JPWO2012133834A1 - 一塩基多型検出用の試料核酸、一塩基多型検出試料調製用のｐｃｒプライマー及びイオン交換クロマトグラフィー分析に用いる一塩基多型検出用試料の調製方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、迅速かつ簡便な一塩基多型の検出方法に用いられる一塩基多型検出用の試料核酸、一塩基多型検出試料調製用のＰＣＲプライマー及びイオン交換クロマトグラフィー分析に用いる一塩基多型検出用試料の調製方法に関する。本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）の特性を有する一塩基多型検出用の試料核酸である。（ａ）全鎖長２００ｂｐ以下である（ｂ）５’末端、３’末端のいずれかに鋳型ＤＮＡと不完全相補な配列（タグ配列）を有する（ｃ）一塩基多型の有無を比較すべき試料核酸との鎖長差が１０ｂｐ以下である

Description

本発明は、迅速かつ簡便な一塩基多型の検出方法に用いられる一塩基多型検出用の試料核酸に関する。また、本発明は、一塩基多型検出試料調製用のＰＣＲプライマー及びイオン交換クロマトグラフィー分析に用いる一塩基多型検出用試料の調製方法に関する。

近年、様々な病気や薬の副作用との関連が明らかとなってきた一塩基多型（ＳＮＰ；Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を解析する技術が開発されており、これらの開発においては、一塩基多型を簡便かつ短時間に精度良く検出することが重要な要素となっている。

一塩基多型を解析する方法として、ＲＦＬＰ法（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）が知られている。ＲＦＬＰ法は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）増幅産物中の遺伝子変異部位を認識する制限酵素が存在する場合、共通配列部位にプライマーを設定し、その内側、すなわち、ＰＣＲ増幅産物内に多型性をもたせて増幅し、得られたＰＣＲ産物を制限酵素で切断し、その断片の長さにより、多型の有無を判定する方法である。しかしながら、制限酵素を用いるため、分析コストが上がったり、解析全体の時間が長くなったりする等の課題がある。また、電気泳動により鎖長差を検出するため、作業が煩雑になったり、解析全体の時間が長くなったりする等の課題もある。

一方、生化学分野や医学分野等において、核酸、タンパク質、多糖類といった生体高分子の分析には、簡便かつ短時間に精度良く検出できる方法としてイオン交換クロマトグラフィーが利用されている。イオン交換クロマトグラフィーを用いると、電気泳動による測定において必要とされるような煩雑な作業が緩和される。非特許文献１には、核酸関連化合物を高速液体クロマトグラフィーで分離する方法が開示されている。しかしながら、非特許文献１に開示された方法でも、一塩基多型のような接近する鎖長差を有する核酸を充分に分離することが難しいという問題がある。

特開２００５−０２７５１８号公報 特開２００６−０７５１２６号公報

「ライフサイエンスのための高速液体クロマトグラフィー 基礎と実験」、廣川書店、ｐ．３２３、（１９８８） Ｎａｔｕｒｅ、３２４、ｐ．１６３−１６６、（１９８６）

本発明は、迅速かつ簡便な一塩基多型の検出方法に用いられる一塩基多型検出用の試料核酸を提供することを目的とする。また、本発明は、一塩基多型検出試料調製用のＰＣＲプライマー及びイオン交換クロマトグラフィー分析に用いる一塩基多型検出用試料の調製方法を提供することを目的とする。

本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）の特性を有する一塩基多型検出用の試料核酸である。
（ａ）全鎖長２００ｂｐ以下である
（ｂ）５’末端、３’末端のいずれかに鋳型ＤＮＡと不完全相補な配列（タグ配列）を有する
（ｃ）一塩基多型の有無を比較すべき試料核酸との鎖長差が１０ｂｐ以下である
以下に本発明を詳述する。

本発明者らは、特定の特性を有する試料核酸を用いることにより、迅速かつ簡便に一塩基多型を検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

ＡＳ−ＰＣＲ（Ａｌｌｅｌｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ−ＰＣＲ）法は、配列特異的な増幅反応を利用した遺伝子多型（特に一塩基多型）を検出する方法である。具体的には、検出したい一塩基多型の塩基配列がプライマーの３’末端になるようにしてＰＣＲを行う。標的核酸の塩基配列とプライマーが完全に相補である場合、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応が起こる。一方、標的核酸の塩基配列とプライマーとが不完全相補である場合には、ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応が阻害される。このように、一塩基多型の野生型又は変異型の塩基配列を３’末端に有する２種類のプライマーを使用し、増幅反応の結果に基づいて一塩基多型の判定を行う方法である。ＡＳ−ＰＣＲ法としては、非特許文献２に開示されている方法を用いることができる。

