CN113388609B - 大型质粒dna的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种大型质粒DNA的纯化方法,包括以下步骤:S1:向含大型质粒DNA的上清液中加入磷酸盐至浓度为10~50mM,并调节溶液电导率为82~89mS/cm(25℃),得到上样溶液;大型质粒DNA是指大于20KB的质粒DNA;S2:将上样溶液上样至Poros HQ阴离子层析进行洗脱,收集洗脱液。本发明的方法能够有效而稳定地将大型质粒DNA从大肠杆菌裂解中和后的上清液中纯化出来,可用于大规模GMP生产。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域中,特别是涉及一种用于大型质粒DNA(大于20KB)的纯化方法,通过添加特定浓度范围的磷酸盐,显著提高大型质粒DNA与杂质RNA间的分辨度,从而提高此工艺方法的纯化效果和工艺稳健性。
背景技术
大型质粒DNA(大于20KB)的生产流程通常为对含大型质粒DNA的细菌进行碱液裂解、酸性中和、对中和后的悬浮混合物进行过滤,得到含大型质粒DNA的滤液(或称为上清液)。通过碱裂解法从大肠杆菌中分离质粒DNA时,得到的上清液中剩下的主要多核苷酸是质粒DNA和RNA。这两者均为强酸性(pKa~2),因此,在生理pH下带负电。本领域需要一种高效的AEX阴离子色谱法用于纯化该上清液,以分离质粒DNA和RNA,从而得到高纯度的质粒DNA。
色谱层析法(Chromatography)用于质粒DNA的纯化自90年代起就有较大的发展,包括尺寸排阻式、反相式、二氧化硅介质。这几种方法涉及到使用溶剂(乙醇、异丙醇),有毒化学品(氯化铯、溴化乙锭、苯酚、氯仿)等不推荐的化学物质,去除关键杂质如染色体DNA、RNA、蛋白质和内毒素的效果通常不足,或者主要适合生产少量质粒DNA供实验室使用, 不适合用于治疗性药物相关的质粒DNA的大规模生产。而阴离子色谱法,基于其疏水作用和羟基磷灰石介质,不涉及溶剂的使用,适合于大规模生产。
但是,基于DNA和RNA在分子一级结构上的高度相似性,对DNA与RNA的分辨,主要在于DNA是双链结构,其疏水性的碱基配对向内,而亲水性的磷酸基向外,与RNA的单链结构相比,DNA分子由于磷酸基在外围,其整体的亲水性和负电性略高于RNA分子。到2000年初,Alex Eon-Duval等对阴离子色谱法进行了系统的研究,发现有好几种阴离子层析的介质(Fractogel EMD DEAE, Q Sepharose FF, POROS 50HQ and Ceramic Hyper D),可以将质粒DNA与RNA分离。需要指出的是,在这个研究中,使用了一个5.9KB的质粒DNA作为代表性质粒分子。对较大的质粒DNA,如10KB以上的,没有进行研究。而大分子DNA,尤其是> 5 KB,具有高负电性,更容易受到机械剪切作用,并且溶液中的流体动力学和流动性较慢,因此使其最佳分离非常成问题。同时,这些质粒的大尺寸使其在分离和纯化过程中,与搅拌相关的流体动力剪切应力,如离心,泵送,过滤,喷雾干燥,小瓶填充和雾化都足以降解DNA,导致生物活性的降低。
在2013,Ongkudon等报告了一种新型圆锥形整体柱 (conical monolithcolumn),可一步分离25 KB的质粒DNA,并消除壁通道(wall channeling)的有效方法。其优点是柱体几乎没有阻力,单片色谱柱的孔径大,易于吸附大分子DNA,实现快速分离,较低的操作压力以及最小的超螺旋DNA的损失。 缺点是这些整体式色谱柱通常由易收缩的聚合物制成,整体树脂与树脂之间会形成缝隙或“壁通道”。这个问题,在扩大规模生产时尤为明显,不适合于大规模生产。
在2017年和2021, Franco-Medrano和Moreir分别报道了使用AEX阴离子膜对DNA纳米疫苗 (nanovaccine) 和慢病毒质粒载体(lenti vector)两种较大的质粒DNA进行纯化,其效果虽好,但AEX阴离子膜价格较高,再生重复使用的效果不好,滤膜的规格尺寸有限,也不适合于大规模的生产。
