FI111266B - Nukleiinihappojen suojaaminen ja analyysimenetelmät - Google Patents
Nukleiinihappojen suojaaminen ja analyysimenetelmät Download PDFInfo
- Publication number
- FI111266B FI111266B FI962340A FI962340A FI111266B FI 111266 B FI111266 B FI 111266B FI 962340 A FI962340 A FI 962340A FI 962340 A FI962340 A FI 962340A FI 111266 B FI111266 B FI 111266B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- nucleic acid
- sequence
- formula
- analog
- complex
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
- C07K14/003—Peptide-nucleic acids (PNAs)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
111266
Nukleiinihappojen suojaaminen ja analyysimenetelmät - Skyddandet av nukleinsyror och analysförfaranden 5 Keksintö koskee menetelmiä nukleiinihappojen suojaamiseksi esimerkiksi nukleaa-sien hyökkäykseltä, ja analyyttisiä menetelmiä ja erityisesti menetelmiä kiinnostuksen kohteena olevan sekvenssin läsnäolon havaitsemiseksi nukleiinihappoa sisältävässä näytteessä.
10 Nykyisin tavallinen tapa sen määrittämiseksi, onko erityinen emässekvenssi läsnä nukleiinihapponäytteessä, on suodatinhybridisointi. Nukleiinihappo uutetaan lähtö-materiaaleista ja puhdistetaan. Se on ehkä monistettava prosessilla kuten PCR. Sitten nukleiinihappo immobilisoidaan yksijuosteisessa muodossa suodattimelle, ja koetetaan leimatulla oligonukleotidilla, jolla on sekvenssi, joka on komplemen-15 taarinen havaittavalle sekvenssille. Ennen immobilisointia nukleiinihappo voidaan ajaa geelillä eri molekyylimassaisten nukleiinihappofragmenttien erottamiseksi. Tämä on laajalti käytetty "Southern blot" -menettelytapa. Tällä menettelytavalla on lukuisia haittoja. Nukleiinihappo on erotettava muista materiaaleista. Kun nukleiinihappo on DNA:ta, on normaalisti välttämätöntä, että se kulkee denaturointi-20 vaiheen kautta. Hybridisoinnin olosuhteiden ankaruus on säädettävä tarkasti, jotta vältettäisiin väärät positiiviset tulokset ja jotta saavutettaisiin samankaltaisten sekvenssien välisen erotuksen haluttu taso. Suodatinhybridisoinnin rajallisesta signaa-li/kohina-suhteesta johtuen ovat monistusvaiheet usein välttämättömiä havaitsemisen kannalta kiinnostavan sekvenssin riittävästi tuottamiseksi. Tämä luo monia 25 tilaisuuksia väärien negatiivisten tulosten tuottamiselle.
Nukleiinihappoanalogit, joilla on tärkeitä uusia käyttöjä määritysmenettelytavoissa ja diagnostiikan alalla, on kuvattu julkaisussa WO 92/20703. Näillä nukleiinihappo-analogeilla on joukko uusia ominaisuuksia, jotka tekevät ne erityisen tärkeiksi 30 diagnostiikan alalla samoin kuin "anti-sense"-terapeutiikan alalla. Sellaisia nukleii-.. nihappoanalogeja kutsutaan tässä "PNA:iksi".
Niissä on tyypillisesti polyamidirunko, jossa on sekvenssi ligandeista, jotka ovat nukleiinihappoemäksiä. Siellä kuvattujen analogien ominaisuutena on hybridisoitua 35 suurella spesifisyydellä ja stabiilisuudella komplementaarisen sekvenssin omaaviin luonnollisiin nukleiinihappoihin.
111266 2
Olemme nyt keksineet, että sellaisilla nukleiinihappoanalogeilla on edelleen se arvokas ominaisuus, että ne suojaavat yksijuosteisten nukleiinihappojen sekvenssejä, joihin ne ovat hybridisoituneet, määrättyjen reagenssien aiheuttamalta hajoamiselta tilanteissa ja olosuhteissa, joissa reagenssit normaalisti olisivat tehokkaita mainittu-5 jen yksijuosteisten nukleiinihappojen hajoamisen aiheuttamisessa. Nukleiinihappo-analogiin hybridisoitumattomat nukleiinihappoalueet voivat hajota kuten normaalisti.
Niinpä keksintö aikaansaa menetelmän nukleiinihapon valitun alueen suojaamiseksi 10 reagenssin hyökkäykseltä, jossa menetelmässä muodostetaan kompleksi nukleiinihapon ja nukleiinihappoanalogin välille, joka hybridisoituu siihen sekvenssiselek-tiivisesti, ja altistetaan mainittu nukleiinihappo nukleiinihapon kimppuun hyökkäävälle reagenssille, jolloin mainittu kompleksi on stabiilimpi mainitun reagenssin hyökkäystä vastaan kuin mainittu lähtöainenukleiinihappo.
15
Nukleiinihappo voi olla RNA:ta tai DNA:ta.
Edullisesti mainittu reagenssi on nukkaasi ja pystyy hajottamaan mainitun nukleiinihapon joko täydellisesti tai katkaisemalla sen määrätyissä kohdissa.
20
Suorasuuntaisimmassa tapauksessa nukleiinihapon valittu alue, joka on suojattava, koostuu nukleiinihapposekvenssistä, johon nukleiinihappoanalogi hybridisoituu. Kun hyökkäävä reagenssi on eksonukleaasi, joka pystyy hajottamaan nukleiinihappoja olosuhteissa, joita käytetään vain 5'- ja 3'-päistä käsin työskenneltäessä, 25 voidaan kuitenkin suurempi valittu alue suojata sijoittamalla vastaava nukleiinihappoanalogi valitun alueen kumpaankin päähän jättäen valitun alueen osa hybridi-soimatta kahden nukleiinihappoanalogisekvenssin välillä. Valitun alueen välissä oleva osa on suojattu eksonukleaasin käsiksi pääsyltä. Kun eksonukleaasi pystyy, käytetyissä olosuhteissa, hyökkäämään 5'- tai 3'-päästä, voidaan käyttää yhtä ainoaa 30 nukleiinihappoanalogisekvenssiä suojaamaan koko tuota nukleiinihappo-osaa, joka .. sijaitsee 3'- tai vastaavasti 5'-suuntaan nukleiinihappoanalogista.
• *
Kun endonukleaasia käytetään hyökkäävänä reagenssina, lyhyt nukleiinihappojakso, joka altistetaan hybridisoimattomana kahden nukleiinihappoanalogioligomeerin 35 välissä, jotka sijaitsevat toistensa vieressä nukleiinihapossa, voi kuitenkin muodostaa osan valitusta alueesta, joka on suojattu, kahden nukleiinihappoanalogisek-venssin päätyemästen välisen jonkin vuorovaikutuksen johdosta tai johtuen nukleiinihappoanalogin endonukleaasin aktiivisuutta häiritsevästä vaikutuksesta.
111266 3
Nukleiinihappoanalogi on edullisesti sellainen, joka käsittää polymeerijuosteen, joka sisältää sekvenssin ligandeista, jotka ovat liittyneet runkoon, joka koostuu liittyneistä runko-osista, joka analogi pystyy hybridisoitumaan komplementaarisen sek-5 venssin omaavaan nukleiinihappoon.
Mainittu nukleiinihappoanalogirunko on edullisesti polyamidi-, polytioamidi-, poly-sulfmamidi- tai polysulfonamidirunko.
10 Mainitut liittyneet runko-osat ovat edullisesti peptidiliittyneitä aminohappo-osia.
Nukleiinihappoanalogi pystyy edullisesti hybridisoitumaan komplementaarisen sekvenssin omaavaan nukleiinihappoon muodostaen hybridin, joka on stabiilimpi kuumuuden aiheuttamaa denaturoitumista vastaan kuin sekvenssiltään mainittua 15 analogia vastaavan tavanomaisen deoksiribonukleotidin ja mainitun nukleiinihapon välinen hybridi.
Edullisesti mainittu nukleiinihappoanalogi on peptidinukleiinihappo, jossa mainittu runko on polyamidirunko, kunkin mainitun ligandin liittyessä suoraan tai epäsuoras-20 ti atsatyppiatomiin mainitussa rungossa, ja jolloin mainitun ligandin sisältäviä typpi-atomeja erottavat toisistaan mainitussa rungossa pääasiassa 4-8 välissä olevaa atomia.
Myös edullisesti nukleiinihappoanalogi pystyy hybridisoitumaan kaksoisjuosteiseen 25 nukleiinihappoon, jossa toisella juosteella on mainitulle analogille komplementaari-' nen sekvenssi, siten, että se syrjäyttää toisen juosteen mainitusta yhdestä juosteesta.
