KR102219638B1

KR102219638B1 - 엔테로바이러스 불활화 및 보강제 흡착 방법과 이로부터 수득되는 저용량 백신 조성물

Info

Publication number: KR102219638B1
Application number: KR1020177012227A
Authority: KR
Inventors: 라지브 말라사칸트 데레; 삼브하지 샨카르 피살; 자그디시 카말라지 자데; 라젠드라 나라얀 사발레
Original assignee: 세럼 인스티튜트 오브 인디아 프라이비트 리미티드
Priority date: 2014-10-07
Filing date: 2015-10-06
Publication date: 2021-02-23
Also published as: NZ731341A; SG10202010814RA; US20170348411A1; EA201700187A1; LT3204494T; AU2021269395A1; EP3663396A1; MX2017004534A; CY1123078T1; UA125788C2; DK3204494T3; SI3204494T1; SG11201702838SA; JP6755243B2; JP7063957B2; WO2016063291A1; PT3204494T; CU20170044A7; US10485862B2; BR112017007089A2

Abstract

본 발명은 트로메타민 완충액의 존재 하에 포름알데하이드를 사용함으로써 D-항원을 최대 수율로 수득하는 개선된 엔테로바이러스 불활화 방법에 관한 것이다. 이후 수산화알루미늄 상에 sIPV를 흡착시켜 현저한 저용량 sIPV 조성물을 제공한다.

Description

엔테로바이러스 불활화 및 보강제 흡착 방법과 이로부터 수득되는 저용량 백신 조성물 {IMPROVED METHODS FOR ENTEROVIRUS INACTIVATION, ADJUVANT ADSORPTION AND DOSE REDUCED VACCINE COMPOSITIONS OBTAINED THEREOF}

폴리오 바이러스의 유행은 약독화된 Sabin 폴리오 생 균주 (live-attenuated Sabin polio strain)에 기반한 소아마비 경구용 백신 (OPV)의 사용으로 크게 줄어들었다. 그러나, OPV는 박멸 이후의 시대 (post-eradication era)에 들어서기에는 한계가 있다. 그래서, Sabin-IPV의 개발이 WHO의 소아마비 박멸 전략에 주요한 역할을 담당한다. 야생형 Salk 폴리오 균주 대신 약독화된 Sabin의 사용은 제조에 부가적인 안전성을 부여할 것이다. 또한, 순환성 백신-유래의 폴리오 바이러스 (cVDPV)의 출현을 방지하기 위해, OPV의 사용은 소아마비가 해결된 이후에는 중단하여야 하며, IPV로 대체되어야 한다. 이들 cVDPV는 전염성이므로, (야생형 소아마비 바이러스와 유사한) 신경독성을 유발하여, 백신 관련 마비성 폴리오 척수염을 일으킬 수 있다. 이 균주는 폴리오 바이러스를 전세계적으로 다시 유병시킬 가능성이 있을 수 있으며, 박멸 달성을 무력화시킬 수 있다.

IPV는 근육내 (IM) 또는 심층 피하 (SC) 주입에 의해 전달된다. IPV는 현재 보강제-비함유성 독립형 제형 (non-adjuvanted stand-alone formulation), 또는 DT-IPV (+ 디프테리아 및 파상풍 톡소이드) 및 6가 DTPHepB-Hib-IPV 백신 (부가적으로 + 백일해, B형 간염 및 용혈성 B형 인플루엔자) 등의 다양한 조합으로서 이용가능하다. 소아마비 백신의 현재 허용가능한 표준 용량은 D 항원으로서 타입 1의 불활화 폴리오바이러스 (Mahoney)의 경우 40 단위 (unit), 타입 2의 불활화 폴리오바이러스 (MEF-1)의 경우 8 단위, 타입 3의 불활화 폴리오바이러스 (Saukett)의 경우 32 단위로 포함한다 (예, Infanrix-IPV™). 기존의 독립형 IPV 조제물에는 보강제가 포함되지 않는다.

대부분의 전문가들은, 예방 실적 및 안전성 입증을 통해, 전세계적인 IPV의 사용이 바람직하다는 점에 동의하고 있다. 그러나, OPV와 비교해, IPV는 비용-대가 (cost-prize)가 매우 높다. 이는 주로 다음과 같은 요건들 때문이다: (i) 용량 당 더 많은 바이러스 수; (ii) 부가적인 후속 가공 처리 (즉, 농축, 정제 및 불활화) 및 관련 QC-검사, (iii) 후속 공정에서 항원 소실 또는 회수율의 저하, 및 (iv) 오염. 지금까지, 저소득 국가 및 중진국에서는 IPV 혁신과 실현에 있어 금전적인 문제가 주된 장애가 되어 왔다. sIPV의 제조 단가는 현재 IPV와 비슷한 것으로 추정되며, OPV 보다는 약 20배 더 많이 소요된다. 폴리오 바이러스의 박멸 이후의, IPV에 대한 향후 전세계적인 수요는 연간 현행 수준 8천만 인분 (dose)에서 4억 5천만 인분으로 증가할 수 있다. 그래서, IPV의 공급을 "확대"하는 접근법이 틀림없이 요구될 것이다.

IPV 항원을 저용량으로 사용해 감염 예방을 제공하는 저용량 유효 백신 제형은, 통례적인 백신 공급 방식이 전세계적인 수요를 충족시키기에는 불충분하거나 또는 통례적인 백신의 제조 비용이 개발도상국에서 감당가능한 가격으로 판매할 수 없는 상황인 경우에, 적합하다. 또한, 기존에 시판된 제형들과 비교해, 더 적은 용량의 IPV에 노출되는 것이 더 안전할 수 있다. 따라서, 보다 합리적인 가격으로 이용가능한 IPV를 제조하는 다양한 전략들에 대한 탐구가 요구되고 있다.

