CN1647822A - 脊髓灰质炎灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及脊髓灰质炎灭活疫苗及其制备方法。具体地说，本发明的脊髓灰质炎灭活疫苗是以脊髓灰质炎减毒病毒为起始株制备的。本发明还涉及预防人受试者中脊髓灰质炎的方法。

Description

脊髓灰质炎灭活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及脊髓灰质炎灭活疫苗及其制备方法。具体地说，本发明的脊髓灰质炎灭活疫苗是以脊髓灰质炎减毒病毒为毒种制备的。本发明还涉及预防脊髓灰质炎的方法。
背景技术
脊髓灰质炎是由脊髓灰质炎病毒引起的、传播广泛、危害极大的急性传染病。50年代中末期脊髓灰质炎灭活疫苗和口服活疫苗(IPV和OPV)相继问世。IPV和OPV的使用有效降低了脊髓灰质炎的发病率。自1988年WHO提出消灭脊髓灰质炎目标后，全球发病报告数由1988年35万例下降至2003年不足700例，发病地区也由1988年的125个国家减少到6个。
我国于1959年底研制成功OPV。其生产过程是将减毒株脊髓灰质炎病毒I、II、III型分别接种人胚肺二倍体细胞(简称2BS)，病毒繁殖扩增后直接收获病毒悬液，按一定比例将三型病毒合并即得。该疫苗的病毒滴度比较低，有时不能达到《中国生物制品规程》(2000年版)中“口服脊髓灰质炎减毒活疫苗制造及检定规程”要求，时常需要进一步浓缩。而且，人二倍体细胞有一定寿命，培养方法和规模受到限制。
从1960年在中国开始使用OPV到1990年，发病率从3.18/10万降至0.24/10万。1994年9月，全国最后一例由野毒株引起的脊髓灰质炎消灭，至此，本土野毒株病毒在我国彻底消灭。然而，伴随着OPV的广泛使用，疫苗变异株感染病例明显增多。变异株病毒有疫苗相关病毒(vaccine-associated poliovirus，VAPV)，和疫苗衍生病毒(vaccine-derived poliovirus，VDPV)两种。
VAPV主要发生在OPV免疫者及与其接触的易感染者中。在流行病学上与服OPV疫苗有关，其中少数感染者可出现急性迟缓性麻痹症。分离的病毒的核苷酸序列与Sabin株的差异小于1％。
VDPV主要发生在未免疫人群中，与是否服OPV无关，可发生人与人之间的持续传播，并出现成群病例，常为永久性麻痹，分离的病毒的核苷酸序列与Sabin株的差异大于1％，其神经毒力已回复。通过序列分析确定，VDPV为Sabin株三型病毒的重组体。2000年7月-2001年9月，美洲区多米尼加共和国和海地发生了I型VDPV引起的脊髓灰质炎爆发，2001年菲律宾发现3名儿童因VDPV感染引起麻痹。2002年马达加斯加有4名儿童因VDPV感染而麻痹。2000年日本在污水中也检测到III型VDPV。对病例的回顾性分析发现，埃及1988年和1993年也发生VDPV引起的脊髓灰质炎爆发，在此期间有32例II型VDPV引起的麻痹病例。
据2004年WHO统计，全球疫苗相关病例(即由VAPV引起的脊髓灰质炎)的发生率为2～4/100万；从1963到2004年VDPV鉴定出约20种。减毒株病毒基因组发生的自然回复突变使VAPV和VDPV必然存在。因此，在我国野毒株引起的麻痹型脊髓灰质炎已经完全消灭的情况下，使用OPV的风险远大于效益。
目前国际上广泛使用的另一种疫苗是灭活疫苗，与OPV有两点主要不同：其一，生产用毒种为野毒株；其二，病毒经纯化、灭活。IPV可产生体液免疫，没有潜在突变及毒力回升之虑。这些广泛使用的灭活脊髓灰质炎疫苗有传代猴肾细胞IPV，灵长类胚胎二倍体细胞系IPV和Vero细胞系IPV。
由饲养猴传出二代到三代猴肾细胞制备疫苗，能减少猴源病毒的污染，在此传代水平也没有致瘤性。但超过此代次后，细胞生长速度开始减慢，至第六、第七代，细胞停止生长。
用二倍体细胞制备IPV，控制了细胞培养的病毒污染。但是细胞对培养液的高要求尤其是血清的要求，使该细胞从经济和技术上不适合大规模培养。另外病毒产量低也是一个缺点。