Edullisesti nukleiinihappoanalogi on yleisen kaavan 1 mukaista: L 1 I 2 r*
I I I
n1 Λ2
I I
o c \ bz ca 1 \/ \/ \a' - "c' xn
Kaava 1 111266 4 jossa: n on ainakin 2, kukin L'-Ln on muista riippumatta valittu ryhmästä, joka koostuu seuraavasta: vety, hydroksi, Ci-4-alkanoyyli, luonnollisesti esiintyvät nukleoemäkset, ei-luonnollisesti 5 esiintyvät nukleoemäkset, aromaattiset osat, DNA-interkalaattorit, nukleoemästä sitovat ryhmät, heterosyklisiä ryhmiä ja reportteriligandit, mutta normaalisti ainakin yksi L on nukleoemästä sitova ryhmä kuten luonnollisesti esiintyvä nukleoemäs, ja edullisesti ainakin 90 % ryhmistä L on sellaisia nukleoemästä sitovia iyhmiä; 10 kukin C'-Cn on (CR6R7)y, jossa R6 on vety ja R7 on valittu ryhmästä, joka koostuu luonnollisesti esiintyvien α-aminohappojen sivuketjuista, tai R6 ja R7 on toisistaan riippumatta valittu ryhmästä, joka koostuu seuraavista: vety, Ci_6-alkyyli, aryyli, aralkyyli, heteroaryyli, hydroksi, Ci-6-alkoksi, Ci-6-alkyylitio, NR3R4 ja SR5, jossa R3 ja R4 ovat alla määritellyt ja R on vety, Ci-6-alkyyli, hydroksi-, alkoksi- tai 15 alkyylitiosubstituoitu Ci-6-alkyyli, tai R6 ja R7 yhdessä täydentävät alisyklisen tai heterosyklisen järjestelmän; kukin D'-Dn on (CR6R7)Z, jossa R6 ja R7 ovat edellä määritellyt; sekä y että z on nolla tai kokonaisluku 1-10, summa y + z on 2-10 (edullisesti yli 2, ja edullisimmin sekä y että z on 1 tai 2; 20 kukin G'-Gn 1 on -NR3CO-, -NR3CS, -NR3SO- tai -NR3S02-, kummassa hyvänsä suunnassa, jossa R‘ on alla määritelty; kukin a'-A11 ja B'-Bn on valittu siten, että: 25 (a) A on kaavan Ha, Hb, Ile tai Ild mukainen ryhmä, ja B on N tai R3N+; tai (b) A on kaavan lld mukainen ryhmä ja B on CH; AJA M Mj «2 1* 1* ia J» L >' Jr L i,
Kaava Ha Kaava Hb 5 111266 * « a _ «l *i r3 9 Γ il Γ ,1 » .3 -i.-J.JJ. i ' 1 f i· i. TT'
L U J j * K
L Jr U J |
Kaava Ile Kaava Ild jossa: X on 0, S, Se, NR3, CH2 tai C(CH3)2; 5 Y on yksinkertainen sidos, O, S tai NR4; sekä p että q on nolla tai kokonaisluku 1-5, jolloin summa r+s ei ole yli 10; sekä r että s on nolla tai kokonaisluku 1-5, jolloin summa r+s ei ole yli 10; kukin R ja R on valittu muista riippumatta ryhmästä, joka koostuu seuraavista: vety, Ci-4-alkyyli, joka voi olla hydroksi- tai alkoksi- tai alkyylitio-substituoitu, 10 hydroksi, alkoksi, alkyylitio, amino ja halogeeni; ja kukin R3 ja R4 on valittu muista riippumatta ryhmästä, joka koostuu seuraavista: vety, C3-4-alkyyli, hydroksi- tai alkoksi- tai alkyylitio-substituoitu Ci-4-alkyyli, hydroksi, alkoksi, alkyylitio ja amino; Q on -CO3H, -CONR'R", -S03H tai -S02NR'R" tai -C02H:n tai -S03H:n aktivoitu 15 johdannainen; ja I on -NR'R", jossa R' ja R" on toisistaan riippumatta valittu ryhmästä, joka koostuu seuraavista: vety, alkyyli, aminosuojaryhmät, reportteriligandit, interkalaattorit, ke-laattorit, peptidit, proteiinit, hiilihydraatit, lipidit, steroidit, nukleosidit, nukleotidit, nukleotididifosfaatit, nukleotiditrifosfaatit, oligonukleotidit, mukaan lukien sekä 20 oligoribonukleotidit että oligodeoksiribonukleotidit, oligonukleosidit ja liukoiset ja ei-liukoiset polymeerit.
Edullisemmin mainittu nukleiinihappoanalogi käsittää yleisen kaavan ill, IV tai V mukaista yhdistettä: 25 111266 6 '' Ί 0. ( C Η0 ) , !
I I
Υί ν <ch^k /n™ /v 0 L· Η Γγί 2 _ r~ ρ η L Jp
Kaava 111 L\ L\ | CH2 3 1 c c H2 5 1 VNR3 o NR3 T 0 v
Rh N § H
V‘H2’iVi •"»»λ , i Π ‘ I“!Vv'»=C·1
X
L- p
Kaava IV
111266 7 L\ L\ Γ [CH2>l ί !CH2>1 r3 A i \/ 0 3 /\ N R\ / A, γ·"Α·"Α λ 1 S } H 2 5/ tCH2<n Rl r"7 p ti L Jn R" — -<p
Kaava V jossa: kukin L on muista riippumatta valittu ryhmästä, joka koostuu seuraavista: vety, 5 fenyyli, heterosykliset osuudet, luonnollisesti esiintyvät nukleoemäkset tai ei-luon-nollisesti esiintyvät nukleoemäkset; kukin R on muista riippumatta valittu ryhmästä, joka koostuu seuraavista: vety tai luonnollisesti esiintyvien α-aminohappojen sivuketjut; 10 n on kokonaisluku yli 1, kukin k, 1 ja m on muista riippumatta nolla tai kokonaisluku 1-5; 15 kukin p on nolla tai 1;
Rh on OH, NH2 tai -NHLysNH2; ja R1 on H tai -COCH3.
> * * 20 Menetelmää edellä kuvatun nukleiinihapon suojaamiseksi voidaan käyttää menetelmässä nukleiinihapposekvenssin havaitsemiseksi. Täten keksintö sisältää eräässä toisessa näkökannassa menetelmän sekvenssin havaitsemiseksi nukleiinihapponäyt-teessä, jossa menetelmässä nukleiinihapon näyte altistetaan nukleiinihappoanalogil-le, joka pystyy hybridisoitumaan hybridisoivissa olosuhteissa sekvenssiselektiivises-25 ti mainittuun sekvenssiin jos sitä on läsnä mainitussa nukleiinihapponäytteessä, 111266 8 jolloin mainitun nukleiinihappoanalogin ja mainitun sekvenssin sisältävän mainitun nukleiinihapon alueen välille muodostuu kompleksi, altistetaan mainittu nukleiinihappo reagenssille, joka pystyy hajottamaan mainitun nukleiinihapon, sellaisissa olosuhteissa, että mainitun nukleiinihapon mainittu alue, joka muodostaa mainitun 5 kompleksin, on suojattu mainitun reagenssin hyökkäykseltä vaikka mainitun nukleiinihapon loppuosa hajoaa, ja detektoidaan mainitun kompleksin läsnäolo.
Mainitun kompleksin läsnäolon detektoimiseen on olemassa useita tapoja. Nämä voidaan jakaa niihin, joissa detektoidaan kompleksi sellaisenaan, ja niihin, joissa 10 kompleksi hajotetaan nukleiinihappo-ja nukleiinihappoanalogiosasiksi, ja detektoidaan nukleiinihapon tai nukleiinihappoanalogin läsnäolo. Kompleksin olemassaolo voidaan päätellä nukleiinihapon säilymisestä.
Menetelmien ensimmäisessä ryhmässä voidaan turvautua nukleiinihappoanalogin ja 15 nukleiinihappo/nukleiinihappoanalogi-hybridin ominaisuuksien eroihin. Täten mainitun kompleksin läsnäolo detektoidaan edullisesti vertaamalla mainitun kompleksin liikettä elektroforeesissa mainitun nukleiinihappoanalogin liikkeeseen samanlaisissa olosuhteissa.
20 Edullisesti nukleiinihappoanalogi tai nukleiinihappo sisältää detektoitavan leiman, sopivia leimoja nukleiinihappoanalogille ovat mm. fluoresoiva leima, radioleima, entsyymileima, biotiini, spinleima, kemiluminoiva leima, antigeenileima tai vasta-aineleima. Edullisimpia näistä ovat fluoroforin tai radioisotoopin käyttö leimana, mutta yleensä voidaan käyttää mitä hyvänsä peptideille sovellettavissa olevaa 25 leimausmenetelmää.
Keksinnön toisen näkökannan eräässä edullisessa toteutuksessa nukleiinihappoanalogi on nukleiinihappoanalogin leimaamiseen tarkoitetulla menetelmällä tuotettu leimattu nukleiinihappoanalogi, jossa menetelmässä aikaansaadaan nukleiinihappo-30 analogi, jossa on peptidimotiivia, joka pystyy toimimaan entsyymisubstraattina leimausreaktiossa ja suoritetaan mainittu leimausreaktio, jossa nukleiinihappoanalogin peptidimotiivi saatetaan reagoimaan entsyymin vaikuttaessa mainitun leiman lähteen kanssa.
