JPS63281051A - Ｄｎａを含む試料の処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、自動的になされる試料の処理方法に関し、さ
らに詳しくは、　　ＤＮＡ、　ＲＮＡ　、蛋白質、多＃
Ｎ類などの各種菌体成分を含む菌体溶菌液から。

吸着剤を用いてＤＮＡを高純度で単離・精製する方法に
関する。

（従来の技術） バイオテクノロジーの発展に伴い、遺伝子の分離、精製
および遺伝子の塩基配列決定を行う頻度は非常に高い。

しかし、各種技術の進歩にもかかわらず、その操作は繁
雑な手作業を必要とし、長時間と多大の労力とを要する
。

例えば、　ＤＮＡ、　ＲＮＡ、多ＩＪｉ類および蛋白質
を含有する試料から純粋なりＮＡを単離・精製するには
。

次の３段階のプロセスが行われる。（１）細胞壁を崩壊
させ、可溶性ＤＮＡを放出させる。（２）放出されたＤ
ＮＡ−蛋白質複合体を、蛋白質変性または蛋白質分解に
より１分解する。（３）変性または分解した蛋白質とＤ
ＮＡとの混合物から、　　ＤＮＡのみを単離・精製する
。しかし、このような処理操作には、長時間（数日間に
もわたる）を要する。そのため、このような作業は基礎
および応用開発において、研究者にとって大きな負担と
なっている。

バイオテクノロジーの特に応用技術の展開のためには、
これらの作業を短時間で完了できるような技術が望まれ
る。特に、　　ＤＮＡの配列分析、遺伝子の構築、構築
されたＤＮＡ配列に所望の遺伝子が正しく入っているか
のチェックなどを行う目的のためには、これに使用する
ための所望のＤＮＡを短時間で単離し、精製することが
必要である。各種研究のためには、特に菌体からＤＮＡ
を迅速に分離して精製することが望まれる。菌体からＤ
ＮＡを比較的迅速に分離する方法としては、ボイリング
法。

アルカリ法などが採用されているが、いずれも複雑な工
程を必要とする手作業であり自動化されにくい。手作業
であるためＤＮＡの回収率や純度などにバラツキが生じ
、技術差による個人間の格差も大きい、さらに、このよ
うな方法で得られたＤＮＡには、　ＲＮＡ　、各種蛋白
質、多糖類などが混入しており、そのままでは上記ＤＮ
Ａの配列分析などの各種実験が正しくなされ得ない。特
にＲＮＡによる妨害が大きいため１通常、このＲＮＡは
、リボヌクレアーゼ処理により低分子化され、ポリエチ
レングリコール沈澱により除去される。しかし、リボヌ
クレアーゼは安定性が高いため、使用後に完全に除去す
ることが難しい。リボヌクレアーゼは高活性であるため
、場合によってはその後の反応に使用される必要なＲＮ
Ａが分解されるという欠点がある。

リボヌクレアーゼを用いず、菌体からＤＮＡを１段階で
単離・精製する方法として、ヒドロキシアパタイトカラ
ムを使用する方法が提案されている。

ＣＦ、＾、Ｂｅ１ａｎｄら、　Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａｐｈＬ　　１ユ４．１７７−１８６（１９７９）　
）。この方法によれば、まず、菌体をあらかじめ溶菌し
、これに、尿素８Ｍ（８モル／１）燐酸緩衝液（燐酸０
．２４Ｍ）、　ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳｉ　　
０．１％）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ　
；　１抛Ｍ）を含む緩衝液を加える。これを。

上記と同様の緩衝液であらかじめ処理したヒドロキシア
パタイトカラムに通液すると、溶菌液中の口ＮＮのみが
選択的にヒドロキシアパタイト（吸着剤）に吸着される
。上記吸着条件下においては。

２重らせんのＤＮＡ　（ダフ゛ルストランドＤＮＡ（ｄ
ｓ　ＤＮＡ）という〕のみが吸着され、１本鎖ＤＮＡ　
（ジングルストランドＤＮ＾（ｓｓ　ＤＮＡ）という）
　、　ＲＮＡ（１本鎖である）などは吸着されない（燐
酸濃度が０．１５Ｍ以下であれば、ある程度は吸着され
る）。尿素濃度が８Ｍと高いため、非特異的な蛋白質の
吸着もほとんど起こらない。ｄｓ　ＤＮＡを吸着したヒ
ドロキシアパタイトカラムに２次に、　１０ｍＭ燐酸緩
衝液を流して上記吸着に用いた緩衝液中の尿素、　ｓｎ
ｓなどを除去する。さらに０．３Ｍ燐酸緩衝液を通液す
ることにより吸着したＤＮＡを溶離させ、これを回収す
る。

