CN103768590B - 利用阴离子交换层析去除乙脑疫苗制品中残留dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用阴离子交换层析去除乙脑疫苗制品中残留DNA的方法，其特点是将乙脑疫苗浓缩液凝胶过滤层析所获得的初步纯化液进行阴离子交换层析，使DNA牢固吸附在离子交换介质上而乙脑病毒蛋白直接穿透，从而达到去除宿主DNA的目的。本发明针对现有的浓缩、凝胶过滤层析等提取乙脑疫苗方法只能将一定比例的游离DNA去除，不能去除与抗原蛋白结合的宿主DNA；临床不良反应现象屡见不鲜的问题，在保证疫苗效价的前提下，提高疫苗产品质量，去除大量杂蛋白及宿主DNA，使疫苗制品中残留DNA含量达到50pg/剂以下，解决目前乙脑疫苗行业面临的质量问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种在疫苗制品中去除宿主DNA及杂蛋白的方法，特别是涉及一种利用阴离子交换层析去除乙脑疫苗制品中残留DNA的方法。
背景技术
乙脑疫苗是将乙脑病毒接种于适合的动物细胞上，经繁殖后病毒释放到培养液中，与此同时一些残余的宿主细胞或其碎片也会进入到培养液中，经澄清，超滤浓缩，凝胶过滤层析后，提取得到的乙脑疫苗原液中会产生游离的宿主DNA及与抗原蛋白结合的宿主DNA，原液中还含有大量的宿主蛋白，浓缩、凝胶过滤层析工艺会将一定比例的游离DNA去除，但仍会有残余DNA存在，特别是与病毒或抗原蛋白结合的DNA会残留在原液中，若去除不彻底，这部分DNA会随着疫苗一起被注入到人体内，可能会在人体内引起不良反应，或具有癌症发生的可能。
目前乙脑疫苗普遍采用浓缩、凝胶过滤层析等传统工艺进行提取，所得到的乙脑疫苗，存在以下缺陷：
1、病毒疫苗提取后残留的宿主DNA含量过高。
2、病毒疫苗提取后仍含有过高的宿主蛋白，杂蛋白去除率不高，导致疫苗在临床使用后有较大的副作用。
3、上述缺陷，影响了病毒疫苗产品的质量，制约了疫苗产品的生产。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有技术存在的上述不足，为了实现在处理乙脑疫苗的过程中尽可能不损失抗原，即不影响疫苗制品的药效，又有效地去除杂蛋白及残留宿主DNA的目标，本发明提供一种利用阴离子交换层析去除乙脑 疫苗制品中残留DNA的方法，即将浓缩、凝胶过滤层析所获得的初步纯化液加载到阴离子交换介质中，在一定的PH、离子强度下，DNA牢固吸附在介质上而病毒蛋白直接穿透，从而使成品乙脑疫苗DNA残留量达到合格标准。
本发明给出的技术方案是：利用阴离子交换层析去除乙脑疫苗制品中残留DNA的方法，其特点是：将凝胶过滤层析所获得的病毒蛋白溶液进行阴离子交换层析，使DNA牢固吸附在离子交换介质上而病毒蛋白穿透，从而达到去除宿主DNA的目的。
具体步骤为：
将乙脑疫苗浓缩液经过BPG200层析柱，Sepharose 4Fast Flow或Sepharose6FastFlow凝胶过滤层析，紫外检测波长280nm，流速为6cm/h，流动相为pH7.4的10mmol/L PBS(NaCl 0.2-0.6mol/L)，收集第一个吸收峰，即乙脑病毒蛋白初步纯化液；
再用pH7.2-7.8，的10mmol/L PBS(NaCl 0.2-0.6mol/L)平衡阴离子层析柱至紫外、电导平衡，流速3cm/h；
然后将初步纯化液按2倍柱床体积加载到阴离子层析介质中，流速为2cm/h，宿主DNA牢固吸附在阴离子层析介质上，而乙脑病毒蛋白与离子交换介质的结合位点被缓冲液中的离子取代，直接穿透，紫外检测波长280nm，收集吸收峰，当样品全部加载后，继续用10mmol/L PBS(NaCl 0.2-0.6mol/L)缓冲液洗涤离子柱2倍柱床体积，直到紫外吸收值降到基线，收集的穿透峰为最终纯化液。
