CN100543031C - 一种分离纯化汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分离纯化汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的方法，其集成了细胞破碎、层析和膜分离等技术，具体包括：将常规工艺发酵培养得到的汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原培养液破碎至细胞破碎率达到50～90%；离心除去细胞碎片，调节pH值和电导率后进行阴离子交换层析，收集活性回收率大于20%以上的洗脱液；合并洗脱液，再次分别调节电导率和pH值后进行疏水层析；采用超滤膜将样品浓缩；最后使用凝胶过滤柱进行凝胶过滤，得到纯度大于99%以上的汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原。该方法纯化活性回收率高，且纯度可达到99%以上，操作步骤少，操作周期短，成本相对较低，易于放大到工业化规模生产，具有较大的实际应用价值。

Description

一种分离纯化汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的方法

技术领域

本发明属于蛋白质分离纯化领域，具体地说是涉及一种分离纯化汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的方法。

背景技术

乙肝病毒严重威胁人类健康。目前，接种乙肝疫苗仍是防治乙肝病毒蔓延的主要手段。由于存在携带HIV等病毒以及来源有限等问题，来自于乙肝病毒携带者血液中的血源乙肝疫苗——乙肝表面抗原(Hepatitis B Surface Antigen，以下简称HBsAg)——已被世界卫生组织取缔，取而代之的是重组乙肝疫苗。常规用于表达HBsAg的体系主要有哺乳动物细胞、酵母细胞和痘苗系统等。其中，酵母细胞由于具有远高于动物细胞的表达量而倍受生产厂家的青睐，由酵母细胞表达的乙肝疫苗占据市场主导地位。常用于表达乙肝疫苗的酵母细胞主要有酿酒酵母细胞(Saccharomy cescerevisiae)、毕赤酵母细胞(Pichia pastorius)和汉逊酵母细胞(Hansenula polymorpha)。各种酵母细胞表达的HBsAg虽均属胞内产物，在分离纯化前均需首先进行细胞破碎，但不同酵母细胞表达的乙肝表面抗原在物理、化学和免疫学性质上有所不同，与之相适应，其纯化工艺有所不同，除此之外，生产乙肝疫苗的主要公司在HBsAg的纯化工艺和生产成本上各具特色。

与酿酒酵母和毕赤酵母相比，汉逊酵母用于表达HBsAg表达量较高。一般来说，酿酒酵母表达量最低，毕赤酵母的表达量也不到100mg/L，而采用汉逊酵母表达，其表达量可达到200～700mg/L。1995年，阿根廷批准Laboratorio Pablo Cassara(LPC)生产商标名为

的汉逊酵母重组HBsAg，两年后，WHO批准韩国Green Cross(KGCC)公司生产商标名为的汉逊酵母重组HBsAg。

现有的汉逊酵母表达的HBsAg的分离纯化过程主要采取PEG沉淀、硅藻土吸附、离子交换层析、超速离心和凝胶过滤层析工艺。其中，特异性吸附是最有效的去除宿主细胞蛋白的方法，该过程通过控制pH和温度变化来实现吸附与解吸，使单步收率达到80％，同时得到10左右的纯化倍数。离子交换层析和超滤用于进一步缩小体积和去除大部分宿主来源的脂类。CsCl超速离心用于最后除去宿主来源的杂质，而后续的凝胶过滤则用于除去CsCl。但上述工艺均存在一定问题。例如，吸附载体寿命有限，操作过程极其繁琐，回收率较低。而超速离心方法利用目的蛋白与杂质在密度、表面电荷和尺寸大小上的差异，与层析工艺原理截然不同，纯化过程中蛋白质受到的影响较小，基本不涉及蛋白质亚基解聚，活性回收率相对较高，性状好且较稳定，但其缺点是处理量较小，纯化周期较长，耗费人力物力较多，制约了生产规模，且在纯度和DNA残留量上不如层析工艺；而采用层析技术，工艺步骤相对较多，所利用的疏水层析或离子交换层析过程因缺乏对多聚亚基目的蛋白颗粒的保护措施，在吸附-解吸过程中均会对蛋白质的结构、状态有影响，可能在一定程度上造成亚基解聚而改变蛋白的三、四级结构，使纯化的蛋白不稳定，易于出现蛋白质变性、聚合，最终导致活性回收率很低。因此，上述纯化工艺普遍存在步骤繁多、周期长、活性回收率偏低(一般小于20％)等不利之处。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的汉逊酵母表达的HBsAg的分离纯化过程中存在的步骤繁多、周期长、活性回收率偏低等缺陷，从而提供一种工艺简单、周期短、成本低、纯度高、活性回收率较高的分离纯化汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