用Vero细胞制备IPV，优点是该细胞系已经被证明不含有细菌、霉菌和支原体的污染，没有致瘤性，胞核学稳定，可在微载体反应器系统大规模培养，是制备疫苗的理想基质。法国1982年研制成功Vero脊髓灰质炎灭活疫苗。
但是，以上所述的各种IPV的生产用毒株都是强毒株，常用的I型毒种为Mahoney株、Brunhilde株、Brunder株，II型毒种为MEF-1株，III型毒种为Saukett株。这些毒株的特点是具有较强的神经毒力。随着脊髓灰质炎在更多国家和地区日趋消灭，实验室来源的野毒株给全球消灭脊髓灰质炎带来新的威胁。另一方面，采用野毒株病毒生产IPV需要在生物安全三级实验室进行，通过对操作间的气流控制和对排放物质的严格消毒，防止病毒泄漏至环境中或感染操作人员，如此生产不仅增加疫苗生产成本，而且不便于大规模生产。另外，随着全球消灭脊灰的目标越来越接近，人类自然感染脊灰病毒机会越来越少，而由于使用野毒株病毒生产疫苗(W-IPV)可能造成的实验室泄漏对人类的威胁显得越来越大。
本发明的目的在于克服以上所述OPV和现有IPV的缺陷。
发明内容
本发明提供了一种制备脊髓灰质炎灭活疫苗的方法，其中使用脊髓灰质炎减毒病毒株作为起始株生产灭活疫苗(S-IPV)。
在另一方面，本发明涉及由本发明的方法制备的脊髓灰质炎灭活疫苗。
本发明还涉及预防脊髓灰质炎的方法，包括对有此需要的个体施用有效量的本发明脊髓灰质炎灭活疫苗。
具体实施方式
在本发明中，脊髓灰质炎灭活疫苗是以减毒株为毒种进行的。在一个实施方案中，本发明提供了一种脊髓灰质炎灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
a，培养来自细胞系的细胞；
b，在细胞长成致密单层时，接种脊髓灰质炎减毒株病毒；
c，病毒在细胞中增殖；
d，收集细胞所产生的病毒悬液；
e，通过澄清过滤去除细胞残渣；
f，通过超滤浓缩病毒悬液；
g，通过凝胶过滤层析步骤和离子交换层析步骤纯化病毒液；
h，通过灭活剂灭活病毒；
i，配制灭活疫苗。
在本发明中，所用的细胞系可以是常规用于增殖脊髓灰质炎减毒株病毒的任何细胞，它们可以从WHO获得。所述细胞可以是二倍体细胞系或Vero细胞系，优选是Vero细胞。细胞的培养可以如下进行：将合适的细胞系例如Vero细胞在15L转瓶内1∶6分种，培养5天后接种脊髓灰质炎减毒株病毒。或者，所述细胞是二倍体细胞系，将该二倍体细胞在15L转瓶内1∶2分种，培养7天后接种脊髓灰质炎减毒株病毒。所述细胞可以由工作细胞库复苏、经传代扩增得到。细胞培养可以依常规方法进行，例如在15升转瓶内进行，也可以在发酵罐内进行。在发酵罐中可以使用微载体，例如Cytodex1TM，Cytodex2TM，Cytopore(Pharmacia公司)，优选Cytodex1TM。其使用浓度可以是1-10g/L；优选3g/L。该微载体适合于Vero细胞生长，维持时间可达一个28天。优选在细胞密度达到3×106时对细胞接种病毒，例如对培养4天的细胞种毒。
在本发明的方法中，可以采用任何减毒的脊髓灰质炎病毒进行接种，例如Sabin株、Sabin纯化株、中III2株或经批准的其他减毒株。优选地，I、II型用Sabin株(WHO提供)；III型用Sabin纯化株(WHO提供)。这些减毒的脊髓灰质炎病毒均可从WHO获得。
可以以任何合适的感染复数接种脊髓灰质炎病毒减毒株。优选地，感染复数(MOI)是0.01-0.1。
用于病毒增殖的培养基为常规培养基，如：199，MEM。它们可以由合适的生产商购得，例如：美国SIGMA公司。或者，还可以按照已公开的配方配制合适的培养基。培养基中应尽可能少的加入小牛血清或蛋白，例如血清浓度低于2％，人血清白蛋白浓度低于0.1％。
接种病毒后，按照常规方式培养细胞。优选地，在含5％ CO2的培养箱中于37℃培养细胞1-7天。更优选地，培养细胞48-96小时。最优选地，培养细胞72小时。
将细胞培养达到预定的时间后，通过常规方法收集上清，由此收获病毒。
