JP3195039B2 - 核酸のアニオン−交換分離の精度及び正確度の改良 - Google Patents

核酸のアニオン−交換分離の精度及び正確度の改良

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は核酸フラグメントのアニオン交換分離のための
新規溶媒に関する。これらの溶媒は、分子生物学、分析
生化学、臨床化学、産業的及び環境的微生物学及び分子
遺伝学における核酸の分析のためのクロマトグラフィー
方法の著しい改良をもたらす。
【０００２】関連する技術の記載 一本鎖ＤＮＡはホスホジエステル結合を通して共有結合
されるデオキシリボ−ホスフェートモノマーの鎖から成
り、そしてまた、個々のデオキシリボ環に共有結合され
る１つの芳香族複素環式“塩基”を含む。約２以上のpH
の水性溶媒においては、ひじょうに親水性の糖−ホスフ
ェートポリマー主鎖が、個々のホスホジエステルのため
の１つの負の電荷及びあらゆる末端ホスホモノエステル
のための１又は２つの負の電荷に寄与する。従って、Ｄ
ＮＡはポリアニオンであり；正味の負の電荷は好ましく
は、鎖の長さに比例する。しかしながら、塩基はひじょ
うに疎水性であり、その結果、一本鎖は混合された親水
性−疎水性性質を有する。一本鎖ＤＮＡは、一定に及び
急速に変動し、そして時間−平均化された球形状を有す
るランダム−コイル形状を採用する。球体内で、ランダ
ム疎水性芳香族炭化水素積み重ね相互作用及び塩基対水
素結合は、鎖の種々の部分を一緒に結合せしめ、そして
ホスフェート基の静電反発作用が構造体の種々の部分を
別々に駆動せしめる傾向がある。これらの反対の傾向性
間のバランス及び従って平均の球体直径は、温度及び溶
媒組成、特にイオン強度に依存する。
【０００３】ほとんどの天然に存在するＤＮＡは、二重
螺旋鎖を形成するために非共有的に相互作用する類似す
る又は同一の長さの２本の一本鎖から成る二本鎖であ
り、ここで４種の通常存在する塩基、アデニン（Ａ）、
チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）は、
１つの鎖上の個々のＡが他の鎖上のＴに水素結合され
（逆もまた同様である）、そして１つの鎖上の個々のＧ
が他の鎖上のＣに水素結合され（逆もまた同様である）
るように２種の相互作用する鎖上で、相補的配列で存在
する。この塩基対構造は、その軸にそって二重螺旋鎖内
に疎水性基を融離し、そして溶媒から分離し；２重螺旋
鎖の糖−ホスフェート鎖が二本鎖構造の外部で螺旋状に
降下し、溶媒に対する親水性ポリアニオン性面を示す。
異なった幅の２種の螺旋状溝、すなわち“主要”及び
“副”が、２種の糖−ホスフェート鎖を分離する。それ
らの溝は、水分子及び溶媒カチオンを結合するのに十分
に大きい。二重螺旋鎖構造はまた、数百以下の塩基対の
セグメントが球状に柔軟に渦巻くよりもむしろ効果的に
硬質で且つ線状であるように、二本鎖ＤＮＡを硬化す
る。数百〜数千の塩基対の長さの規模に基づけば、二本
鎖ＤＮＡはまた渦巻きにされるが、しかし一本鎖ＤＮＡ
よりもゆるい。最近、二本鎖ＤＮＡにおける一定の配列
が二重螺旋鎖において湾曲性を誘発し、その結果、１０
〜１００個の塩基対の長さの規模に基づいては、もはや
線状でないことが明確になった（Ｈａｇｅｒｍａｎ，１
９９０，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５９：７５５〜７８１を参照のこ
と）。
【０００４】二本鎖ＤＮＡは、約５０〜１００℃の範囲
の温度に加熱することによって、一本鎖ＤＮＡの２つの
鎖を得るために、可逆的に“溶融”され得る。Ｇ−Ｃ塩
基対は、Ａ−Ｔ塩基対よりも高い温度で溶融する傾向が
ある。なぜならば、それらの塩基対の相互作用が強いか
らである。溶媒組成物はまた、二重螺旋鎖の安定性に影
響を及ぼし；有機補助溶媒の添加又は水性溶媒における
塩濃度の低下は、塩基組成に関係なく、いづれかのＤＮ
ＡのＴｍ（ＤＮＡの半分が一本鎖に解離する温度）を下
げる。
【０００５】ＲＮＡ構造は類似するが、しかしＤＮＡ構
造よりも複雑である。その一本鎖はＤＮＡ一本鎖にほと
んど同一であり、リボースによるデオキシリボースの置
換及びアデニンに対して塩基対でもあり得るウラシルに
よるチミンの置換において異なる。しかしながら、一本
鎖は、隣接する塩基配列は相補的であるので、しばしば
比較的短い自己対合二本鎖領域を含むけれども、二本鎖
ＲＮＡはまれである。ＲＮＡはＤＮＡと同じポリアニオ
ン性質を有するが、しかし多数の一本鎖領域がそれを疎
水性にし、そして一本鎖及び二本鎖領域の混合物が、一
本鎖及び二本鎖ＤＮＡに見られる形状の規則性（球状又
は線状）を破壊する。
【０００６】種々のＤＮＡ分子を分離するための最っと
も通常の方法は、予備又は分析目的のためのいずれにせ
よ、厳密な長さ依存性ポリアニオン性質及び一本鎖及び
二本鎖の両構造の相当の形状規則性及び柔軟性を利用す
る。ほとんどの電気泳動性及びクロマトグラフィー性Ｄ
ＮＡ分離はポリマーの正味の電荷に直接的に又は間接的
に依存するが、電荷とポリマーの長さとの間の類似する
比例関係が、分離軸にそっての異なったＤＮＡ種の置換
においてサイズ−依存性差異をもたらす（ゲル電気泳動
においては距離として、細管電気泳動においては時間と
して及びクロマトグラフィーにおいては時間又は体積と
して通常表わされる）。大きな分子はよりゆっくり移動
し、そして従って、ゲルが荷電された溶質分子上に粘性
抵抗を及ぼすための節として作用するので、与えられた
電気泳動分離においてより短い距離を移動し；この抵抗
力は溶質と共に直接変化する。ＤＮＡのほとんどのクロ
マトグラフィー性分離は、グラジエント溶離を必要とし
て、ここで溶媒における溶離用溶質は、溶離の時間及び
連続して流れる溶媒の体積と共に組織的及び通常、連続
的に高められ；大きな分子は小さな分子よりもクロマト
グラフィー用樹脂により強く結合され；そして従って、
樹脂から置換されるべきクロマトグラフィー用溶離溶質
の高い濃度を必要とする。理想的な分離条件下で、電気
泳動移動速度及び距離又はクロマトグラフィー溶離時間
及び体積はＤＮＡ分子サイズに単調に依存し、そしてサ
イズに従って、特定のＤＮＡフラグメントを同定するた
めに使用され得る。十分に最適化された分離において
は、電気泳動置換又はクロマトグラフィー溶離時間は、
分子サイズの対数の線状関数である。
【０００７】サイズ依存性核酸分離の同定値は、４種の
性能特性、すなわちサイズ範囲、サイズ分解能、移動の
精度及びサイズの正確さに依存する。数回の分離が、分
子サイズの大きさの１以上の広範なオーダーに対して線
状の対数サイズ検量線を与える。多くの分析物システム
は、サイズの大きさのいくつかのオーダーにわたっての
範囲のＤＮＡ種を包含するので、いくつかの異なった電
気泳動ゲル（例えば種々のゲル密度を用いる）又はクロ
マトグラフィー溶離が、前記システムを十分に特徴づけ
るために行なわれるべきである。サイズ分解能は、ＤＮ
Ａの長さのいかに小さな差異が区別できる電気泳動バン
ド又はクロマトグラフィーピークをもたらすかに関し；
高い分解システムは通常、最っとも狭いサイズ範囲に近
づく。移動の精度は、ＤＮＡ同定のために最っとも重要
な性能基準である。特定のフラグメントがいかに再現的
に一定の距離を移動し又は与えられた時間で溶離するか
が、フラグメントが特定のサイズを有し、そして完全に
異なった種でない信頼性を絶対的に決定する。電気泳動
及びクロマトグラフィー両分離の精度限界は、標準が分
析物のバンド又はピークを妨害しないことを注意しなが
ら、隣接するゲルレーンにおける外部分子サイズ標準を
時々流すことによって、又はサンプルと共に内部分子サ
イズ標準を流すことによって減じられる。分子サイズ精
度は、いかに正確に分析物種が移動距離又は溶離時間対
分子サイズ（又はその対数）の滑らかな検量線に陥るか
を言及する。大部分のサイズ標準又は分析物分子のため
の一致する検量線を遠ざかる種は、誤った分子サイズ値
を付与し、但し、それらは、分離例外が既知のサンプル
により正確に特徴づけられている限り、試験サンプルに
おいて正しく且つ正確に同定され得る。サイズ誤差の主
な危険性は、研究及び発見活動の間、新規分析物の誤っ
た特徴化である。
【０００８】分離方法の全体の価値は、サイズ情報の質
の他に他の手段における性能に依存する。他の重要な分
析性質は、分析物定量化（精密度、精度、力学的範囲及
び検出限界）、分離された種の回収の容易性（後−分離
研究、たとえばＤＮＡ配列決定のための）、信頼性（妨
害、装置又は試薬の機能不全及び操作者の誤りを包含し
ない）、速度（サンプル当たりの時間）、処理量（時
間、日又は週当たりのサンプル）及び費用（装置、試薬
及び労力、たとえば労力の量及び質における）を包含す
る。
【０００９】最近、ゲル電気泳動は、サイズ依存性核酸
分離のために標準の方法になって来た。２種のゲルマト
リックスが通常使用される。すなわち容易に使用される
が、しかし低いサイズ分解能を与えるアガロース及び使
用するのに難かしく且つより危険性を伴うが、しかし特
に一本鎖ＤＮＡのための単一のヌクレオチドの差異を解
決する最大の可能な実施（十分に長いゲルにおいて）ま
で最良のサイズ分解能を与えるポリアクリルアミド。与
えられたゲル密度は、実際のＤＮＡサイズ範囲の大きさ
の約１つよりも多くないオーダーを提供する。サイズ精
度はまれに測定され又は予測され；ゲル又は電場の非均
質性がしばしば、スラブゲルにおける複数のレーン間に
又は単一のレーン内に矛盾する移動をもたらす。種は一
般的に、他の種に対するおおよその移動性により同定さ
れ；そして絶対的な分析物の同定は、分離された種が既
知の配列のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに
対して相補的な塩基配列を含む場合にのみ正のシグナル
を付与する、核酸プロービング、最っとも通常にはドッ
トブロット又はサザン分析に基づかれる。ブロットする
ことによる同定は一般的に遅く、集中的な労力を要し、
そして比較的信頼ができず、そしてしばしば、分析用シ
グナルが通常、プローブルに基づいての放射性タッグに
より創造されるので危険である。
【００１０】ゲル電気泳動は、二本鎖ＤＮＡのサイズ精
度に関しては信頼できない。なぜならば上記の分子曲率
は、分子が実際の２倍であることを十分に暗示するため
に電気泳動性移動を遅くするからである（Ｋｏｏ ａｎ
ｄ Ｃｒｏｔｈｅｒｓ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５；１７６３〜１７
６７；Ｈａｇｅｒｍａｎ，１９８５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ２４：７０３３〜７０３７；及びＳｈｏｒｅ
など．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ７８：４８３３〜４８３７）。ゲル電気
泳動は、他の性能限界を有する。バンドは最っとも通常
には、エチジウムによる染色により可視化され、ここで
前記エチジウムは、それが二本鎖（但し一本鎖ではな
い）ＤＮＡに結合する場合、強い螢光増強性を示す。そ
のような染色は、エチジウムが発癌性物質であるので危
険性を伴い；それは一本鎖ＤＮＡに対してひじょうに鈍
感であり；可逆性染料結合反応が実験条件に対してひじ
ょうに敏感であり、そして螢光が注意した検定を要する
ので、それは電気泳動により分離された種を定量化する
ために信頼できない。ゲル電気泳動は集中的な労力を要
し、そして操作者の変動性又は誤差を受けやすい。それ
は比較的遅いが（染色又は他の後−電気泳動検出を包含
する１回の操作当たり少なくとも数時間を要する）、し
かし数１０種のサンプルが同時に操作され得るので、許
容できる処理量を加する。ゲルからの分離された種の回
収は遅く、且つ集中的な労力を要する。
【００１１】細管電気泳動が最近、少量（質量単位で）
のＤＮＡに対してひじょうに敏感である早く、高い分解
性のサイズ依存性ＤＮＡ分離を提供するように開発され
て来た。しかしながら、サイズ精度は良好でなく；個々
の種の定量化は難かしく且つ鈍感であり（ＤＮＡ質量よ
りも、分子生物学者及び臨床化学者にとってより重要で
あるＤＮＡ濃度に関して；ＤＮＡは通常、多量に得られ
るが、しかししばしば比較的低い濃度である）；有用な
量での分離された種の回収は、個々の分離において処理
されたＤＮＡの質量がひじょうに少量であるので困難で
ある。
【００１２】液体クロマトグラフィー及び特に高圧液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、ＤＮＡ分離方法と
してさらに開発されたものである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，
１９８６，Ｂｉｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ １：
１６〜２０，２２〜３２及び６８〜８０；１９８７，Ｂ
ｉｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ２：４〜１８を参
照のこと）。その分離化学は、分離圧力に無関係であ
り；後者の変数は、クロマトグラフィーマトリックスの
粒度及び分離のために必要とされる時間に逆比例して変
化する。大きな粒子吸着剤上で大気圧下で行なわれる場
合、多くの時間と数百mlの溶媒を必要とする分離は、２
〜１０μｍの直径の粒子上で５〜１０気圧下で溶媒３〜
３０mlを消費して３〜３０分で完結され得る。定量的感
度は、分離体積に反比例し、そしてＨＰＬＣは、労力の
質又は量に対する要求を少なくするひじょうに自動化さ
れた方法である。液体クロマトグラフィーは通常、２６
０nm近くの最大吸光度（λｍａｘ）の波長でその高い紫
外線（ＵＶ）吸光度を通してＤＮＡを検出する。ＨＰＬ
Ｃは、単一のコンピューター調節された装置が、その分
離を行ない、溶出時間の関数として溶離された吸光度を
測定し、個々のピーク（異なったＤＮＡ種に対応する）
における吸光度を定量化するためにその得られた溶離プ
ロフィールを分析し、溶離時間及び均等（コンピュータ
ーに貯蔵される検量線への比較により）の分子サイズに
関して個々のピークを同定し、そして追加の分析のため
