MXPA99000184A - Vacunas multivalentes de dtp-polio - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una composición de vacuna multicomponente que comprende componentes de vacuna acelular de pertussis, toxoide diftérico, toxoide tetánico y poliovirus inactivado. La composición también puede contener un conjugado de un polisacárido capsular de Haemophilus influenzae tipo b y toxoide tetánico o toxoide diftérico, que pueden reconstituirse a partir de un estado liofilizado mediante los otros componentes de la vacuna. La administración de la vacuna de componentes múltiples da por resultado la no disminución de inmunogenicidad de cualquiera de los componentes como resultado de la interferencia por otros componentes de la vacuna.

Description

VACUNAS UI_TIVAI_EN-?S DE DTP-POLIO CAMPO DE L? INVENCIÓN La presente invención se relaciona con vacunas multivalentes, particularmente, con vacunas multivalentes para administración pediátrica.

REFERENCIA CON OKA SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud es una continuación en parte de la Solicitud de Patente copendiente de los Estados Unidos No. 08/501,7.3, pi eontadu eJ l? de julio de 1 -05, la _-n.il es en si misma una continuación en parte de la Solicitud de Patente cupetidicnta de los Estados Unidos No. 08/?3, 646, presentada el 4 de mayo de 1935.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La tosferina es una infección grave y muy contagiosa de las vias respiratorias superiores, provocada por Bo L d L I l a pevt ussis . La Organización Mundial de la Salud estima que existen 60 millones de casos de tosferina al año y de 0.5 a 1 millón de muertes asociadas (referencia 1) . En toda esta especificación, se "hará referencia a diversas referencias para describir en forma más completa el estado de la técnica al que pertenece esta invención. La información bibliográfica completa de cada cita se encuentra al final de la especificación, que está inmediatamente después de las reivindicaciones. Las expocisi onop de estas referencias se consideran incorporadas a la presente exposición. En poblaciones no vacunadas, en niños menores de 5 años se ha observado una tasa elevada de incidencia de tosferina de hasta 80% (referencia 2). Aunque la tosferina o p rtusis generalmente está considerada como una enfermedad infantil, existo un,] Trociente evidencia de enfermedad clínica y asintomática en adolescentes y en adultos (referencias 3, 4 y 5) . La introducción de vacunas de célula completa, compuestas de organismos de B . pert ussis, químicamente inactivados y térmicamente inactivados data de los años '40 y fue la responsable de una drástica _ reducción en la incidencia de la tosferina provocada por B. pertussis. Las tasas de el J cacia dc las vacunas de célula completa se han estimado en hasta 95%, dependiendo de la definición del caso (reLuiuiiciü 6) . En tanto que la inl?cción por B. pertussis confiere inmunidad para toda la vida, acxrualmente existe evidencia creciente de una mengua en la protección después de la inmunización con vacunas de célula completa (referencia 3). Diversos reportes que citan una relación entre la vacunación de célula completa contra la tosferina y reactogenicidad y graves efectos laterales, condujeron a una declinación en la aceptación de la vacuna y en los consecuentes efectos epidémicos renovados (referencia 7). Más recientemente se han desarrollado vacunas contra pertusis de componente definido.

Antigenos para vacunas anfci-petusis definidas . Se han desarrollado diversas vacunas acelulares contra pertusis que incluyen antigenos de Bordetella pertussis, Toxina de Portusis (PT), hemuglut?nina filamentosa (FHA), proteina de membrana externa de 69 kDa (pertactina) y aglutinógenos fimbria los (ver Cundió 1 más adelante. Los cuadros aparecen al final de la especificación) .

Toxina pertúsica La toxina pertúsica es una exotoxina miembro de la familia ?/D de las toxinas bacterianas con actividad ADP-ribosiltransferasa (referencia 8). La entidad A de estas toxinas exhibe actividad ?DP-ribosil transierasa y la porción B media la unión de la toxina a los receptores de la célula hospedera y la translocación de A hacia su sitio de acción. La PT también facilita la adherencia de B. pertussis a las células epiteliales ciliadas (referencia 9) y también desempeña un papel en la invasión de los macrófagos pot. H. pertussis (referencia 10) .

Todas las vacunas anti-pertúsis acelulares han incluido a la PT, lo que ha sido propuesto como un importante l.u-lor de virulencia y de antiqeno protector (referencias 11, 12) . La infección natural con B. pertussis, genera tanto respuestas humorales como respuestas mediadas por célula ante la presencia de PT (referencias 13 a 17) . Los lactantes tienen anticuerpos anti-PT derivados en forma transplacentapa (referencias 16, 18) y el ...ilustro humano que contiene anticueipos anti-PT fue efectivo en la protección pasiva de ratones contra la infección por aerosol (referencia 19). Una íespuesta inmunitaria mediada por célula (CMI) hacia las subunidades de PT se ha demostrado después de la inmunización con una vacuna acelular (referencia 20) y se generó una respuesta CMI ante PT después de la vacunación de célula completa (referencia 13). La PT químicamente inactivada en las vacunas dc célula completa o en las vacunas componentes, es un elemento protector en modelos animales y en humanos (referencia 21). Adicionalmente, los anticuerpos monoclonales específicos para la subunidad SI protegen contra la infección por B. pert ussis (referencias 22 y 23) .

Los principales efectos fisiopatológicos de la PT se deben a su actividad ADP-ribosiltransferasa. La PT cataliza la transferencia de la ADP-ribosa del NAD a la proteina de unión al nucleotido guanina G, , lo que altera de este modo al sistema regulatorio do la adoni 1 atoriclasa celular (referencia 24). La PT también evita la migración de los mar t o l ,?yos y los linfocitos hacia los sitios de inflamación e interfiere con la fagocitosis mediada por neutrófilos y la destrucción de las bacterias ( referencia 25). Se han utilizado varios ensayos ip vitro e in vivo para valorar la actividad enzimática del SI y/o de la PT, que incluyen la ADP-ribosilación de la transducina de bovino ( releí encia 26), ol ensayo de aglomeración de células ováricas de hámster chino (CHO) (referencia 27), la sensibilización a la histamina (referencia 28), la leucocitosis y la NAD glicohidrolasa. Cuando se expusieron a la PT, las células de CHO desarrollan una morfología aglomerada característica. Este fenómeno depende de la unión de la PT, y la subsecuente translocación y la actividad ADP-ribosiltransferasa de SI y, de este modo, el ensayo de aglomeración de células de CHO se utiliza ampliamente para probar la integridad y la toxicidad de las holotoxinas de _/"__.

Hemaglutinina Filamentosa La hemaglutinina filamentosa es un polipéptido de gran tamañi (220 kDa), no tóxico, que media la unión de B. pertussis a células ciliadas de las vias respir torias superiores durante la colonización bacteriana (referencias 9, 29). La infección natural induce anticuerpos anti-FHA e inmunidad mediada por células (referencias 13, 15, l7, 30 y 31). los _mt u uerpos anti-FHA se encuentran en el calostro humano y también se transmiten en forma transplacentapa (referencias 17, 18 y 19). La vacunación con vacunas anti-pertusis de célula completa o acelulares, genera anticuerpos anti-FHA y las vacunas acelulares que contienen FHA también inducen una respuesta CMI a la FHA (referencias 20, 32) . L i I I1? os un antigono protector en un modelo de sensibilización respiratoria de ratón después de la inmuní 7ac i on idiva o pasiva ( refei i nr-jns ?, 34) Sin embargo, la FHA sola no protege en el ensayo de potencia de sensibilización mtracerebral en ratón (referencia 28).

Proteína de la Membrana Externa de 69 kDa (Pertactina) . L i µtüLtind de 69kDa es una piotema de la membrana externa que originalmente fue identificada a partir de B . bionchiseptica (referencia 35). La proteina también es conocida como pertactina y P.69. Se muestra que es un antigeno protector contra B. bronchisep i ca y subsecuentemente se identifico tanto en B. pertussis como en B. para pertussis . La protema de 69kDa, se une directamente a las células eucarioticas (referencia 36) y la infección natural con B pertussis induce una respuesta humoral anti-P.69 (referencia 14) y la P.69 también induce una respuesta inmunitaria mediada por célula (referencias 17, 37, 38). L? vacunación con vacunas do célula rompí ota o con vacunas acelulares induce anticuerpos anti-P.69 (referencias 3-2, 39) y las vacunas acelulares inducen CMI a P.69 (referencia 39). La pertactina protege a los ratones contra la inoculación con B. pertussis en aerosol (referencia 40) y combinada con la FHA, protege en la prueba de sensibilización intracerebral contra 13. pert ussis (referencia 41) . La transferencia pasiva de anticuerpos anti-P.69 policlonales o monoclonales también protege a los ratones contra la inoculación en aerosol (referencia 42).

Aglutinógenos Los serotipos de B . pertussis están definidos por sus fimbrias de aglutinación. La OMS recomienda que las vacunas de célula completa incluyan los tipos 1, 2 y 3 de aglutinógenos (Aggs), ya que no proporcionan protección cruzada (referencia 43) . El Agg 1 es no fimbrial y se encuentra en todas las cepas de B. pertussis, en tanto que los serotipos 2 y 3 de Aggs son fimbriales. La infección natural o inmunización con vacunas de célula completa o acelulares induce anticuerpos anti-Agg (referencias 15, 32) . Puede generarse una respuesta inmunitaria mediada por células especifica en ratones mediante Agg 2 y Agg 3 después de la infección por aerosol (referencia 1 1 ) . Los Aggs 2 y 3 protegen a los ratones contra la inoculación respi i iloi i i y el calostro humano quo lonli iio anti-aglutinogenos también protegerá en este ensayo (referencias 19, 44, 45) .

Vacunas Acelulares Contra pertusis La primer vacuna acelular contra pertusis desarrollad i lue la vacuna de dos componentes P'I i THA (JNIH 6) de Sato et al. (referencia 46). Esta vacuna se preparó mediante la co-purif icación de antigenos de PT y FHA a partir del cultivo del sobrenadante de B. pertussis, cepa Tohama, seguida de la formación de toxoide en formalina. Se han utilizado vacunas acelulares proveniente:-, de diversos fabricantes y de composiciones para inmunizar con éxito a niños japoneses en contra de la tosfenna desde 1981, resultando en una drástica disminución de la incidencia de la enfermedad (referencia 47) . La vacuna JNI11 6 y una vacuna de toxoide PT monocomponente (JNIH 7) se probaron en un gran ensayo clínico en Suecia en 1986. Los resultados iniciales indicaron una menor eficacia que la eficacia reportada de una vacuna de célula completa pero, los estudios de seguimiento han mostrado que es mas efectiva contra una enfermedad mas moderada diagnosticada mediante métodos serológicos (referencias 48, 49, 50, 51). Sin embargo, hubo evidencia de reversión de la toxicidad de PT inacfivacia con formal ina en estas vacunas. También se encontró que estas vacunas protegen contra mejor contra la enfermedad y no contra la infección. Actualmente están siendo evaluadas varias nuevas vacunas acelulares y vacunas componente contra pertusis, que incluyen combinaciones de PT, FHA, P.69 y/o aglutínógono.. y se listan en el Cuadro 1. So lian utilizado varias técnicas de desintoxicación química para la PT, incluyendo la inactivación con formalina (referencia 46), con glutaraldehido (referencia 52), con peróxido de hidrógeno (referencia 53) y con tetranitrometano (referencia 54) .

Tétanos El totanos es una iniección aguda provocada por Clostridium tetani . La enfermedad se caracteriza por graves y dolorosas contracciones musculares, acompañadas de hipersensibilidad, hiperreflexia y un aumento en la estimulación autonómica de la parte o partes del cuerpo afectadas. Los estímulos leves pueden provocar graves espasmos ~_iel músculo reflejo. Puede presentarse fiebre debido a un espasmo extremo del músculo. El tétanos puede generalizarse, afectando a la cara, cuello, abdomen y tronco o localizarse en una parte especifica del cuerpo (sitio de la lesión) . La afecación del músculo macetero de la cara resulta en el trismo que da origen a la clásica expresión- facial conocida como "risus sardonicus" (referencia 78). El C. tetani existe como un organismo no patogénico en el intestino de humanos y animales. El organismo también se encuentra en suelo contaminado con heces y uo o sobrevivir en el suelo .durante años como esporas infecciosas (referencia 79) . El totanos resulta del crecimiento anaeióbico del C. tetani y la producción de neurotoxina en heridas contaminadas. La infección es provocada por la introducción en el tejido de materiales contaminados por organismos o esporas. El escenario más común es la infección por medio de una lesión por penetración. Sin embargo, en muchos casos no es obtenible la historia de la lesión. La presencia de tejido necrótico o isquémico, facilita el crecimiento del bacilo (referencia 78) . La prevención de la infección es mediante la vacunación y mediante un buen cuidado de la herida, que incluye una limpieza cuidadosa y eliminación de los tejidos desvitalizado . A los individuos con heridas contaminadas y a quienes han abandonado la serie, debe suminirtrarse tanto la vacuna antitetánica como la inmunoglcbulina tetánica. El tratamiento del síndrome principalmente es de apoyo y puede incluir el apoyo respiratario, la administración de la antitoxina tetánica y una cuidadosa limpieza de las heridas infectadas. A pesar de los modernos cuidados médicos, las tasas de fatalidad de los casos, aun son tan elevadas como del 30 al 901 (referencia 79). Esto es particularmente cierto en los ancianos. La infección natural no siempre produce inmunidad ante una infección posterior. La prevención de la infección por medio de la vacunación es el método mas efectivo para controlar la enfermedad. Desde la introducción de la vacunación universal, el tétanos se ha vuelto muy raro en los países desarrollados. Los casos ocurren casi exclusivamente en individuos que no completaron su serie de vacunaciones o quienes no recibieron las dosis de refuerzo apropiadas. Los individuos deben recibir una dosis de refuerzo una vez cada diez años.

Difteria La difteria es una infección aguda provocada por la bacteria Corynebactepum diphtheriac . El principal sitio de infección son las vias respiratorias superiores (nariz, faringe, laringe y traquea) (referencia 80) . La lesión carnet oristlca, un resultado de la citotoxina bacteriana, son parches de pseudomembrana grisácea rodeada ^h por inflamación. Esto está acompañado por linfadenopatia cervical, hinchazón y edema de la garganta. En casos 5 graves, la hinchazón puede progresar hasta el punto de la obstrucción (difteria laringea) . Otras complicaciones incluyen miocarditis, efectos al sistema nervioso central (neuropatías cranianas, motoras y sensoriales, tales como la parálisis ascendente) y la trombocitopenia. Otras ^ 10 membranas mucosas pueden ser afectadas menos frecuentemente. La presentación clínica puede variar desde la infección asintomética a la infección multisistemas fulminante y l . muerte (referencia 79) . Las infecciones cutáneas y por heridas con difteria son comunes en los 15 trópicos y han sido frecuentemente reportadas en la población indigente de los Estados Unidos. El hombre es el ^ único reservorio del C. diphtheriae (referencia 79). Puede realizarse un diagnóstico de presunción a la observación clínica de las lesiones características 20 pero, debe confirmarse mediante el examen bacteriano de las lesiones. Si existe una fuerte sospecha clínica de difteria, inmediatamente debe iniciarse el tratamiento con antibióticos (penicilina o eritromicina) y la antitoxina diftérica, incluso si el diagnóstico no es confirmado. La 25 mortalidad aumenta mientras más se espere después del inicio de los síntomas clínicos (referencia 80). La tasa de fatalidad de los casos varía de cinco a diez por ciento, a pesar de los modernos cuidados médicos (referencia 79) y se presenta principalmente en los muy jóvenes y en los ancianos. La infección natural no siempre produce inmunidad contra una infección posterior (referencia 80) .

La transmisión es mediante el contacto directo con secreciones o descargas de un individuo infectado. Los individuos pueden contagiar mientras la bacteria se observe en las secreciones. Esto puede durar hasta cuatro semanas después de la infección. La transmisión también puede ocurrir con fomites [sic] infectados (referencia 79) . Se recomienda el estricto aislamiento de los casos. Los individuos raras veces pueden convertirse en portadores y esparcir los organismos hasta seis meses después de la infección. Los portadores no inmunizados deben ser vacunados rápidamente con la serie completa. El tratamiento con antibióticos elimina el transporte y la contagiosidad de los casos en 4 días (referencia 80).

Poliomielitis Las vacunas de poliovirus tanto inactivados (IPV) como vivos atenuados (OPV) han sido efectivas para controlar la poliomielitis en todo el mundo. Una vacuna DPT-IPV combinada esta actualmente autorizada en Europa y . en Canadá y en millones de niños por todo el mundo ha mostrado ser segura y efectiva.

Ha.emophilus influenzae tipo b Antes de la disponibilidad de vacunas efectivas, el Haemophilus mf l uenzae tipo b (Hib) fue la causa principal de infecciones de meningitis invasiva transportada por la sangre en niños jóvenes y fue la causa principal du meningitis durante los primeros 2 años de vida (referencia 81). Aproximadamente 10% de las víctimas de meningitis pot ll emopliil us influenzac murieron a pesar de los cuidados médicos. Las secuelas permanentes son comunes en los supervivientes. La inmunización contra ííaejnophiJus influenzae comenzó en Canadá en 1987 con una vacuna de polisacápdo (polirribosa ribitol fosfato [PR J del Haemoph lus inf luenzae tipo b) . Se logró una mejorada mmunogcnicidad en niños de 18 meses de edad y mayores con la introducción en 1988 de una vacuna que consiste de PRP conjugado con toxoide diftérico (PRP-D). Desde 1992 ha sido posible la inmunización de lactantes con la autorización de vacunas conjugadas de PRP inmunogénicas en lactantes menores a 1 año de edad (PRP conjugado con toxoide tet nico o PRP-T) . El uso de estas vacunas conjugadas de Haemophi l us ínf luenzae ha estado asociado a una drástica disminución en la incidencia de la infección invasiva con Ilaemophilus en Canadá y en otros lugares (referencia 82) . Dos estudios clínicos canadienses que involucraron acerca de 900 niños en Columbia Británica y en Alberta demostraron que la PRP-T liofilizada puede ser reconstituida con DPT (COMBIPACK) (referencia 83) o con DPT-Polio Adsorbida (PENTA™) (referencia 84) además del usual diluyente salino. Los estudios clínicos que involucraron a más de 100,000 niños en todo el mundo han demostrado la eficacia de la PRP-T liofilizada (ActHib,M) . Más del 90% obtuvieron niveles anti-PRP considerados como protectores (> 0.15 µg/ml) después de 3 dosis de PRP-T comenzando a los 2 meses o después de una sola dosis de PRP-T proporcionada después de los 12 meses de edad. La proporción en lograr los niveles indicativos de una protección a largo plazo (>1.0 µg/ml) varían del 70 al 100%, dependiendo del estudio. Millones de dosis de PRP-T se han vendido en Canadá desde 1992. La irrupción de casos de infección invasiva por haemophilus después de la vacunación con PRP-T, son raros y pueden estar asociados a enfermedades tales como la inmunodeficiencia (referencia 85) .

Vacunas de Combinación Aunque existen muchos beneficios reales y potenciales de vacunas que se combinan con antígenos para conferir protección contra múltiples patógenos, estas combinaciones pueden tener un efecto perjudicial sobre la inmunogenicidad de los componentes individuales. Las combinaciones de toxoides diftérico y tetánico con la vacuna anti-pertusis de célula completa ~~ (DTP) han estado disponible durante más de 50 años y la respuesta de los anticuerpos a la combinación es superior a la de los componentes individuales, quizás como resultado de un efecto adyuvante de la vacuna anti-pertusis de célula completa. Las combinaciones DTP que también incluyen a la vacuna de poliovirus inactivado están autorizadas en muchas jurisdicciones, aunque la respuesta del anticuerpo a los antigenos de µertusis puede ser disminuida mediante esta combinación (referencias 69 a 71). El efecto de combinar vacunas DTP con vacuna de conjugado de Hib ha sido variable. Los estudios con una DTP francesa y una PRPT demostraron una seguridad similar pero una disminución en la respuesta del anticuerpo a la PRP (referencias 72 a 73), en tanto que los estudios con una vacuna DTP canadiense y PRPT no mostraron efectos sobre la respuesta a la PRP sino que monoi u ng 1 ut inógonos de perlusis y un aumento on la sensibilidad en el sitio de inyección en comparación con el grupo de inmunización combinado (referencias 74, 75). Actualmente se están teniendo a disposición datos sobre el efecto de combinar vacunas APDT con la vacuna de conjugado Hib. En lactantes de dos meses de edad a los que se suministraron tres dosis de una vacuna acelular contra pertusis-difteria-tétanos (APDT) combinada con una vacuna de conjugado Hib (PRP-T), la respuesta del anticuerpo a la PRP fue significativamente menor que en el grupo al que se suministraron inyecciones separadas el mismo día (referencia 76) . Se reportaron resultados similares con otra vacuna acelular contra pertusis-dífteria-tétanos combinada con PRP-T suministrada durante las primeras tres dosis (referencia 77) . En contraste con otros estudios reportados, los niños inmunizados con la vacuna combinada tuvieron una superior respuesta de anticuerpo a PRP, difteria y a varios de los antígenos de pertusis cuando se compararon con niños a los que se suministro PRP en una visita separada. Pueden existir varias razones para la inmunogenícidad equivalente o mejor para estas vacunas cuando se -suministraron como una inyección combinada, e n comparación con la disminución en la inmunogenicidad reportada con otros productos. Todas las vacunas anti-pertusis acelulares y componentes no son idénticas en su contenido antigénico, método de formación del toxoide, del adyuvante o del conservador. Sin embargo, se ha reportado una disminución en la inmunogenicidad con vacunas anti-pertusis acelulares que contienen PT, FHA, y 69k ("referencia 77) y que contiene PT, FHA, 69K y fimbrias ( eferencia 76) . Se encontró que la vacuna APDT de cinco componentes examinada en este estudio tieno una eficacia protectora del 85% (Ejemplo 5) (95% Cl 81/89) en un ensayo clínico de fase III terminado recientemente en Suecia bajo los auspicios de los Institutos Nacionales de Salud (referencia 78 ) . Actualmente las vacunas de combinación comercialmente disponibles pueden no contener formulaciones apropiadas de los antígenos apropiados en las formas inmunogénicas apropiadas para lograr el nivel deseado de eficacia en una población humana susceptible a pertusis. Soria deseable proporcionar vacunas combinadas eficaces que comprenden componentes acelulares de pertusis que contienen cantidades relativas seleccionadas de antígenos seleccionados.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN _ La presente invención está dirigida hacia vacunas combinadas o vacunas multivalentes que contienen componentes de vacuna acelulares anti-pertusis y métodos para utilizarlas. De conformidad con un aspecto de la presente invención, se proporciona una composición inmunogénica multivalente para conferir protección a un hospedero contra las enfermedades provocadas por la infección con Bordetella pertussis, Clostridi um tetam , poliovirus y/o Haemophilus mf 'l uenzae , que comprende: (a) toxoide pertúsico, hemaglutinina filamentosa, pertactina y aglutinógenos en forma purificada, (b) toxoide tetánico, (c) toxoide diftérico, (d) virus de pollo inactivado y, opcionalmente, (e) un conjugado de una molécula portadora seleccionada del toxoide tetánico y del toxoide diftérico, con un polisacárido capsular de Haemophilus mf l uenzae tipo b. La composición inmunogénica puede ser formulada como una vacuna para la administración ni vi vo al hospedero, en donde los componentes individuales de la composición estén formulados de tal forma que la inmunogenicidad de los componentes individuales no se ve perjudicada por los otros componentes individuales de la composición. La composición inmunogénica puede comprender adicionalmente un adyuvante, particularmente hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio. Esta composición inmunogéníca puede contener de aproximadamente 5 a aproximadamente 30µg de nitrógeno del toxoide de pertusis, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30µg de nitrógeno de hemaglutinina filamentosa; de aproximadamente 3 a aproximadamente 15µg de nitrógeno de pertactina y de aproximadamente 1 a aproximadamente lOµg de nitrógeno de aglutinógenos. En una modalidad especifica, la composición inmunogénica puede comprender al toxoide de pertusis, hemaglutinina fimbrial, la proteína 69 kDa y aglutinógenos filamentosos de .Bordetella pertussis a una proporción en peso de aproximadamente 20:20:5:3, según "lo proporcionan aproximadamente 20µg de toxoide de perfusis, aproximadamente 20µg de hemaglutinina filamentosa, aproximadamente 5 µg de aglutinógenos fimbriales y aproximadamente 3 µg de la proteína de 59 Kda en una sola dosis humana. En otra modalidad específica, la vacuna puede comprender al toxoide de pertusis, hemaglutinina filamentosa, proteína de 69 kDa y aglutinógeno fimbrial de Bordetella pertussis en una proporción en peso de 10:5:5:3, según se proporciona mediante aproximadamente 10 µg de toxoide de pertusis, aproximadamente 5 µg de hemaglutinina filamentosa, aproximadamente 5 µg de aglutinógeno fimbrial y aproximadamente 3 µg de la proteína de 69 kDa en una sola dosis humana. En una modalidad de la composición inmunogénica proporcionada aquí, la vacuna contiene aproximadamente 15 Lfs de toxoide diftérico y aproximadamente 5 Lfs del toxoide tetánico. El poliovirus inactivado utilizado en la composición inmunogénica de la invención comprende generalmente una mezcla de los poliovirus inactivados de los tipos 1, 2 y 3. Esta mezcla de poliovirus inactivado tipo 1, 2 y 3, puede ser utilizada en las composiciones: de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 unidades de antígeno D del poliovirus tipo 1; de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 unidades de antígeno D del poliovirus tipo 2; de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 unidades de antígeno D del poliovirus tipo 3, en una sola dosis humana. En una formulación, estas mezclas de los tipos de poliovirus inactivado pueden comprender: aproximadamente 40 unidades de antígeno D del poliovirus tipo 1, aproximadamente 8 unidades de antígeno D del poliovirus tipo 2, aproximadamente 32 unidades de antígeno D del poliovirus tipo 3 en una sola dosis humana. El componente molecular del conjugado de la composición inmunogénica puede comprender un conjugado del toxoide tetánico o del toxoide diftérico y polirribosa ribitol fosfato (PRP) del Haemophil us influenzae tipo b.

