JP2004513625A - オリゴヌクレオチドアナログの分析のための方法 - Google Patents

Abstract

非荷電のヌクレオチドアナログを、主に分離、検出、定量および／または単離するための方法が開示され、この方法は、相補的またはほぼ相補的なＤＮＡあるいは荷電ＤＮＡアナログとの、このような分子の二重鎖を分析することによる。ＤＮＡまたは荷電アナログは、検出目的のために標識され得る。オリゴマー分析物分子の集団を分析する方法であって、（ｉ）分析物分子の集団であって、該分子の各々は、少なくとも５０％が非荷電である結合サブユニットから構成され、かつ核酸または荷電核酸アナログである特異的プローブ分子と、ワトソン−クリック塩基対形成を介してハイブリダイズし得る分析物分子の集団と（ｉｉ）該プローブ分子との混合物を、該プローブ分子が該分析物分子の複数または全てと安定な二重鎖を形成するような条件下で、電荷保有分離媒体に適用する工程を包含する。

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、実質的な量の、好ましくは５０％以上の非荷電サブユニットを有するオリゴヌクレオチドアナログの分離、定量および／または単離するための方法に関する。特に、本発明は、分離のクロマトグラフィー方法または電気泳動方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
非常に多くの電荷に基づく分離方法が、生体高分子を用いた使用のために利用可能であり、この生体高分子（例えば、核酸および大多数のタンパク質）は、中性またはほぼ中性のｐＨで電荷を保有する。これらとしては、例えば、種々の様式の電気泳動、等電点電気泳動およびイオン交換が挙げられる。しかし、このような方法は、分子の事前のイオン化を伴わずには、実質的に非荷電のオリゴヌクレオチドアナログについて、一般的に利用できない。例えば、非荷電オリゴヌクレオチドのイオン交換分離の現行の方法は、高いｐＨ（１１を超える）（ここで、Ｇ塩基およびＴ塩基がイオン化する）または低いｐＨ（３未満）（ここで、Ｃ塩基およびＡ塩基がイオン化する）のいずれかでの分子のイオン化を必要とする。いくつかの非荷電オリゴヌクレオチドアナログ（例えば、ホスホロアミデート結合オリゴマーまたはホスホロジアミデート結合オリゴマーのような）は、これらの低いｐＨで安定ではない。従って、穏やかな条件下（中性またはほぼ中性のｐＨ）で行われ得る、このような非荷電分子の分離方法についての必要性が存在する。
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は、１つの局面において、オリゴマー分析物分子集団の分析および／または分離の方法を含み、ここで、これらの分子は、少なくとも５０％が、中性またはほぼ中性のｐＨで非荷電である、結合したサブユニットから構成され、そして核酸または荷電核酸アナログである特定のプローブ分子と、ワトソンクリック塩基対形成を介してハイブリダイズし得る。この方法は、（ａ）プローブの相補的またはほぼ相補的な領域、および少なくとも１つの分析物分子が安定にハイブリダイズするような条件下で、（ｉ）分析物分子の集団および（ｉｉ）プローブの混合物を、電荷保有分離媒体に適用し、それによって、プローブ−分析物二重鎖、一本鎖分析物、一本鎖プローブおよびそれらの組み合わせから選択される種の混合物を形成する工程、ならびに（ｂ）その媒体内の種を分離する工程を包含する。
【０００４】
好ましくは、プローブは、異なる分析物分子との二重鎖が、核酸のハイブリダイズしない部分の存在、長さまたは位置に関して異なるような長さおよび配列を有する。検出目的のために、このプローブを、好ましくは蛍光標識（例えば、フルオレセイン）で標識する。この標識は、代表的には、プローブの末端（例えば、５’末端）である。
【０００５】
代表的な分離において、各々の分析物分子は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する：選択された配列、選択された配列の異なる長さのフラグメント、選択された配列の内部欠失改変体または内部挿入改変体、選択された配列の変異改変体、およびそれらの組み合わせ。このような欠失改変体、挿入改変体または変異改変体は、一般的には、選択された配列の８ヌクレオチド当たり、少なくとも１つのこのような欠失または変異を含む。１つの実施形態において、この改変体は、選択された配列の１ヌクレオチド改変体である。
【０００６】
このプローブは、選択された配列に相補的な配列を含み得る。１つの実施形態において、このプローブは、選択された配列に等しい長さ、または選択された配列のわずか２５％長い長さを有する。このプローブはまた、最も長い分析物分子よりも短いものであり得るが、この分離条件下で、少なくとも１つの分析物分子と安定な二重鎖を形成するに有効な長さのものである。例は分離であり、ここで、分析物分子の間の長さおよび／または配列におけるバリエーションは、所定のサブ領域内（例えば、分析物分子の末端、または分析物分子の末端近傍）で生じ、そしてこのプローブは、分析条件下で、このサブ領域に安定にハイブリダイズするに有効である。好ましくは、このプローブは、複数の分析物分子またはすべての分析物分子と安定な二重鎖を形成するに有効であり、そしてこのような二重鎖は、電荷保有媒体内で、互いに分離され、そして一本鎖種から分離される。
【０００７】
例えば、この集団は、選択された配列のＮ−１欠失改変体である分析物分子を含み得、そしてこのプローブは、欠失部位を含む分析物分子の領域で、分離条件下において、少なくとも複数のこのような分析物分子と安定にハイブリダイズするに有効である。
【０００８】
別の実施形態において、プローブは、選択された配列のＮ−１欠失改変体と同一の配列および長さを有し、そして分析条件は、プローブが、このＮ−１欠失改変体とのみハイブリダイズするような条件である。
【０００９】
さらなる実施形態において、長さおよび／または配列バリエーションが生じるサブ領域が、分析物分子で、または分析物分子の近傍で生じ、そしてこのプローブは、この分析物末端にハイブリダイズする標識部分を末端に含む。この標識部分は、好ましくは、蛍光部分（例えば、フルオレセイン）である。
【００１０】
電荷保有支持体は、イオン交換媒体（ここで、工程（ｂ）の分離工程は、媒体を通じて溶離液を通過させる工程を包含する）、または電気泳動媒体（ここで、工程（ｂ）の分離工程は、媒体の反対の境界間に、電場を印加する工程を包含する）であり得る。この電気泳動媒体は、非篩分け（ｎｏｎ−ｓｅｉｖｉｎｇ）媒体であり得る。この媒体はまた、積載的（ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｅｄ）ｐＨ勾配（すなわち、等電点電気泳動における使用のための勾配）を含む媒体であり得る。