35 Edullisesti mainittu leima on radioleima.
Mainitun leiman lähde on edullisesti radioleimattua ATP:tä.
111266 9
Mainittu entsyymi on edullisesti proteiinikinaasia.
Peptidimotiivi on edullisesti kemptidimotiivi.
5 Edullisesti leimausreaktio on fosforylointi mainitun peptidimotiivin seriinitähteessä.
Erääseen vaihtoehtoiseen menetelmään nukleiinihappoanalogin leimaamiseksi sisältyy, edullisesti nukleiinihappoanalogin toisessa päässä, kelatoivan osan aikaansaaminen, joka osa pystyy sitomaan ainakin yhden metalli-ionin kelatoimalla ja 10 kelatoimaan radioisotoopin tai fluoroforin suoraan tai epäsuorasti siihen. Esimerkiksi europiumioni voidaan kelatoida nukleiinihappoanalogin sisältämällä sopivalla kelatointiryhmällä toimimaan fluoresoivana leimana.
Tämän ensimmäisen ryhmän eräässä vaihtoehtoisessa detektointimenetelmässä käy-15 tetään hyväksi nukleiinihapposekvenssiä, joka on suojattu liittämällä kaksi nukleii-nihappoanalogisekvenssiä, jotka eivät muuten liittyisi yhteen. Jos kummassakin on erityyppinen leima, kahden leiman liittyminen voidaan detektoida. Esimerkiksi, kaksi nukleiinihappoanalogioligomeeriä voidaan hybridisoida suuremman nukleiini-happosekvenssin kohdenukleiinihapposekvenssin muodostavan osan vastaaviin päi-20 hin. Toinen nukleiinihappoanalogi leimataan osalla, joka soveltuu kiinteälle faasille liittämiseen, esimerkiksi kelatoivalla peptidimotiivilla kuten Hiss. Toinen varustetaan havaittavalla leimalla, esimerkiksi radioleimataan. Suojaamattoman nukleiinihapon hajotuksen jälkeen kaksi nukleiinihappoanalogisekvenssiä jäävät hybri-disoinnin kautta liitettyiksi suojattuun kohdenukleiinihapposekvenssiin. Kompleksi 25 voidaan vangita kelatoitavia nikkeli-ioneja sisältävälle kiinteälle kantajalle kelatoimalla ensimmäisellä nukleiinihappoanalogilla. Ylimääräinen radioleimattu toinen nukleiinihappoanalogi voidaan pestä pois, ja toisen leimatun nukleiinihappoanalogin radioaktiivisuus voidaan detektoida kiinteällä kantajalla tai siitä eluoimisen jälkeen.
30 Muita esimerkkejä olisivat nukleiinihappoanalogi, jossa on biotiini osana, joka soveltuu kiinteälle faasille liittämiseen kelatoivan peptidimotiivin sijasta, ja toinen nukleiinihappoanalogi liitettynä havaittavaan leimaan, esimerkiksi entsyymiin tai fluoroforiin. Jos havaittava leima on entsyymi, joka pystyy katalysoimaan havaittavan tuotteen tuotantoa, määritys on analoginen immunomäärityksen hyvin vakiintu-35 neelle ELISA-periaatteelle.
Vaihtoehtoiseen tapaan hybridisoidun erottamiseksi hybridisoimattomasta nukleiini-happoanalogista sisältyy käänteisfaasi- tai ioninvaihtokromatografia tai geelisuoda- 111266 10 tus. Voitaisiin käyttää vasta-aineenvalintamenettelytapaa käyttämällä vasta-ainetta, jolla on spesifisyyttä koskematonta nukleiinihappoa kohtaan tai spesifisyyttä nukle-iinihappo/nukleiinihappoanalogi-hybridiä kohtaan.
5 Havaitsemismenetelmien toisessa ryhmässä nukleiinihapon ja nukleiinihappoanalo-gin välinen kompleksi denaturoidaan, ja osoitetaan suojatun nukleiinihapposek-venssiti selviytyminen, sopivasti tunnetuilla nukleiinihapposekvenssinhavaitsemis-menetelmillä kuten hybridisointimäärityksellä. Mahdollisesti nukleiinihapposek-venssi voidaan alistaa monistusmenettelytavalle. LCR on yleensä edullinen lyhyiden 10 suojattujen sekvenssien monistukseen, ja PCR pitkien.
Nukleiinihappomonistusmenettelytavoilla, erityisesti hyvin tunnetuilla PCR-menet-telytavoilla kohdataan usein vaikeuksia, kun monistettava kohdesekvenssi on läsnä muun nukleiinihapon suuren määrän joukossa.
15
Kuten edellä osoitetaan, keksintö aikaansaa helpon tavan nukleiinihapponäytteen "puhdistukseen" hajottamalla kaiken läsnä olevan nukleiinihapon kohdesekvenssiä lukuun ottamatta, sallien täten monistuksen helpomman suorituksen joko määritys-tarkoituksiin tai preparatiivisesti.
20
Niinpä keksintö aikaansaa eräässä kolmannessa näkökannassa menetelmän nukleii-nihappomonistuksen suorittamiseksi, jossa menetelmässä nukleiinihapponäytteen nukleiinihapon valittu alue suojataan hybridisoimalla mainittuun nukleiinihappoon nukleiinihappoanalogi, joka hybridisoituu siihen sekvenssispesifisellä tavalla, altis-25 tetaan mainittu näyte nukleiinihapon kimppuun käyvälle reagenssille näytteessä olevan nukleiinihapon hajottamiseksi mainittua valittua aluetta lukuunottamatta, ja monistetaan mainittu valittu alue.
Suojatun sekvenssin vapauttamiseksi monistusta varten nukleiinihappo/nukleiinihap-30 poanalogi-hybridi voidaan denaturoida kuumuudella. Voidaan käyttää mitä hyvänsä monistusmenetelmää, mukaan lukien kaikki nykyiset tunnetut menetelmät, kuten PCR ja sen variantit, LCR ja 3SR.
Julkaisussa WO 93/25706 (PCT/EP93/01435) kuvataan menetelmä nukleiinihappo-35 monistuksen steriloimiseksi hybridisoimalla monistustuotteeseen nukleiinihappoanalogi, joka estää kaikkea monistusta vaikuttamasta monistettavana kohteena. Tätä voidaan parantaa vielä edelleen keksinnön erään neljännen näkökannan mukaan suojaamalla monistustuotteen alue, joka sulkee pois ainakin yhden alukkeensitoutu- 111266 π miskohdan, joka on välttämätön monistuksen toistoon keksinnön ensimmäisen näkökannan mukaisella menetelmällä, hajottamalla loppu nukleiinihappo, mukaan lukien monistustuotteen alukkeensitoutumiskohdat, ja havaitsemalla edellä kuvatun suojatun nukleiinihapon selviytyminen. Edullisesti, ainakin joitakin, edullisemmin kaikki 5 alukkeensitoutumissekvensseistä hajotetaan.
Nukleiinihappoanalogi voi olla läsnä koko PCR-menettelytavan ajan, edellyttäen, että käytetyt lämpötilat ovat riittävän korkeat nukleiinihappoanalogin sulattamiseksi nukleiinihaposta, tai se voidaan lisätä monistuksen lopussa. Hyökkäysreagenssi on 10 lisättävä monistuksen jälkeen, mutta se voidaan lisätä suljetun monistuslaitteen sisällä olevasta erillisestä osastosta niin, ettei monistetulla tuotteella ole koskaan mahdollisuutta paeta ja muuttua kontaminoivaksi aineeksi.
Keksintöä kuvataan seuraavilla esimerkeillä viitaten oheisiin piirroksiin, joissa: 15
Kuvio 1 on autoradiografi geelistä, jossa esitetään esimerkkien 3-5 tulokset.
Yksi sopiva tapa tuottaa PNA:ta, jossa on suuren ominaisaktiivisuuden omaavaa radioleimaa, ja joka on erityisen edullinen keksinnössä käytettäväksi, kuvataan 20 samanaikaisesti vireillä olevassa GB-patenttihakemuksessamme 9324956.3 (jolla on asiamiehen viitenumero P3685GB), joka on jätetty samana päivänä kuin tämä patenttihakemus. Sellaisen tavan mukaan edullisessa muodossaan valmistetaan PNA:ta, jossa on kemptidipäätyjatke, jossa tapahtuu proteiinikinaasi A -välitteinen reaktio 32P-ATP:n kanssa seriinitähteeseen sitoutuneen 32P-leiman saamiseksi. 25 PNA:ita, joissa on halutut aminohapposekvenssit omaavat peptidiulokkeet, voidaan tuottaa sopivasti tekniikan alalla hyvin ymmärretyillä Boc- tai Fmoc-kiintofaasi-tekniikoilla kun lähtöaine-PNA-sekvenssi on kerran muodostettu sopivalle kiinteälle kantajalle käyttämällä Boc-kiintofaasisynteesiä, joka on kuvattu julkaisussa WO 92/20703.