に別々の容器における個々のピークを収集できるように
自動化される。ＨＰＬＣ ＵＶ吸光度検出器の高い感度
は、クロマトグラフィー用溶媒の０．１ml以下に約１／
１０10ｇの核酸を含む、１／１０4 吸光度単位よりも高
くないピークの信頼できる定量化を与える。分光光度的
にモニターされたＨＰＬＣは、エチジウム染色されたゲ
ル電気泳動よりも、二本鎖ＤＮＡのために低いＤＮＡ検
出限界を有する。約１単位までの吸光度を測定するＨＰ
ＬＣ ＵＶ吸光度検出器の広い力学的範囲は、螢光測定
の検量困難性を伴わないで、４オーダー以上の濃度の大
きさの範囲のＤＮＡのＨＰＬＣによる定量化を可能にす
る。
【００１３】２種の主な液体クロマトグラフィー分離化
学、すなわちアニオン交換及びイオン対逆相がＤＮＡの
ために使用される。アニオン交換においては、固体クロ
マトグラフィーマトリックスは、ＤＮＡの長さに直接関
連する強度でＤＮＡポリアニオンを結合する多くの固定
された正の電荷をその表面上に含む。溶離塩の濃度は、
溶離時間及び密に充填されたマトリックスの円柱カラム
を通過する溶媒の量により通常連続して高められるの
で、ＤＮＡフラグメントは、溶解された塩がマトリック
スへのポリアニオンの結合を弱くするので、上昇するサ
イズのおおよそのオーダーで溶離される。イオン対逆相
分離においては、固体クロマトグラフィーマトリックス
は、その表面上に多くの固定された疎水性基を含み、そ
して溶媒は疎水性テトラアルキルアンモニウム又はトリ
アルキルアンモニウムクロリド、ブロミド又はアセテー
ト塩を含む。アルキルアンモニウムカチオンは、ＤＮＡ
ポリアニオンに弱く結合し、それを電気的に中性及び疎
水性にし、そして疎水性ＤＮＡ−アルキルアンモニウム
複合体は疎水性マトリックスに結合する。水性溶媒にお
ける低い極性有機補助溶媒の濃度は溶離時間にわたって
通常連続的に高められるので、ＤＮＡとマトリックスと
の間の疎水性相互作用は弱くされる。より長いＤＮＡ分
子は小さな分子よりもより強くマトリックスに結合し、
その結果、溶離オーダーは再びおおよそ、分子サイズに
平行し；大きなＤＮＡ分子は、溶離されるべき高い有機
補助溶媒濃度を必要とする。
【００１４】信頼でき、経済的で、感受性のＤＮＡの定
量分析法としてのＨＰＬＣの前記利点にもかかわらず、
分離化学はサイズ分解能、範囲、精度又は正確さの点で
最適でない。イオン対逆相分離は遅く（数時間を要す
る）、しばしば溶離されたフラグメントの比較的低い回
収をもたらし、そしてサイズ−正確同定のためのそれら
の値を危険にさらす、分子サイズの関数としての保持時
間の時々の逆転を与える（Ｅｒｉｋｓｏｎなど．，１９
８６，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．３５９：２６５〜２７
４）。これらの分離のために使用される水性溶媒は、比
較的低い（１／１０3 〜１／１０Ｍ）濃度のトリアルキ
ルアンモニウム（たとえばトリエチルアンモニウム）又
はテトラアルキルアンモニウム（たとえばテトラブチル
アンモニウム）塩を含み、そして５〜５０％の範囲にわ
たって溶離有機補助触媒、たとえばアセトニトリルの濃
度を変える。
【００１５】本発明の前、種々の異なったイオン交換固
体に基づく二本鎖ＤＮＡのアニオン交換ＨＰＬＣ分離
は、分子サイズの関数としての保持時間の時々の逆転を
有し、サイズ精度フラグメント同定のためへのその使用
を妨げる（Ｋａｔｏなど．，１９８３，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇ．２６５：３４２〜３４６；Ｍｅｒｉｏｎな
ど．，１９８８，Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：２
４６〜２５１；Ｋａｔｏなど．，１９８９，Ｊ．Ｃｈｒ
ｏｍａｔｏｇ．４７８：２６４〜２６８；Ｍａａな
ど．，１９９０，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．５０８：６
１〜７３；Ｍｕｌｌｅｒ，１９８６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．１５５：２０３〜２１２；Ｈｅｃｋｅｒな
ど．，１９８５，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．３２６；２
５１〜２６１；及びＷｅｓｔｍａｎなど．，１９８７，
Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６６：１５８〜１７
１）。ほとんどあらゆる場合、分子サイズに基づいて予
測されるよりも長い保持時間をたぶん有するＤＮＡフラ
グメントはまた、異常に高いＡ−Ｔ含有率を有すること
が言及されている。しかしながら、対応策はこの効果の
ために提供されても又は示されてもなく、そして唯一の
理論、すなわちＡ−Ｔに富むＤＮＡの曲率がそれを説明
するために示唆された（Ｈｅｃｋｅｒなど．，前記）。
ほとんどあらゆる場合、溶離塩は、一般的に０．３〜
１．２Ｍの濃度範囲で変えられるＮａｃｌであった。他
のアルカリ金属の塩化物塩も試みられたが、Ｎａｃｌよ
りも改良された性能は有さず、そしていくつかの溶離塩
アニオン、たとえばアセテート、トリクロロアセテー
ト、塩素酸塩及びスルフェートはひじょうに低められた
フラグメント分解能を付与し、又はまったく分離を与え
なかった（Ｗｅｓｔｍａｎなど．，ａｎｄ Ｈｅｃｋｅ
ｒなど．，前記）。
【００１６】塩グラジエントは、１つのアニオン交換固
体に関して、ひじょうに小さなサイズの分解能が５００
塩基対以上で生じる点まで、上昇するサイズのフラグメ
ントを分解するためにますます狭くされるにちがいない
ことが一般的に観察された（Ｗｅｓｔｍａｎなど．，前
記）。この現象は、ＤＮＡ溶離が濃度よりもむしろ塩の
活性により制御されるので生じることが示唆された（Ｍ
ｕｌｌｅｒ，前記）。塩、たとえばＮａｃｌは、塩濃度
が０．１Ｍの範囲で高められるにつれて活性率の低下を
示す。この低下は、塩濃度への塩活性の弱い比例をもた
らし、与えられた活性上昇を得るために必要とされる塩
濃度上昇を高め、そして従って保持時間の塩濃度感度を
低める。しかしながら、０．５〜１．０Ｍの塩濃度範囲
において、活性率はますます塩濃度非依存性になり、塩
活性もより強い塩濃度依存性にし、そして従って保持時
間の塩濃度感度を高める。
【００１７】たった１つの場合において（Ｍｕｌｌｅ
ｒ，前記）、アニオン交換ＨＰＬＣ保持時間に対する温
度の効果が観察された。上昇する温度は、アニオン交換
固体へのＤＮＡ結合の強さを高めるが、しかしその現象
を定量化する努力は行なわれず、又はそれを保持時間精
度のための技術的な必要条件に関係づけなかった。保持
時間精度は従来技術に関係していない。
【００１８】前記再調査は、一部又は完全に単一鎖の核
酸が溶媒及びクロマトグラフィーマトリックスに塩基を
露出し、そして従って強い配列−及び組成物依存性保持
時間を示すので、一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡのＨＰＬＣよ
りも単純であることが予測される二本鎖ＤＮＡのＨＰＬ
Ｃに対して集中された。しかしながら、これらの複雑な
相互作用は、溶離溶媒に有機補助溶媒を含むことによっ
て、塩基と最少に相互作用するクロマトグラフィーマト
リックスを選択することによって、又は塩基のいくつ
か、一般的には１０個以上がアニオン性になるような高
いpHで操作することによって減じられ得る。塩基が負の
電荷を担持する場合、それらの間での塩基の積み重ね及
び水素結合相互作用が弱くされ、そしてその核酸は純粋
にランダムなコイル、すなわちポリマーの長さに直接関
係される半径及び正味の電荷に類似する。有機補助溶媒
は、塩基の積み重ね及び水素結合を弱くすることによっ
て、及び塩基−マトリックス相互作用を弱くすることに
よって、この挙動性単純化を促進する。
【００１９】高いＡ−Ｔ含有率が、分子サイズに基づい
て単純に予測されるよりもより強く、二本鎖ＤＮＡのア
ニオン交換固体への結合を引き起こす傾向が観察される
場合、次の問題が発生する：溶離条件、たとえば温度又
は溶媒組成におけるある単純な変化が、Ａ−Ｔに富むＤ
ＮＡとＧ−Ｃに富むＤＮＡとの間の構造的な差異がその
現象の原因であるもののすべてを削除することができる
か？ Ｍｅｌｃｈｉｏｒ ａｎｄ ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅ
ｌ，１９７３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ７０：２９２〜３０２は、テトラアルキル
アンモニウムイクド塩（特にテトラメチルアンモニウム
塩化物及びテトラエチルアンモニウム塩化物）及び少な
くとも１種のトリアルキルアンモニウム塩（トリエチル
アンモニウム塩化物）がＧ−Ｃに富むＤＮＡとＡ−Ｔに
富むＤＮＡとの間の溶融挙動の差異をひじょうに減じ、
そしてさらに排除できることを示した。しかしながら、
テトラメチルアンモニウムイオン及びテトラエチルアン
モニウムイオンは二本鎖ＤＮＡの安定性に対して劇的に
反対の効果を有し；前者はＴｍを高めるが、後者はＴｍ
を低めた。これらの効果は、ひじょうに高い（２Ｍ以
上）塩濃度で、すなわち核酸のイオン対逆相ＨＰＬＣに
これらの塩が使用される濃度範囲よりも高い１〜２の高
い濃度範囲で最っとも明らかであった。Ｓｈａｐｉｒｏ
など．，１９６９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９：３
２１９〜３２３２は、ポリリシンが好ましくはＡ−Ｔに
富むＤＮＡに結合し、そしてそれを沈澱せしめ、そして
ひじょうに高い濃度でのテトラアルキルアンモニウム塩
の添加がこの選択を破壊し、そしてさらに反対にするこ
とを示した。
【００２０】第２の現象は、テトラアルキルアンモニウ
ムのイオンがまた、好ましくは、Ａ−Ｔに富むＤＮＡに
結合することを包含し；この推測は同様にＭｅｌｃｈｉ
ｏｒａｎｄ ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌの結果を説明する。
Ｓｈａｐｉｒｏなど．，１９６９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ９：３２３３〜３２４１は、いくつかのテトラ
アルキルアンモニウムイオンがＧ−Ｃに富むＤＮＡによ
りもＡ−Ｔに富むＤＮＡにより強く結合することを直接
的に示し、そしてアルカリ金属のカチオンに関しては見
られないこの現象が二重螺旋鎖の主要溝におけるテトラ
アルキルアンモニウムイオンの立体的固定化から生じる
ことを示唆した。Ｏｒｏｓｚ ａｎｄＷｅｔｍｕｒ，１
９７７，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ １６：１１８３〜１
１９９は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチ
ル及びヘキシル基の種々の組合せを含む種々のテトラア
ルキルアンモニウムイオンの二本鎖ＤＮＡ安定性に対す
る効果とプローブすることによって、その立体的解釈を
調査した。アルキル基のサイズの上昇はカチオンのより
ヘリックス−不安定化を引き起こす傾向があり、そして
エチルよりも大きなアルキル基に関しては、Ａ−Ｔに富
む領域を安定化する能力を選択的に減じる傾向があっ
た。
【００２１】二本鎖ＤＮＡのＡ−Ｔに富む領域へのテト
ラアルキルアンモニウム塩及びトリアルキルアンモニウ
ム塩の好ましい結合のこれらの指摘により発生する問題
は、そのような選択がアニオン交換固体に特に強く結合
するＡ−Ｔに富む二本鎖ＤＮＡの傾向を減じることがで
きるかいなかである。アルキルアンモニウムカチオンが
その濃度範囲、たぶん１Ｍ近くで、それらがアニオン交
換マトリックスからＤＮＡを溶離する態様で作用する場
合、それらはアニオン交換ＨＰＬＣをクロマトグラフィ
ー保持時間からのＤＮＡフラグメントサイズの正確な評
価方法にすることができる。さらに、少なくとも１つの
アニオン交換固体のための二本鎖ＤＮＡ親和性が上昇す
る温度と共に上昇する観察（Ｍｕｌｌｅｒ，前記）は、
溶離カチオンとＤＮＡとの及び溶離アニオンとアニオン
交換固体との相互作用がその温度依存性を制御すること
ができることを示唆する。ＤＮＡ−アニオン−交換−固
体相互作用のみがその温度依存性を制御する場合、親和
性は、温度が高められるにつれて低下するであろう。従
って、アルキルアンモニウム溶離塩は、クロマトグラフ
ィー保持時間の温度感度を変えることができる。この温
度感度が低いほど、高い保持時間精度をより容易に達成
することができ、保持時間にのみ基づいてＤＮＡフラグ
メントを同定するＨＰＬＣの能力を改良することができ
る。
【００２２】溶離塩カチオンの選択は二本鎖ＤＮＡのア
ニオン交換ＨＰＬＣのサイズ精度への影響の最良の選択
を有するが、塩アニオンの選択は、分離の質に対して正
又は負の強い効果を有する。上記に示されたように、い
くつかのアニオンは、少なくともいくつかのアニオン交
換固体上でのピーク分解能を減じる。アニオンは、二本
鎖ＤＮＡの安定性に対して深い効果を有し、（Ｒｏｂｉ
ｎｓｏｎ ａｎｄ Ｇｒａｎｔ，１９６６，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２４１：４０３０〜４０４２）；ＤＮＡ
を溶融する傾向がある塩アニオンはＤＮＡのＡ−Ｔ含有
率又は配列に対する保持時間感度を高めることができ
る。アニオン交換固体との塩アニオンの相互作用は、そ
れがアニオン交換工程の全体のエントロピー変化に寄与
するので、保持時間温度依存性に影響を及ぼすであろ
う。これに関しては、アニオン交換固体に弱く結合する
アニオンが好ましい。なぜならば、それらは最少のエン
トロピー変化に寄与するからである。最後に、ＤＮＡア
ニオン交換クロマトグラフィーのための溶離緩衝液にほ
とんど普遍的に使用されるクロリドアニオンは、ＨＰＬ
Ｃポンプ、取付部品、カラム及び管に通常使用されるス
テンレス鋼の腐蝕を促進することが良く知られている。
いづれか他の緩衝アニオンが、ＨＰＬＣのハードウェア
耐久性を改良し、そしてカラム及び分析物のＦｅ（III
）による汚染を最少にすることにおいて好ましい。