本発明におけるＡＳ−ＰＣＲは、使用するプライマーが以下の特徴を有する。
（１）Ｆｏｒｗａｒｄプライマーは、変異型用、野生型用の２種類を用い、変異型用は３’末端に一塩基多型の塩基配列を有し、野生型用は３’末端（一塩基多型部位に相当）に野生型の塩基配列を有する。
（２）上記２種類のＦｏｒｗａｒｄプライマーのうち一方のプライマーは、５’末端に標的核酸の塩基配列とは不完全相補である配列（以下「タグ配列」ということがある。）を有する。
（３）上記タグ配列の鎖長は、１０ｂｐ以下である。
（４）上記２種類のＦｏｒｗａｒｄプライマーは、増幅産物の鎖長が２００ｂｐ以下になるよう設計されている。
（５）Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーは、変異型用、野生型用で共通のプライマーを使用する。
（６）上記Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーは、変異型用Ｆｏｒｗａｒｄプライマーにより、５’末端にタグ配列を有するＰＣＲ増幅産物が複製されていた場合には、ＰＣＲ増幅の２サイクル目以降、３’末端にタグ配列を有する増幅産物を複製することができる。

上記したプライマーのうち、変異型用プライマーがタグ配列を有する場合のＰＣＲ増幅反応の特徴を模式的に説明する。
（Ａ）ＰＣＲ増幅の１サイクル目の特徴は以下である。変異型用、野生型用の２種類のプライマーは、変異型の鋳型ＤＮＡ、野生型の鋳型ＤＮＡに対してそれぞれアニーリングした後、それぞれ伸長反応が進行し、変異型ＤＮＡ、野生型ＤＮＡ、それぞれが複製される。この時、複製された変異型ＤＮＡは、複製された野生型ＤＮＡに対して、タグ配列の鎖長分だけ全鎖長が長い。
（Ｂ）ＰＣＲ増幅の２サイクル目以降の特徴は以下である。Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーは、変異型ＤＮＡの複製産物（５’末端にタグ配列を有する）及び野生型ＤＮＡの複製産物、それぞれにアニーリングした後、伸長反応が進行し、変異型ＤＮＡ、野生型ＤＮＡそれぞれが複製される。この時、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーで複製された変異型ＤＮＡも、複製された野生型ＤＮＡに対して、タグ配列の鎖長分だけ全鎖長が長い。

こうして得られたタグ配列の分だけ全鎖長が異なる２種類のＰＣＲ増幅産物は、後記するイオン交換クロマトグラフィーによって分離分析される。

上記の模式的説明において、２種類のＰＣＲ増幅産物が、イオン交換クロマトグラフィーによって分離分析され得ることを限度として、変異型用プライマー、野生型用プライマーの両方にタグ配列が付加されていてもよいこと、通常使用されるプライマーが具備すべき特性を除きタグの配列に制限がないことを、当業者は容易に理解しうる。
なお、Ｆｏｒｗａｒｄプライマー、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーの用語は、本発明の技術分野における通常の意味で使用しており、Ｆｏｒｗａｒｄプライマーを変異型用、野生型用で共通のプライマーを使用し、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーのうち変異型用の５’末端にタグ配列を付加するといった形態も本発明の範囲に含まれることはいうまでもない。

従来、プライマーに本発明と同様のタグ配列を付加する場合には、非特異反応の回避（特許文献１）、タグ認識プローブによる検出（特許文献２）を目的としており、イオン交換クロマトグラフィー用の試料、特に一塩基多型の検出用試料とした例はない。

以上のように、本発明では、一塩基多型検出用の試料核酸、一塩基多型検出試料調製用のＰＣＲプライマー及びイオン交換クロマトグラフィー分析に用いる一塩基多型検出用試料の調製方法が提供されるのである。

本発明の一塩基多型の検出方法では、イオン交換クロマトグラフィーを用いる。
イオン交換クロマトグラフィーに用いる溶離液は、下記式（１）で示されるグアニジンから誘導されるグアニジン塩を含有することが好ましい。

グアニジン塩としては、例えば、グアニジン塩酸塩、グアニジン硫酸塩、グアニジン硝酸塩、グアニジン炭酸塩、グアニジンリン酸塩、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジンスルファミン酸塩、アミノグアニジン塩酸塩、アミノグアニジン重炭酸塩等が挙げられる。なかでも、グアニジン塩酸塩、グアニジン硫酸塩が好適に用いられる。

溶離液におけるグアニジン塩の分析時の濃度は、検出対象物質に合わせて、適宜調整すればよいが、２０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましい。
具体的には、グアニジン塩の濃度を０〜２０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲でグラジエント溶出させる方法を挙げることができる。従って、分析開始時のグアニジン塩の濃度は０ｍｍｏｌ／Ｌである必要はなく、また、分析終了時のグアニジン塩の塩濃度も２０００ｍｍｏｌ／Ｌである必要はない。
グラジエント溶出の方法は、低圧グラジエント法であっても高圧グラジエント法であってもよいが、高圧グラジエント法による精密な濃度調整を行いながら溶出させる方法が好ましい。