유행성 인플루엔자 백신의 경우, 보강제를 사용하여 용량은 줄이고, 이용성은 높이며, 백신의 단가는 낮추었다. 따라서, 보강제 첨가된 sIPV 백신 제형 역시 단가를 떨어뜨리고, 전세계적으로 이용가능한 sIPV 인분의 수를 증대시킬 것으로 추정된다.

전세계적으로 여러 연구 그룹들에서는 알럼 (Alum), 에멀젼 (Emulsion), TLR-작용제 (MPL, CpG, poly-IC, 이미퀴모드), dmLT, 1,25-다이하이드록시비타민 D3, CAF01, 폴리[다이(카르복실라토페녹시)-포스파젠](PCPP) 및 베네주엘라 말 뇌염 (VEE) 레플리콘 입자로 지칭되는 여러가지 보강제들을 사용함으로써, 백신내 용량 저감 전략을 연구하여 왔다. 실험 중인 대부분의 보강제 타입들은 i) 안전성 미확인 또는 규제 기관에서 독성으로 분류됨, ii) 투여 경로와 관련된 한계, iii) 낮은 제조 재현성, iv) 보강제의 안정성과 같은 문제들에 직면해 있다.

에멀젼 보강제 (MF-59, AS03, AF3)는 인플루엔자 및 B형 간염 백신에서 강력한 용량-저하 효과 (>30배)를 제공하는 것으로 기존에 보고된 바 있다. 이들 보강제는 주사 부위에서 항원 물질을 정량적으로 방출하여 항체 생산성 형질세포를 자극할 수 있는 디포트를 형성함으로써 작용한다. 그러나, 이들 보강제는 광범위한 인간용 예방 백신에 사용하였을 때 매우 유해한 것으로 여겨지고 있으며, 통상적으로 부작용에 대한 허용성이 높은 암과 같은 중증 및/또는 치명적인 병태 (terminal condition)에서만 전용되고 있다.

나아가, 알루미늄 염은 안전한 것으로 간주되어, sIPV를 함유한 조합 백신에 이미 사용되고 있으며, 개발과 관련된 장벽이 가장 낮고, 제조 비용이 저렴하다. 그러나, 알루미늄 보강제는 현저한 용량-저감 특성에 대해 알려진 바가 없다.

병원체에 대한 백신, 특히 바이러스 백신을 제조하는데 있어 가장 결정적인 단계들 중 한가지 단계가 바이러스의 불활화이다. 바이러스를 불활화하는 경우, 백신 제조에서 가장 많이 사용되는 불활성화제는 포르말린이다. 포름알데하이드는 표면 단백질의 1차 아민을 단백질의 다른 인접 질소 원자와 또는 -CH₂ 연결을 통해 DNA와 비가역적으로 가교함으로써 바이러스를 불활화한다. 바이러스의 불활화에 포르말린을 사용하는 경우 잠재적인 문제는 바이러스 단백질의 가교와 바이러스 입자의 응집을 유도할 수 있는 반응성 산물이 생성되는 일련의 화학 반응이 수반된다는 것이다. 이는 포르말린의 불활화 효과를 방해할 수 있으며, 또한 백신내 항원의 면역원성을 일부 파괴할 수 있다. 즉, 폴리오바이러스의 포르말린 불활화는 바이러스 면역원성 뿐만 아니라 항원성에도 영향을 비칠 수 있다는 것이 이미 발표된 바 있다. Morag Ferguson et al Journal of General Virology (1993), 74, 685-690를 참조한다. 가장 중요하게도, 기존에 개시된 포름알데하이드 불활화 방법이 포스페이트 완충액의 존재 하에 특히 수행되는데, Sabin 타입 I/II/III에서 D-항원의 현저한 감소와 에피토프 변형이 관찰되어 (불활화 후 D-항원 회수율: sabin 타입 1의 경우 22%, sabin 타입 II의 경우 15%, sabin 타입 III의 경우 25%), 에피토프의 구조를 유지하는데 실패하였다. 따라서, (포스페이트 완충액의 존재 하에) 포르말린-불활화된 폴리오 바이러스를 투여받은 수여체에서 생산되는 항체가 예방적 면역 반응에 기여하지 않을 수 있다는 것도 가능한 일이다.

과학자들은, 특히 복원성 (resilient) 폴리오바이러스를 불활화하는 경우, 포르말린과 UV-불활화를 조합함으로써, 독립형 UV-불활화 또는 포르말린-불활화 각각의 문제를 극복하고자 시도하였다. 예를 들어, McLean, et al., "Experiences in the Production of poliovirus vaccines," Prog. Med. Virol., vol 1, pp. 122-164 (1958)을 참조한다. Taylor 등 (J. Immunol. (1957) 79:265-75)은 회색질척수염 바이러스 (poliomyelitis virus)를 포르말린과 자외선 조합에 의해 불활화하는 방법을 개시하였다. Molner 등 (Am. J. Pub. Health (1958) 48:590-8)은 자외선-포르말린에 의해 불활화된 회색질척수염 바이러스 백신을 접종받은 개체에서 혈중 순환성 항체가 측정가능한 수준으로 형성됨을 기술하였다. Truffelli 등 (Appl. Microbiol. (1967) 15:516-27)은 포르말린, UV 광 및 β-프로피올락톤 (BPL)으로 이루어진 3단계 불활화 공정을 통해 햄스터에서 아데노바이러스 및 시미안 바이러스 40의 발암성의 불활화를 발표하였다. Miyamae (Microbiol. Immunol. (1986) 30:213-23)는 UV 선 및 포르말린을 이용한 처리에 의한 센다이 바이러스의 면역원의 제조 방법을 개시하였다. 그러나, 기존에 논의된 β-프로피올락톤 (BPL)과 같은, 포름알데하이드에 대한 기대되는 대안책들이, 광견병 백신의 다른 구성 성분과 조합되는 경우, 면역 복합-반응을 발생시키는 것으로 보고된 바 있다. 또한, 편평 세포암, 림프종 및 간 종양을 마우스에서 유발하는 것으로 밝혀지고 있다.

