kgのクエン酸三ナトリウムを添加した。１日中撹
拌をして、培養の最後の段階で細菌から残留毒素の抽出
をした。濾過または連続遠心分離により毒素を清澄化し
た。
1200リットルの培養物からの上清を限外濾過により濃
縮し、濃縮毒素を0.07M・リン酸二ナトリム（pH8.2）で
濾過した。最終容量を500Lf/mに調整した。
精製した破傷風毒素を得るために、二重硫安沈澱を実
施した。硫安と、以前にすでに得ている濾過毒素の１リ
ットル当たりに対して10gのチャーコールをゆっくりと
添加する。＋４℃で16〜24時間インキュベートした後、
沈澱物を除去するために、毒素をカートリッジ上で濾過
した。その後、全体の容量が320gm/Lになるように、あ
る量の硫安を以前に取得していた上清の１リットル当た
りに対してゆっくりと添加した。＋４℃で48時間放置し
た後、ペレットを遠心分離により収集し、0.05M・リン
酸ジナトリム溶液（pH8.2）中で溶解させた。その溶液
を0.5M・リン酸ジナトリム溶液（pH8.2）を使用して濾
過した後、濃度が300Lf/mlになるように調整した。その
後、溶液を濾過滅菌した。7.5μモル（0.225％）のホル
ムアルデヒドを毒素溶液のml当たりに対して添加した。
＋４℃と＋22℃での中間的期間を含めて＋37℃で24時間
インキュベーションを実施した後に、無毒化を行った。
破傷風トキソイドを得るために濾過による滅菌（0.22
μ）をおこなった。破傷風トキソイドを分子量が≦50,0
00である膜を使用したNaClで透析して濃縮した。濃縮し
たタンパク質を無菌的に濾過し、＋４℃で貯蔵した。AH
−ポリ多糖と破傷風トキソイド（±20％）の同量を、0.
05M・NaClを使用して混合し、ポリ多糖のmlあたりの濃
度を7.5mgとした。その溶液のpHをpH5.7＋0.2に調整
し、HClと１−エチル−３−（３ジメチル・アミノプロ
ピル）カルボジイミド（EDAC）を添加して、反応混合物
の最終濃度を19.17mgEDAC/mlとした。破傷風タンパク質
のカルボキシル基をEDACに結合させることで活性化させ
た。反応条件をかすかに酸性条件として、AH−PSとEDAC
活性化破傷風タンパク質が共有結合する脱水反応を起こ
させた。混合物を、一定のpH（5.7）で60分間＋４℃で
インキュベートし、その後、NaOHを使用して、pHを6.9
±0.2に調整し、反応混合物をNaClで＋４℃で透析し
た。複合物を、スクロース勾配（４％〜60％）で、ゾー
ン遠心分離法により精製して、EDAC、遊離AH−ポリ多
糖、遊離破傷風タンパク質、低分子量複合体を除去し
た。下記の成分を含む複合溶液を得るために、ポリ多糖
複合体を含む分画に、発熱物質を含まない水、スクロー
ス、トリス−HCL緩衝液を添加した。
スクロース 8.5％W/V±0.5％ ポリ多糖 濃度約200μg/ml トリス−HCl緩衝10mM（pH7.0±0.5） この溶液をその後無菌的に、0.2μフィルタを使用し
て濾過し、−40℃で貯蔵した。
インフルエンザ菌ｂ型ポリ多糖複合体を、希釈液を使
用して滅菌条件下で希釈して、最終成分が以下のように
なるようにした。
多糖インフルエンザｂ型複合体を200mgのポリ多糖に
濃度調製した。
トリスHCL緩衝液200mMを10mM（pH7.2）にした。
スクロースを850gに、注射用水を10lにして、最終液
をバイアルに充填し凍結乾燥した。（この凍結乾燥ワク
チンは、使用するときには、0.5mlまたは0.4％NaClで液
体状に戻した。） （ｂ）調剤 多価ワクチン（APDT）である２つの調剤を試験した。
第１のワクチン（APDT−低）は、0.5ml用量当たり、10
μｇの百日咳トキソイド（PT）、５μｇの線状赤血球凝
集素（FHA）、５μｇの線毛２、３μｇの69Kタンパク質
（69K）を含む。第２の調剤（APDT−高）には、上記の
ワクチンの２倍の量のPT（20μｇ）と、同量のFIMと69K
（ハイブリッド）が含まれるようにした。両方の調剤に
は、15Lfのジフテリアトキソイド、5Lfの破傷風トキソ
イド、1.5mgのリン酸アルミニウム（アジュバント）、
0.6％２−フェノキシエタノール（保存剤）が含まれ
る。上記と同じ方法で、Hib破傷風トキソイドワクチン
（PRPT）がコノートラボラトリーズ社（Connaught Labo
ratories Inc.スイフトウオータ、米国）により生産さ
れている。
治験対象 以前の臨床試験において、APDT（低）またはPRP−Ｔ
のいずれかの３回用量を、別々の注射により、生後2,4,
6カ月の時に、投与された健常な、生後17〜21カ月の小
児が治験に組み入れられた。書面によるインフォームド
コンセントへの同意の後、これらの小児を、コンピュー
タベースの無作為バランスリストを基に、APDTワクチン
が投与された後１カ月目、PRP−Ｔを、同じ日に、APDT
とは別々に注射される群と、この両方を一緒に一回の注
射（APDTにより凍結乾燥したPRP−Ｔを液体状に戻した
注射液）により投与される群に割り当てた。各小児への
APDT調剤（高または低）は、最初の３回投与されたもの
と同じものであった（割り当て率6:1、APDT（高）:APDT
（低））。ワクチンを、25mm針を使用して、腕の三角筋
または、大腿が注射に不適切である時には、大腿の外側
広筋の筋肉内投与した。PRP−Ｔに第２の注射が必要で
ある時には、反対側の足に注射を行った。
臨床および検査モニター 試験対象者について、免疫のすぐ後に、局所的および
系統的（全身的）の副作用がないかどうかを、両親が免
疫後72時間モニターした。24時間目および72時間目に電
話インタビューの形でデータを収集した。体温を少なく