グアニジン塩は、溶離液に単独で添加してもよいし、他の塩と組み合わせて添加してもよい。グアニジン塩に組み合わせて用いることができる塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム等のハロゲン化物とアルカリ金属とからなる塩や、塩化カルシウム、臭化カルシウム、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム等のハロゲン化物とアルカリ土類金属とからなる塩や、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の無機酸塩等が挙げられる。また、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、コハク酸ナトリウム、コハク酸カリウム等の有機酸塩を用いてもよい。

溶離液に用いる緩衝液としては、公知の緩衝液類や有機溶媒類を用いることができ、具体的には例えば、トリス塩酸緩衝液、トリスとＥＤＴＡとからなるＴＥ緩衝液、トリスと酢酸とＥＤＴＡとからなるＴＡＥ緩衝液、トリスとホウ酸とＥＤＴＡとからなるＴＢＡ緩衝液等が挙げられる。

溶離液のｐＨは特に制限されず、アニオン交換によって核酸鎖を分離できる範囲であればよい。

イオン交換クロマトグラフィーに用いる充填剤としては、基材粒子の少なくとも表面にカチオン性基が導入されているものが好ましく、基材粒子の少なくとも表面に強カチオン性基と弱アニオン性基とを有するものがより好ましい。

本明細書において、「強カチオン性基」とは、ｐＨが１から１４の広い範囲で解離するカチオン性基を意味する。すなわち、強カチオン性基は、水溶液のｐＨに影響を受けず解離した（カチオン化した）状態を保つことが可能である。

強カチオン性基としては、４級アンモニウム基が挙げられる。具体的には例えば、トリメチルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基、ジメチルエチルアンモニウム基等のトリアルキルアンモニウム基等が挙げられる。
また、強カチオン性基のカウンターイオンとしては、例えば、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲン化物イオンが挙げられる。

強カチオン性基量は特に限定されないが、充填剤の乾燥重量あたりの好ましい下限は１μｅｑ／ｇ、好ましい上限は５００μｅｑ／ｇである。強カチオン性基量が１μｅｑ／ｇ未満であると、充填剤の保持力が弱くなり、分離性能が悪くなることがある。強カチオン性基量が５００μｅｑ／ｇを超えると、充填剤の保持力が強くなりすぎ、検出対象物質を容易に溶出させることができず、分析時間が長くなる等の問題が生じることがある。

本明細書において「弱アニオン性基」とは、ｐＫａが３以上のアニオン性基を意味する。すなわち、上記弱アニオン性基は、水溶液のｐＨによる影響を受け、解離状態が変化する。ｐＨが３より高くなると、カルボキシ基のプロトンは解離し、マイナスの電荷を持つ割合が増える。逆に、ｐＨが３より低くなると、カルボキシ基のプロトンが結合した非解離状態の割合が増える。
上記弱アニオン性基としては、例えば、カルボキシ基、リン酸基等が挙げられる。なかでも、カルボキシ基であることが好ましい。

カルボキシ基を基材粒子の少なくとも表面に導入する方法としては、例えば、カルボキシ基を有する単量体を共重合する方法、単量体中のエステル部を加水分解する方法、オゾン水処理によってカルボキシ基を形成する方法、オゾンガスによってカルボキシ基を形成する方法、プラズマ処理によってカルボキシ基を形成する方法、カルボキシ基を有するシランカップリング剤を反応させる方法、エポキシ基を有する単量体を共重合させエポキシ基の開環によってカルボキシ基を形成する方法等、公知の方法を用いることができる。なかでも、基材粒子が疎水性の構造部分、特に炭素−炭素の二重結合を有するものである場合、オゾン水処理によってカルボキシ基を形成する方法を用いることが好ましい。

オゾン水処理によってカルボキシ基を形成する方法について説明する。
オゾンは二重結合との反応性が高く、二重結合と反応したオゾンは、中間体であるオゾナイドを形成し、その後、カルボキシ基等が形成される。

オゾン水とは、オゾンガスが水に溶解したものを意味する。
オゾン水を用いることにより、オゾン水中に粒子を分散させるだけで粒子表面を簡便に酸化させることができる。その結果、基材粒子における疎水性の構造部分が酸化され、カルボキシ基、水酸基、アルデヒド基、ケト基等の親水性基が形成されると考えられる。
オゾンには強力な酸化作用があるが、オゾン水を用いて処理することにより、オゾンガスを用いて処理するよりも粒子表面を均一に酸化させることができ、より均一にカルボキシ基が形成されるので好ましい。