【００２３】溶離塩におけるカチオン及びアニオンの組
合せは、さらに他の方法でＨＰＬＣポンプの耐久性及び
維持に影響を及ぼすことができる。少量の溶媒が、移動
部分上で析出物溶離溶媒を漏らす。水が蒸発した後、緩
衝塩が結晶化し、ピストン及びシールを引っかく研磨性
固体を形成する。ＤＮＡのアニオン交換クロマトグラフ
ィーの特に高い溶離塩濃度は、ＨＰＬＣポンプ及びバル
ブに特に損傷を与える。しかしながら、溶離塩は結晶硬
度及び形状において異なりそして従って、研磨能力にお
いて異なり；Ｎａｃｌは特に研磨性であるが、しかしア
ルキルアンモニウムカチオン及びカルボキシレートアニ
オンの塩は柔らかな結晶を形成するはずである。ジアル
キルアミン又はトリアルキルアミンと短鎖脂肪性カルボ
ン酸（たとえば蟻酸及び酢酸）との間のいくらかの塩
は、揮発性である追加の利点を有する。なぜならば、そ
れらの成分の酸及び塩基が揮発性であるからである（テ
トラアルキルアンモニウム塩はこの性質を共有しな
い）。揮発性塩は、たぶんほとんど移動部分を研磨せ
ず、そしてまた、それらが後−ＨＰＬＣ処理を妨害する
場合、クロマトグラフィー処理されたＤＮＡの回収され
たサンプルから容易に除去される。
【００２４】明らかには、ＤＮＡのアニオン交換ＨＰＬ
Ｃのための最適の溶媒組成物は多くの基準を包含し、そ
のいくつかは相互に不適合性である。従来の溶離塩、す
なわちＮａｃｌは多くの理由のために最適でないことが
明確であり、すなわちそれらの理由とは、（１）サイズ
精度を減じる、ＤＮＡのＡ−Ｔ含有率に対する保持時間
感度、（２）サイズ精度を減じるひじょうに高い保持時
間温度感度、（３）減じられた実際のサイズ範囲をもた
らす、ＤＮＡフラグメントサイズの上昇につれての塩濃
度に対する段階的に増強する保持時間感度及び（４）Ｈ
ＰＬＣのハードウェアを化学的及び物理的に損傷を与え
る傾向を包含する。本発明は、これらの関係のすべてを
提供する改良されたＨＰＬＣ溶媒を提供する。
【００２５】発明の要約 第１の観点において、本発明は、アニオン交換固体、特
に粒状のクロマトグラフィー用マトリックスからの核
酸、特に二本鎖ＤＮＡの塩グラジエント溶離のために最
適化された溶媒を含んでなる。この溶媒の実質的な成分
は、（ａ）ジ、トリ又はテトラ−アルキルアンモニウム
カチオン及び種々のモノアニオン、たとえばホルメー
ト、アセテート、過塩素酸塩、ニトレート、クロリド、
ブロミド、メタンスルホネート及びエタンスルホネート
のいづれかを含んで成る、０．５〜１．５Ｍの濃度範囲
での溶離性、及び（ｂ）約０．０５Ｍよりも高くない濃
度で存在し、そして約４〜約８の間の溶媒pHを調節す
る、約３．５〜８．５の範囲のpKa の緩衝酸である。好
ましくは、緩衝酸はカチオン性であり、その結果、その
接合体塩基はアニオン交換固体に結合しない。本発明の
この観点の１つの態様はまた、核酸を含んで成る。もう
１つの態様は、製造、貯蔵、輸送のために便利なアニオ
ン交換溶媒の濃縮形を含んで成る。
【００２６】第２の観点において、本発明は、核酸を伴
って、又は伴わないで、アニオン交換溶媒とアニオン交
換固体、特に合成有機ポリマー性主鎖を有する固体との
組合せを含んで成る。第３の観点において、本発明は、
分子サイズで異なる核酸のアニオン交換分離のための塩
グラジエント溶離方法を含んで成り、ここで前記核酸は
アニオン交換固体に結合され、そして次に、溶離塩濃度
が時間と共に高められるような態様で本発明の第１の観
点の一連の溶媒により洗浄される。溶出の後、前記溶媒
は、ＵＶ吸光度により核酸について分析される。
【００２７】好ましい態様の記載 本発明の利点 本発明は、核酸、特に二本鎖ＤＮＡのアニオン交換分離
及び分析のために従来技術よりも少なくとも４種の改良
点を提供する。
【００２８】（１）核酸、特に二本鎖ＤＮＡが核酸の塩
基組成又は塩基配列並びにその長さに依存するオーダー
でアニオン交換固体から溶離されることが通常観察され
る。しばしば、長さに厳密に基づく分離が、特定の核酸
フラグメントを同定する方法として最っとも所望され
る。本発明のアニオン交換溶媒は、信頼できる同定を可
能にする長さ依存性分離を調和して付与する最初の溶媒
である。それらは、サイズ依存性ＤＮＡ同定の最適態様
としてゲル電気泳動に代わるＨＰＬＣのような早く、自
動化された、定量的に正確なアニオン交換方法を可能に
する。ゲル電気泳動は、ＨＰＬＣよりもより遅く、より
集中的な労力を要せず、定量的に低く、そして一般的に
低い信頼性のものである。
【００２９】（２）クロマトグラフィー溶離プロフィー
ルにおける位置に基づく信頼できるＤＮＡフラグメント
同定は、種々のサンプルがクロマトグラフィー処理され
る場合、その位置が再現され得る精度に依存する。特に
合成有機ポリマーアニオン交換固体に基づく二本鎖ＤＮ
Ａのアニオン交換分離は、従来の溶離塩；すなわちＮａ
ｃｌが使用される場合、非常に温度感受性である。必要
とされる溶離精度を得るために十分に密接にクロマトグ
ラフィー分離をサーモスタット制御することは困難であ
る。本発明の溶媒は、溶離の温度感受性をひじょうに減
じ、ひじょうに正確なサーモスタット制御を必要とする
ことによるクロマトグラフィー装置の出費を高めない
で、核酸分子サイズの評価に高い精度を提供する。
【００３０】（３）二本鎖ＤＮＡの塩グラジエントアニ
オン交換分離は、拡大するサイズのＤＮＡフラグメント
を分解するためにますます狭いグラジエントを必要とす
る。溶離塩としてＮａｃｌを用いての従来の溶媒による
長さ約１０3 個以上の塩基対のフラグメントの溶離は、
その塩グラジエントは従来のクロマトグラフィー装置に
より正確に制御されるには狭過ぎるので、良好でないサ
イズ分解能を有する。本発明のアニオン交換溶媒は、溶
離塩濃度感度が核酸分子サイズと共に上昇し、アニオン
交換クロマトグラフィーが許容できる分解能を有する実
際のサイズ範囲を拡張する程度を減じる。
【００３１】（４）アニオン交換固体からの二本鎖核酸
の従来のＮａｃｌグラジエント溶離は、異なったサイズ
のフラグメントのために同一の温度感受性を示す。この
現象は、異なったサイズのフラグメントの分解が溶離温
度を変えることによって改良され得ないことを包含す
る。本発明の溶媒は、大きなフラグメントに対して高い
溶離温度感受性を付与し、溶離温度を高めることによっ
て分解能の単純な改良を可能にする。
【００３２】定義 核酸は、１つのペントースの５′−ＯＨを次のペントー
スの３′−ＯＨとの間をホスホジエステル結合でのホス
ホリル基により連結されるペントースのオリゴマー又は
ポリマーを含んで成り、そして個々のペントースは、第
１炭素原子に対するグリコシド結合に芳香族複素環式
“塩基”を担持する。ペントースがリボースである場
合、核酸はＲＮＡである。ペントースが２−デオキシリ
ボースである場合、核酸はＤＮＡである。核酸ポリマー
の末端でのいづれかのホスホリル基を除く個々のホスホ
リル基は、約２〜３以上のpH値で単一の負の電荷を担持
し、その結果、核酸の全体の負の電荷は、ヌクレオチド
（ｎｔ）又は塩基対（ｂｐ）の単位でしばしば表わされ
るその長さにほぼ比例する。広範囲の種類の塩基のいづ
れかがペントースに結合され得るが、しかしたった５
種：アデニン（“Ａ”）、チミン（ＤＮＡにおいてのみ
“Ｔ”）、ウラシル（ＲＮＡにおいて“Ｕ”）、グアニ
ン（“Ｇ”）及びシトシン（“Ｃ”）が天然に存在する
ＤＮＡ及びＲＮＡにおいて優勢に存在する。
【００３３】ＲＮＡは通常、単一のリボヌクレオチドポ
リマー鎖から成る。一本鎖ＤＮＡは単一のデオキシリボ
ヌクレオチドポリマー鎖である。しかしながら、相補的
塩基配列の２つのＤＮＡ鎖は二本鎖ＤＮＡを形成するた
めに二量体化することができる。ほぼ相補的な塩基配列
のＤＮＡ及びＲＮＡ鎖は、二本鎖ＤＮＡに構造的に類似
するＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成するために二量
体化することができる。しばしば、個々のＲＮＡ又はＲ
ＮＡ鎖は、局部的な二本鎖領域を形成するために折りた
たみを可能にするポリマー鎖の種々の部分においてほぼ
相互に相補する塩基配列を有する。塩基は相補的に単純
な規則を従がえる：ＡはＴ又はＵと対合し；ＧはＣと対
合し；最高の安定した二本鎖構造は、２つの鎖が、１つ
の鎖の５′−ＯＨが他の鎖の３′−ＯＨに対して塩基相
補性であるように“逆平行”配向を有する場合に生じ
る。
【００３４】アニオン交換分離は、１つの相、通常固体
（但し時々液体である）における固定された正の電荷
が、第１相と接触する第２相、通常液体における負の分
子を結合する工程である。結合された負の分子は、２つ
の相の単純な分離により第２相における電気的に中性又
は正の分子から分離され得る。それらは、新規組成物
が、第１相へのより強く結合されたアニオンの誘引を弱
めるよりも一層、第１相へのより弱く結合されたアニオ
ンの誘引を弱めるように、元の第２相からの異なった組
成の新鮮な液体と第１相とを接触することによってお互
い分離され得る。結合されたアニオンは、新しい液体が
第１相からそれを置換することで続く場合に“溶離”さ
れる。第２相が、第１相に結合するアニオンをより強
く、漸進的に妨害する液体により反復して置換される場
合、その工程は“グラジエント溶離”と呼ばれる。溶離
液体が逐次的段階におけるよりもむしろ時間にわたって
滑らかに組成において変えられる場合、グラジエント溶
離は、“連続的”であり；他の場合、それは“段階的”
溶離である。
【００３５】好ましくは、第１相は固体である。この
“アニオン交換固体”は、そのサイズ、形状、多孔性及
び機械的性質を定義する電気的に中性の“主鎖”材料及
び好ましくはその主鎖に共有結合される正に荷電された
“官能基”から成る。主鎖材料の３種の最っとも通常の
種類はシリカ、多糖類及び合成ポリオレフィンであり；
２種の主なポリオレフィンサブクラスはポリスチレン及
びポリアクリル酸樹脂である。後者は、種々の置換され
たアクリル酸アミド（“ポリアクリルアミド”）及びア
クリル酸エステル（“ポリアクリレート”）のポリマー
を含んで成り、ここでアクリル酸モノマーは２−又は３
−位置の炭素原子上にアルキル置換基を有しても良く又
は有さなくても良い。前記２種の最っとも通常の陽性官
能基は、主鎖に共有結合されるジエチルアミノエチル
（ＤＥＡＥ；〔（ＣＨ3 ＣＨ2 ）2 Ｎ−ＣＨ2 −ＣＨ2
−〕n ）及び主鎖に共有結合され得るか又は非共有的に
吸着され得るかのポリエチレンイミン（ＰＥＩ：〔−Ｃ
Ｈ2 ＣＨ2 ＮＨ−〕n ）である。アニオン交換固体を接
触する液体が約９〜１１以下のpHの水性溶媒である場
合、ＤＥＡＥ及びＰＥＩの窒素原子はプロトン化され、
そして従って正に荷電される。pHが低くなれば、官能基
の多くの画分がカチオンになる。与えられたアニオン交
換固体におけるほとんどの官能基が正に荷電されるpH領
域は、主に主鎖の構造及び主鎖の表面上の官能基の密度
に依存する。
【００３６】最っとも通常には、アニオン交換分離にお
いては、溶離液体は水性電解質であり；そしてグラジエ
ント溶離は水に溶解される完全に解離された塩の濃度を
高めることによって達成される。アニオン交換溶媒にお
ける溶離塩濃度の上昇は、アニオン交換固体へのアニオ
ン、たとえば核酸の結合を弱める。本発明の目的のため
には、０．５〜１．５Ｍのおおよその濃度範囲で存在す
る溶離塩は、ジ、トリ又はテトラアルキルアンモニウム
カチオン及び種々のモノアニオン、好ましくはホルメー
ト、アセテート、クロリド、グロミド、ニトレート、過
塩素酸塩、メタンスルホネート、リン酸二水素又はエタ
ンスルホネートのいづれかから成る。好ましくは、アン
モニウムカチオン上のアルキル基はメチル又はエチル基
であり、そしてメチル基が最っとも好ましい。メチル及
びエチル基の両者を含むカチオンもまた可能であるが、
しかしたった１つの又は他のアルキル基を含むカチオン
よりも調製するのに困難である。溶離塩は、溶離溶媒を
製造するために水に溶解される固体として調製され得、
又は溶離塩の溶液は、アルキルアミン又はアルキルアン
モニウム水酸化物の水溶液と共にプロトン化されたモノ
アニオン（たとえば蟻酸、酢酸、塩酸）から成る酸を理
論的な等モル量で混合することによって調製され得る。
【００３７】アニオン交換溶媒は、溶解されたアルキル
アンモニウム塩を含むだけでなく、また、所望するpHを
達成するために十分な塩基と一緒に、約３．５〜約８．
５の間の pKa（酸分子の半分が陽子を失っているpH）を
有する弱酸を添加することによって、約４〜約８のpHで
緩衝化される。好ましくは、緩衝酸濃度は約０．０５Ｍ
を越えないであろう。また好ましくは、緩衝酸はそれ自
体カチオン性であり（すなわち、それは緩衝酸カチオン
及びもう１つの酸、通常、強い無機酸のアニオン性複合
塩基の塩として供給され得る）、その結果、その複合塩
基はアニオン性ではない。アニオン性緩衝複合塩基は、
所望する値からpHを低める手段で、アニオン交換固体に
結合することができる。特に好ましい緩衝酸は、Ｇｏｏ
ｄなど．，１９６６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５：
４６７〜４７７により記載される“両性イオン緩衝液”
により供給され、そして現在、生化学試薬会社から高純
度で入手できる。
【００３８】好ましいアニオン交換分離方法は、“クロ
マトグラフィー”であり、ここで通常、粒状形でのアニ
オン交換固体が、初期結合反応のために前記固体に核酸
を運び、そして溶離塩濃度が高められるにつれて前記固
体からそれらを効果的に除去する連続的に流れるアニオ
ン交換溶媒と接触せしめられる。粒状アニオン交換固体
は好ましくは、円柱状のカラムに充填され；溶媒がカラ
ムの一端から他端に流れる。液体クロマトグラフィーの
特に好ましい態様はＨＰＬＣであり、ここでアニオン交
換固体粒子はひじょうに小さく（通常直径２〜１０μ
ｍ）、そして高圧（数百〜数千ポンド／平方インチ）が
カラムを通して溶媒に力を加えるのに必要とされるほど
密接して充填される。そのような小さな粒子は、数分の
時間的規模で分離を可能にする、アニオン交換結合及び
溶離反応をひじょうに急速に受け、そしてこれはさら
に、１〜２オーダーの大きさの範囲の長さ（たとえば５
０〜５００又は５，０００個の塩基対）の多くの異なっ
た核酸種のお互いからの分離を可能にする。