【００１１】
好ましくは、この分析物分子は、少なくとも７５％が非荷電である結合したサブユニットから構成される；１つの実施形態において、すべてのサブユニットが、非荷電である。分析物分子の例としては、ペプチド核酸、ホスホトリエステルオリゴヌクレオチド、メチルホスホネートオリゴヌクレオチド、モルホリノオリゴマー、および別のメンバーあるいはＤＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡまたは２’−Ｏ−アリルＲＮＡとのこの群の任意のメンバーのキメラが挙げられる。好ましい実施形態において、この分析物分子は、モルホリノオリゴマーであり、好ましくは、ホスホロアミデートサブユニット間結合および／またはホスホロジアミデートサブユニット間結合を有する。このプローブは、好ましくは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡ、２’−Ｏ−アリルＲＮＡ、ホスホロチオエートＤＮＡ、または任意のこれらのキメラであり、そして最も好ましくは、ＤＮＡである。分離の実行において、このプローブは、好ましくは、集団において、あらゆる分析物分子とハイブリダイズするに必要な濃度を超えた濃度で、混合物中に存在する。
【００１２】
１つの実施形態において、この方法は、集団中の少なくとも１つの標的分析物分子との標識プローブの二重鎖を検出および定量する工程をさらに包含する。別の実施形態において、この方法は、少なくとも１つのプローブ／分析物二重鎖を単離する工程をさらに包含する。
【００１３】
本発明のこれらの目的および特徴ならびに他の目的および特徴は、以下の発明の詳細な説明を、添付の図面と組み合わせて読む場合に、より完全に明らかになる。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
以下の用語は、別に示されない限り、以下の意味を有する。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、「オリゴマー」分子は、およそ８〜１００ヌクレオチド、好ましくは、およそ１０〜５０ヌクレオチド、そしてより好ましくは、およそ１０〜３０のヌクレオチドのサブユニットを有するオリゴヌクレオチドアナログである。
【００１６】
オリゴヌクレオチドまたはそのアナログは、ハイブリダイゼーションまたは二重鎖形成が、２つの一本鎖オリゴヌクレオチドまたはアナログの間で生じる場合に、互いに「相補的」と記載される。相補性（１つのオリゴヌクレオチドまたはアナログが、別のオリゴヌクレオチドまたはアナログと相補的である度合い）は、反対の鎖における塩基の割合に関して定量可能であり、この反対の鎖は、一般的に認められる塩基対合規則に従って、互いに水素結合を形成することが予想される。本発明に関連して、荷電核酸またはアナログは、荷電オリゴマープローブと非荷電分析物との間に形成された二重鎖が、二重鎖形態で分離媒体から溶出されるに十分に安定である限りは、分析物配列に１００％相補的であり得るか、またはほぼ相補的（例えば、１つ以上のミスマッチまたは欠失を含む）であり得る。このような場合において、このプローブおよび分析物は、分析条件下で、「安定にハイブリダイズされる」か、または「安定な二重鎖」を形成する。特に、ＰＭＯのＮ−１欠失配列は、以下に実証されるように、Ｎマーの荷電核酸とのハイブリダイゼーションによって分離可能であることが見出された。
【００１７】
二重鎖におけるＤＮＡの「ハイブリダイズしない」セグメントまたは別の荷電オリゴマーは、末端の一本鎖部分ならびに欠失部位またはミスマッチ部位での内部「ループ」をいい得る（例えば、図４Ｂのような）。
【００１８】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログの「サブユニット」は、オリゴマーの１つのヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）単位をいう。この用語は、付着したサブユニット間結合を有するかまたは有さないヌクレオチド単位をいい得るが、「荷電サブユニット」といわれる場合には、電荷は、代表的には、サブユニット間結合（例えば、ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合）の内部に存在する。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「非荷電」サブユニットは、およそ５〜およそ９のｐＨ範囲に対応して、中性またはほぼ中性のｐＨで非荷電であるサブユニットである。このサブユニット結合はまた、この範囲外のｐＨで非荷電のままであり得る。しかし、このｐＨは、Ｃ塩基およびＡ塩基がイオン化するｐＨ（およそ３）を超えなければならず、そしてＧ塩基およびＴ塩基がイオン化するｐＨ（およそ１１）未満でなければならない。本明細書中に開示される分析は、好ましくは、上記で規定されるような、中性またはほぼ中性のｐＨで行われる。フルオレセイン標識が使用される場合、穏やかに塩基性のｐＨ（すなわち、７〜９）が好ましい。
【００２０】
「荷電」サブユニットは、上記で規定されるように、中性またはほぼ中性のｐＨで荷電したサブユニットである。例は、ホスホジエステル（ネイティブＤＮＡ）結合サブユニットまたはホスホロチオエート結合サブユニットである。
【００２１】
「モルホリノオリゴマー」は、図１に示される形態のモルホリノサブユニット構造から構成されるオリゴヌクレオチドアナログであり、ここで、（ｉ）この構造は、１〜３原子長のリン含有結合によって互いに結合され、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を、隣接サブユニットの５’環外炭素に結合し、そして（ｉｉ）Ｐ_ｉおよびＰ_ｊは、ポリヌクレオチド中の塩基への塩基特異的水素結合によって結合するに有効な、プリンまたはピリミジン塩基対合部分である。このプリンまたはピリミジン塩基対合部分は、代表的には、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシルまたはチミンである。モルホリノオリゴマーの合成、構造および結合特性は、米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２１，０６３号および同第５，５０６，３３７号に詳述され、これらのすべては、本明細書中において参考として援用される。