とも１日に１回または両親が小児に熱があると判断した
場合に測定した。痛みと系統的（全身的）反応（被刺激
性、活動減退、食欲不振）については、事前に設定され
た基準に従って、軽度、中等症、重度にランク付けを行
い、両親は、この基準により症状の程度を、すでにある
例を基に判定して選択した。測定された局所反応につい
ては、その大きさや小児が泣く時間の長さなどによりラ
ンク付けを行った。
PRP−Ｔを投与した小児（それ故、APDTの投与後２カ
月の小児）の血液サンプルを、免疫をする前および免疫
の後28日目に、静脈穿刺または指穿刺により採取した。
Hib（PRP）の莢膜多糖に対する抗体をRIAにより測定し
た。PTに対するIgG抗体をELAにより、PT中和抗体をチャ
イニーズハムスタ卵巣細胞（CHO）細胞毒性中和法によ
り測定した。IgG抗−FHA、抗−FIM、抗−69k抗体をEIA
により測定した。抗体単位量を米国FDA基準抗血清（＃
３）を使用して計算した。百日咳凝集原も測定した。ジ
フテリア抗毒素を微細中和法により、破傷風抗毒素をEI
A法により測定した。抗体価は幾何平均抗体価で示さ
れ、試験上の検出限界以下の抗体価である血清サンプル
には、統計上の計算のために、低い検出限界の２分の１
の値を割り当てた。
統計分析 副作用を臨床的な有意性によりグループ分けをして分
析した。副作用の発生率を、ワクチン調剤を層別化変数
として使用して、その相対リスクに関するマンテル・ハ
ンツゼル（Mantel−Haenszel）予測値を基に比較検討し
た。RRの点予測値および95％CI（信頼区間）を各症例で
推定した。１を含まないCIは統計的に有意である。抗体
価を計算するために、幾何平均抗体価および95％CIを各
ワクチン抗原を接種する前および接種した後に計算し
た。平均ログ（log）抗体価を３因子分散分析により比
較した。各群における事前に特定したレベルを達成した
対象の割合をロジスティック回帰分析により比較した。
多重比較での調整は行わなかった。
合計545例の小児（44％女児）が治験に組み込まれ、7
4％が幼児シリーズ治験を最後まで完了した。２種類の
調剤を投与された治験への参加者の割合は6:1（468APDT
［高］:77APDT［低］）のままであった。平均年齢は、1
8.9カ月（17〜21カ月の範囲）であり、３小児以外はす
べて治験を完了した（99.4％）。
副作用 APDT（高）とAPDT（低）との間における副作用の発生
率に差異はなかった。一回の来院時に接種が別々になさ
れたか、組み合わされて単回で注射されたかどうかに関
係なく、この発生率は類似していた。
抗体反応 APDT（高）またはAPDT（低）を、最初の３回の用量で
投与した小児に免疫をする前における、FHA以外のすべ
ての抗原に対する抗体レベルは類似していた。その４倍
量のFHAの量のAPDT（高）ワクチンを投与した小児で
は、APDT（低）で免疫した小児に較べて、有意に高い
（Ｐ＝0.0001）FHA抗体が認められた。免疫後におい
て、APDT（高）は、APDT（低）よりも高い抗体価を誘導
した（Ｐ＝0.0001）。対照的なこととして、CHO中和ま
たはEIAにより測定された免疫前抗−PT抗体は、２群に
おいては類似していた。逆説的なことであるが、抗原量
が２倍であったにもかかわらず、抗−PT抗体価は、APDT
（低）の免疫後に較べて、APDT（高）の免疫後のほうが
低かった（Ｐ＝0.038）。同様に、ワクチン製剤中の線
毛抗原の量が同量であったにもかからず、抗−FIM抗体
と凝集素後免疫は、APDT（低）を投与した群において高
かった（それぞれＰ＝0.01およびＰ＝0.04）。免疫前に
おいては、APDTと組み合わせたPRP−Ｔを、無作為に、
同じ日に、あるいは、別々の日に、一回の投与により、
あるいは、別々の注射による投与により接種した群間に
は抗−百日咳抗体における差異は少なかった（表10）。
APDT（高）またはAPDT（低）のレシピエントに関しての
データが個別に提示されたが、APDT（低）を投与した小
児が少数であるので、これらの結果についてはこれ以上
は記載しない。CHO中和分析の結果では、無作為に、同
じ日にワクチンを別々に注射した群の抗−PT抗体は、２
つのワクチンを別々の日に投与した群のそれに較べて、
高かった（6.14:4.80ユニット、ｐ＜0.05）。この群（1
76ユニット）における免疫後の抗体レベルは、組み合わ
せたワクチンを一回に投与された群（171ユニット、ｐ
＜0.01）で同様な高いレベルが認められたけれども、別
々の日に、別々の注射により投与された群（122ユニッ
ト、ｐ＜0.01）に較べれば高かった。抗体応答は、組み
合わせたワクチンを一回で投与された小児よりも、同じ
日に２つの注射で投与された小児において高く、さら
に、同じ日に２つの注射により免疫された小児のほう
が、別の日に免疫された小児（243:190ユニット;p＜0.0
01）、および別の日に２つの注射で免疫された小児に較
べて、高かったけれど、抗−69k免疫後の抗体応答につ
いては、この群において認められた。
免疫前においては、抗−PRP抗体レベルは３群におい
て類似していた。免疫後の抗体は、別々の日に別々の注
射により免疫された群28.4μg/ml;P＜0.001）または組
み合わされたワクチンを一回に投与された群（47.1;P＜
0.05）に較べて、同じ日に別々の注射により免疫された
小児において高かった（66.0μg/ml）。組み合わせたワ
クチンの免疫の場合には、別の日に免疫した場合に較べ
て、有意に（ｐ＜0.05）高い抗体レベルを誘導した。
「防御」レベルを成し遂げた割合においては、群間には