本发明提供的分离纯化汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的方法，如图1所示，是一种集成细胞破碎、层析和膜分离等技术的方法，具体包括如下的步骤：

1)细胞破碎

取常规工艺发酵培养得到的汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原培养液，通过离心并洗涤用于表达乙肝表面抗原的汉逊酵母细胞，然后置于高压匀浆机或球磨机中，加入占待破碎液重量比0.05～0.3％的Triton X-100及终浓度为0.1～10mM的酶抑制剂(如PMSF)，反复破碎1～6次，直至细胞破碎率达到50～90％；

2)离子交换层析

将破碎后细胞以5000～20000g的转速离心除去细胞碎片，用1.0M NaOH和1.0MHCl调节pH值至5.5～8.5，且电导率小于5.0～20mS/cm，然后进行阴离子交换层析；

所述的阴离子交换层析介质的配基为二乙胺基乙基纤维素(DEAE)或季铵盐(Q)，洗脱液为含0.1～1.0M无机盐(硫酸铵、氯化钠或硫酸钠，下同)的10～50mM缓冲液(pH 5.5～8.5)，流速为1.0～20ml/(h·ml gel)，按照常规的平衡、进料、淋洗、洗脱、再生顺序完成离子交换层析的全过程，ELISA法监测，收集含汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原活性回收率大于20％以上的紫外吸收峰的洗脱液；

3)疏水层析

合并阴离子交换层析得到的活性汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原组分，加入无机盐(硫酸铵、硫酸钠或氯化钠)直至其电导率为50～200ms/cm，然后用1.0M NaOH和1.0M HCl调节pH至5.5～8.5，然后进行疏水层析；

所述的疏水层析的介质的配基为丁基(Butyl)、苯基(Phenyl)或辛基(Octyl)，依次使用缓冲液A(含5～20wt％硫酸铵的10～50mM缓冲液，pH 5.5～8.5)平衡、进料、淋洗，再使用100％缓冲液B(10～50mM缓冲液，pH 5.5～8.5)梯度洗脱，最后使用0.5～1.0M NaOH或20～40wt％异丙醇再生，全过程流速控制在1.0～20ml/(h·ml gel)，ELISA法监测，收集含汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原活性回收率大于20％以上的紫外吸收峰的洗脱液；

4)超滤浓缩

对疏水层析所得组分，采用截留分子量为100～500KD的超滤膜将样品一次或多次重复浓缩，直至样品中蛋白质浓度为0.1～1.0mg/ml，超滤时流速为10～100cm/s，压力在0.3MPa以下；

5)凝胶过滤

将步骤4)得到的浓缩液使用凝胶过滤柱，按照常规的平衡(1～2柱体积)、进料、洗脱、再平衡进行凝胶过滤，最后得到纯度大于99％以上的汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原；

所述的凝胶过滤柱为Sepharose 4FF或6FF，进料体积为凝胶柱体积的0.5～5％，流动相为含0.05～0.5M硫酸铵、硫酸钠或氯化钠的pH 5.5～7.5的缓冲液，全过程流速保持恒定，为0.05～0.5ml/(h·ml gel)；

上述方法各步骤均在2～30℃温度范围内进行。

本发明提供的分离纯化汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的方法分别在实验室规模、500人份小试和5000人份中试规模进行了试验。从细胞破碎开始，样品经离心预处理后依次经过阴离子交换层析、疏水层析、超滤和凝胶过滤。在纯化过程中，离子交换层析可除去85％以上的宿主蛋白和部分脂类物质。疏水层析可进一步去除90％以上的杂蛋白和部分脂类物质。凝胶过滤层析可进一步除去残留的绝大部分杂质，使最终样品纯度大于99％以上，达到电泳纯和色谱纯。与文献记录的现有技术相比较，本发明具有以下特点：