このような処理方法では、前処理工程としての溶菌操作
がカラムとは全く別の容器で行われる。

溶菌液は９例えば、ピペットなどによりカラムに供給さ
れる。しかし、ピペットによる溶菌液の供給は、煩雑で
あるうえに、精度に欠ける。溶菌容器とカラムとをチュ
ーブを介して接続し、ポンプの動力により溶菌液を供給
する方法もある。この・方法では、溶菌液の供給におけ
る煩雑さは解消されるものの、溶菌液によりチューブや
ポンプが汚染される。そのために、測定ごとにチューブ
やポンプの汚染を除去しなければならず、この点でめ操
作が煩雑となる。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記従来の問題点を解決するものであり、その
目的とするところは、前処理工程を経て試料を短時間の
うちに、高純度でかつ煩雑な操作を必要とすることなく
処理する方法を提供することにある。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、従来カラムとは別の容器内で行われていた試
料の前処理工程（特に菌体の溶菌操作）を、カラムの吸
着剤層と一体的に形成されたりツーバ一部分（溶菌容器
）にて行うことにより、ピペットなどによる溶菌液の供
給といった煩雑な操作を要しない；しかも、溶菌容器と
カラムとは一体的であるため、従来溶菌容器とカラムと
を接続していたチューブやポンプの汚染が回避される。

との発明者の知見に基づいて完成された。

このように、カラムと一体化されたりツーバ一部分を溶
菌容器とすれば、カラムの吸着剤層とりツーバ一部分と
はフィルターを介するだけであり。

リザーバ一部分に供給された菌体は、すみやかに吸着剤
層に流出すると考えられる。しかし、実際には、驚くべ
きことに、菌体はフィルターを容易に透過し得ず、吸着
剤層にはほとんど流出しない。

これらの事実から２本発明者は、カラムのリザーバ一部
分でも菌体の溶菌がなされ得る。との結論に達した。

本発明の試料の処理方法は、吸着剤層およびリザーバ一
部分を有し、該吸着剤層と該リザーバ一部分とがフィル
ターを介して一体的に連結されたカラムを用いた試料の
処理方法であって、該リザーバ一部分に試料および前処
理液を充填して、該試料を前処理する工程、該前処理さ
れた試料を該吸着剤層に供給して、該試料中の成分を該
吸着剤に吸着させる工程、および該吸着剤層を洗浄した
後、該成分を溶出させる工程、を包含し、そのことによ
り、上記目的が達成される。

本発明の試料の処理方法に用いられるカラム１は２例え
ば、第１図に示すように、吸着剤層ＩＯと。

この吸着剤層１０の上部に形成されたリザーバ一部分１
１とを有する。リザーバ一部分１１にて試料が溶菌され
るとともに、吸着剤層１０で試料中の成分が吸着される
。この吸着剤層１０とリザーバ一部分１１との間には、
フィルター１２が装着されている。カラム１の内部底面
にもフィルター１３が装着され。

このフィルター１３上に吸着剤層１０が設けられている
。カラム１の底部には、下方へ突出する溶出液の流出口
１４およびこの流出口１４と接続された回収チューブ１
５が配設されている。カラムｌの上端部には、カラム１
内を気密に密閉するカラム栓１６が装着され、またカラ
ム１内を開放系にするためのチューブ１７およびパルプ
１８が装着されている。カラム１には、処理液（洗浄液
、溶離液、再生液など）を供給するためのチューブ１９
が連結されている。

このカラム１は９例えば、第２図に示すように。

吸着剤層１０とリザーバ一部分１１とが、適当な長さの
チューブ２０を介して連結されてもよい。カラム１の他
の例には２例えば、第３図に示すように。

吸着剤層１０とリザーバ一部分１１とが、別体ではある
ものの、接続部２１を介してほぼ一体的に連結された構
成がある。

本発明方法において、試料の前処理工程には。

菌体の溶菌工程、タンパク溶解工程、抽出工程などが含
まれる。この方法で処理されるべき試料には９例えば、
　ＤＮＡを含む試料、特に菌体なと細胞を含む試料が好
適である。本発明方法は、　ＤＮＡを含む試料からのＤ
ＮＡの抽出、特に大腸菌細胞がらのプラスミドＯＮＡ　
　（１０’ダルトンオーダー）〜さらに高分子量のＯＮ
Ａ　　（１０’ダルトンオーダー）のＤＮＡの抽出に適
している。しかし、この方法は。