따라서, Sabin 균주의 항원성 구조체의 구조 완전성을 유지하는 유익한 포름알데하이드 불활화 조건을 적용할 뿐만 아니라 용량이 현저하게 (즉, 8 내지 10배) 저감된 sIPV (Sabin IPV) 백신 조성물을 제조할 수 있는 안전하고 비용-효율적인 보강제를 활용하여, 제조 단가를 절감하고, 백신 공급을 증대시키고, 개발도상국에서 부담가능한 수준의 백신을 제조하는 것이 특히 바람직하다.

본 발명자들은, 포름알데하이드를 이용한 불활화 이후의 D-항원 감소가, 예상치못하게도, 폴리오 바이러스의 부적절한 응집을 야기하는 포스페이트 완충액의 존재로 인한 것일 수 있다는 것을 놀랍게도 밝히게 되었다. 본 발명은 TRIS 완충액 중에서 포름알데하이드 불활화를 수행함으로써 에피토프의 최소 변형을 확보하고 후속적으로 D-항원의 소실을 최소화하는 개선된 불활화 방법을 제공한다. 후속적으로, Sabin 타입 1의 용량이 8배 이상 저감되고 Sabin 타입 III의 용량이 3배 저감된, 용량이 현저하게 저감된 Sabin IPV 백신을 수득할 수 있다.

도 1: 0.9% NaCl 중에 제조된 알럼 포스페이트 겔 (여러가지 농도의 알럼 포스페이트 겔에서의 pH 대 Zeta 전위)
도 2: WFI 중에 제조된 알럼 포스페이트 겔 (여러가지 농도의 알럼 포스페이트 겔에서의 pH 대 Zeta 전위)
도 3: 0.9% NaCl 중에 제조된 알럼 하이드록사이드 겔 (여러가지 농도의 알럼 하이드록사이드 겔에서의 pH 대 Zeta 전위)
도 4: WFI 중에 제조된 알럼 하이드록사이드 겔 (여러가지 농도의 알럼 하이드록사이드 겔에서의 pH 대 Zeta 전위)

본 발명의 주요 측면은, 개선된 포르말린 불활화 및 알럼 염에의 흡착 방법이,

a) Sabin IPV 정제된 벌크 (bulk)를 pH 6.8 - 7.2의 TRIS 완충액 (30 내지 50mM)에 첨가하는 단계,

b) 글리신 (5gm/l)이 포함된 M-199 매질 (medium)을 (a)의 혼합물에 첨가하는 단계,

c) 0.025% 포름알데하이드를 혼합하면서 첨가하는 단계,

d) 단계 (a)에서 수득된 혼합물을 37℃에서 5 내지 13일간 자기 교반기 위에서 인큐베이션하는 단계,

e) 배양된 혼합물을 0.22 μ에서 7일째에 중간 여과하고, 13일째에 최종 여과를 수행하는 단계,

f) 단계 (e)에서 수득된 벌크를 2 내지 8℃에 보관하는 단계,

g) D-항원 단위 측정 (unit determination)을 위해 D-Ag ELISA를 수행하는 단계,

h) 자동멸균처리된 Al(OH)₃를 적량 취하여, 50 ml 용기에서 알럼 (Al⁺⁺⁺)을 최종 농도 0.8 내지 1.2 mg/dose로 제조하는 단계,

i) sIPV 벌크를 적정된 D-Ag와 함께 첨가하고, 희석제 (10x M-199 + 0.5% 글리신)를 첨가하여 소정의 부피를 만드는 단계,

j) 최종 제형의 pH를 적정하여, pH 6 - 6.5의 최종 제형을 수득하는 단계,

k) 제형 벌크를 밤새 2 내지 8℃에서 자기 교반하는 단계를 포함하며,

단계 (a)의 포르말린 불활화는 포스페이트 완충액의 존재 하에 수행되지 않는다.

본 발명의 제1 구현예에서, 포름알데하이드 불활화시 사용되는 완충액은 TRIS, TBS, MOPS, HEPES 및 중탄산염 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

제1 구현예에 대한 바람직한 측면에서, 포름알데하이드 불활화는, 30mM, 40mM 및 50mM로부터 선택되는 농도, 바람직하게는 40mM 농도를 가지며; pH가 6.8, 6.9, 7, 7.1 및 7.2로부터 선택되고, 바람직하게는 6.8 내지 7.2인, TRIS 완충액 또는 TR1S 완충화된 염수의 존재 중에서 이루어질 수 있으며, 이 불활화에 임의의 포스페이트 완충액은 사용되지 않는다.

본 발명에 대한 제2 구현예에서, 포르말린 불활화된 sIPV의 흡착은, 1.5 mg/dose, 1.8 mg/dose, 2.2 mg/dose로부터 선택되는 농도, 바람직하게는 2 mg/dose 내지 2.4 mg/dose의 농도를 가지며; pH가 6.2, 6.3, 6.4 및 6.5로부터 선택되며, 바람직하게는 6.5인, 수산화알루미늄 상에서 행해질 수 있다.