1)纯化活性回收率高，平均可达到30％以上(重复三次实验)，且纯度可达到99％以上；

2)纯化工艺操作步骤少，步骤间衔接紧凑，操作周期短；

3)避免使用超速离心机等价格高昂的设备，成本相对较低；

4)生产工艺简单，可使用自制层析介质，生产成本低；

5)全过程采用层析和膜分离技术相结合，易于放大到工业化规模生产；

综上所述，本发明提供了一种简便、快速、易于放大的分离纯化汉逊酵母表达的乙肝表面抗原的方法，具有较大的实际应用价值。

附图说明

图1为本发明提供的分离纯化汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的流程图；

图2为实施例4中离子交换层析图谱；

图3为实施例4中疏水层析HIC图谱；

图4为实施例4中凝胶过滤GF图谱；

图5为实施例1和4的纯化产品的SDS-PAGE图谱；

图6为实施例1和4的纯化产品的HPSEC图谱。

具体实施方式

实施例1、实验室规模分离纯化实验1

取200ml常规工艺发酵培养得到的汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原培养上清液，先通过离心并洗涤用于表达乙肝表面抗原的汉逊酵母细胞，然后置于高压匀浆机中，加入占待破碎液重量比0.05％Triton X-100和1mM的PMSF，反复破碎6次，细胞破碎率达到90％。

将破碎后细胞在20000g的转速下离心20min，除去细胞碎片，将上清液用1.0MNaOH和1.0M HCl调整pH值至5.5，且电导率小于5.0mS/cm，然后进料到Q SepharoseFF离子交换层析柱中(GE Healthcare，30cm×15cm I.D.)，柱体积(CV)为2000ml，流速为1.0ml/(h·ml gel)。层析过程依次进行缓冲液I(20mM磷酸盐缓冲液(PB)，pH 5.5)平衡、进料、缓冲液I再平衡、0～100％缓冲液II(1.0M NaCl+缓冲液I)连续梯度洗脱、缓冲液I再生等步骤，收集各洗脱峰组分，采用ELISA法测定蛋白浓度和目的蛋白抗原活性，收集含汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原活性回收率大于20％以上的紫外吸收峰的洗脱液。

合并上述阴离子交换层析得到的活性组分，依次用硫酸铵和NaOH溶液分别调整电导率和pH至50ms/cm和5.5后，进料到预先用加有硫酸铵到电导率为50ms/cm的PB缓冲液(缓冲液III，pH 5.5)平衡的Octyl QZT疏水层析柱(国家生化工程中心，北京，40cm×5.5cm I.D.)，柱体积1000ml，流速为1.0ml/(h·ml gel)。进料后经缓冲液III再平衡后用20mM PB(pH5.5)进行梯度洗脱，收集含汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原活性回收率大于20％以上的紫外吸收峰的洗脱液。

对疏水层析所得活性峰样品，经截留分子量为100KD的中空纤维膜超滤膜(GEHealthercare)一次超滤浓缩到10ml左右，样品中蛋白质浓度为0.1mg/ml；超滤时中空纤维膜流速为10cm/s，压力控制在0.3MPa以下。

取10ml超滤浓缩后样品，进料到Sepharose 4FF凝胶过滤柱(GE Healthcare，100cm×5.0cm，I.D.)，柱体积为2000ml，流速保持为0.5ml/(h·ml gel)，流动相为含0.10M硫酸钠的20mM PB，pH 5.5，分别检测洗脱峰组分的蛋白质含量和活性，最后得到纯度大于99％以上的汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原，所得活性峰组分相对于细胞破碎上清液的活性回收率为32％。

实施例2、实验室规模分离纯化实验2

取200ml常规工艺发酵培养得到的汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原培养上清液，先通过离心并洗涤用于表达乙肝表面抗原的汉逊酵母细胞，然后置于球磨机上，加入占待破碎液重量比0.3％Triton X-100和0.1mM的PMSF，反复破碎2次，细胞破碎率达到50％。