【００２２】
図１Ｂに示されるサブユニットは、図２のＢ−Ｂで示されるように、６原子反復単位の骨格について使用される。これらの構造において、５’モルホリノ炭素をリン基に結合する原子Ｙ_１は、硫黄、窒素、炭素または好ましくは、酸素であり得る。リンから張り出したＸ部分は、塩基特異的水素結合を妨げない任意の安定な基である。好ましい基としては、アルキル、アルコキシ、チオアルコキシおよびアルキルアミノ（環状アミンを含む）が挙げられ、これらのすべては、塩基特異的結合が分裂しない限り、様々に置換され得る。アルキル、アルコキシおよびチオアルコキシは、好ましくは、１〜６個の炭素原子を含む。アルキルアミノは、好ましくは、低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）置換をいい、そして環状アミンは、好ましくは、酸素、窒素および硫黄から選択される１〜２個のさらなるヘテロ原子を必要に応じて含む、５〜７員の窒素複素環である。Ｚは、硫黄または酸素であり、そして好ましくは、酸素である。
【００２３】
好ましいモルホリノオリゴマーは、図２Ｂ−Ｂに示される形態のモルホリノサブユニット構造から構成され、ここで、この構造は、ホスホロジアミデート結合によって互いに結合され、ここで、Ｘ＝ＮＨ_２、ＮＨＲまたはＮＲ_２（ここで、Ｒは、低級アルキルであり、好ましくは、メチルである）、Ｙ＝ＯおよびＺ＝Ｏであり、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を、隣接サブユニットの５’環外炭素に結合し、Ｐ_ｉおよびＰ_ｊは、塩基特異的水素結合によって、ポリヌクレオチド中の塩基に結合するに有効なプリンまたはピリミジン塩基対合部分である。また、交互のホスホロジアミデート結合を有する構造が好ましく、ここで、図２Ｂ−Ｂにおいて、Ｘ＝低級アルコキシ（例えば、メトキシまたはエトキシ）であり、Ｙ＝ＮＨまたはＮＲであり、ここで、Ｒは、低級アルキルであり、そしてＺ＝Ｏである。
【００２４】
「ペプチド核酸」において、オリゴヌクレオチド骨格のデオキシリボースホスホジエステル単位が、ポリアミド結合で置換される。適切な骨格間隔が、２−アミノエチルグリシン単位の使用によって達成され、ヌクレオチド塩基が、メチレンカルボニル基を介して各々の２−アミノ基に付着する。
【００２５】
「２’−Ｏ−アリル（またはアルキル）改変オリゴヌクレオチド」は、２’ヒドロキシルが、それぞれアリルエーテルまたはアルキルエーテルに転換されるオリゴヌクレオチドである。アルキルエーテルは、代表的には、メチルエーテルまたはメトキシエチルエーテルである。
【００２６】
「アルキル」は、炭素および水素を含む完全に飽和した非環式一価の基をいい、これは、分枝鎖または直鎖であり得る。アルキル基の例は、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ヘプチルおよびイソプロピルである。「低級アルキル」は、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチルおよびｔ−ブチルによって例示されるような、１〜６個の炭素原子、および好ましくは、１〜４個の炭素原子のアルキル基をいう。
【００２７】
（ＩＩ．分離方法）
本発明は、本明細書中で分析物分子といわれる、実質的に非荷電のオリゴマー分子の集団の分離方法および／または分析方法を提供する。本発明の文脈において、「実質的に非荷電の」オリゴマー分子は、すべてのサブユニットが、（中性またはほぼ中性のｐＨ、すなわち、およそ５〜およそ９で）非荷電であるか、または十分な数が非荷電であるかのいずれかである分子であり、その結果、荷電オリゴマー（例えば、ＤＮＡ）との異なる長さの分析物分子の二重鎖が、本明細書中に記載される分離方法によって分離可能である。好ましくは、５０％を超えるサブユニット、より好ましくは、７５％を超えるサブユニット、そして最も好ましくは、９０％を超えるサブユニットが非荷電である。１つの実施形態において、このポリマーのすべてのサブユニットが非荷電である。分析物分子は、塩基対合部分の配列を支持する骨格を含み、この塩基対合部分は、ワトソンクリック塩基対形成を介して、相補的プローブ中の塩基とハイブリダイズするに有効であるという意味で、オリゴヌクレオチドアナログである。
【００２８】
分析物分子は、全長ポリマーの合成的調製または分解から産生され得る場合、異なる長さ（例えば、同じ「親」配列（Ｎマー）の異なる長さのフラグメントの混合物において）であり得る。内部欠失改変体または内部変異改変体（すなわち、所定のヌクレオチドが、それぞれ、存在しないかまたは異なるヌクレオチドで置換される改変体）がまた存在し得、そして内部挿入改変体が存在し得る。（Ｎ−１またはＮ＋１フラグメントがまた、それぞれ末端欠失または末端挿入とみなされ得ることに注意のこと。）このような改変体は、代表的には、およそ８ヌクレオチド当たり多くとも１バリエーションだけ、「親」配列と異なる。１つの実施形態において、この改変体は、選択された配列の１ヌクレオチド改変体である。種々の位置での１ヌクレオチドの欠失によってのみ配列が異なる同じ長さのオリゴマー（すなわち、選択された配列の異なるＮ−１種）の分解が、以下の実施例に例示される。単一位置の改変体配列の分離もまた、意図される。
【００２９】
分離は、種々の非荷電または実質的に非荷電のオリゴマー分子と、相補的な荷電オリゴヌクレオチドプローブ（これは、好ましくは、ＤＮＡ分子である）との間の二重鎖の形成に基づく。以下の議論において、荷電オリゴヌクレオチドプローブは、ＤＮＡといわれる；しかし、ＲＮＡまたは荷電オリゴヌクレオチドアナログがまた、プローブとして使用され得ることが理解される。
【００３０】
本方法の１つの実施形態において、分析物混合物は、同じ配列の異なる長さのフラグメント（これは、全長配列を含み得る）の混合物を含み、そしてＤＮＡ分子は、集団において最も長い分析物分子の予想された長さと同じ長さか、またはその予想された長さをわずかに超え、そして最も長い分析物分子の全長に相補的な（または、ほぼ相補的な）配列を有する。（より長いプローブ（例えば、最も長い分析物分子よりもおよそ２５％まで長いプローブ）がまた、使用され得る。）従って、分析物分子の長さに依存して、この分子：ＤＮＡ二重鎖は、例えば、図３に示されるように、完全な二本鎖であるか、またはいくつかの長さの一本鎖のハイブリダイズしないＤＮＡを含むかのいずれかである。