与现有技术相比，本发明的创新之处在于，在保证疫苗抗原原始结构的前提下，有效去除宿主DNA的含量，突破疫苗制品的质量瓶颈，提高产品质量及合格率。
附图说明
下面结合实施例及图谱详尽说明本发明。
图1是乙脑浓缩液直接进行Sepharose 4Fast Flow凝胶过滤层析的图谱。
图2是乙脑浓缩液进行Sepharose 4Fast Flow凝胶过滤层析后，再进行DEAESepharose Fast Flow阴离子交换层析的图谱。
图3乙脑浓缩液进行Sepharose 4Fast Flow凝胶过滤层析后，再进行QSepharoseFast Flow阴离子交换层析的图谱。
图4乙脑浓缩液进行Sepharose 4Fast Flow凝胶过滤层析后，再进行CaptoQ阴离子交换层析的图谱。
图5乙脑浓缩液直接进行Sepharose 6Fast Flow凝胶过滤层析的图谱。
图6乙脑浓缩液进行Sepharose 6Fast Flow凝胶过滤层析后，再进行QSepharoseFast Flow阴离子交换层析的图谱。
图7乙脑浓缩液进行Sepharose 6Fast Flow凝胶过滤层析后，再进行CaptoQ阴离子交换层析的图谱。
图8是DNA残留量检测图谱。
其中，凝胶过滤层析图谱(图1和图5)横坐标代表体积(mL)，纵坐标代表紫外吸收(mAU)；离子交换层析图谱(图2、图3、图4、图6、图7)横坐标代表时间(min)，纵坐标代表紫外吸收(mAU)。
具体实施方式
以下实施例详细说明了本发明，但不用于限制本发明的范围。本实施例采用常规实验技术，这些均是本技术领域人员所熟悉的，可以按照本实施例使用材料厂商所提供的说明书即可进行。
实施例1：
使用AKTApilot自动层析设备将2000mL乙脑疫苗浓缩液(批号S1)经过 BPG200层析柱，Sepharose 4Fast Flow凝胶过滤层析，紫外检测波长280nm，流速为6cm/h，流动相为pH7.2的10mmol/L PBS(NaCl 0.2mol/L)，收集第一个吸收峰，即乙脑病毒蛋白初步纯化液(批号S2)。再用pH7.2的10mmol/L PBS(NaCl0.2mol/L)平衡DEAE Sepharose Fast Flow层析柱(柱床体积1000mL)至紫外、电导平衡，流速3cm/h。然后将初步纯化液按2倍柱床体积(2000mL)加载到DEAE Sepharose Fast Flow层析介质中，流速为2cm/h，宿主DNA牢固吸附在DEAESepharose Fast Flow层析介质上，而乙脑病毒蛋白与离子交换介质的结合位点被缓冲液中的离子取代，直接穿透，紫外检测波长280nm，收集吸收峰，当样品全部加载后，继续用pH7.2的10mmol/L PBS(NaCl 0.2mol/L)缓冲液洗涤离子柱2000mL(2倍柱床体积)，直到紫外吸收值降到基线，收集的穿透峰为最终纯化液(批号S3)。收集结束后，用1mol/LNaCl冲洗离子柱3000mL(3柱床体积)进行再生处理，流速3cm/h。
实施例2