将破碎后细胞在6000g的转速下离心30min，除去细胞碎片，将上清液用1.0MNaOH和1.0M HCl调整pH值至8.5，且电导率小于20mS/cm，然后进料到Q SepharoseFF离子交换层析柱中(GE Healthcare，30cm×15cm I.D.)，柱体积(CV)为2000ml，流速为20ml/(h·ml gel)。层析过程依次进行缓冲液I(20mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.5)平衡、进料、缓冲液I再平衡、0～100％缓冲液II(1.0M硫酸钠+缓冲液I)连续梯度洗脱、缓冲液I再生等步骤，收集各洗脱峰组分，采用ELISA法测定蛋白浓度和目的蛋白抗原活性，收集含汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原活性回收率大于20％以上的紫外吸收峰的洗脱液。

合并上述阴离子交换层析得到的活性组分，依次用NaCl和NaOH溶液分别调整电导率和pH至200ms/cm和5.5后，进料到预先用加NaCl到电导率为200ms/cm的PB缓冲液(缓冲液III)平衡的Butyl-S Sepharose 6 FF疏水层析柱(GE Healthcare，40cm×5.5cm I.D.)，柱体积1000ml，流速为20ml/(h·ml gel)。进料后经缓冲液C再平衡后用20mM PB(pH5.5)进行梯度洗脱，收集含汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原活性回收率大于20％以上的紫外吸收峰的洗脱液。

对疏水层析所得活性峰样品，经截留分子量为300KD的平板式超滤膜(Millipore，USA)分三次超滤浓缩到20ml左右，样品中蛋白质浓度为1.0mg/ml；超滤时中空纤维膜流速为50cm/s，压力控制在0.2MPa以下。

取10ml超滤浓缩后样品，进料到Sepharose 6 FF凝胶过滤柱(GE Healthcare，100cm×5.0cm，I.D.)，柱体积为2000ml，流速保持为0.05ml/(h·ml gel)，流动相为含0.2MNaCl的20mM PB，pH 7.0，分别检测洗脱峰组分的蛋白质含量和活性，最后得到纯度大于99％以上的汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原，所得活性峰组分相对于细胞破碎上清液的活性回收率为35％。

实施例3、实验室规模分离纯化实验3

取50ml常规工艺发酵培养得到的汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原培养上清液，先通过离心并洗涤用于表达乙肝表面抗原的汉逊酵母细胞，然后置于高压匀浆机上，加入占待破碎液重量比0.1％Triton X-100和10mM的PMSF，反复破碎3次，细胞破碎率达到70％。

将破碎后细胞在10000g的转速下离心20min，除去细胞碎片，将上清液用1.0MNaOH和1.0M HCl调整pH值至7.0，且电导率小于10mS/cm，然后进料到DEAE QZTFF离子交换层析柱中(国家生化工程中心，30cm×5.5cm I.D.)，柱体积(CV)为500ml，流速为10ml/(h·ml gel)。层析过程依次进行缓冲液I(20mM Tris-HCl，pH 7.0)平衡、进料、缓冲液A再平衡、0％，20％，40％，100％缓冲液II(1.0M NaCl+缓冲液I)阶跃梯度洗脱、缓冲液I再生等步骤，收集各洗脱峰组分，采用ELISA法测定蛋白浓度和目的蛋白抗原活性，收集含汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原活性回收率大于20％以上的紫外吸收峰的洗脱液。

合并上述阴离子交换层析得到的活性组分，依次用硫酸铵和NaOH溶液分别调整电导率和pH至96ms/cm和7.0后，进料到预先用加硫酸铵到电导率为96ms/cm的Tris-HCl缓冲液(缓冲液III)平衡的Butyl-S QZT FF疏水层析柱(国家生化工程中心，北京，20cm×5.5cm I.D.)，柱体积200ml，流速为20ml/(h·ml gel)。进料后经缓冲液C再平衡后用20mM Tris-HCl(pH7.0)进行梯度洗脱，收集含汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原活性回收率大于20％以上的紫外吸收峰的洗脱液。