病毒收获后通过滤器进行澄清过滤。优选地，通过多级滤器对病毒上清液进行多次澄清过滤步骤。例如，依次用孔径为1.0微米，0.65微米，0.45微米，最小一级为0.22微米的滤器进行过滤。
澄清后的病毒液通过超滤进行浓缩。超滤膜的截留分子量可以是300KD以下，优选100-300KD，更优选200-300KD，以便对病毒液进行浓缩，浓缩倍数可以达到20-100倍。
浓缩后的病毒液必须纯化。第一步进行凝胶过滤层析，介质可以采用已知的凝胶过滤介质进行，例如Pharmacia公司生产的Sepharose6FF或其他厂商生产的具有相同性能的凝胶过滤介质，如德国Merk公司生产的Fractolgel。凝胶过滤中使用的平衡液可以是例如pH6.2-8.0、更优选pH6.5-7.5的PBS。如有必要，可以对病毒液进行多次凝胶过滤层析。第二步纯化采用离子交换层析，其中使用弱阴离子交换介质，可以采用Merck公司生产的Fractogel EMD DEAE或其他厂商生产的弱阴离子交换介质，如Pharmacia公司生产的DEAE-SepharoseFF。离子交换所用的缓冲盐溶液可以是磷酸盐缓冲系统，或Tris-HCl缓冲系统。平衡缓冲液和洗脱缓冲液的pH值及氯化钠的浓度随所使用的介质的生产厂家不同可以有所变化。例如，平衡缓冲液盐浓度范围可以为0.05M～0.1M，其pH值可以是pH6.2-8.0、更优选pH6.5-7.5，其中还包含浓度为0.06～0.12M的氯化钠。洗脱缓冲液盐浓度可以是0.05M～0.1M，pH值可以是pH6.2-8.0、更优选pH6.5-7.5，其中包含氯化钠，浓度为0.1-0.5M，优选0.15～0.45M，更优选0.2-0.4M。
经过上述纯化后，病毒悬液的蛋白含量小于0.1微克/D抗原单位，细胞残余DNA含量低于100pg/ml。残余牛血清含量低于50ng/ml。
在纯化后对病毒进行灭活。可使用WHO的《IPV制造及检定规程》中规定的灭活剂和灭活条件。例如，可以采用甲醛作为灭活剂，其使用浓度为1∶2000-1∶8000，优选浓度为1∶4000。在35-37℃灭活10-12天。优选灭活温度为37℃，灭活时间为12天。
最后，按照常规方法配制疫苗。例如，将本发明疫苗配制成包括药学可接受的载体，如标准的缓冲液，稳定剂，稀释剂，防腐剂和/或增溶剂，也可配制成便于缓释的剂型。稀释剂包括水，盐水等。等渗添加剂包括氯化钠，葡萄糖，甘露糖醇，山梨糖醇和乳糖等。稳定剂包括白蛋白等，例如可以向按照上述方法制备的灭活病毒中加入终浓度为0.1％的人血白蛋白。其它适当的疫苗载体和添加剂是本领域技术人员已知的或显而易见的，例见Remington’s PharmaceuticalScience，第18版，1990，Mack Publishing，该文献列入本文作为参考。
本发明疫苗中还可含有一种或多种其它的免疫调节成分，如佐剂或细胞因子等。可用于本发明疫苗之佐剂的非限制性例子包括RIBI佐剂系统(Ribi公司，Hamilton，MT)，明矾，如氢氧化铝凝胶的矿物凝胶，水包油乳剂，油包水乳剂，嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA)，QS-21(Cambridge Biotech公司，Cambridge MA)，SAF-M(Chiron，Emeryville CA)，AMPHIGEN佐剂，皂苷，Quil A或其它皂苷组分，单磷酰脂质A和Avridine脂质-胺佐剂。可用于本发明疫苗的水包油溶剂的非限制性例子包括经改良的SEAM62和SEAM 1/2制剂。经改良的SEAM62是含有5％(v/v)角鲨烯(Sigma)，1％(v/v)SPAN85去污剂(ICI表面活性剂)，0.7％(v/v)TWEEN80去污剂(ICI表面活性剂)，2.5％(v/v)乙醇，200μg/ml Quil A，100μg/ml胆固醇和0.5％(v/v)卵磷脂的水包油乳剂。经改良的SEAM 1/2是含有5％(v/v)角鲨烯，1％(v/v)SPAN85去污剂，0.7％(v/v)TWEEN80去污剂，2.5％(v/v)乙醇，100μg/ml Quil A和50μg/ml胆固醇的水包油乳剂。可包括在疫苗中的其它免疫调节剂包括例如一种或多种白细胞介素，干扰素或其它已知的细胞因子。