大腸菌細胞以外の細胞９例えば真核細胞に対しても使用
され得る。

本発明に用いられる吸着剤としては１例えば。

ヒドロキシアパタイト、イオン交換体、逆層吸着剤（Ｃ
１ｌｌシリカゲル、フェニルシリカゲルなど）がある。

しかし、試料の処理によりＤＮＡを溶出させる場合には
、　ｄｓＤＮＡのみを選択的に吸着し得るヒドロキシア
パタイトが好適に用いられる。フィルターの孔径は、５
〜１００μｍ、好ましくは２０〜７０μｍの範囲とされ
る。特に、４０μｍ以下であれば好適である。５μｍを
下まわると、フィルターの抵抗が大きくなるため、前処
理された試料の吸着剤層への浸透が充分になされない。

１００μｍを上まわると、試料および前処理液がカラム
のりザーバ一部分に充填され得ず、すぐに吸着剤層°に
流出してしまうため、試料の前処理がなされない。

試料の前処理液には９例えば、洗剤、塩、溶解酵素、ア
ルカリ剤、キレート剤、カオトロピック剤、尿素などを
含む溶液が使用され得る。キレート剤および溶解酵素は
、細胞溶解に際して、細胞壁を弱めるために用いられる
。キレート剤には。

ＥＤＴＡ、　　８−ヒドロキシキノリンなどがある。溶
解酵素としてはりゾチーム、ブロテイナーゼになどが挙
げられる。洗剤は、溶解酵素またはキレート剤により弱
められた細胞壁を溶解させるために用いられる。洗剤に
は１例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（
ｓｏｓ）　、　　ｔ−リドンＸ−１００゜Ｎｏｎ１ｄｅ
ｔ　＋　　ラウロイルサルコシンがある。ドデシル硫酸
ナトリうムの濃度は、０．１〜２％の範囲で変えられる
。しかし、０．５〜１％の範囲が好適である。尿素は１
通常、２〜８Ｍの濃度で用いられる。８Ｍ尿素はほぼ飽
和濃度に対応する。処理されるべき試料が大腸菌の場合
に、好ましい前処理液の組み合わせは、　　０，２Ｍ　
Ｎａ０ＩＩ、　　１％ＳＯ３，５０ｍＭトリス−１１ｃ
Ｉ（ｐＨ８，０）　、　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　　１ｍ
ｇ／　ｍｌリゾチームである。試料が真核細胞であれば
、　　ＩＭＮａＣｌ、　　１％ＳＤＳ、　　５ＯＮＭ　
）リス・ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、　　１０ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ　、　　１ｍｇ／　ｗｒｌプロテイナーゼにである。

溶出工程で用いられる溶離液としては２例えば上記のよ
うに吸着剤を構成する成分（アニオンおよびカチオン）
の少なくとも一方、好ましくは両方と強い相互作用を有
する溶媒が使用され得る。

例えばヒドロキシアパタイトを吸着剤とする場合に、使
用される塩のアニオン成分としては炭酸；および蟻酸、
酢酸、プロピオン酸などの有機酸が好適である。カチオ
ン成分としては、アンモニア；ジエチルアミン、トリエ
チルアミンなどのアルキルアミン類；エタノールアミン
、プロパツールアミンなどのアルカノールアミン類；お
よびピリジン、アミノベンゼンなどの芳香族アミン類が
好適である。このような成分でなる塩を含む溶離液とし
ては、特にトリエチルアミン炭酸緩衝液が好適である。

トリエチルアミン炭酸緩衝液は揮発性であるため、　　
ＤＮＡを含む溶出液の溶媒を留去したり凍結乾燥するこ
とによりＤＮＡのみを高純度で回収することが可能とな
る。

溶離液の濃度は、使用する溶離液の種類により異なるが
２例えばトリエチルアミン炭酸緩衝液を使用する場合に
は、　１０ｎ＋Ｍ以上、好ましくは５０ｍＭ〜２Ｍ、　
　さらに好ましくは１００＋ｓＭ〜ＩＭの範囲である。