总的来说,使用常规AEX阴离子色谱介质,对大于22KB的质粒DNA,从裂解液中直接将质粒DNA提纯出来的方法,还不多见。另一方面,磷酸盐因为其负电性,能够与带正电的阴离子交换树脂发生相互作用, 一般不建议用于阴离子交换色谱法。综上所述,涉及到使用特定浓度的磷酸盐,结合常规AEX阴离子色谱介质,对质粒DNA与杂质RNA进行分离纯化的方法,尚未见报导。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于,提供一种大型质粒DNA的纯化方法,该方法是基于常规的阴离子交换色谱法,有效而稳定地将大型质粒DNA从大肠杆菌裂解中和后的上清液中纯化出来,可用于大规模GMP生产。
为解决上述技术问题,本发明提高以下技术方案:
一种大型质粒DNA的纯化方法,包括以下步骤:
S1:向含大型质粒DNA的上清液中加入磷酸盐至浓度为10~50 mM,并调节溶液电导率为82~89 mS/cm(25℃),得到上样溶液;所述大型质粒DNA是指大于20KB的质粒DNA;
S2:将所述上样溶液上样至Poros HQ阴离子层析进行洗脱,收集洗脱液。
具体地,所述含大型质粒DNA的上清液通过以下方法得到:对含大型质粒DNA的细菌进行碱液裂解、酸性中和、对中和后的悬浮混合物进行过滤,即得。
具体地,所述含大型质粒DNA的上清液的pH值5,电导率为60 – 65mS/cm,且不含有任何磷酸根的盐类。
优选地,所述含大型质粒DNA的细菌悬浮于悬浮缓冲液中。更优选地,所述悬浮缓冲液为含50mM Tris,10mM EDTA,pH 7.4的溶液。
优选地,所述碱液裂解使用的裂解缓冲液为含1.0% SDS,0.2M NaOH的溶液。
优选地,所述酸性中和使用的中和缓冲液为含3.0M乙酸钾,2.0M乙酸的溶液。
具体地,所述S1中,使用NaCl溶液调节溶液电导率。优选地,所述NaCl溶液浓度为5M。
具体地,所述上样溶液为HPO42--H2PO4-缓冲盐体系。优选地,所述上样溶液的pH值为7.0。
具体地,所述磷酸盐为钠盐和/或钾盐(磷酸钠和/或磷酸钾)。
具体地,所述S2包括上样、淋洗、洗脱和清洗再生。其中,上样、淋洗、洗脱和清洗再生步骤均按照本领域的常规工艺方法来进行。
优选地,所述淋洗步骤使用的淋洗液为50mM磷酸盐,0.78M NaCl, pH 7的缓冲液。
优选地,所述洗脱步骤使用的洗脱液为50 mM磷酸盐,0.78 M NaCl,pH 7.0的缓冲液。
优选地,所述清洗再生步骤使用的再生液为1M NaCl,0.2M NaOH的溶液。
现有常规的经碱液裂解、酸液中和然后过滤得到的质粒上清液中,通常是由一定量的大肠杆菌的菌体与悬浮缓冲液(50mM Tris,10mM EDTA,pH 7.4),裂解缓冲液(1.0%SDS, 0.2N NaOH)和中和缓冲液(3.0M乙酸钾,2.0M乙酸)以1:1:1的比例混合而成,其酸碱度在pH 5左右,电导率通常在60–65mS/cm,不含有任何磷酸根的盐类。在这种上清液中,除了残留的宿主蛋白外,主要是要表达的质粒DNA、杂质RNA和少量的宿主染色体DNA。
本发明的方法是基于常规的AEX阴离子色谱纯化方法,使用Poros HQ50阴离子色谱介质装柱,对经过碱液裂解、酸液中和然后过滤得到的大型质粒(> 20KB)上清液,添加特定浓度范围的磷酸盐(约50 mM)并调节其电导率至一个特定的范围,采用常规的上样和洗脱的工艺步骤进行纯化,可以显著提高Poros HQ50对质粒DNA与杂质RNA的分辨性能,提高AEX阴离子工艺方法纯化质粒DNA的产率和纯度。同时,Poros HQ50这种阴离子色谱介质和磷酸盐,都是本领域常规原料且都有GMP级别的原料供应商,是可以用于大规模GMP生产的,对生产成本的影响是非常小的,生产成本低。
本发明发现向大型质粒DNA的上清液添加磷酸钠,并控制其电导率在适当范围,能提高AEX阴离子色谱纯化工艺的鲁棒性,降低AEX阴离子色谱洗脱液中含有大量RNA的风险。鲁棒性(Robust)是指系统或方法在一定的参数摄动下,维持其它某些性能的特性,分为稳定鲁棒性和性能鲁棒性。本发明提高了阴离子交换层析工艺纯化质粒DNA的效果,能够稳定、有效地将大型质粒DNA从上清液中分离纯化出来,提高了工艺稳定性。
附图说明
图1为实施例一中不含磷酸根离子的大型质粒DNA上清液的AEX层析结果图。
图2为实施例一中图1中AEX层析各组分的琼脂凝胶电泳检测图。
图3为实施例一中含磷酸根离子的三种不同电导率的大型质粒DNA上清液的连续AEX层析结果图。
图4为实施例一中图3中AEX层析各组分的琼脂凝胶电泳检测图。