30
Keksinnön ensimmäisen näkökannan edullisten muotojen mukaan suojattavat, nukleiinihappoa sisältävät sekvenssit voidaan käsitellä PNA:lla, jolla on sekvenssi, joka on komplementaarinen kiinnostuksen kohteena olevalle sekvenssille. Jos nukleiinihappo on DNA:ta, se voi olla kaksijuosteisessa muodossa, ja voidaan luottaa 35 nukleiinihappoanalogin kykyyn hybridisoitua kohdesekvenssiinsä kaksijuosteisessa muodossa. Voi kuitenkin olla välttämätöntä ja on normaalisti toivottavaa denaturoida kaksijuosteinen kohde-DNA, tavallisesti kuumentamalla. DNA voi olla melko epäpuhdasta, ts. läsnä voi olla muita solutuotteita. DNA voi myös olla koko 111266 12 genomi-DNAita tai kokonaista solu-RNA:ta, joka on uutettu soluista eikä sulatettu lyhempiin pituuksiin. DNA tai RNA voisi myös olla nukleiinihappomonistusmenet-telytavan, kuten LCR:n tai PCR:n tai NASBA(35R)-monistuksen tuotetta. Edulliset PNA:t sitoutuvat sekvenssiselektiivisesti suurella affiniteetilla, vaikka kohde-DNA 5 on kaksijuosteista. Sitten voidaan nukleiinihapponäyte käsitellä nukleaasilla tai nukleaasiseoksella kaiken nukleiinihapon hajottamiseksi, jota ei ole suojattu PNA:han hybridisoimalla. PNA:ta voi olla läsnä oleellinen ylimäärä, jotta varmistettaisiin, että jos nukleiinihapponäytteessä on läsnä jopa vain yksi oikea sekvenssi, se hybridisoituu ja suojataan.
10
Reaktiotuote voidaan alistaa elektroforeesille geelillä tai kapilläärissä erottamaan nukleiinihappoon hybridisoitu PNA hybridisoimattomasta PNA:sta. Koska PNA on oleellisen neutraali molekyyli, jossa on yksi positiivinen varaus/molekyyli tyypillisesti terminaalisessa amiiniryhmässä, sillä on vähäinen taipumus vaeltaa elektro-15 foreesin aikana. Toisaalta nukleiinihapot ovat hyvin negatiivisesti varautuneita, ja PNA:n hybridisointi nukleiinihappofragmenttiin antaa tulokseksi negatiivisesti varautuneen hybridin, joka kulkee elektroforeesin aikana vastakkaiseen suuntaan itse PNA:han verrattuna. Tämä aikaansaa hybridisoidun ja hybridisoimattoinan PNA:n helpon ja hyvin spesifisen erotuksen. Jos PNA on sopivasti leimattua, on 20 mahdollista havaita sen äärimmäisen pieniä määriä, ja keksinnön toisen näkökannan mukainen analyyttinen menetelmä antaa erinomaisen signaali/kohina-suhteen.
PNA:t pystyvät tekemään eron nukleiinihapposekvenssien välillä, jotka poikkeavat toisistaan vain yhden tähteen suhteen. Niinpä edellä kuvatut menetelmät tarjoavat 25 mahdollisuuden hyvin nopeaan ja yksinkertaiseen määritykseen, joka pystyy määrittämään, sisältääkö genomi-DNA:n näyte erityistä alleelivaihtelua erityisen geenin sisällä. Lisäksi, koska eripituiset, nukleiinihappoihin hybridisoidut PNA:t ovat helposti erotettavissa elektroforeesilla, on myös olemassa mahdollisuus koettaa nukleiinihapponäyte samanaikaisesti suurella joukolla PNA:ita, sulattaa pois kaikki 30 hybridisoitumaton nukleiinihappo ja erottaa elektroforeesilla kaikki PNA/nukleiini-happo-hybridit hybridisoitumattomista ylimääräisistä PN Alista ja toisistaan. Täten voidaan yhdessä ainoassa määrityksessä osoittaa, että DNA-näyte sisältää, mahdollisesti eri geeneissä, kiinnostuksen kohteena olevien alleelivaihtelujen jotain erityistä yhdistelmää, esimerkiksi sellaista, jonka on havaittu aiheuttavan erityistä fenotyyp-35 piä kuten tautitilaa.
111266 13
Esimerkki 1 PNA-kemptidi-kimeerin valmistus Käytettiin julkaisussa W0 92/20703 kuvattua kiintofaasi-PNA-synteesiä muodostamaan sekvenssi: 5
Boc-NH(CH2)5CONH-TG(Z)T.A(Z)C(Z)G(Z).TC(Z)A(Z).C(Z)A(Z) A(Z).C(Z)T A(Z)-CONH-hartsi N-tenninaalinen Boc-ryhmä poistettiin käsittelemällä TFA:lla ja käytettiin kemptidi-10 motiivin standardi-boc-tyyppisen kiintofaasipeptidisynteesin lähtöpisteenä linkkeri- 6-amino-heksaanihapon kautta kimeerin tuottamiseksi:
Boc-Leu-Arg(T os)-Arg(T os)-Ala-Ser-(Bzl)-Leu-Gly-NH(CH2)5CONH-TG(Z)T.A(Z)C(Z)G(Z).TC(Z)A(Z).C(Z)A(Z) A(Z).C(Z)TA(Z)-CONH-hartsi 15
Suojaryhmät poistettiin, ja tuote katkaistiin hartsista "Low-High"-TFMSA-menette-lytavalla. Raakatuote puhdistettiin preparatiivisella HPLC:llä (käänteisfaasi-Cis eluoiden gradientilla A:0,1 % TFA vedessä (Millie™) ja B:0,2 % TFA, 10 % vettä, 90 % asetonitriiliä). Puhdistettu kimeerinen PNA-kemptidi karakterisoitiin analyytti-20 sellä HPLC:llä ja FAB-MS:llä.
Esimerkki 2
Kemptidimotiivin (Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly) radioleimaus protennikinaasi A:lla PNA-kemptidikimeeri, jolla oli kaava: 25 H-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-TGTACGTCACAACTA-NH2 leimattiin 32P:llä reaktioseoksessa, joka sisälsi: PNA-kemptidiä, 10 μΜ....................... 5 μΐ 30 10 x proteiinikinaasi A-puskuria............ 5 μΐ y-32P-ATP:tä(>5000 Ci/mmol; 50 pCi/pl).... 10 μΐ
Proteiinikinaasi A:ta (Boehringer; 5 mU/μΙ). 0,2 μΐ H20:ta...................................... 30 μΐ 1
Reaktiota inkuboitiin 30 min ajan 30 °C:ssa ja sitten 10 min ajan 65 °C:ssa ennen kuin sentrifugoitiin 30 s ajan nopeudella 15000 g. Supematantti siirrettiin uuteen eppendorff-putkeen. Lisättiin vettä 1 mkaan, ja leimattu PNA-kemptidi erotettiin 111266 14 sisältymättömästä γ- p-ATP:stä anioninvaihtokromatografialla DEAE Sephadex A-50™ -amoninvaihtokolonnia käyttämällä.
PNA-kemptidin ominaisaktiivisuudeksi arvioitiin 1 X 108 cpm/μΐ PNA-kemptidiä.
5
Esimerkki 3 DNA-sekvenssin detektio PNA:lla suojauksen kautta. 15-meeri-PNA:ta, jossa on esimerkissä 2 tehty radioleimattu kemptidimotiivi, inkuboitiin 15 min ajan erikseen kunkin kanssa seuraavista nukleiinihapoista: 10 1. Ei mitään (ks. kuvion 1 riviä 1) 2. Komplementaarinen DNA 15-meeri (ks. kuvion 1 rivejä 2 ja 5) 3. 10-meeri-DNA, joka on komplementaarinen PNA-sekvenssin osalle (ks. kuvion 1 riviä 3) 15 4. 40-meeri-DNA 5'CTAGAGGATCT AGTTGTGACGT ACAGGATCTTTTT- CATAG-3, joka sisältää 15 emäksen sekvenssin, joka on komplementaarinen PNA:lle sekvenssin keskiosassa, (ks. kuvion 1 rivejä 4 ja 6)
Kussakin tapauksessa 4 μΐ ohgonukleotidin 10 μΜ liuosta sekoitettiin 5 μ1:η kanssa 20 leimattua PNA:ta reaktiotilavuudessa 10 μΐ, joka sisälsi 30 mM NaAc:tä (pH 5,0), 50 mM NaCkää, 10 mM ZnChtta ja 55 % tilavuus/tilavuus glyserolia. Inkuboitiin 15 min ajan huoneenlämpötilassa.