Esta molécula conjugada puede ser suministrada en forma liofilizada, que es reconstituida para su administración mediante la combinación con otros componentes. La composición ífimunogénica puede contener al conjugado en una cantidad de aproximadamente 5 a aproximadamente 15µg del conjugado PRP a aproximadamente 15 a aproximadamente 35µg del toxoide tetánico, en una sola dosis humana. En una formulación, el conjugado se utiliza en una cantidad de aproximadamente 10 µg del conjugado PRP a aproximadamente 20 µg del toxoide tetánico. En estas modalidades particulares, las composiciones inmunog_nicas proporcionan un perfil de respuesta inmunitaria a cada uno de los antigenos de pertusis contenidos en la misma y el perfil de respuesta proporcionado por los componentes acelulares es substancialmente equivalente al producido por una vacuna de célula completa contra pertusis. En una modalidad preferida de esta invención, se proporciona una composición de vacuna multivalente que comprende, por dosis de 0.5 ml, 20µg del toxoide de pertusis, 20 µg de hemaglu inina 1 ilament osa ; 5µg de fimbrias 2 y 3; 3µg de proteína de membrana pertactina; 15 Lf del toxoide diftérico; 5 Lf del Loxoide tetánico; 40 unidades de antígeno D del poliovirus tipo 1; 8 unidades de antígeno D del poliovirus tipo 2; 1.5µg de fosfato de aluminio. Esta composición puede comprender adicionalmente, por dosis de 0.5 ml, lOµg del polisacárido capsular de polimbosa ribitol fosfato (PRP) purificado de Haemoph lus ínf luenzae tipo b unido covalentemente a 20µg de toxoide tetánico. Además, estas composiciones pueden contener, por dosis de 0.5 ml, 0.6% de 2-fenoxietanol . En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para inmunizar a un hospedero contra múltiples enfermedades, que comprende administrar al hospedero que puede ser humano, una cantidad inmunoefectiva de la composición inmunogénica o vacuna, según se proporciona en la presente. Las ventajas de la presente invención incluyen una vacuna multivalente que puede conferir protección contra una gama de enfermedades pediátricas comunes en forma segura y eficaz. La habilidad para proporcionar una sola vacuna contra enfermedades múltiples sin interferencia entre las respuestas inmunogénicas a los diversos inmunógenos es benéfica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La presente invención se comprenderá adicionalmente a partir de la siguiente descripción detallada y de los Ejemplos con referencia al dibujo que la acompaña n la que: La Figura 1 es un diagrama de flujo esquemático de un procedimiento para el aislamiento de una preparación de aglutinógeno a partir de la cepa Bordetella .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Preparación de Aglutinógeno Refiriéndonos a la Figura 1, se ilustra un diagrama de flujo de un método para preparar una preparación de aglutinógeno a partir de una cepa de Bordetella . Según se observa en la Figura 1, una pasta de células de Bordetella, que contiene a los aglutinógenos, tal como la pasta de células B. pertussis, se extrae con, por ejemplo, un amortiguador o regulador que contiene urea, tal como 10 M de fosfato de potasio, 150 mM de NaCl y 4M de urea, para extraer selectivamente los aglutinógenos de la pasta de células para producir un primer sobrenadante (spi) que contiene los aglutinógenos y un primer precipitado residual (pptl) . El primer sobrenadante (spl) se separa del primer precipitado residual (pptl), tal como por ejemplo, mediante centrifugación. El precipitado residual (pptl) se desecha. El sobrenadante clarificado (spi) puede entonces concentrarse y diafiltrarse contra, por ejemplo, lOmM de fosfato de potasio/150mM de NaCl/0.1% de Tritón X-100, utilizando, por ejemplo, un filtro de membrana NMWL de 100 a 300 kDa. El primer sobrenadante se incuba entonces a una temperatura y durante un tiempo para producir un sobrenadante clarificado (sp2) que contiene aglutinógenos y un segundo precipitado de desecho (ppt2) que contiene contaminantes no aglutinógenos. Las temperaturas apropiadas incluyen de aproximadamente 50°C a aproximadamente 100°C, incluyendo de aproximadamente 75° a aproximadamente 85°C y, los tiempos de incubación apropiados incluyen de aproximadamente 1 a aproximadamente 60 minutos. El sobrenadante clarificado se concentra entonces mediante, por ejemplo, la adición de polietilenglicol con peso molecular de aproximadamente 8000 (PEG 8000) hasta una concentración final de aproximadamente 4.5 ± 0.2% y agitando suavemente durante un mínimo de aproximadamente 30 minutos para producir un tercer precipitado (ppt3) que puede recolectado mediante centrifugación. El sobrenadante restante sp3 se desecha. Este tercer precipitado (ppt3) se extrae con, por ejemplo, un amortiguador o regulador que comprende lOmM de fosfato de potasio/150 mM de NaCl para proporcionar la solución cruda que contiene aglutinogeno fimbrial. Puede agregarse fosfato de potasio ÍM a la solución fimbrial cruda para convertirla en aproximadamente lOOmM con respecto al fosfato de potasio. Alternativamente, el sobrenadante clarificado de aglutinógenos fimbriales tratados térmicamente puede ser purificado sin precipitación mediante cromatografía por filtración en gel utilizando un gel, tal como Sepharose CL6B. Los aglutinógenos fimbriales en la solución cruda se purifican entonces mediante cromatografía en columna, tal como por ejemplo, haciéndola pasar a través de una columna de sílice PEÍ, para producir la preparación de aglutinógeno fimbrial en la porción pasante. Esto aglutinógeno fimbrial que contiene la porción pasante puede concentrarse adicionalmente y diafiltrarse contra, por ejemplo, un amortiguador o regulador que contiene fosfato de potasio lOmM/NaCl 150mM, utilizando una membrana NMWL de 100-300 kDa. La preparación de aglutinógeno puede esterilizarse mediante filtración a través de un filtro de membrana < 0.22 µM, para proporcionar la preparación final de aglutinógeno fimbrial purificada que contiene aglutinógeno fimbrial 2 y 3 substancialmente libre de aglutinógeno 1. La proporción en peso de Agg 2 a Agg 3 puede ser desde aproximadamente 1.5:1 hasta aproximadamente 2:1. Las vacunas pueden contener otros inmunógenos de Bordetella purificados que contienen hemaglutinina filamentosa, la proteína de la membrana externa de 69 kDa y toxina de pertusis o un toxoide de la misma, incluyendo, los análogos genéticamente destoxificados del PT según se describe, por ejemplo, en la referencia 68. Los otros inmunógenos de BordeteZ La, la toxina de pertusis (incluyendo a los análogos genéticamente destoxificados de la misma, según se describe, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 5,085,862, de Klein et al., cedida a la cesionaria de la misma e incorporada aquí como referencia) , FH? y la proteína de 69 kDa pueden ser producidos en forma purificada mediante una variedad de métodos talos como se describe a continuación.

Purificación del PT El PT puede aislarse a partir del sobrenadante de cultivo de una cepa de B. pertussis utilizando métodos convencionales. Por ejemplo, puede utilizarse el método de Sekura et al (referencia 55) . El PT puede aislarse absorbiendo primero al sobrenadante de cultivo en una columna que contiene la matriz de gel tintura-ligando, Affi-Gel Blue (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) . El PT se eluye a partir de esta columna mediante alta concentración salina, tal como por ejemplo, con cloruro de magnesio 0.75 M y, eliminando después a la sal, se hace pasar a través de una columna de matriz de afinidad fetuin-Sepharose, compuesta de fetuin ligado a la Sepharose activada con bromuro de cianógeno. El PT se eluye de la columna de fetuin utilizando sal de magnesio 4M. Alternativamente, puede utilizarse el método de Irons et al (referencia 56) . El sobrenadante de cultivo se absorbe sobre una columna 4B de Sepharose activada con CNBr a la que la haptoglobina se une primero en forma covalente. El PT se une al absorbente a un pH de 6.5 y se eluye de la columna utilizando amortiguador Tris O.lM/NaCl 0.5M en un cambio por etapas o gradual hasta un pH de 10. Alternativamente, puede utilizarse el método descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 4,705,686, otorgada a Scott et al el 10 de noviembre de 1987 y que se incorpora on la presente como referencia. En este método, los sobrenadantes de cultivo o extractos celulares de B. pertussis se hacen pasar a través de una columna de resina de intercambio aniónico con capacidad suficiente para adsorber endotoxina pero, que permite que los antígenos de Bordetella fluyan a través de la misma o se separen de alguna otra forma de la endotoxina. Alternativamente, el PT puede ser purificado utilizando cromatografía en perlita, según se describe en la Patente Europea NO. 336,736, cedida a la ceslonaria de la presente e incorporada aquí como referencia.

Destoxificación del PT El PT se destoxifica para eliminar actividades no deseadasque pudieran provocar reacciones laterales en la vacuna final. Puede utilizarse cualquiera de una variedad de métodos de destoxificación química convencionales, tales como el tratamiento con formaldehído, peróxido de hidrógeno, tetranitro-metano o glutaraldehído. Por ejemplo, el PT puede destoxificarse con glutaraldehido utilizando una modificación del procedimiento descrito en Muñoz et al (referencia 57) . En este proceso de destoxificación, el PT purificado se incuba en una solución que contiene solución salina amortiguada con fosfato al 0.01 M. La solución se hace al 0.05% con glutaraldehído y la mezcla se incuba a temperatura ambiente durante dos horas, y entonces se hace 0.02 M con L-lisina. La mezcla se incuba adicionalmente durante dos horas a temperatura ambiente y se dializa entonces durante dos días contra PBS 0.01 M. En una modalidad particular, puede utilizarse el proceso de destoxificación de la Patente Europea No. 336 736. Brevemente, el PT puede destoxilicarse con glutaraldehído como sigue: El PT purificado en fosfato de potasio 75mM a pH de 8.0 y que contiene cloruro de sodio 0.22M, se diluye con un volumen igual de glicerol a concentraciones de proteína de aproximadamente 50 a 400 µg/ml. La solución se calienta a 37°C y se destoxifica mediante la adición de glutaraldehido hasta una concentración final de 0.5% (p/v). La mezcla so mantiene a 37°C durante 4 horas y entonces se añade ácido aspártico (1.5 M) hasta una concentración final de 0.25 M. La mezcla se incuba a temperatura ambiente durante una hora y entonces se diafiltra con 10 volúmenes de fosfato de potasio 10 mM a pH de 8.0 que contiene cloruro de sodio 0.15M y 5% de glicerol para reducir el glicerol y eliminar al glutaraldehído. El toxoide PT se esteriliza por filtración a través de una membrana de 0.2 µM. Si se utilizan técnicas recombinantes para preparar una molécula mutante de PT que muestra poca o ninguna toxicidad, para utilizarse como la molécula tox ficada, no es necesaria la destoxificación química.

Purificación de la FHA La FHA puede purificarse a partir del sobrenadante do cultivo, esencialmente según se describe en Co ell et al (referencia 58). Los promotores del crecimiento, tales como las beta-ciclodextrinas metiladas, pueden ser utilizados para incrementar el rendimiento de la FHA en los sobrenadantes de cultivo. El sobrenadante de cultivo se aplica a una columna de hidroxilapatita. La FHA se adsorbe en la columna pero, el PT no. La columna se lava perfectamente con Tritón X-100 para eliminar la endotoxina. La FHA se eluye entonces utilizando NaCl 0.5M" en fosfato de sodio O.lM y, si es necesario, se hace pasar a través de una columna de fetuin-Sepharose para eliminar el PT residual. La purificación adicional puede involucrar el paso a través de una columna de Sepharose CL-6B. Alternativamente, la FHA puede purificarse utilizando _ anticuerpos monoclonales contra el antígeno, en donde los anticuerpos se fijan en una columna de afinidad activada con CNBr (referencia 59) . Alternativamente, la FH? puede purificarse utilizando cromatografía de perlita según se describió en la antes mencionada EP 336 736.

Purificación de la Proteína de Membrana Externa de 69 kDa (pertactina) . La proteína de membrana externa de 69 kDa (69K o pertactina) puede recuperarse de células bacterianas inactivando primero a las células con un agente bacteriostático, tal como puede ser, timerosal, según se describe en la EP publicada 484 621 e incorpora aquí como referencia. Las células inactivadas sé suspenden en un medio acuoso, tal como puede ser PBS (pH de 7 a 8 ) y se someten a la extracción repetida a temperatura elevada (de 45 a 60°C) con el subsecuente enfriamiento a temperatura ambiente o 4°C. Las extracciones liberan a la proteina 69K_ de las células. El material que contiene a la proteína .9K se recolecta mediante precipitación y se hace pasar a través de una columna Affi-gel Blue. La proteína 69K se eluye con una concentración elevada de sal, tal como cloruro de magnesio 0.5M. Después de la diálisis, se hace pasar a través de un soporte de cromatoenfoque. Alternativamente, la proteina de 69 kDa puede purificarse n partir del sobrenadante de cultivo de un cultivo de B. pertussis, según se describe en la Solicitud de PCT publicada WO 91/15505, a nombre de la cesionaria de la misma e~ incorporada aquí como referencia. Se prefiere este método, ya que la pertactina se proporciona libre de los materiales de cromatografía de la tintura de adenilatociclasa . Otros métodos apropiados para la purificación de la proteína de membrena externa de 69 kDa de B. pertussis, se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 5,276,142, otorgada a GoLto et al, el 4 de enero de 1984 y en la Patente de los Estados Unidos No. 5,101,014, otorgada a Burns, el 31 de marzo de 1992.

Otros Componentes de la Invención Las vacunas de la invención también contienen inmunógenos no de Bordetella que incluyen"- al toxoide tetánico, al toxoide diftérico, poliovirus inactivado (IPV) y, opcionalmente, un conjugado del toxoide diftérico o del toxoide tetánico y un polisacárido capsular de Haemophilus influenzae tipo b. Otros componentes potenciales de las vacunas multicomponente incluyen proteínas de membrana externa _de Hae_nopíilus, antígeno superficial de hepatitis B, de parotiditis, de sarampión y de rubéola. Los conjugados del toxoide tetánico o del toxoide diftérico y el polisacárido capsular del Hib pueden formarse aislando polirribosa ribitol fosfato (PRP) aislado del //. inf l ucnzac tipo b, derivando al PRP para proporcionar una dihidrazida de ácido adípico y conjugando covalentemente ésta con el toxoide tetánico o el toxoide diftérico para proporcionar los conjugados de PRP-T ó PRP-D, respectivamente. Cada uno de los antígenos es absorbido individualmente en un adyuvante, tal como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio, llamados colectivamente alumbre, paia proporcionar la producción rápida y conveniente de vacunas que contienen cantidades relativas seleccionadas de estos antígenos en las vacunas según se proporciona aquí.

Formulaciones de Vacuna Multivalente Seleccionadas . En modalidades seleccionadas, la invención proporciona vacunas con las siguientes características (los µg de proteínas utilizados aquí están basados en los resultados de la prueba Kjedahl efectuada sobre concentrados purificados y están expresados como µg de nitrógeno de la proteína) , todas estas pueden administrarse mediante inyección intramuscular: (a) CP^o^M^jDT-mlPV (HYBRID) : Un.i formulación comprende una combinación de vacuna componente de pertusis (CP) combinada con los toxoides diftérico (DI) y tetánico (T) y poliovirus inactivado (mlPV) y se denomina CP20/20/5/3DT-mIPV (HYBRID) . Los poliovirus que crecieron en células MRC-5 son designados irilPV, en tanto que los poliovirus que crecieron en células vero son designados IPV ó vIPV. En las formulaciones pueden utilizarse en forma intercambiable cualquier material de poliovirus inactivado. Cada 0.5 ml de dosis humana de CP20/20 5 3DT-r_IPV (HYBRID) se formularon para contener aproximadamente: 20 µg del toxoide de pertusis (PT) 20 µg de hemaglutinina filamentosa (FHA) 5 µg de aglutinógenos fimbriales 2 y 3 (FIM) 3 µg de proteína de membrana externa pertactina (69kDa) Lf del toxoide diftérico 5 Lf de toxoide tetánico 40 unidades de antígeno D del poliovirus tipo 1 8 unidades de antígeno D del poliovirus tipo 2 32 unidades de antígeno D del poliovirus tipo 3 1.5 mg de fosfato de aluminio 0.6% de 2-fenoxietanol, como conservador. (b) CP20/20/5/3DT-mIPV (HYBRID) + PRP-T: Otra formulación comprende una combinación de vacuna componente de pertusis (CP) combinada con toxoides diftérico (D) y tetánico (T) y poliovirus inactivado (mlPV) y se denomina CP20/2c?/s/3DT-mIPV (HYBRID) y se utiliza para reconstituir 'PRP-T liofilizado. La composición resultante contiene, por dosis de 0.5, aproximadamente: 20 µg del toxoide de pertusis (PT) 20 µg de hemaglutinina filamentosa (FHA) 5 µg de aglutinógenos fimbriales 2 y 3 (FIM) 3 µg de proteína de membrana externa pertactina (69kDa) 15 Lf de toxoide diftérico 5 Lf de toxoide tetánico 10 µg de polisacárido capsular de polirribosa ribitol fosfato (PRP) purificado de Haemophi lus influenzae tipo b unido covalentemente a 20 µg de toxoide tetánico. Poliovirus tipo 1 40 unidades de antígeno D Poliovirus tipo 2 8 unidades de antígeno D Poliovirus tipo 3 32 unidades de antígeno D 1.5 mg Fosfato de aluminio 0.61 ?.- Conoxietanol . (c) CP?,./2(,/..i/:lDT-p.-PV (HYBRID) : Una formulación adicional comprende una combinación de vacuna componente de pertussis (CP) combinada con toxoides diftérico (D) _ _y tetánico (T) , poliovirus inactivado (mlPV) y PRP-T y se denomina CP20/20/,,/JDT-P_U,-T-I V. Cada dosis humana de 0.5 ml de esta composición contiene aproximadamente: 20 µg dol 1 ox ¡ c do pertusis (PT) 20 µg de hemaglutinina filamentosa (FHA) 5 µg de aglutinógenos fimbriales 2 y 3 (FIM) 3 µg de proteína de membrana externa pertactina (69kDa) 15 Lf de toxoide diftérico 5 Lf de toxoide tetánico 10 µg de polisacárido capsular de polirribosa ribitol fosfato (PRP) purificado de Haemophi lus influenzae tipo b unido covalentemente a 20 µg de toxoide tetánico. Poliovirus tipo 1 40 unidades de antígeno D Poliovirus tipo 2 8 unidades de antígeno D Poliovirus tipo 3 32 unidades de antígeno D 1.5 mg Foslat-o de aluminio 0.6% 2-fenoxietanol .

Ensayos Clínicos (a) Vacuna DTP anti-pertusis componente So realizaron varios ensayos clínicos en humanos, según se describe en la presente para establecer la seguridad, no reactogenicidad y utilidad de las vacunas componente de pertusis que contienen aglutinógenos fimbriales preparados según se describe aquí, para la protección contra pertusis. En particular, se obtuvieron respuestas inmunitarias a cada uno de los antígenos contenidos en las vacunas (según se muestra, por ejemplo, en el Cuadro 3 más adelante) . Se analizó una vacuna multivalente de pertusis particular CP10/5/5/3DT en un gran ensayo clínico controlado con placebo, multicéntrico y doble aleatorizado en una población humana en riesgo para estimar la eficacia de la vacuna contra pertusis típica. La definición del caso para la enfermedad de pertusis típica fue: Veintiún días o más de tos espasmódica, y ya sea B. pertussis confirmada por cultivo o evidencia serológica de infección específica por Bordetella indicada por un aumento de 100% en el anticuerpo IgG ó IgA determinado por ELISA, en comparación con FHA ó PT en sueros aparejados, o si se carece de datos serológicos, el niño en estudio ha estado en contacto en casa con un caso de B. pertussis confirmado por cultivo, con inicio de tos en un plazo de 28 días antes o después del inicio de tos en el niño en estudio.