【００３９】発明を実施するための態様 二本鎖ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド又は一本
鎖ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る核酸は、有機化学者、生
化学者及び分子生物学者に良く知られた多くの方法のい
づれかによりアニオン交換クロマトグラフィーのために
調製される。ＤＮＡ又はＲＮＡは、良く知られ、そして
商業的に利用できる方法により固相上に通常調製される
合成物であり得る。それは、天然に存在し又は人工的に
生長せしめられた生物（生存又は死んだ）、たとえば疾
病の診断又は予後、たとえば治療のモニターのために収
集される動物又はヒトの臨床的試験サンプルに得られる
生物又は細胞から単離され得る。核酸のクロマトグラフ
ィー分析は、試験サンプルが比較的少ない種類の及び明
確な核酸種を含む場合、有益に単純化され、その結果、
溶離プロフィールは、ＵＶ吸光度の低いハックグラウン
ド上で目だつ容易に解決でき、そして同定できるピーク
から成る。
【００４０】クロマトグラフィー分析のためにＤＮＡを
提供する好ましい手段は、通常知られており、そして実
施されているポリマラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、すなわち
１又は数個の特定の核酸配列、通常５０〜１，０００bp
の大きさの範囲での分子の数をひじょうに増幅する方法
であり、この方法は好ましくはサイズに基づくアニオン
交換ＨＰＬＣ分離のために適切である。ＰＣＲ方法は、
アメリカ特許第４，６８３，１９５号；第４，６８３，
２０２号；第４，８００，１５９号；第４，８８９，８
１８号及び第４，９６５，１８８号（これらは引用によ
り本明細書に組込まれる）により詳細に記載されてい
る。いづれか単一のＰＣＲは、特に１９９０年２月１６
日に出願されたアメリカ特許第４８１，５０１号（引用
により本明細書に組込まれる）に記載されるワックス蒸
気バリヤーを使用するＨｏｔ Ｓｆａｒｔ（ＴＭ）法に
より行なわれる場合、約１／１０10Ｍ〜１／１０7 Ｍ
の、クロマトグラフィーピークのＵＶ吸光度検出のため
に必要とされる正確な濃度範囲で、１又は数個のＤＮＡ
フラグメントを生成する傾向がある。実際、本発明は、
特にアメリカ特許第４８１，５０１号と組合して、アニ
オン交換ＨＰＬＣを、分子サイズに基づいてのＰＣＲ生
成物の同定及びＰＣＲ生成物の収量の定量化のための最
適な方法にする。アニオン交換ＨＰＬＣ分析のために適
切な核酸を供給するための、単独又はＰＣＲと一緒に使
用されるもう１つの好ましい方法は、制限エンドヌクレ
アーゼによる消化であり、この方法は、比較的均質のＤ
ＮＡのために、限定された及びしばしば低い数の良く定
義されたフラグメントを生成する。
【００４１】本発明のためには、アニオン交換固体に適
用される試験サンプル核酸は、その試験サンプルが、ア
ニオン交換固体に核酸をできるだけ堅く結合し、又は対
象の核酸を溶離するために効果的な同じ塩濃度範囲でア
ニオン交換固体から溶離される実質的な量のＵＶ−吸光
物質を含む場合、有意に精製されない。そのような妨害
物質が存在する場合、それらは、いづれか通常利用でき
る分子生物学技法のマニュアルに記載されるように、フ
ェノールクロロホルム抽出及びエタノール沈殿法により
除去される。好ましくは、アニオン交換固体に適用され
るサンプルは、アニオン交換固体を被覆し、又は詰まら
せる粒状物質を除去するために処理されるであろう。粒
状物を除去するための好ましい方法は、約０．４５μｍ
よりも大きくない孔サイズを有するフィルターを通して
の注射器駆動性及び遠心分離器駆動性通過及びたとえば
マイクロ遠心分離による少なくとも１０，０００ rpmで
少なくとも５分間の単純な遠心分離を包含する。濾過は
遠心分離のみよりも好ましく；両方法は化学者、生物学
者及び分子生物学者に良く知られている市販の多くの装
置及び使い捨て装置のいづれかにより行なわれ得る。試
験サンプル調製の最後の詳細は、好ましくは核酸がグラ
ジエント溶離の出発溶媒に組成上近い溶媒に溶解される
べきであることである。
【００４２】クロマトグラフィー分析物が二本鎖ＤＮＡ
であるが、しかし試験サンプルがＲＮＡ又は一本鎖ＤＮ
Ａを含むことが予測される場合、２つの好ましい方法
が、前記分析物の溶離プロフィールと前記後者の２種の
タイプの核酸との実質的な妨害を最少にするために存在
する。１つの態様は、まず、同じ酵素による消化から二
本鎖ＤＮＡを保護するために、分子生物学において良く
知られた酸素濃度、温度及び緩衝組成物条件下で、ＲＮ
Ａに対して特異的なヌクレアーゼ（たとえばＲＮアーゼ
又はＲＮアーゼＴ１）又は一本鎖ＤＮＡに対して特異的
なヌクレアーゼ（たとえばアスペルギラス オリザエ
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）からのヌク
レアーゼＳ１又はヤエナリ（ｍｕｎｇ ｂｅａｍ）のヌ
クレアーゼ）により試験サンプルを処理することから成
る。
【００４３】他の態様は、この結合特異性を強化する溶
媒及び温度条件下で一本鎖ＤＮＡを結合する固体材料と
試験サンプルとをまず接触することから成る。次に、Ｒ
ＮＡ又は一本鎖ＤＮＡが結合している固体材料が残存す
る液体試験サンプルから除去される場合（たとえば、遠
心分離又は濾過により）、その試験サンプルはアニオン
交換固体への適用のために準備できている。好ましく
は、この接触は、クロマトグラフィー溶離に使用される
第１溶媒とほぼ同じ組成の溶媒（たとえば約０．５〜
１．０の濃度範囲でジアルキルアンモニウム、トリアル
キルアンモニウム又はテトラアルキルアンモニウム塩を
含む）で行なわれる。
【００４４】ＲＮＡ及び一本鎖ＤＮＡの特異的結合のた
めの好ましい固体は、膜の形で通常利用できるニトロセ
ルロース及び固体支持体に共有結合されるアラルキルア
ミンのいづれかである。そのようなアラルキルアミンの
例は、フェニルエチルアミン、フェニルプロピルアミ
ン、フェニルブチルアミン及びナフチルエチレンジアミ
ンである。特に便利な固体支持体は、粒状の、エポキシ
ド由来の多孔性又は非多孔性アクリルマトリックス、た
とえばＡｌｌｔｅｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎ
ｃ．により供給されるＨＥＭＡ−１００ＥＨ Ｂｉｏで
ある。アラルキルアミンは、Ａｌｌｔｅｃｈにより供給
される指示に従って、エポキシド担持の支持体と反応せ
しめられ得る。市販の固定化されたアラルキルアミンは
フェニルブチルアミンＥｕｐｅｒｇｉｔ（Ｒｏｈｍ Ｐ
ｈａｒｍａ）である。しかしながら、それは、アラルキ
ルアミン変性のエポキシド担持性ＨＥＭＡに比べて、劣
っている能力、結合運動学及び耐性を有する。試験サン
プル処理のために使用される固体支持体の量は、固体か
ら処理されたサンプルの回収を増強するために、予備試
験サンプルの手探り試験の後、最少化され得る。
【００４５】ＨＰＬＣ分析が二本鎖ＤＮＡであり、妨害
性ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡがたぶん存在し、そして前記
処理がたぶん有益である試験サンプルの１つの種類は、
ＰＣＲ生成物である。初期ＰＣＲ標的がゲノムＤＮＡに
含まれる場合、そのゲノムＤＮＡは実質的に、ＰＣＲ熱
循環の最後までに一本鎖化されるであろう。ＰＣＲ増幅
のための試験サンプルはしばしば、同様にＲＮＡを含
む。ＰＣＲ生成物はまた、一本鎖合成オリゴヌクレオチ
ドである天然プライマーを伴う。
【００４６】本発明のアニオン交換溶媒は、標準の化学
的除去により脱イオン又はガラス蒸留水中において製造
される。いくつかの溶離塩、たとえばテトラメチルアン
モニウムクロリドは、ひじょうに精製された固体として
市販されている。しかしながら、多くは、等モル量の市
販の塩基、たとえばトリメチルアミン及びテトラメチル
アンモニウム水酸化物、及び酸、たとえば蟻酸、酢酸、
硝酸、過塩素酸、メタンスルホン酸及びスルホン酸を混
合することによって調製され得る。成分である酸及び塩
基のモル濃度は、分析化学の従来の方法により標準化さ
れた酸又は塩基により指示薬又は電位差エンドポイント
に滴定することによってあらかじめ決定され得る。多く
の市販のアルキルアンモニウム塩は吸湿性であり、そし
て多くの酸及び塩基は種々の濃度の濃縮水溶液として供
給されるので、溶媒調製物の精度は、注意して滴定され
た成分から製造される溶液の導電性、密度又は屈折率の
注意した測定により促進される。次に、後者の溶液は、
これらの容易に測定された物性の記録された値を適合す
るために集中的に調製され得、酸−塩基滴定の労力のか
かる方法を回避する。
【００４７】本発明の溶媒における溶離塩の最終濃度は
０．５〜１．５Ｍの間であろう。溶離塩アニオンが強酸
の複合塩基（たとえばブロミド、クロリド、ニトレー
ト、過塩素酸酸塩、メタンスルホネート及びエタンスル
ホネート）である場合、溶離塩は４〜８pH範囲での少々
の効果的な緩衝能力を提供する。従って、所望するpHの
１pH単位（好ましくは１／２pH単位）以内の pKaを有す
る追加の緩衝酸が溶媒に添加され、好ましくは０．０１
〜０．０５Ｍの範囲での最終濃度が達成される。特に好
ましい緩衝酸は、Ｇｏｏｄなど．，１９６６，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ５ ：４６７〜４７７により記載される合成両性イオン緩
衝液、又はそれらの複合塩基（アミン）の塩、たとえば
ピペラジニウムクロリド、メチルピペラジニウムクロリ
ド及びエチレンジアミンジヒドロクロリドとして供給さ
れるカチオン性酸種（プロトン化されたアミン）であ
る。十分な追加の塩基は、４〜８の所望するpHに希釈緩
衝酸を調節するために添加されるべきである。溶媒から
すべての塩化物を排除することが所望される場合、同等
の緩衝は、所望するpH値を達成するために、溶離塩を調
製するために使用される十分な酸と塩基性アミン（たと
えばピペラジン又はエチレンジアミン）とを組合すこと
によって得られる。低いpH値は、たぶん二本鎖ＤＮＡを
変性し、そしてＡ，Ｇ，及びＣ塩基上に正の電荷を付与
する。高いpH値は、官能基が第１、第２又は第３アミン
（たとえばジエチルアミノエチル基及びポリエチレンミ
ミン）であるアニオン交換固体の正味のカチオン電荷を
減じる傾向がある。８以上のpH値は、第４アミン官能基
で担持するマトリックス上で、アニオン交換分離が行な
われる場合、不必要であるが、しかし約１０以上のpH
は、二本鎖ＤＮＡがそれらの高いpH値で変性する傾向が
あるので、すべてのアニオン交換固体上での二本鎖ＤＮ
Ａ分離のためには不都合である。アニオン交換固体がシ
リカ主鎖を有する場合、約８（好ましくは７）以上の溶
媒pH値は、それらが主鎖を溶解するので、回避されるべ
きである。
【００４８】本発明のアニオン交換溶媒はまた、添加
物、たとえば低濃度でのキレート剤（たとえば０．１〜
１０mMの濃度範囲でのＥＤＴＡ又はＤＴＰＡ）又は有機
補助溶媒、たとえば０．１〜１０％の濃度範囲でのアセ
トニトリル、ホルムアミド及びＮ−メチルピロリバンを
含むことができる。キレート剤は、核酸調製に通常見出
され、そして核酸に堅く結合されるMg2+のアニオン交換
分離での妨害を防ぐことができる。それはまた、Fe（II
I ）酸化状態の錯イオンとして通常存在する遍在性汚染
物である偶発的な鉄が、溶解されたＯ2 による核酸酸化
及び分解を触媒することを防ぐことができる。鉄触媒の
酸化反応を阻止するための特に好ましいキレート剤は、
Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙにより製造され、そしてＳｉｇｍ
ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，により売られているデ
フェロキサミンメシレートであり；０．１mM濃度のこの
化合物が適切に保護性である。有機補助溶媒は、厳密に
サイズ依存性分離、より厳密には、二本鎖ＤＮＡよりも
一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを妨害する、核酸とアニオン交
換固体との間の非イオン性相互作用の阻止を助けること
ができる。そのような阻止のための必要性は、アニオン
交換固体の主鎖の正確な化学に依存する。有機補助溶媒
の回避は、それらが通常、酸化的活性鉄により汚染され
るので、好ましい。
【００４９】（ａ）０．５〜１．５Ｍ濃度でのアルキル
アンモニウム溶離塩の存在及び（ｂ）３．５〜８．５の
pKaを有する０．０１Ｍの緩衝酸により供給される緩衝
液に少なくとも同等の、pH４〜８の範囲の緩衝液の他
に、本発明のアニオン交換溶媒は溶離された核酸の分光
光度アッセイを可能にするために、次の第３番目の必要
条件：特に２６０nm近くでの十分なＵＶ透明度を満足す
べきである。蒸留水に対する０．０１以下の２６０nmで
の吸光度（１cmの路の長さ）が好ましく、二成分グラジ
エント溶離における両緩衝液がほぼ同じ吸光度を有する
限り、０．０１〜０．１の吸光度は許容できる。厳密な
吸光度遮断は存在しないが、吸光度が約０．１を越える
程度は、ひじょうに少量の核酸を分析する能力を制限す
る。従って、アニオン交換溶媒を調製する重要な部分
は、色彩形成反応、主に縮合及び酸化を好まない条件下
でＵＶ−透過成分の獲得及び成分及び最終溶媒の貯蔵で
ある。好ましい条件は、暗やみ、低温度及びそれらの水
性含有物中へのＵＶ−吸収性材料（主に酸化防止剤）を
それ自体浸出せしめないプラスチック容器の使用であ
る。好ましくは吸収された酸化活性金属、たとえば鉄を
除去するために、強い無機酸、たとえばＨＮＯ3 に飽和
させた後、ガラス容器が許容できる。色彩形成を最少に
することにおいては、本発明の溶媒が有機補助溶媒を含
み、そして０．０５Ｍ又はそれ以下、好ましくは０．０
２Ｍよりも高くない緩衝液濃度に緩衝酸を制限すること
が好ましい。溶媒pHが約７〜約４の間であり、又は第四
アンモニウム官能基がアニオン交換固体に使用される場
合、塩におけるpH緩衝のための必要性は最少である。
【００５０】本発明のアニオン交換溶媒のいくつかの処
理は、ＵＶ−吸収性不純物を除去するために及び多くの
そのような不純物の生成を遅くするために有用である。