このように、　５０ｍＭ以下の低濃度であってもＤＮＡ
を溶離する場合には使用可能である。

吸着剤層の洗浄に用いられる洗浄剤には８例えば、キレ
ート剤、カオトロピック剤がある。これらキレート剤、
カオトロピック剤としては、前処理液に使用した試薬が
挙げられる。

本発明の試料の処理方法は、試料の処理が菌体からのＤ
ＮＡ０単離・精製の場合３例えば１次のようにしてなさ
れる： 処理すべき菌体をカラムのリザーバ一部分に入れ、溶解
酵素、（リゾチーム、プロテイナーゼになど）、キレー
ト剤（ＥＤＴＡなと）１洗剤（ドデシル硫酸ナトリウム
など）を加える。このカラムを攪拌または振盪して、菌
体を溶菌させる。菌体の細胞壁はキレート剤や溶解酵素
により弱められ。

洗剤により溶解される。得られた溶菌液を吸着剤。

例えばヒドロキシアパタイトと接触させる。ヒドロキシ
アパタイトを充填したカラムなどが好適に利用され９例
えば０．１５〜０．２５Ｍの燐酸緩衝液を溶媒として通
液することにより、溶菌液中のｄｓ　ＤＮＡが選択的に
吸着される。溶菌液中のＲＮＡ　、蛋白質。

多糖類などは吸着されない。次に、　　ＤＮＡを吸着・
担持する吸着剤に、上記溶離液を接触させる。例えば、
　ＤＮＡを吸着・担持するヒドロキシアパタイトにトリ
エチルアミン炭酸緩衝液を接触させると。

炭酸イオンがヒドロキシアパタイトのカルシウムと結合
して難溶性の炭酸カルシウムを生成し、一方トリエチル
アミンはＯＮへの燐酸部分と塩を形成し、その結果、　
ＤＮＡはヒドロキシアパタイトから脱着する。例えば、
ヒドロキシアパタイトカラムのベッド容量の２倍量のト
リエチルアミン炭酸緩衝液を通液することにより、吸着
されているＤＮＡのほぼ全量を回収することができる。

このようにして回収される溶出液（抽出液）を通常のエ
タノール沈澱処理に付すことにより精製ＤＮＡが得られ
る。溶出液中のトリエチルアミン炭酸塩はエタノールに
相溶するため、　ＤＮＡに混入してその純度を低下させ
ることがない。エタノール沈澱処理の代わりに溶媒の減
圧留去や凍結乾燥を行うことによってもトリエチルアミ
ン炭酸塩が揮発・除去され（脱塩が達成され）で高純度
のＤＮＡが得られる。

本発明の試料の処理方法は２．上記のようなりＮＡの単
離・精製の他に、タンパクの溶解・抽出にも用いられる
。

本発明の試料の処理方法では、前処理工程と溶菌工程と
が連続してなされ得るカラムが用いられる。このカラム
に、前処理液、溶離液、洗浄液などを収容する容器を組
み合わせ、これらの処理液をこの容器から供給手段（チ
ューブ、ポンプなど）によって供給すれば、試料の処理
が自動化され得る。さらに、カラムの下流にフラクショ
ンコレクターを配置すれば、溶出液の回収も自動化され
る。

供給手段やフラクションコレクターは２通常、コンピュ
ーターにより制御される。

（実施例） 以下に本発明を実施例について述べる。

尖旌■上 （Ａ）菌体の培養 プラスミドｐＢＲ３２２を含有する大腸菌０８１０１株
を５−のＬＢ培地中で一夜培養した。この培養液１．５
−を５．０００ｒｐ−にて５分間遠心分離し、菌体を沈
澱させた。

（Ｂ）菌体の溶菌 （Ａ）項で得られた菌体に、２０ｍＭ）リス塩酸緩衝液
（ｐＨ８，０）−１０ｄエチレンジアミン四酢酸（２×
ＴＥ）　２５０μｌを加えて懸濁させ、これをカラム１
のリザーバ一部分１１に入れた。カラムｌにカラム栓１
６を取りつけ、チューブ１７．１９およびパルプ１８を
接続した。チューブ１９は９図外の供給手段（ポンプを
有する）および容器と連結した。さらに、このリザーバ
一部分ｌｌに、パルプ１８を開け、開放系にした後、チ
ューブ１９より５０ｓ？ｌのトリス塩酸緩衝液に溶解さ
せた１■／−リゾチームを５０μｌ加えた。パルプ１８
を閉じ、リザーバ一部分１１を密閉系として、菌体を室
温にて１０分間振盪し溶菌した。