图5为实施例二中四种不同的磷酸根离子浓度的大型质粒DNA上清液的AEX层析结果图。
图6为实施例二中图5中AEX层析各组分的琼脂凝胶电泳检测图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述,显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例一:不含和含50 mM磷酸根离子的裂解物的初步数据:
材料与方法:
取进行裂解并过滤的含大型质粒DNA(22KB)的上清液,保存于2-8℃。
取样,通过添加氯化钠,将电导率调节到23℃下86~87 mS/cm(编号046-25-3),此时的样品不含磷酸盐;
取样,利用5N NaOH调节裂解液至pH6.0(约10%添加量),随后添加500mM磷酸钠盐至终浓度50mM,接着用5N NaCl调节至电导91mS/cm(25℃)(编号为046-32-1);
取样(编号为046-32-1),添加1.5ml水到28ml 32-1料液中至电导89mS/cm(编号为046-32-2),添加0.5ml水到9ml料液中至电导86mS/cm(编号为046-32-3)。
以上配置得到的样品在相同的条件下进行洗脱,具体的洗脱条件包括:
平衡/淋洗/洗脱缓冲液:磷酸盐缓冲液;
层析柱:Poros 50 HQ 2ml;
流速:1-1.5ml/min;
收集:1.5ml 每管;
DNA电泳胶:0.8%琼脂糖凝胶,120V,180mA,30min。4ul上样液+20ul样品,每泳道上样20ul;
层析方法:
保留时间:2分钟;
裂解液:含50 mM 磷酸盐(NaH2PO4- Na2HPO4体系),pH 7,电导率25℃时为82-89mS/cm;
树脂加载量:(2毫克/毫升)
平衡/ 淋洗:50 mM磷酸盐(NaH2PO4- Na2HPO4体系)、0.78 M NaCl,pH 7.0;
洗脱:10 CV的1.5 M NaCl,50 mM磷酸盐(NaH2PO4- Na2HPO4体系),pH 7.0;
再生:5CV 1M NaCl,0.2M NaOH;
1 25°C下的电导率,2 22-23°C下的电导率。
试验结果:
1:不含磷酸根离子的裂解物的初步数据
单独对编号046-25-3样品进行洗脱,洗脱结果如图1所示。含大型质粒DNA的上清液直接上样后,使用含50mM磷酸钠,0.78M氯化钠,pH 7的缓冲液对层析柱淋洗时,图1中出现了一个显著的UV260的淋洗峰。
将上述试验得到的流穿液、淋洗峰、质粒DNA的洗脱峰和再生峰, 与上清液一起在0.8%的琼脂胶上进行测定,其结果如图2所示。图2中显示,通过添加氯化钠调节上清液达到86~87 mS/cm电导率的条件下,上清液中的部分RNA,通过AEX层析介质上样时,不能与AEX介质结合,从而与质粒DNA分离开。另一部分RNA通过微弱的结合力,被AEX平衡液(50mM磷酸钠,0.78M氯化钠,pH 7)淋洗下来,见图2的淋洗峰。然后,使用1.5-2 M的氯化钠溶液洗脱下来的成分,以超螺旋态的22KB质粒DNA为主,见图2的洗脱峰。最后,使用0.1M氯化钠、0.1M氢氧化钠对 AEX层析介质再生时,发现再生峰仍然含有大量杂质RNA,见图2的再生峰。这种结果,说明使用氯化钠来调节电导率的方式,虽然有效果,但工艺过程的稳定性是不够的,杂质RNA与AEX层析介质的结合不是完全受控于电导率因素。
与此同时,我们注意到,AEX平衡液(50mM磷酸钠,0.78M氯化钠,pH 7)可以将结合力微弱的RNA从AEX层析介质上,特异性地冲洗下来,其化学成分只有磷酸钠和氯化钠。通过对质粒上清液成分的分析,发现其中不含有磷酸钠。基于这个不同点,我们推测来自平衡液的磷酸根可能干扰了杂质RNA与AEX层析介质的结合过程。这一点,与前述DNA和RNA均含磷酸根,磷酸根能够与AEX层析介质上的正电性基团结合是一致的。
2.含有50 mM磷酸根离子的裂解物的初步数据