【００３１】
例えば、所定の配列を有するモルホリノオリゴマーの異なる長さのフラグメントのアニオン交換ＨＰＬＣ分離において、一本鎖オリゴマー（これは、非荷電である）が、少なくともアニオン交換カラム上に保持される。相補的ＤＮＡは、荷電したホスホジエステル骨格を有し、そして一本鎖形態において、配座が制限されない。従って、これは、正に荷電した固定相との相互作用を最大にし得るので、カラム上で最も長く保持される。（このような非制限電荷は、図３において、ボールドフェースの負電荷によって例示される。）オリゴマー：ＤＮＡ二重鎖は、ハイブリダイズしないＤＮＡと同じ電荷を有するが、ＤＮＡ骨格のうちのいくつかまたはすべては、二重鎖構造によって配座が束縛され、これは、固定相との骨格電荷の最適の相互作用を妨げる（図３において、ボールドフェースではない負電荷によって例示されるような）。従って、二重鎖は、束縛されない一本鎖ＤＮＡの量に依存した速度で、未結合のＰＭＯとＤＮＡとの間で溶出する。このような分離を、以下の実施例において実証する。
【００３２】
内部欠失配列の場合において、ＤＮＡのハイブリダイズしないループは、図４Ｂに例示されるように、二重鎖における異なる位置（欠失位置）で生じる。分解は、一般に、異なる長さの配列についての分解ほど優れていないが（ここで、二重鎖は、いくつかの長さの一本鎖ＤＮＡを含む）、このような欠失配列はまた、実施例２において示されるように分解され得る。
【００３３】
分離工程はまた、最も長いと予想される分析物分子よりも短いＤＮＡ分子を用いて行われ得る。この場合において、ＤＮＡ分子は、分析物分子の一部分にハイブリダイズする配列を有し、ここで、この部分は、各々の分析物分子の領域を含み、この領域において、分析物分子間の変異が予想され、そして安定な二重鎖を形成するに有効な長さである。例えば、分析物分子が、所定の末端での短縮によって、互いに異なる場合、得られた二重鎖は、図４Ａに例示されるように、荷電ＤＮＡのハイブリダイズしない部分に関して異なる。図４Ａに示されるように、ＤＮＡはまた、短いハイブリダイズしない末端配列（ＮＮＮＮによって、図に示される）を含み得る。
【００３４】
本発明の利点は、分解（特に、Ｎ−１マーの欠失配列の分解）において予想される増大である。図４Ａ〜Ｂに示されるように、短縮または欠失を含む分析物分子の一部分とのみハイブリダイズするＤＮＡは、分子全体にハイブリダイズするＤＮＡよりも優れた分解を提供することが予想される。なぜなら、相互作用の識別に関して、「非特異的」相互作用の割合が減少するからである。従って、この変異は、混合物の分解について最も適切であり、これにおいて、長さおよび／または配列の変異は、１つの末端、またはオリゴマーの特定の領域内部で広く生じることが予想される。
【００３５】
全長「親」オリゴマーからのＮ−１欠失改変体種の二重鎖の分離が、（１）欠失が、オリゴマーの末端（例えば、５’末端）、またはその末端付近で生じる場合、および（２）二重鎖の形成に使用されるプローブが、ハイブリダイズする末端（この場合においては、３’末端）で、標識部分（例えば、フルオレセインのような蛍光部分）を含む場合に増強されることがまた見出されている。類似の増強された分離は、Ｎ−１欠失が、分析物オリゴマーの３’末端またはその末端付近で生じ、そしてプローブが、５’末端でそのように標識される場合に観察される。
【００３６】
プローブはまた、特定のＮ−１種（その種の同じ長さおよび配列である）を特異的に標的し得、そして分析は、十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（代表的には、温度に関して）行われ、その結果、プローブは、そのＮ−１種とのみ安定にハイブリダイズする。あるいは、分析は、幾分低いストリンジェント条件下で行われ得、その結果、プローブは、Ｎマーおよびいくつかの他のＮ−１種と安定にハイブリダイズし得、そして二重鎖は、電荷保有分離媒体との異なる相互作用に基づいて分離され得る。
【００３７】
分離または分析の実行において、分離されるべき分子集団および荷電プローブ分子（好ましくは、標識ＤＮＡ）の混合物が、適切なハイブリダイズ条件下で形成され、そしてこの混合物が、電荷保有分離媒体（好ましくは、アニオン交換カラム）に適用される。ＤＮＡプローブが、相補的領域またはほぼ相補的な領域を有するあらゆる分析物分子と安定にハイブリダイズすることが望まれる場合、このプローブが、好ましくは過剰に添加される。次いで、二重鎖が、媒体内部で、代表的には溶出によって、中性またはほぼ中性のｐＨ（およそ５とおよそ９との間）で分離される。
【００３８】
この分析は、一般的には、所望の分析物の二重鎖の十分にＴｍ未満の温度で行われて、その分析物が、分離の間に二重鎖形態のままでいることを確実にする。好ましくは、この温度は、最も低いと予想されるＴｍ未満のおよそ２０℃である。しかし、例えば、上記のように、プローブが、選択種のみと安定にハイブリダイズすることが所望である場合、より高い温度が用いられて、ストリンジェンシーを増大し得る。
【００３９】
この方法は、標識ＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって、低いレベルの分析物の検出を可能にする。この標識は、好ましくは、蛍光標識（例えば、フルオレセイン）であり、そして代表的には、ＤＮＡプローブの末端に付着する。分析物のフラグメントを含むかまたは分析物のフラグメントであるが、しかし異なる長さである配列を有する内部標準が、分析物の定量について使用され得る。実施例３は、血漿サンプルにおける極めて低いレベル（およそ１０ｎｇ）の特定のＰＭＯの検出におけるこの方法の使用を実証する。
【００４０】
（ＩＩＩ．分析物分子）
上記のように、本発明の文脈において、「実質的に非荷電の」オリゴマー分子は、オリゴヌクレオチドアナログであり、このアナログにおいて、ヌクレオチドサブユニットのすべてが、中性またはほぼ中性のｐＨ（およそ５〜およそ９）で非荷電であるか、または十分な数が、上記のｐＨで非荷電であり、その結果、荷電オリゴマー（例えば、ＤＮＡ）との異なる長さの分子の二重鎖が、本明細書中に記載の分離方法によって分離可能である。
【００４１】