使用AKTApilot自动层析设备将2000mL乙脑疫苗浓缩液经过BPG200层析柱，Sepharose 4Fast Flow凝胶过滤层析，紫外检测波长280nm，流速为6cm/h，流动相为pH7.4的10mmol/L PBS(NaCl 0.3mol/L)，收集第一个吸收峰，即乙脑病毒蛋白初步纯化液。再用pH7.4的10mmol/L PBS(NaCl 0.3mol/L)平衡QSepharose Fast Flow层析柱至紫外、电导平衡，流速3cm/h。然后将初步纯化液按2倍柱床体积(2000mL)加载到Q Sepharose Fast Flow层析介质中，流速为2cm/h，宿主DNA牢固吸附在Q Sepharose Fast Flow层析介质上，而乙脑病毒蛋白与离子交换介质的结合位点被缓冲液中的离子取代，直接穿透，紫外检测波长280nm，收集吸收峰，当样品全部加载后，继续用pH7.4的10mmol/LPBS(NaCl 0.3mol/L)缓冲液洗涤离子柱2000mL(2倍柱床体积)，直到紫外吸收 值降到基线，收集的穿透峰为最终纯化液(批号S4)。收集结束后，用1mol/L NaCl冲洗离子柱3000mL(3柱床体积)进行再生处理，流速3cm/h。
实施例3
使用AKTApilot自动层析设备将2000mL乙脑疫苗浓缩液经过BPG200层析柱，Sepharose 4Fast Flow凝胶过滤层析，紫外检测波长280nm，流速为6cm/h，流动相为pH7.4的10mmol/L PBS(NaCl 0.4mol/L)，收集第一个吸收峰，即乙脑病毒蛋白初步纯化液。再用pH7.4的10mmol/L PBS(NaCl 0.4mol/L)平衡CaptoQ层析柱至紫外、电导平衡，流速3cm/h。然后将初步纯化液按2倍柱床体积(2000mL)加载到Capto Q层析介质中，流速为2cm/h，宿主DNA牢固吸附在Capto Q层析介质上，而乙脑病毒蛋白与离子交换介质的结合位点被缓冲液中的离子取代，直接穿透，紫外检测波长280nm，收集吸收峰，当样品全部加载后，继续用pH7.4的10mmol/L PBS(NaCl 0.4mol/L)缓冲液洗涤离子柱2000mL(2倍柱床体积)，直到紫外吸收值降到基线，收集的穿透峰为最终纯化液(批号S5)。收集结束后，用1mol/L NaCl冲洗离子柱3000mL(3柱床体积)进行再生处理，流速3cm/h。
实施例4
使用AKTApilot自动层析设备将2000mL乙脑疫苗浓缩液经过BPG200层析柱，Sepharose 6Fast Flow凝胶过滤层析，紫外检测波长280nm，流速为6cm/h，流动相为pH7.6的10mmol/L PBS(NaCl 0.5mol/L)，收集第一个吸收峰，即乙脑病毒蛋白初步纯化液(批号S6)。再用pH7.6的10mmol/L PBS(NaCl 0.5mol/L)平衡Q Sepharose Fast Flow层析柱至紫外、电导平衡，流速3cm/h。然后将初步纯化液按2倍柱床体积(2000mL)加载到Q SepharoseFast Flow层析介质中，流速为2cm/h，宿主DNA牢固吸附在Q Sepharose Fast Flow层析介质上，而 乙脑病毒蛋白与离子交换介质的结合位点被缓冲液中的离子取代，直接穿透，紫外检测波长280nm，收集吸收峰，当样品全部加载后，继续用pH7.6的10mmol/LPBS(NaCl0.5mol/L)缓冲液洗涤离子柱2000mL(2倍柱床体积)，直到紫外吸收值降到基线，收集的穿透峰为最终纯化液(批号S7)。收集结束后，用1mol/L NaCl冲洗离子柱3000mL(3柱床体积)进行再生处理，流速3cm/h。
实施例5
使用AKTApilot自动层析设备将2000mL乙脑疫苗浓缩液经过BPG200层析柱，Sepharose 6Fast Flow凝胶过滤层析，紫外检测波长280nm，流速为6cm/h，流动相为pH7.8的10mmol/L PBS(NaCl 0.6mol/L)，收集第一个吸收峰，即乙脑病毒蛋白初步纯化液。再用pH7.8的10mmol/L PBS(NaCl 0.6mol/L)平衡CaptoQ层析柱至紫外、电导平衡，流速3cm/h。