将编号046-32-1、046-32-2、046-32-3三个样品进行连续洗脱。在三个不同的电导率(91, 89, 86 mS/cm)的条件下,检测AEX层析纯化的结果,如图3所示。图3中,在三次连续的纯化试验中,添加50mM磷酸钠后,AEX层析纯化的色谱发生了显著的变化,其中最明显的不同点,就是使用AEX平衡液(50mM磷酸钠,0.78M氯化钠, pH 7)对AEX层析柱淋洗时,没有UV260的吸收峰。在电导率达到91 mS/cm时,对质粒DNA洗脱时,UV260的吸收峰很小(标注NoElution),而再生峰(标注Regen)很大;当电导率在87 mS/cm附近时(包括89 mS/cm和86mS/cm两种条件下),都有明显的洗脱峰(标注Elution),且再生峰明显降低(标注SmallRegen)。
图4是对这三次连续的纯化试验使用琼脂胶的方法对图3所对应得到的流穿液、洗脱液、再生液的迁移条带的位置和纯度的分析结果。图4中的数据表明,添加50mM磷酸盐同时电导率达到91 mS/cm时,质粒DNA与RNA都不能与AEX层析介质结合,大部分在流穿液中(见图4的流穿液a),而再生峰a含有少量质粒DNA和杂质RNA,表明电导率达到91 mS/cm时,少量DNA和RNA与AEX介质结合且不能正常洗脱。另一方面,添加磷酸盐的89和86 mS/cm的条件下的流穿液,其中RNA含量与上清液是相似的(见图4流穿液b, c)。相比前述不添加磷酸盐时87 mS/cm电导率的条件下(即图2),其流穿液中RNA含量是明显低于上清液中的RNA含量的,这说明添加50mM磷酸盐后,在同样的87 mS/cm电导率左右的条件下,RNA与AEX层析介质的结合力是不同的。50mM的磷酸盐对杂质RNA与AEX层析介质的结合有抑制作用,这一点也可以通过对比两种条件下再生液中RNA的含量得到验证:在图2中,不添加磷酸盐时,AEX的再生液中含有大量RNA,而图4中,添加磷酸盐且电导率适中时(89-86 mS/cm),AEX再生液(图4再生峰b, 再生峰c)中的RNA在琼脂胶上几乎是不可见的。最后,添加磷酸盐的89和86mS/cm的条件下,洗脱峰中22KB质粒DNA大部分呈超螺旋态(见图4洗脱峰b, 洗脱峰c),与不添加磷酸盐的87mS/cm的条件下得到的洗脱液 (见图2洗脱峰) 是相似的。
以上三次连续的添加磷酸盐的纯化试验与不添加磷酸盐的数据对比,清楚地表明,未添加磷酸盐时,RNA主要结合在填料上,在淋洗和再生组分中有少量;添加磷酸盐后,RNA不与填料结合,主要在流穿液中,因而没有淋洗峰,在再生峰中含量也很少。这说明,向22KB质粒DNA的上清液添加50mM磷酸钠并控制其电导率在适当范围,能提高AEX纯化工艺的鲁棒性,降低AEX洗脱液中含有大量RNA的风险。
实施例二 磷酸根的适宜浓度范围:质粒DNA裂解物含0mM / 10mM / 50mM/ 100mM磷酸根离子
对添加0、10、50、100 mM磷酸钠且电导率相同的样品溶液进行AEX纯化洗脱。样品溶液的配置参考实施例一的方法,洗脱条件与实施例一相同。
4种样品溶液的具体参数如下表所示:
电导率的测定是在22~23℃下进行的。
试验结果:
如图5所示为对含有22KB质粒DNA的上清液添加0mM (a),10mM (b),50mM (c),100mM (d)磷酸钠后的AEX层析纯化步骤的色谱图。其中,LOAD为上样后的流穿液,Wash为淋洗峰,Elu为洗脱峰,EluTail为洗脱峰拖尾,Strip为再生峰。图5的色谱结果表明,在上清液中不添加磷酸钠时(a),使用含有磷酸钠的平衡液进行淋洗,出现了一个与上样流穿时的A260吸光度等高的淋洗峰,而洗脱峰非常小;上清液中添加10mM和50mM的磷酸钠时(b,c),有显著的洗脱峰,而淋洗峰很小或没有;上清液中添加100mM的磷酸钠时(d),不仅没有淋洗峰外,洗脱峰也很小。
如图6所示,为将图5中添加0、10、50、100 mM磷酸钠并调节电导率至85mS/cm后经AEX纯化步骤后产生的各组分在0.8%琼脂胶上的迁移条带和浓度结果的对比。其中pDP8为22KB质粒DNA的标准品。Load为添加磷酸钠的上清液,即AEX上样液,FT为AEX流穿液,WASH为AEX淋洗峰,Elu为AEX洗脱峰,EluTail为洗脱峰拖尾,Strip为AEX再生峰。