본 발명의 제3 구현예에서, 개선된 포르말린 불활화 및 수산화알루미늄 흡착 방법은, 불활화 이후의 D-항원 회수율 50% 내지 80% 및 수산화알루미늄 상에서 흡착율% 85% 내지 99%를 달성할 수 있다.

제3 구현예에 대한 일 측면에서, 본 발명은 개선된 포르말린 불활화 및 수산화알루미늄 흡착 방법을 제공하며, 이로써 40DU-8DU-32DU인 표준 용량과 비교해, Sabin 타입 I의 8배 이상 용량 감소, Sabin 타입 III의 3배 이상 용량 감소가 달성된다.

제2 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 백신 조성물을 제조하는, 개선된 포름알데하이드 불활화 및 수산화알루미늄 흡착 방법을 제공한다: i) 5 이상의 D-항원 단위 (D-antigen unit) 용량의 타입1 불활화 폴리오바이러스, ii) 8 이상의 D-항원 단위 용량의 타입 2 불활화 폴리오바이러스, 및 iii) 10 이상의 D-항원 단위 용량의 타입 3 불활화 폴리오바이러스.

본 발명의 제4 구현예에서, 알루미늄 염 보강제는, 농도가 1.5mg/0.5ml dose 내지 2.5mg/0.5ml dose이고, 바람직하게는 2.100mg/0.5ml dose 내지 2.4mg/0.5ml dose이고; pH가 약 6.5인, 수산화알루미늄이다.

제4 구현예에 대한 일 측면에서, 3가 백신 (타입 1, 2 및 3)내 알루미늄의 총량은, 타입 1의 경우 Al³⁺　400 ㎍ 이상, 타입 2의 경우 Al³⁺　200 ㎍ 이상, 타입 3의 경우 Al³⁺　200 ㎍ 이상을 특징으로 하는, 800 내지 1000 ㎍이고, 바람직하게는 800 ㎍ Al³ ⁺/0.5 mL dose이다.

다른 측면에서, 저용량 폴리오 바이러스 백신 조성물은 타입 1과 타입 3으로 구성되고, 타입 2는 결여되어 있으며, 투여 부피 (dose volume)는 0.1 내지 0.4 ml이다.

본 발명의 방법에 의해 제조되는 저용량 백신 조성물은, i) 항원이 sIPV 타입 1, 또는 sIPV 타입 2, 또는 sIPV 타입 3, 또는 sIPV 타입 1 및 타입 2, 또는 sIPV 타입 1 및 타입 3, 또는 sIPV 타입 2 및 타입 3, 또는 sIPV 타입 1, 타입 2 및 타입 3으로 구성될 수 있는 "Standalone SIPV", 또는 ii) "sIPV를 포함하는 조합 백신"으로서, 조합 백신에서 비-IPV 항원이 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 백일해 전세포 항원(들), 백일해 비-세포성 항원 (들), B형 간염 바이러스의 표면 항원, 용혈성 B형 인플루엔자 항원(들), 수막구균 (Neisseria meningitidis)의 A 항원(들), 수막구균의 C 항원(들), 수막구균의 W-135 항원(들), 수막구균의 Y 항원(들), 수막구균의 X 항원(들), 수막구균의 B bleb 또는 정제 항원(들), A형 간염 바이러스의 항원(들), 살모넬라 티피 (Salmonella typhi)의 항원(들), 폐렴구균 (Streptococcus pneumoniae)의 항원(들)로부터 선택될 수 있으나 이들로 한정되지 않는, 조합 백신일 수 있다.

비-IPV 항원(들)은 수산화알루미늄과 같은 알루미늄 염, 인산알루미늄과 같은 알루미늄 염 상에, 또는 수산화알루미늄 및 인산알루미늄의 혼합물 상에 흡착되거나, 또는 흡착되지 않을 수 있다.

폴리오바이러스는 세포 배양으로 배양될 수 있다. 세포 배양물은 VERO 세포주 또는 PMKC일 수 있으며, 이는 원숭이 신장으로부터 유래된 불멸 세포주 (continuous cell line)이다. VERO 세포는 편리하게는 마이크로캐리어에서 배양될 수 있다. 배양 후, 초미세여과, 희석여과 (diafiltration) 및 크로마토그래피 등의 기법을 이용해 비리온을 정제할 수 있다. 바이러스는, 환자에 투여하기 전에, 불활화되어야 하며, 이는 포름알데하이드 처리에 의해 달성될 수 있다.

조성물은 바이얼 안에 든 형태로 제공되거나, 또는 시린지에 미리 충진된 형태로 제공될 수 있다. 시린지는 바늘과 함께 또는 바늘없이 제공될 수 있다. 시린지는 조성물을 1회 용량으로 함유하겠지만, 바이얼은 1회 용량 또는 다회 용량 (예, 2회분)을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 용량은 인간에 대한 것이다. 또 다른 구현예에서, 용량은 성인, 청소년, 유아, 신생아 또는 1살 미만의 아기에 대한 것이며, 주입에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 백신은 단위 용량 형태 (unit dose form) 또는 다회 용량 형태 (예, 2회분)로 포장될 수 있다. 다회 용량 조성물은 2회분, 5회분 및 10회분으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 다회 용량 형태의 경우, 바이얼은 사전 충전된 시린지가 바람직하다. 유효 투여량의 부피는 통례적으로 정해질 수 있지만, 인간에 대한 전형적인 주사용 조성물의 용량의 경우 부피는 0.5 mL이다.