对疏水层析所得活性峰样品，经截留分子量为500KD的中空纤维膜超滤膜(Pall公司，USA)超滤浓缩到10ml左右，样品中蛋白质浓度为0.5mg/ml；超滤时中空纤维膜流速为10cm/s，压力控制在0.1MPa以下。

取10ml超滤浓缩后样品，进料到Sepharose 4FF凝胶过滤柱(国家生化工程中心，北京，100cm×2.6cm，I.D.)，柱体积为400ml，流速保持为0.5ml/(h·mlgel)，流动相为含0.3M硫酸钠的20mM Tris-HCl，pH 7.5，分别检测洗脱峰组分的蛋白质含量和活性，最后得到纯度大于99％以上的汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原，所得活性峰组分相对于细胞破碎上清液的活性回收率为44％。

实施例4、5000人份中试实验

4000ml实施例1中的细胞破碎液离心后的样品，用50mM Tris-HCl，pH8.5缓冲液(缓冲液A)稀释到电导率小于20ms/cm，并用1.0M NaOH和1.0M HCl调节pH到8.5后，进料到用缓冲液A平衡过的Q QZT FF离子交换柱(国家生化工程中心，100cm×30cm I.D，CV＝30L)，流速5ml/(h·ml gel)，进料完成后依次经缓冲液A再平衡、15％、50％和100％缓冲液B(1.0M NaCl+缓冲液A)洗脱，洗脱图谱如图2所示，采用ELISA法测定蛋白浓度和目的蛋白抗原活性，收集含汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原活性回收率大于20％以上的紫外吸收峰的洗脱液10000ml，计算活性回收率和纯化倍数。

取离子交换层析所得活性峰组分，加入饱和硫酸铵溶液至其电导率接近于缓冲液C(含15％硫酸铵的20mM PB，电导率在120ms/cm左右)，再用0.1M NaOH调节其pH至8.5，进料到预先用缓冲液C平衡后的HIC柱(Phenyl QZT FF，国家生化工程中心，北京，50cm×15cm I.D，CV＝5.0L)，流速10ml/(h·ml gel)。进料完成后按照再平衡、缓冲液D(10mM Tris-HCl，pH 8.5)、1.0M NaOH洗脱。收集缓冲液D洗脱峰组分，洗脱图谱如图3所示，收集含汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原活性回收率大于20％以上的紫外吸收峰的洗脱液5000ml。

将疏水层析HIC中P1峰(如图3所示)的样品，用截留分子量为300KD超滤膜(GE Healthcare)进行超滤，将样品体积浓缩到约500ml，样品中蛋白质浓度为0.5mg/ml；超滤时中空纤维膜流速为100cm/s，压力控制在0.3MPa以下。由活性和蛋白浓度测定结果可知，该浓缩步骤没有活性损失。

对于超滤浓缩所得样品，用凝胶过滤柱(Sepharose 4 FF，GE Healthcare，100cm×11.3cm，I.D.，CV＝10.2L)进行纯化实验，流动相为含0.05M NaCl的50mM PB溶液，洗脱图谱如图4所示，最后得到纯度大于99％以上的汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原，所得活性峰组分相对于细胞破碎上清液的活性回收率为29％。

该中试实验中，包括离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤和超滤浓缩在内的工艺的总操作时间小于40小时，整个工艺的最终回收率为31.5％，大于30％。

实施例5、SDS-PAGE电泳分析

将实施例1和4中得到的汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原进行SDS—PAGE电泳分析。将凝胶过滤所得最终样品浓缩，然后还原型SDS-PAGE分析其纯度，如图5所示，其中，第一泳道为低分子量Marker，第二、三泳道分别为实验室规模的实施例1和中试实验的实施例4所得的样品。由此结果可见，实施例1和4得到的样品均只含有一条主带，其分子量为24KD左右，为HBsAg的S蛋白单体。此结果说明，经本发明提供的方法纯化的汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原可得到电泳纯样品，纯度大于99％。