优选地，将本发明的疫苗制备成二价或三价的形式。因此，可以重复上述(a)-(h)的步骤以便分别制备I、II和III型灭活病毒原液，然后将I、II和III型灭活病毒中的任意两种或三种混合，配制二价或三价疫苗。其混合比例可依常规方法确定，这在本领域普通技术人员的技术范围之内。优选地，三价疫苗中I型、II型、III型D抗原含量配比为40-80/80-200/30-60IU，更优选为80/100/60。
或者，可以将由本发明制得的疫苗与本领域中的一种或多种疫苗制成联合疫苗。例如，可以与百-白-破疫苗相联合，制成四联疫苗。制备联合疫合的方法在现有技术中已有众多教导。
在本发明的疫苗制备方法中，由于使用的起始病毒株(也可称作毒种)是Sabin株病毒，其毒力已经被高度减弱，大大降低了发生脊髓灰质炎的风险。即使泄漏，也不能使正常接触者发生脊髓灰质炎，因此，S-IPV比W-IPV更安全，更有助于实现在全球消灭脊髓灰质炎的目标。而且，本发明的制备方法可以在普通GMP车间内进行，无需生物安全三级实验室所需的实验室防护和操作人员个体防护。不仅使实验室建造成本和运行成本大幅度降低，而且使操作人员行动方便操作简单。该方法易于扩大生产规模，生产过程及产品均安全，有利于根除麻痹型脊髓灰质炎。利用该方法生产的疫苗的效果可以与野毒株生产的IPV相当，同时降低、甚至消除了现有技术中与脊髓灰质炎疫苗有关的缺点和风险。
本发明还涉及利用上述方法制备的脊髓灰质炎灭活疫苗。
本发明另外涉及避免因接种疫苗感染脊髓灰质炎的方法，包括对有此需要的个体施用有效量的本发明脊髓灰质炎疫苗。
疫苗的有效量可通过常规方法，先从低剂量的疫苗开始，然后增加剂量同时监测药效来确定。单次施用疫苗或多次施用疫苗之后可得到有效量。当确定每只动物的最适剂量时需考虑已知因素，包括动物的物种、大小、年龄和身体状况，动物中其它药物的存在等。优选考虑其它动物的研究结果之后选定实际的剂量。
检测是否得到足够的免疫应答的一个方法是测定免疫后的动物中的血清转变和抗体滴度。优选由医疗工作人员根据所有相关因素(其中一些如上所述)的分析结果确定免疫的时间安排和加强免疫的次数(如果需要的话)。
使用已知技术，并考虑本领域技术人员可确定的因素，如参考WHO提供的W-IPV的国际标准品，可确定本发明病毒的有效量。本发明疫苗中每剂含本发明D抗原的剂量范围优选为，I型D抗原为40至80IU，II型为80至200IU，III型为30至60IU。最优选为I型、II型、III型分别为80IU/100IU/60IU。适当的剂量大小范围为约0.5ml至约1.0ml，更优选约为0.5ml。
本发明的疫苗可经皮下或肌肉接种。相应地，本发明的疫苗可以配制成注射剂型。
下面参考实施例对本发明作进一步说明。给出这些实施例只是为了举例说明，它们不以任何方式限制本发明的范围
实施例
实施例1疫苗生产工艺流程
细胞：采用非洲绿猴肾传代细胞系(Vero细胞系)。该细胞由日本学者于1963年从非洲绿猴肾分离得到。第112代被送至美国典型培养物保藏中心(ATCC)，经过鉴定，该细胞无致肿瘤性，无细菌、霉菌及支原体污染，无病毒污染，适合于用来生产生物制品。
北京生物制品研究所于1988年12月从美国ATCC获得117代Vero细胞(编号为CCL81)二方瓶，立即作为原始种子冻存在液态氮中。从一支原始种子传代扩增制备了主细胞库，一支主种子库细胞传代扩增又制备了工作细胞库。主细胞库和工作细胞库的检定均符合世界卫生组织(WHO)关于动物细胞制备生物制品规程《Recommendations for the use of animal cells as in vitro substratesfor the production of biologicals》的要求。