실시예:

실시예 1

Sabin IPV ( sIPV )의 제조

1) 접선 유동 여과 (Tangential flow filtration, TFF):

청징 처리된 회수 풀 (clarified harvest pool)을 100 Kda 카세트 (0.5 m²)가 장착된 접선 유도 여과 시스템을 사용해 10X로 농축한 다음 포스페이트 완충액 (40 mM, pH: 7.0)을 사용해 회수물 부피의 3배 부피로 희석여과하였다.

2) 컬럼 크로마토그래피:

이온 교환 크로마토그래피 (IEC)로 정제를 수행하였다. 10X TFF 농축물을 Akta explorer (GE Healthcare)를 이용하여 컬럼 xk-26에 충진된 AE 세파로즈 패스트 플로우 (약-음이온 교환기)를 통과시켰다. 음으로 하전된 불순물은 컬럼에 결합시키고, 폴리오 바이러스는 포스페이트 완충액 40mM과 함께 플로우 스루로 수집하였다.

3) TRIS 완충액 교환:

매우 번거러운 불활화 공정 (13일)에서 항원의 소실을 최소화하기 위해, 정제된 바이러스 풀을 포스페이트 완충액에서 TRIS 완충액 (40 mM, pH:)으로 완충액을 교체하였다.

7) TFF 시스템 (100 KDa, 0.1 m²) 사용. 정제된 바이러스 풀을 TRIS 완충액 3배 부피로 교환하였다.

실시예 2

A) sIPV의 불활화

0.5% 글리신이 첨가된 10X 농축 M-199를 첨가하여, 최종 농도 1X로 만들었다. 일정하게 혼합하면서 불활화제 포르말린 (0.025%)을 정제된 바이러스 벌크에 첨가하였다. 불활화는 37℃에서 수행하면서 13일간 연속 교반하였으며, 7일째 및 13일째에 0.22 μ에서 여과하였다.

B) TRIS 완충액 및 포스페이트 완충액에서의 sIPV의 불활화

0.025% 포름알데하이드를 사용해 13일간 37℃에서 불활화하였다.

표 1: D-항원 함량, TRSI 완충액 및 포스페이트 완충액의 존재 하에 포르말린 불활화

	D-항원 함량(불활화시 40mM 포스페이트 완충액)	D-항원 함량(불활화시 40mM Tris 완충액)
타입 1	52.70 DU/ml	408.19 DU/ml
타입 2	22.63	180.20
타입 3	4.21	21.50

포름알데하이드 불활화 방법을 특히 포스페이트 완충액의 존재 하에 수행하였을 때, Sabin 타입 1에서 D-항원의 현저한 소실이 관찰되었다. 반면, Tris 완충액 존재 하에 포름알데하이드 불활화를 수행한 경우에는 D-항원의 소실은 최소화되는 것으로 확인되었다.

표 2: 불활화시 사용된 여러가지 농도의 Tris 완충액

	30 mM	40 mM	50 mM
타입 1	500 DU/ml	576.80 DU/ml	585 DU/ml
타입 2	140 DU/ml	165.16 DU/ml	155 DU/ml
타입 3	16 DU/ml	21.17 DU/ml	19 DU/ml

40 mM 농도의 TRIS 완충액은 sIPV 1, 2 및 3의 D 항원 함량 보존 측면에서 가장 효과적인 것으로 확인되었다.

C) ELISA에 의한 D-항원 함량 측정

1일: 플레이트 코팅:

1. 특이 보바인 항-폴리오 100 ㎕를 각 웰에 PBS 중에 파이펫으로 주입하였다.

2. 마이크로타이터 플레이트를 밀봉하여, 실온에서 밤새 인큐베이션하였다.

2일: 차단:

1. 플레이트를 3번 세척하였다 (세척/희석 완충액 - 0.05% 트윈 20/1x PBS).

2. 차단 완충액 300 ㎕ (1% BSA/PBS)을 웰마다 파이펫으로 주입하였다.

3. 플레이트를 밀봉하여 45분간 37±1 ℃에서 인큐베이션하였다.

샘플 첨가:

1. 플레이트를 3번 세척하였다.

2. 샘플 희석물 100 ㎕를 A줄 웰을 제외한 모든 웰에 넣었다.

3. 표준물질 100 ㎕를 2번 및 3번 열의 처음 2개의 웰에 첨가하였다.

4. 샘플 100 ㎕를 4-12번 열의 처음 2개의 웰에 첨가하였다.

5. 샘플을 적절한 농도로 미리 희석하였다.

6. 샘플 희석물 100 ㎕를 1번 열의 처음 2개의 웰에 첨가하였다.

7. 각 웰에서 100 ㎕를 취하여 동일 열의 다음 웰로 옮기고 마지막 웰에서는 100 ㎕를 버림으로써, 열에서 옆으로 연속 2배 희석을 수행하였다.

8. 37℃에서 2시간 인큐베이션하였다.

9. 플레이트를 밤새 4℃에서 보관하였다.

3일: 단일클론 항체 첨가:

1. 플레이트를 3번 세척하였다.

2. 희석한 (1:240) 타입 특이 단일클론 항체 100 ㎕를 첨가하였다.

3. 플레이트를 밀봉하여, 37℃에서 2시간 인큐베이션하였다.

접합체:

1. 플레이트를 3번 세척하였다.

2. 희석한 접합체 (타입 1 - 1:2400, 타입 2 - 1:1500, 타입 3 - 1:4800) 100 ㎕를 첨가하였다.