图6的结果显示,在上清液电导率控制在85 mS/cm的条件下,不添加磷酸钠时(a),质粒DNA与少量RNA与AEX层析介质结合,大部分RNA没有结合,进入了流穿液,说明此条件下AEX层析介质对质粒DNA与RNA有一定的辨识度。但是,在使用含有50mM磷酸钠的平衡液对AEX层析柱进行淋洗时,大部分质粒DNA与少量RNA在此步骤被洗脱下来 (见图6中a的Wash),说明单纯AEX树脂对RNA和pDNA的分辨率不足,在洗涤步骤时被同时从色谱柱上洗脱下去,此工艺规程是不稳健的。当添加10mM (b) 和50mM (c)磷酸钠并保持上清液电导率在85 mS/cm的条件下,流穿液和淋洗峰为杂质RNA,而洗脱峰为目标质粒DNA,说明上清液添加10mM到50mM的磷酸钠后,AEX工艺规程的稳健性得到提高,在使用不同批次的质粒上清液,AEX缓冲液,AKTA层析系统,以及操作人员的条件下,重现了第一次试验时连续三次AEX纯化试验的结果(图3和图4)。裂解液中磷酸盐的浓度为10mM至50mM时,有助于质粒DNA选择性地结合AEX树脂上的可用位点,有助于Poros HQ树脂上区分的DNA和RNA。最后,在上清液电导率控制在85 mS/cm的条件下,添加100mM磷酸钠的结果表明,100mM的添加量,首先对上清液造成较大的稀释,同时还降低的上清液的电导率,需要添加5M的氯化钠,以保持上清液电导率在85 mS/cm;同时,此条件下的AEX色谱数据和琼脂胶数据,均显示质粒DNA和杂质RNA都不能与AEX层析介质结合,所有可用的位点都被磷酸盐占据,说明过量磷酸钠对DNA和RNA上的磷酸根与AEX介质的结合有削弱和抑制的作用。这种作用,很可能是一种竞争性的抑制作用,因为DNA和RNA上的磷酸根与外源缓冲液中的磷酸根,都能与AEX介质上的正电性基团结合。
综上所述,上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限定本发明的保护范围,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (11)
1.一种大型质粒DNA的纯化方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1:向含大型质粒DNA的上清液中加入磷酸盐至浓度为10~50 mM,并调节溶液电导率为82~89 mS/cm,25℃,得到上样溶液;所述大型质粒DNA是指大于20KB的质粒DNA;
S2:将所述上样溶液上样至Poros HQ阴离子层析进行洗脱,收集洗脱液;
所述大型质粒DNA的上清液通过以下方法得到:对含大型质粒DNA的细菌进行碱液裂解、酸性中和、对中和后的悬浮混合物进行过滤,即得。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述含大型质粒DNA的上清液的pH值5,电导率为60~65mS/cm,且不含有任何磷酸根的盐类。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述S1中,使用NaCl溶液调节溶液电导率。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述NaCl溶液的浓度为5M。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述上样溶液为HPO4 2--H2PO4 -缓冲盐体系。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述上样溶液的pH值为7.0。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述磷酸盐为磷酸钠和/或磷酸钾。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述S2包括上样、淋洗、洗脱和清洗再生。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述S2中,淋洗步骤使用的淋洗液为50mM磷酸盐,0.78M NaCl,pH 7的缓冲液。
10.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述S2中,洗脱步骤使用的洗脱液为50 mM磷酸盐,0.78 M NaCl,pH 7.0的缓冲液。
11.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述S2中,清洗再生步骤使用的再生液为1MNaCl,0.2M NaOH的溶液。
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