病毒：Sabin株，由WHO提供。I型和II型为WHO制备的主毒种批，Sabin SO+2，III型为Pfizer RSO+5(来自Pfizer公司)。用以上病毒经Vero细胞培养扩增一代，建立了工作种子批毒种，用于生产IPV。
工作种子批毒种通过了中国药品生物制品检定所的复核检定。
细胞培养：复苏工作库细胞，将一支安瓶的细胞复苏到一个15L转瓶中，培养4至6天后，按照1∶6的分种比例传出6个转瓶，如此传代扩增至50至200个15L转瓶。培养方式可在15升转瓶中，也可在微载体反应器系统中，微载体的使用浓度为3mg/ml，培养液为含5％小牛血清的199培养基。培养温度为37℃。
病毒接种：细胞培养三至五天后，弃去细胞培养上清，接种I、II、III型病毒的工作种子批病毒。病毒接种量为0.1MOI，培养温度为33-36℃，培养时间为72-120小时。病毒维持液为含人血清白蛋白0.1％的MEM培养基。
病毒收获：当细胞出现明显病变时，收获细胞培养上清。
澄清过滤：用1.2-0.22微米的滤器过滤所有收获上清。
病毒液浓缩：用截留分子量为300KD的超滤膜超滤浓缩病毒液，浓缩倍数为20-50倍。
凝胶过滤：用pH6.5-7.5的PBS平衡的Sepharose6FFTM介质进行纯化病毒液，收集外水体积流穿峰。通过凝胶过滤，杂蛋白去除可达95％以上。
离子交换：凝胶过滤纯化后的病毒液进行离子交换层析。介质可以采用DEAE-SepharoseFFTM或其他厂商生产的弱阴离子交换介质，平衡液为pH6.5-7.5、含有0.05-0.15M氯化钠的PBS，洗脱液为含0.2-0.5M氯化钠、pH值为6.5-7.5的PBS。
灭活：纯化后的病毒液用0.22微米滤膜过滤。加入1∶4000的甲醛，置于33-36℃灭活12天。
然后通过双抗体夹心法测定脊髓灰质炎疫苗D抗原含量。该方法进行如下：用氯化铯密度梯度离心法纯化脊髓灰质炎病毒D抗原，免疫家兔和豚鼠，制备纯化兔抗D抗原抗体(R-Ab)和豚鼠抗D抗原抗体(G-Ab)；用R-Ab包板酶标板(4℃培育过夜)，洗板后，加入系列稀释的待检抗原和标准品，37℃培育1小时，洗去未反应物质，加入G-Ab，37℃作用1小时，洗板后加入抗豚鼠IgG的酶结合物，37℃培育1小时，洗板后加入邻苯二氨底物系统。37℃培育10分钟，后立即用2N硫酸终止反应，在492nm波长下测定吸收值。以标准品抗原浓度及吸收值(OD)的对数做标准曲线，计算待检样品的抗原浓度。
配制：纯化后的单价病毒灭活液加入终浓度为0.1％的人血白蛋白后，将三个型的灭活原液混合，配制注射剂，其中I、II、III型D抗原的配制比例分别为80/60/30IU。
实施例2疫苗纯度分析
因为疫苗的细胞基质是传代细胞，因此，疫苗纯度直接影响了疫苗的安全性。WHO关于《传代细胞作为生物制品细胞基质规程》要求，疫苗中细胞残余DNA须低于100pg/剂，因此，通过核酸杂交法检测本发明疫苗中的残余Vero细胞DNA。该方法进行如下：
培养收集约107的Vero细胞，按照《分子克隆》提供方法提取Vero细胞染色体DNA。将DNA与蛋白酶K及SDS于50℃作用3小时，用酚/仿/异戊醇(25∶24∶1)混合液抽提三次，再用无水乙醇沉淀其中DNA。用此纯化DNA做DNA测定标准，并取其中一部分进行光敏生物素标记，制备成探针。用同样方法提取待检样品中的DNA，并通过狭缝杂交点样器将样品及标准品点在硝酸纤维素膜上，将膜80℃烘干2小时使固定，置入杂交袋，于42℃预杂交2～4小时，再在42℃杂交20～24小时。洗膜后用3％牛血清白蛋白于42℃封闭2～4小时。然后碱性磷酶系统显色15分钟，用2N硫酸终止反应。对照待检样品与标准DNA条带的显色强度，估测出DNA含量范围。
由上述方法检测出本发明的疫苗中细胞残余DNA低于10pg/剂，纯度达96％以上。
另外，按照上述实施例1中的方法测定出本发明的方法中D抗原(病毒中产生中和抗体的蛋白)回收可达20％。结果显示在下表1中。
表1
检测指标                   凝胶过滤         离子交换