次いで２パルプ１８を開けて系を開放系にした後。

チューブ１９から０．５Ｍ　ＢＤＴＡを２０μｌ加え、
室温にて１０分分間中かにカラムを振盪し攪拌した。さ
らに、チューブ１９により、２％トリトンＸ１００を１
０μｌを加えて、室温にて４５分間放置した。この間に
、カラムをゆるやかに攪拌し振盪を続けた。

この溶液に９回収率の算出を目的として　３Ｈでインビ
トロ（ｉｎ　ｖｉＬｒｏ）標識されたプラスミド口ＮＡ
（クトｐＢＲ３２２ＤＮＡ）を約０．１　ｐ　Ｃｉ添加
した。

（Ｃ）　　ＤＮＡの精製： （Ｃ）−１力ラム操作（吸着） （Ｂ）項で得られた溶菌菌体を含む水溶液（溶菌液）に
対し、９Ｍ尿素−０，２７Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７、０）
　−１％ＳＯＳを含む緩衝液を８倍容量をパルプ１８を
開け、系を開放系とし、チューブ１９から加えた。この
混合液を、パルプ１８を閉じてカラム１を密閉系にして
、０．５−のヒドロキシアパタイト（吸着剤）を充填し
たカラムに流速５−７時間でチャージし。

菌体成分を吸着させた。

（Ｃ）−２力ラム操作（洗浄１） 上記カラムに約２０−の８Ｍ尿素−０，２４Ｍ燐酸緩衝
液（ｐＨ７，０）を流速２０ｄ／時間で約１時間、溶出
し、　　２６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤｏ。）がほぼ
Ｏになるまで通液した。

（Ｃ）−３力ラム操作（洗浄２） 次に１０１１Ｍトリス・塩酸−１＋ｍＭ　　エチレンジ
アミン四酢酸（ｐｌ＋７．５）　（ＴＥ）緩衝成約１０
ｍ１を流速２〇−７時間の割合で３０分間通液し、　（
Ｃ）−２項の洗浄液の成分である尿素および燐酸緩衝液
を洗い流した。

（Ｃ）−４力ラム操作（溶離） このカラムに０．１Ｍ　　）リエチルアミン炭酸緩衝液
（ｐｌ＋８．０）を流速５−７時間で流した。カラムの
出口に紫外線吸収モニター（Ｕνモニター）を接続して
２６０ｍｎの吸光度をモニターしたところ、第４図に曲
線で示す結果が得られた。第４図から。

溶離液の通液開始後０．２〜ｌ、２〜ｌの範囲で大部分
のプラスミドＤＮＡが溶出されているのがわかる。

カラムからの溶出液の各フラクションの放射活性を液体
シンチレーションカウンターで測定し、各フランクジョ
ンに含まれる３Ｈ標識化プラスミドの回収率を調べた。

その結果を第４図に棒グラフで示す。第４図から、はぼ
９５％以上のプラスミドｐＢＲ３２２−ＤＮＡが回収さ
れていることがわかる。

（Ｃ）−５ＤＮＡ０単離および純度の評価得られた溶出
液約１ｍに３Ｍ酢酸ナトリウムを０．１−加えてエタノ
ール沈澱を行った。プラスミドＤＮＡ　（ｐＢＲ３２２
）が４μｇ回収された。このプラスミドＤＮＡの１７５
量をアガロースゲル電気泳動にかけたところ、第５図２
に示す泳動パターンが得られたく第５図１は、プラスミ
ドＤＮＡ　（ｐＢＲ３２２）のマーカーである）。ＲＮ
Ａは全く検出されず、かつ、宿主ＤＮＡもリボヌクレア
ーゼを用いる従来法（比較例、泳動パターン５）に比べ
て同程度以下（５％以下）であった。第５図において、
　ｏｃ　ＤＮＡは、ニック（切り目）の入ったｐＢＲ３
２２プラスミドＤＮＡを、そしてｃｃ　ＤＮＡは、ニッ
クの入らないｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡを示す。

さらに９回収された溶液の蛋白質の定量を行ったところ
、蛋白質の含有量は検出限界の２Ｈｇ以下であり、　　
ＤＮＡは充分に純粋であることが推定された。このＤＮ
Ａは制限酵素器ｎｆｌにより完全に切断され、純度的に
も十分満足できることがわかった。