实施例6、高效分子排阻色谱(HPSEC)分析

将实施例1和4中得到的汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原进行高效分子排阻色谱(HPSEC)分析。将凝胶过滤所得最终样品分别浓缩20和50倍后，与样品处理液(0.1MDTT与1:50Tween 80等体积比混合液)等量混合，进行HPSEC分析(TSK G5000柱，300mm×7.8mm)，实验结果如图6所示，图6-A和图6-B分别为实验室规模的实施例1和中试实验的实施例4所得的样品。由图6可知，2种样品均不含任何杂蛋白，即经本发明提供的方法纯化的汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原不含杂蛋白，样品达到色谱纯，纯度大于99％以上。

实施例7、样品蛋白含量测定

对三批中试试验中所得GF样品采用Lowry法进行蛋白浓度测定实验，结果表明可知，由每升细胞破碎上清液经上述分离纯化工艺平均可得到42mg目的蛋白抗原HBsAg，每批试验平均可得到168mg目的蛋白。

Claims (9)

1、一种分离纯化汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的方法，其包括如下的步骤：

1)细胞破碎

取常规工艺发酵培养得到的汉逊酵母(Hansenula polymorpha)表达的重组乙肝表面抗原培养液，通过离心并洗涤用于表达乙肝表面抗原的汉逊酵母细胞，然后置于高压匀浆机或球磨机中，加入占待破碎液重量比0.05～0.3％的Triton X-100及终浓度为0.1～10mM的酶抑制剂，反复破碎1～6次，直至细胞破碎率达到50～90％；

2)离子交换层析

将破碎后细胞以5000～20000g的转速离心除去细胞碎片，用1.0MNaOH和1.0MHC1调节pH值至5.5～8.5，且电导率小于5.0～20mS/cm，然后进行阴离子交换层析，收集含汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原活性回收率大于20％以上的紫外吸收峰的洗脱液；

3)疏水层析

合并阴离子交换层析得到的活性汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原组分，加入无机盐直至其电导率为50～200ms/cm，然后用1.0M NaOH和1.0M HCl调节pH至5.5～8.5，然后进行疏水层析，收集含汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原活性回收率大于20％以上的紫外吸收峰的洗脱液；

4)超滤浓缩

对疏水层析所得组分，采用截留分子量为100～500KD的超滤膜将样品一次或多次重复浓缩，直至样品中蛋白质浓度为0.1～1.0mg/ml，超滤时流速为20～100cm/s，压力在0.3Mpa以下；

5)凝胶过滤

将步骤4)得到的浓缩液使用凝胶过滤柱进行凝胶过滤，最后得到纯度大于99％以上的汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原；

上述方法各步骤均在2～30℃温度范围内进行。

2、如权利要求1所述的分离纯化汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的方法，其特征在于：所述步骤2)的阴离子交换层析介质的配基为二乙胺基乙基纤维素或季铵盐。

3、如权利要求1所述的分离纯化汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的方法，其特征在于：所述步骤2)的阴离子交换层析的洗脱液为含0.1～1.0M无机盐的10～50mM缓冲液。

4、如权利要求3所述的分离纯化汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的方法，其特征在于：所述的洗脱液中的无机盐为硫酸铵、氯化钠或硫酸钠。

5、如权利要求1所述的分离纯化汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的方法，其特征在于：所述步骤3)的无机盐为硫酸铵、硫酸钠或氯化钠。

6、如权利要求1所述的分离纯化汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的方法，其特征在于：所述步骤3)的疏水层析的介质的配基为丁基、苯基或辛基。

7、如权利要求1所述的分离纯化汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的方法，其特征在于：所述步骤3)的疏水层析时，依次使用含5～20wt％硫酸铵、pH5.5～8.5、10～50mM缓冲液平衡、进料、淋洗，再使用pH5.5～8.5、10～50mM缓冲液梯度洗脱，最后使用0.5～1.0M NaOH或20～40wt％异丙醇再生。

8、如权利要求1所述的分离纯化汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的方法，其特征在于：所述步骤5)中，凝胶过滤柱为Sepharose 4FF或6FF，进料体积为凝胶柱体积的0.5～5％。

9、如权利要求1所述的分离纯化汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的方法，其特征在于：所述步骤5)中，流动相为含0.05～0.5M硫酸铵、硫酸钠或氯化钠的pH5.5～7.5的缓冲液。

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