残余蛋白                    5％             0.4％
DNA含量                     ＜1000pg        ＜10pg
D抗原回收率                 60％            20％
实施例3疫苗效力分析：
将本发明的疫苗(S-IPV)与作为参考品的国际脊髓灰质炎灭活疫苗(W-IPV)同时免疫无特殊致病因子级(SPF)大鼠，每只0.5ml，后腿肌肉注射，每批疫苗免疫20只。免疫后21天采血，分离血清。于56℃ 30min灭活后进行中和试验，测定血清中和效价。结果显示，Sabin株IPV的免疫效果可以达到国际疫苗参考品的水平，结果见表1。
表2  S-IPV与国际标准品大鼠效力试验结果比较
  疫苗成分     S-IPV     国际IPV标准品
  疫苗浓度(IU/ml)   效力试验结果血清效价   疫苗浓度(IU/ml)   效力试验结果血清效价
    I型     52     2733     40     874
    II型     106     281     5     234
    III型     60     1318     29.5     614
实施例4安全性分析：
按照中国生物制品规程对制备的灭活疫苗进行异常毒性试验。异常毒性实验是指各制品的特异性毒性实验以外的一般安全试验，目的是通过动物实验检查制品中外源性毒性物质的污染情况以及是否存在意外的不安全因素，以保证人体使用安全。
试验，目的是通过动物实验检查制品中外源性毒性物质的污染情况以及是否存在意外的不安全因素，以保证人体使用安全。
针对小鼠和豚鼠两种动物进行异常毒性实验。试验中使用的小鼠和豚鼠应达到清洁级标准。
取体重18-22g小鼠，注射前称取每只小鼠体重。每批样品用5只小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml测试疫苗，观察7天。
另外，取体重250-350g豚鼠，注射前称取每只豚鼠体重。每批样品用2只豚鼠，每只豚鼠腹腔注射5.0ml测试疫苗，观察7天。
表3中显示了本发明疫苗的异常毒性试验结果。
表3异常毒性试验结果
动物 接种动物编号 接种剂量 观察时间     观察结果
  小鼠     1     0.5     7   健存，无异常反应体重增加
    2     0.5     7   健存，无异常反应体重增加
    3     0.5     7   健存，无异常反应体重增加
    4     0.5     7   健存，无异常反应体重增加
    5     0.5     7   健存，无异常反应体重增加
豚鼠     1     5     7   健存，无异常反应体重增加
    2     5     7   健存，无异常反应体重增加
结论                                合格
上述结果说明，本发明的疫苗无异常毒性。
另外进行过敏原性试验，具体方法如下：以牛血清为过敏试验的阳性对照，生理盐水为阴性对照。每组3只豚鼠，分别于腹部皮下注射阳性物质、阴性物质或疫苗0.5ml，隔日一次，共3次，第3次注射后24天，耳静脉给予相同物质0.5ml，立即观察注射后反应，结果如表4。阳性对照组3只豚鼠全部发生过敏反应，其中2只死亡。Sabin株灭活疫苗组和阴性对照组没有差别，豚鼠没有发生任何反应，观察期内健存。过敏原性试验的结果显示在表4中。
                 表4.过敏原性试验结果
 试验分组 豚鼠号        30分钟内表现                  3天结果
                 咳嗽    抓耳   抽搐   休克     死亡
 牛血清    1      +      -      +      -        +      死亡
           2
                  +      -      +      +        +      死亡