大立桝ｌ 菌体の溶菌方法としてアルカリ法を用いたこと以外は、
実施例１と同様の方法により、菌体の溶菌を行った。

（Ａ）菌体の培養および溶菌 実施例１（Ａ）項と同様の操作で得られる遠心分離され
た菌体１．５−を、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐｔ１
８．Ｏ）−１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（２ＸＴｆ
り１００μｌを加えて懸濁させ、これをカラム１のリザ
ーバ一部分１１に入れた。カラム１にカラムａ１６を取
りつけ、チューブ１７．１９およびパルプ１８を接続し
た。チューブ１９は９図外の供給手段（ポンプを有する
）および容器と連結した。さらに、このリザーバ一部分
１１に、　５０ｎ＋Ｍのトリス塩酸緩衝液に０．２Ｍ水
酸化ナトリウム−０，１％ドデシル硫酸ナトリウムを２
００μｌ加えた。パルプ１８を閉じ、リザーバ一部分１
１を密閉系として、菌体を室温にて１０分間振盪し溶菌
した。

次いで、この強アルカリ水溶液に、酢酸カリウム１５０
μｌを加えて中和した。この溶液に１回収率の算出を目
的として、Ｈでインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）標識さ
れたプラスミドＤＮＡ　（３Ｈ−ｐＢＲ３２２ＤＮ八）
を約０．１μＣｉ添加した。この溶菌液を、この上澄み
液に３Ｈでインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）標識された
プラスミドＤＮＡ　（’Ｈ−ｐＢＲ３２２ＤＮＡ）約０
．１μＣｉ相当分を添加した。これは回収率を算出する
ためである。

（Ｂ）　ＤＮＡの精製 本実施例（Ａ）項で得られた”Ｈ−ｐＢＲ３２２ＤＮＡ
を含む液を用い実施例１と同様にカラム操作を行った。

溶離・液通液開始後０．２〜１．２　ｄの範囲で大部分
のプラスミドＤＮＡが溶出された。ＤＮＡの回収率は３
１１！ｌｉ化プラスミドの放射能から、はぼ９５％以上
であるこが判明した。これらの操作は、全てコンピュー
ターにより制御され、約２時間で終了した。

回収された溶出液約ｌ　ｄに３Ｍ酢酸ナトリウムを０．
１ｄ加えてエタノール沈澱を行い、プラスミドＤＮＡ　
（ｐＢＲ３２２）を３μｇ回収した。このプラスミドＤ
ＮＡをアガロース電気泳動にかけたところ第５図３に示
す泳動パターンが得られた。ＲＮＡは全く認められず、
かつ、宿主ＤＮＡも従来法（比較例；泳動パターン４）
に比べてかなり低く、エチジウムブロマイド染色によっ
ては検出することが困難であった。

さらに２回収された溶液の蛋白質の定量を行ったところ
、蛋白質の含有量は検出限界の２ｎｇ以下であり、　　
ＤＮＡは十分に純粋であることが推定された。このＤＮ
Ａは制限酵素Ｈｉｎｆ　Ｉにより完全に切断され、純度
的にも十分満足できることがわかった。

ル較舅 実施例１および２は全て液体クロマトグラフィーの原理
に基づ（ミニカラム法を用いた自動化装置による試料の
処理方法（ＤＮＡ精製）の例である。

これに対して、従来の手動によるＤＮＡの精製例をアル
カリ法を用いて次に示す。

（Ａ）菌体の培養および溶菌 実施例２（＾）項と同様に操作して、上澄み液を得、こ
れに”ＩＩ−ｐＢＲ３２２ＯＮＡを加えた。この液に等
量のフェノール−クロロホルム（１：　１）を加えて抽
出し、蛋白質を除去した後、上澄み液を分は取り、これ
に等量のイソプロパツールを加え、アルコール沈澱を行
った。得られた沈澱を１５．００Ｏｒｐｍで１０分間遠
心し、沈澱を７０％エタノールで洗浄後真空乾燥し、　
ＤＮＡ分画を回収した。このＤＮＡ分画を５０μｌのＴ
Ｅ緩衝液に溶解させた。次いでこの溶液に１■／　ｍｌ
のリボヌクレアーゼを２μｌ加え。