ＵＶ−吸収性不純物は実質的に芳香族有機化合物から構
成され、それはそのような化合物を選択的に吸着する固
体と溶媒とを接触することによって除去され得る。その
ような固体は、木炭、ピーズ化されたマクロ網状ポリス
チレン−ジビニルベンゼン樹脂、たとえばＸＡＤ−２，
ＸＡＤ−１６及びＸＡＤ−４、及びアクリル酸樹脂、た
とえばＸＡＤ−７及びＸＡＤ−８（Ｒｏｈｍ ａｎｄ
Ｈａａｓ）、及び高温分解されたビーズ化マクロ網状ポ
リスチレン−ジビニルベンゼン樹脂、たとえばＡｍｂｅ
ｒｓｏｒｂ（Ｒ）ＸＥ−３４０，ＸＥ−３４７及びＸＥ
−３４８（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ）を包含する。
【００５１】溶媒着色（ＵＶにおいて）が製造及び貯蔵
の間、酸化副反応に起因する限り、それは、不純物とし
て存在し、そして溶媒における溶解された酸素により溶
媒成分の酸化を触媒することを担当する酸化活性遷移金
属、主にFe,Cr, Co及びCuの吸着性除去により減じられ
得る。遷移金属汚染物を除去する好ましい態様は、溶媒
又はそれが製造される成分とキレート固体とを接触せし
めることである。市販のキレート固体は、Chelex20及び
100(BioRad Laboratories), Amberlite(R)IRC-718(Rohm
and Haas), Chelite(R)C, N及びP(Serva Biochemical
s), Duolite(R)ES346, ES466 及びES467(Chemical Proc
ess Co.), Bio-Rex and Chelex Chelating Membranes(B
io-Rad Laboratories) 及びChelating Sepharose Fast
Flow(Pharmacia LKB Biotechnology)を包含する。
【００５２】溶媒又はそれらの成分と芳香族化合物を選
択的に結合する固体との接触は、溶媒における懸濁され
た固体又は成分の水性濃縮物を攪拌し、続いて固体の沈
降及び上清液体のデカント又は濾過により達成され得
る。他方、固体が円柱状カラムに充填され、そしてこの
カラムを通して、溶媒又は溶媒成分の溶液が、溶媒から
の不純物の完全な除去がもたらされる十分に遅い速度で
通される。いくらかの吸着性固体がフィルター形での多
孔性プラスチックマトリックスに埋封されて利用され、
その結果、効果的な接触が、比較的低い適用圧力下でフ
ィルターを通してのアニオン交換溶媒の通過のみを必要
とする。
【００５３】アニオン交換溶媒調製の最終的な有用態様
は、好ましくは減菌フィルター及び受容体を用いて、
０．２２μｍよりも大きくない呼称孔サイズのフィルタ
ーを通しての真空又は圧力下でのマイクロ濾過である。
特に好ましいフィルター材料は、Ａｎｏｔｅｃ Ｓｅｐ
ａｒａｔｏｏｎｓにより製造され、そして多くの実験用
試薬及び装置供給者により売られている０．０２μｍの
孔サイズのアルミナハネカム膜である。そのような濾過
は、クロマトグラフィー装置に損傷を与える粒状材料を
除去するだけでなく、また溶媒成分を代謝することがで
きる細菌を除去することによって溶媒の貯蔵寿命を拡張
する。
【００５４】本発明のアニオン交換溶媒及び方法は、当
業者に良く知られており、そして商業的な試薬及び装置
市場により多く支持される種々の溶離型（イソクラティ
クな、段階的グラジエント、連続グラジエント、塩グラ
ジエント、pHグラジエント）で、多くの異なったアニオ
ン交換固体（膜、フェルト、紙、大きな粒子、小さな粒
子、多孔性粒子、非多孔性粒子、球状粒子、不規則粒
子）に供給され得る。しかしながら、平均約２〜１０μ
ｍの小さなアニオン交換粒子に基づく分析的なＨＰＬＣ
分離が、本発明の改良点から最っとも十分に利益を受け
る。
【００５５】ＨＰＬＣ装置の最っとも重要な成分は、カ
ラム及びその充填物である。分析的な分離のためには、
カラムの内径は１０mmを越えず、そして好ましくは、５
mmを越えず；カラムの長さは５０mmを越えず、そして１
０mmほどの短さであり得る。最っとも好ましい充填物
は、４．６×３５mmのステンレス鋼カラムに充填される
“ＤＥＡＥ−ＮＰＲ”としてＴｏｓｏｈ Ｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎにより製造され、そしてＳｕｐｅｌｃｏ，ｔ
ｈｅＮｅｓｔ Ｇｒｏｕｐ及びｔｈｅ Ｄｅｒｋｉｎ−
Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより売られてい
る、ジエチルアミノエチル官能基を担持する２．５μｍ
の直径の非多孔性有機ポリマー（アクリル）材料であ
る。４．６×５０又は１５０mmのステンレス鋼に充填す
る“ＰＬ−ＳＡＸ”としてＰｏｌｙｍｅｒＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄにより製造され、そして
Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ｔｈｅ
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、
及びＰｅｒ Ｓｏｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓに
より売られている、親水性ポリマーにより被覆され、そ
して第四アンモニウム基を担持する８μｍの直径の多孔
性（１０００Ａ又は４０００Ａの呼称孔サイズ）ポリス
チレンマトリックスは前記のものより好ましくない。ま
た、４×５０mmのプラスチックカラムに充填される“Ｐ
ｒｏＰａｃＰＡ１”又は“ＮｕｃｌｅｏＰａｃ ＰＡ−
１００”としてＤｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
により製造され、そして売られている、第四アンモニウ
ム官能基を担持する０．２μｍの非多孔性ポリスチレン
ビーズにより被覆される１０μｍの直径の非多孔性ポリ
スチレン球体から成る球状粒子は前記のものより好まし
くない。また、４×５０mmのステンレス鋼カラムに充填
されるそれぞれ“Ｎａｃｌｅｏｇｅｎ ４０００−７”
又は“Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ４０００−７”としてＭａ
ｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌにより製造され、そしてＲａｉ
ｎｉｎにより売られている、ジエチルアミノエチル担持
のシラン又はポリエチレンイミンにより共有被覆される
７μｍの直径の多孔性（４０００Ａの呼称孔サイズ）シ
リカ材料は前記のものより好ましくない。また、４．６
×１００mmのステンレス鋼カラムに充填される“Ｇｅｎ
−Ｐａｋ ＦＡＸ”としてＷａｔｅｒｓ Ｃｈｒｏｍａ
ｔｏｇｒａｐｈｙＤｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｌｌｉ
ｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造され、そ
して売られている、ジエチルアミノエチル官能基を担持
する２．５μｍの直径の非多孔性アクリル酸ポリマービ
ーズは前記のものより好ましくない。プラスチックの末
端取付部品を有する５×５０mmのガラスカラムに充填さ
れる“Ｍｏｎｏ−Ｑ”としてＰｈａｒｍａｃｉａ ＬＫ
Ｂにより製造され、そして売られる、第四アミン官能基
を担持する１０μｍの直径の多孔性（４００〜６００Ａ
の呼称孔サイズ）アクリル酸ポリマー材料はまた、前記
のものより好ましくない。
【００５６】ＨＰＬＣ分析物がポリマラーゼ鎖反応又は
分析規模の制限酵素消化の二本鎖ＤＮＡ生成物である場
合、上記の市販のアニオン交換カラムは、理想的にはＤ
ＮＡ種のサイズによる急速な分析及び同定には適切でな
い。それらはすべて大き過ぎるので、特にグラジエント
溶離が２〜１０分の時間規模に基づいて行なわれる場
合、有意なピークの広がりが生じる。分析用ＰＣＲ及び
制限消化の規模はひじょうに小さいので、ＨＰＬＣカラ
ム上に注入される得られるＤＮＡの量はめったに１μｇ
を越えず、そしてしばしば１ngに近く、従ってそれらの
カラムのはるか能力以下である。さらに、これらのカラ
ムのすべては、全体のカラム層断面にわたって均質に多
孔性である末端フリットを使用する。この企画は、ピー
クの広がりを引き起こす。なぜならばカラムの上部に入
る溶媒が、端でよりも中央でより急速に流れるので、均
等な速度で全体の末端フリットを通して押し流さないか
らである。この流れのパターンは、層の端近くのＨＰＬ
Ｃ吸着剤に結合する分析物の、カラム軸近くに結合する
分析物よりもよりゆっくりした溶離を引き起こす傾向が
ある。これらのカラムの企画の問題の最適な解決法は次
の通りである。クロマトグラフィー用樹脂が、約２mm〜
６mmの直径及び約１０mm〜約３０mmの長さを有する円柱
状カラムに、クロマトグラフィー業界において良く知ら
れている方法により充填されるべきである。これらのカ
ラムは、底部末端フリット（その多孔性部分は完全にそ
の層断面を被覆する）及び上部末端フリット（その多孔
性部分はカラム軸に集中されたベンド断面の画分のみを
被覆する）を有すべきである。４．６mmの内径のカラム
に関しては、制限された直径の多孔性プラグを有するそ
のような末端フリットの選択がＵｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃから入手できる。
【００５７】適切なアニオン交換カラムの場合、核酸分
離は、本発明の溶媒及び方法により広範囲の市販のＨＰ
ＬＣ装置に基づいて行なわれ得る。二成分グラジエント
溶媒供給システム、少なくとも±０．１℃の精度にサー
モスタットするカラム及び２６０nmでのＵＶ分光光度検
出が、本発明のために好ましい。しかしながら、完全な
グラジエント分離による３分以下での５０〜１，０００
bpサイズ範囲の二本鎖ＤＮＡのひじょうに早い効果的な
分析が、ＨＰＬＣ装置が次の基準を満たす場合にＴｏｓ
ｏｈ ＤＥＡＥ−ＮＰＲ材料上で得られる：溶媒ミキサ
ーとカラムとの間の１００μＬ以下の合計体積、１．５
μＬ／分ほどの合計流速、１００ms以下の検出器応答、
及び１０μＬ以下の検出器体積。さらに、カラムと検出
器との間の管の長さを２cm以下に減じ、そして注入器を
カラムに連結する管及び注入器をサーモスタットするこ
とが好ましい。
【００５８】本発明のアニオン交換溶媒の最っとも正確
な使用のためには、従来のＨＰＬＣ溶媒溜めの改良が、
その溜めが使用されるにつれて保持時間の短縮を引き起
こすであろう水の蒸発及びその得られる溶離塩の濃度を
最少にすることが所望される。この改良においては、溶
媒が、液体上に最少の蒸気空間が存在するように、より
硬質の溜めのシェル内の折りたたみ式のプラスチックバ
ッグに閉じ込められ；そのバッグは堅く密封される（但
し、ＨＰＬＣポンプの出口を除く）。溜めの内容物が使
用されるにつれて、バッグは空気との最少の溶媒の接触
を維持するために折りたたまれる。好ましくは、そのバ
ッグは、水及び空気の両者への最少の透過性を有するプ
ラスチックから製造される。また好ましくは、溶媒は、
バッグ中への導入の前、当業界において良く知られた方
法によりガス抜きされる。次に、水蒸気のための機会を
高める通常のヘリウムスパージを伴わないでＨＰＬＣポ
ンプに気泡を有さない溶媒を供給することが可能であ
る。ＨＰＬＣ溶媒蒸発を減じるのに良く適合された折り
たたみ式テフロンライナーを含む２．５Ｌの高密度ポリ
エチレン溜が、ＮＯＷ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍ
ｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から市販されている。
【００５９】本発明の核酸のＨＰＬＣ分離は、（ａ）約
０．５〜約１Ｍの濃度で溶離塩を含む出発溶媒組成物に
よりカラムを平衡化し、（ｂ）核酸含有サンプルを約１
μＬ〜約１００μＬ（好ましくは約１０μＬ）の体積で
注入し、（ｃ）約２分〜約３０分の間隔で約１Ｍ〜約
１．５Ｍの値に溶離塩濃度を高める連続グラジエントプ
ログラムを開始し，そして（ｄ）２６０nm領域でのＵＶ
吸光度を記録することによって、最適にもたらされる。
場合によっては、分光光度検出器からの流出液は、等体
積の画分又は個々のクロマトグラフィーピークを得るた
めに選択された画分に集められ得る。溶離プロフィー
ル、すなわち吸光度対時間又は体積のグラフが、多くの
市販のマイクロコンピューターベースのデータシステム
のいづれかで数的に記録される場合、それは、クロマト
グラフィー処理試験が完結する場合に最適に比較され得
る。
【００６０】グラジエントプログラムの選択の他に効果
的なＨＰＬＣ分離の企画における主な判定事は、注入す
る核酸の量の選択に関する。この決定は、試験サンプル
が不足しておらず又は高価でない場合、特に短い分離時
間による手探り法により最適化され得る。他方、それ
は、分光測光及び材料バランスの原理を用いて近められ
得る。現代のＨＰＬＣ分光光度検出器は、１／１０4 の
吸光度単位（ＡＵ）以下の検出限界を有し、そして１／
１０3 〜１／１０2 のＡＵの強い高さのピークを付与す
る。（ａ）ＨＰＬＣ検出器の光路、（ｂ）いかに多くの
明確なピークを、サンプルが生成するか、（ｃ）いかに
多量の核酸を、与えられた体積の試験サンプルが含む
か、及び（ｄ）いかに多くの体積を、そのピークが溶離
するかの推定値が与えられる場合、１／１０3 ＡＵ以上
の平均吸光度（最大吸光度の約半分）を有するピークを
付与するであろう試験サンプル体積を推定することがで
きる。１μｇの二本鎖ＤＮＡは、２６０nmの吸光度の約
０．０２ＡＵmLを含む。それが約０．１mLの体積の１０
種のピーク間に分布される場合、個々のピークは１０mm
の光路を伴って約０．０２ＡＵ又は５mmの光路を伴って
０．０１ＡＵの平均吸光度を有するであろう。
【００６１】最適なＨＰＬＣグラジエント溶離プロフィ
ールは通常、手探り法により選択される。対象のピーク
のすべてをお互いから及びカラム上に保持されないＵＶ
吸収性材料の通常観察される“注入スパイク”から分離
する溶離塩の開始及び最終濃度が見出された後すぐに、