Los resultados de este estudio mostraron que CP10/5/5/3DT da aproximadamente el 85% de eficacia en la provención de pertusis según so define en la definición del caso para enfermedad de pertusis típica según se describió anteriormente. En el mismo estudio, una vacuna acelular de pertusis de dos componentes que contiene solamente PT y FHA fue de aproximadamente el 58% de eficacia (PT5. FHA25. DT) y una vacuna de célula completa de pertusis (DTP) fue de aproximadamente 48% de eficacia (ver Cuadro 4 más adelante) . Además, la vacuna CP10/5 5 3DT evitó pertusis moderada definida como una tos de al menos un día de duración a una eficacia de aproximadamente 77%. En particular, el perfil de la respuesta inmunitaria obtenido fue substancialmente el mismo del obtenido después de la inmunización con vacunas de célula completa de pertusis, las cuales fueron reportadas como muy eficaces contra pertusis . (b) Vacuna Multivalente DPT-PRP -T-IPV (I) La seguridad e inmunogenicidad de las vacunas componente de pertusis combinadas con toxoide diftérico y toxoide tetánico adsorbidos, vacuna de toxoide tetánico conjugado con Haemophil us influenzae tipo b y vacuna de poliomielitis inactivada que crecieron en células VERO (CP20/20/5/3DT-PRP-T-IPV) fueron comparadas con la vacuna de célula completa de pertusis (a) en combinación con los toxoides diftérico y tetánico adsorbidos y vacuna de poliomielitis inactivada, (b) en combinación con toxoides diftérico y tetánico adsorbidos y vacuna de poliomielitis inactivada que crecieron en células MRC-5 (DPT-polio adsorbido) utilizadas para reconstituir la vacuna de toxoide tetánico conjugado con Haemophilus mf luenzae tipo b liofilizada (PENTA™) ó (c) vacuna componente de pertusis en combinación con toxoides diftérico y tetánico adsorbidos, vacuna de Haemophil us influenzae tipo b conjugado con toxoide tetánico y vacuna de poliomielitis inactivada que crecieron sobre células MRC-5 (CP20/20/s,3DT-mlPV) proporcionada en forma separada o utilizada para reconstituir la vacuna de /iaejpop ilus mf l uenzae tipo b conjugado con toxoide tetánico liofilizada (PRP-T) en niños a los 2, 4, G y 18 meses de edad. Este ensayo controlado y aleatorizado se estudiaron 897 lactantes de dos meses de edad para que recibieran una de ocho ramas diferentes de vacuna: CP20/20/5/3DT-PRP-T-IPV (líquida) ; CP20/20/5/3DT suministrada en forma concurrente pero en un sitio diferente de la PRP-T; o la vacuna de control, DPT-polio de célula completa utilizada para reconstituir PRP-T (PENTA™). Todas las vacunas en estudio fueron bien toleradas. No se observaron diferencias significativas en las tasas de reacción entre los dos tipos de combinaciones de pertusis recombinante. Los niños que recibieron la CP20/20 s/3DT-mIPV combinada utilizada para reconstituir la PRP-T tuvieron tasas de reacciones locales ligeramente superiores en comparación con los mismos productos administrados en sitios diferentes. Todas las combinaciones de componente de pertusis tuvieron tasas de reacciones locales y sistémicas consistentemente menores que la combinación de célula completa. Las diferencias en las tasas de reacción entre las vacunas componente de pertusis y de célula completa, fueron muy evidentes en las 24 horas inmediatamente después de la vacunación. Ambas combinaciones Componente de Pertusis, produjeron excelentes respuestas a todos los antigenos. En todas las situaciones, las respuestas al PT de pertusis, FHA y pet Lactina fueron superiores a las respuestas observadas en las combinaciones de célula completa. No se observaron diferencias significativas entre las combinaciones de componente y de célula completa. No se observaron diferencias significativas entre las formulaciones de componente y de célula completa para anti-PRP, difteria y polios 1 y 2. Ambas formulaciones componente dc pertusis produjeron superiores respuestas al tétanos que el PENTA™. Ambas formulaciones de componente produjeron respuestas serológicas similares a todos los antígenos, con excepción del polio 3, para el cual se utilizó CP2u/20 b 3DT-mIPV para reconstituir la PRP-T, produjo respuestas superiores al CP20/20/5/3DT-PRP-T-IPV. El método de administración no afectó las respuestas __serológicas a ninguno de los antígenos con excepción del tétanos. En los dos grupos, el combinado y el separado, el 100% do los niños fueron protegidos (>0.01 UE/ml) contra tétanos después de 3 dosis de la vacuna. En forma más importante, todos los -grupos de vacunas tuvieron buenas respuestas a la PRP-T en donde el 98% de los niños obtuvieron niveles > 0.15µg/ml y por encima del 86.1% de los niños obtuvieron niveles > 1.0 µg/ml. Estas cifras son comparables a las observadas en los estudios previos en los cuales se utilizaron vacuna de célula completa de pertusis con PRP-T. Las respuestas serológicas obtenidas y descritas anteriormente, se muestran en los Cuadros 5 a 7 (H = híbrido) . (II) La seguridad e inmunogenicidad de la vacuna componente de pertusis en combinación con los toxoides diftérico y tetánico adsorbidos y la vacuna de poliomielitis inactivada desarrolladas en células MRC-5 (cP_>_/.-o _/_D -ml Pv) i proporcionadas en forma separada o utilizadas para reconstituir la vacuna de Haemophilus influenzae tipo b conjugado con toxoide tetánico liofilizada (PRP-T) fueron comparadas con la vacuna de célula completa de pertusis en combinación con los toxoides diftérico y tetánico adsorbidos y la vacuna de poliomielitis inactivada desarrollada en células MRC-5 (DPT polio adsorbida) utilizada para reconstituir la vacuna de Ilacmoph i l ur. i nflucnzac tipo b toxoide tetánico conjugado liofilizada (PENTA™) en niños de 18 a 19 meses de edad. Este estudio de cinco ramas incluyó una rama de control con PENTA™ de célula completa y se utilizó CP20/20/5/3DT-mIPV para reconstituir la PRP-T. Al quinto grupo se le proporcionó CP20 2o"5 D mIPV en forma concurrente pero en un sitio diferente de la PRP-T. Cuatrocientos noventa y ocho niños recibieron la vacuna a los 18-19 meses de edad, de los cuales 46G (95%) terminaron el estudio de conformidad con el protocolo. La CP20/20/5 3DT-mlPV utilizada para reconstituir la PRP-T era significativamente menos reactogénica que la PENTA™, particularmente dentro de las primeras 24 horas después de la vacunación. El producto reconstituido tuvo tasas de reacciones locales ligeramente superiores que el producto administrado en forma separada. La PENTA™ produjo respuestas superiores a la antipolio 1 que la CP20/20/5 3DT-mIPV utilizada para reconstituir la PRP-T. No se observaron diferencias significativas para anti-PRP, difteria, aglutinina de pertusis, fimbrias, polio 2 o polio 3. La CP20/20/5/3DT-mIPV utilizada para reconstituir la PRP-T produjo respuestas serológicas significativamente superiores al PT de pertusis, FHA y pertactina. La CP20 20/5/3DT-mIPV utilizada para reconstituir la PRP-T produjo respuestas serológicas consistentes para todos los antígenos probados. No se observaron diferencias significativas entre la CP20 20 5 3DT-mlPV proporcionada en forma separada contra la utilizada para reconstituir la PRP-T, con excepción de la antitoxina tetánica (6.78 vs 4.91 UE/ml). Este estudio demostró que la CP20/20/5 3DT-mIPV utilizada para reconstituir la PRP-T produjo respuestas serológicas consistentes en tres lotes y fue más inmunogénica que la PENTA1M para las respuestas a pertusis. La CP20 20 5/3DT-mIPV también produjo tasas de reacciones locales y sistémicas significativamente menores a las de la PENTA™. (III) La seguridad e inmunogenicidad de la vacuna componente de pertusis combinada con toxoides diftérico y tetánico adsorbidos y vacuna de poliomielitis inactivada desarrolladas en células MRC-5 (CP20/20/5 3DT-mIPV) se compararon con la vacuna de célula completa de pertussis en combinación con toxoides diftérico y tetánico adsorbidos y vacuna de poliomielitis inactivada desarrollada en células MRC-5 (DPT-polio adsorbida) en niños a edades de 4 a 6 años. Ciento sesenta y cuatro niños fueron asignados aleatoriamente en una proporción de 4 a 1 para que recibieran ya sea CP20/20/5,3DT-mIPV (n=131) o DFT-Polio (n=33) . En el estudio no ocurrieron eventos adversos significativos o serios. La CP2o/2o/5/3Ll'í'-mlPV tuvo tasas de reacciones tanto locales como sistémicas consistentemente menores, particularmente en el período de 0 a 24 horas. Las reacciones locales fueron comunes para" ambos grupos con 97% de recipientes de DPT-polio y 76.9% de recipientes de CP20/20 5/3DT-mIPV que tienen cierta reacción local en el período de 0 a 24 horas. Las reacciones locales por CP20/2o/5/3DT-mIPv fueron normalmente de suaves a moderadas. En contraste, mas de la mitad de los recipientes de DPT-polio tuvieron reacciones locales clasificadas como severas. La sensibilidad en el sitio de la inyección desapareció normalmente a las 72 horas pero, lo rojo de zona o el hmchamiento tendió a persistir en el período de 24 a 72 horas. Las reacciones sistémicas en el período de 0 a 24 horas fueron menos comunes en los recipientes de CP0 20 5 3DT-mIPV (38.5%) que en los recipientes ae DPr-polio (90.9%) . Las reacciones sistémicas en el periodo de 24-72 horas fueron raras en ambos grupos. Las respuestas a la difteria, tétanos, polio 2 y 3 fueron comparables entre las dos vacunas. Los recipientes de DPT-polio tuvieron una respuesta a polio 1 significativamente superior (15,462) que la respuesta que tuvieron los recipientes de CP20 2u 5 3DT-mIPV (10,903). Todos los sujetos tuvieron excelentes respuestas y se considerarían protegidos contra las enfermedades respectivas. Las respuestas serológicas a todos los antígenos de pertusis fueron significativamente superiores en los recipientes de CP20 20/5 3DT-mIPV. (IV) La seguridad e inmunogenicidad de la vacuna componente de pertusis en combinación con toxoides diftérico y tetánico adsorbidos, la vacuna de Haemophil us influenzae tipo b conjugado con toxoide tetánico y vacuna de poliomielitis inactivada desarrollada en células MRC-5 (CP20/20/5/3DT-PRP-T-mIPV) , se compararon con la vacuna de célula completa de pertusis en combinación con toxoides diftérico y tetánico adsorbidos y vacuna de poliomielitis inactivada desarrollada en células MRC- (LPT-polio adsorbida) utilizada para reconstituir la vacuna de Haemophilus influenzae tipo b conjugado con toxoide tetánico liofilizada (PENTA™) o la vacuna componente de pertusis en combinación con toxoides diftérico y tetánico adsorbidos y vacuna do poliomielitis inactivada desarrollada en células MRC-5 (CP2020/5/3DT-mIPV) utilizada para reconstituir la vacuna de Haemophil us infl uenzae tipo b conjugado con toxoide tetánico liofilizada (PRP-T) en niños a edades de 18 a 19 meses. El propósito de este estudio de tres ramas aleatorizado, controlado y ciego fue para evaluar la seguridad e inmunogenicidad de dos nuevas combinaciones acelulares de pertusis, CP20/20/5/3DT-PRP-T-IPV y CP20/20/5/3DT-mlPV utilizadas para reconstituir la PRP-T, con PENTA™ (de célula completa de pertusis DPT polio utilizada para reconstituir la PRP-T) en niños de 18 a 19 meses de edad. Participaron un total de 99 niños; 33 en cada uno de los tres grupos de vacuna, de los cuales 97 (98%) completaron el estudio de conformidad con el protocolo. En este estudio no se observaron reacciones serias. Los recipientes de PENTA™ tuvieron significativamente más probabilidad de experimentar reacciones locales y sistémicas moderadas o severas que los recipientes de las otras dos vacunas. Las diferencias fueron más pronunciadas a las 24 horas y alcanzaron significancia estadística por fiebre, enrojecimiento, hinchazón, sensibilidad, agitación, disminución en la actividad y reducción en el apetito. Las reacciones tendieron a ser suaves en niños .que recibieron combinaciones componente de pertusis. No se observaron diferencias significativas en las tasas de reacción entre las dos formulaciones componente de pertusis aunque la agitación se observó más frecuentemente a las 24 horas en los que recibieron CP20 20 5/3DT-mIPV utilizada para reconstituir la PRP-T contra CP20/20/5/3DT-PRP-T-IPV (18% vs 3%) . Las respuestas serológicas fueron satisfactorias con el 100% de los participantes que obtuvieron niveles considerados como protectores de la antitoxina diftérica (> 0.01 Ul/ml), antitoxina tetánica (>0._01 Ul/ml) y anti PRP (> 1.0 µg/ml) . Los anticuerpos neutralizantes detectables para la polio de los tipos 1, 2 y 3 fueron observados en todos los participantes posterior a la inmunización. Las respuestas diftéricas fueron superiores en recipientes de la PENTA™ reflejando el superior contenido de antígeno de esta vacuna (25 Lf vs 15 Lf) . Los anticuerpos de pertusis fueron consistentemente elevados en las dos combinaciones componentes de pertusis contra PENTA™ que alcanzó una significancia estadística para las respuestas anti-PT, anti-FHA y anti-pertactina GMT. Los anticuerpos aglutinantes anti-fimbriales y de pertusis tamoién fueron superiores en los recipientes de componente de pertusis, aunque las diferencias no llegaron a la significancia estadística . En resumen, este estudio mostró que las dos combinaciones acelulares de pertusis CP20 20/53DT-mIPV utilizadas para reconstituir PFP-T y CP20 2o5/3DT-PRP-T-IPV, fueron comparables y produjeron tasas de reacción satisfactoriamente bajas y respuestas serológicas elevadas cuando se suministraron como refuerzo a niños en edades de 18 a 19 meses. (V) La seguridad e inmunogenicidad de la vacuna componente de pertusis en combinación con el toxoide diftérico y tetánico adsorbidos (CP20/2o5 3DT) , sola o combinada con uno o dos poliovirus inactivados, una mlPV, desarrollada en células MRC-5 y la otra vIPV desarrollada en células vero o la vacuna oral de poliomielitis (OPV) en niños con edades de 17 a 19 meses. Este estudio de cinco ramas fue diseñado para examinar la interacción entre CP20/20 5 3DT y dos IPVs (desarrolladas en células Vero y en células MRC-5) . Ambas IPVs se combinaron como un solo producto líquido con CP20/20 5/3DT-mIPV y CP2o2o5 3DT_vIP o se suministraron en forma concurrente pero en un sitio de inyección separado (CP20/2o/5/3DT+mIPV y CP20/20/5/3DT+vIPV) . Un quinto grupo de estudio recibió CP20/2o53DT Y OPV en forma concurrente.

Todos los sujetos recibieron la PRP-T por el torrente sanguíneo post inmunización. En este estudio no se evaluaron las respuestas anti-PRP.

DISEÑO DEL ESTUDIO En general, no hubo diferencias en las tasas de reacciones adversas reportadas después de las vacunas de poliomielitis inactivada derivadas de célula MRC-5 o vero, independientemente de que la vacuna se proporcionó como una inyección separada o combinada con la vacuna CP2[,20 5 3DT (HYBRID) . No se observaron diferencias significativas entre grupos para PT, FHA y pertactina. Las respuestas en los niños que recibieron CP20/20/5/3DT (HYBRID) y OPV fueron ligeramente superiores pero no significativamente superiores a la de los niños que recibieron CP20 20 5 3DT (HYBRID) y IPV de célula Vero para FIM, aglutinina pertusis, difteria y tétanos. Las respuestas a la polio generalmente fueron comparables o superiores en niños que recibieron una vacuna IPV contra una vacuna OPV. Todos menos un individuo tuvieron aglutinina pertusis > 1.64. Todos menos un individuo alcanzaron niveles antitoxina diftérica > 0.1 U/ml y todos alcanzaron niveles antitoxina tetánica > 0.1 UE/ml. Los resultados de este estudio demostraron que CP20/20 5/3DT (HYBRID) combinada con IPV (ya sea de célula MRC-5 ó Vero) es segura e inraunogénica en niños de 17 a 19 meses de edad. Las vacunas combinadas fueron al menos tan inmunogénicas como la vacuna proporcionada como inyecciones separadas y en algunos casos más inmunogénicas. La combinación de la vacuna como una sola inyección no estuvo asociada a un incremento significativo en las reacciones locales adversas. No se detectaron diferencias substanciales en las reacciones adversas o en la respuesta inmunitaria a las dos preparaciones IPV, ya sea como inyecciones separadas o como productos combinados. La inclusión de la IPV no incrementó la tasa de reacciones adversas en comparación con la CP20 20 5 3DT (HYBRID) suministrada sola (es decir, con la OPV) . Los resultados serológicos obtenidos en el estudio están resumidos en el Cuadro 8 (H = híbrido) . (VI) La seguridad e inmunogenlcidad de las vacunas componente de pertussis combinadas con toxoides diftérico y tetánico adsorbidos (CP20 20/5/3DT y CPI0/5 5 3DT) solas o combinadas con la vacuna de conjugado Jíaejtiophilus influenzae tipo b se determinaron en niños de 17 a 19 meses de edad. El estudio de seis ramas se diseñó para examinar la interacción tanto entre las formulaciones componente de pertusis clásica (CP10 5 5 3DT) e Híbrida (CP20/20 5 3DT) y la Vacuna de Conjugado Haemophil us influenzae Tipo B (PRP-T) en niños de 18 a 19 meses de edad. Se utilizaron tres programas o esquemas, en los cuales (a) cada una de las vacunas componente de pertusis se utilizaron para reconstituir la PRP-T, (b) se suministraron en forma concurrente pero en un sitio separado de la PRP-T ó (c) la PRP-T se _ suministró 1 mes después de la vacuna componente de pertusis. Todos los niños recibieron la OPV en la primera visita y fueron cebados con los mismos componentes de vacuna de pertusis a los 2, 4 y 6 meses de edad. Todos los niños hablan participado previamente en el gran estudio de seguridad de estas dos formulaciones de vacuna. En el estudio se enrolaron un total de 545 sujetos, de los cuales 542 (99%) terminaron el estudio.

DISEÑO DEL ESTUDIO Las respuestas serológicas generalmente fueron superiores a la mayoría de los antígenos cuando se suministraron una vacuna combinada componente de pertusis y la PRP-T en el mismo día en comparación con "suministrarlas en días separados (ver Cuadro 9) . En forma importante, las respuestas anti-PRP no disminuyeron cuando la PRP-T se proporcionó en forma separada contra la combinada con una vacuna de combinación componente de pertusis en el mismo día. Las medias geométricas de los título (GMTs) post inmunización en niños a los que se proporcionó las vacunas en días separados fueron significativamente menores. Se observaron diferencias on las respuestas anti-PRP entre inyecciones combinada y separada cuando los sujetos se estratificaron mediante formulación de vacuna componente de per usis. Los recipientes de CP20/20/5/3DT (HYBRID) demostraron menores niveles anti-PRP cuando la vacuna se suministró en forma combinada en vez de en forma separada. Estas diferencias no fueron observadas con los recipientes de CPa0/5/5/3DT y las diferencias desaparecieron cuando los grupos se combinaron. Todos los participantes alcanzaron niveles anti-PRP > 0.15 µg/ml y por encima del 98% de cada grupo tuvieron un nivel > 1.0 µg/ml. Solamente cuatro participantes (0.7%) del estudio no lograron obtener este nivel; tres en las inyecciones separadas en días separados y uno en el grupo de inyección combinada. Más del 82% de cada grupo excedieron títulos de 10 µg/ml de anticuerpo anti-PRP.

De las reacciones locales evocadas, solamente la sensibilidad fue reportada en forma más frecuente en el grupo combinado (27.8%) en comparación con ol grupo de vacunación en día separado (16.7%) . Esta tasa no fue diferente de la observada en el grupo de vacunas proporcionadas el mismo día como inyecciones separadas (24.2%) . En total, se reportó una reacción sistémica con frecuencia similar (de 60 a 62.1%) en participantes de cada uno de los grupos de vacuna. La fiebre se reportó en aproximadamente un tercio de los participantes. Solo la agitación fue reportada más comúnmente en el grupo de inyección combinada (33.3%) en comparación con los grupos de inyección separada (22.0%) o el de día separado (22.8%). Para resumir los resultados de este ensayo, la administración concurrente de CP10/5/5/3DT ó CP20 20 5 3DT y PRP-T en el mismo dia no interfirió con las respuestas anti-PRP pero realmente puede haberlas aumentado. Las respuestas serológicas a otros antígenos también fueron excelentes. El tétanos fue el único antígeno afectado cuando las dos vacunas se mezclaron pero, todos los niños tuvieron elevados niveles de protección. Para ensayos clínicos posteriores, la CP10 5/5/3DT-IPV desarrollada en células MRC5 para la reconstitución con ActHib (PRP-T) y A5I (CP10/5/5/3DT-PRP-T-IPV desarrollada en células Vero 3 µg/ml) se prepararon. Los antígenos componente de pertusis fueron adsorbidos individualmente en fosfato de aluminio 3 mg/ml en ausencia del conservador. En este aspecto, PT estaba en fosfato de potasio lOmM, NaCl 0.15M, glicerol al 5%, FHA estaba en fosfato de potasio lOmM, NaCl 0.5M, 69K estaba en fosfato de potasio lOmM, NaCl 0.15M, y las fimbrias estuvieron en fosfato de potasio lOmM, NaCl 0.15M. D fue adsorbido en fosfato de aluminio (6.25 mg/ml) a una concentración de 300 Lf/ml. 2-fenoxietanol se añadió como un conservador en 0.6%. T fue adsorbido en fosfato de aluminio (6.25mg/ml) a una concentración de 300Lf/mL. Se añadió 2-fenoxietanol hasta el 0.6%. Los antígenos componente de pertusis adsorbidos se combinaron con D adsorbido y T adsorbido a una concentración de 3.65 dosis/ml ó 55% del volumen final. El contenido de 2-fenoxietanol fue de 0.6%. Antes de la combinación con mlPV ó v-IPV/PRP-T, se confirmaron la esterilidad, el contenido de aluminio y el contenido de 2-fenoxietanol. Para 5ml, se añadieron m-IPV y 2-fenoxietanol y se diluyeron a la concentración final. Para A5I, v-IPV, PRP-T y 2-fenoxietanol se añadieron y diluyeron a la concentración final. En el resumen de los resultados del ensayo clínico con vacunas multivalentes, puede observarse que la CP20 20 5/3DT-mIPV utilizada para reconstituir la PRP-T produce respuestas serológicas comparables para difteria, tétanos y polios 1, 2 y 3 en comparación con la PENTA™ (que contiene vacuna de célula completa de pertusis) . Las respuestas anti-PRP fueron comparables o superiores a aquellas observadas con PENTA™ tanto en dosis para lactante como de refuerzo. Las respuestas al tétanos son menores que la CP20/20/5 3DT-mIPV utilizada para reconstituir PRP-T cuando se comparan con CP20 20/b 3DT-mIPV, proporcionada en forma separada de la PRP-T, pero esa reducción no es clínicamente relevante. Consistente con otros estudios, la vacuna de célula completa produce respuestas de fimbrias y de aglutininas comparables o superiores a la de vacuna componente de pertusis, sin embargo, se sabe que la vacuna de célula completa utilizada contiene un componente fimbrial muy inmunogénico. Todas las otras respuestas a pertusis fueron consistentemente superiores" con CP20 20/5 3DT-mlPV utilizada para reconstituir la PRP-T que con la PENTA™. De este modo, la presente invención proporciona composiciones inmunogénicas multivalentes en las que las respuestas inmunitarias a los antígenos no se disminuyen o deterioran por los otros componentes o por su inclusión en la vacuna multivalente. Las respuestas inmunitarias disminuidas algunas veces son referidas como" interferencia.