差異は認められなかった。全部の治験参加者に、免疫後
に、0.15μg/mlを超える量の抗体が認められた。４例
（0.7％）だけが１μg/mlを超える量の抗体を産生でき
なかった（この４例のうちの３例は、別の日に、別の注
射を受けた群に属し、残りの１例は、組み合わせたワク
チンを一回に投与された群に属していた）。各群の82％
以上の小児において、抗−PRP抗体のレベルが10μg/ml
を越えた。
ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドに対し
ての強い抗体応答も誘起された。別々の日に免疫された
群（2.1IU/ml）と比較して、同じ日に２回の注射で免疫
された（3.1IU/ml;p＜0.01）小児において、または、組
み合わせワクチンを一回注射して免疫された（3.3IU/m
l;p＜0.001）小児において、有意に高い抗−ジフテリア
抗体レベルが誘起された。同じ日に２回注射して免疫し
た（6.7IU/ml）レシピエントのほうが、別の日に免疫し
た（5.2IU/ml;p＜0.01）小児または組み合わせたワクチ
ンを一回の注射により免疫した小児（4.8IU/ml;p＜0.00
1）に較べて、抗破傷風抗体のレベルは高かった。免疫
後に、0.1IU/mlを越える抗−ジフテリア、抗−破傷風の
抗体価（すでに報告されているレベルの10倍）が全部の
小児に認められた。抗−破傷風抗体価が96％以上、抗ジ
フテリア抗体価が74％以上であると、1.0IU/ml以上のレ
ベルであり、免疫群間には差異はなかった。
例８ この例は、不活性ポリオワクチンを含む多価組み合わ
せワクチンの製剤と免疫原性を記載したものである。
（ａ）不活化ポリオウイルスの調製 （ｉ）MRC−５細胞内での増殖 不活化ポリオウイルス（MRC−５細胞内で増殖）を下
記のように調製した。細胞をミドリザル（Ceropithacus
aethiops）の肝臓細胞から採取した。
三価ポリオウイルスの不活化ウイルスには、マイクロ
・キャリア・ビーズ上のMCR−５細胞内で増殖させたＩ
型（Maoney）、II型（MEF）、III型（Saukett）の各成
分が含まれ、これを加工して、三価ポリオウイルスワク
チンに組み合わせる前に、別々に不活化させた。
MCR−５細胞の縣濁液を、pHが7.2（6.9〜7.6）で、温
度が35±0.5℃である、発酵槽の中の細胞増殖培地に入
れた。細胞増殖培地の成分は以下の通りであった。
CMRL培地1969 重炭酸ナトリウム 0.15％ 成牛血清 5.00％〜7.00％ 硫酸ネオマイシン（活性μｇ）10IU/ml ポリミキシンＢ 200IU/ml CMBL培地の成分は以下の通りであった。
乾燥粉末成分アミノ酸 mg/l Ｌ−アラニン 25.0 Ｌ−アルギニン（遊離塩基） 58.0 Ｌ−アスパラギン酸 30.0 Ｌ−システイン・HCl 0.1 Ｌ−シスチン・ジナトリウム 24.0 Ｌ−グルタミン酸・H2O 67.0 Ｌ−グルタミン 200.0 Ｌ−グリシン 50.0 Ｌ−ヒスチジン（遊離塩基） 16.2 Ｌ−ヒドロキシプロリン 10.0 Ｌ−イソロイシン 20.0 Ｌ−ロイシン 60.0 Ｌ−リシン・HCl 70.0 Ｌ−メチオニン 15.0 Ｌ−フェニルアラニン 25.0 Ｌ−プロリン 40.0 Ｌ−セリン 25.0 Ｌ−トレオニン 30.0 Ｌ−トリプトファン 10.0 Ｌ−チロシン 40.0 Ｌ−バリン 25.0 ビタミン類 Ｐ−アミノ安息香酸 0.05 アスコルビン酸 0.05 ｄ−ビオチン 1.00 パントテン酸カルシウム 1.00 コリン二水素クエン酸 2.12 葉酸 1.00 グルタチオン 0.05 ｉ−イノシトール 2.00 ニコチンアミド 1.00 ピリドキサール・HCl 0.10 リボフラビン−５−リン酸 0.10 チアミン・HCl 1.00有効成分 mg/l 塩化ナトリム 8000.0 塩化カリウム 400.0 塩化カルシウム（無水） 140.0 硫酸マグネシウム・7H2O 200.0 リン酸ナトリウム、無水二塩基 180.0 リン酸ナトリウム（無塩基） 70.0 Ｄ−グルコース（無水） 1000.0 フェノールレッド 20.0 10.852gm歩留まり・１リットル培地CMRL1969。
この培地は以下のように調製する。
450リットルの発熱物質を含まない蒸留水を905mlの1N
塩酸に添加した。この混合物を、5426.5gのCMRL1969乾
燥粉末に、連続的に撹拌しながら、溶解されて液が透明
になるまで添加した。
下記の化学品を、連続的に撹拌しながら、各化学品が
溶解するまで、以下の順序で、次の化学品を添加する前
に添加した。
ネオマイシン 10mcg/ml ポリミキシンＢ 200ユニット/ml TES緩衝溶液 5000.0ml 重炭酸ナトリウム 750.0g ウシ血清 30.0L 新鮮な蒸留水を加えて、500Lまで用量を増やし、均一
に混合するまで撹拌した。
細胞増殖をモニターし、増殖が対数期になると、使用
した増殖培地を廃棄し、ウイルス増殖培地で取り換え
る。ウイルス増殖培地の成分は以下の通りであった。
イーグル塩を含んだ培地199の化学成分 重炭酸ナトリウム 0.26％ トゥエーン80（Tween 80） 20ppm 硫酸ネオマイシン（活性μｇ） 10IU/ml ポリミキシンＢ 200IU/ml Ｌ−グルタミン 100mg/l Ｌ−アルギニン 29mg/l Ｌ−ロイシン 30mg/l Ｌ−イソロイシン 10mg/l Ｌ−メチオニン 7.5mg/l Ｌ−セリン 12.5mg/l Ｌ−トレオニン 15mg/l Ｌ−システイン 10mg/l コリン二水素クエン酸 107mg/l CMRL199培地の成分は以下の通りである。