グラジエントの平均的勾配が所望する間隔で分離をもた
らすために選択される。この間隔内でのグラジエントの
正確な形状は、特定のピークの分析を増強するために、
又はしばしば、保持時間対ＤＮＡフラグメントサイズの
対数の線状グラフを創造するために形成され得る。二本
鎖ＤＮＡのアニオン交換分離に関しては、その得られた
形状は、たぶん上方に向かっての凸形状を有する。本発
明の理解及び実施を促進するために、多くの例示的な例
が下記に与えられる。
【００６２】
【実施例】例１ 溶離塩としてＮａｃｌを用いての二本鎖ＤＮＡのアニオ
ン交換ＨＰＬＣ分離 二本鎖ＤＮＡサンプルは、１０mMのトリス−cl及び５０
mMの Kclの溶液（pH８．３）中で１／５に希釈された１
０mMのトリス−cl及び１mMおＥＤＴＡの溶液（pH８．
０）に供給されるプラスミドｐＢＲ３２２（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のエンドヌクレアーゼ
Ｈａｅ III消化物であった。それは、次の塩基対での分
子サイズのブラント末端化されたフラグメントを含む：
５１，５７，６４，８０，８９，１０４，１２３，１２
４，１８４，１９２，２１３，２３４，２６４，４３
４，４５８，５０４，５４０及び５８７。ＨＰＬＣ溶媒
は次のものである：１０mMのシクロヘキシルアミノエタ
ンスルホン酸（ＣＨＥＳ、２５℃で pKa９．５０）及び
５０mMのＮａｃｌを含む緩衝液Ａ、pH８．９９；１０mM
のＣＨＥＳ及び７００mMのＮａｃｌを含む緩衝液Ｂ、pH
８．７７。ＨＰＬＣ装置は次のものから成る：１０ＷＳ
Ｃヘッドを有する二軸Ｇｉｌｓｏｎモデル３０２ポン
プ、６５μＬの混合チャンバーを有するＧｉｌｓｏｎモ
デル８１１動的ミキサー、Ｇｉｌｓｏｎモデル８０２Ｂ
マノメーターモジュール、５０μＬのループを有するＧ
ｉｌｓｏｎモデル２３１サンプル注入器、Ｊｏｎｅ Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｌｔｄ．からのカラムヒ
ーター、８μＬ（１０mmの路）の流動セル及び２０msの
応答時間設定を有するＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｎａｅｒモデ
ルＬＣ−９５ＵＶ／Ｖｉｓｉｂｌｅ分光光度検出吸光
度、及びＰＣ−ＡＴのみにおいてＧｉｌｓｏｎモデル７
１５コントローラーソフトウェア（バージョン１．０）
により制御され、そしてモニターされるＧｉｌｓｏｎモ
デル６２１データモジュール。カラム温度は、カラム本
体にテープにより設置されているテフロン被覆された１
／２０インチの直径タイプＴサーモカップルをモニター
するＰｈｙｓｉｔｅｒｍｐモデルＢＡＴ−１２電気温度
計により±０．１℃の誤差で測定された。
【００６３】アニオン交換ＨＰＬＣカラムは、Ｓｕｐｅ
ｌｃｏ又はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａ
ｔｉｏｎにより供給される、４．６×３５mmのＴｏｓｏ
ｈＤＥＡＥ−ＮＰＲカラムであった。次の溶媒グラジエ
ントプログラムが１．０mL／分の合計の流速で供給され
た（注入からの時間、すべてのグラジエントセグメント
は線状である。）：Ｏ時間で８％緩衝液Ｂ（０．５１６
ＭのＮａｃｌ）；０．３０分で２７％緩衝液Ｂ（０．５
５４ＭのＮａｃｌ）；１．３０分で５０％緩衝液Ｂ
（０．６００ＭのＮａｃｌ）；１．６０分で５０％緩衝
液Ｂ；１．７０分で１００％緩衝液液Ｂ；（０．７００
ＭのＮａｃｌ）；２．１０分で１０％の緩衝液Ｂ；２．
２０分で８％緩衝液Ｂ。
【００６４】図１は、カラムが３０．４℃でサーモスタ
ットされ、そして１０μＬのＤＮＡサンプル（約０．５
μｇのＤＮＡ）が注入される場合の代表的な溶離プロフ
ィールを示し；吸光度は２６０nmでモニターされた。点
線は、ミキサー、注入器及びカラムのフリー溶媒体積の
ために、溶離プロフィールから約０．３mL（０．３分）
左側に移動された塩グラジエントプログラムを示す。公
開された分析法（Ｗｅｓｔｍａｎなど．，１９８７，Ａ
ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６６：１５８〜１７１，及
びＫａｔｏなど．，１９８９，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇ．４７８：２６４〜２６８）に基づいてのbpでのフラ
グメントサイズ同定は、個々のピークに対して与えられ
る。それは、保持時間に基づくフラグメント組成の効果
の多くの証拠を示し；１２３bpのピークは、それをオー
バーラップする代わりに、１２４bpのピークを従え；１
９２bpのピークは２１３bpのピークを従がえ；４５８bp
のピークは５０４，５４０bpのオーバーラップするピー
クを従える。
【００６５】図２は、bpでの分子サイズの対数に対する
保持時間の検量線を示す。ほとんどのピークは許容でき
る直線上に存在するが、６種のピークは明らかに、サイ
ズのみに基づいて予測されるよりも強く保持される。１
２３bp、１９２bp及び４５８bpのピークは、単に異常な
フラグメントではなく；２３４bp、２６７bp及び５８７
bpのピークはまた、クロマトグラフィーマトリックスに
対して非サイズ依存性の追加の化学吸着の形跡を示すｐ
ＢＲ３２２プラスミドの塩基配列及び制限地図に基づく
組成分析は、Ａ−Ｔ含有率に関して、この集団における
すべてのフラグメント間の異常なフラグメントの等級程
度は次の通りであることを示す：＃１、４５８bp（５
７．４％Ａ−Ｔ）；＃２、５８７bp（５６．７％Ａ−
Ｔ）；＃３、１９２bp（５２．６％Ａ−Ｔ）；＃４、２
６７bp（４９．１％Ａ−Ｔ）；＃６、１２３bp（４３．
９％Ａ−Ｔ）；＃１０、２３４bp（４１．０％Ａ−
Ｔ）。２３４bpのフラグメントの例外に関しては、異常
に保持されたフラグメントは、最高のＡ−Ｔ含有率を有
する種である傾向があるが、但し、それらのフラグメン
トは、天然に存在するＤＮＡ間で利用できるものの見通
しからひじょうに高いＡ−Ｔ含有率を有さない。明らか
に、そのような分離は、前もって特徴づけられていない
ＤＮＡ分子のサイズを正確に予測することは期待され得
ない。
【００６６】図３は、上記の実験と同一の実験で測定さ
れた、図１及び２からのピークのサンプルの保持時間温
度依存性を示し、但し、前記実験とは、次の点で異な
る：カラム温度が０．２℃にわたって異なり；３０．４
℃のデータ点は６回の反復試験の平均を示す。ひじょう
に低い温度変化が１℃当たり平均０．４１分のひじょう
に大きな保持時間移動を引き起こすことができることが
示される。この高い温度感受性の真の有意性は、塩基対
割り当ての温度感受性を得るために図２の傾斜により保
持時間温度感受性を割ることによって得られ、すなわち
Δｌｏｇbp／Δ℃＝０．３７５である。０．１℃の温度
不安定性は、フラグメントサイズ、危険なピーク同定及
び実験から実験に調和するピークにおいて９％の不安定
性を生成するであろう。
【００６７】図１の他の注目すべき特徴は、５１〜５８
７bp（より密接には、保持時間変則を伴わないピークの
ためには５１〜７００bp）間でフラグメント化する塩濃
度範囲はたった０．０８Ｍであり、そして塩グラジエン
トの傾斜が溶離の最後でゼロに近づくことである。これ
らの事実は、保持時間及びピーク同定の正確性を得るた
めに実験から実験でのひじょうに正確なグラジエント制
御のための必要性及び約１，０００bp以上の大きなフラ
グメントを正確に分析するための良好でない予測を示
す。
【００６８】これらの問題（分子サイズの誤差、分子サ
イズの不正確さ及び限定された分子サイズ範囲）は、従
来のＨＰＬＣ溶媒が使用される場合、二本鎖ＤＮＡフラ
グメントを同定するためにアニオン交換ＨＰＬＣを用い
ることの困難性を示す。本明細書に示されるような実験
は、溶離pHを６．０に下げ及び２４〜４０℃の範囲でカ
ラム温度を変えることは、本明細書に示される問題を軽
減しないが、但し、pHの低下は異なった問題を排除する
ことを示す。pH８以上で、保持時間はひじょうにpH感受
性であり、その結果、高いpHの緩衝液による（Ｏ2 吸収
を伴う緩衝液調製物及び酸化の小さな誤差が、保持時間
の精度を破壊する。pH６〜８で、保持時間はpH依存性で
はなく、その結果、８以下のpH値が、分子サイズの割り
当てにおける高い精度のために好ましい。
【００６９】例２ 溶離塩としてテトラメチルアンモニウムクロリドを用い
ての二本鎖ＤＮＡのアニオン交換ＨＰＬＣ分離 ＤＮＡサンプル、ＨＰＬＣ装置、ＨＰＬＣカラム、ＨＰ
ＬＣ流速、分光光度検出器の設定及び一般的な実験企画
は、例１に記載される通りであった。ＨＰＬＣ溶離は次
の通りであった：１０mMの２−（Ｎ−モルホリノ）エタ
ンスルホン酸（ＭＥＳ， pKa＝２０℃で６．１５）及び
８００テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）
を含む緩衝液Ａ；１０mMのＭＥＳ、及び１５００mMのＴ
ＭＡＣを含む緩衝液Ｂ、pH６．０４。次のグラジエント
プログラムが使用された（すべてのグラジエントセグメ
ントは直線である）：０時間で１２％緩衝液Ｂ（０．８
８４ＭのＴＭＡＣ）；１．００分で３５％緩衝液Ｂ
（１．０４５ＭのＴＭＡＣ）；３分で４５％緩衝液Ｂ
（１．１１５ＭのＴＭＡＣ）；３．１０分で１００％緩
衝液Ｂ；３．６０分で１００％緩衝液Ｂ；３．７０分で
１２％緩衝液Ｂ。
【００７０】図４は、カラムが２９．７℃でサーモスタ
ットされ、そして１０μＬのＤＮＡサンプルが注入され
る場合の代表的な溶離プロフィールを示す。個々のピー
クに見られる主な肩は、カラムの上部でのボイドの形跡
であり、そしてカラムの方向を逆にし、又はカラムを取
り換えることによって排除され；それはピークの保持時
間分析を妨害しなかった。この溶離プロフィールは図２
のプロフィールとは性質上異なる。図４におけるピーク
にわたってのフラグメントサイズの割り当てを得るため
には、類似する形状の塩グラジエントが９．５分間にわ
たって適用され、１５倍の多量のＤＮＡサンプルが注入
され、ピークが刻々の試験管に集められ、そして個々の
集められた連動が４％アガロースゲル中で電気泳動さ
れ、これは続いて臭化エチジウムにより染色された。螢
光バンドパターンは、制限消化物のフラグメントが、図
４におけるピーク割り当てを判断する分子サイズの厳格
なオーダーでアニオン交換カラムから溶離されることを
明確に示した。事実、遅いサイズ検量クロマトグラフィ
ー試験は、図４に見られるよりも良好なピーク分析を付
与し、いづれかの場合においては基本分析ではないが、
８番目のピークを１８４及び１９２bp成分に及び１３番
目のピークをその４５８，５０４，及び５４０bpの成分
に分割する。
【００７１】図５は、図４におけるピークのためにbpで
の分子サイズの対数に対する保持時間の検量線を示す。
現在、ピークは、滑らかな曲線上に存在する（ピーク分
析により可能にされる程度に）。非直線は、塩グラジエ
ントプログラムの形状を細かに区別する必要性を単純に
もたらし；０〜３分の間の二直線グラジエントは滑らか
な曲線により交換されるべきである。フラグメント組成
について心配しないで、正確に分子サイズを予測するで
あろう線上分子サイズ検量線が得られる。
【００７２】図６は、図４及び５の実験と同一の実験で
測定される、図４及び５からのほとんどのピークの保持
時間温度依存性を示し、但し、前記実験とは、カラム温
度が２．４℃にわたって異なることで異なっている。Ｔ
ＭＡＣは、次の２種の点で、Ｎａｃｌに見出される感受
性よりも異なった保持時間温度感受性を示す：（ａ）傾
斜は０．４１分／℃からひじょうにゆるくなり、そして
（ｂ）傾斜はフラグメントサイズにほぼ比例する。最初
の事実の論理的な結果は、ＴＭＡＣが許容できる保持時
間程度を得るためにＨＰＬＣカラムのサーモスタットを
ひじょうに単純にすることである。第２の事実の論理的
な結果は、サイズ分析が、温度が高められるにつれて、
有意に高められることである。事実、保持時間温度感受
性の底下は、図３及び６におけるグラフの傾斜の単純な
比較から推測されるよりも大きい。なぜならば、ＴＭＡ
Ｃ実験におけるグラジエントはＮａｃｌ実験におけるグ
ラジエントよりも、持続期間で１．９倍長いからであ
る。より信頼できる比較のためには、図６の傾斜は１．
９により割り算されるべきである。
【００７３】分子サイズの割り当て精度に対する溶離塩
交換の効果は表１に明確に示され、ここで、推定された
分子サイズの温度感受性をカラム５で評価するために、
図５（第４段）の対応する傾斜により図６（第３段）の
傾斜で割り算し；この変換は、２種の実験におけるグラ
ジエントプログラムの差異及び検量曲線形状の差異のた
めに正しい。究極的な実際の関係は第６段に要約され；
Ｎａｃｌにおいては、分離は１％以内でフラグメントサ
イズの精度を維持するために０．０１℃以内にサーモス
タットされるべきであり、そして０．０７℃の熱精度は
ＴＭＡＣにおいて同じか又はより良好なサイズ精度を生
むであろう。
【００７４】図４はＴＭＡＣの他の機能的な利点を示
し：保持時間の塩濃度感受性が減じられ（溶離塩濃度範
囲は、０．０８Ｍの代わりに０．２３Ｍである）、そし
てグラジエント傾斜は最大のフラグメントの分析のため
にゼロに近づかない。これらの事実は、グラジエント精
度が、特に１，０００bp又はそれ以上のオーダーでのフ
ラグメントのために、分子サイズ精度を制限せず；ＴＭ
ＡＣはＮａｃｌよりも大きな分析用分子サイズ範囲を付
与することを包含する。
【００７５】ＴＭＡＣの分子サイズ精度利点は、塩グラ
ジエントが図１におけるのと同じ合計のグラジエント期
間を付与するために圧縮される場合に保存される。分子
サイズ分析はＮａｃｌにおけるよりもＴＭＡＣにおいて
が悪く思えるが（少数のピークが分析される）、Ｎａｃ
ｌにおける高い分析性は、組成物依存性保持時間の例外
から生じる。二本鎖ＤＮＡフラグメントの信頼でき且つ
正確な分析のためには、好ましくは、保持時間が厳密に
サイズ依存性であり、そしてサイズ分析性が次のような
方法により改良される：（ａ）ＨＰＬＣ流速の上昇（た
とえば１．０から１．５mL／分に）、（ｂ）検出器にカ
ラムを連結する管の長さ及び直径を最小にすること、
（ｃ）長さ直径割合及び合計の長さを減じるためにカラ
ム寸法の改良、及び（ｄ）カラムの上部での死空間を最