Preparación y Uso de la Vacuna De este modo, las composiciones inmunogénicas, adecuadas para ser utilizadas como vacunas, pueden prepararse a partir de los inmunógenos, según se revela aquí. La vacuna induce una respuesta inmunitaria en un sujeto que produce anticuerpos. Las composiciones inmunogénicas que incluyen vacunas pueden ser preparadas como composiciones inyectables, como soluciones líquidas o como emulsiones. Los inmunógenos pueden mezclarse con excipientes farmacéuticamente aceptables que sean compatibles con los inmunógenos. Estos excipientes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. Las composiciones inmunogénicas y las vacunas pueden contener además substancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes amortiguadores o reguladores de pH o adyuvantes para mejorar la efectividad de las mismas. Las composiciones y vacunas inmunogénicas pueden administrarse en forma parenteral, mediante inyección subcutánea o intramuscular. Las preparaciones y vacunas inmunogénicas se administran en una forma comparable a la formulación de la dosis y, en una cantidad tal que será terapéuticamente efectiva, inmunogénica y protectora. La cantidad que será administrada depende del sujeto que será tratado, incluyendo, por ejemplo, la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos y, si es necesario, para producir una respuesta inmunitaria mediada por células. Cantidades precisas del ingrediente activo requerido que será administrado, dependen del juicio del médico practicante. Sin embargo, los intervalos de dosificación adecuada son fácilmente determinables por alguien experimentado en la técnica y pueden ser del orden de microgramos de los inmunógenos. Los regímenes adecuados para administración inicial y las dosis de refuerzo también son variables. Pero, pueden incluir una administración inicial seguida de administraciones subsecuentes. La dosis también puede depender de la ruta de administración y variará de conformidad con el tamaño del hospedero. La concentración de los inmunógenos en una composición inmunogénica de conformidad con la invención en general es de aproximadamente 1 a aproximadamente 95%. La inmunogenicidad puede mejorarse en forma significativa si los antígenos son co-administrados con adyuvantes, utilizados comúnmente como solución al 0.005 a 0.5 por ciento en solución salina amortiguada con fosfato. Los adyuvantes mejoran la inmunogenicidad de un antígeno pero, no son necesariamente inmunogénicos por sí mismos. Los adyuvantes pueden actuar reteniendo al antígeno localmente cerca del sitio de administración para producir un efecto de depósito que facilita una liberación lenta y prolongada del antígeno hacia las células del sistema inmunitario. Los adyuvantes también pueden atraer células del sistema inmunitario hacía un depósito de antígeno y estimular a dichas células para inducir respuestas inmunitarias . Los agentes inmunoestimulatorios o adyuvantes se han utilizado durante muchos años para mejorar las respuestas inmunitarias del hospedero a, por ejemplo, las vacunas. Los adyuvantes intrínsecos, tales como los lipopolisacáridos, normalmente son los componentes de la bacteria destruida o atenuada y utilizadas como vacunas. Los adyuvantes extrínsecos son inmunomoduladores que normalmente no están enlazados en forma covalente a los antígenos y" están formulados para mejorar las respuestas inmunitarias del hospedero. De este modo, se han identificado adyuvantes que mejoran la respuesta inmunitaria a los antígenos suministrados en forma parenteral. Sin embargo, algunos de estos adyuvantes son tóxicos y pueden provocar efectos laterales indeseables, haciéndolos inadecuados para utilizarse en humanos y en muchos, animales. Por supuesto, solamente el hidróxido de aluminio y el fosfato de aluminio (comúnmente referidos en forma colectiva como alumbre) son utilizados rutinariamente como adyuvantes en vacunas para humanos y veterinarias. La eficacia del alumbre en el aumento de las respuestas de anticuerpos a los toxoides diftérico y tetánico está bien establecida. Una amplia gama de adyuvantes extrínsecos pueden provocar potentes respuestas inmunitarias a los antígenos. Estos incluyen saponinas acomplejadas con antígenos de proteína de membrana (complejos estimulantes inmunitarios) , polímeros plurónlcos con aceite mineral, microbacterias destruidas en aceite mineral, adyuvante completo de Freund, productos bacterianos, tales como muramil dipéptido (MDP) y lipopolisacárido (LPS), así como lípido A y liposomas. Para inducir en forma eficiente respuestas inmunitarias humorales (HIR) y la inmunidad mediada por células (CMI), los inmunógenos frecuentemente son emulsificados en adyuvantes. Muchos adyuvantes son tóxicos, inducen granulomas, inflamaciones agudas y crónicas (adyuvante completo de Freund, FCA) , citolisis (saponinas y polimeros Plurónicos) y pirogonicidad, artritis y uveitis anterior (LPS y MDP) . Aunque el FCA es un excelente adyuvante y es ampliamente utilizado en la investigación, no está autorizado su uso en vacunas humanas o veterinarias, debido a su toxicidad. Las características deseables de los adyuvantes ideales incluyen: (1) carencia de toxicidad; (2) habilidad para estimular una respuesta inmunitaria de larga duración; (3) simplicidad de manufactura y estabilidad durante el almacenamiento de largo plazo; (4) habilidad para inducir tanto la CMI como la HIR a los antigenos administrados por diversas rutas; (5) sinergia con otros adyuvantes; (6) capacidad de interactuar selectivamente con poblaciones de células que presentan antígenos (APC) : (7) habilidad para inducir específicamente las apropiadas respuestas inmunitarias específicas de células (8) habilidad para incrementar en forma selectiva los niveles apropiados del isotipo de anticuerpo (por ejemplo, IgA) contra los antígenos. La Patente de los Estados Unidos No. 4,855,283 otorgada a Lockhoff et al, el 8 de agosto de 1989, misma que se incorpora en la presente como referencia, enseña análogos del glicolípido que incluyen N-glicosilamidas, N-glicosilureas y N-glicosilcarbamatos, cada uno de los cuales es substituido en el residuo de azúcar por un aminoácido, como inmunomoduladores o adyuvantes. Así, Lockhoff et al. (Patente de los Estados Unidos No. 4,855,283 y referencia 60) reportaron que los análogos del N-glicolipido exhibían similaridades estructurales con los glicblípidos naturales, tales como glicoesfingolípidos y glicoglisirelípidos, son capaces de inducir fuertes respuestas inmunitarias en ambas vacunas del virus simple del herpes y del virus de la pseudorabia. Algunos glicolípidos han sido sintetizados a partir de alquilaminas de cadena larga y de ácidos grasos que están directamente enlazados a los azúcares a través del átomo de carbono anomérico, para imitar las funciones de los residuos lípidos naturaleza. La Patente de los Estados Unidos No. 4,258,029, otorgada a Moloney, cedida a la cesionaria de la presente e incorporada aquí como referencia, enseña que el clorohidrato de octacdecil tirosina (OTH) funciona como un adyuvante cuando se acompleja con el toxoide tetánico y la vacuna del virus de la poliomelitis de tipo I, II y III inactivada con formalina. También, Nixon-George et al. (Ref. 61), reportaron que los esteres del octadecilo de aminoácidos aromáticos acomplejados con un antígeno de superficie de la hepatitis B recombinante, aumentaron la respuesta inmunitaria del hospedero contra el virus de la hepatitis B.

EJEMPLOS La revelación anterior describe en general a la presente invención. Una comprensión más completa puede obtenerse con referencia a los siguientes ejemplos específicos. Estos ejemplos están descritos solamente con propósitos de ilustración y no se pretende que limiten el alcance de la invención. Están contemplados los cambios en la forma y la substitución de equivalentes conforme las circunstancias -puedan sugerirlo o hacerlo conveniente. Aunque en la presente se han utilizado términos específicos, se pretende que estos términos tengan un sentido descriptivo y no con propósitos de limitación. Los métodos de la bioquímica de las proteínas, de la fermentación y de la inmunología utilizados pero no explícitamente descritos en esta exposición y estos ejemplos están ampliamente reportados en la literatura científica y se encuentran dentro de la habilidad de los experimentados en la técnica.

Ejemplo 1 : Este ejemplo describe el crecimiento de la Bordetella pertussis. Semilla Maestra: Los cultivos de la semilla maestra de una cepa de Bordetella pertussis se mantuvieron como lotes de semillas secas por congelación, de 2° a 8°C. Semilla de Trabajo: El cultivo secado por congelación fue recuperado en medio de Hornibrook y utilizado para sembrar placas Bordet-Gengou Agar (BGA) . El medio de Hornibrook tiene la siguiente composición: Componente para 1 litro hidrolizato de caseína (tratado con carbón) 10.0 g Ácido nicotínico 0-001 g Cloruro de calcio 0.002 g Cloruro de Sodio _ 5.0 g Cloruro de magnesio hexahidratado 0.025 g Cloruro de potasio 0.200 g Fosfato dibásico de potasio 0.250 g Almidón 1.0 g Agua destilada para 1.0 litros , El pll se ajustó en__ 6.9 ± 0.1 con solución de carbonato de sodio al 1%. El medio se despacho en tubos y se esterilizó por tratamiento con vapor en autoclave durante 20 minutos y permaneció en el autoclave durante 20 minutos de 121 °C a 124 °C. La semilla se subcultivo dos veces, en primer lugar, sobre placas BGA y después en Agar de Componente de Pertussis (CPA) . El Agar de Componente de Pertussis (CPA) tiene la siguiente composición. NaCl 2.5 g/L KH2P04 0.5 g/L KCl 0.2 g/L MgCl2(H20)6 0.1 g/L Tris base 1.5 g/L Casaminoácidos 10.0 g/L NaHGlutamato 10.0 g/L HCl Conc. a pll 7.2 Agar 15.0 g/L Factores del crecimiento (CPGF) 10.0 mL/L Los Factores del Crecimiento del Componente de Pertussis (CPGF) - 100X tienen la siguiente composición: HCl L-cisteina 4.0 g/L Niacina 0.4 g/L Ácido ascórbico 40.0 g/L Glutationa, reducida 15.0 g/L Fe2SO„, (H20)7 1.0 g/L Dimetil -[.-ciclodextrina 100 g/L CAC12(H20)2 2.0 g/L El cultivo final se suspendió en Suspención Amortiguadora de Semilla de Pertussis (CPSB) , despachada en alícuotas de 2 a 4 ml y almacenada congelada de - 60°C a -85°C. La Suspensión Amortiguadora de Semilla de Pertussis (PSSB) tiene la siguiente composición: Casaminoácidos 10.0 g/L Tris base 1.5 g/L Glicerol anhidro 100 mL/L HCl Conc. hasta pH 7.2 Estas suspensiones de glicerol proporcionaron el material inicial para la preparación de la semilla de trabajo.

Proceso de Cultivo La propagación de la semilla de trabajo se condujo en botellas Roux de Agar Componente de Pertussis durante 4 a 7 días ha 34°C hasta 38°C. A .continuación de este cultivo, se eliminó el agar de las células con caldo componente de Pertussis (CPB) . Las muestras fueron observadas mediante tinsión Gram, para pureza del cultivo y opacidad. Las células fueron transferidas a matraces cónicos de 4 litros que contenían CPB y se incubaron de 34°C a 38°C durante 20 hasta 26 horas con agitación. Las muestras fueron observadas por tinción Gram y se comprobó la pureza del cultivo. El contenido de los matraces se agrupó y la suspensión se utilizó para sembrar dos fermentadores que contienen CPB (comenzando con un volumen de 10 litros a OD600 0.1-0.4). La semilla se desarrollo hasta un OD600 final de 5.0 a 10.0. Las muestras fueron probadas mediante cepa Gram, por la pureza del cultivo, mediante ELISAs específicos de antígencs y por la esterilidad.

Ejemplo 2 : Este Ejemplo describe la purificación de antígenos a partir del cultivo de la célula de Bordetella pertussis. Producción del Caldo y concentrados Celulares : La suspensión bacteriana se cultivó en dos fermentadores de producción, de 34 °C a 37°C durante 35 a 50 horas. Los fermentadores fueron muestreados para probar la esterilidad del medio. La suspensión se alimentó a una centrífuga de disco apilado de flujo continuo (12,000 x g) para separar las células del caldo. Las células se recolectaron para esperar la extracción del componente fimbrial. El líquido clarificado se hizo pasar a través de un filtro de membrana = 0.22 µm. El líquido filtrado se concentró mediante ultrafilfración utilizando una membrana con peso molecular limite nominal (NMWL) de 10 a 30 kDa. El concentrado se almacenó para esperar la separación y purificación de los componentes de Toxina de Pertussis (PT) , Hemaglutonina Filamentosa (FHA) y proteína 69 kDa (pertactina) .

Separación de los Componentes del Caldo Los componentes del caldo (69 kDa, PT y FHA) se separaron y purificaron mediante cromatografía en perlita y pasos de elusión selectiva, esencialmente según se describe en la Patente Europea No. 336 736 y en la solicitud de PCT publicada por los solicitantes No. WO 91/15505, descrita anteriormente. Las operaciones específicas de purificación efectuadas se describen más adelante.

Toxina de Pertussis (PT) : La columna de la perlita se.lavó con Tris 50 mM, Tris 50 mM/Triton X-100 0.5% y con reguladores de Tris 50 mM. La fracción PT se eluyó de la columna de perlita con regulador Tris 50 mM/NaCl 0.12M. La fracción PT de la cromatografía de perlita se cargó en una columna de hidroxil apatita y se lavó entonces con regulador de fosfato de potasio 30 mM. La PT se eluyó con regulador de fosfato de potasión 75 mM/NaCl 225 mM. La columna se lavó con fosfato de potasio 200 mM/NaCl 0.6M para obtener la fracción FHA que se desecho. Se añadió glicerol a la PT purificada hasta el 50% y la mezcla se almaceno de 2CC a 8°C hasta de la destoxificación dentro de una semana.

Hemaglutonina Filamentosa (FHA) : La fracción FHA se eluyó de la columna de perlita con Tris 50 mM/NaCl 0.6M. la hemaglutinina filamentosa se purificó mediante cromatografía sobre hidroxilapatita. La fracción FHA de la columna de perlita se cargo en una columna de hidroxilapatita, se lavó entonces con fosfato de potasión 30 mM que contiene Tritón X-100 al 0.5%, seguida de un regulador de fosfato de potasión 30 mM. La fracción PT se eluyó con regulador de fosfato de potasio 85 mM y se desecho. La fracción FHA se eluyó entonces con fosfato de potasión 200 mM/NaCl 0.6 M y se almacenó de 2°C a 8°C, hasta la destoxificación dentro de una semana. proteína de 69 kDa (pertactina) : El concentrado del caldo se diluyó con agua inyectable (WFI) para obtener una conductividad de 3 a 4 mS/cm y se cargó en una columna de perlita a una carga de 0.5 a 3.5 mg de proteína por ml de perlita. La porción pasante (Fracción Componente de 69 kDa) se concentró por ultrafiltración utilizando una membrana NMWL de 10 a 30 kDa. Se añadió sulfato de amonio al concentrado de la porción pasante hasta 35% + 3% (p/v) y la mezcla resultante se almaceno de 2°C a 8°C durante 4 ± 2 días o se centrifugo (7,00 x g) inmediatamente. El exceso de sobrenadante se decantó y el precipitado se recolectó mediante centrifugación (7,000 x g) . El glóbulo de 69 kDa se almacenó congelado de -20°C a -30°C o se .disolvió en Tris o amortiguador de fosfato y se utilizó inmediatamente. La proteína de la membrana externa de 69 kDa obtenida mediante la precipitación con sulfato de amonio al 35% (p/v) " de la porción pasante de perlita concentrada se utilizó para la purificación. Se añadió sulfato de amonio (100 ± 5 g por litro) a la fracción 69 kDa y la mezcla se agitó durante al menos 2 horas de 2°C a 8°C. La mezcla se centrifugó (7,00 x g) para recuperar el sobrenadante. Se añadió-' sulfato de amonio (de 100 a 150 g por litro) al sobrenadante y la mezcla se agitó durante al menos 2 horas de 2°C a 8°C. La mezcla se centrifugó (7,000 x g) para recuperar el aglomerado, el cual se disolvió en Tris 10 mM, HCl, pH 8. La concentración o fuerza iónica de la solución se ajustó al equivalente de Tris HCl 10 mM (pH 8) que contenía sulfato de amonio 15 mM. La proteína de 69 KDa se aplicó a una columna de hidroxilapatita conectada, en serie con una columna de Q-Sepharose. La proteina 69 kDa se recolectó en la porción pasante, se lavó de las columnas por arrastre con Tris 10 mM, HCl (pH 8), conteniendo sulfato de amonio 15 mM y se agrupó con la proteína 69 kDa de la porción pasante. La reunión de la proteína 69 kDa se diafiltró con 6 a 10 volúmenes de fosfato de potasio 10 mM (pH 8), conteniendo NaCl 0.15M en una membrana NMWL de 100 a 300 kDa. El ultrafiltrado se recolectó y la proteína 69 kDa se concentró en el ultrafiltrado. La proteína 69 kDa se intercambio mediante solventes en Tris 10 mM HCl (pH8) y se adsorbió en Q-Sepharose, se lavó con Tris HCl 10 mM (pH 8) /sulfato de amonio 5 mM.. la proteina de 69 kDa se eluyó con fosfato de potasio 50 mM (pH 8). La proteína 69 kDa "se diafiltró de 6 a 10 volúmenes de fosfato de potasio 10 mM (pH 8) conteniendo NaCl 0.15M en una membrana NMWL de 10 a 30 kDa. La proteína 69 kDa se esterilizó por filtración a través de un filtro = 0.22 µm este volumen estéril se almacenó de 2°C a 8°C y la adsorción se realizó dentro de 3 meses.

Aglutinógenos Fimbriales : Los aglutinogenos fueron purificados a partir de la pasta celular después de la separación del caldo. La pasta celular se diluyó a una fracción de volumen de 0.05 de las células en un regulador que contiene fosfato de potasio 10 mM, NaCl 150mM y urea 4M y se mezcló durante 30 minutos. El lisado celular se clarificó mediante centrifugación (12,000 x g) , entonces se concentró y diafiltró contra fosfato de potasio 10 mM /NaCl 150 mM/Triton X-100 al 0.1% utilizando un filtro de membrana NMWL de 100 a 300 kDa. El concentrado se trató térmicamente a 80°C durante 30 minutos, entonces se reclarificó mediante centrifugación (9,000 x g) . Se añadió PEG 8000 al sobrenadante clarificado hasta una concentración de 4.5% ± 0.2% y se agitó suavemente durante un mínimo de 30 minutos. El precipitado resultante se recolectó durante centrifugación (17,000 x g) y el glóbulo se extrajo con amortiguador de fosfato de potasión 10 mM/NaCl 150mM para proporcionar una solución de algutinógeno fimbrial crudo. Los aglutionógenos fimbriales se purificaron pasándolos sobre sílice PEÍ. La solución cruda se hizo de 100 mM con respecto al fosfato de potasio utilizando regulador de fosfato de potasio ÍM y se hizo pasar a través de la columna de sílice PEÍ. La porción pasante de las columnas se concentró y diafiltró contra regulador de fosfato de potasión lOmM/NaCl 150mM utilizando un filtro de membrana NMWL de 100 a 300 kDa. Este volumen estéril se almacenó de 2°C a 8°C y la adsorción se efectúo dentro de 3 meses. La preparación de aglutinogeno fimbrial contenía Agg fimbrial 2 y Agg fimbrial 3 en una proporción en peso de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 2:1 y se encontró que estaba substancialmente libre del Agg 1.

Ejemplo 3 : Este ejemplo describe la toxificación de los antígenos de Bordetella pertussis purificados, PT y FHA. El PT, preparado en forma pura según se describió en el Ejemplo 2, se toxifico al ajustar la concentración de glutaraldehído en la solución de PT a 0.5% ± 0.1% e incubarlo a 37°C ± 3° durante 4 horas. La reacción se detuvo al añadir L-aspartato hasta 0.21 ± 0.02M. La mezcla se mantuvo entonces a temperatura ambiente durante 1 ± 0.1 horas y, entonces de 2°C a 8°C de 1 a 7 días. La mezcla resultante se diafiltró contra un regulador de fosfato de potasio lOmM/NaCl 0.15M/glicerol al 5% sobre un filtro de membrana NMWL 30 kDa y se esterilizó entonces mediante el paso a través de un filtro de membrana < 0.22 µm. Este volumen estéril se almacenó de 2°C a 8°C y la adsorción se efectúo dentro de tres meses. La fracción FH?, preparada en forma pura según se describe en el Ejemplo 2, se toxificó al ajustar la concentración de L-lisina y de formaldehído a 47 ± 5mM y 0.24 ± 0.05% respectivamente e incubarla de 35°C a 38°C durante 6 semanas. La mezcla se diafiltró entonces contra fosfato de potasio lOmM/NaCl 0.5M, utilizando un filtro de membrana NMWL 30 kDa y se esterilizó mediante el paso a través de un filtro de membrana. Este volumen estéril se almacenó de 2°C a 8°C y la adsorción se efectúo dentro de 3 meses.

Ejemplo 4: Este ejemplo describe la adsorción de los antígenos de Bordetella pertussis purificados. Para la adsorción individual de PT, FHA, Ayg y 69 kDa sobre fosfato de aluminio (alumbre) , se preparó una solución madre de fosfato de aluminio a una concentración de 18.75 ± 1 mg/ml. Se preparó un recipiente adecuado y cualquiera de los antígenos se despacho asépticamente hacia el recipiente. Se añadió asépticamente 2-fenoxietanol para producir una concentración final de 0.6% f~ 0.1% v/v y se agitó hasta la homogeneidad. En forma aséptica se añadió ' al recipiente el volumen apropiado de fosfato de aluminio.

Se añadió el volumen apropiado de agua destilada estéril para llevar la concentración final a 3 mg de fosfato de aluminio/ml. Los contenedores o envases se sellaron y etiquetaron y se les dejó agitándose a temperatura ambiente durante 4 días. El recipiente se almacenó entonces en espera de la formulación final.

Ejemplo 5 : Este ejemplo describe la formulación de una vacuna componente de pertussis combinada con toxoides diftérico y tetánico. Los antígenos B. pertussis preparados según se describió en los ejemplos precedentes, ee formularon con los toxoides difético y tetánico para proporcionar diversas vacunas componente de pertussis (CP) , según se describe más adelante. Los componentes de pertussis se produjeron a partir de Bordetella pertussis desarrollada en un cultivo sumergido según se describió con detalle en los anteriores Ejemplos 1 a 4. Después del término del crecimiento, el caldo de cultivo y las células bacterianas se separaron mediante centrifugación. Cada antígeno se purificó individualmente. La toxina de la pertussis (PT) y la hemaglutinina filamentosa (FHA) se purificaron a partir del caldo mediante cromatografía secuencial sobre perlita e- hidroxilapatita . La PT se destoxifico con glutaraldehído y cualquier PT residual (aproximadamente 1%) presente en la fracción FH? se destoxificó con formaldehído. Los aglutinogenos fimbriales (2+3) (AGG) se prepararon a partir de las células bacterianas. Las células se alteraron con urea y se trataron térmicamente, y los aglutinógenos fimbriales se _ purificaron mediante precipitación con polietilenglicol y cromatografía sobre sílice polietilenimina. El componente proteína 69 kDa (pertactina) se aisló de la porción pasante por medio del paso de cromatografía en perlita (Ejemplo 2) mediante precipitación con sulfato de amonio y se purifico mediante cromatografía secuencial sobre hidroxilapatita y Q-sepharose. Todos los componentes se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de membrana de 0.22 µm. El toxoide diftérico se "preparo a partir de Corynejacteriupi diph theriae desarrollada en cultivo sumergido mediante métodos normales. La producción del toxoide diftérico se dividió en cinco etapas, a saber, mantenimiento de la semilla de trabajo, crecimiento de la Corynebacterium diphtheriae, cosecha de la toxina diftérica, destoxificación de la toxina diftérica y concentración del toxoide diftérico.

Preparación del Toxoide Diftérico (I) Semilla de Trabajo La cepa de Corynebacterium diphtheriae, se mantuvo como un lote de semilla secado por congelación. La semilla reconstituida se desarrollo en pendiente de Loeffler de 18 a 24 horas a 35°C ± 2°C y se transfirieron entonces a matraces de medio diftérico. Al cultivo se le probaron entonces la pureza y el contenido de Lf. El resto de las semillas se utilizo para inocular un fermentador. (II) Crecimiento de Corynebacterium diphtherxae El cultivo se incubo a 35°C ± 2°C y se agito en el fermentador. Al cultivo se añadieron cantidades predeterminadas de sulfato ferroso, cloruro de calcio y soluciones de fosfato. Las cantidades reales de cada solución (fosfato, sulfato ferroso, cloruro de calcio) se determinaron experimentalmente para cada lote del medio. Los niveles elegidos son aquéllos que proporcionaron el contenido de Lf más elevado. Al termino del ciclo de crecimiento (de 30 a 50 horas) , los cultivos se muestrearon para la pureza y el contenido de Lf.

El pH se ajusto con bicarbonato de sodio y el cultivo se inactivo con tolueno al 0.4% durante 1 hora a una temperatura sostenida de 35°C ± 2°C Entonces se realizó una prueba de esterilidad para confirmar la ausencia de C. diphtheriae viva. (III) Cosecha de la Toxina Diftérica Los cultivos tratados con tolueno provenientes de uno o de varios fermentadores se unieron en un gran tanque. Se añadió aproximadamente bicarbonato de sodio al 0.12%, carbón 0.25% y sulfato de amonio al 23%, y se probó el pH.