周知の非荷電オリゴヌクレオチドアナログの例としては、非荷電のサブユニット間結合を有する、ペプチド核酸、ホスホトリエステルオリゴヌクレオチド、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドおよびモルホリノオリゴマーが挙げられる。好ましい実施形態において、分析物オリゴマーは、非荷電のサブユニット間結合を有するモルホリノオリゴマーである。このような結合は、図２ＡＡ〜２ＥＥに例示される。好ましい実施形態において、この結合は、図２Ｂ−Ｂによって示されるように、ホスホロジアミデート結合（ここで、Ｘ＝ＮＨ_２、ＮＨＲまたはＮＲ_２（ここで、Ｒは低級アルキルであり、好ましくは、メチルである）、Ｙ＝ＯおよびＺ＝Ｏである）、ならびに図２Ｂ−Ｂによってまた示されるような交互のホスホロジアミデート結合（ここで、Ｘ＝ＯＲ、Ｙ＝ＮＨまたはＮＲ、およびＺ＝Ｏ（ここで、Ｒは低級アルキルである））から選択される。これらの結合のいずれかを有するモルホリノオリゴマーが、本明細書中でＰＭＯといわれる。
【００４２】
分析物分子はまた、上記で示されたオリゴヌクレオチドアナログのキメラを含み得る。また、キメラ（例えば、荷電オリゴマー（例えば、ＤＮＡ、２−Ｏ−アルキルＲＮＡまたは２−Ｏ−アリルＲＮＡ）を含む交互コポリマー）が含まれる。上記のように、このようなコポリマーの少なくとも５０％のサブユニットが非荷電であることが好ましい。
【００４３】
荷電核酸に相補的な領域を有さない分析物分子が、ハイブリダイズされないまま残り、そして荷電ベースの分離を伴わずに、荷電媒体を迅速に通過することが予想される。従って、本発明の方法は、同じ配列の異なるフラグメントを示す分析物分子の混合物について最も適切である。例は、実施例１に例示されるように、合成反応混合物である。この実施例は、ただ１つのサブユニットだけ長さが異なるいくつかのＰＭＯの混合物の分離における方法の使用を例示する。実施例２は、Ｎ−１欠失配列の分解を例示する。生物学的経路または他の経路によるオリゴマーの骨格開裂がまた、分解産物の分析によって決定され得る。
【００４４】
（ＩＶ．荷電核酸オリゴマー）
二重鎖形成について使用される荷電核酸は、最も代表的なＤＮＡである。しかし、任意の荷電した、安定にハイブリダイズするＲＮＡアナログまたはＤＮＡアナログがまた使用され得る。このオリゴマーは、好ましくは、そして最も簡便に、完全に荷電しているが、十分な数の荷電サブユニットを含むことのみが必要であり、その結果、異なる長さの分析物分子とのこのオリゴマーの二重鎖が、本明細書中に記載される分離方法によって分離可能である。分析の簡便化および単純化について、一種の（すなわち、１つの長さおよび配列の）荷電核酸またはアナログが好ましくは用いられる。
【００４５】
使用され得る荷電核酸アナログとしては、改変ＤＮＡ、ＲＮＡ、改変ＲＮＡ（例えば、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡまたは２’−Ｏ−アリルＲＮＡ）およびホスホロチオエートＤＮＡが挙げられる。この意味での「改変」は、このような改変が、荷電：非荷電二重鎖のハイブリダイゼーションまたは分解を妨げない限りは、リボース糖基または塩基対合部分（例えば、Ｃ−２−メチルまたはＣ−２−プロピニル置換塩基）に対する改変を含む。
【００４６】
分離ストラテジーに従って、ＤＮＡまたは荷電アナログは、異なる分析物分子とのその二重鎖が、二重鎖形成の際に生じるハイブリダイズしない部分（すなわち、一本鎖もしくは内部ループ）の存在、長さおよび／または位置に関して異なるような長さおよび配列を有する。これは、分離されると意図される最も長い分析物分子の少なくとも一部分の配列に相補的またはほぼ相補的である。これはまた、末端のハイブリダイズしない配列を含み得る（図４Ａ〜Ｂを参照のこと）。
【００４７】
本方法の１つの実施形態において、ＤＮＡは、分離されると意図される最も長い分析物分子の予想される長さと同じかまたはそれを超える長さを有する。しかし上記のように、より短いＤＮＡが、特に分析物分子間の予想される差異が、主に分析物分子の推定サブ領域内にある場合に使用され得る。
【００４８】
このＤＮＡは、最も長い分析物分子よりも長くあり得、そして／またはハイブリダイズしない配列を含み得、二重鎖におけるハイブリダイズしないＤＮＡの長さの増大が、より長い保持時間および電荷保有媒体との非特異的相互作用の増大をもたらす。従って、大半の適用について、ＤＮＡは、最も長い分析物分子の予想される長さよりもわずか約２５％長い。
【００４９】
検出目的について、プローブが、好ましくは、蛍光標識（例えば、フルオレセイン）で、そして好ましくは、プローブの５’末端または３’末端で標識される。
【００５０】
（Ｖ．分離技術）
荷電した生体高分子の分離に有用な任意の荷電ベースの分離技術が使用されて、本発明に従って、荷電核酸またはアナログと実質的に非荷電の分析物分子を混合することによって形成される荷電：非荷電二重鎖を分離し得る。このような技術は、当該分野で周知である。一般に、この混合物は、当該分野で公知の手順に従って、分離について電荷保有分離媒体に適用される。分離は、中性またはほぼ中性のｐＨで、ＤＮＡおよび分析物分子間の二重鎖が、分離目的について十分に維持されるような条件下で行われる。好ましい方法において、電荷保有媒体は、イオン交換樹脂（特に、アニオン交換カラム）であり、そして溶出は、以下の実施例のように、中性またはほぼ中性のｐＨで行われる。
【００５１】
他の実施形態において、電荷保有分離媒体は、電気泳動媒体である。このような媒体は、当該分野で周知の手順に従って、反対の境界間に電場を印加することによって荷電される。このような媒体における荷電分子の分離の確立された分離方法としては、キャピラリー電気泳動、ゲル電気泳動（例えば、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動））および等電点電気泳動が挙げられ、これは、積載的ｐＨ勾配を利用する。本発明の方法は、非篩分け媒体、すなわち、サイズによって分子を識別しない媒体を利用し得る。例は、非ゲルキャピラリー電気泳動および非ゲル等電点電気泳動である。
【００５２】
（ＶＩ．適用）
代表的な分析において、最も長いと予想される分析物分子の少なくともいくつかの領域と相補的か、またはほぼ相補的であるＤＮＡ分子（代表的には、蛍光標識されたＤＮＡ分子）が、上記のように、分析物分子を含むサンプルと混合される。このサンプルは、既知の単離プロトコル（例えば、実施例３において、血漿について以下に記載されるような）に従って、分析について調製される生物学的サンプル（例えば、血漿、尿または組織溶解物サンプル）であり得る。あるいは、これは、オリゴヌクレオチド合成由来の産物の混合物であり得る。極めて過剰のＤＮＡが用いられて、二重鎖の完全な形成を確実にし得る。なぜなら、遊離のＤＮＡは、二重鎖から十分に離れて移動し、これは、妨げないからである。好ましくは、ＤＮＡは、さらなる使用について、特に、反応混合物の予備分離の場合に回収される。