乾燥粉末成分 mg/l Ｌ−アラニン 25.0 Ｌ−アルギニン（遊離塩基） 58.0 Ｌ−アスパラギン酸 30.0 Ｌ−システイン・HCl・H2O 0.1 Ｌ−シスチン・ジナトリウム 24.0 Ｌ−グルタミン酸H2O 67.0 Ｌ−グルタミン 100.0 グリシン 50.0 Ｌ−ヒスチジン（遊離塩基） 16.2 Ｌ−ヒドロキシプロリン 10.0 Ｌ−イソロイシン 20.0 Ｌ−ロイシン 60.0 Ｌ−リシン 70.0 Ｌ−メチオニン 15.0 Ｌ−フェニルアラニン 25.0 Ｌ−プロリン 40.0 Ｌ−セリン 25.0 Ｌ−トレオニン 30.0 Ｌ−トリプトファン 10.0 Ｌ−チロシン 40.0 Ｌ−バリン 25.0 ｐ−アミノ安息香酸 0.050 アスコルビン酸 0.050 ｄ−ビオチン 0.010 パントテン酸カルシウム 0.010 コリン二水素クエン酸 1.060 葉酸 0.010 グルタチオン 0.050 ｉ−イノシトール 0.050 メナジオン 0.010 ニコチンアミド（ナイアシンアミド） 0.025 ニコチン酸（ナイアシン） 0.025 ピリドキサール・HCl 0.025 ピリドキシン・HCl 0.025 リボフラビン−５−リン酸 0.010 チアミンHCL 0.010 酢酸ビタミンＡ 0.100 ビタミンＤ（カルシフェロール） 0.100 ビタミンＥ（トコフェロール・リン酸） 0.010 硫酸アデニン 10.000 アデノシン三リン酸 1.000 アデノシン−５−リン酸 0.200 デオキシ−２−リボース 0.500 ｄ−リボース 0.500 コレストロール 0.200 グアニン 0.300 ヒポキサンチン 0.300 培養物を適当なシード・ウイルスで感染させた（感染
多重度）。感染は36±１℃で起こるようにした。ウイル
スのＣ・Ｐ・Ｅが完全になった時に培養物を２〜15℃に
冷やした。
集めたウイルス液を濾過により清澄化した。集めたウ
イルス容量を、分子量100,000でカットする膜限外濾過
により、0.04Mリン酸緩衝液で濾過するのに適当な量に
減少させた。濾過の後、容量をさらに濃縮して、ゲル濾
過のできるまで量まで減少させた、生ワクチン濃縮物の
サンプリングをして２〜８℃で貯蔵した。
生きたウイルス濃縮物をゲル濾過カラムに入れて、そ
のカラムから0.04M・リン酸緩衝液で溶出させた。ウイ
ルス分画を254と280nmでのカラム溶出物の光学的濃度を
モニターすることにより集めた。
第２の精製ステップを、溶出緩衝液として0.04M・リ
ン酸を使い、DEAEイオン交換媒体物により実行した。25
4nmと280nmでの光学濃度をモニタしながら、使用したイ
オン交換媒体の量が不十分であれば、上記のステップを
繰り返した。
収集したウイルス分画を濃縮し、リン酸含有を減らす
ために、ハンクス特別培地を使用して透析した。ハンク
ス特別培地の成分は以下の通りであった。アミノ酸 mg/l Ｄ、Ｌ−アラニン 25.00 Ｌ−アルギニン・HCl 58.00 Ｄ、Ｌ−アスパラギン酸 30.00 Ｌ−システイン・HCl・H2O 0.10 Ｌ−シスチン・2HCl 26.00 Ｄ、Ｌ−グルタミン酸 67.00 Ｌ−グルタミン 100.00 グリシン 50.00 Ｌ−ヒスチジン・HCl・H2O 16.20 Ｌ−ヒドロプロリン 10.00 Ｄ、Ｌ−イソロイシン 20.00 Ｄ、Ｌ−ロイシン 60.00 Ｌ−リシン・HCL 70.00 D,L−メチオニン 15.00 Ｄ、Ｌ−フェニルアラニン 25.00 Ｌ−プロリン 40.00 Ｄ、Ｌ−セリン 25.00 Ｄ、Ｌ−トレオニン 30.00 Ｄ、Ｌ−トリプトファン 10.00 Ｌ−チロシン（ジナトリウム塩） 40.00 Ｄ、Ｌ−バリン 25.00 ビタミン アスコルビン酸 0.050 ｄ−ビオチン 0.010 ビタミンＤ（カルシフェロル） 0.100 Ｄ−パントテン酸カルシウム 0.010 塩酸コリン 1.060 葉酸 0.010 ｉ−イノシトール 0.050ミネラル塩 mg/l 塩化カルシウム（無水） 40.00 硝酸鉄・9H2O 0.10 塩化カリウム 400.00 塩化ナトリウム 8000.00 硫酸マグネシウム・7H2O 200.00 その他の成分 硫酸アデニン 10.000 アデノシン三リン酸（ジナトリム塩） 1.000 アデニル酸 0.200 ｄαリン酸トコフェロール （ナトリウム塩） 0.010 コレステロール 0.200 デオキシリボース 0.500 グルコース 1000.000 グルタチオン 0.050 グアニン・HCl 0.300 ヒポキサンチン（ナトリウム塩） 0.300 リボース 0.500 酢酸ナトリウム・3H2O 81.500 チミン 0.300 トゥエーン80 20.000 ウラシル 0.300 キサンチン（ナトリム塩） 0.300 メナジオン 0.010 ニコチン酸 0.025 ニコチンアミド 0.025 ｐ−アミノ安息香酸 0.050 ピロドサール・HCl 0.025 ピリドキシン・HCl 0.025 リボフラビン−５−リン酸 0.010 チアミンHCl 0.010 ビタミンＡ（酢酸） 0.140 精製したウイルス分画を0.2μの多孔フィルターを使
用して濾過した。複数の精製ウイルス濃縮分画を不活化
のためにプールした。ELISA試験結果に基礎をおいて一
価ウイルスプールを希釈した。
型1:1750±250DU/ml 型II:1500±250DU/ml 型III:1250±250DU/ml（ハンクス特別培地） 一価プールを37±１℃まで加温し、その後、0.2μの
多孔フィルターを使用して濾過をした。
濃度を1:4000にするために、必要なホルマリン量を添