           3
                  +      +      +      +        -      存活
生理盐水   1      -      -      -      -        -      存活
           2      -      -      -      -        -      存活
           3
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疫苗       1      -      -      -      -        -      存活
20041101   2
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上述结果说明，本发明的疫苗内无致敏原。
上述实施例只是为了阐明，而不是限制本发明。相关领域的技术人员清楚地知道，可对本文所述的内容作其它适当的修饰和变化，并可在本发明或其任何实施方案的范围内进行这种修饰和变化。这样的修饰和变化都落入本发明的保护范围。

Claims (18)

1.一种制备脊髓灰质炎灭活疫苗的方法，包括以下步骤：
(1)培养来自细胞系的细胞；
(2)在细胞长成致密单层时，接种脊髓灰质炎病毒减毒株病毒；
(3)病毒在细胞中增殖；
(4)收集细胞所产生的病毒悬液；
(5)通过澄清过滤去除细胞残渣；
(6)通过凝胶过滤层析步骤和一个离子交换层析步骤纯化病毒液；
(7)通过灭活剂灭活病毒；
(8)配制灭活病毒悬液。
2.权利要求1的方法，其中所述脊髓灰质炎病毒减毒株是脊髓灰质炎I、II、III型病毒减毒株，优选Sabin株、Sabin纯化株、中III2株或经批准的其他减毒株。
3.权利要求1的方法，其中所述细胞是二倍体细胞系或Vero细胞。
4.权利要求1的方法，其中所述脊髓灰质炎减毒病毒的感染复数为0.01-0.1。
5.权利要求1的方法，其中所述细胞在含有微载体的发酵罐内培养或转瓶内培养。
6.权利要求5的方法，其中所述微载体是cytodex1、cytodex2或cytopore。
7.权利要求1的方法，其中在病毒接种后培养细胞48-120小时，然后收获培养上清液。
8.权利要求1的方法，其中对收获的培养上清液进行1.2-0.22μ的滤器过滤，优选进行多个过滤步骤。
9.权利要求1的方法，其中对经过过滤的培养上清液通过超滤进行浓缩，优选超滤膜的截留分子量为300KD以下，更优选为100-300KD，最优选200-300KD。
10.权利要求1的方法，其中对经过过滤的培养上清液通过用Sepharose6FF或Fractolgel或其它具有相同性能的凝胶过滤介质进行凝胶过滤纯化，优选进行多个凝胶过滤步骤。
11.权利要求1的方法，其中离子交换步骤采用弱阴离子交换介质进行，例如Fractol EMDTM DEAE或DEAE-SepharoseFF。
12.权利要求1的方法，其中灭活步骤是使用1∶4000的甲醛，置于33-36℃，灭活12天。
13.权利要求1的方法，其中还任选地向疫苗中加入合适的稳定剂和/或佐剂，例如0.1％的人血白蛋白。
14.权利要求1的方法，其中重复上述(a)-(h)的步骤以便分别制备I、II和III型灭活病毒原液，并将制得的I、II和III型灭活病毒中配制成三价疫苗。
15.权利要求14的方法，其中所述疫苗中I型、II型、III型D抗原含量配比优选为40-80/80-200/30-60IU，更优选为80/100/60。
16.由权利要求1-15任一项的方法制备的脊髓灰质炎灭活疫苗。
17.权利要求16的疫苗，其中还含有合适的佐剂和/或免疫助剂。
18.预防人受试者中脊髓灰质炎的方法，包括对有此需要的个体施用有效量的权利要求16或17的脊髓灰质炎灭活疫苗。
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