オゾン水における溶存オゾンの濃度は特に限定されないが、好ましい下限は２０ｐｐｍである。溶存オゾンの濃度が２０ｐｐｍ未満であると、カルボキシ基を形成するのに長時間を必要としたり、カルボキシ基の形成が不充分となって、検出対象物質の非特異吸着等を充分に抑制することができなかったりする。溶存オゾンの濃度のより好ましい下限は５０ｐｐｍである。

オゾン水は、例えば、特開２００１−３３０９６９号公報等に記載されているように、原料水とオゾンガスとを、気体のみを透過し液体の透過を阻止するオゾンガス透過膜を介して接触させる方法等により調製することができる。

アルカリ条件下においては、基材粒子の表面に導入されたカルボキシ基はほぼ解離した状態にあり、核酸塩基中の僅かなカチオンとの間に弱いカチオン交換相互作用が生じると考えられる。
また、オゾン水によって処理することで、カルボキシ基の他、水酸基、アルデヒド基、ケト基等の親水性基が形成され、これらの親水性基の存在によって充填剤の表面と核酸との間に働く疎水性相互作用が弱まると考えられる。
従って、少なくとも表面に強カチオン性基と弱アニオン性基とを有する充填剤を用いた場合、主たる相互作用である充填剤表面と核酸との間に働くアニオン交換相互作用に加え、上述したように、弱いカチオン交換相互作用が働いたり、疎水性相互作用が弱まったりすることによって分離性能が向上するものと考えられる。

基材粒子の少なくとも表面に導入される弱アニオン性基量は、強カチオン性基量以下であれば特に限定されない。

基材粒子としては、例えば、重合性単量体等を用いて得られる合成高分子微粒子、シリカ系等の無機微粒子等を用いることができるが、有機合成高分子からなる疎水性架橋重合体粒子と、該疎水性架橋重合体粒子の表面に共重合されたイオン交換基を有する親水性重合体からなる層とからなるものであることが好適である。

疎水性架橋重合体は、１種の疎水性架橋性単量体を単独重合して得られる疎水性架橋重合体、２種以上の疎水性架橋性単量体を共重合して得られる疎水性架橋重合体、少なくとも１種の疎水性架橋性単量体と少なくとも１種の疎水性非架橋性単量体とを共重合して得られる疎水性架橋重合体のいずれであってもよい。

疎水性架橋性単量体としては、単量体１分子中にビニル基を２個以上有するものであれば特に限定されず、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート等のジ（メタ）アクリル酸エステルや、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート等のトリ（メタ）アクリル酸エステル又はテトラ（メタ）アクリル酸エステルや、ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルナフタレン等の芳香族系化合物等が挙げられる。
なお、本明細書において、「（メタ）アクリル」とは、「アクリル又はメタクリル」を意味し、「（メタ）アクリレート」とは、「アクリレート又はメタクリレート」を意味する。

疎水性非架橋性単量体としては、疎水性の性質を有する非架橋性の重合性有機単量体であれば特に限定されず、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、イソプロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステルや、スチレン、メチルスチレン等のスチレン系単量体等が挙げられる。

疎水性架橋重合体が、疎水性架橋性単量体と疎水性非架橋性単量体との共重合からなる場合、疎水性架橋重合体における疎水性架橋性単量体に由来するセグメントの含有割合の好ましい下限は１０重量％、より好ましい下限は２０重量％である。

イオン交換基を有する親水性重合体は、イオン交換基を有する親水性単量体から構成されるものであり、１種以上のイオン交換基を有する親水性単量体に由来するセグメントを含めばよい。即ち、イオン交換基を有する親水性重合体を製造する方法としては、イオン交換基を有する親水性単量体単独で重合させる方法、イオン交換基を有する親水性単量体とイオン交換基を有さない親水性単量体とを共重合させる方法等が挙げられる。

イオン交換基を有する親水性単量体としては、強カチオン性基を有するものであることが好ましく、４級アンモニウム基を有するものであることがより好ましい。具体的には例えば、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸エチルトリエチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸エチルジメチルエチルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルトリエチルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルジメチルエチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルトリメチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルトリエチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルジメチルエチルアンモニウムクロリド等が挙げられる。

充填剤の平均粒子径は特に限定されないが、好ましい下限は０．１μｍ、好ましい上限は２０μｍである。充填剤の平均粒子径が０．１μｍ未満であると、カラムの内圧が高くなり、分離不良を起こすことがある。充填剤の平均粒子径が２０μｍを超えると、カラム内のデッドボリュームが大きくなりすぎて分離不良を起こすことがある。
なお、本明細書において平均粒子径は体積平均粒子径を示し、粒度分布測定装置（ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ７８０／Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて測定することができる。