3. 플레이트를 밀봉하여, 37℃에서 1시간 인큐베이션하였다.

기질 첨가:

1. TMB 기질 100 ㎕를 모든 웰에 첨가하였다.

2. 혼합물을 10분간 실온에서 인큐베이션하였다.

3. 2M H₂SO₄ 100 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시켰다.

4. 플레이트를 450/630 nm에서 판독하였다.

5. D 항원 농도를 KC4 소프트웨어로 계산하였다.

실시예 3

sIPV 흡착 :

1. 자동멸균된 Al(OH)₃ 및 AlPO₄의 1% 원액을 제형의 제조에 사용하였다.

2. Al(OH)₃/AlPO₄를 적절한 부피로 취하여 100 ml 유리병에서 필수 알럼 농도로 만들었다.

3. 불활화된 폴리오 바이러스 벌크와 기지의 D-Ag 단위를 첨가하고, 희석제로 부피를 적정하였다.

4. 최종 제형의 pH를 1 N HCl/NaOH를 사용해 6.5로 적정하였다.

5. 제형 벌크를 자기 교반기 위에서 밤새 2 - 8℃ 하에 두었다.

실시예 4

프리포뮬레이션 연구 (p reformulation study)

pH 변동에 따른 크기 및 제타 전위를 체크하기 위해, 0.9% 염수 및 WFI 중에 여러가지 농도로 Al(OH)₃& AlPO₄를 준비하였다.

AlPO₄의 제타 전위는 WFI 뿐만 아니라 염수 중에서 pH의 5 -> 7.5 증가에 따라 감소 (음성도)되는 것으로 관찰되었다 (도 1 및 2 참조).

반면, 염수 중의 Al(OH)₃ 제타 전위는 pH 및 Al(OH)₃ 염 농도와는 독립적으로 일정하게 유지되었다 (도 3 및 4 참조)

실시예 5

알럼 포스페이트 및 알럼 하이드록사이드 상에서의 sIPV 흡착 실험

표 3: 알럼 (알럼 포스페이트 및 알럼 하이드록사이드) 상에서의 Sabin 타입 1, 2 & 3 (역가 (titer) 10^6.0/dose) 흡착

	샘플	역가 (/dose)	바이러스 입자 (K)	SUP 중의 프리%	겔 상 흡착율 %
타입 1, Al(OH) ₃	대조군	5.45	284	NA
	Al⁺⁺⁺ 125 ㎍/dose	4.15	14	4.98	95.02
	Al⁺⁺⁺ 250 ㎍/dose	3.85	7	2.49	97.51
	Al⁺⁺⁺ 500 ㎍/dose	3.8	6.3	2.24	97.78
타입 1, AlPO ₄	대조군	5.84	691	NA
	Al⁺⁺⁺ 125 ㎍/dose	3.49	3	0.43	99.57
	Al⁺⁺⁺ 250 ㎍/dose	3.09	1.2	0.17	99.83
	Al⁺⁺⁺ 500 ㎍/dose	2.94	0.87	0.12	99.87
타입 2, Al(OH) ₃	대조군	5.49	309	NA
	Al⁺⁺⁺ 125 ㎍/dose	3.59	3.89	1.25	98.75
	Al⁺⁺⁺ 250 ㎍/dose	3.49	3.09	1	99
	Al⁺⁺⁺ 500 ㎍/dose	3.49	3.09	1	99
타입 2, AlPO ₄	대조군	5.49	309	NA
	Al⁺⁺⁺ 125 ㎍/dose	3.15	1.41	0.45	99.5
	Al⁺⁺⁺ 250 ㎍/dose	3.09	1.23	0.39	99.6
	Al⁺⁺⁺ 500 ㎍/dose	3.09	1.23	0.39	99.6
타입 3, Al(OH) ₃	대조군	5.59	389	NA
	Al⁺⁺⁺ 125 ㎍/dose	4.14	13.8	3.54	96.47
	Al⁺⁺⁺ 250 ㎍/dose	3.94	8.7	2.23	97.77
	Al⁺⁺⁺ 500 ㎍/dose	3.54	3.4	0.87	99.13
타입 3, AlPO ₄	대조군	5.59	389	NA
	Al⁺⁺⁺ 125 ㎍/dose	5.34	218	56.04	43.96
	Al⁺⁺⁺ 250 ㎍/dose	5.24	173	44.47	55.53
	Al⁺⁺⁺ 500 ㎍/dose	5.16	144	37.01	62.9

Sabin 폴리오 바이러스 타입 3는 인산알루미늄 [AlPO₄]에 50 - 60%의 흡착율을 나타내는 반면, Sabin 폴리오 바이러스 타입 3는 Al(OH)₃에는 90% 이상의 흡착율을 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서, 알럼 하이드록사이드가 알럼 포스페이트에 비해 Sabin 타입 1, 2 및 3의 흡착에 더 효과적인 것으로 확인되었다.

실시예 6

알럼 흡착된 sIPV의 면역원성 실험

보강제 첨가된 sIPV의 랫에서의 면역 반응 (혈청 중화 검사)을 체크하기 위해, SNT 검사를 수행하였다. 혈청을 분리하여, 타입 특이 폴리오바이러스에 대한 중화 항체의 존재를 검사하는데 사용하였다. 대조군 혈청은 검사를 검증하기 위해 사용하였다. 또한, 바이러스 백-타이트레이션도 수행하여 첨가된 챌린지 바이러스 입자의 수를 구하였다.

동물 모델: Wistar 랫 (8주령, 약 200 gm) 수컷 50% 및 암컷 50%/그룹.