加した。ウイルスプールとホルマリンを混合して、37±
１℃の温度で連続で撹拌した。一価ウイルスプールのサ
ンプルを採取して生存率を検査した。第６日目に、不活
化ウイルスプールを0.2μのフィルターを使用して濾過
を行って、37±１℃で保温した。不活化から13日目に、
ウイルスプールを２μのフィルターを使用して濾過し
た。
複数の不活化一価成分を選択し無菌的にプールタンク
に移した。さらに、この一価プールを分子量100,000で
カットする膜限外濾過により濃縮した。RIV−PBS希釈
液： リン酸水素ジナトリウム（Na2HPO4）、0.346g/CCml リン酸二水素カリウム（KH2PO4）、0.187g/CCml をTweenとともに使用して、これに対しての透析を最終
製剤が均一になるように行った。
最終濃度が0.5％になるように、アルブミン（ヒト）
を添加した。その後、プールした一価の濃縮液を0.2μ
のフィルターを使用して濾過した。
推定（計算）により、0.5ml当たり10〜15用量になる
ように、トゥエーン（Tween）を含んだRIV−PBS希釈液
を添加した。プールした濃縮液を使用する時間まで２〜
８℃で保管した。
型Ｉ、型II、型IIIの一価成分の適当な用量を計算し
組み合わせた。三価のワクチンには以下のものを含むよ
うにした。
型1:40 DU/0.5ml用量 型II:8 DU/0.5ml用量 型III:32 DU/0.5ml用量 三価の濃縮液を使用する時まで２〜８℃で保管した。
ホルムアルデヒドと２−フェノキシエタノールを加えて
混合した。計算により濃度が0.5％になるようにアルブ
ミン（ヒト）を加えた。
（ii）ベロ細胞内での増殖 ベロ（Vero）細胞をアンプルに入れて、選択した細胞継
代数になるまで、継代培養した。この細胞をアンプルに
入れた状態で、液体窒素で保管した。細胞を、表面にDE
AEの基を有するデキストランポリマー（ジエチルアミノ
エチル）で構成されている直径が約100ミクロンの球形
ビーズであるマクロサポートビーズ（これが陽電荷を与
える）を使用して増殖させた。
細胞増殖の基礎培地は、Earle生理食塩水溶液に0.2％
のラクトアルブミン加水分解物、0.1％のデキストロー
ス、５％の子ウシ血清を入れた「イーグルの最小必須培
地」であった。この培地のml当たりの成分は以下の通り
であった。
ストレプトマイシン:ml当たり75ユニット ネオマイシン:ml当たり14ユニット 硫酸ポリミキシンB:ml当たり35ユニット ベロ細胞を、バイオジェネレータのサイズを順次に大
きくしながら、順番に継代培養をした。その後、培地
と、培地のリットル当たりの十分な量のマイクロサポー
トビーズを産業用のバイオジェネレータに入れた。温度
を37℃で安定化させた。トリプシン化により収集した細
胞を撹拌しながら加えた、連続培養を、撹拌の速度を順
番に増加させながら37℃で４〜７日間実施した。通常、
培養の最後において、細胞増殖が６〜20倍増加する。ウ
イルスの増殖に使用された培地は、Earle生理食塩水中
の199培地（パーカ）を使用し、0.1％デキストロースで
強化した。この培地には、細胞増殖のために培地と同じ
濃度で、同じ抗生物質を含むが、子ウシ血清は含んでい
ない。細胞増殖の第４日目、第７日目に、撹拌している
工業的な段階にあるバイオジェネレータを停止させ、タ
ンクの底にビーズを固定させて、古い培地を除去した。
血清の入っていない199培地を各バイオジェネレータに
入れて撹拌した。その後、この培地に引き出してビーズ
と細胞を洗浄した。血清の入っていない199培地を、必
要な量の使用菌と一緒にバイオジェネレータに移した。
ゆっくりと撹拌して、ウイルスを細胞に吸着させた。ウ
イルスの培養の最後において、撹拌を停止した。ウイル
スの縣濁液を取り出して、収集しビーズを濾過した。ウ
イルスの縣濁液をホモジェナイザー処理した。ポアサイ
ズが0.20mmである有機膜により濾過したウイルスを＋４
℃で保存した。このウイルスを限外濾過により濃縮し
た。DEAEデキストラン・スフェロシル・サポートを使用
し、0.04Mリン酸緩衝液（pH＝7.00）で均衡させた、イ
オン交換クロマトグラフィにより、ウイルスをさらに精
製した。そのウイルスを、さらに、アガロースゲルおよ
び0.04Mのリン酸（pH＝7.00）で緩衝させたセファロシ
スCL−6Bを含んだゲル濾過クロマトグラフィにより精製
した。0.04Mのリン酸緩衝液（pH＝7.00）で緩衝させたD
EAEデキストラン・スフェロシルを使用したクロマトグ
ラフィにより精製した。最後の精製が実施されるとすぐ
に、ウイルス縣濁液の量を、リン酸の入っていないＭ−
199培地（pH＝7.0）を使用して、必要なレベルに調整
し、5mgのEDTA、0.5％グリセリン、トゥエーン80で10回
濃縮して、最終濃度を50mg/lとした（不活化培地）。
「濃縮ウイルス混合液」は、この混合液から成ってお
り、これを、0.2μｍの膜フィルターを使用して濾過し
た。濃縮したウイルス縣濁液を＋４℃で保存した。
上記の同じ型の「濃縮ウイルス混合液」の１ロットま
たは数ロットを混合し、その用量を、適当なタンクに入
れた「不活化培地」を使用して、希釈または調整した。
以下の範囲のＤ抗原の抗体を得るために、その希釈液
を、型に従って、正しい用量になるように調整した。
−型１では、1500および2000Dユニット −型２では、800および1000Dユニット −型３では、1000および1500Dユニット そして、そのタンパク質の割合が以下の通りである。
−型１では、≦40μg/ml −型２では、≦70μg/ml −型３では、≦30μg/ml 調整した精製濃縮ウイルス縣濁液を、不活化を始める