本発明の一塩基多型の検出方法において、ＡＳ−ＰＣＲ法によって増幅される産物の大きさは２００ｂｐ以下であることが好ましい。ＡＳ−ＰＣＲ法によって増幅される産物の大きさが２００ｂｐを超えると、ＰＣＲの増幅時間やイオン交換クロマトグラフィーにおける分析時間が長くなったり、充分な分離性能が得られなかったりすることがある。ＡＳ−ＰＣＲ法によって増幅される産物の大きさは、１００ｂｐ以下であることがより好ましい。

本発明の一塩基多型の検出方法において、ＡＳ−ＰＣＲ法によって増幅される野生型と変異型との産物の大きさの差（鎖長差）は１０ｂｐ以下であることが好ましい。増幅される野生型と変異型との産物の大きさの差が１０ｂｐを超えるようにＡＳプライマーを設計しても、非特異増幅反応等で所望の増幅産物が得られないことがある。

本発明によれば、迅速かつ簡便な一塩基多型の検出方法に用いられる一塩基多型検出用の試料核酸を提供することができる。また、本発明によれば、一塩基多型検出試料調製用のＰＣＲプライマー及びイオン交換クロマトグラフィー分析に用いる一塩基多型検出用試料の調製方法を提供することができる。

実施例１において、アニオン交換カラム１を用いてＵＧＴ１Ａ１＊６領域の野生型７６ｂｐと変異型７９ｂｐとを分離検出して得られたクロマトグラムである。 実施例１において、アニオン交換カラム２を用いてＵＧＴ１Ａ１＊６領域の野生型７６ｂｐと変異型７９ｂｐとを分離検出して得られたクロマトグラムである。 参考例１において、アニオン交換カラム１を用いてＵＧＴ１Ａ１＊６領域の野生型２７１ｂｐと変異型２７４ｂｐとを分離検出して得られたクロマトグラムである。 参考例１において、アニオン交換カラム２を用いてＵＧＴ１Ａ１＊６領域の野生型２７１ｂｐと変異型２７４ｂｐとを分離検出して得られたクロマトグラムである。 参考例２において、アニオン交換カラム２を用いてＵＧＴ１Ａ１＊６領域の野生型７６ｂｐと変異型７９ｂｐとを分離検出して得られたクロマトグラムである。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されない。

（アニオン交換カラムの準備）
（アニオン交換カラム１）
攪拌機付き反応器中にて、３重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２０００ｍＬに、テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）３００ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）１００ｇ、及び、過酸化ベンゾイル（キシダ化学社製）１．０ｇの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて８０℃で１時間重合した。次に、強カチオン性のイオン交換基（４級アンモニウム基）を有する単量体として、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド（和光純薬工業社製）１００ｇをイオン交換水に溶解し、得られた溶液を上記反応器中に更に添加した。次いで、攪拌しながら窒素雰囲気下にて８０℃で２時間重合し、重合体組成物を得た。得られた重合体組成物を水及びアセトンで洗浄することにより、基材粒子の表面に４級アンモニウム基を有する親水性の被覆重合体粒子を得た。
得られた被覆重合体粒子１０ｇを溶存オゾン濃度１００ｐｐｍのオゾン水３００ｍＬに浸漬し、３０分間攪拌した。攪拌終了後、遠心分離機（日立製作所社製、「Ｈｉｍａｃ ＣＲ２０Ｇ」）を用いて遠心分離し、上澄みを除去した。この操作を２回繰り返し、被覆重合体粒子にオゾン水処理を施し、４級アンモニウム基とカルボキシ基が共存するイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を得た。
なお、オゾン水は、内径１５ｃｍ×長さ２０ｃｍの円柱形を有する外套内に、パーフルオロアルコキシ樹脂からなる内径０．５ｍｍ×厚さ０．０４ｍｍ×長さ３５０ｃｍの中空管状のオゾンガス透過膜４００本収容されたオゾン溶解モジュールを含むオゾン水製造システム（積水化学工業社製）を用いて調製した。
得られたイオン交換クロマトグラフィー用充填剤について、粒度分布計（Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、「Ａｃｃｕｓｉｚｅｒ７８０」）を用いて測定したところ、平均粒子径は１０μｍであった。
得られたイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用いて以下のカラム（アニオン交換カラム１）を準備した。
カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×２０ｍｍ
イオン交換基：４級アンモニウム基

（アニオン交換カラム２）
市販されているカラムとして、以下のカラムを準備した。
品名：ＴＳＫ−ｇｅｌ ＤＮＡ−ＳＴＡＴ（東ソー社製）
カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×長さ１００ｍｍ
イオン交換基：４級アンモニウム基