然后将初步纯化液按2倍柱床体积(2000mL)加载到Capto Q层析介质中，流速为2cm/h，宿主DNA牢固吸附在Capto Q层析介质上，而乙脑病毒蛋白与离子交换介质的结合位点被缓冲液中的离子取代，直接穿透，紫外检测波长280nm，收集吸收峰，当样品全部加载后，继续用pH7.8的10mmol/L PBS(NaCl 0.6mol/L)缓冲液洗涤离子柱2000mL(2倍柱床体积)，直到紫外吸收值降到基线，收集的穿透峰为最终纯化液(批号S8)。收集结束后，用1mol/L NaCl冲洗离子柱3000mL(3柱床体积)进行再生处理，流速3cm/h。
将S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8分别进行抗原含量、DNA残留量检测。检测数据见表1，DNA杂交膜见附图4，层析图谱见附图1。
表1：S1～S8抗原含量、DNA残留量检测结果
通过实验结果，分析抗原回收率及DNA残留量，比较进过不同工艺对相同乙脑疫苗浓缩液处理后宿主DNA去除情况，数据如表2：
表2：不同工艺对相同乙脑疫苗浓缩液处理后检测
由表2可知，在乙脑病毒抗原几乎无损失的前提下，浓缩液通过凝胶过滤层析后再进行阴离子交换层析，宿主DNA去除效果明显好于常规工艺的凝胶过滤层析。
综上所述，将乙脑疫苗浓缩液凝胶过滤层析所获得的初步纯化液进行阴离子交换层析，使DNA牢固吸附在离子交换介质上而乙脑病毒蛋白直接穿透，从而达到去除宿主DNA的目的。
上述数据检测方法均符合《中华人民共和国药典》2010版。
Claims (1)
1.一种利用阴离子交换层析去除乙脑疫苗制品中残留ＤＮＡ的方法，其特征在于：
使用AKTApilot自动层析设备将2000mL乙脑疫苗浓缩液经过BPG200层析柱，Sepharose4 Fast Flow凝胶过滤层析，紫外检测波长280nm，流速为6cm/h，流动相为pH7.2，NaCl为0.2mol/L的10mmol/L PBS，收集第一个吸收峰，即乙脑病毒蛋白初步纯化液;
再用pH7.2，NaCl 0.2mol/L的10mmol/L PBS平衡DEAE Sepharose Fast Flow层析柱，柱床体积1000mL，至紫外、电导平衡，流速3cm/h;
然后将初步纯化液按2倍柱床体积，即2000mL，加载到DEAE Sepharose Fast Flow层析介质中，流速为2cm/h，宿主ＤＮＡ牢固吸附在DEAE Sepharose Fast Flow层析介质上，而乙脑病毒蛋白与离子交换介质的结合位点被缓冲液中的离子取代，直接穿透，紫外检测波长280nm，收集吸收峰，当样品全部加载后，继续用pH7.2，NaCl 0.2mol/L的10mmol/L PBS缓冲液洗涤离子柱2000mL，即2倍柱床体积，直到紫外吸收值降到基线，收集的穿透峰为最终纯化液;
收集结束后，用1mol/L NaCl冲洗离子柱3000mL ，即3柱床体积，进行再生处理，流速3cm/h；或
使用AKTApilot自动层析设备将2000mL乙脑疫苗浓缩液经过BPG200层析柱，Sepharose4 Fast Flow凝胶过滤层析，紫外检测波长280nm，流速为6cm/h，流动相为pH7.4，NaCl0.3mol/L的10mmol/L PBS，收集第一个吸收峰，即乙脑病毒蛋白初步纯化液;
再用pH7.4，NaCl 0.3mol/L的10mmol/L PBS平衡Q Sepharose Fast Flow层析柱至紫外、电导平衡，流速3cm/h;
然后将初步纯化液按2倍柱床体积，即2000mL，加载到Q Sepharose Fast Flow层析介质中，流速为2cm/h，宿主ＤＮＡ牢固吸附在Q Sepharose Fast Flow层析介质上，而乙脑病毒蛋白与离子交换介质的结合位点被缓冲液中的离子取代，直接穿透，紫外检测波长280nm，收集吸收峰；