前に、0.22μｍ膜を使用して最長72時間濾過した。この
ウイルス縣濁液を再度＋37℃まで加温した。不活化のた
めに、濃度を1/4000にするために、ホルムアルデヒド溶
液を追加した。24,48,72、96時間後に、不活化の状態を
確認するために、最初の４日間サンプルを採取した。10
mlのサンプリングを実施し、すぐに亜硫酸水素塩ナトリ
ウムを使用してホルムアルデヒドの中和を行った。これ
を−20℃で保存して滴定を行った。
６日目に、不活化させているウイルス縣濁液を0.22μ
ｍフィルタを使用して濾過した。濾過後に、６日間以上
に亘り一定の撹拌をしながら、＋37℃で濾過後の液体の
インキュベーションを実施した。不活化を開始してから
９日目に、3000ヒト投与量に相当する量と、最低500ml
の粗収穫物を取り出した。この容量を、「濃縮ウイルス
混合液」のＤ抗原に対する抗体価に従って計算した。残
留ホルムアルデヒドの作用を止めるために、サンプリン
グした試料を、直接に亜硫酸水素塩ナトリウムを使用し
て中和した。12日目の不活化の後、ホノナイナイザー処
理をして不活化させたウイルス縣濁液を、37℃のインキ
ュベータから取り出した。この溶液を亜硫酸水素塩ナト
リウムを使用して中和し、＋４℃で保存した。
IPVの濃縮三価ロットを調整するために、一価の調剤
を組み合わせて下記の抗原が得られるようにした。
型１（Mahoney） 400抗原Ｄユニット 型２（MEF−１） 80抗原Ｄユニット 型３（Saukett） 320抗原Ｄユニット 199培地（pH7.2）1ml 混合液を撹拌して、0.22μｍ多孔膜フィルタで均一濾過
を行った。
濃縮した三価の液体ロットから、0.5ml当たりのユニ
ット抗原量が下記の量になるように、フェノールレッド
を使用することなく、199培地（pH7.2）を使用した希釈
プロセスにより最終製品を得るようにした。
型１では、40ユニットのＤ抗原 型２では、８ユニットのＤ抗原 型３では、32ユニットのＤ抗原 （ｂ）調剤 多価ワクチン調剤（APDT）には、0.5ml当たり、５種類
百日咳抗原（10μｇのPT、５μｇのFHM2,5μｇのFIM2及
び３、３μｇの69K）、15Lfのジフテリアトキソイド、5
Lfの破傷風トキソイド、1.5mgのリン酸アルミニウム
（アジュバント）、0.6％の２−フェノキシエタノール
（保存剤）が含まれるようにした（クラシック:CLASSI
C）。
このワクチンは、単独で、あるいは、MRC−５細胞内
で増殖させて得たIPV（mIPV）または、ベロ細胞内で増
殖させて得たIPV（vIPV）またはOPV（コノートラボラト
リーズ社）と組み合わせて使用した。これらの抗原の通
常の免疫スケジュールを乱さないように、フォローアッ
プのために来院した際に、インフルエンザ菌ｂ型−破傷
風トキソイド複合ワクチンを投与した。
治験対象 生後８カ月目の時に、DTPの３用量とOPVの２用量また
はDTP−IPVの３用量で免疫した健常な71〜19カ月の小児
を対象とした。両親または保護者の書面による同意を得
た後、コンピュータベースの無作為均衡ブロックリスト
に従って、対象小児を割り振って、５ワクチンのうちの
どれか１つを投与した（表10）。A3DTを含む組み合わせ
ワクチンを25mm針を使用して腕の三角筋または、三角筋
の部位が不十分な場合には、大腿の外側広筋に穿刺を行
い筋肉内投与した。IPV（0.5ml;mIPVまたはvIPV）を単
独で投与する場合には、長さが1/2〜5/8インチ（12.5〜
16mm）の針を使用して、皮下投与をし、ワクチンを含む
APDTは左足肢に投与し、不活化ポリオワクチンを別に投
与する場合及び２回目の来院で全部に対してインフルエ
ンザ菌ｂ型複合ワクチンを投与するときには、右足肢を
使用した。
臨床試験および検査モニター 免疫をする前、および、免疫をした後28日目に、静脈
穿刺または指穿刺により、血液サンプルを採取した。PT
に対するIgG抗体をエンザイムイムノアッセイにより、P
T−中和抗体をCHO中和法により測定した。IgG抗−FHA、
抗−FIM、および抗−69K抗体をエンザイムイムノアッセ
イにより測定し、抗体価をUS・FDA基準抗血清（＃３）
を使用して計算した。百日咳凝集原も測定した。ジフテ
リア抗毒素をマイクロ中和法により、破傷風抗毒素をイ
ムノアッセイにより測定した。抗体ポリオウイルス型1,
2,3をウイルス中和法により測定した。抗体価を幾何平
均抗体価として表した。試験検出限界値以下の抗体価の
血清サンプルには、統計計算のために、低いほうの検出
限界値の２分の１を割り当てた。免疫をする前後に、各
ワクチン抗原に対する抗体価を算出するために、幾何平
均抗体価および95％信頼区間を計算した。平均対数抗体
価における増加をプロファイル分析と分散分析により比
較した。各群における事前特定のレベルに到達した対象
の割合をロジステック回帰分析により比較した。別々に
投与されたか、または、組み合わせて投与されたかのい
ずれかの各ポリオウイルス・ワクチン間、および、mIPV
およびvIPV間、および、組み合わせたIPVワクチンとOPV
間の比較を行った。多重比較での調整は実施しなかっ
た。
合計425例の小児（52％は女児）を治験に組み入れ
て、ブースター免疫を行った（表10）。平均年齢は17.8
カ月（範囲は17.0〜20.0）であった。免疫後の血清試料
を、免疫後平均29.2日目に422（99.3％）例の参加小児
から採取した（28〜41日の範囲）。重篤と分類された副
作用はまれであった。
免疫前には、大抵の抗原に対して群間の抗体価レベル
は同等であった。例外は、APDTおよびmIPVを別々の注射
により投与した群での抗−FIM、抗−凝集原、抗−ジフ