（実施例１）
実施例１では、ＵＧＴ１Ａ１＊６領域の野生型７６ｂｐと変異型７９ｂｐとの分離検出を行った。

（ＡＳ−ＰＣＲ増幅）
以下に示すＡＳ−ＰＣＲ条件によって野生型と変異型の増幅産物を得た。
（１）試薬
ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社製、Ｌｏｔ．７６０８１６）
１０×ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ
ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（５Ｕ／μＬ）
ＵＧＴ１Ａ１＊６ ｐｒｉｍｅｒ（Ｏｐｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
Ｆｏｒｗａｒｄ（野生型）（１０ｐｍｏｌ／μＬ）：５’−（ｃｇｃｃｔｃｇｔｔｇｔａｃａｔｃａｇａｇｃｇｇ）−３’（配列番号１）
Ｆｏｒｗａｒｄ（変異型）（１０ｐｍｏｌ／μＬ）：５’−（ｃｔｇａｃｇｃｃｔｃｇｔｔｇｔａｃａｔｃａｇａｇｃｇａ）−３”（配列番号２）
Ｒｅｖｅｒｓｅ（１０ｐｍｏｌ／μＬ）：５’−（ｃａｃａｔｃｃｔｃｃｃｔｔｔｇｇａａｔｇｇｃａ）−３”（配列番号３）
Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ（ｎｏｔ ＤＥＰＣ−ｔｒｅａｔｅｄ）（Ａｍｂｉｏｎ社製、Ｌｏｔ．０８０３０１５）
ＵＧＴ１Ａ１遺伝子 野生型配列挿入プラスミド（１×１０^６コピー／μＬ）
ＵＧＴ１Ａ１遺伝子 変異型配列挿入プラスミド（１×１０^６コピー／μＬ）

（２）調製
５μＬの１０×ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ、１μＬのＦｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ、１μＬのＲｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒに総量が４９μＬとなるようＮｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒで調整した溶液に、１μＬのＵＧＴ１Ａ１遺伝子配列挿入プラスミドを添加し反応溶液とした。

（３）反応
Ｃ１０００（バイオ・ラッド ラボラトリーズ社製）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。温度サイクルは以下に示す通りである。
９４℃、３０秒でテンプレートを熱変性させ、９４℃を１５秒、６２℃を１５秒、６８℃を３０秒の増幅サイクルを４０サイクル行い、最後に６８℃、５分で保温した。サンプルは使用するまで４℃で保存した。

ＡＳ−ＰＣＲ増幅後、電気泳動（アドバンス社製、「Ｍｕｐｉｄ−ｅｘ」）にて８０ｂｐ付近に増幅産物に由来するバンドを確認した。増幅産物の大きさは、２０ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒマーカー（タカラバイオ社製）を用いて確認した。

（ＨＰＬＣ分析）
準備したアニオン交換カラムを用いて、以下の条件でＡＳ−ＰＣＲ増幅産物を分離検出した。
システム：ＬＣ−２０Ａシリーズ（島津製作所社製）
溶離液：溶離液Ａ ２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
溶離液Ｂ ２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）＋１ｍｏｌ／Ｌグアニジン塩酸塩
分析時間：アニオン交換カラム１を用いたときの分析時間は１０分
アニオン交換カラム２を用いたときの分析時間は２０分
溶出法：以下に示すグラジエント条件により、溶離液Ｂの混合比率を直線的に増加させた。
アニオン交換カラム１を用いたときの条件
０分（溶離液Ｂ４０％）→１０分（溶離液Ｂ５０％）
アニオン交換カラム２を用いたときの条件
０分（溶離液Ｂ７０％）→２０分（溶離液Ｂ９０％）
検体：ＵＧＴ１Ａ１＊６領域の野生型７６ｂｐ
ＵＧＴ１Ａ１＊６領域の変異型７９ｂｐ
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ（アニオン交換カラム１を用いたとき）
１．０ｍＬ／ｍｉｎ（アニオン交換カラム２を用いたとき）
検出波長：２６０ｎｍ
試料注入量：１０μＬ