３７℃で１時間放置し、　ＲＮＡを低分子化した。これ
に、０．２倍量の５ＭＮａＣ１水溶液および０．３３倍
量の３０％ポリエチレングリコール６０００水溶液を加
え。

−１０℃にて１時間冷却した。生じた沈Ｒ（プラスミド
ＤＮＡ）を、　１５．００Ｏｒｐｍにて１０分間遠心分
離し。

回収した。低分子化されたＲＮＡは沈澱しないため。

除去される。得られたＤＮＡを５０μｌのＴＥに溶解し
。

これに５μｌの３ＭＮａＣ１水溶液を加えた。これに９
９％エタノール１００μｌを加え、−７８℃で１０分間
冷却した。これを１５．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心分
離し。

ＤＮＡを回収した。この操作によりポリエチレングリコ
ールが除去された。得られたＤＮＡを再び７０％エタノ
ールにて洗浄後、真空乾燥した。　　ＤＮＡの収量は３
μｇであった。リボヌクレアーゼ処理を行わなかった場
合および行った場合のＤＮＡの電気泳動パターンを第５
図４および５に示す。この比較例においては、リボヌク
レアーゼ処理を行わなかった場合は、多量のＲＮＡがコ
ンタミしており、一方ＲＮＡ除去のための処理を行った
場合には約３時間を余分に要した。

（発明の効果） 本発明方法によれば、このように、試料の前処理工程（
例えば菌体の溶菌工程）が、カラムの吸着剤層と一体的
に形成されたリザーバ一部分でなされるため、試料の処
理が短時間のうちに、高純度・高収率で、かつ煩雑な操
作を必要とすることなくなされ得る。このような方法は
、菌体からのＤＮＡの単離・精製などの遺伝子工学の各
分野で広く利用され得る。

４、　゛　　の　　　なＩ 第１図、第２図および第３図は９本発明の試料の処理方
法に用いられる装置の一実施例を示す断面図；第４図は
、実施例１において９本発明の試料の処理方法によりＤ
ＮＡの精製を行ったときの溶出液の紫外線吸収をモニタ
ーした結果、およびＤＮＡの指標として加えられた３Ｈ
放射能活性をモニターした結果を示すグラフ；そして第
５図は本発明方法および他の方法により得られる精製Ｄ
ＮＡの電気泳動パターンである。

１・・・カラム、　１０・・・吸着剤層、　１１・・・
リザーバ一部分、　１２．１３・・・フィルター、１４
・・・流出０．１５・・・回収チューブ、１６・・・カ
ラム栓、　１７．１９．２０・・・チューブ。

１８・・・バルブ、　２１・・・連結部。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、吸着剤層およびリザーバー部分を有し、該吸着剤層
   と該リザーバー部分とがフィルターを介して一体的に連
   結されたカラムを用いた試料の処理方法であって、 該リザーバー部分に試料および前処理液を充填して、該
   試料を前処理する工程、 該前処理された試料を該吸着剤層に供給して、該試料中
   の成分を該吸着剤に吸着させる工程、および 該吸着剤層を洗浄した後、該成分を溶出させる工程、 を包含する試料の処理方法。 ２、前記フィルターの孔径が、５〜１００μｍの範囲で
   ある特許請求の範囲第１項に記載の試料の処理方法。 ３、前記試料が細胞を含む特許請求の範囲第１項に記載
   の試料の処理方法。 ４、前記試料が、ＤＮＡを含む試料である特許請求の範
   囲第１項に記載の試料の処理方法。 ５、前記前処理工程が、溶菌工程、タンパク溶解工程お
   よび抽出工程のうちの少なくとも一種の工程である特許
   請求の範囲第１項に記載の試料の処理方法。 ６、前記吸着剤が、ヒドロキシアパタイト、イオン交換
   体および逆相吸着剤のうちの少なくとも一種である特許
   請求の範囲第１項に記載の試料の処理方法。 ７、前記前処理液が、洗剤、塩、溶解酵素、アルカリ剤
   、キレート剤、カオトロピック剤および尿素のうちの少
   なくとも一種を含有する特許請求の範囲第１項に記載の
   試料の処理方法。 ８、前記洗剤がドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム
   である特許請求の範囲第７項に記載の試料の処理方法。 ９、前記キレート剤がＥＤＴＡである特許請求の範囲第
   ７項に記載の試料の処理方法。 １０、前記洗浄に用いる洗浄剤が、キレート剤および／
   またはカオトロピック剤である特許請求の範囲第１項に
   記載の試料の処理方法。