テリア、抗−破傷風抗体レベルが、組み合わせたAPDT−
mIPVワクチンを投与した群に比べて低かったことであ
る。同様に、APDTおよびvIPVを別々の注射により無作為
に投与した群での抗−破傷風抗体レベルが、組み合わせ
たAPDT−vIPVを投与した群に比べて低かった。免疫後で
は、すべてのワクチン投与群において、ワクチンに含ま
れているすべての抗原に対して、抗体価の有意な上昇が
認められた。ポリオワクチンの群では、百日咳抗原に対
する抗体応答における差異はわずかしかない。エンザイ
ムイムノアッセイまたはCHO中和による抗−PT抗体また
は抗−FAH抗体での差異はない。抗−69K抗体は、別々の
注射によりmIPV（37.9ユニット;p＜0.001）を投与した
群またはOPV（47.7;p＜0.05）を投与した群に比べて、A
PDT（77.7ユニット）と組み合わせたmIPVワクチンを投
与した群において有意に高かった。抗−FIM抗体および
抗−凝集原抗体も、別々に注射された群に比べて、組み
合わせたAPDT−mIPVを投与した群において、そのレベル
が高かったが、これらの同じ差異が事前免疫した血清に
も検出された。
抗−ポリオウイルス抗体応答において差異は検出され
なかった。APDT−mIPVおよびAPDT−vIPVの両方におい
て、高い抗−ポリオウイルス型1,型３抗体が誘起された
（全比較において、ｐ＜0.001）。抗ポリオウイルス型
２抗体レベルも、OPV（7185）を投与した群に比べて、A
PDT−mIPV（10,633、相互希釈）およびAPDT−vIPV（10,
256）を投与した群において高かったが、このことか
ら、APDT−mIPV（ｐ＜0.05）に関してのみ統計的有意性
が認められた。抗−ポリオウイルス抗体についても、AP
DT−MIPVと組み合わせた群において、別々の注射で投与
した群よりも高かった（6620−１、ｐ＜0.05）。OPVの
レシピエントにおいて、IPVの組み合わせがいずれの場
合も、抗−破傷風抗体価が高かった（ｐ＜0.05）。抗−
ジフテリア抗体価も、OPV投与群において高かったが、
これは、APDT−vIPVの投与群（ｐ＜0.05）と比べた場合
の統計的な意味においてである。免疫後、小児全部にお
いて、ジフテリア、破傷風に対する抗体が0.01IU/mlを
超えていた（１例だけは、0.1IU/mlの抗体価であっ
た）。
この研究の結果の示すところは、ジフテリアトキソイ
ド、破傷風トキソイドを組み合わせたPT、FHA、69K、FI
Mを含む成分性百日咳ワクチンを、不活化したポリオウ
イルス・ワクチンに組み合わせて投与しても、その副作
用反応性や免疫原性に有意な増減がないということであ
る。全細胞DTPの試験結果と対照的に、百日咳抗原に対
する抗体応答に減少は認められなかった。MMC−５細胞
内増殖あるいはベロ細胞内増殖のいずれにより得たIPV
ワクチンの投与群間においても実質的な差異は認められ
なかった。これらは両方とも、OPVよりも高いレベルの
抗−ポリオウイルス抗体を誘発した。mIPVであってもvI
PVであってもそれらが同等であるということは、細胞か
ら得たIPVを優先的に組み合わせた無細胞性百日咳ワク
チンとして使用できるということである。
この例から判明したことの結論は、５成分無細胞性百
日咳ワクチンは、２種類のIPVワクチンのいずれとも組
み合わせて、第４番目のワクチンとして、生後17〜19カ
月の小児に、安全に使用できるということである。
発明の概要 本発明の開示を概略すれば、本発明は、ボルデテラ属
（Bordetella）および非ボルデテラ属（Non−Bordetell
a）の抗原を使用した多成分性百日咳ワクチンである新
規製剤を提供することである。このワクチンは、ヒトに
使用した場合、安全で、副作用無反応性、免疫原性で、
感染防御作用を有する。この発明の範囲内で修正が可能
である。
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フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/13 Ａ６１Ｋ 39/13 Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 31/04 31/12 31/12 (72)発明者 タン、 ラリー、 ユー．、 エル. カナダ国 エル５エル ３エヌ３ オン タリオ州 ミシソウガ フォークウェイ ドライヴ 2424 (72)発明者 バレット、 ルイス カナダ国 エル４ケイ １ピー４ オン タリオ州 コンコード クロックドステ ィック クレセント 53 (72)発明者 ティファウォン、 ジョン カナダ国 エム５ビー ２エイチ９ オ ンタリオ州 トロント カールトンスト リート 45 アパートメント 602 (72)発明者 ジャクソン、 ゲイル、 イー．、 デ ィー. カナダ国 エル４シー ５ピー３ オン タリオ州 リッチモンド ヒル アネッ ト ゲート 10 (56)参考文献 国際公開93／24148（ＷＯ，Ａ１) 英国特許出願公開928807（ＧＢ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 39/295 A61K 39/05 A61K 39/10 A61K 39/102 A61K 39/116 A61K 39/13 A61P 31/04 A61P 31/12 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (18)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）精製した状態の、百日咳トキソイ