（参考例１）
参考例１では、ＵＧＴ１Ａ１＊６領域の野生型２７１ｂｐと変異型２７４ｂｐとの分離検出を行った。

（ＡＳ−ＰＣＲ増幅）
以下に示すＡＳ−ＰＣＲ条件によって野生型と変異型の増幅産物を得た。

（１）試薬
ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社製、Ｌｏｔ．７６０８１６）
１０×ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ
ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（５Ｕ／μＬ）
ＵＧＴ１Ａ１＊６ ｐｒｉｍｅｒ（Ｏｐｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
Ｆｏｒｗａｒｄ（野生型）（１０ｐｍｏｌ／μＬ）：５’−（ｃｇｃｃｔｃｇｔｔｇｔａｃａｔｃａｇａｇｃｇｇ）−３’（配列番号１）
Ｆｏｒｗａｒｄ（変異型）（１０ｐｍｏｌ／μＬ）：５’−（ｃｔｇａｃｇｃｃｔｃｇｔｔｇｔａｃａｔｃａｇａｇｃｇａ）−３”（配列番号２）
Ｒｅｖｅｒｓｅ（１０ｐｍｏｌ／μＬ）：５’−（ｇａａａｇｇｇｔｃｃｇｔｃａｇｃａｔｇａｃ）−３”（配列番号４）
Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ（ｎｏｔ ＤＥＰＣ−ｔｒｅａｔｅｄ）（Ａｍｂｉｏｎ社製、Ｌｏｔ．０８０３０１５）
ＵＧＴ１Ａ１遺伝子 野生型配列挿入プラスミド（１×１０^６コピー／μＬ）
ＵＧＴ１Ａ１遺伝子 変異型配列挿入プラスミド（１×１０^６コピー／μＬ）

（２）調製
５μＬの１０×ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ、１μＬのＦｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ、１μＬのＲｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒに総量が４９μＬとなるようＮｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒで調整した溶液に、１μＬのＵＧＴ１Ａ１遺伝子配列挿入プラスミドを添加し反応溶液とした。

（３）反応
Ｃ１０００（バイオ・ラッド ラボラトリーズ社製）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。温度サイクルは以下に示す通りである。
９４℃、３０秒でテンプレートを熱変性させ、９４℃を１５秒、６２℃を１５秒、６８℃を３０秒の増幅サイクルを４０サイクル行い、最後に６８℃、５分で保温した。サンプルは使用するまで４℃で保存した。

ＡＳ−ＰＣＲ増幅後、電気泳動（アドバンス社製、「Ｍｕｐｉｄ−ｅｘ」）にて２７０ｂｐ付近（２００ｂｐと３００ｂｐの間）に増幅産物に由来するバンドを確認した。増幅産物の大きさは、２０ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒマーカー（タカラバイオ社製）を用いて確認した。

（ＨＰＬＣ分析）
準備したアニオン交換カラムを用いて、以下の条件でＡＳ−ＰＣＲ増幅産物を分離検出した。
システム：ＬＣ−２０Ａシリーズ（島津製作所社製）
溶離液：溶離液Ａ ２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
溶離液Ｂ ２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）＋１ｍｏｌ／Ｌグアニジン塩酸塩
分析時間：アニオン交換カラム１を用いたときの分析時間は１０分
アニオン交換カラム２を用いたときの分析時間は２０分
溶出法：以下に示すグラジエント条件により、溶離液Ｂの混合比率を直線的に増加させた。
アニオン交換カラム１を用いたときの条件
０分（溶離液Ｂ６０％）→１０分（溶離液Ｂ８０％）
アニオン交換カラム２を用いたときの条件
０分（溶離液Ｂ８０％）→２０分（溶離液Ｂ１００％）
検体：ＵＧＴ１Ａ１＊６領域の野生型２７１ｂｐ
ＵＧＴ１Ａ１＊６領域の変異型２７４ｂｐ
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ（アニオン交換カラム１を用いたとき）
１．０ｍＬ／ｍｉｎ（アニオン交換カラム２を用いたとき）
検出波長：２６０ｎｍ
試料注入量：１０μＬ

（比較例１）
比較例１では、ＵＧＴ１Ａ１＊６領域の野生型７６ｂｐと変異型９６ｂｐとの分離検出を試みた。

（１）試薬
ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社製、Ｌｏｔ．７６０８１６）
１０× ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ
ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（５Ｕ／μＬ）
ＵＧＴ１Ａ１＊６ ｐｒｉｍｅｒ（Ｏｐｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
Ｆｏｒｗａｒｄ（野生型）（１０ｐｍｏｌ／μＬ）：５’−（ｃｇｃｃｔｃｇｔｔｇｔａｃａｔｃａｇａｇｃｇｇ）−３’（配列番号１）
Ｆｏｒｗａｒｄ（変異型）（１０ｐｍｏｌ／μＬ）：５’−（ａｔａｇｔｔｇｔｃｃｔａｇｃａｃｃｔｇａｃｇｃｃｔｃｇｔｔｇｔａｃａｔｃａｇａｇｃｇａ）−３”（配列番号５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ（１０ｐｍｏｌ／μＬ）：５’−（ｃａｃａｔｃｃｔｃｃｃｔｔｔｇｇａａｔｇｇｃａ）−３”（配列番号３）
Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ（ｎｏｔ ＤＥＰＣ−ｔｒｅａｔｅｄ）（Ａｍｂｉｏｎ社製、Ｌｏｔ．０８０３０１５）
ＵＧＴ１Ａ１遺伝子 野生型配列挿入プラスミド（１×１０^６コピー／μＬ）
ＵＧＴ１Ａ１遺伝子 変異型配列挿入プラスミド（１×１０^６コピー／μＬ）