접종 경로: 근육내

부피: 0.5 ml

채혈: 21일째

채혈 부위: 안와정맥총 (Retro-Orbital plexus)

표 4: 타입 1

랫 번호	그룹 1		그룹 2		그룹 3		그룹 4		그룹 5		그룹 6		그룹 7		그룹 15
	Comm.IPV		5DU 1.15mgOH		2.5DU 1.15mgOH		1DU 1.15mgOH		5DU 1.8mgPO4		2.5DU 1.8mgPO4		1DU 1.8mgPO		-ve 대조군
	SNT +ve	혈청 역가	SNT	혈청 역가	SNT	혈청 역가	SNT	혈청 역가	SNT	혈청 역가	SNT +ve	혈청 역가	SNT	혈청 역가	SNT	혈청 역가
1	1	(1:2)	8	(1:256)	1	(1:2)	4	(1:16)	5	(1:32)	5	(1:32)	2	(1:4)	0	(<1:2)
2	1	(1:2)	5	1:32)	1	(1:2)	7	(1:128)	8	(1:256)	4	(1:16)	1	(1:2)	0	(<1:2)
3	0	(<1:2)	7	(1:128)	3	(1:8)	0	(<1:2)	4	(1:16)	6	(1:64)	0	(<1:2)	0	(<1:2)
4	0	(<1:2)	11	(1:2048)	2	(1:4)	2	(1:4)	1	(1:2)	5	(1:32)	0	(<1:2)	0	(<1:2)
5	7	(1:128)	3	(1:8)	7	(1:128)	5	(1:32)	6	(1:64)	4	(1:16)	1	(1:2)	0	(<1:2)
6	4	(1:16)	7	(1:128)	7	(1:128)	1	(1:2)	5	(1:32)	6	(1:64)	3	(1:8)	0	(<1:2)
7	3	(1:8)	5	(1:32)	4	(1:16)	1	(1:2)	8	(1:256)	7	(1:128)	0	(<1:2)	0	(<1:2)
8	1	(1:2)	7	(1:128)	3	(1:8)	2	(1:4)	6	(1:64)	0	(<1:2)	0	(<1:2)	0	(<1:2)
9	3	(1:8)	8	(1:256)	2	(1:4)	3	(1:8)	8	(1:256)	4	(1:16)	4	(1:16)	0	(<1:2)
10	3	(1:8)	7	(1:128)	4	(1:16)	5	(1:32)	6	(1:64)	2	(1:4)	2	(1:4)	0	(<1:2)

놀랍게도, 5 DU/dose의 알럼 하이드록사이드 보강된 타입 1 Sabin IPV는, 40DU/dose의 Salk IPV 백신과 5 DU/dose의 알럼 포스페이트 5 보강된 Sabin IPV와 비교해, 양호한 혈청전환을 제공하는 것으로 확인되었다.

표 5: 타입 2

랫 번호	그룹 1		그룹 2		그룹 3
	Al(OH) ₃ 보강됨
	4DU (0.6mgOH)		8DU (0.6mgOH)		16DU (0.6mgOH)
	SNT +ve	혈청 역가	SNT +ve	혈청 역가	SNT +ve	혈청 역가
1	3	(1:8)	4	(1:16)	7	(1:128)
2	4	(1:16)	6	(1:64)	5	(1:32)
3	0	(<1:2)	3	(1:8)	5	(1:32)
4	3	(1:8)	4	(1:16)	6	(1:64)
5	5	(1:32)	7	(1:128)	6	(1:64)
6	6	(1:64)	4	(1:16)	9	(1:512)
7	4	(1:16)	7	(1:128)	4	(1:16)
8	5	(1:32)	3	(1:8)	8	(1:256)
9	7	(1:128)	8	(1:256)	8	(1:256)
10	5	(1:32)	3	(1:8)	8	(1:256)

보강제가 첨가된 8 DU/dose의 타입 2 sIPV는 8 DU/dose의 Salk IPV 백신과 비교해 등가의 혈청 전환을 제공하였다.

표 6: 타입 3

랫 번호	그룹 1		그룹 2		그룹 3
	Al(OH) ₃ 보강됨
	10DU (0.6mgOH)		5DU (0.6mgOH)		2.5DU (0.6mgOH)
	SNT +ve	혈청 역가	SNT +ve	혈청 역가	SNT +ve	혈청 역가
1	3	(1:8)	2	(1:4)	0	(<1:2)
2	0	(<1:2)	5	(1:32)	1	(1:2)
3	2	(1:4)	3	(1:8)	1	(1:2)
4	4	(1:16)	2	(1:4)	0	(<1:2)
5	4	(1:16)	2	(1:4)	1	(1:2)
6	4	(1:16)	1	(1:2)	1	(1:2)
7	9	(1:512)	0	(<1:2)	2	(1:4)
8	7	(1:128)	2	(1:4)	2	(1:4)
9	1	(1:2)	0	(<1:2)	1	(1:2)
10	5	(1:32)	7	(1:128)	1	(1:2)

보강제가 첨가된 10 DU/dose의 타입 3 sIPV는 32 DU/dose의 Salk IPV 백신과 비교해 등가의 혈청 전환을 제공하는 것으로 확인되었다.

표 7: 실험 후 개개 타입 1, 2 & 3 Sabin에서 관찰된 최대 용량 감소

sIPV	표준 용량	*SIIL 용량	용량 감소
타입 1	40DU	5DU	~8배
타입 2	8DU	8DU	동일
타입 3	32DU	10DU	~3배

SIIL: Serum Institute of India In House dose reduced IPV preparation.