    ド、線状赤血球凝集素、ペルタクチン及び凝集原、 （ｂ）破傷風トキソイド、 （ｃ）ジフテリアトキソイド、及び （ｄ）不活化ポリオウイルス を含み、宿主にin vivo投与するワクチンとして調剤さ
    れた、百日咳菌（Bordetella pertussis）、破傷風菌
    （Clostridium tetani）、ジフテリア菌（Corynebacter
    ium diphtheriae）及びポリオウイルス（poliovirus）
    の少なくとも１種の感染が原因となる疾病に対する宿主
    内防御を与える多価免疫原性組成物であって、 該組成物中の各成分が、その免疫原性が該組成物中の他
    の成分により障害を受けないように製剤化されているこ
    とを特徴とする多価免疫原性組成物。
  2. 【請求項２】アジュバントを更に含む請求項１に記載の
    多価免疫原性組成物。
  3. 【請求項３】アジュバントが水酸化アルミニウムまたは
    リン酸アルミニウムである請求項２に記載の多価免疫原
    性組成物。
  4. 【請求項４】ヒトにおける１回当たりの用量に、前記百
    日咳トキソイドが窒素換算で５〜30μｇ、前記線状赤血
    球凝集素が窒素換算で５〜30μｇ、前記ペルタクチンが
    窒素換算で３〜15μｇ、前記凝集原が１〜10μｇ含まれ
    る請求項１〜３のいずれかに記載の多価免疫原性組成
    物。
  5. 【請求項５】ヒトにおける１回当たりの用量に、前記百
    日咳トキソイドが窒素換算で20μｇ、前記線状赤血球凝
    集原が窒素換算で20μｇ、前記ペルタクチンが窒素換算
    で５μｇ、前記凝集原が３μｇ含まれる請求項４に記載
    の多価免疫原性組成物。
  6. 【請求項６】前記ジフテリアトキソイドを10〜20Lf、前
    記破傷風トキソイドを１〜10Lf含む請求項１〜５のいず
    れかに記載の多価免疫原性組成物。
  7. 【請求項７】前記ジフテリアトキソイドを15Lf、前記破
    傷風トキソイドを5Lf含む請求項５に記載の多価免疫原
    性組成物。
  8. 【請求項８】前記不活化ポリオウイルスが、不活化ポリ
    オウイルス１、２、３型の混合物から成る請求項１〜７
    のいずれかに記載の多価免疫原性組成物。
  9. 【請求項９】前記不活化ポリオウイルス１、２、３型の
    混合物が、ヒトにおける１回の用量につき、 20〜50D抗原ユニットのポリオウイルス１型、 ５〜10D抗原ユニットのポリオウイルス２型、及び 20〜50D抗原ユニットのポリオウイルス３型 の比率で含む請求項８に記載の多価免疫原性組成物。
  10. 【請求項１０】前記不活化ポリオウイルス１、２、３型
    の混合物が、ヒトにおける１回の用量につき、 40D抗原ユニットのポリオウイルス１型、 8D抗原ユニットのポリオウイルス２型、及び 32D抗原ユニットのポリオウイルス３型 の比率で含む請求項９に記載の多価免疫原性組成物。
  11. 【請求項１１】破傷風トキソイド及びジフテリアトキソ
    イドからなる群から選択された担体と、インフルエンザ
    菌（Haemophilus influenzae）ｂ型の莢膜多糖との複合
    体を更に含み、インフルエンザ菌の感染が原因となる疾
    病に対する防御をさらに与える請求項１〜10のいずれか
    に記載の多価免疫原性組成物。
  12. 【請求項１２】上記複合体が、破傷風トキソイドまたは
    ジフテリアトキソイドと、インフルエンザ菌ｂ型の硫酸
    ポリリポース・リビトール（PRP）の複合体を含む請求
    項11に記載の多価免疫原性組成物。
  13. 【請求項１３】前記複合体が凍結乾燥品として提供さ
    れ、該多価免疫原性組成物の投与の際には、前記成分に
    より復元される請求項11または12に記載の多価免疫原性
    組成物。
  14. 【請求項１４】前記複合体が、ヒトにおける１回の用量
    につき、５〜15μｇのPRPに15〜35μｇの破傷風トキソ
    イドが結合した複合体を含む請求項11〜13のいずれかに
    記載の多価免疫原性組成物。
  15. 【請求項１５】前記複合体が、ヒトにおける１回の用量
    につき、10μｇのPRPに20μｇの破傷風トキソイドが結
    合した複合体を含む請求項14に記載の多価免疫原性組成
    物。
  16. 【請求項１６】0.5ml用量当たり、20μｇの百日咳トキ
    ソイド、20μｇの線状赤血球凝集素、５μｇの凝集原２
    及び３、３μｇのペルタクチン、15Lfのジフテリアトキ
    ソイド、5Lfの破傷風トキソイド、40D抗原ユニットのポ
    リオウイルス１型、8D抗原ユニットのポリオウイルス２
    型、及び1.5μｇのリン酸アルミニウムを含む多価免疫
    疫原性ワクチン組成物。
  17. 【請求項１７】前記破傷風トキソイドに加えて、0.5ml
    用量当たり、20μｇの破傷風トキソイドに共有結合した
    10μｇのインフルエンザ菌ｂ型の精製した硫酸ポリリボ
    ース・リビトール莢膜多糖（PRP）を更に含む請求項16
    に記載の多価免疫疫原性ワクチン組成物。
  18. 【請求項１８】0.5ml用量当たり、0.6％の２−フェノキ
    シエタノールを更に含む請求項16または17に記載の多価
    免疫疫原性ワクチン組成物。
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