Toisessa tapauksessa kahdesta reaktiosta, joissa käytettiin 40-meeri-DNA:ta ja 25 toisessa tapauksessa kahdesta reaktiosta, joissa käytettiin 15-meeri-DNA:ta, lisättiin 15 yksikköä mungpapunukleaasia, ja reaktioita inkuboitiin 37 °C:ssa 5 minuutin ajan.
Kaikki reaktiot lopetettiin lisäämällä 10 μΐ lisäyspuskuria (30 % tilavuus/tilavuus 30 glyserolia, 0,25 % paino/tilavuus bromifenolisinistä, 0,25 % ksyleenisyanolia, 0,01 % SDS:ää), ja reaktioseokset alistettiin elektroforeesille 10-%:isessa poly-akryyliamidigeelissä, ja seuraavaksi autoradiografialle.
Tulokset esitetään kuvion 1 riveillä 1-6. Rivillä 1 leimattu PN A ajetaan yksinään, 35 eikä nähdä mitään, koska se on geelillä liikkumatonta. Rivillä 2 leimattu PN A on hybridisoitu 15-meeri-DNA:han, ja nähdään hybridiä edustava vyöhyke. Rivillä 3 leimattu PN A on hybridisoitu 10-meeri-DNA:han, ja voidaan nähdä, että muodostunut vyöhyke on selvästi erotettavissa etäisyysajossa rivillä 2 olevasta vyöhykkeestä 111266 15 kahden oligo-DNA'n koon erosta johtuen. Rivillä 4 PNA on hybridisoitunut 40-meeri-DNA:han, ja jälleen vyöhykkeen etäisyysajo geelillä sallii 15PNA/'°DNA- ja 15PNA/l5DNA-hybridien ja 15PNA/40DNA-hybridin välisen eron havaitsemisen.
5 Rivillä 5 nähdään nukleaasihajotuksen tulos ^PNA/^DNA-hybridin tapauksessa. Vyöhyke on sama kuin rivillä 2 osoittaen, ettei nukleaasi ole pystynyt hajottamaan hybridisoitunutta DNA:ta. Rivillä 6 esitetään tulos I5PNA/40DNA-hybridin nukle-aasihajotuksesta. Jälleen vyöhyke on kuten rivillä 2 osoittaen, että vain se osa DNA:sta, joka on hybridisoitunut PNA:han, on suojattu nukleaasia vastaan. 40-mee-10 ri-DNA:ssa oleva sisäinen 15-meerin sekvenssi, joka on komplementaarinen PNA:lie, on sen vuoksi havaittu menettelytavalla, joka on kuvattu edellä riviin 6 viitaten.
Esimerkki 4 15 RNA:n suojaus nukleaasia vastaan PNA.lla. PNA-Tjo, jossa on kemptidimotiivi, leimattiin kuten esimerkissä 2. Leimattua PNA:ta inkuboitiin seuraavan menettelytavan mukaisesti seoksen kanssa, jossa oli polyadenyloituja RNA:ita. PNA:ta (5 pl) inkuboitiin 4 pl:n kanssa 100 ng/μΐ seka-in vitro-RNA-transkriptejä (Gibco BRL) reaktiotilavuudessa 10 μΐ, joka sisälsi muita ainesosia ja samoissa aika- ja lämpötila-20 olosuhteissa kuin esimerkissä 3. Samanlaista inkuboitua seosta inkuboitiin edelleen mungpapunukleaasin kanssa kuten esimerkissä 3, ja reaktioseokset valmistettiin ja alistettiin elektroforeesille ja tehtiin autoradiografiakuva kuten esimerkissä 3. Tulokset nähdään kuvion 1 riveillä 7 ja 8.
25 Rivillä 7 nähdään erottamattomat tikapuut erikokoisista PNA/RNA-hybrideistä. Rivillä 8 nukleaasi on erottanut tikapuut yhdeksi vyöhykkeeksi siistimällä pois kaikki RNA:t PNA:lla suojattuun Aio-osaan.
Esimerkki 5 30 15-meeri-DNA:n yhden ainoan emäsparin vaihtelun havaitseminen
Esimerkissä 3 käytetty leimattu 15-meeri-PNA hybridisoitiin kahdeksi eri DNA:ksi molemmissa kahdesta eri lämpötilaoloista seuraavalla tavalla.
Leimattu PNA hybridisoitiin komplementaariseen 15-meeri-DNA:han inkubointi-35 lämpötiloissa 55 °C ja 66 °C vastaavasti, ja kummassakin tapauksessa reaktioseos käsiteltiin tuossa lämpötilassa mungpapunukleaasilla. Muissa suhteissa olosuhteet olivat kuten esimerkissä 3. Suoritettiin kaksi samanlaista inkubointia käyttäen yhden ainoan emäksen erilaista 15-meeri-DNA:ta 5-TAGTTGCGACGTACA-3' samoissa 111266 16 kahdessa lämpötilassa lisäten seuraavaksi mungpapunukleaasia. Tulokseksi saadut autoradiografit nähdään kuvion l riveillä 9-12.
Rivillä 9 tulos PNA:n hybridisoinnista sille täysin komplementaariseen DNA:han 5 65 °C:ssa nukleaasihajotuksen kanssa on vyöhyke, joka vastaa DNA:n suojausta PNA:lla. Rivillä 10 esitetään tulos hybridisoinnista yhden ainoan emäksen suhteen eroavalla sekvenssillä 65 °C:ssa. DNA:ta ei ole suojattu, eikä nähdä hybridiä. Rivillä 11 esitetään kokeen tulos 55 °C:ssa täysin komplementaarisella sekvenssillä, ja rivillä 12 esitetään tulos kokeesta yhden ainoan emäksen suhteen poikkeavalla sek-10 venssillä 55 °C:ssa. Molemmilla näistä riveistä havaitaan suojattua DNA:ta.
Täysin sopivan 15-meerihybridin sulamispiste on 69 °C. Ankarissa hybridisointi-oloissa, jotka toteutettiin toimimalla lähellä tätä sulamispistettä, PNA havaitsee eron täysin sopivan DNA:n ja yhden emäksen suhteen eroavan sekvenssin välillä, jonka 15 sulamispiste on 61 °C. 55 °C:ssa muodostuu kuitenkin hybridit sekä täysin vastaavalla sekvenssillä että yhden emäksen suhteen poikkeavalla sekvenssillä, kuten hybridien sulamispisteistä voitiin ennustaa.
Claims (20)
111266
1. Menetelmä nukleiinihapposekvenssin läsnäolon havaitsemiseksi näytteessä, tunnettu siitä, että mainittu näyte alistetaan nukleiinihappoanalogille, joka pystyy 5 hybridisoitumaan hybridisoivissa oloissa sekvenssiselektiivisesti mainittuun sekvenssiin jos sitä on läsnä mainitussa näytteessä, jolloin mainitun nukleiinihappo-analogin ja mainitun sekvenssin sisältävän mainitun nukleiinihapon välille muodostuu kompleksi, alistetaan mainittu nukleiinihappo reagenssille, joka pystyy hajottamaan mainitun nukleiinihapon, sellaisissa oloissa, että mainitun nukleiinihappo-10 kompleksin mainittu sekvenssi on suojattu mainitun reagenssin hyökkäykseltä vaikka mainitun nukleiinihapon loppuosa hajoaa, ja detektoidaan mainitun kompleksin läsnäolo nukleiinihappoanalogista poikkeavan nukleiinihapon ja nukleiinihappoana-login kompleksin ominaisuuden perusteella.
2. Menetelmä nukleiinihapposekvenssin läsnäolon havaitsemiseksi näytteessä, tunnettu siitä, että mainittu näyte alistetaan nukleiinihappoanalogille, joka pystyy hybridisoitumaan hybridisoivissa oloissa sekvenssiselektiivisesti mainittuun sekvenssiin jos sitä on läsnä mainitussa näytteessä, jolloin mainitun nukleiinihappo-analogin ja mainitun nukleiinihapon välille muodostuu kompleksi reagenssiin, joka 20 pystyy hajottamaan mainitun nukleiinihapon, sellaisissa oloissa, että mainitun nuk-leiinihappokompleksin mainittu sekvenssi on suojattu mainitun reagenssin hyökkäykseltä vaikka mainitun nukleiinihapon loppuosa hajoaa, erottaen mainittuun nukleiinihappoon hybridisoituneen nukleiinihappoanalogin mainitun kompleksin hybri-disoitumattomasta nukleiinihappoanalogista. 25
3. Menetelmä nukleiinihapposekvenssin läsnäolon havaitsemiseksi näytteessä, tunnettu siitä, että mainittu näyte alistetaan nukleiinihappoanalogille, joka pystyy hybridisoitumaan hybridisoivissa oloissa sekvenssiselektiivisesti mainittuun sekvenssiin jos sitä on läsnä mainitussa näytteessä, jolloin mainitun nukleiinihappoana-30 login ja mainitun sekvenssin sisältävän mainitun nukleiinihapon välille muodostuu kompleksi, alistetaan mainittu nukleiinihappo reagenssille, joka pystyy hajottamaan mainitun nukleiinihapon, sellaisissa oloissa, että mainitun nukleiinihappokomplek-sin mainittu sekvenssi on suojattu mainitun reagenssin hyökkäykseltä, vaikka mainitun nukleiinihapon loppuosa hajoaa, ja detektoidaan mainitun kompleksin läsnäolo 35 denaturoimalla mainittu kompleksi ja osoittamalla mainitun sekvenssin selviytyminen. 111266