La mezcla se agitó durante aproximadamente 30 minutos. Se añadió tierra de diatomeas y la mezcla se bombeo hacia un filtro de profundidad. El filtrado se recirculó hasta que se aclaró, se recolectó entonces y se muestreó para probar el contenido de Lf. Al filtrado se añadió sulfato de amonio adicional para proporcionar una concentración del 40%. También se añadió tierra de diatomeas. Esta mezcla se mantuvo de 3 a 4 días de 2°C a 8°C para permitir que el precipitados se sedimentara. La toxina precipitada se recolectó y disolvió en solución salina al 0.9.. la tierra de diatomeas se elimino mediante filtración y la toxina se sometió a diálisis contra solución salina al 0.9% para eliminar el sulfato de amonio. La toxina dializada se reunió y se muestreo para probar el contenido de Lf y la pureza.

(IV) Destoxificasión de la Toxina Diftérica La destoxificación ocurre inmediatamente después de la diálisis. Para la destoxificación, la toxina se diluyó de modo que la solución final contenía: a) Toxina diftérica a 1000 ± 10% Lf/ml. b) 0.5% de bicarbonato de sodio c) 0.5% de formalina d) 0.9% p/v de monoclorohidrato de L-lisina La solución se llevó hasta el volumen con solución salina y el pH se ajusto a 7.6 ± 0.1. El toxoide se filtro a través de almohadillas filtrantes de celulosa tierra de diatomeas y/o un prefiltro. de membrana y un filtro de membrana de 0.2 µm en un recipiente de recolección y se incubó de 5 a 7 semanas a 34°C. Se extrajo una muestra para probar la toxicidad. (V) Concentración del Toxoide Purificado Los toxoides se unieron, se concentraron entonces por ultrafiltración y se recolectaron en un depósito adecuado. Se tomaron muestras para probar el contenido de Lf y la pureza. Se añadió el conservador (2-fenox?etanol) para proporcionar una concentración final de 0.375 y el pH se ajusto de 6.6 a 7.6. El toxoide se esterilizó mediante filtración a través de un prefiltro y de un filtro de membrana de 0.2 µm (o equivalente) y se recolectó. El toxoide estéril se muestreo entonces para probar la irreversibilidad del contenido de Lf del toxoide, el contenido del conservador, la pureza (contenido de hidrógeno) la esterilidad y la toxicidad. El toxoide concentrado y estéril se almacenó de 2°C a 8°C (hasta la formulación final).

Preparación del Toxoide Tetánico El taxoide tetánico (T) se preparó a partir de Clostpdium tetam desarrollado en un cultivo sumergido. La producción de Toxoide Tetánico puede dividirse en cinco etapas, a saber, mantenimiento de la semilla de trabajo, crecimiento del Clostridium tetaní, cosecha, de la Toxina Tetánica, destoxificación de la Toxina Tetánica y purificación del Toxoide Tetánico. (I) Semilla de Trabajo La cepa de Clostridi um tetani, utilizada en la producción de la toxina tetánica para la con conversión en toxoide tetánico se mantuvo en forma liofilizada en un lote de semillas. Las semillas se inocularon en un medio de tioglicolato y se les dejó crecer aproximadamente durante 24 horas a 35°C i 2°C. Se tomó una muestra para probar la pureza del cultivo- (II) Crecimiento de Clostrid±um tetani El medio tetánico se despacho hacia un fermentador, se trato térmicamente y se enfrió. El fermentador se sembró entonces y se dejó que el cultivo creciera de 4 a 9 días a 34°C ± 2°C. Se tomo una muestra para probar la pureza del cultivo y el contenido de Lf. (III) Cosecha de la Toxina Tetánica La toxina se separó mediante filtración a través de almohadillas de celulosa tierra de diatomeas y la toxina clarificada se esterilizó por filtración utilizando filtros de membrana. Se tomaron muestras para probar el contenido de Lf y la esterilidad. La toxina se concentró mediante ultrafiltración, utilizando un tamaño de poro de 30,000 daltones . (IV) Destoxificación de la Toxina Tetánica La toxina fue muestreada para probar el contenido de Lf antes de la destoxificación. La toxina concentrada (de 475 a 525 Lf/ml) se destoxifico mediante la adición de bicarbonato de sodio al 0.5% p/v, formalina al 0.3% v/v y monoclorohidrato de L-lisina al 0.9% w/v y se llevó hasta el volumen con solución salina. El pH se ajusto a 7.5 ± 0.1 y la mezcla se incubó a 37°C de 20 a 30 días. Se tomaron muestras para probar la esterilidad y la toxicidad. (V) Purificación del Toxoide El toxoide concentrado se esterilizo por medio de prefiltros, seguidos por filtros de membrana de 0.2 µm. Se tomaron muestras para probar la esterilidad y el contenido de Lf.

La concentración óptima del sulfato de amonio se basó en una curva de fraccionamiento "S" determinada a partir de muestras del toxoide. La primera concentración se añadió al toxoide (diluido a 1900-2100 Lf/ml) . La mezcla se mantuvo durante al menos 1 hora de 20°C a 25°C y el sobrenadante se recolecto y el precipitado que contenida a la fracción de alto peso molecular, se desecho. Al sobrenadante se añadió una segunda concentración de sulfato de amonio para el segundo fraccionamiento para eliminar las impurezas de bajo peso molecular. La mezcla se mantuvo durante al menos 2 horas de 20°C a 25°C y, pudo entonces mantenerse de 2°C a 8°C durante un máximo de tres días. El precipitado, que representa al toxoide purificado, se recolectó mediante centrifugación y filtración. Del toxoide purificado se elimino el sulfato de amonio por diafiltración, utilizando membranas de ultrafiltración Amicon (o equivalente) con PBS hasta que en la solución del toxoide no pudo detectarse más sulfato de aluminio. El pH se ajusto de 6.6 a 7.6 y, se añadió 2-fenoxietanol para proporcionar una concentración final de 0.375%. El toxoide se esterilizó por filtración en membrana y se tomaron muestras para probar (la irreversibilidad del toxoide, el contenido de Lf, el pH, el contenido de conservador, la pureza, la esterilidad y la toxicidad) .

Formulación de Vacuna Multivalente Una formulación de una vacuna componente de pertussis combinada con toxoides diftérico y tetánico se denominó CP10/5 5/3DT (llamada algunas veces CLASSIC) . Cada dosis humana de 0.5 ml de CP10 5 5 3DT se formuló para contener: 10 µg del toxoide de pertussis (PT) 5 µg de hemaglutonina filamentosa (FHA) 5 µg de aglutinogenos fimbriales 2 y 3 (FIMB) 3 µg de proteína de membrana externa de 69 kDa 15 Lf de toxoide diftérico 5 Lf de toxoide tetánico 1.5 mg de fosfato de aluminio 0.6% de 2-fenoxietanol como conservador Otra formulación de la vacuna componente de pertussis combinada con toxoides diftérico y tetánico se denominó CP10/5 5DT (llamada algunas veces HYBRID) . Cada dosis humana de 0.5 ml de la CP10/5 5DT se formuló para contener: 10 µg del toxoide de pertussis (PT) 5 µg de hemaglutonina filamentosa (FHA) 5 µg de aglutinogenos fimbriales 2 y 3 (FIMB) 15 Lf de toxoide diftérico _ Lf de toxoide tetánico 1.5 mg de fosfato de aluminio 0.6% de 2-fenoxietanol como conservador Otra formulación de la vacuna componente de pertussis combinada con toxoides diftérico y tetánico se denominó CP20/20 5 3D . Cada dosis humana de 0.5 ml de la CP20/20/5/3DT se formuló para contener: 20 µg del toxoide de pertussis (PT) 20 µg de hemaglutonina filamentosa (FHA) 5 µg de aglutinogenos fimbriales 2 y 3 (FIMB) 3 µg de proteína de membrana externa de 69 kDa 15 Lf de toxoide diftérico _ 5 Lf de toxoide tetánico 1.5 mg de fosfato de aluminio 0.6% de 2-fenoxietanol como conservador Una formulación adicional de una vacuna componente de pertussis combinada con toxoides diftérico y tetánico fue denominada CP20/10 10 6DT. Cada dosis humana de 0.5 ml de la CP20 10 10 6DT fue formulada para contener: 20 µg del toxoide de pertussis (PT) 10 µg de hemaglutonina filamentosa (FHA) 10 µg de aglutinogenos fimbriales 2 y 3 (FIMB) 6 µg de proteína de membrana externa de 69 kDa 15 Lf de toxoide diftérico 5 Lf de toxoide tetánico 1.5 mg de fosfato de aluminio 0.6% de 2-fenoxietanol como conservador Ejemplo 6: Este ejemplo describe la evaluación clínica de las vacunas Componente Acelular de Pertussis. (a) Estudios en Adultos Los estudios en adultos y niños de 16 a 20 meses de edad indicaron que las vacunas multicomponente contienen aglutinógenos fimbriales seguros e inmunogénicos (Cuadro 2) . Un estudio clínico Fase I se efectuó en niños de 17 y 18 meses en Calgary, Alberta, con la vacuna de Pertussis de cinco componentes (cl?10/5/5/3DT) Y ?e reportaron las reacciones adversas. Treinta y tres niños recibieron la vacuna y otros treinta y cinco recibieron la misma vacuna sin el componente de la proteína 69kDa. Las reacciones locales fueron raras. Las' reacciones adversas sistémicas, principalmente consistentes de irritabilidad estuvieron presente en aproximadamente la mitad de los participantes en el estudio, sin importar cual fue la vacuna administrada. Las elevaciones significativas de anticuerpos se midieron para aglutinógenos anti-PT, anti-FHA, anti-fimbrial y los anticuerpos anti-IgG 69kDa por inmunoensayo enzimático y para el anticuerpo anti-PT en la prueba de neutralización de célula CHO. No se detectaron diferencias en la respuesta de anticuerpos en niños que recibieron los cuatro componentes (CP?o/5/sDT) o los cinco componentes (CP?o/5/5/3DT> excepto en el anticuerpo anti-69kDa. Los niños que recibieron la vacuna de cinco componentes que contenía la proteína 69 kDa tuvieron un nivel de anticuerpos anti-69 kDa después de la inmunización, significativamente superior. Un estudio dosis-respuesta se llevó a cabo con la vacuna de 4 componentes en Winnipeg, Manitoba, Canadá. Se utilizaron formulaciones de vacuna de dos componentes: CP10/5/53DT y CP o/lo/10/6DT- Una vacuna DPT de célula completa también se incluyó como control. Este estudio fue un estudio doble ciego en bebés de 91, 17 y 18 meses en el momento de su primera dosis de refuerzo de pertusis. Tanto CP10/5/5/3DT y CP o/?o/10/6DT fueron bien toleradas en estos niños. No se demostraron diferencias en el número de niños que tuvieron alguna reacción local o reacciones sistémicas después de cualquiera de las vacunas componentes. En contraste, significativamente más niños que recibieron la vacuna de célula completa presentaron reacciones locales y sistémicas que aquéllos que recibieron las vacunas componentes cp20/10/10/6°T.

Estudios en Lactantes: Fase II: Se realizó un estudio utilizando la vacuna cp10/5/5/3DT en Calgary, Alberta y en British Columbia, Canadá. En este estudio, 432 lactantes recibieron la vacuna componente de pertussis o la vacuna de control de célula completa DPT a los 2, 4 y 6 meses de edad. La vacuna CP n/5/5/3DT fue bien tolerada por estos lactantes. Las reacciones locales fueron menos comunes con la vacuna componente que con la vacuna de célula completa, después de cada dosis. Una respuesta de anticuerpo significativa a todos los antígenos se demostró después de la vacunación con la vacuna de pertussis componente. Los recipientes de la vacuna de célula completa tuvieron una respuesta de anticuerpo vigorosa a los aglutinógenos fimbriales, D y T. A los siete meses, 82 a 89% de los recipientes de la vacuna componente y 92% de lo recipientes de la vacuna de célula completa tuvieron un aumento de cuatro veces o mayor en la elevación del título de anticuerpos a los aglutinógenos fimbriales. En contraste, la respuesta de anticuerpo a FHA fue de 75 a 78% en vacunas componentes, en comparación con 31% de recipientes de célula completa. Se observó un aumento de cuatro veces en el anticuerpo anti-69 kDa en 90 a 93% de las vacunas componentes y 75% de los recipientes de célula completa. Se observó una elevación del cuádruple en los anticuerpos contra PT, por inmunoensayo enzimático, en 40 a 49% de los vacunados con la vacuna componente y 32% de los vacunados con la vacuna de célula completa. Se encontró una elevación de cuatro veces en el anticuerpo PT, por neutralización de CHO, en 55 a 69% de los vacunados con la vacuna componente y 6% de los vacunados con la vacuna de célula completa. (Cuadro 2). Fase IIB: Las vacunas CP2o/20/5/3DT Y CP10/?o/5/3DT se valoraron en un estudio ciego aleatorizado contra un control de D]_5PT, con un contenido bajo de difteria de 15 Lf en comparación con la formulación de 25 Lf, en 100 lactantes a los 2, 4 y 6 meses de edad. No hubo diferencias en las tasas de reacciones adversas que se detectaron entre las dos formulaciones componentes, ambas fueron significativamente menos reactogénicas que el control de célula completa. Se lograron títulos de anticuerpo mayores contra PT, por inmunoensayo enzimático y neutralización de CHO y FHA, en los recipientes de la vacuna CP u/2o/5/3DT, on un contenido de antígenos mayor. A los 7 meses, la media geométrica del título de anti-FHA fue de 95.0 en los recipientes CP Q/ 0/5/3DTÍ 45.2 en los recipientes CPi 0/5/5/3DT, y solamente 8.9 en los recipientes D15PT. Los títulos anti-PT fueron 133.3, 58.4 y 10.4 por inmunoensayo y 82.4, 32.7 y 4.0 por neutralización con CHO, respectivamente (Cuadro 2) . Este estudio demostró que la vacuna componente de Pertussis combinada con toxoides tetánicos y difteria adsorbidos, con un aumento en el contenido de antígeno, fue segura e inmunogénica en lactantes y que el contenido aumentado de antígeno aumentó la respuesta inmunitaria a los antígenos preparados (PT y FHA) sin un aumento en la reactogenicidad.

Ensayo Comparativo en los Estados Unidos NIAID, FASE II : Un estudio fase II se efectúa en los Estados Unidos ba o el auspicio del Instituto Nacional de Enfermedades Alérgicas e Infecciosas (NIAID) como un preludio para un ensayo de eficacia a gran escala para las vacunas acelulares de pertussis. Una vacuna componente de pertussis de la invención, en combinación con toxoides tetánicos y difteria adsorbidos (CPj_n/5/5/3DT) se incluyó en el ensayo junto con otras 12 vacunas acelulares y 2 vacunas de célula completa. Los resultados de seguridad se reportaron en 137 niños inmunizados a los 2, 4 y 6 meses de edad con la vacuna componente CP10/5/5/3DT. Como se observó en estudios previos, la vacuna componente resultó ser segura, de baja reactogenicidad y bien tolerada por los vacunados.

A los 7 meses, el anticuerpo anti-PT, el anticuerpo anti-FHA, el anticuerpo anti-69kDa y el anticuerpo de aglutinógenos anti-fimbriales todos fueron elevados en mayor grado o en grado equivalente a los niveles logrados después de la vacuna de célula completa (referencia 71 y Cuadro 2) . Se efectuó un estudio doble ciego en el que los niños se asignaron aleatoriamente a recibir ya sea la formulación de vacuna CP2o/20/5/3DT ° J-a vacuna CP10/5/5/3DT. Un total de 2050 lactantes fueron incluidos en los Estados Unidos y en Canadá, 1961 lactantes completaron el estudio. Las dos formulaciones de vacuna fueron seguras, de baja reactogenicidad e inmunogénicas en estos lactantes. La inmunogenicidad se valoró en un subgrupo de 292. Una elevación de anticuerpos se indujo hacia todos los antígenos contenidos en la vacuna, por las dos formulaciones de vacuna. La formulación CP20/20/5/3DT indujo títulos de anticuerpo superiores contra FHA pero no contra PT. La formulación CP10/5/5/3DT indujo títulos superiores contra fimbrias y títulos superiores de aglutinógeno. Otro estudio de seguridad e inmunogenicidad se efectuó en Francia. El diseño del estudio fue similar al del estudio en Estados Unidos que se describió antes, _ excepto porque las vacunas se administraron a los 2, 3 y 4 meses de edad. Las reacciones locales y sistémicas fueron en general menores. En general, la vacuna fue bien aceptada por los participantes en el estudio francés, utilizando este régimen de administración.

Ensavo de e icacia controlado por placebo de dos vacunas acelulares de pertusis y_ de una vacuna de célula completa en 10, 000 lactantes. Después de los resultados del ensayo comparativo en Estados Unidos, NIAID Fase II, se seleccionaron una vacuna de dos componentes y una vacuna acelular de cinco componentes para un ensayo multicéntrico, controlado, de doble aleatorización, controlado con placebo, para determinar eficacia. El ensayo clínico se efectuó en Suecia, en donde hubo una alta incidencia de pertusis. La vacuna de dos componentes con tubo PT (25µg) inactivado con gliceraldehído y formalina, FHA tratado con formalina (25 µg) y toxoide diftérico 17 Lf y toxoide tetánico 10 Lf. La vacuna de cinco componentes de pertusis fue CP10/5/5/3DT.

Para el ensayo, se admitieron diez mil lactantes que representaban aproximadamente la mitad de lactantes de este grupo de edad en Suecia, en 14 estudios de sitio definidos geográficamente, por el uso de registro de nacimientos. Los niños nacidos en enero y febrero de 1992 se asignaron aleatoriamente a un ensayo de 3 ramas. Después del consentimiento paterno, dos tercios de los lactantes recibieron una de las dos preparaciones" de difteria-tétanos-pertusis acelular a los dos, cuatro y seis meses de edad. El grupo control recibió solamente DT. En mayo de 1992, se introdujo una vacuna DTP de célula completa, comercialmente disponible, autorizada por los Estados Unidos, y los niños nacidos de marzo a- diciembre de 1992 fueron aleatorizados a un ensayo de 4 ramas. Después del consentimiento paterno, tres cuartos - de los niños recibieron una de las tres preparaciones de DTP a los dos, cuatro y seis meses de edad. El grupo de control solamente recibió la DT. Cada vacuna se administró aproximadamente 2500 niños. Las vacunas se administraron en tres dosis, la primera vacuna se proporcionó a los 2 meses de edad y a más tardar a los 3 meses de edad. Las dosis subsecuentes se administraron con intervalos de 8 semanas. Las vacunas se administraron por inyección intramuscular. Los niños y sus padres recibieron un seguimiento de 30 meses. Si se sospechaba pertusis, se recolectaban los datos clínicos y se conseguía la verificación de laboratorio por aspirados nasales para ser un cultivo bacteriológico y un diagnóstico por reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Se recolectaron muestras sanguíneas aguda y convaleciente para el diagnóstico serológico. Antes de este estudio, se desconocía el grado de pertactina proporcionado por las vacunas componentes de pertusis de la presente invención en una población humana en riesgo (particularmente neonatos) . En particular, la contribución de los diferentes componentes de Bordetella y su presencia en las vacunas de pertusis en cantidades relativas seleccionadas, en la eficacia de las vacunas, era desconocida. El primer objetivo del ensayo era estimar la capacidad de las vacunas de pertusis acelular y de las vacunas de célula completa de proteger contra pertusis típico, en comparación Con un placebo. Un segundo punto final era explorar la eficacia de la vacuna contra la infección confirmada con pertusis de diferente gravedad. La eficacia de la vacuna se definió como el porcentaje de reducción en la probabilidad de contraer pertusis entre los recipientes de la vacuna en relación a niño no vacunados. El riesgo relativo de pertusis en dos grupos de vacuna se expresó como la proporción de la probabilidad de enfermedad en los dos grupos. La probabilidad de contraer pertusis, también llamada taza de ataque, puede estimarse en diferentes formas. En el cálculo del tamaño de muestra, la probabilidad de contraer pertusis en un grupo de estudio específico se estima por el cociente entre el número de niños con pertusis y los niños restantes en el grupo de estudio, a la terminación del seguimiento del estudio. La eficacia de la vacuna componente CP?o/5/5/3DT en este ensayo para evitar pertusis típico, se muestra en el Cuadro 4 y fue de aproximadamente 85%. En el mismo ensayo, una vacuna acelular de pertusis, de dos componentes que contenía solo PT y FHA fue aproximadamente 58% eficaz y una vacuna de célula completa fue aproximadamente 48% eficaz. El CP]_n/5/5/3DT también fue eficaz en prevenir pertusis leve a una eficacia estimada de- aproximadamente 77%.

Ejemplo 7 Este ejemplo describe la formulación y la inmunogenicidad de la vacuna de combinación multivalente que contiene al polisacárido capsular de Haemophilus influenzae . (a) Preparación del Componente PRP-T __ El polisacérido capsular (PRP) de H. influenzae se purificó y conjugó con el toxoide tetánico en la siguiente forma. A partir de ampolletas liofilizadas de un lote de semillas de trabajo de H. influenzae, se efectuaron tres precultivos sucesivos. El primer precultivo se hizo en medio sólido. Las ampolletas se inocularon en de agar carbón + sangre hervida (10% de sangre de caballo calentada por 15 minutos a 80°C) y se incubaron por 20 ± 4 horas a 36°C-37°C bajo C02. El segundo precultivo se hizo en medio líquido, durante 8 horas a 37°C. El medio líquido tuvo la siguiente composición por litro: 1. Casaminoácidos Difco 10 g Fosfato monosódico 2H2O 2.03 g Fosfato disódico 12H20 31.14 g Lactato de sodio (solución al 60%) 1.5 ml L-cisteína 0.07 g L-triptófanos 0.02 g CaCL2, 2H20 0.02 g (NH4)2 SO4 1 g MgS04, 7H20 0.4 g Antiespumante Dow Corning M.S.A a 25% en aceite de parafina 0.15 ml 2. Ultrafiltrado de hemina + dextrosa a una proporción de 20 g de dextrosa y 1 mg de hemina. Esta solución se añade con 5 mg de nicotinamida - adenina dinucleótido Esterilizado por filtración. 3. Extracto de levadura Difco 5 g Esterilizado por filtración El tercer cultivo se hizo en medio líquido, con agitación por 4 horas a 37 °C. El tercer precultivo se utilizó para inocular el fermentador y el cultivo se mantuvo con agitación, a 37 °C por 12 a 14 horas. El cultivo se recolectó en un tanque refrigerado. Se añadió formalina a una concentración de 10 ml/litro. El cultivo se conservó con agitación suave a + 4°C por 2 a 24 horas y después se centrifugó. La formalina añadida no tenía la intención de inactivar completamente la bacteria sino de detener el crecimiento e inhibir el metabolismo. Esta adición redujo la lisis celular con contaminación consecuente con componentes intracelulares. La duración de esta fijación fue de entre 2 y 24 horas y típicamente el cultivo se dejo por toda la noche antes de centrifugarse. El sobrenadante que contenía al polisacárido se recolectó y el aglomerado bacteriano se desechó. El proceso de purificación en general se desarrolló en un cuarto frío o en condiciones tales que la temperatura de los productos y reactivos fue menor o igual a + 10 °C, excepto por el paso de purificación con fenol que se llevó a cabo a temperatura ambiente. Después de la centrifugación del cultivo, el sobrenadante del cultivo se concentró. El polisacárido capsular se precipitó del. concentrado resultante por adición de centrimida para dar una concentración final de 5% P/V. La centrimida precipitó PS del fluido concentrado (SNF) . Algo de proteína, ácido nucleico y lipopolisacárido (LPS) también co-precipitaron. Los precipitados se recolectaron por centrifugación dejando algo de otros contaminantes y proteína en el SNF. El aglomerado resultante se recolectó por centrifugación y se almacenó a < -20°C. Los aglomerados se resuspendieron en solución NaCl 0.3 M y la suspensión se volvió a centrifugar. El NaCl disasocid selectivamente los complejos de centrimida y polisacárido. Algunos contaminantes (ácido nucleico, LPS, proteína) también se disociaron en el proceso. Se añadió al sobrenadante etanol absoluto previamente enfriado hasta una concentración final de 60%. El precipitado resultante se recolectó por centrifugación y se lavó con etanol absoluto frío. El precipitado se secó al vacío a 0-4°C y fue el producto intermedio. El producto intermedio se disolvió en buffer de acetato de sodio y con fenol a temperatura ambiente. La fase acuosa se recolectó por centrifugación continua. La extracción con fenol y la centrifugación pueden repetirse varias veces y la fase acuosa se dializa y diafiltra. El polisacárido capsular de la solución diafiltrada se precipitó por adición de etanol previamente enfriado hasta una concentración final de 60% en presencia de NaCl 0.3 M. El precipitado se recolectó por centrifugación, se lavó con etanol absoluto previamente enfriado, acetona y éter y se secó al vacío a 4°C. El precipitado seco después se molió para obtener un polvo fino en baja humedad y este producto constituyó el polisacárido tipo b purificado de Haemophílus influenzae.