（２）調製
５μＬの１０×ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ、１μＬのＦｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ、１μＬのＲｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒに総量が４９μＬとなるようＮｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒで調整した溶液に、１μＬのＵＧＴ１Ａ１遺伝子配列挿入プラスミドを添加し反応溶液とした。

（３）反応
Ｃ１０００（バイオ・ラッド ラボラトリーズ社製）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。温度サイクルは以下に示す通りである。
９４℃、３０秒でテンプレートを熱変性させ、９４℃を１５秒、６２℃を１５秒、６８℃を３０秒の増幅サイクルを４０サイクル行い、最後に６８℃、５分で保温した。サンプルは使用するまで４℃で保存した。

ＡＳ−ＰＣＲ増幅後、電気泳動（アドバンス社製、「Ｍｕｐｉｄ−ｅｘ」）にて増幅産物の確認を行ったところ、非特異増幅と思われる多数のバンドが確認された。これは、ＡＳ−ＰＣＲ増幅が正常に行えなかったことを意味する。そのため、ＨＰＬＣ分析は実施しなかった。

（参考例２）
参考例２では、ＵＧＴ１Ａ１＊６領域の野生型７６ｂｐと変異型７９ｂｐとの分離検出を行った。

溶離液Ｂに添加する塩をグアニジン塩酸塩に代えて塩化ナトリウムとしたこと以外は、実施例１と同様にして、アニオン交換カラム２を用いてＨＰＬＣ分析を行った。

実施例１において、ＵＧＴ１Ａ１＊６領域の野生型７６ｂｐと変異型７９ｂｐとを分離検出して得られたクロマトグラムを図１（アニオン交換カラム１を用いた場合）と図２（アニオン交換カラム２を用いた場合）に示す。図１、２の結果から、両カラムともにＡＳ−ＰＣＲで増幅したＵＧＴ１Ａ１＊６領域の野生型７６ｂｐと変異型７９ｂｐを良好に分離検出することができた。特に、アニオン交換カラム１を用いた場合は、短時間でほぼ完全に分離検出することができた。

参考例１において、ＵＧＴ１Ａ１＊６領域の野生型２７１ｂｐと変異型２７４ｂｐとを分離検出して得られたクロマトグラムを図３（アニオン交換カラム１を用いた場合）と図４（アニオン交換カラム２を用いた場合）に示す。図３、４の結果から、実施例１とは対照的に、ＡＳ−ＰＣＲで増幅したＵＧＴ１Ａ１＊６領域の野生型２７１ｂｐと変異型２７４ｂｐとを分離することができなかった。これは、ＡＳ−ＰＣＲ増幅産物のサイズに対して、野生型と変異型の鎖長差が小さかったためであると考えられる。

参考例２において、アニオン交換カラム２を用いてＵＧＴ１Ａ１＊６領域の野生型７６ｂｐと変異型７９ｂｐとを分離検出して得られたクロマトグラムを図５に示す。溶離液Ｂにグアニジン塩酸塩に代えて塩化ナトリウムを添加すると、野生型７６ｂｐと変異型７９ｂｐを分離することができなかった。

本発明によれば、迅速かつ簡便な一塩基多型の検出方法に用いられる一塩基多型検出用の試料核酸を提供することができる。また、本発明によれば、一塩基多型検出試料調製用のＰＣＲプライマー及びイオン交換クロマトグラフィー分析に用いる一塩基多型検出用試料の調製方法を提供することができる。

Claims (5)

1. 下記（ａ）〜（ｃ）の特性を有する一塩基多型検出用の試料核酸。
   （ａ）全鎖長２００ｂｐ以下である
   （ｂ）５’末端、３’末端のいずれかに鋳型ＤＮＡと不完全相補な配列（タグ配列）を有する
   （ｃ）一塩基多型の有無を比較すべき試料核酸との鎖長差が１０ｂｐ以下である
2. さらに、（ｄ）タグ配列の鎖長が１０ｂｐ以下である、請求項１記載の試料核酸。
3. イオン交換クロマトグラフィー分析に用いられるものである、請求項１又２記載の試料核酸。
4. 下記（ａ）〜（ｃ）の特性を有する一塩基多型検出試料調製用のＰＣＲプライマー。
   （ａ）ＡＳ−ＰＣＲ法に用いた場合に全鎖長２００ｂｐ以下の増幅産物を複製する
   （ｂ）５’末端に鋳型ＤＮＡと不完全相補な配列（タグ配列）を有する
   （ｃ）タグ配列の鎖長が１０ｂｐ以下である
5. 請求項４に記載のＰＣＲプライマーを用いることを特徴とする、イオン交換クロマトグラフィー分析に用いる一塩基多型検出用試料の調製方法。

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