小にするためにカラムの直径よりも小さな直径を有する
カラム入口フリットを用いること。
【００７６】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【図１】これは、制限エンドヌクレアーゼＨａｅ IIIに
よるプラスミドｐＢＲ３２２の消化により創造された二
本鎖ＤＮＡフラグメントの分離のためのアニオン交換Ｈ
ＰＬＣ溶離を示し、ここでＮａｃｌが溶離塩として使用
される。
【図２】これは、保持時間がフラグメントの長さ（塩基
対）の対数に対してグラフ化される場合、図１における
溶離プロフィールから得られる分子サイズ検量線を示
し、ここでフラグメントサイズの割り当て（それぞれの
ピーク上で示される）は、別々の集められたクロマトグ
ラフィーピークのアガロースゲル電気泳動に基づいて行
なわれた。
【図３】これは、図１における分離と同一の一連の分離
からの保持時間データを用いて、図１及び２の制限フラ
グメントのための温度に対するアニオン交換ＨＰＬＣ保
持時間のグラフを示し、但し、それらが示される種々の
温度でサーモスタットされる事実で異なる。
【図４】これは図１における分離にひじょうに類似する
分離からのアニオン交換ＨＰＬＣ溶離プロフィールを示
し、ここでテトラメチルアンモニウムクロリドが溶離塩
としてＮａｃｌの代わりに使用された。
【図５】これは、図４における溶離プロフィールから得
られる、図２における検量線のような分子サイズ検量線
を示し、ここでフラグメントサイズの割り当て（それぞ
れのピーク上で示される）は、別々の集められたクロマ
トグラフィーピークのアガロースゲル電気泳動に基づい
て行なわれた。
【図６】これは、図４における分離のような一連の分離
からの保持時間データを用いて、図３におけるような温
度に対するアニオン交換ＨＰＬＣ保持時間のグラフを示
し、但し、それらが示される種々の温度でサーモスタッ
トされる事実で異なる。

Claims (33)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ４〜８の範囲のｐＨを有する、核酸のア
    ニオン−交換クロマトグラフィーのための有用な水性溶
    媒であって： （ａ） （１）ジアルキルアンモニウム、トリアルキルアンモニ
    ウム及びテトラアルキルアンモニウム（ここで前記アル
    キル基はメチル及びエチルのいづれかの組合せである）
    から成る群から選択されたカチオン及び （２）ブロミド、クロリド、アセテート、ホルメート、
    ニトレート、過塩素酸塩、リン酸二水素、エタンスルホ
    ネート及びメタンスルホネートからなる群から選択され
    たアニオンから成り、カチオン（１）とアニオン（２）
    が等モル濃度である０．５ 〜１．５Ｍの濃度範囲の溶離
    塩及び （ｂ）３．５〜８．５の範囲のｐＫａを有する緩衝酸
    （該酸は０．０５Ｍを越えない濃度を有する）を含有す
    ることを特徴とする、核酸のアニオン−交換クロマトグ
    ラフィーのために有用な水性溶媒。
  2. 【請求項２】 前記緩衝酸がカチオン性であり、そして
    電荷上カチオン性又は中性である複合塩基を有する請求
    項１記載の溶媒。
  3. 【請求項３】 前記アニオンがホルメートである請求項
    １記載の溶媒。
  4. 【請求項４】 水性組成物であって、水中における前記
    組成物の１／２〜１／２０の希釈度が請求項１記載の溶
    媒をもたらすように、請求項１記載の溶媒の２〜２０倍
    濃縮物を含有している水性組成物。
  5. 【請求項５】 また、１μｇ／ｌ〜１ｇ／ｌの濃度範囲
    で核酸を含有している請求項４記載の組成物。
  6. 【請求項６】 前記核酸が二本鎖ＤＮＡを含有している
    請求項５記載の組成物。
  7. 【請求項７】 請求項１記載の溶媒とアニオン−交換固
    体との組み合わせ物を含有している組成物。
  8. 【請求項８】 前記固体がポリアクリル酸主鎖を含有し
    ている請求項７記載の組成物。
  9. 【請求項９】 前記固体がジエチルアミノエチル官能基
    を含有している請求項７記載の組成物。
  10. 【請求項１０】 前記固体がポリエチレンイミン官能基
    を含有している請求項７記載の組成物。
  11. 【請求項１１】 前記固体が１０μｍ〜２μｍの間の平
    均直径を有する粒子を含有している請求項７記載の組成
    物。
  12. 【請求項１２】 前記固体が実質的に非多孔性である請
    求項７記載の組成物。
  13. 【請求項１３】 前記固体がポリスチレン主鎖を含有し
    ている請求項７記載の組成物。
  14. 【請求項１４】 さらに、１μｇ／ｌ〜１ｇ／ｌの濃度
    範囲で核酸を含有している請求項７記載の組成物。
  15. 【請求項１５】 分子の大きさの差異に基づいて核酸を
    分離し、そして分析するための方法であって：この方法
    は、 （ａ）核酸を含む試験サンプルとアニオン−交換固体と
    を接触せしめ； （ｂ）段階（ａ）の固体と請求項１記載の一連の溶媒と
    を接触せしめ、ここで溶離塩の濃度を、溶媒の主部分
    が、前記接触の後、前記固体から分離されるように、
    ０．５Ｍから１．５Ｍに計画的に高め、そして （ｃ）核酸について前記一連の溶媒を分析することを含
    んでいる、核酸を分離し、分析する方法。
  16. 【請求項１６】 前記固体を含む溶離塩濃度を連続して
    高める請求項１５記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記固体から分離された溶媒中におけ
    る核酸の濃度を、２５０nm〜２９０nmの波長範囲での紫
    外線吸光度により測定する請求項１５記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記固体は１０μｍ〜２μｍの間の平
    均直径の粒子を含有している請求項１５記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記固体が、１ｍｍ〜６ｍｍの直径及
    び１０ｍｍ〜６０ｍｍの長さの円柱状形のカラム中に含
    まれている請求項１８記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記工程を完結するために必要とされ
    る合計時間が２分〜３０分の間である請求項１５記載の
    方法。
  21. 【請求項２１】 液体試験サンプル中の一本鎖ＤＮＡ
    （ｓｓＤＮＡ）及びＲＮＡを含有する汚染物から液体試
    験サンプル中の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を分離する
    方法において、 ａ）前記試験サンプルを担体物質に共有結合しているア
    ラルキルアミン分子を有する固体担体物質と接触させ；
    かつ ｂ）前記固体担体物質を前記液体試験サンプルから分離
    させる工程を含んでいる、液体試験サンプル中の二本鎖
    ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を分離する方法。
  22. 【請求項２２】 前記アラルキルアミンを、実質的にフ
    ェニルブチルアミン、フェニルプロピルアミン、フェニ
    ルエチルアミン及びナフチルエチルアミンより成る群か
    ら選択する請求項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記試験サンプルは、ジアルキルアン
    モニウム、トリアルキルアンモニウム又はテトラアルキ
    ルアンモニウム塩を含有している請求項２１に記載の方
    法。
  24. 【請求項２４】 前記塩は、０.５〜１.０Ｍの濃度範囲
    で存在している請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記試験サンプルをクロマトグラフィ
    分離プロセスにかける更なる工程を含んでいる請求項２
    １に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記クロマトグラフィ法は高圧液体ク
    ロマトグラフィである請求項２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 ４〜８の範囲のｐＨを有する、核酸の
    アニオン−交換クロマトグラフィーのための有用な水性
    溶媒であって： （ａ） （１）ジアルキルアンモニウム、トリアルキルアンモニ
    ウム及びテトラアルキルアンモニウム（ここで前記アル
    キル基はメチル及びエチルのいづれかの組合せである）
    から成る群から選択されたカチオン及び （２）ブロミド、クロリド、アセテート、ホルメート、
    ニトレート、過塩素酸塩、リン酸二水素、エタンスルホ
    ネート及びメタンスルホネートからなる群から選択され
    たアニオンから成り、カチオン（１）とアニオン（２）
    が等モル濃度である０．５ 〜１．５Ｍの濃度範囲の溶離
    塩及び （ｂ）３．５〜８．５の範囲のｐＫａを有する緩衝酸
    （該酸は０．０５Ｍを越えない濃度を有する）から成
    る、核酸のアニオン−交換クロマトグラフィーのために
    有用な水性溶媒を含有する請求項２１に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記試験サンプルをクロマトグラフィ
    分離工程にかける更なる工程を含んでいる請求項２７に
    記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記クロマトグラフィ法は高圧液体ク
    ロマトグラフィである請求項２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記固体担体は、アクリルマトリック
    スである請求項２１に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記固体担体は、エポキシド−誘導体
    化された多孔性又は非多孔性の粒状アクリルマトリック
    スである請求項３０に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記分離工程は、前記試験サンプルを
    濾過して前記担体物質を除去する工程を含んでいる請求
    項２１に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記分離工程には、前記試験サンプル
    を遠心分離器中に置き、前記サンプルを遠心分離して前
    記液体試験サンプルから前記固体担体物質を分離させる
    ことを包含する請求項２１に記載の方法。
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Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT398973B (de) * 1992-11-18 1995-02-27 Bonn Guenther Dr Verfahren zur trennung von nukleinsäuren
US5622822A (en) * 1994-09-13 1997-04-22 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Methods for capture and selective release of nucleic acids using polyethyleneimine and an anionic phosphate ester surfactant and amplification of same
US5630924A (en) 1995-04-20 1997-05-20 Perseptive Biosystems, Inc. Compositions, methods and apparatus for ultrafast electroseparation analysis
JP2965131B2 (ja) 1995-07-07 1999-10-18 東洋紡績株式会社 核酸結合用磁性担体およびそれを用いる核酸単離方法
US6355791B1 (en) 1995-11-13 2002-03-12 Transgenomic, Inc. Polynucleotide separations on polymeric separation media
US6066258A (en) 1997-12-05 2000-05-23 Transgenomic, Inc. Polynucleotide separations on polymeric separation media
US5772889A (en) * 1995-11-13 1998-06-30 Transgenomic, Inc. System and method for performing nucleic acid separations using liquid chromatography
AU723900B2 (en) 1996-02-14 2000-09-07 Akzo Nobel N.V. Isolation and amplification of nucleic acid materials
SE9600796D0 (sv) * 1996-02-29 1996-02-29 Pharmacia Biotech Ab A method of preparing a liquid mixture
US6576133B2 (en) 1996-11-13 2003-06-10 Transgenomic, Inc Method and system for RNA analysis by matched ion polynucleotide chromatography
US6372142B1 (en) 1996-11-13 2002-04-16 Transgenomic, Inc. Column for DNA separation by matched ion polynucleotide chromatography