4. Patenttivaatimuksen k 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu reagenssi on nukleaasi.
5. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nuk-5 leiinihappoanalogi käsittää polymeerijuosteen, joka sisältää sekvenssin ligandeista, jotka ovat liittyneet liittyneistä runko-osista muodostuneeseen runkoon, joka analogi pystyy hybridisoitumaan komplementaarisen sekvenssin nukleiinihappoon.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu nukit) leiinihappoanalogirunko on polyamidi-, polytioamidi-, polysulfmamidi- tai polysui- fonamidimnko.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitut liittyneet runko-osat ovat peptidiliittyneitä aminohappo-osia. 15
8. Jonkin edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nukleiinihappoanalogi pystyy hybridisoitumaan komplementaarisen sekvenssin nukleiinihappoon, jolloin muodostuu hybridi, joka on stabiilimpi kuumuuden aiheuttamaa denaturoitumista vastaan kuin tavanomaisen deoksiribonukleotidin 20 hybridi, joka vastaa sekvenssiltään mainittua analogia ja mainittua nukleiinihappoa.
9. Jonkin edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu nukleiinihappoanalogi on peptidinukleiinihappo, jossa mainittu runko on polyamidirunko, jolloin kukin mainittu ligandi on liittynyt suoraan tai epäsuorasti 25 mainitussa rungossa olevaan atsatyppiatomiin, ja jolloin mainitun ligandin sisältäviä typpiatomeja erottaa toisistaan mainitussa rungossa pääasiassa 4-8 välissä olevaa atomia.
10. Jonkin edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 30 että nukleiinihappoanalogi pystyy hybridisoitumaan kaksijuosteiseen nukleiinihap- * poon, jossa toisella juosteella on sekvenssi, joka on komplementaarinen mainitulle analogille, sillä lailla, että se syrjäyttää toisen juosteen toisesta. 1 Jonkin edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 35 että nukleiinihappoanalogi on yleisen kaavan (I) mukainen: 111266 L 1 ,2 . n I I I A1 I ί ?n Q B1 c\ B2 (-2 1 V V V '-·. /\ /1 c J -cn/ on Kaava (1) jossa: n on ainakin 2, 5 kukin L‘-Ln on muista riippumatta valittu ryhmästä, joka koostuu seuraavista: vety, hydroksi, CM-alkanoyyli, luonnollisesti esiintyvät nukleoemäkset, ei-luonnollisesti esiintyvät nukleoemäkset, aromaattiset osat, DNA-interkalaattorit, nukleoemästä sitovat ryhmät, heterosykliset osat ja reportteri; kukin C'-Cn on (CR6R7)y, jossa R6 on vetyjä R7 on valittu ryhmästä, joka koostuu 10 luonnollisesti esiintyvien α-aminohappojen sivuketjuista, tai R6 ja R7 on toisistaan riippumatta valittu ryhmästä, joka koostuu seuraavista: vety, Ci-6-alkyyli, aryyli, aralkyyli, heteroaryyli, hydroksi, Ci-6-alkoksi, Ci-β-alkyylitio, NR3R4 ja SR5, jossa R3 ja R4 ovat alla määritellyt, ja R5 on vety, Ci-6-alkyyli, hydroksi-, alkoksi- tai alkyylitio-substituoitu Ci-6-alkyyli, tai R° ja R7 yhdessä täydentävät alisyklisen tai 15 heterosyklisen järjestelmän; kukin D'-Dn on (CR6R7)Z, jossa R6ja R7 ovat edellä määritellyt; sekä y että z on nolla tai kokonaisluku 1-10, summa y+z on 2-10; kukin G!-Gn 1 on -NR3CO-, -NR3CS-, -NR3SO- tai -NR3SC>2-, kummassa hyvänsä suunnassa, jossa R on alla määritelty; 20 kukin A1-A" ja B'-Bn on valittu siten, että: (a) A on kaavan (Ila), (Ilb), (Ile) tai (Ild) mukainen ryhmä ja B on N tai R3lsf; tai (b) A on kaavan (Ild) mukainen ryhmä ja B on CH; 111266 -f v 'l_ f 'l ' «S I!2 »2 l2 L -V ^ -U Kaava (Ila) (Kaava Hb) .X__r_Tj_ H Mj f k j* l P w Jr u J f Kaava (Ile) (Kaava Ild) jossa: 5. on 0, S, Se, NR3, CH2 tai C(CH3)2; Y on yksinkertainen sidos, O, S tai NR4; sekä p että q on nolla tai kokonaisluku 1-5, jolloin summa r+s ei ole yli 10; sekä r että s on nolla tai kokonaisluku 1-5, jolloin summa r+s ei ole yli 10; kukin R ja R on valittu muista riippumatta ryhmästä, joka koostuu seuraavista: . 10 vety, Ci-4-alkyyli, joka voi olla hydroksi- tai alkoksi- tai alkyylitio-substituoitu, hydroksi, alkoksi, alkyylitio, amino ja halogeeneja kukin R3 ja R4 on valittu muista riippumatta ryhmästä, joka koostuu seuraavista: vety, C2-4-alkyyli, hydroksi- tai alkoksi- tai alkyylitio-substituoitu Ci-4-alkyyli, hydroksi, alkoksi, alkyylitio ja amino; 15. on -C03H, -CONR'R", -S03H tai -S02NR'R" tai -C02H:n tai -S03H:n aktivoitu johdannainen; ja I on -NR’R", jossa R1 ja R" on toisistaan riippumatta valittu ryhmästä, joka koostuu seuraavista: vety, alkyyli, aminosuojaryhmät, reportteriligandit, interkalaattorit, ke-laattorit, peptidit, proteiinit, hiilihydraatit, lipidit, steroidit, nukleosidit, nukleotidit, 20 nukleotididifosfaatit, nukleotiditrifosfaatit, oligonukleotidit, mukaan lukien sekä oligoribonukleotidit että oligodeoksiribonukleotidit, oligonukleosidit ja liukoiset ja ei-liukoiset polymeerit. 5 111266
12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu nukleiinihappoanalogi käsittää yleisen kaavan (III), (IV) tai (V) mukaisen yhdisteen: Γ ' Ί 0v (CH,), 1 ^ ' 0 ph N II Y'CB!VNc,.,V ! “"’·/ _ _ r~ p n L Jp Kaava (III) L\ Lx jCH2>l cch2)i I _ O NR3 T 0 V ph N S u Y "“ί’ΐλ 1 n I [i] s ^jv-W.v L Jn R- 7 Kaava (IV) 10 111266 L\ [CH2>1 c ch2 > χ '^Λ ] A. 1 ! V N (CHp ), / \ / \ . ο I Η Λ/ lCH2<, V r7 p y- L A 1— _Jp Kaava (V) 5 jossa: kukin L on muista riippumatta valittu ryhmästä, joka koostuu seuraavista: vety, fenyyli, heterosykliset osuudet, luonnollisesti esiintyvät nukleoemäkset tai ei-luon-nollisesti esiintyvät nukleoemäkset; 10 kukin R on muista riippumatta valittu tyhmästä, joka koostuu seuraavista: vety tai luonnollisesti esiintyvien a-aminohappojen sivuketjut; n on kokonaisluku yli 1, kukin k, 1 ja m on muista riippumatta nolla tai kokonaisluku 1-5; 15 kukin p on nolla tai 1; Rh on OH, NH2 tai -NHLysNH2; ja Ri on H tai COCH3.
13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun 20 kompleksin läsnäolo havaitaan vertaamalla mainitun kompleksin liikettä elektroforeesissa mainitun nukleiinihappoanalogin liikkeeseen samanlaisissa olosuhteissa. 1 2 25 Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nukle- 2 iinihappoanalogissa on yksi tai useita havaittavissa olevia leimoja. 111266
15. Menetelmä nukleiinihappomonistuksen suorittamiseksi, tunnettu siitä, että nukleiinihapponäytteessä olevan nukleiinihapon valittu alue suojataan hybridisoi-malla mainittuun nukleiinihappoon nukleiinihappoanalogi, joka hybridisoituu siihen sekvenssispesifisesti, altistetaan mainittu näyte nukleiinihappoon hyökkäävälle 5 reagenssille, joka hajottaa näytteessä olevan nukleiinihapon lukuunottamatta mainittua valittua aluetta, denaturoidaan muodostunut nukleiinihapon ja nukleiinihappo-analogin kompleksi, ja monistetaan mainittu valittu alue.