El polisacárido purificado se disolvió en agua a fin de obtener una solución de 5 mg de polisacárido por ml, y se ajustó el pH a 10.8 ± 0.2 con NaOH. El bromuro de cianógeno como solución en agua, se añadió en proporciones de 0.5 mg de CNBr/mg de polisacárido. El pH de la mezcla de reacción se mantuvo con NaOH a 10.8 ± 0.2 por 35 a 40 minutos a 23 ± 3°C. El pH se disminuyó a pH9 con la adición de HCl. Se añadió dihidrazida de ácido adípico para dar una concentración final de 3.5 mg ADH/mg de polisacárido y se ajustó el pH a 8.5. La mezcla de reacción se incubó a 23 ± 3°C por 15 minutos (el pH se conservó a 8.5) y después la solución se incubó por toda la noche a + 4°C, con agitación suave. La mezcla de reacción se dializó contra solución NaCl y después se concentró. La solución se filtró a través de un filtro de 0.45 µ y congeló a < -40°C. Esto constituyó el AH-polisacárido y se almacenó a temperatura de < -40°C._ Para producir el componente de toxina de tétano, se inoculó una cepa de Clostrídium tetani en una serie de tubos que contenían 10 ml del medio Rosenow o medio tioglicolato. El medio Rosenow tiene la siguiente composición: Fórmula (en gramos por litro de agua destilada) Peptona 10 Extracto de carne 3 Glucosa 2 Cloruro de sodio 5 Indicador de "Andrade" (ácido Fuchsin al 5%) 10 ml Mármol blanco 1 pieza Cerebro 1 pieza El medio, preparado inmediatamente antes de utilizarlo, y preparado a partir de productos listos para usarse, se llenó en tubos y se esterilizó a 120 °C por 20 minutos . Una botella de 5 litros que contenía 3 litros del medio "Massachusetts" se inoculó con C. tetani y se incubó por 16 a 18 horas a 35°C ± 1°C por 16 horas. El contenido se transfirió entonces a un frasco de 20 litros que contenía 15 litros de medio "Massachusetts" estéril y se incubó 8 horas a 35°C ± 1°C. Cada botella se utilizó para inocular un fermentador que contenía 582 litros de medio "Massachusetts" y se incubó a 35 °C por 5 a 6 días con aereación. Los fermentadores se enfriaron y al cultivo se añadió cloruro de sodio 12kg, citrato de trisodio 8 kg. La agitación se mantuvo por un día y después se detuvo y este proceso permitió la extracción de la toxina residual a partir del bacteria, al final del cultivo. La toxina se clarificó ya sea por filtración o por pasos través de una centrífuga continua. El sobrenadante de 1200 litros de cultivo se concentró por ultrafiltración y la toxina concentrada se diafiltró contra solución de fosfato disódico 0.07 M, pH 8.2. El volumen final se ajustó a 500 Lf/ . Una doble precipitación con sulfato de amonio se efectuó para obtener la toxina de tétanos purificada. Por lo tanto, el sulfato de amonio y 10 g de carbón se añadieron lentamente por litro a la toxina diafiltrada, previamente obtenida. Después de 16 a 24 horas de incubación a + 4°C, la toxina se filtró en cartuchos para eliminar el precipitado. Después, se añadió lentamente una cantidad de sulfato de amonio suficiente para proporcionar 320 gm/L, en el sobrenadante previamente obtenido. Después de aproximadamente 48 horas a + 4°C, el aglomerado se recolectó por centrifugación y se disolvió en una solución de fosfato disódico 0.05 M, pH 8.2. La solución se diafiltró contra solución de fosfato disódico 0.05 M, pH 8.2 y se ajustó a 300 Lf/ml. La solución después se esterilizó por filtración. 7.5 µ moles (0.225%) de formaldehído se añadieron por ml de la solución de toxina. La detoxificación se logró después de la incubación por 24 días a + 37°C, incluyendo períodos intermedios a + 4°C y + 22°C. La esterilización por filtración (0.22 µ) se efectuó para obtener el toxoide tetánico. El toxoide tetánico se dializó y concentró contra NaCl utilizando una membrana que tenía un valor de discriminación de peso molecular < 50,000. La proteína concentrada después se filtró asépticamente y se almacenó a + 4o. Se mezclaron cantidades iguales de AH-polisacárido y toxoide tetánico (± 20%) con NaCl 0.05 M para dar una concentración de 7.5 mg de polisacárido por ml . El pH de la solución se ajustó a pH 5.7 + 0.2 con HCl y 1-etil 3 - (3 dimetilaminopropil) carbodiimida (EDAC) se añadió para dar una concentración final de 19.17 mg EDAC/ml de mezcla de reacción. Los grupos carboxilo de la proteína de tétanos se activaron por unión al EDAC. Bajo las condiciones ligeramente acidas de la reacción, se presenta una reacción de condensación en la que el AH-PS y la proteína de tétanos activada por EDAC quedan covalentemente unidos. La mezcla se incubó a un pH constante (5.7) por 60 minutos a + 4°C, y después el pH se ajustó a pH 6.9 ± 0.2 con NaOH y la mezcla de reacción se dializó contra NaCl a + 4°C. El conjugado se purificó por centrifugación zonal en un gradiente de sacarosa (4% a 60%) para eliminar EDAC, AH-polisacárido libre, proteína de tétanos libre y conjugado de bajo peso molecular. A la fracción que contenía el conjugado de polisacárido se añadió después agua libre de pirógenos, sacarosa, buffer de Tris-HCl para obtener una solución de conjugado con la siguiente composición: sacarosa 8.5 % P/V ± 0.5% polisacárido en una concentración aproximadamente de 200 µg/ml. Buffer tris-HCl lOmM pH 7.0 ± 0.5. La solución después se filtró asépticamente utilizando un filtro de 0.2 µ y se almacenó a -40°C. El polisacérido tipo b de Haemophílus influenzae, como un granel de conjugado, se diluyó bajo condiciones estériles con diluyente a fin de obtener la composición final : granel concentrado de conjugado tipo a 200 mg de b de polisacárido de Haemophilus polisacárido Buffer tris-HCl 200 mM a pH 7.2 a 10" mM Sacarosa a 850 g Agua inyectable a 10 1 El granel final se llenó en viales y se liofilizó. (La vacuna liofilizada se reconstituyó con 0.5 ml ó NaCl al 0.4% para su uso. (b) Formulación Se probaron dos formulaciones de la vacuna componente multivalente (APDT) . La primera (APDT-baja) con tubo 10 µg de toxoide de pertusis (PT) , 5 µg de hemaglutinina filamentosa (FHA) , 5 µg de fimbrias 2 y 3 µg de proteína 69 K (69K) por 0.5 ml de dosis (CLÁSICO). La segunda formulación (APDT-elevado) contuvo dos veces la cantidad de PT (20 µg) y cantidades idénticas de FIM y 69K (HÍBRIDO) . Las dos formulaciones contuvieron toxoide diftérico en 15 de límite de floculación (Lf) , toxoide tetánico 5 Lf, 1.5 mg de fosfato de aluminio como -adyuvante y 0.6% de 2-fenoxietanol como conservador. La vacuna conjugada de Hib-toxoide tetánico (PRPT) se produjo en la manera antes descrita por Connaught Laboratories Inc. (Swiftwater, Estados Unidos) .

Población Niños sanos de 17 a 21 meses de edad que se habían inmunizado con tres dosis ya sea de APDT-bajo o PRPT como inyecciones separadas a 2, 4 y 6 meses de edad en un ensayo clínico previo, se aceptaron para este estudio. Después del consentimiento informado por escrito, los niños fueron asignados mediante una lista de números aleatorios de bloque equilibrado generada por computadora, a recibir PRT-T ya sea como una inyección separada en el mismo día o como una inyección separada con el PRP-T administrado un mes después de la vacuna APDT, o como una inyección simple (PRP-T liofilizado reconstituido en APDT) . La formulación APDT (elevada o baja) para cada niño fue la misma que la que se administró para las primeras tres dosis (proporción de asignación 6:1 APDT-elevado; APDT-bajo). Las vacunas se administraron intramuscularmente con una aguja de 25 mm en el músculo deltoideo del brazo o en el músculo vastus lateralis del muslo, si el deltoideo no tenía una masa suficiente. Cuando se requirió de una segunda inyección para PRPT, se inyectó el miembro opuesto.

Monitoreo Clínico y de Laboratorio Los participantes se monitorearon respecto a reacciones adversas locales y sistémicas inmediatamente después de la inmunización y después, por los padres en las 72 horas posteriores a la inmunización. Los datos se recolectaron por una entrevista telefónica estructurada a las 24 y 72 horas. Se midió la temperatura corporal por lo menos una vez al día o cuando los padres pensaban que el niño tenía fiebre. Las reacciones de sensibilidad y sistémicas (irritabilidad, actividad disminuida, apetito disminuido, se graduaron como leve, modera o severa de acuerdo a un criterio pre-establecido mediante el cual los padres seleccionaron una severidad con base en ejemplos estructurados. Las reacciones locales medidas se calificaron por su tamaño y tiempo de duración del llanto. Las muestras sanguíneas se recolectaron por venipunctura o por punzonación del dedo antes de la inmunización y 28 días después, en niños a los que se les administró la inyección PRP-T (por lo tanto 2 meses después de APDT) . Los anticuerpos de polisacárido capsular de Hib (PRP) se midieron por RÍA. Los anticuerpos IgG del PT se midieron por ELA y por anticuerpo neutralizante del PT mediante neutralización de citotoxicidad en célula ovárica de hámster Chino (CHO) . Los anticuerpos IgG anti-FHA, anti-FIM y anti-69K se midieron por EIA; las unidades se calcularon utilizando el antisuero de referencia FDA de Estados Unidos (#3) . Se midieron también las aglutininas de pertusis. La antitoxina de difteria se midió por microneutralización y la antitoxina de tétanos por EIA. Los títulos de anticuerpo se expresaron como títulos de medias geométricas; las muestras de suero con títulos menores al límite de detección de la prueba recibieron un valor de asignación de un medio del limite de detección menor, para fines de cálculos estadísticos.

Análisis Estadístico Las reacciones adversas se analizaron después del agrupamiento para determinar la significancia clínica. Las tazas de reacciones adversas se compararon por estimados Mantel-Haenszel de riesgo relativo utilizando formulaciones de centro y de vacuna como las variables de estratificación. Los estimados puntuales y el índice de confianza al 95% de RR se estimaron para cada caso. El Cl que no incluye 1.00 es estadísticamente significante. Los títulos de anticuerpo por medio geométrica y el Cl al 95% se calcularon para los títulos de anticuerpo en cada antígeno de vacuna, antes y después de la inmunización. El logaritmo de la media de los títulos se comparó por tres factores de análisis de varianza. La proporción de los sujetos que lograron niveles previamente especificados en cada grupo se comparó por regresión logística. No se hicieron ajustes para comparaciones múltiples. Un total de 545 niños (44% hembras) se aceptaron en el estudio, 74% fueron los que terminaron las series de estudios para lactantes. La proporción de participantes en este estudio que recibieron las dos formulaciones, fue de 6:1 (468 APDT-alta, 77 APDT-baja. La edad media fue 18.9 meses (varió entre 17 y 21 meses) , y todos, excepto 3 niños (99.4%) completaron el estudio.

Reacciones Adversas _ La tasa de reacciones adversas no fue diferente en los grupos inmunizados con APDT-elevado ó APDT-bajo, las tasas fueron también similares independientemente de sí las inmunizaciones se administraron separadamente en una visita, en visitas separadas o en una sola inyección combinada.

Respuesta de Anticuerpos Antes de la inmunización, el nivel de anticuerpos contra todos los antígenos excepto FHA fue similar en niños que habían recibido APDT-elevado ó APDT-bajo para sus primeras tres dosis. Los niños sensibilizados con APDT-elevado con su contenido de FHA al cuádruple, tuvieron títulos de FHA significativamente mayores que los niños inmunizados con APdT-bajo (p-0.0001). Después de la inmunización, APDT-elevado indujo títulos de anticuerpo superiores que APDT-bajo (p=0.0001). En contraste, los títulos anti-PT previos a la inmunización se midieron por neutralización de CHO o por EIA, y fueron similares en los dos grupos. Paradójicamente, a pesar del doble contenido antigénico, los títulos anti-PT fueron menores después de la inmunización con APDT-elevada que con APDT-bajo (p=0.038). Similarmente, los anticuerpos anti-FIM y la aglutmma después de la inmunización fue superior en el grupo de APDT-bajo (p=0.01 y p=0.04), respectivamente) a pesar de cantidades idénticas del antígeno fimbpal en las dos formulaciones de vacuna. Antes de la inmunización, hubo unas cuantas diferencias en anticuerpos anti-pertusss entre los grupos aleatorizados para recibir el PRPT combinado con APDT como una sola inyección o a los que se administró como inyecciones separadas en el mismo día o en días separados (Cuadro 10) . Los datos se presentan separadamente para los recipientes de APDT-elevado ó APDT-bajo; sin embargo, debido al pequeño número de niños en el grupo de APDT-bajo, estos resultados no se analizarán con más detalle. El grupo aleatorizado para recibir inyecciones separadas en el mismo día tuvieron anticuerpos anti-PT superiores por neutralización CHO que el grupo que iba a recibir las dos inyecciones en días separados (6.14 contra 4.80 unidades ; p<0.05). Los niveles anticuerpo post-inmunización también fueron superiores en este grupo (176 unidades) respecto al grupo de inyecciones separadas en días separados (122 unidades; p<0.01) aunque se encontraron niveles similarmente superiores en el grupo al que se administró una sola inmunización combinada (171 unidades; p<0.01). Las respuestas de anticuerpo anti-69K se detectaron en este grupo después" de la inmunización, aunque los niños imunizados con dos inyecciones el mismo día tuvieron una respuesta de anticuerpo superior que los niños inmunizados con la vacuna simple combinada y los niños inmunizados con las dos inyecciones el mismo día tuvieron una respuesta de anticuerpos superior que los niños inmunizados en días separados (243 contra 190 unidades; p<0.001) que los niños inmunizados con dos inyecciones en días separados. Los niveles de anticuerpo anti-PRP fueron similares entre los tres grupos antes de la inmunización. Los títulos después de la inmunización fueron superiores en niños inmunizados con inyecciones separadas el mismo día (66.0 µg/ml) que los niños inmunizados en días separados (28.4 µg/ml; p<0.001) o en niños a los que se les administró una sola inmunización combinada (47.1; p<0.05). La inmunización combinada también indujo niveles de anticuerpo significativamente superiores que las vacunas administradas en días separados (p<0.05). No se detectaron diferencias entre los grupos en el porcentaje que logró niveles "protectores", todos los participantes tuvieron títulos post-inmunización superiores a 0.15 µg/ml y solo 4 participantes (0-.7%) no lograron un título superior a 1 µg/ml (3 en el grupo al que se administró inyecciones separadas en días separados y uno en el grupo al que se administró una sola inyección combinada) . Más de 82% de los niños en cada grupo excedió un nivel de anticuerpo anti-PRP de lOµg/ l. Una respuesta de anticuerpo vigorosa también se indujo contra los toxoides de tétanos y difteria. En comparación con el grupo al que se administró la inmunización en días separados (2.1 Ul/ml) se indujeron niveles de anticuerpo anti-diftena significativamente superiores en los niños inmunizados con dos inyecciones el mismo día (3.1; p<0.01 Ul/ml) o una sola inyección combinada (3.3 Ul/ml; p<0.001). Los anticuerpos antitétanos fueron superiores en recipientes de las dos inyecciones el mismo día (6.7 Ul/ml) que en niños inmunizados en días separados (5.2 Ul/ml; p<0.01) o en niños a los que se administró una sola inyección combinada (4.8 Ul/ml; p<0.001). Todos los niños tuvieron títulos de anticuerpo anti-difteria y anti-tétanos, post-inmunización, superiores a 0.1 Ul/ml, un nivel de 10 veces el nivel protector objetivo. Sobre el 96% de los títulos antitétanos y sobre el 74% de los títulos anti-difteria excedieron un nivel de 1.0 Ul/ml; no hubo diferencias entre los grupos de inmunización.

Ejemplo 8 Este ejemplo describe la formulación e inmunogenicidad de una vacuna de combinación multivalente que contiene vacuna de polio inactivada. (a) Preparación de Poliovirus Inactivado (i) Crecimiento en células MRC-5 El virus de polio inactivado que creció en células MRC 5 se produjo en la siguiente forma. Las células eran células de riñon de un mono verde ( Ceropithacus aethiops) : La vacuna de poliovirus trivalente, inactivada, contuvo componentes Tipo 1 (Mahoney) , Tipo II (MEF) y Tipo III (Saukett) que se hicieron crecer _ en células MRC-5 en perlas microacarreadoras, se procesó e inactivo separadamente antes de combinarse en una vacuna de virus de polio trivalente. Una suspensión de células MRC-5 se añadió al medio de crecimiento celular en un fermentador a pH 7.2 (6.9 a 7.6) y a temperatura de 37°C ± 0.5°C. El medio de crecimiento celular tuvo la siguiente composición: medio CMRL 1969 Bicarbonato de sodio 0.15% Suero bovino adulto 5.00% - 7.00% Sulfato de neomicina (µg de actividad) 10 Ul/ml Polimixin B 200 Ul/ml el medio CMRL tuvo la siguiente composición: POLVO SECO Ingredientes mg/litro Aminoácido L-Alanina 25.0 L-Arginina (base libre) 58.0 L-Ácldo Aspártico 30.0 L-Cisteína .HCl 0.1 L-Cisteína disódica 24.0 L-Ácido Glutámico .H2O 67.0 L-Glutamina " 200.0 L-Glicina 50.0 L-Histidina (base libre) 16.2 L-Hidroxiprolina 10.0 L-Isoleucina 20.0 L-Leucina 60.0 L-Lisina .HCl - 70.0 L-Metionina 15.0 L-Fenilalanina 25.0 L-Prolina 40.0 L-Serina 25.0 L-Treonina 30.0 L-Triptófano 10.0 L-Tirosina 40.0 L-Valina 25.0 Vitaminas Ácido p-aminobenzoico 0.05 Ácido ascórbico 0.05 d-Biotina 1.00 Pantotenato de Calcio 1.00 Citrato diácido de colina 2.12 Ácido Fólico " 1.00 Glutation 0.05 i-Inositol 2.00 Nicotinamida 1.00 Piridoxal .HCl 1.00 Riboflavin-5-fosfato 0.10 Tiamina-HCl 1.00 Ingredientes . mg/litro Componente Cloruro de sodio 8000.0 Cloruro de potasio 400.0 Cloruro de calcio (anhidro) 140.0 Sulfato de magnesio .7H20 200.0 Fosfato de sodio, dibásico anhidro 180.0 Fosfato de sodio, no básico 70.0 D-glucosa (anhidra) 1000.0 Rojo de fenol 20.0 .852 gm dan 1 litro del Medio CMRL 1969. El medio se preparó de la siguiente forma: 450 litros de agua destilada libre de pirógenos se añadieron a 905 ml de ácido clorhídrico ÍN. A esta mezcla se añadieron 5426.5 g de CMRL 1969, como polvo seco con agitación continua hasta que se disolvió para formar una solución clara. Los siguientes agentes químicos se añadieron en el orden mencionado, con agitación continua, esperando a que cada agente se disolviera antes de añadir el siguiente: Neomicina 10 cg/ml Polimixin B 200 unidades/ml Solución Buffer TES 5000.0 ml Bicarbonato de Sodio 750.0 g Suero de Bovino 30.0 L El volumen se llevó a 500 L con agua destilada y se agitó hasta que se mezcló uniformemente. El crecimiento celular se supervisó y "Cuando se determinó que las células estaban en su fase logarítmica, el medio de crecimiento agotado se desechó y se reemplazó con medio de crecimiento para virus. el medio de crecimiento para virus tuvo la siguiente composición: Agentes guímicos "del Medio 199 con sales de Earle.

Bicarbonato de sodio 0.26% Tween 80 20 ppm Sulfato de neomicina (µg de actividad) 10 Ul/ml Polimixin B 200 Ul/ml L-glutamina 100 mg/l L-arginina 29 mg/l L-leucina 30 mg/l L-isoleucina 10 mg/l L-metionina 7.5 mg/l L-serina 12.5 mg/l L-treonina 15 mg/l L-cisteína 10 mg/l diH citrato de colina 107 mg/l El medio CMRL 199 tuvo la siguiente composición: POLVO SECO Ingredientes _mg/litro L-Alanina 25.0 L-Arginina (base libre) 58.0 L-Ácido Aspártico 30.0 L-Cisteína .HCl .H 0 0.1 L-Cisteína disódica 24.0 L-Ácido Glutámico .H2O 67.0 L-Glutamina 100.0 L-Glicina 50.0 L-Histidina (base libre) 16.2 L-Hidroxiprolina 10.0 L—Isoleucina 20.0 L-Leucina 60.0 L-Lisina 70.0 L-Metionina 15.0 L-Fenilalanina 25.0 L-Prolina 40.0 L-Serína 25.0 L-Treonina 30.0 L-Triptófano 10.0 L-Tirosina 40.0 L-Valina 25.0 Ácido £-aminobenzoico 0.050 Ácido ascórbico O.050 d-Biotina _ 1.010 Pantotenato de Calcio 1.010 Citrato diácido de colina 1.60 Ácido Fólico 1.010 Glutation 0.050 i-Inositol 0.050 Menadiona 0.010 Nicotinamida (niacinamida) 0.025 Ácido nicotínico (niacina) 0.025 Piridoxal .HCl 0.025 Piridoxina .HCl 0.025 Riboflavin-5-fosfato 0.10 Tiaraina HCl 0.010 Acetato de vitamina A 0.100 Vitamina D (calciferol) O.100 Vitamina E (fosfato de tocoferol) 0.010 Sulfato de Adenina 10.000 Trifosfato de adenosina 1.000 Ácido adenosina-5-fosfórico 0.200 Deoxi-2-ribosa 0.500 d-Ribosa 0.500 Colesterol 0.200 Guanina 0.300 Hipoxantina 0.300 Los cultivos se infectaron con la semilla de virus adecuada a una multiplicidad de infección. La infección procedió a 36°C ±1°C. Cuando el C.P.E. de virus se completó, el cultivo se enfrió a 2°C-15°C.