US6482317B2 (en) 1996-11-13 2002-11-19 Transgenomic, Inc. Polynucleotide separations on polymeric separation media
US6030527A (en) * 1996-11-13 2000-02-29 Transgenomic, Inc. Apparatus for performing polynucleotide separations using liquid chromatography
US5997742A (en) * 1996-11-13 1999-12-07 Transgenomic, Inc. Method for performing polynucleotide separations using liquid chromatography
US6287822B1 (en) 1997-08-05 2001-09-11 Transgenomic, Inc. Mutation detection method
US6471866B1 (en) 1996-11-13 2002-10-29 Transgenomic, Inc. Process for performing polynucleotide separations
US5972222A (en) * 1996-11-13 1999-10-26 Transgenomic, Inc. Process for performing polynucleotide separations
US6174441B1 (en) 1996-11-13 2001-01-16 Transgenomic, Inc. Method for performing polynucleotide separations using liquid chromatography
US6017457A (en) * 1996-11-13 2000-01-25 Transgenomic, Inc. Method for performing polynucleotide separations using liquid chromatography
US7138518B1 (en) 1996-11-13 2006-11-21 Transgenomic, Inc. Liquid chromatographic separation of polynucleotides
US6475388B1 (en) 1996-11-13 2002-11-05 Transgenomic, Inc. Method and system for RNA analysis by matched ion polynucleotide chromatography
US6177559B1 (en) 1998-04-24 2001-01-23 Transgenomic, Inc. Process for separation of polynucleotide fragments
US5986085A (en) * 1997-04-25 1999-11-16 Transgenomic, Inc. Matched ion polynucleotide chromatography (MIPC) process for separation of polynucleotide fragments
US6056877A (en) * 1997-12-05 2000-05-02 Transgenomic, Inc. Non-polar media for polynucleotide separations
DE69817207T2 (de) 1997-06-10 2004-06-17 Transgenomic, Inc., San Jose System und verfahren zur durchführung von polynukleotid-trennungen mit hilfe von flüssigchromatographie
US5972618A (en) * 1997-08-28 1999-10-26 Bloch; Will Detection of mutations in nucleic acids by chemical cleavage
US6258264B1 (en) 1998-04-10 2001-07-10 Transgenomic, Inc. Non-polar media for polynucleotide separations
US6503397B2 (en) 1997-12-05 2003-01-07 Transgenomic, Inc. Non-polar media for polynucleotide separations
US6372130B1 (en) 1997-12-05 2002-04-16 Transgenomic, Inc. Non-polar media for polynucleotide separations
US6265168B1 (en) 1998-10-06 2001-07-24 Transgenomic, Inc. Apparatus and method for separating and purifying polynucleotides
US6485648B1 (en) 1998-05-18 2002-11-26 Transgenomic, Inc. MIPC column cleaning system and process
US6455692B1 (en) 1998-08-04 2002-09-24 Transgenomic, Inc. Method of concentrating polynucleotides using MIPC
US6074880A (en) * 1998-08-28 2000-06-13 Transgenomic, Inc. Sample analyte containing solution fraction collection system, and method of use
DE60040232D1 (de) * 1999-10-12 2008-10-23 Transgenomic Inc Nachweis von nukleinsäure-heteroduplex molekülen mittels anionen-austausch-chromatographie
ATE512975T1 (de) 2000-01-26 2011-07-15 Transgenomic Inc Verfahren zur trennung von polynukleotidionen mittels monolithischer kapillarsäulen
US6969587B2 (en) 2000-04-04 2005-11-29 Taylor Paul D Detection of nucleic acid heteroduplex molecules by anion-exchange chromatography
WO2002018656A2 (en) * 2000-08-30 2002-03-07 Avi Biopharma, Inc. Method for analysis of oligonucleotide analogs
US20030004371A1 (en) * 2001-05-23 2003-01-02 Gyula Vigh Cationic ion pairing compositions having volatile combustion products with O or S or halogen atoms or their combinations as heteroatoms for use with gas-phase or vapor-phase element-specific detectors
US20020197726A1 (en) * 2001-05-23 2002-12-26 Gyula Vigh Anionic ion pairing compositions having volatile combustion products with O or S or halogen atoms or their combinations as heteroatoms for use with gas-phase or vapor-phase element-specific detectors
EP1525052A1 (en) * 2002-07-26 2005-04-27 Applera Corporation Size-exclusion ion-exchange particles
DE102006020463B4 (de) * 2005-05-24 2013-05-23 Sartorius Stedim Biotech Gmbh Verfahren zum Entfernen von Nukleinsäuren aus einer Flüssigkeit, Verfahren zur Herstellung von Adsorberelementen und Verwendung von Membranadsorbermaterial-Verschnitt
DE102005059315A1 (de) * 2005-12-09 2007-06-14 Qiagen Gmbh Verfahren zur Anreicherung von kurzkettigen Nukleinsäuren
AU2012205204B2 (en) * 2005-12-09 2015-03-12 Qiagen Gmbh Method for enriching short-chain nucleic acids
EP2081442B1 (en) * 2006-10-10 2016-08-10 TrovaGene, Inc. Compositions, methods and kits for isolating nucleic acids from body fluids using anion exchange media
DK2396405T3 (en) 2009-02-11 2017-02-06 Univ Rochester SPACIOUS UNHOMOGENTALLY FUNCTIONALIZED POROUS MEDIA AND PROCEDURE FOR USING SELECTIVE REMOVAL OF CONTAMINANTS
JP5914338B2 (ja) * 2009-09-24 2016-05-11 キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド 陰イオン交換材料を使用した核酸の単離および分析のための組成物、方法およびキット
CN104946626A (zh) 2011-01-12 2015-09-30 积水医疗株式会社 离子交换色谱法用洗脱液以及核酸链的分析方法
US20140147842A1 (en) 2011-01-12 2014-05-29 Sekisui Medical Co. Ltd Method for detecting single nucleotide polymorphisms
JPWO2012133834A1 (ja) * 2011-03-31 2014-07-28 積水メディカル株式会社 一塩基多型検出用の試料核酸、一塩基多型検出試料調製用のｐｃｒプライマー及びイオン交換クロマトグラフィー分析に用いる一塩基多型検出用試料の調製方法
CN106380592B (zh) * 2016-11-04 2018-10-16 江南大学 一种从发酵液中提取ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4672040A (en) * 1983-05-12 1987-06-09 Advanced Magnetics, Inc. Magnetic particles for use in separations
DE3639949A1 (de) * 1986-11-22 1988-06-09 Diagen Inst Molekularbio Verfahren zur trennung von langkettigen nukleinsaeuren
US4935342A (en) * 1986-12-01 1990-06-19 Syngene, Inc. Method of isolating and purifying nucleic acids from biological samples
DE3717211A1 (de) * 1987-05-22 1988-12-01 Diagen Inst Molekularbio Vorrichtung und verfahren zur trennung und reinigung von molekuelen
US4959176A (en) * 1988-04-29 1990-09-25 Beckman Instruments, Inc. High resolution non corrosive amino acid analysis buffer solutions
SE8902315D0 (sv) * 1989-06-27 1989-06-27 Pharmacia Ab Anjonbytare
US5010183A (en) * 1989-07-07 1991-04-23 Macfarlane Donald E Process for purifying DNA and RNA using cationic detergents

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IL101356A0 (en) 1992-11-15
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AU645674B2 (en) 1994-01-20
ES2053416T1 (es) 1994-08-01
CA2063855C (en) 1997-08-26
NZ242226A (en) 1993-07-27
AU1403492A (en) 1992-10-08

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