본원의 개념이 적용될 수 있는 많은 가능한 구현예들에 비추어, 예시된 구현예들은 본 발명의 바람직한 예에 불과한 것으로 간주되며, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 여겨져서는 안된다. 오히려, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해 정의된다. 따라서, 본 발명자들은 첨부된 청구항의 범위 및 사상내에 포함되는 모든 것들을 본 발명으로서 청구한다.

Claims

폴리오바이러스 입자를 포함하는 백신 조성물의 제조 방법으로서,
a) 포스페이트 완충액의 존재하에 폴리오바이러스 풀을 정제하여, 포스페이트 완충액을 포함하는 정제된 폴리오바이러스 풀을 수집하는 단계;
b) 상기 정제된 폴리오바이러스 풀에 포함된 포스페이트 완충액을 30mM 내지 50mM, 또는 40mM 의 농도를 가지는 TRIS, TBS, MOPS 또는 HEPES 완충액으로 교체하는 단계;
c) 글리신이 함유된 M-199 매질을 첨가하는 단계;
d) 0.025% 포름알데하이드를 37℃ 에서 5 내지 13일간 사용하여 폴리오바이러스 입자의 포르말린 불활화를 수행하는 단계; 및
e) 상기 불활화된 폴리오바이러스 입자를 알루미늄 염 보강제 상에서 흡착율 95% 이상으로 흡착시키는 단계를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 TRIS, TBS, MOPS 또는 HEPES 완충액이, pH 6.8 내지 7.2 의 pH 를 가지는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
단계 (e)의 상기 알루미늄 염 보강제가 수산화알루미늄, 인산알루미늄 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는, 방법.
제3항에 있어서,
단계 (e)의 상기 알루미늄 염 보강제가, 농도 1.5mg/0.5ml dose 내지 2.5mg/0.5ml dose의 농도를 가지는 수산화알루미늄인, 방법.
제4항에 있어서,
상기 백신 조성물 내 알루미늄의 총량이 0.8 - 1.0mg Al³⁺/0.5mL dose, 또는 0.8mg Al³⁺/0.5mL dose인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 폴리오바이러스 입자가 Sabin 혈청형 1, 2 및 3의 폴리오바이러스를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 폴리오바이러스 입자가 Salk 혈청형 IPV 타입 1 (Mahoney 주), IPV 타입 2 (MEF-1 주) 및 IPV 타입 3 (Saukett 주)의 폴리오바이러스를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서,
백신 조성물이 저용량 (dose reduced) 불활화 소아마비 백신 (IPV) 조성물이고, 상기 저용량이 표준 용량 40 DU (D-항원 단위)와 비교해 타입 1 폴리오바이러스의 8배 이상 용량 감소, 또는 표준용량 32 DU와 비교해 타입 3 폴리오바이러스의 3배 이상 용량 감소인, 방법.
제8항에 있어서,
상기 저용량 불활화 소아마비 백신 조성물이 표준용량 32 DU 대신 6 내지 10 DU 용량의 불활화된 타입 3 폴리오바이러스를 포함하는 것인, 방법.
제8항에 있어서,
저용량 불활화 소아마비 백신 조성물의 제조 방법이,
a) 포스페이트 완충액의 존재하에 폴리오바이러스 풀을 정제하여, 포스페이트 완충액을 포함하는 정제된 폴리오바이러스 풀을 수집하는 단계;
b) 상기 정제된 폴리오바이러스 풀에 포함된 포스페이트 완충액을 30mM 내지 50mM, 또는 40mM 의 농도를 가지는 TRIS 완충액으로 교체하는 단계;
c) 글리신이 함유된 M-199 매질을 첨가하는 단계;
d) 0.025% 포름알데하이드를 37℃에서 5 내지 13일간 사용하여 폴리오바이러스를 불활화하는 단계; 및
e) 상기 불활화된 폴리오바이러스 입자를 1.5mg/0.5ml dose 내지 2.5mg/0.5ml dose 의 농도를 가지는 수산화알루미늄 보강제 상에서 타입 1 폴리오바이러스, 타입 2 폴리오바이러스 및 타입 3 폴리오바이러스에 대한 흡착율 95% 이상으로 흡착시키는 단계를 포함하는, 방법.
제10항에 있어서,
저용량 불활화 소아마비 백신 조성물이 타입 2 폴리오바이러스를 포함하지 않는, 방법.
제10항에 있어서,
상기 백신 조성물이 병원체 유래의 하나 이상의 항원을 포함하고, 상기 병원체가 용혈성 B형 인플루엔자, 네이세리아 메닝기티디스 (Neisseria meningitidis) 타입 A, 네이세리아 메닝기티디스 타입 C, 네이세리아 메닝기티디스 타입 W, 네이세리아 메닝기티디스 타입 Y, 네이세리아 메닝기티디스 타입 X, 네이세리아 메닝기티디스 타입 B, 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae), 살모넬라 티피 (Salmonella typhi), A형 간염, B형 간염, 디프테리아 톡소이드 (diphtheria toxoid), 파상풍 톡소이드 (tetanus toxoid), 전체 세포 백일해 (whole cell pertussis), 또는 무세포성 백일해 (acellular pertussis)인, 방법.
제12항에 있어서,
상기 백신 조성물이 저용량 IPV, 디프테리아 톡소이드 (diphtheria toxoid), 파상풍 톡소이드 (tetanus toxoid), 전체 세포 백일해 (whole cell pertussis), 용혈성 B형 인플루엔자, 및 B형 간염 바이러스의 표면 항원으로 구성된 6가 조합 백신인, 방법.
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