16. Menetelmä nukleiinihappomonistusmenettelytavan reaktiotuotteen käsittele-10 miseksi, tunnettu siitä, että suojataan monistuksen nukleiinihappotuotteen valittu alue muodostamalla nukleiinihapon ja siihen hybridisoituvan nukleiinihappoanalo-gin välille sekvenssiselektiivisesti kompleksin ja alistamalla mainitun nukleiinihapon nukleiinihappoon hyökkäävälle reagenssille, jolloin mainittu kompleksi on stabiilimpi mainitun reagenssin aiheuttamaa hajoamista vastaan kuin mainittu 15 lähtöainenukleiinihappo.
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu suojattavaksi valittu alue ei sisällä ainakaan yhtä alukkeensitoutumiskohtaa, joka on välttämätön mainitun monistusmenettelytavan toistolle. 20
18. Jonkin patenttivaatimuksista 15-17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nukleiinihappoanalogi pystyy hybridisoitumaan komplementaarisen sekvenssin nukleiinihappoon muodostaen hybridin, joka on stabiilimpi kuumuuden aiheuttamaa denaturoitumista vastaan kuin sekvenssiltään mainittua analogia vastaavan tavan- . 25 omaisen deoksiribonukleotidin ja mainitun nukleiinihapon hybridi.
19. Jonkin patenttivaatimuksista 15-18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nukleiinihappoanalogi on peptidinukleiinihappo, jossa mainittu runko on polyamidi-runko, jolloin kukin mainittu ligandi on liittynyt suoraan tai epäsuorasti mainitussa 30 rungossa olevaan atsatyppiatomiin, ja mainitun ligandin sisältäviä typpiatomeja erottaa toisistaan mainitussa rungossa pääasiassa 4-8 välissä olevaa atomia. 1 Jonkin patenttivaatimuksista 15-19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nukleiinihappoanalogi pystyy hybridisoitumaan kaksijuosteiseen nukleiinihappoon, 35 jossa toisella juosteella on mainitulle analogille komplementaarinen sekvenssi, siten että se syrjäyttää toisen juosteen mainitusta toisesta juosteesta. 111266
21. Jonkin patenttivaatimuksista 15-20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nukleiinihappoanalogi on yleisen kaavan (I) mukainen: L i 2 .n I I i f1 *r a e1. B2 c2 1 V V V Kaava (I) 5 jossa: n on ainakin 2, kukin ryhmistä L'-Ln on muista riippumatta vety, hydroksi, Ct-4-alkanoyyli, luonnollisesti esiintyviä nukleoemäksiä, ei-luoimollisesti esiintyviä nukleoemäksiä, aromaattisia ryhmiä, DNA-interkalaattoreita, nukleoemästä sitovia ryhmiä, heterosyk-10 lisiä ryhmiä tai reportteria; kukin C'-Cn on (CR6R7)y, jossa R6 on vety ja R7 on valittu ryhmästä, joka koostuu luonnollisesti esiintyvien α-aminohappojen sivuketjuista, tai R6 ja R7 on toisistaan riippumatta valittu ryhmästä, joka koostuu seuraavista: vety, Ci-6-alkyyli, aryyli, aralkyyli, heteroaryyli, hydroksi, Ci-6-alkoksi, Ci-6-alkyylitio, NR3R4 ja SR3, jossa 15 R3 ja R4 ovat alla määritellyt ja R3 on vety, Ci-6-alkyyli, hydroksi-, alkoksi- tai alkyylitio-substituoitu Ci-e-alkyyli, tai R ja R yhdessä täydentävät alisyklisen tai heterosyklisen järjestelmän; kukin D*-Dn on (CR6R7)Z, jossa R6 ja R7 ovat edellä määritellyt; sekä y että z on nolla tai kokonaisluku 1-10, summa y+z on 2-10; 20 kukin ryhmistä G'-G""' on -NR3CO-, -NR3CS-, -NR3SO- tai -NR3S02-, kummassa hyvänsä suunnassa, jossa R on alla määritelty; kukin ryhmistä A'-An ja B'-Bn ovat sellaisia, että: (a) A on kaavan (Ha), (Hb), (Ile) tai (Ild) mukainen ryhmä, ja B on N tai R3N ; tai (b) A on kaavan (Ild) mukainen ryhmä ja B on CH; 25 111266 Ή Μ Μ Μι «S l* 1! li L L -** lJrLJf Kaava (11a) (Kaava 11b) « « - 1-jll!. id Hi f H1T Tl~- Kaava (Ile) (Kaava Ild) 5 jossa: X on O, S, Se, NR3, CH2 tai C(CH3)2; Y on yksinkertainen sidos, O, S tai NR4; sekä p että q on nolla tai kokonaisluku l-5, jolloin summa r+s ei ole yli 10; 10 sekä r että s on nolla tai kokonaisluku l-5, jolloin summa r+s ei ole yli 10; * ‘ l 2 kukin R ja R on valittu muista riippumatta ryhmästä, joka koostuu seuraavista: vety, CM-alkyyli, joka voi olla hydroksi- tai alkoksi- tai alkyylitio-substituoitu, hydroksi, alkoksi, alkyylitio, amino ja halogeeni; ja kukin R3 ja R4 on valittu muista riippumatta ryhmästä, joka koostuu seuraavista: 15 vety, C3^-alkyyli, hydroksi- tai alkoksi- tai alkyylitio-substituoitu Cj-4-alkyyli, hydroksi, alkoksi, alkyylitio ja amino; Q on -C03H, -CONR'R", -S03H tai -S02NR'R" tai -C02H:n tai -S03H:n aktivoitu johdannainen; ja l on -NR'R", jossa R' ja R" on toisistaan riippumatta valittu ryhmästä, joka koostuu 20 seuraavista: vety, alkyyli, aminosuojaryhmät, reportteriligandit, interkalaattorit, ke-laattorit, peptidit, proteiinit, hiilihydraatit, lipidit, steroidit, nukleosidit, nukleotidit, nukleotididifosfaatit, nukleotiditrifosfaatit, oligonukleotidit, mukaan lukien sekä 111266 oligoribonukleotidit että oligodeoksiribonukleotidit, oligonukleosidit ja liukoiset ja ei-liukoiset polymeerit.