El virus se recolectó y se clarificó por filtración. El volumen de virus recolectado se redujo por ultrafíltración en membrana con una discriminación de peso molecular nominal de 100,000 a un volumen adecuado para su diafiltración con buffer de fosfato 0.04M. Después de la diafiltración, el volumen se concentró adicionalmente a un volumen adecuado para la filtración en gel. El concentrado de virus vivo se muestreó y se almacenó a 2°C-8°C. El concentrado de virus vivo se aplicó a una columna de filtración en gel y se eluyó de la columna con buffer de fosfato 0.04M. La fracción de virus se recolectó por monitoreo de la densidad óptica del eluido de la columna a 254 y 280 nm. Un segundo paso de purificación se llevó a cabo utilizando un medio de intercambio iónico de DEAE, con fosfato 0.04M como el buffer de elución. Este paso puede repetirse dos veces y la cantidad del medio de intercambio iónico utilizada es insuficiente, como se determina por la supervisión a 254 y 280 nm. La fracción de virus recolectada se concentró y se dializó contra Medio Especial de Hank para reducir el contenido de fosfato. El Medio Especial de Hank tuvo la siguiente composición: AMINOÁCIDOS mg,'litro D, L-Alanina 25. .00 L-Arginina .HCl 58 .00 D, L-Ácido Aspártico 30. .00 L-Cisteína HCl H2O 0.: 10 L-Cisteína 2HC1 26 .00 D, -Ácido Glutámico 67 .00 L-Glutamina 100.00 Glicina 50 .00 L-Histidina HCl .H2O 16 .20 L-Hidroxiprolina 10 .00 D,L-Isoleucina 20 .00 D, L-Leucina 60 .00 L-Lisina .HCl 70 .00 D, L-Metionina 15 .00 D, L-Fenilalanina 25 .00 L-Prolina 40 .00 D,L-Serina 25 .00 D, L-Treonina 30 .00 D,L-Triptófano 10 .00 L-Tirosina (sal disódica) 40 .00 D,L-Valina 25 .00 VITAMINAS Ácido ascórbico _ O.i 050 d-Biotina O.i 010 Vitamina D (Calciferol) 0. 100 D-Pantotenato de Calcio 0. 010 Cloruro de Colina 1. 060 Ácido Fólico 0.010 i-Inositol _ 0.050 Sales Minerales mg/litro Cloruro de Calcio (anhidro) 40.00 Nitrato Férrico .9H2O 0.10 Cloruro de Potasio 400.00 Cloruro de Sodio 8000.00 Sulfato de Magnesio .7H20 200.00 Otros Ingredientes Sulfato de Adenina 10.000 Trifosfato de Adenosina (sal disódica) 1000 Ácido Adenílico 0.200 d a Tocoferol Ácido Fosfórico (sal sódica) 0.010 Colesterol - 0.200 Deoxirribosa 0.500 Glucosa 1000.000 Glutation 0.050 Guanina .HCl 0.300 Hipoxantina (sal de sodio) 0.300 Ribosa 0.500 Acetato de Sodio .3H20 81.500 Timina 0.300 Tween 80 20.000 Uracilo 0.300 Xantina (sal sódica) 0.300 Menadiona 0.010 Ácido Nicotínico 0.025 Nicotinamida 0.025 Ácido p-Aminobenzoico 0.050 Piridoxal .HCl 0.025 Piridoxina .HCl 0.025 Riboflavin-5-fosfato 0.010 Tiamina .HCl 0.010 Vitamina A (acetato) 0.140 La fracción purificada del virus se filtró a través de un filtro con porosidad de 0.2 µ. Una o más fracciones concentradas de virus purificado pueden agruparse para su inactivación. Con base en los resultados de la prueba ELISA, la agrupación de virus monovalente se diluyó a: Tipo I: 1750 ± 250 UD/ml Tipo II: 1500 ± 250 UD/ml y Tipo III: 1250 ± 250 UD/ml con Medio Especial de Hank. El agrupado monovalente se calentó a 37°C ± 1°C, y después se filtró a través de un filtro con porosidad de 0.2 µ. La cantidad requerida de formalina para lograr una concentración 1:4000 se añadió. El agrupado de virus y formalina se mezclaron y se agitaron continuamente a 37 °C ± 1°C. El agrupado de virus monovalente se muestreó para determinar viabilidad. Al día seis, el agrupado de virus inactivado se filtró a través de un filtro de 0.2 µ y se mantuvo a 37°C ± 1°C. Al día trece de inactivación, el agrupado de virus se filtró a través de un filtro 0.2 µ. Uno o más componentes monovalentes inactivados se seleccionaron y conectaron asépticamente a un tanque almacén. El almacenado monovalente se concentró adicionalmente por ultrafiltración en membrana con una discriminación nominal de peso molecular de 100,000. Se llevó a cabo una diálisis contra diluyente RIV-PBS: Fosfato dibásico de sodio (Na2HPO_j) , 0.346 g/CCmL Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4), .187 g/CCmL con Tween, para lograr uniformidad en el producto final. Se añadió albúmina (humana) para lograr una concentración final de 0.5%. El concentrado monovalente agrupado se filtró entonces a través de n filtro de 0.2 µ. El diluyente RIV-PBS con Tween se añadió para lograr un estimado (por cálculo) , de concentración de 10 a 15 dosis por 0.5 ml. El concentrado agrupado se almacenó a 2°C-8°C hasta que se requirió. " " Los volúmenes adecuados de los componentes monovalentes Tipos I, II y III se calcularon y combinaron. La vacuna trivalente tenía el objetivo de contener: Tipo I: 40 UD/0.5 ml dosis Tipo II: 8 UD/0.5 ml dosis Tipo III: 32 ÜD/0.5 ml dosis El concentrado trivalente se almacenó a 2°C-8°C hasta que se utilizó. El formaldehído y 2-fenoxietanol se añadieron y se mezclaron. Se añadió albúmina (humana) , por cálculo, hasta una concentración final de 0.5%. (ii) Crecimiento sobre Células Vero Las ampolletas del banco de células de trabajo Vero se subcultivaron hasta el nivel de paso celular seleccionado. Las ampolletas de células se conservaron en nitrógeno líquido. Las células se hicieron crecer utilizando perlas de microsoporte que fueron perlas esféricas de un diámetro promedio de aproximadamente 100 micrómetros, constituidas por polímeros de Dextrano con radicales de DEAE injertados en su superficie (dietilaminoetilo) , dándoles una carga positiva. El medio básico para crecimiento celular fue el medio "Medio Mínimo Esencial" (MEM) de Eagle, en solución salina de Earle enriquecida con 0.2% de hidrolizado de lactalbúmma, 0.1% de dextrosa, 5% de suero de ternera. Cada mililitro del medio contuvo los siguientes antibióticos : Estreptomicina : 75 unidades por ml Neomicina : 14 unidades por ml Sulfato de polimixina B : 35 unidades por ml Las células Vero se subcultivaron progresivamente en biogeneradores de cada vez mayor tamaño. Posteriormente, el medio de cultivo y el volumen suficiente de perlas de microsoporte por litro de medio, se introdujeron en el biogenerador industrial. La temperatura se estabilizó a + 37 °C. Las células se recolectaron por tripsinización y se añadieron y se agitaron. El cultivo continuó durante 4 a 7 días a + 37°C, la agitación fue aumentando progresivamente. Normalmente, al final del cultivo, se observó un aumento de 6_a 20 veces en el crecimiento celular. El medio utilizado para el crecimiento de virus fue el medio 199 (Parker) en la solución salina Earle enriquecido con 0.1% de dextrosa. Este medio contuvo los mismos antibióticos, a la misma concentración que el medio para el crecimiento celular, pero no contuvo suero de ternera. A lo días 4/7 de crecimiento celular, la agitación del biogenerador en la etapa industrial se detuvo, las perlas se asentaron en el fondo del tanque, y se retiró el medio viejo. Un poco del medio 199 libre de suero se introdujo entonces a cada biogenerador y se agitó. Este medio después se extrajo, efectuando un lavado de las perlas y células. Algo del medio 199 libre del suero se transfirió al biogenerador junto con el volumen necesario del lote semilla. El virus se absorbió dentro de las células por agitación suave. Al final del cultivo del virus, la agitación se detuvo. La suspensión del virus se extrajo y se recolectó y las perlas se retuvieron por filtración- La suspensión de virus se homogeneizó. La recolección, filtrada sobre una membrana orgánica con tamaño de poro medio de 0.20 mm se almacenó a + 4°C. El virus se concentró por ultrafiltración. El virus se purificó adicionalmente por cromatografía de intercambio iónico utilizando un soporte de DEAE-dextrano-Spherosil, equilibrado con buffer de fosfato 0.04 M, pH = 7.00. El virus se purificó adicionalmente por cromatografía de filtración en gel utilizando una columna que contiene un gel de agarosa, Sepharosil CL-6B, con buffer de fosfato 0.04 M, pH = 7.00. El virus se purificó adicionalmente por cromatografía utilizando DEAE dextrano-Spherosil, amortiguado con buffer de fosfato 0.04 M, pH = 7.00. Tan pronto como se efectuó la última purificación, la suspensión de virus se ajustó al volumen requerido con un poco del medio M-199, pH = 7.0 sin fosfato, se concentró diez veces en" EDTA 5 mm, glicina a 0.5% y Tween 80 a un concentración final de 50 mg/litro (Medio de Inactivación) . Esta mezcla constituyó una "Mezcla de Virus Concentrada" y se filtró en una membrana de 0.2 µm. La suspensión de virus concentrada se almacenó a + 4°C durante la inactivación. Uno o varios lotes de "Mezclas de Virus Concentradas" del mismo tipo, se mezclaron y posiblemente se diluyeron o ajustaron con algo - del "Medio de Inactivación" en un tanque adecuado. La dilución se ajustó al volumen correcto de acuerdo a los tipos, a fin de obtener un título de antígeno D entre: - 1500 y 2000 unidades D en el tipo 1 - 800 y 1000 unidades D en el tipo 2 - 1000 y 1500 unidades D en el tipo 3 y una proporción de proteína de: - < 40 µg/ml en el tipo 1 - < 70 µg/ml en el tipo 2 - < 30 µg/ml en el tipo 3. La suspensión de virus concentrada, purificada, ajustada se filtró en una membrana de 0.22 µm cuando mucho 72 horas antes de iniciar la inactivación. La suspensión de virus después se calentó de nuevo a + 37 °C. Para la inactivación, se añadió solución de formaldehído para obtener una concentración a 1/4000. A fin de seguir la cinética de inactivación después de 24, 48, 72 y 96 horas, se extrajeron muestras durante los primeros cuatro días. Se realizó un muestreo de 10 ml con neutralización inmediata del formaldehído, por acción de bisulfito sódico y almacenaje directo a - 20°C durante la titulación. Al 6o día, la suspensión de virus durante la activación se filtró utilizando un filtro de 0.22 µm. Después de la filtración, la incubación de líquido se llevó a cabo a + 37 °C por 6 días más, con agitación constante. Al día 9 de activación, se extrajo 3 veces el volumen correspondiente a 3000 dosis humanas y 500 mL mínimo de la recolección individual cruda. Este volumen se calculó de acuerdo al título en antígeno D de la "Mezcla de Virus Concentrada". El muestreo se neutralizó directamente con algo de bisulfito de sodio para detener la acción del formaldehído residual. La suspensión de virus homogeneizada e inactivada se extrajo entonces del incubador a + 37°C después del 12vo. día de inactivación. El volumen se neutralizó directamente con un poco de bisulfito de sodio y se almacenó a + 4°C. Para preparar un lote trivalente concentrado de IPV, se combinaron las preparaciones monovalentes para proporcionar: Tipo 1 (Mahoney) 400 unidades de antígeno D Tipo 2 (MEF-1) 800 unidades de antígeno D Tipo 3 (Saukett) 320 unidades de antígeno D Medio 199- pH 7.2, c.b.p. a 1 ml La mezcla se agitó para homogeneizarse y se filtró en una membrana de porosidad 0.22 mieras. El producto a granel final se obtuvo a partir de los lotes de granel trivalente concentrados, como aquellos descritos, por dilución con el medio 199, pH 7.2, sin rojo de fenol, de manera que la dosis unitaria contenía por 0.5 ml. 40 unidades de antígeno D para tipo 1 8 unidades de antígeno D para tipo 2 32 unidades de antígeno D para tipo 3. (b) Formulaciones Una formulación de vacuna multivalente (APDT) contuvo cinco antígenos de pertusis (10 µg PT, 5 µg FHA, 5 µg FIM 2 y 3, 3 µg 69K) , 15 Lf de toxoide diftérico, 5 Lf toxoide tetánico, 1.5 mg de fosfato de aluminio como adyuvante y 0.6% de 2-fenoxietanol como conservador por 0.5 ml (CLÁSICO) . La vacuna se utilizó sola o en combinación ya sea con IPV producido sobre células MRC-5 (mlPV) preparadas como se describe antes, IPV producida sobre células Vero (vIPV) preparado como se describe antes o con OPV (Connaught Laboratories Limited) . Con objeto de no perturbar _su esquema de inmunización de rutina, la vacuna conjugada de toxoide b-tetánico de Haemophilus inf luenzae se administró en la siguiente visita.

Población Niños sanos de 17 a 19 meses de edad que habían sido inmunizados con tres dosis de DTP y 2 dosis de OPV, o 3 dosis de DTP-IPV antes de los 8 meses de edad, fueron los aceptados para este estudio. Después del consentimiento informado por escrito de los padres o tutores, a los niños se les asignó mediante números aleatorios de lista de bloque balanceada, generada por computadora, para recibir uno de los cinco esquemas de vacunación (.Cuadro 10?) . Las vacunas de combinación que contenían A3DT se administraron por ruta intramuscular con una aguja de 25 mm en el músculo deltoideo del brazo o en el músculo vastus lateralis del muslo, en caso de que el deltoideo tuviera masa insuficiente. IPV (0.5 ml; mlPV ó vlPV) cuando se administró solo se administró por ruta subcutánea utilizando una aguja de a 5/8 de pulgada (12.5 a 16 mm) de longitud, las vacunas que contenía APDT se administraron en el miembro izquierdo, el miembro derecho se utilizó para las vacunas de poliovirus inactivado cuando se administraron separadamente y para las vacunas de conjugado b de Haemophilus influenzae en la segunda visita.

Supervisión Clínica y de Laboratorio Se recolectaron muestras sanguíneas por venipunción o por punción en el dedo, antes y 28 días después de la inmunización. Los anticuerpos IgG para PT se midieron por inmunoensayo enzimático y anticuerpo neutralizante para PT por neutralización CHO. Los anticuerpos IgG anti-FHA, anti-FIM y anti-69K se midieron por inmunoensayo enzimático, las unidades se calcularon utilizando el antisuero de referencia FDA US (#3) . Las aglutininas de pertusis también se midieron. La antitoxina diftérica se midió por el ensayo de microneutralización y la antitoxina tetánica por inmunoensayo. Los anticuerpos de poliovirus tipo 1, 2 y 3 se midieron por neutralización viral. Los títulos de anticuerpos se .expresaron como medias geométricas de los títulos, las muestras séricas con títulos menores al límite de detección de prueba recibieron la asignación de un valor de la mitad del límite de detección inferior para los fines de cálculos estadísticos.

La media geométrica de los títulos de anticuerpo y los intervalos de confianza al 95% se calcularon para el título de anticuerpo en cada antígeno de vacuna, antes y después de la inmunización. Las elevaciones en el logaritmo de la media de los títulos y la duplicación logarítmica de la media de los títulos de anticuerpo se compararon por análisis de perfil y análisis de varianza. La proporción de sujetos que lograron niveles previamente especificados en cada grupo, se comparó por regresión logística. Las comparaciones se hicieron entre cada vacuna de poliovirus administrada separadamente o como una inyección combinada, entre mlPV y vIPV (tanto en forma separada como combinada) y entre las vacunas IPV combinadas y OPV. No se hicieron ajustes para comparaciones múltiples.

Un total de 425 niños (52% hembra) se admitieron en el estudio y recibieron la inmunización de refuerzo (Cuadro 10) . La edad media al entrar en el estudio fue de 17.8 meses (intervalo de 17.0 a 20.0). Se obtuvieron muestras de suero posteriores a la inmunización de 422 (99.3%) participantes en una media de 29.2 días después de la inmunización (intervalo de 28 a 41 días) . Los eventos adversos calificados como severos fueron raros en el estudio. Antes de la inmunización, los niveles de anticuerpos fueron equivalentes entre los grupos para la mayoría de los antígenos. Las excepciones fueron que los participantes asignados a recibir APDT y mlPV como inyecciones separadas tenían niveles de anticuerpos anti-FIM, aglutinina, anti-difteria y anti-tétanos significativamente menores que el grupo asignado a recibir la vacuna combinada APDT-mIPV. Similarmente, el grupo aleatorizado para recibir las inyecciones separadas de APDT y vIPV tuvo menores niveles de anticuerpos antitetánicos que el grupo que iba a recibir APDT-vIPV combinada. Después de la inmunización, hubo una elevación significativa en anticuerpos en todos los grupos de vacunas contra todos los antígenos incluidos en las vacunas. Hubo unas cuantas diferencias" en las respuestas de anticuerpo a los antígenos de pertusis dependiendo del grupo de vacuna de polio. No hubo diferencias en anticuerpos anti-PT por inmunoenzayo enzimático o neutralización CHO o anticuerpos anti-FHA. Los anticuerpos anti-69K fueron significativamente superiores en el grupo al que se administró la vacuna mlPV combinada con APDT (77.7 unidades) que para el grupo al que se administró mlPV como una inyección separada (37.9 unidades; p<0.001) o el grupo al que se administró OPV (47.7; p<0.05). Las aglutininas de anticuerpos anti-FIM también fueron superiores en el grupo al que se administró APDT-mIPV combinada que en el grupo al que se administraron inyecciones separadas, sin embargo, estas mismas diferencias se detectaron también en los suelos de pre-inmunización. Se detectaron diferencias en las respuestas de anticuerpo anti-poliovirus . Tanto APDT-mlPV como APDT-vIPV indujeron más anticuerpos anti-poliovirus tipo 1 y tipo 3 (P<0.001 para todas las comparaciones). Los niveles de anticuerpos anti-poliovirus tipo 2 también fueron superiores después de APDT-mlPV (10,633 diluciones recíprocas) y APDT-vIPV (10,256) en relación a OPV (7185), sin embargo, esto solo logró significancia estadística para APDT-mIPV (p < 0.05). Los títulos de anticuerpos anti-poliovirus logrados con APDT-MIPV combinada también fueron superiores que cuando se administró mlPV como una inyección separada (6620-1 p<0.05).

Los títulos de anticuerpos anti-tetánicos fueron superiores en recipientes de OPV que en cualquiera de las combinaciones IPV (p<0.05). Los títulos antidifteria también fueron superiores en recipientes OPV pero esto solo alcanzó significancia estadística en comparación con el grupo APDT-vIPV (p < 0.05). Después de la inmunización, todos los niños tuvieron niveles de anticuerpo contra difteria y tétanos superiores a 0.01 Ul/ml y todos, excepto uno, tuvieron niveles superiores de 0.1 Ul/ml. Los resultados de este estudio demuestran que una vacuna de pertusis componente que contiene PT, FHA, 69K y FIM combinados con toxoides tetánico y diftérico también pueden combinarse con vacuna de poliovirus sin ningún aumento significativo en reactogenicidad o pérdida de inmunogenicidad. En contraste con los resultados encontrados con DTP de célula completa, no hubo disminución de la respuesta del anticuerpo a los antígenos Bordetella pertussis. NO hubo diferencias substanciales entre la vacuna IPV preparada con cualquiera de las líneas celulares Vero ó MRC-5, las dos vacunas indujeron niveles de anticuerpo anti-poliovirus séricos superiores que OPV. La demostración de la equivalencia de mlPV y vIPV facilita la implementación de la vacuna de pertusis acelular en lugares con una preferencia por IPV, derivada de una línea celular particular.

En conclusión de los experimentos reportados en este Ejemplo, se demuestra que una vacuna de pertusis acelular de cinco componentes puede combinarse de manera segura con cualquiera de las dos vacunas IPV, en la cuarta dosis de vacuna entre los 17 y 19 meses de edad.

SUMARIO DE LA EXPOSICIÓN En resumen de esta exposición, esta invención proporciona preparaciones novedosas de antígenos de Bordetella y no de Bordetella para producir vacunas de pertusis multicomponentes. Estas vacunas son seguras, no reactogénicas, inmunogénicas y protectoras en humanos. Son posibles modificaciones dentro del alcance de esta invención.

Cuadro 1. Vacunas de Pertussis Acelular Inactivado con peróxido de hidrógeno. Massachusetts Public Health Laboratories. c TNM inactivado con tetranitrometano. Gl mactivado con glutaraldehido. 5 e Fl inactivado con formalina. f Centre for Applied Microbiology and Research.

Cuadro 2 Respuestas de anticuerpo IgG ante el antígeno de pertusis y toxoides diftérico y tetánico en adultos y niños jóvenes después de la inmunización con placebo o toxoides de pertusis acelular (AP) , diftérico, tetánico, pertusis (DTP) , o DTP acelular multicomponente (ADTP) Tabla 3 Resultados Serológicos de las Vacunas de Pertusis Componente en Lactantes (2,4 y 6 Meses de Edad) CLI Connaught Laboratories Incorporated, Swiftwater, Pensylvania. Mass - Massachusetts Public Laboratories . CLL Connaught Laboratories Limited, Willowdale, Ontario. Lederle - Lederle Laboratories Inc.

Cuadro 4 - Eficacia de Vacunas de Pertusis Acelular Vacuna h B CP10/5/5/3DT 84.7 (80.3 ? 88.5) X - 11 PT25.FHA25DT 58 (49.8 ? 64.8) a DPT2 47.9 (37.1 ? 56.9)1 A: definición de caso: tos espasmódica de 21 días y cultivo positivo B: definición de caso: tos de pertusis leve de por lo menos un día Nota 1: limites de confianza Nota 2: vacuna de pertusis de célula completa CUADRO 5 CUADRO 6 ? CUADRO 7 CUADRO 8 »_. o CUADRO 9 combinación de PRP-T con Vacuna de Pertusis Componente cuando se administra en Forma Combinada o Separada en el Mismo Día o en Días Diferentes CP10/5/5/3DT (CLÁSICO) y CP20/20/5/3DT (HÍBRIDO) a los 19 meses (1 mes después) Nota: Los valores con letras coincidentes difieren significativamente (p < 0.05) REFERENCIAS ler, A.S. Leeuwenburg, J. and Pratt, D.S. (1986) Pertussis; epidemiology and control, Bull WHO 64: 321-331. e, P.E.M, and Clar son, J.A. (1984), Distribution of immunity to pertussis in tiie population of England and Wales. J. Hyg. 92:21-26. timer, E.A. Jr. (1990). Pertussis and its prevention: a family affair. J. Tníect. Dis . 161: 473-479. iss, D.G, Davis, I.P., Meade, B.D., Burstyn, D.G.

Meissner, M. , Zastrow, J.A., Berg, J.L., Drinka, P., and Phillips, R. (1991) . A pertussis outbreak in a Wisconsin nursing home. J. Infecí, Dis . 154: 704-710. perin, S.A. and Marrie, T.J. 1991a). Pertussis encephalopathy in an adult: case report and review. Rev. Infecí. Dis- 13: 1043-1047. rato, I.M., Wassilak, S.G, and Meade, B. (1992). Efficacy of whole-cell pertussis vaccine in preschool children in the United States. J?MA 267: 2745-2749. ler, D.L., Ross, E.M., Alderslade, R., Bellman, M.H. , and Brawson, N.S.B. (1981). Pertussis immunization and serious acute neurological illness in children. Bri t Med. J. 282: 1595-1599. 8. Tamura, M., Nogimorl, K., Murai, S., Yajima, M. , lto, K, . , Katada, T., Ui r M., and Ishii, S. (1982). Subunit structure of islet-activating protein, pertussis toxin, in conformity with the A-B model.

Biochemistry 21; 5516-5522. 9. Tuomanen, E. and Weiss, A, (1985).