当样品全部加载后，继续用pH7.4，NaCl 0.3mol/L，的10mmol/L PBS缓冲液洗涤离子柱2000mL即2倍柱床体积，直到紫外吸收值降到基线，收集的穿透峰为最终纯化液;
收集结束后，用1mol/L NaCl冲洗离子柱3000mL 即3柱床体积，进行再生处理，流速3cm/h；或
使用AKTApilot自动层析设备将2000mL乙脑疫苗浓缩液经过BPG200层析柱，Sepharose4 Fast Flow凝胶过滤层析，紫外检测波长280nm，流速为6cm/h，流动相为pH7.4，NaCl0.4mol/L的10mmol/L PBS，收集第一个吸收峰，即乙脑病毒蛋白初步纯化液;
再用pH7.4，NaCl 0.4mol/L的10mmol/L PBS平衡Capto Q层析柱至紫外、电导平衡，流速3cm/h;
然后将初步纯化液按2倍柱床体积，即2000mL，加载到Capto Q层析介质中，流速为2cm/h，宿主ＤＮＡ牢固吸附在Capto Q层析介质上，而乙脑病毒蛋白与离子交换介质的结合位点被缓冲液中的离子取代，直接穿透，紫外检测波长280nm，收集吸收峰，当样品全部加载后，继续用pH7.4，NaCl 0.4mol/L的10mmol/L PBS缓冲液洗涤离子柱2000mL，即2倍柱床体积，直到紫外吸收值降到基线，收集的穿透峰为最终纯化液;
收集结束后，用1mol/L NaCl冲洗离子柱3000mL ，即3柱床体积进行再生处理，流速3cm/h；或
使用AKTApilot自动层析设备将2000mL乙脑疫苗浓缩液经过BPG200层析柱，Sepharose6 Fast Flow凝胶过滤层析，紫外检测波长280nm，流速为6cm/h，流动相为pH7.6，NaCl0.4mol/L的10mmol/L PBS，收集第一个吸收峰，即乙脑病毒蛋白初步纯化液;
再用pH7.6，NaCl 0.5mol/L的10mmol/L PBS平衡Q Sepharose Fast Flow层析柱至紫外、电导平衡，流速3cm/h;
然后将初步纯化液按2倍柱床体积，即2000mL，加载到Q Sepharose Fast Flow层析介质中，流速为2cm/h，宿主ＤＮＡ牢固吸附在Q Sepharose Fast Flow层析介质上，而乙脑病毒蛋白与离子交换介质的结合位点被缓冲液中的离子取代，直接穿透，紫外检测波长280nm，收集吸收峰，当样品全部加载后，继续用pH7.6，NaCl 0.5mol/L的10mmol/L PBS缓冲液洗涤离子柱2000mL，即2倍柱床体积，直到紫外吸收值降到基线，收集的穿透峰为最终纯化液;
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再用pH7.8NaCl 0.6mol/L的10mmol/L PBS平衡Capto Q层析柱至紫外、电导平衡，流速3cm/h;
然后将初步纯化液按2倍柱床体积，即2000mL，加载到Capto Q层析介质中，流速为2cm/h，宿主ＤＮＡ牢固吸附在Capto Q层析介质上，而乙脑病毒蛋白与离子交换介质的结合位点被缓冲液中的离子取代，直接穿透，紫外检测波长280nm，收集吸收峰，当样品全部加载后，继续用pH7.8，NaCl 0.6mol/L的10mmol/L PBS缓冲液洗涤离子柱2000mL，即2倍柱床体积，直到紫外吸收值降到基线，收集的穿透峰为最终纯化液;
收集结束后，用1mol/L NaCl冲洗离子柱3000mL，即3柱床体积，进行再生处理，流速3cm/h。
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