【００５３】
以下の実施例１は、２０マーのＰＭＯから、１３マー〜１９マーの短縮型種のイオン交換による分離を例示する。分離は、７〜９のｐＨ範囲を有する溶離液を用いて、Ｄｉｏｎｅｘ　ＤＮＡ　Ｐａｃ（登録商標）イオン交換カラム上で行われた。図５Ａ〜Ｂに示されるように、１ヌクレオチド長だけ異なる種が、明確に分解された。
【００５４】
実施例２は、種々の１９マーのＮ−１欠失種の分離を示し、これにおいて、１ヌクレオチドが、親の２０マーから欠失された。異なる１９マーの保持時間における差異が、図６〜９に示される。
【００５５】
これらの分析のすべてにおいて、サンプルマトリックスからの極めて少ないバックグラウンドが観察され、そして極めて低いレベルの分析物が、検出および定量され得る。血漿サンプルにおける標的ＰＭＯの検出におけるこの方法の感受性は、実施例３に実証される。較正曲線（図１０）は、２００μＬの血漿サンプル、および図１１に示される漸増量の１５マー標準を用いて調製された。血漿サンプルの分析において、１５マーの内部標準が、２０マーの分析物から正確に分離され、これは、１０ｎｇまたは５０ｎｇ／ｍＬのレベルで検出された（図１２）。
【００５６】
（実施例）
以下の実施例は、本発明を例示するが、本発明を制限するように意図されない。
【００５７】
（材料および方法）
ＤＮＡを、Ｈｙｂｒｉｄｏｎ　Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓから購入した。分析物（配列ＡＣＧ　ＴＴＧ　ＡＧＧ　ＧＧＣ　ＡＴＣ　ＧＴＣ　ＧＣ（配列番号１）を有するＰＭＯ）および配列ＧＡＧ　ＧＧＧ　ＣＡＴ　ＣＧＴ　ＣＧＣ（配列番号２）を有する内部標準としての１５マーのフラグメント（図１１）を、標準的な方法に従って、ＡＶＩ　ＢｉｏＰｈａｒｍａで調製した。（配列番号１は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ００１９６のヌクレオチド２５５１〜２５７０に対応するヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子配列に対するアンチセンスである。）１５マーの同一性を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって確認した（計算値、Ｍ＋Ｈ　５３５０．６、見出された値、５３５０．０）。
【００５８】
ＨＰＬＣを、Ｒａｉｎｉｎ　Ａｌ−２００自動サンプラーを備えた、そしてＶａｒｉａｎ　９０７５蛍光検出器に接続したＶａｒｉａｎ　９０１０「挿入」ポンプを用いて行った。データ獲得を、Ｖａｒｉａｎ　Ｓｔａｒクロマトグラフィーワークステーション、５．３版を用いて行った。ＨＰＬＣ条件は、以下に記載される通りであった。
【００５９】
（実施例１．２０マーＰＭＯの１３マー〜１９マーの短縮型種の分解）
１３マー〜１９マーの短縮型種、および配列ＡＣＧ　ＴＴＧ　ＡＧＧ　ＧＧＣ　ＡＴＣ　ＧＴＣ　ＧＣ（配列番号１）を有する親の２０マーＰＭＯとの混合物を、相補的な２０マーＤＮＡとの錯形成反応によって分解した。ＨＰＬＣ条件は、以下の通りであった：
カラム：Ｄｉｏｎｅｘ　ＤＮＡ　Ｐａｃ（登録商標）ＰＡ−１００（２５０×４ｍｍ、１５μ粒子サイズ）
移動相：Ａ：０．０２５Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）；Ｂ：０．０２５Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）／１Ｍ　ＮａＣｌ
勾配：Ａ：Ｂ：Ｃ　０分で９０／１０〜２０分で５５／４５
流速：１．５ｍＬ／分
波長：２５４ｎｍ
温度：２５℃
図５Ａ〜Ｂに示されるように、すべての種が分解された。上記で議論されるように、保持時間の変化は、それぞれのＰＭＯ：ＤＮＡ二重鎖の配座が制限されない荷電および配座が抑制される荷電の相対比に起因すると考えられる。
【００６０】
（実施例２．Ｎ−１欠失種の分解）
本研究において、配列ＡＣＧ　ＴＴＧ　ＡＧＧ　ＧＧＣ　ＡＴＣ　ＧＴＣ　ＧＣ（配列番号１）を有する２０マーＰＭＯ由来のＮ−１　１９マー種とのＤＮＡ二重鎖の保持時間を、全長２０マー：ＤＮＡ二重鎖と比較した。０．１ＯＤ／３０．０μＬのＤＮＡ溶液を、０．１ＯＤのＮ−１オリゴマーを含む水性サンプルの各々１００．０μＬのアリコートに添加し、そしてこの溶液を、完全に混合した。各々の得られる溶液の１０．０μＬのアリコートを、自動サンプラーを使用して取り出し、そしてＨＰＬＣ（イオン交換）によって分析した。ＨＰＬＣ条件は、以下の通りであった：
カラム：Ｄｉｏｎｅｘ　ＤＮＡ　Ｐａｃ（登録商標）ＰＡ−１００（２５０×４ｍｍ、１５μ粒子サイズ）
移動相：Ａ：水；Ｂ：０．２５Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）；Ｃ：１Ｍ　ＮａＣｌ
勾配：Ａ：Ｂ：Ｃ　０分で８０／１０／１０〜２０分で４５／１０／４５
流速：１．５ｍＬ／分
温度：２５℃
検出：紫外線、２５４ｎｍ
保持時間を、以下の表１に与える。示されるように、すべてのＮ−１二重鎖サンプルが、全長２０マー：ＤＮＡ二重鎖の後に溶出された。図６〜９は、各々のヌクレオチドについての種々のＮ−１種についての保持時間を示すクロマトグラムのオーバーレイを示す。
【００６１】
【表１】

（実施例３．血漿における標的ＰＭＯ種の定量）
ＨＰＬＣ条件：
カラム：Ｄｉｏｎｅｘ　ＤＮＡ　Ｐａｃ（登録商標）ＰＡ−１００（２５０×４ｍｍ、１５μ粒子サイズ）
移動相：Ａ：０．０２５Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）；Ｂ：０．０２５Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）／１Ｍ　ＮａＣｌ
勾配：Ａ：Ｂ：Ｃ　０分で９０／１０〜２０分で５５／４５
流速：１．５ｍＬ／分
波長：４９４ｎｍ励起；５１８ｎｍ検出
温度：２５℃