Characterization of two adhesins; of Bordetella pertussis for human ciliated respiratory epithelial cells, J. Infecí, Dis . 152:113-125. 10. Friedman, R-L., Nordensson, K. , Wilson, L., Akporiaye, E.T., and Yocum D.E. (1992). Uptake and intracellular survival of Bordetella pertussis in human macrophages . Infect. Immun. SO: 4578-4585. 11. Pittman, M (1979), Pertussis toxin: the cause of the harmful effects and prolonged immunity of whooping cough. A hypothesis. Rev. Infecí. Dis . , 1: 401-402. 12. Granstrom, M. and Granstrom G. (1993) . Serological correlates in whooping cough. Vaccine 11:445-448. 13. Gearing, A.J.H., Bird, C.R., Redhead, K. , and Thomas, M. (1989) . Human cellular immune responses to Bordotella pertussis infection. FEMS Microbial .

Immunol. 47: 205-212. 14. Thomas, M.G., Redhead, K. , and Lambert, H.P. (1989a). Human suerum antibody responses to Bordetella pertussis infection and pertussis vaccination. J. Infecí. Dis. 159: 211-218. 15. Thomas, M.G. , Ashworth, L.A.E., Miller, E., and Lambert, H.P. (1989b). Serum IgG, IgA, and IgM responses to pertussis toxin, filamentous haemagglutonin, and agglutinogens 2 _ and 3 after infection with Bordetella pertussis and immunization with whole-cell pertussis vaccine. J. Infecí. Dis . 160: 838-845. 16. Tomoda, T., Ogura, H., and Kurashige, T. (1991).

Immune responses to Bordetella pertussis. Infection and vaccination. J\ Infecí. Dis . 163: 559-563. 17. Petersen, J.W. , Ibsen. P.H., Haslov, K. , Capiau, C, and Heron, I. (1992a) . Proliferative responses and gamma interferon and tumor necrosis factor production by lymphocytes isolated from trachcobroncheal lymph nodes and spleens of mice aerosol infected with Bordetella pertussis. Infecí. Im un . 60, 4563-4570. 18. Englund, J.A. , Reed, G.F., Edwards, K.M. , Decker, D., Pichichero, M.E., Ronnels, M.B., Steinhoff, M.C., Anderson, E.L., Meade, B.D., Deloria, M.A., and the NTAID Acellular Pertussis Vaccine Group. (1992b), . Effect of transplacental antibody and development of pertussis toxin (Pl) and filamentous haemagglutonin (FHA) antibody after acellular (AC) and whole cell (WC) pertussis vaccines in infants. Pediat. Res . 31:91A. , M., Cowell, J.L., Burstyn, D.G., Thaib, S., and Manclark, C.R. (1985) . Antibodies to Bordetella pertussis in human colostrum and their protective activity against aerosol infection of mice. Xnfect. Immun. 47:441-445. ersen, J.W., P.H. Bentzon, M,W., Capiau, C, and Heron, I. (1991) . The cell mediated and humoral immune response to vaccination with acellular and whole cell pertussis vaccine in adult humans. FEMS Microbiol Lett. 76: 279-288. , M. , Cowell, J.L., Burstyn, D.G., and Manclark, C.R. (1984) . Protective activities of the filamentous haemagglutionin and the lymphocytosis-promoting factor of Bordetella pertussis in mice. J. Infecí. Dis. 150: 823-833. o, H., Ito, A., Chiba, J. and Sato. Y. (1984b). MOnoclonal antibody against pertussis toxin: effect on toxin activity and pertussis infections . Infecí, Immun. 46: 422-428. o, H. and Sato, Y. (1990). Protective activities in mice of monoclonal antibodies against pertussis toxin. Infect. Immun. 58: 3369-3174. 24. Weiss, A. . and Hewlett, E,.L. (1986). Virulence factors of Bordetella Pertussis. Ann. Rev. Microbiol 40: 661-668. 25. Muñoz, J.J. (1988). Action of Pertussigen (pertussis toxin) on the host immune system. 26. Watkins, P.A., Burns, D.L., Kanaho, Y., Liu, T-Y., Hewlett E.L., and Moss, J. (1985). ADP-ribosylation of transducin by pertussis toxin. J. Biol . Chem . 260: 13478-13482. 27. Burns, D.L., Kenimer, J.G., and Manclark, C.R. (1987). Role of the A subunit of pertussis toxin in alteration of Chinese hámster ovary cell morphology. Zpfect. Immun. , 55: 24-28. 28. Mu oz, J.J., Arai, H., and Colé, R.L. (1981). Mouse- protecting and histamine-sensitizing activities of pertussigen and fimbrial hemagglutinins from Bordetella pertussis. Infect. Jjnmun. 32: 243-250. 29. Rel an, D.A., Domenighini, M., Tuomanen, E., Rappuoli, R., and Falkow, S. (1989). Filamentous haemagglutonin of Bordetella pertussis: nucleotide sequence and crucial role inadherence. Proc. Naíl . Acad. Sci . USA 86: 2637-2641. 30. Di Tommaso, A,, Domenighini, M., Rugnoli, M., Tagliabuc, A., Rappuoli, R., and De Magistris, M.T. (1991) . Identification of subregions of Bordetella pertussis filamentous haemagglutonin that stimulate human T-cell responses. Infecí . Immun. 59: 3313-3315. oda, T., Ogura, H., and Kurashige, T. (1992). The longevity of the immune response to filamentous haemagglutonin and pertussis toxin in patients with pertussis in a semiclosed community. J. Infecí. Dis. 166: 908-910. ards, K.M. , Meade, B.D., Decker, M.D., Reed, G.F., Rennels, M.B., Steinhoff, M.C., Anderson, E.L., Englund, J.A. , Pichichero, M.E., Deloria, M.A., Deforest, A., and the NIAID Acellular Pertussis Vaccine Study Group (1992) . Comparison of thirteen acellular pertussis vaccines: aerological response. Pedíatr. , Res . 31:91A. ura, ;k., Mountzoutos, K.T,, Relman, D.A., Falkow, S., and Cowell, J.L. (1990a"). Blordetella pertussis filamentous haemagglutonin: evaluation as a protective antigen and colonization factor in a mouse respíratory infection model. Infecí. Immun. 58:7-16. hin, R.D., Amsbaugh, D.F., and Leef, M.F. (1992).

Mucosal immunization with filamentous haemagglutonin protects against Bordetella pertussis respiratory infection. Jnfect. Im un. 60: 1482-1488. taraz, J.A. , Novotny, P., and Ivanyi, J. (1985).

Identification of a 68-kilodalton protective protein antigen from Bordetella bronchiceptica. Xnfect. Immun. 161: 581-582. ninger, E., Roberts, M., Kenimer, J.G., Charles, I.G., Fairweather, M. , Novotny, P., and Brennan, M.J. (1991) . Pertactin, and Arg-Gly-Asp-containing Bordetella pertussis surface protein thah promotes adherence of mammalian cells. Proc. Naíl . Acad Sci .

USA 88: 345-349. Magistris, T., Romano, M. , Nuti, S., Rappuoli, R. and Tagliabue, A. (1998) , Diasecting human T responses against Bordetella species J. Exp. Med. 168: 1351-1362. don, P.C., Novotny, P., Hall, C.A., and Smith, C.S. (1990) . Systemic and mucosal antibody response to Bordetella pertussis antigens in children with whooping cough. Serodiagnosis Immunother. Inf. Dis. 3: 337-343. da, A., Nencioni, L., Marsili, I., Peppoloni, S., Volpini, G-, Donati, D., Di Tommaso, A., De Magistris, M.T., and Rappuoli, R. (1991). Phase I clinical trial of an acellular pertussis vaccine composed of genetically detoxified pertussis toxin combined with FHA and 69 kDa. Vaccine 9: 741-745. 40. Roberts, M. , Tite, J.P., Fairweather, N.F., Dougan, G. and Charles, I.G. (1992). Recombinant P.69/pertactin: immunogenicity and protection of mice against Bordetella pertussis infection.

Vaccino 10: 43-48. 41. Novotny, P., Chubb, A.P., Cownley, K. , and Charles, I.G. (1991). Biological and protective properties of the 69kDa outer membrane protein of Bordetella pertussis: a novel formulation lor an acellular vaccine . J. Infecí. Dis. 164: 114-122. 42. Shahin, R. D, , Brennan, M.J. , Li . Z.M., Meade, B.D., and Manclark, C.R. (1990b) . Cacterization of the protective capacity and ímmunogenicity of the 69kD outer membrane protein of Bordetella pertussis. J.

Exp. Med. 171: 63-73. 43. Robinson, A., Irons, L.I., and Ashworth, L.A.E. (1985a) . Pertussis vaccine: present status and future prospects, Vaccine 3: 11-22. 44. Robinson, A., Ashworth, L.A.E. Baskerville, A., and Irons, L.l. (1985b). Protection against intranasal mfection of mice with Bordetella pertussis.

Develop. Biol . Stand. 61: 165-172. 45. Robinson, A., Corrige, A.R., Funnell, S.G.P., and Fernandez, M. (1989b) . Serospecific protection of mice against in infection with Bordetella pertussis, Vaccine 7: 321-324. o, Y., Kimura, M., and Fukumi, H. (1984a).

Development of a pertussis component vaccine in Japan, Lancet i: 122-126. ura, M. (1991). Japanese clinical experiences with acellular pertussis vaccines. Develop. Biol . Standard. 73: 5-9. Hoc Group for the Study of Pertussis Vaccines (1998) . Placebo-controlled trial of two acellular vaccines in Sweden-protective eficacy and adverse effects. Lancet i :995-960. n, P., Storsaeter, J., and Romanus, V. (1989). The efficacy of acellular pertussis vaccine. JAMA 261: 560. rsaeter, J., Hallander, H., Farrington, C.P., Olin, P., Moliby, R. , and Miller, E. (1990). Secondary analyses of the efficacy of two acellular pertussis vaccines evaluated in a Swedish phase III trial. Vaccine, 8: 457-462. rsaeter, J. , and Olin, P. (1992). Relative efficacy of two acellular pertussis vaccines during three years of passive surveillance. Vaccine 10: 142-144. , L.U.T., Fahim R.E.F., Jackson, G., Phillips, K. , Wah, P., Alkema, D., Zobrist, G., Herbert, A., Boux. L.. Chong, P., Harjee, N., Klein, M. , and Vose, J. (1991) . A novel process for preparing an acellular pertussis vaccine composed of non- pyrogenic toxoids of pertussis toxin and filamentous haemagglutonin. Molec. Immunol , 28: 251-255. 53. Sekura, R.D., Zhang, Y., Roberson, R., Acton, B., Trollfors, B. , Toisón, N. , Siloach, J. , Bryla, D., Muir-Nash, J., Koeller, D., Schneerson, R., and Robbins, J.B. " (1988) . Clinical, metabolic, and antibody responses of adult volunteers to an investigation vaccine composed of pertussis toxin inactivated by peroxide. J. Pediaír. 113: 807-813. 54. Winberry, L., Walker, R. , Cohén, N., Todd, C. , Sentissi, A., and Siber, G. (1988), Evaluation of a new method for inactivating pertussis toxin with tetranitromethane. Internacional Workshop on Bordetella pertussis, Rocky Mountain Laboratories, Hamilton, Montana. 55. Sekura, R.D. et al. (1993), J. Biol . Chem. 258: 14647- 14651. 56. Irons, L.l. et al. (1979), Biochem. Biophys . Ac a 580: 175-185. 57. Muñoz, J.J, et al. (1981). Infect. I mun. 33: 820-826. 58. Cowell, J.L. et al. (1980), Seminar on ?nfectious Diseases 4: 371-379. Selmer, J.C. (1984) Acta Path. Microbial . Immunol .

Scand. Sect. C, 92: 279-284. Lockhoff, O. (1991) Gycolipids as Immunomodulators : Syntl?esis and Properties, Chem. Iní. Ed. Engl . 30: 1611-1620. Nixon-George, A., Moran, T., Dionne, G., Penney, C.L., Lafleur, D., Bona, C.A. (1990) The adjuvant effect of stearyl tyrosine on a recombinant subunit hepatitis B surface antigen. J. Immunol . 144: 4798- 4802. Siber, G.R. , Thakrar, N. , Yancey, B.A., Herzog. L., Todd, C, Cohén, N. , Sekura, R.D., Lowe, CU. (1991) . Safety and immunogenicity of hydrogen peroxide- inactivated pertussis toxoid in 18-month- old children. Vaccine 9; 735-740. Siber, G. , Winberry, L., Todd, C, Samore, M., Sentissi, A., and Cohén, N. (1988). Satety and immunogenicity in adults of pertussis toxoid inactivated with tetronitromethane. In: International Workshop on Bordetella pertussis, Rocky Mountain Laboratories, Hamilton, Montana. Edwards, K.M., Bradley, R.B., Decker, M.D., Palmer, P.S., Van Savage, J., Taylor, J.C., Dupont, W.D., Hager, C.C., and Wright , P.F. (1989). Evaluation of a new highly purified pertussis vaccine in infants and children. J. Xpfect. Dia . 160: 832-837. ter, D.A., Ashworth, L.A.E., Day, A-, Funnell, S., Lovell, F., and Robinson, A. (1988). Trial of new acellular pertussis vaccine in healthy adult volunteers. Vaccine 6: 29-32. mberg, D.A., Mink, C.A.M., Cherry, J.D., Johnson, C, Garber, R. , Plotkin, S.A., Watson, B., Ballanco, G.A. , Daum R.S., Sullivañ B., Townsend, T.R. Brayton, J., Gooch, W.M., Nelson, D.R., Congeni, B.L., Prober, C.G. , Hackell, J.G., Dekker, C.L. , Christenson, P.D., and the APDT Vaccine Study Group (1991). Comparison of -acellular and whole-cell pertussis-component diphtheria-tetanus-pertussis vaccines in infants. J. Pediaír. 119: 194-204. lund, J.A., Glezen, W.P, and Barreto, L. (1992a) .

Controlled study of a new five-component acellular pertussis vaccine in adults in young children, J. Inf. Dis . 166: 1436-1441. ley, G. , Loosmore, S., Yacoob, R., Klein, M. , Vaccine Research, vol. 1, pp. 413-427. er JD, Halperin SA, Edwards K, Miller B. Decker M, Stephens D. Antibody response to Bordetella pertussis antigens after immunization with American and Canadian whole cell vaccines J". pedíatr. 1992, 121:523-527. 70. Halperin SA. Eastwood BJ. Langley JM. Immune responses to pertussis vaccines concurrently administered with viral vaccines. Ann NY Acad. Sci. 1995, 754: 89-96. 71. Halperin SA, Langley JM. Eastwood BJ. Effect of inactivated poliovirus vaccine on the antibody response to Bordetella pertussis antigens when combined with diphtheria-pertussis-tetanus vaccine.

Clin. Infect. Dis. 1996; in press. 72. Ferreccio C. , Clemens J. Avendano A. et al. The Clinical and immunogenic response of Chilean infants to Haemophilus influenzae type b polysaccharide tetanus protein conjúgate vaccine coadminístered in the same syringe with diphtheria- tetanus toxoide-pertussis vaccine _ at two, four and six months of age. Pediatr. Infect. Dis. J. 1991; 10:761-771. " " 73. Clemens J. Ferreccio C._ Levine M. et al. Impact of Haemophilus influenzae typ b polysaccharide-tetanus protein conjúgate vaccine on responses to concurrently administered - diphtheria-tetanus pertussis vaccine. JAMA 1992: 267:673-8. 74. Scheifele D. Barreto L. Meekison _W. et al. Can Haemophilus influenzae vaccine be combined with diphtheria and tetanus toxoids. Can med Assoc. J. 1993; 149: 1105-16. d R. , Scheifele D., Barreto L. et al. Safety and immunogeniciy of Haemophilus influenzae vaccine (tetanus toxoid conjúgate) administered concurrently or combined with diphtheria and tetanus toxoids, pertussis vaccine and inactivated poliomyelitis vaccine to healt infants at two, four and six months of age. Pediatr. Infect. Dis.

J. 1994; 13: 348-55. nefield H. Black S., Ray P., Lewis E. Fireman B., Hohenboken, hackell JG. Safety of combined acellular pertussis vaccine in intants (abstract no G72) . In: program and Abstracts of the 35th Interscience Conference on Antimicrobiols and Chemotherapy . Washington, DC; American Society of Microbiology 1995: 171. enberg DP, Wong VK, Partridge S, Howe BJ, Fing J. Ward JL. Evaluaticn of a new combination vaccine that incorporates diphtheria-tetanus -acellular pertussis, hepatitis b, and Haemophilus influenzae type b conjúgate vaccines [Abstract no G70] In: program and Abstracts of the 35th Interscience Conference on - Antimicrobiols and Chemotherapy.

Washington, DC; American Society of Microbiology 1995; 170. silak SGF, Orenstein WA, Tetanus, In Plotkin SA, Mortimer EA, Jr., eds, Vaccines, WB Saunders Company, Philadelphia, 1988; 45-73. taffson et al, New England J. Medicine, 1996, vol. 334. pp 349-355. timer EA Jr., Diphtheria Toxoid, In Plotkin SA, Mortimer EA, Jr., eds, Vaccines, WB Saunders Company, Philadelphia, 1988; 30-44. ughese P: Haemophilus Inf luenzae infection in Canadá, 1969-1985, Can Dio Wkly Rep 1986, 12:37-43. eifele D, Gold R, Law B, et al: Decline in Haemophilus Influenzae type b invasive infections at five Canadian pediatric centres. Can Commun Dis Rep 1993; 19:88-91. eifele D., Barreto L. , Meekison W. et al.: Can Haemophilus Influenzae type b-tetanus toxoid conjúgate vaccine be combined with diphtheria toxoid-pertussis vaccine-tetanus toxoid? Can Med Assoc J 1993, 149: 1105-1112. d R. , Scheifele D., Barreto L. et al.: Safety and Immunogenicity of Haemophílus Influenzae type b vaccine (tetanus toxoid conjúgate) administered concurrently or combined with diphtheria and tetanus toxoids, pertussis vaccine and inactivated poliomyelitis vaccines to healthy infants at two, four and six months of age. Pediatric Infectious Diseases Journal 1994; 13:348-55. Scheifele D, Gold R et al. Canadá Communicable Disease Report 22-3, F1-F3 Feb 1, 1996.

Claims (22)

1. REIVINDICACIONES : 1. Una composición inmunogénica multivalente para conferir protección a un hospedero contra enfermedad provocada por infección por Bordetella períussis, Clostridium tetani , Corynebacíerium diphtheriae y poliovirus, que comprende: (a) toxoide de pertussis, hemaglutinina filamentosa, pertactina y aglutinógenos en forma purificada, (b) toxoide tetánico, (c) toxoide diftérico y (d) virus de polio inactivado, que se formula como una vacuna para administración in vivo a un hospedero, caracterizada porque los componentes individuales de la composición se formulan de manera que la inmunogenicidad de los componentes individuales no se vea afectada por otros componentes individuales de la composición.
2. 2. La composición inmunogénica según la reivindicación 1, que se_ caracteriza además por un adyuvante.
3. 3. La composición inmunogéníca según la reivindicación 2, caracterizada porque el adyuvante es hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio.
4. 4. La composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el toxoide de pertussis está presente en una cantidad de 5 a 30 µg de nitrógeno, la hemaglutinina filamentosa está presente en una cantidad de 5 a 30 µg de nitrógeno, el pertactina está presente en una cantidad de 3 a 15 µg de nitrógeno y los aglutinógenos están presentes en una cantidad de 1 a 10 mg de nitrógeno, en una sola dosis para humanos .
5. 5. La composición inmunogénica según la reivindicación 4, que contiene 20 µg de nitrógeno de toxoide de pertussis, 20 µg de nitrógeno de hamaglutinina filamentosa, 5 µg de nitrógeno de pertactina y 3 µg de nitrógeno de aglutinógenos, en una sola dosis para humanos.
6. 6. La composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el toxoide diftérico está presente en una cantidad de 10 a 20 Lfs y el toxoide tetánico está presente en una cantidad de 1 a 10 Lfs.
7. 7. La composición inmunogénica según la reivindicación 6, caracterizada porque el toxoide diftérico está presente en una cantidad de 15 Lf y el toxoide tetánico está presente en una cantidad de 5 Lfs.
8. 8. La composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el virus de polio inactivado comprende una mezcla de virus de polio inactivados tipos 1, 2 y 3.
9. 9. La composición inmunogénica según la ( reivindicación 8, caracterizada porque la mezcla de los poliovirus inactivados tipos 1, 2 y 3 está presente en las 5 siguientes proporciones: 20 a 50 unidades de antígeno D de poliovirus tipo 1 5 a 10 unidades de antígeno D de poliovirus tipo 2 20 a 50 unidades de antígeno D de poliovirus tipo 3, en una sola dosis para humanos. 10
10. 10. La composición inmunogénica según la reivindicación 9, caracterizada porque la mezcla de virus de polio inactivados tipos 1, 2 y 3 se utiliza en las siguientes proporciones: 40 unidades de antígeno D de poliovirus tipo 1 15 8 unidades de antígeno D de poliovirus tipo 2 32 unidades de antígeno D de poliovirus tipo 3, en o una sola dosis para humanos.
11. 11. La composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que confiere además 20 protección contra enfermedad provocada por la infección con Haemophilus influenzae y además comprende un conjugado de una molécula acarreadora seleccionada del grupo que consiste de toxoide tetánico y toxoide diftérico y un polisacárido capsular de Haemophilus influenzae tipo B. 25
12. 12. La composición inmunogénica según la reivindicación 11, caracterizada porque el conjugado _ comprende un conjugado de toxoide tetánico o toxoide diftérico y polirribosa ribitol fosfato (PRP) de Haemophilus influenzae tipo b.
13. 13. La composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12, caracterizada porque el conjugado se proporciona en una forma liofilizada y se reconstituye para administrarse en "la composición inmunogénica por los componentes de la composición.
14. 14. La composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizada la composición inmunogénica contiene al conjugado en una cantidad de 5 a 30 µg del conjugado PRP hasta 15 a 30 µg del toxoide tetánico, en una sola dosis para humanos.
15. 15. La composición inmunogénica según la reivindicación 14, caracterizada porque la composición inmunogénica contiene al conjugado en una cantidad de 10 µg de PRP conjugado con 20 µg de toxoide tetánico, en una sola dosis para humanos.
16. 16. Una composición de vacuna multivalente caracterizada por, por cada 0.5 ml de dosis: 20 µg de toxoide de pertussis 20 µg de hemaglutinina filamentosa 5 µg de fimbras 2 y 3 3 µg de proteína de membrana pertactina 15 Lf de toxoide diftérico 5 Lf de toxoide tetánico poliovirus tipo 1 en 40 unidades de antígeno D poliovirus tipo 2 en 8 unidades de antígeno D 1.5 µg de fosfato de aluminio
17. 17. La composición inmunogénica según la reivindicación 16, caracterizada además porque, por cada 0.5 ml de dosis: 10 µg de polisacárido capsular de polirribosa ribitol fosfato purificado (PRP) de Haemophilus influenzae tipo b ligado covalentemente a 20 µg de toxoide tetánico.
18. 18. La composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 16 o 17, caracterizada además porque, por cada 0.5 ml de dosis, hay 0.6% de 2-fenoxietanol.
19. 19. Una composición inmunogénica multivalente para conferir protección a un hospedero contra enfermedad provocada por la infección por Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacteríum diphtheriae y Haemophilus influenzae, que comprende: (a) toxoide de pertussis, hemaglutinina filamentosa, pertactina y aglutinógenos en forma purificada, (b) toxoide tetánico, (c) toxoide diftérico y (d) un conjugado de una molécula acarreadora y un polisacárido capsular de Haemophilus mf luenzae tipo b, que está formula como una vacuna para administración in vivo a un hospedero, caracterizada porque los componentes individuales de la composición se formulan de manera que la inmunogenicidad de los componentes individuales no se vea perjudicada por otros componentes individuales de la composición.
20. 20. La composición inmunogénica según la reivindicación 19, caracterizada porque la molécula acarreadora se selecciona de toxoide tetánico y toxoide diftérico. —
21. 21. El uso de la composición inmúnogénica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, como un medicamento.
22. 22. Una composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 22, en la manufactura de un medicamento para inmunizar a un hospedero contra una enfermedad.