22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu 5 nukleiinihappoanalogi käsittää yleisen kaavan (111), (IV) tai (V) mukaista yhdistettä: l Ov (Ch2)1 ΊΤ ' 0 %/CH2>' Rh N V, Y‘CH*V :CH2>A i 1 I m i R1 J p n L Jp Kaava (III) Lx" L\ j CH2 M (CH2)1 o_.nr3 I Y , V R\ /N\ I 7 Y (iA (CH2^a n L ' -7 n < CHp>k N\ ^ /Ns |^Rj H 1vV (CH2*n Rl X r7 2 Kaava (IV) 2 jossa: 111266 kukin L on muista riippumatta valittu ryhmästä, joka koostuu seuraavista: vety, fenyyli, heterosykliset osuudet, luonnollisesti esiintyvät nukleoemäkset tai ei-luon-nollisesti esiintyvät nukleoemäkset; 5 kukin R on muista riippumatta valittu ryhmästä, joka koostuu seuraavista: vety tai luonnollisesti esiintyvien α-aminohappojen sivuketjut; n on kokonaisluku yli 1, kukin k, 1 ja m on muista riippumatta nolla tai kokonaisluku 1-5; kukin p on nolla tai 10 1; Rh on OH, NH2 tai -NHLysNHa; ja R' on H tai COCH3. 15
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9324955 | 1993-12-06 | ||
| GB9324955A GB2285445A (en) | 1993-12-06 | 1993-12-06 | Protecting nucleic acids and methods of analysis |
| PCT/EP1994/003973 WO1995015974A1 (en) | 1993-12-06 | 1994-11-30 | Protecting nucleic acids and methods of analysis |
| EP9403973 | 1994-11-30 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI962340A0 FI962340A0 (fi) | 1996-06-05 |
| FI962340A FI962340A (fi) | 1996-06-05 |
| FI111266B true FI111266B (fi) | 2003-06-30 |
Family
ID=10746180
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI962340A FI111266B (fi) | 1993-12-06 | 1996-06-05 | Nukleiinihappojen suojaaminen ja analyysimenetelmät |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5861250A (fi) |
| EP (1) | EP0733062B1 (fi) |
| JP (1) | JPH09506255A (fi) |
| KR (1) | KR100221399B1 (fi) |
| AT (1) | ATE166066T1 (fi) |
| AU (1) | AU682563B2 (fi) |
| CA (1) | CA2177603C (fi) |
| DE (1) | DE69410291T2 (fi) |
| DK (1) | DK0733062T3 (fi) |
| ES (1) | ES2119370T3 (fi) |
| FI (1) | FI111266B (fi) |
| GB (1) | GB2285445A (fi) |
| IL (1) | IL111831A (fi) |
| NO (1) | NO317934B1 (fi) |
| WO (1) | WO1995015974A1 (fi) |
| ZA (1) | ZA949643B (fi) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK0815259T3 (da) | 1995-03-04 | 2001-09-17 | Pna Diagnostics As | Modulation af nucleinsyre-bindingspartneres bindingsegenskaber |
| AU4327196A (en) * | 1995-06-22 | 1996-05-31 | Dako A/S | Monoclonal antibody capable of binding to pna/nucleic acid complexes |
| AU4327296A (en) * | 1995-06-22 | 1996-05-15 | Dako A/S | Recombinant antibody capable of binding to pna/nucleic acid complexes |
| US5939262A (en) | 1996-07-03 | 1999-08-17 | Ambion, Inc. | Ribonuclease resistant RNA preparation and utilization |
| US5677124A (en) * | 1996-07-03 | 1997-10-14 | Ambion, Inc. | Ribonuclease resistant viral RNA standards |
| US5853990A (en) | 1996-07-26 | 1998-12-29 | Edward E. Winger | Real time homogeneous nucleotide assay |
| DE19633436A1 (de) | 1996-08-20 | 1998-02-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren unter Ermittlung der Masse |
| US6617422B1 (en) | 1997-05-23 | 2003-09-09 | Peter Nielsen | Peptide nucleic acid monomers and oligomers |
| WO1999034014A2 (en) * | 1997-12-23 | 1999-07-08 | Roche Diagnostics Gmbh | A method for the determination of a nucleic acid |
| JP2002517981A (ja) * | 1998-01-13 | 2002-06-25 | ビオヒプ テヒノロギース ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 核酸配列を検出するための方法 |
| DK1137807T3 (da) * | 1998-12-08 | 2005-01-24 | Boston Probes Inc | Fremgangsmåder, kits og sammensætninger til identifikation af nukleinsyrer, der er elektrostatisk bundet til matrixer |
| US6441152B1 (en) * | 1998-12-08 | 2002-08-27 | Boston Probes, Inc. | Methods, kits and compositions for the identification of nucleic acids electrostatically bound to matrices |
| WO2000056937A2 (en) * | 1999-03-25 | 2000-09-28 | Hyseq, Inc. | Solution-based methods and materials for sequence analysis by hybridization |
| US7816098B2 (en) * | 2000-01-31 | 2010-10-19 | Sense Proteomic Limited | Methods of making and using a protein array |
| AU2001236589A1 (en) * | 2000-02-04 | 2001-08-14 | Aeomica, Inc. | Methods and apparatus for high-throughput detection and characterization of alternatively spliced genes |
| US6962906B2 (en) * | 2000-03-14 | 2005-11-08 | Active Motif | Oligonucleotide analogues, methods of synthesis and methods of use |
| US20040014644A1 (en) * | 2000-03-14 | 2004-01-22 | Vladimir Efimov | Oligonucleotide analogues and methods of use for modulating gene expression |
| WO2001068673A1 (en) | 2000-03-14 | 2001-09-20 | Active Motif | Oligonucleotide analogues, methods of synthesis and methods of use |
| GB0406864D0 (en) | 2004-03-26 | 2004-04-28 | Qiagen As | Nucleic acid sequencing |
| US20080268451A1 (en) * | 2007-03-30 | 2008-10-30 | Bruce Seligmann | Measurement of an insoluble analyte in a sample |
| US20100129902A1 (en) | 2008-11-24 | 2010-05-27 | Erhard Ralf Schoenbrunner | Replication Stable and RNase Resistant Chimeras of Pestivirus with Insertion in 3' Nontranslated Region (3'NTR) |
| CA2778249C (en) * | 2009-11-03 | 2018-12-04 | Htg Molecular Diagnostics, Inc. | Quantitative nuclease protection sequencing (qnps) |
| CA2834976C (en) | 2011-05-04 | 2016-03-15 | Htg Molecular Diagnostics, Inc. | Quantitative nuclease protection assay (qnpa) and sequencing (qnps) improvements |
| EA031654B1 (ru) | 2014-01-10 | 2019-02-28 | Глэксосмитклайн Интеллекчуал Проперти (No.2) Лимитед | Гидроксиформамидные производные и их применение |
| US10689689B2 (en) * | 2015-12-28 | 2020-06-23 | Roche Molecular Systems, Inc. | Generic method for the stabilization of specific RNA |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4800159A (en) * | 1986-02-07 | 1989-01-24 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
| US5578468A (en) * | 1987-08-10 | 1996-11-26 | Duke University | Site-specific RNA cleavage |
| DK51092D0 (da) * | 1991-05-24 | 1992-04-15 | Ole Buchardt | Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf |
| US5539082A (en) * | 1993-04-26 | 1996-07-23 | Nielsen; Peter E. | Peptide nucleic acids |
-
1993
- 1993-12-06 GB GB9324955A patent/GB2285445A/en not_active Withdrawn
-
1994
- 1994-11-30 WO PCT/EP1994/003973 patent/WO1995015974A1/en active IP Right Grant
- 1994-11-30 AT AT95903782T patent/ATE166066T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-11-30 DE DE69410291T patent/DE69410291T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-30 CA CA002177603A patent/CA2177603C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-30 JP JP7515942A patent/JPH09506255A/ja active Pending
- 1994-11-30 DK DK95903782T patent/DK0733062T3/da active
- 1994-11-30 ES ES95903782T patent/ES2119370T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-30 KR KR1019960703043A patent/KR100221399B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-11-30 EP EP95903782A patent/EP0733062B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-30 AU AU12729/95A patent/AU682563B2/en not_active Expired
- 1994-11-30 IL IL11183194A patent/IL111831A/xx not_active IP Right Cessation
- 1994-12-05 ZA ZA949643A patent/ZA949643B/xx unknown
-
1996
- 1996-06-05 NO NO19962331A patent/NO317934B1/no not_active IP Right Cessation
- 1996-06-05 FI FI962340A patent/FI111266B/fi not_active IP Right Cessation
- 1996-06-06 US US08/659,529 patent/US5861250A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0733062A1 (en) | 1996-09-25 |
| US5861250A (en) | 1999-01-19 |
| AU1272995A (en) | 1995-06-27 |
| ATE166066T1 (de) | 1998-05-15 |
| DK0733062T3 (da) | 1999-03-15 |
| WO1995015974A1 (en) | 1995-06-15 |
| AU682563B2 (en) | 1997-10-09 |
| DE69410291D1 (de) | 1998-06-18 |
| GB2285445A (en) | 1995-07-12 |
| GB9324955D0 (en) | 1994-01-26 |
| NO317934B1 (no) | 2005-01-10 |
| NO962331D0 (no) | 1996-06-05 |
| IL111831A (en) | 2000-12-06 |
| ZA949643B (en) | 1996-06-05 |
| CA2177603A1 (en) | 1995-06-15 |
| KR960706504A (ko) | 1996-12-09 |
| NO962331L (no) | 1996-08-06 |
| FI962340A0 (fi) | 1996-06-05 |
| EP0733062B1 (en) | 1998-05-13 |
| DE69410291T2 (de) | 1998-10-29 |
| JPH09506255A (ja) | 1997-06-24 |
| ES2119370T3 (es) | 1998-10-01 |
| FI962340A (fi) | 1996-06-05 |
| IL111831A0 (en) | 1995-01-24 |
| CA2177603C (en) | 2000-07-18 |
| KR100221399B1 (ko) | 1999-10-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI111266B (fi) | Nukleiinihappojen suojaaminen ja analyysimenetelmät | |
| KR0169873B1 (ko) | 킬레이트 작용성을 가지는 핵산 유도체 | |
| AU694468B2 (en) | Solution phase nucleic acid sandwich assays having reduced background noise | |
| FI118424B (fi) | Nukleiinihappoanalogit ja niiden käyttö diagnostisissa ja analyyttisissä toimenpiteissä | |
| US6903206B1 (en) | Kits for amplifying target nucleic acid sequences using modified oligonucleotides | |
| US7572588B2 (en) | Modified probe molecules having self-complementary regions | |
| JP3574134B2 (ja) | 核酸類似体−ペプチドキメラの標識 | |
| AU2001286966B2 (en) | Method for analysis of oligonucleotide analogs | |
| AU2001286966A1 (en) | Method for analysis of oligonucleotide analogs | |
| Borre et al. | PNA used for specific capture of nucleic acids | |
| WO2019165469A1 (en) | Composition and methods for affinity directed enrichment of rare species | |
| EP0815259B1 (en) | Modulation of the binding properties of nucleic acid binding partners | |
| JPH11127876A (ja) | 小三本鎖形成ｐｎａオリゴ | |
| JP2006075110A (ja) | 新規ｓ‐オリゴヌクレオチドコンジュゲート及びそれを有効成分とするアンチセンス剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MA | Patent expired |