カニクイザルを、分析物ＰＭＯを用いてｉ．ｖ．注入し、そして血液サンプルを、表２に示されるように、種々の時間間隔で採取した。代表的な分析において、２００μＬの血漿を、１０μＬの０．０２５Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８〜９において、既知量（例えば、５００ｎｇ）の内部標準（図１１）と組み合わせた。メタノール（２００．０μＬ）を添加し、そしてこのサンプルを、ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）ミキサーを用いて混合した。この沈殿を、高速遠心分離の助けによって除去した。上清を取り出し、そしてペレットを、１００μＬのＴｒｉｓ緩衝液で洗浄した；この洗浄液を、上清に添加した。この混合物を、１０分間７０℃で加熱し、そしてサンプルを、高速遠心分離にもう一度供した。上清を移し、そして乾燥するまで凍結乾燥した。乾燥物質を、０．０２５Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８〜９）において、１００．０μＬアリコートのＤＮＡ（５’−フルオレセイン標識された）を用いて再構成し、そして自動サンプラーバイアルに移し、そしてサンプル全体を、ＨＰＬＣカラム上に注入し、そして分析した。
【００６２】
較正を、２５０ｎｇ〜２０，０００ｎｇのＡＶＩ−４１２６を含む血漿標準の分析によって行った。データを、内部標準シグナル強度に対する分析物の比対内部標準濃度に対する分析物の比としてプロットした。このプロットを、図１０に示し、これは、０．９９９９２０の相関係数を示す。
【００６３】
内部標準に基づくサンプルの定量を、表２に与える。代表的なアッセイのクロマトグラムを、図１２に示す。このアッセイにおいて検出されるレベルは、１０．０ｎｇの分析物であり、これは、５０ｎｇ／ｍＬに対応した。従って、本方法の感受性は、紫外線ベースの方法の検出限界および定量限界をはるかに超える。
【００６４】
【表２】

本発明は、特定の方法および実施形態に関して記載してきたが、種々の改変が、本発明を逸脱することなくなされ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、モルホリノオリゴマーの形成に適切な、５原子（Ａ）結合群、６原子（Ｂ）結合群および７原子（Ｃ〜Ｅ）結合群を有するいくつかの好ましいサブユニットを示す。
【図２】
図２Ａ−Ａ〜２Ｅ−Ｅは、Ａ−Ａ〜Ｅ−Ｅと称される例示的なモルホリノオリゴマーの反復サブユニットセグメントを示し、これらは、それぞれ図１のサブユニットＡ〜Ｅを用いて構築された。
【図３】
図３は、全長の分析物オリゴマーに等しい長さを有する相補的荷電核酸（例えば、ＤＮＡ）との、異なる長さの非荷電分析物オリゴマーのハイブリダイゼーションを例示する。
図３において、以下の配列を利用する：第一の「非荷電」配列は、本明細書中で配列番号１として示される、ＡＣＧ　ＴＴＧ　ＡＧＧ　ＧＧＣ　ＡＴＣ　ＧＴＣ　ＧＣである。（この配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ００１９６のヌクレオチド２５５１〜２５７０に対応するヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子配列に対するアンチセンスである。）この図におけるすべての「荷電」配列は、配列番号１の相補体である。図３における引き続く「非荷電」配列は、本明細書中で配列番号３（ＡＣＧ　ＴＴＧ　ＡＧＧ　ＧＧＣ　ＡＴＣ　ＧＴＣ）、配列番号４（ＡＣＧ　ＴＴＧ　ＡＧＧ　ＧＧＣ　ＡＴＣ　Ｇ）、配列番号５（ＡＣＧ　ＴＴＧ　ＡＧＧ　ＧＧＣ　ＡＴ）、配列番号６（ＧＴＴ　ＧＡＧ　ＧＧＧ　ＣＡＴ）および配列番号７（ＴＧＡ　ＧＧＧ　ＧＣＡ　ＴＣＧ　ＴＣＧ　Ｃ）として示される、配列番号１のフラグメントである。
【図４】
図４Ａは、分析物分子の短縮末端に安定にハイブリダイズするに十分な長さを有し、そして任意のハイブリダイズしないセグメント（ＮＮＮＮによって示される）を含む相補的荷電核酸（例えば、ＤＮＡ）との、異なる長さの非荷電分析物オリゴマーのハイブリダイゼーションを例示する。図４Ｂは、欠失が生じる分析物分子の領域に安定にハイブリダイズするに十分な長さを有する相補的荷電核酸（例えば、ＤＮＡ）との、欠失改変体の非荷電分析物オリゴマーのハイブリダイゼーションを例示する。
図４Ａにおいて、以下の配列が利用される：第一の「非荷電」配列は、本明細書中で、配列番号１として示されるＡＣＧ　ＴＴＧ　ＡＧＧ　ＧＧＣ　ＡＴＣ　ＧＴＣ　ＧＣである。図４Ａにおける引き続く「非荷電」配列は、本明細書中で配列番号３（ＡＣＧ　ＴＴＧ　ＡＧＧ　ＧＧＣ　ＡＴＣ　ＧＴＣ）および配列番号４（ＡＣＧ　ＴＴＧ　ＡＧＧ　ＧＧＣ　ＡＴＣ　Ｇ）として示される、配列番号１のフラグメントである。この図におけるすべての「荷電」配列は、配列番号１の相補体、および本明細書中で配列番号８（ＮＮＮＮ　ＧＣＧ　ＡＣＧ　ＡＴＧ　ＣＣＣ、５’から３’で記す）として示されるさらなる配列ＮＮＮＮのフラグメントであり、ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドである。
図４Ｂにおいて、以下の配列を利用する：第一の「非荷電」配列は、本明細書中で配列番号１として示される、ＡＣＧ　ＴＴＧ　ＡＧＧ　ＧＧＣ　ＡＴＣ　ＧＴＣ　ＧＣである。図４Ｂにおける引き続く「非荷電」配列は、本明細書中で配列番号１０（ＡＣＧ　ＴＴＧ　ＡＧＧ　ＧＧＣ　ＡＴＣ　ＴＣＧ　Ｃ）として示される、配列番号１の欠失改変体である。この図における「荷電」配列の両方は、本明細書中で配列番号９（ＣＧＡ　ＣＧＡ　ＴＧＣ　Ｃ、５’から３’で記す）として示される、配列番号１の相補体のフラグメントである。
【図５】
図５Ａ〜５Ｂは、１３マー〜２０マーのモルホリノオリゴマーとのＤＮＡの二重鎖のアニオン交換による分解を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図６】
図６は、２０マーのモルホリノオリゴマーの種々のＮ−１欠失配列（図６、Ｎ〜Ａ）とのＤＮＡの二重鎖のアニオン交換保持時間を示すＨＰＬＣクロマトグラムのオーバーレイである。
【図７】
図７は、２０マーのモルホリノオリゴマーの種々のＮ−１欠失配列（図７、Ｎ〜Ｃ）とのＤＮＡの二重鎖のアニオン交換保持時間を示すＨＰＬＣクロマトグラムのオーバーレイである。
【図８】
図８は、２０マーのモルホリノオリゴマーの種々のＮ−１欠失配列（図８、Ｎ〜Ｇ）とのＤＮＡの二重鎖のアニオン交換保持時間を示すＨＰＬＣクロマトグラムのオーバーレイである。
【図９】
図９は、２０マーのモルホリノオリゴマーの種々のＮ−１欠失配列（図９、Ｎ〜Ｔ）とのＤＮＡの二重鎖のアニオン交換保持時間を示すＨＰＬＣクロマトグラムのオーバーレイである。
【図１０】
図１０は、２０マーのＰＭＯ分析物および１５マーのＰＭＯ内部標準の濃度に対するピーク面積を示す較正曲線である。
【図１１】
図１１は、１５マーのＰＭＯ内部標準の構造を示す。
【図１２】
図１２は、内部標準由来のＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖を有する二重鎖および過剰のＤＮＡの分解による、血漿サンプル中のおよそ１０ｎｇの標的ＰＭＯの検出を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。

Claims (27)

1. オリゴマー分析物分子の集団を分析する方法であって、該方法は、以下：
   （ａ）（ｉ）分析物分子の集団であって、該分子の各々は、少なくとも５０％が非荷電である結合サブユニットから構成され、かつ核酸または荷電核酸アナログである特異的プローブ分子と、ワトソン−クリック塩基対形成を介してハイブリダイズし得る、分析物分子の集団と（ｉｉ）該プローブ分子との混合物を、
   該プローブ分子が該分析物分子の複数または全てと安定な二重鎖を形成するような条件下で、電荷保有分離媒体に適用し、
   それによって、プローブ−分析物二重鎖、一本鎖分析物、一本鎖プローブおよびこれらの組み合わせから選択される種の混合物を形成する、工程；ならびに
   （ｂ）該二重鎖を、互いに、そして該媒体内の一本鎖種から分離する工程、
   を包含する、方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、前記各分析物分子のヌクレオチド配列が、選択された配列、該選択された配列の異なる長さのフラグメント、該選択された配列の内部欠失改変体または内部挿入改変体、該選択された配列の変異改変体およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、方法。
3. 前記欠失改変体、挿入改変体または変異改変体が、多くても、前記選択された配列の８ヌクレオチド当たり１つのこのような欠失、挿入または変異を含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記プローブが、異なる分析物分子との該プローブの二重鎖が前記核酸のハイブリダイズしていない部分の存在、長さまたは位置に関して異なるような、長さおよび配列を有する、請求項１に記載の方法。
5. 前記プローブが、前記選択された配列に対して相補的な配列を有する、請求項２に記載の方法。
6. 前記プローブが、前記選択された配列と等しい長さを有するか、または該選択された配列の２５％だけ長い長さを有する、請求項５に記載の方法。
7. 前記プローブが、前記選択された配列のＮ−１欠失改変体に対して相補的な配列を含む、請求項２に記載の方法。
8. 前記プローブが、前記選択された配列の前記Ｎ−１欠失改変体と等しい長さを有する、請求項７に記載の方法。
9. 前記条件が、前記プローブが前記Ｎ−１欠失改変体にのみハイブリダイズするような条件である、請求項８に記載の方法。
10. 請求項２に記載の方法であって、前記分析物分子間の配列または長さにおけるバリエーションが、前記選択された配列の所定のサブ領域内で生じ、そして前記プローブが、前記分析条件下で該サブ領域と安定にハイブリダイズするのに有効である、方法。
11. 請求項１０に記載の方法であって、前記集団が、前記選択された配列のＮ−１欠失改変体である分析物分子を含み、そして前記プローブが、前記分離条件下で、欠失部位を含む該分析物分子の領域において、各分析物分子に安定にハイブリダイズするのに十分な配列および長さを有する、方法。
12. 前記サブ領域が、前記分析物分子の末端であるか、または末端に近い、請求項１０に記載の方法。
13. 前記末端が、それぞれ、前記分析物分子の５’末端または３’末端であり、そして前記プローブが、それぞれ、その３’末端または５’末端に標識部分を含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記標識部分が、蛍光標識である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記電荷保有支持体が、イオン交換媒体であり、そして前記分離する工程（ｂ）が、該媒体に溶離液を通過させる工程を包含する、請求項１に記載の方法。
16. 前記電荷保有支持体が、電気泳動媒体であり、そして前記分離する工程（ｂ）が、該媒体の反対の境界間で電場を印加する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
17. 前記媒体が、積載的なｐＨ勾配を含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記分析物分子が、少なくとも７５％が非荷電である結合サブユニットから構成される、請求項１に記載の方法。
19. 前記サブユニットの全てが、非荷電である、請求項１８に記載の方法。
20. 請求項１に記載の方法であって、前記分析物分子が、ペプチド核酸、ホスホトリエステルオリゴヌクレオチド、メチルホスホネートオリゴヌクレオチド、モルホリノオリゴマー、および別のメンバーまたはＤＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡもしくは２’−Ｏ−アリルＲＮＡとの、この群のいずれかのメンバーとのキメラからなる群より選択される、方法。
21. 前記分析物分子が、モルホリノオリゴマーである、請求項２０に記載の方法。
22. 前記モルホリノオリゴマーが、ホスホラミデートおよびホスホロジアミデートからなる群より選択される、サブユニット間結合を有する、請求項２１に記載の方法。
23. 前記プローブが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡ、２’−Ｏ−アリルＲＮＡ、ホスホロチオエートＤＮＡ、およびこれらのキメラからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
24. 前記核酸がＤＮＡである、請求項２３に記載の方法。
25. 前記プローブが標識される、請求項１に記載の方法。
26. 前記集団中の少なくとも１つの標的分析物分子との、前記標識されたプローブの二重鎖を、検出および定量する工程をさらに包含する、請求項２５に記載の方法。
27. 少なくとも１つの前記二重鎖を単離する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。

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