NO317934B1

NO317934B1 - Fremgangsmate for beskyttelse og pavisning av en nukleinsyresekvens ved a anvende en nukleinsyreanalog, fremgangsmate for utforelse av en nukleinsyreamplifikasjon og fremgangsmate for opparbeidelse av reaksjonsprodukt derav.

Info

Publication number: NO317934B1
Application number: NO19962331A
Authority: NO
Inventors: Christopher John Stanley; Mikkel Jorgensen; Henrik Orum; Ole Basboll
Original assignee: Pna Diagnostics As
Priority date: 1993-12-06
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 2005-01-10
Also published as: EP0733062A1; IL111831A; ES2119370T3; CA2177603A1; FI962340A; FI111266B; JPH09506255A; ZA949643B; NO962331L; ATE166066T1; DE69410291T2; EP0733062B1; AU682563B2; DE69410291D1; KR960706504A; FI962340A0; WO1995015974A1; NO962331D0; US5861250A; IL111831A0

Abstract

Et utvalgt område i en nukleinsyre beskyttes mot angrep f ra nuklease ved å danne kompleks mellom nukleinsyren og en nukleinsyreanalog av PNA-typen.Den intakte sekvens kan påvises i en analyse,. eventuelt etter amplifikasjon. En PCR-reaksjonsblanding kan steriliseres og produktet av reaksjonen analyseres ved å beskytte et karakteriserende område i produktet ved hjelp av PNA-hybridisering, etterfulgt av nukleasenedbrytning av ubeskyttet nukleinsyre.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for beskyttelse og påvisning av en nukleinsyresekvens ved å anvende en nukleinsyreanalog, en fremgangsmåte for utførelse av en nukleinsyreamplifikasjon og en fremgangsmåte for opparbeidelse av reaksjonsproduktet derav.

For tiden er filterhybridisering den vanlige måte for påvisning av hvorvidt en bestemt basesekvens er til stede i en nukleinsyreprøve. Nukleinsyren ekstraheres fra utgangsmaterialer og renses. Det kan være nødvendig å amplifisere den ved hjelp av en slik fremgangsmåte som PCR. Nukleinsyren immobiliseres så i enkelttrådet form på et filter og probes med et merket oligo-nukleotid som har en sekvens som er komplementær til den som skal påvises. Før den immobiliseres kan nukleinsyren kjøres på en gel for å separere nukleinsyrefragmenter med forskjellig molekylvekt. Dette er den mye brukte "Southern blot"-fremgangsmåte. Denne fremgangsmåte har et stort antall ulemper. Nukleinsyren må separeres fra andre materialer. Når nukleinsyren er DNA, vil det normalt være nødvendig å gå gjennom et denature-ringstrinn. Stringensbetingelsene ved hybridiseringen vil trenge nøyaktig regulering for å unngå falske, positive resultater og for å oppnå det ønskede sondringsnivå mellom like sekvenser. På grunn av det begrensede signal til forstyrrelser ved filter-hybridiseringen vil amplifikasjonstrinn ofte være nødvendig for å gi tilstrekkelig av den interessante sekvens for påvisning. Dette frembringer mange muligheter for fremstillingen av falske, negative resultater.

Nukleinsyreanaloger med viktige, nye anvendelser innen ana-lysefremgangsmåter og innenfor diagnoseområdet er blitt beskrevet i WO 92/20703. Disse nukleinsyreanalogene hadde en rekke nye egenskaper som gjorde dem spesielt viktige innenfor diagnose-feltet samt innenfor feltet antisense-terapeutika. Slike nukleinsyreanaloger er her henvist til som "PNA-er".

De fremviser vanligvis en polyamidryggrad som bærer en sekvens av ligander som er nukleinsyrebaser. De der beskrevne analoger har den egenskap at de hybridiserer med stor spesifisitet og stabilitet til naturlige nukleinsyrer med komplementær sekvens.

I WO 93/25706 beskrives anvendelsen av PNA-nukleinsyreanaloger for å danne bestemte stabile hybrider med DNA-sekvenser for selektivt å blokkere PCR-amplifikasjonen av disse bestemte sekvensene, ved å anvende vanlige nukleinsyreprimere med en lavere hybridiseringsstabilitet.

Vi har nå oppdaget at slike nukleinsyreanaloger har den ytterligere verdifulle egenskap at de beskytter sekvenser av enkelttrådede nukleinsyrer som de er hybridisert til, mot å bli brutt ned ved hjelp av disse reagenser under omstendigheter og betingelser hvor reagensene normalt ville være effektive når det gjelder å gi nedbrytning av de enkelttrådede nukleinsyrer. Om-råder i nukleinsyren som ikke er hybridisert til nukleinsyreanalogen, kan nedbrytes som normalt.

Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for påvisning av tilstedeværelsen av en nukleinsyresekvens i en prøve kjennetegnet ved at prøven eksponeres mot en nukleinsyreanalog som er i stand til å hybridisere på sekvensselektiv måte til sekvensen dersom den er til stede i prøven, under slike hybridiseringsbetingelser at det dannes et kompleks mellom nukleinsyreanalogen og nukleinsyren som inneholder sekvensen, nukleinsyren eksponeres mot et reagens som er i stand til å bryte ned nukleinsyren under slike betingelser at sekvensen til nukleinsyrekomplekset beskyttes mot angrep fra reagenset mens det gjenværende av nukleinsyren brytes ned, og tilstedeværelsen av komplekset påvises.

Nukleinsyren kan være RNA eller DNA.

Reagenset er fortrinnsvis en nuklease og er i stand til å bryte ned nukleinsyren enten fullstendig eller ved å spalte den på bestemte steder.

I det enkleste tilfelle vil det utvalgte område i nukleinsyren som skal beskyttes, bestå av nukleinsyresekvensen som nukleinsyreanalogen hybridiserer til. Når det angripende reagens er en eksonuklease som er i stand til å bryte ned nukleinsyrer under betingelsene som anvendes bare ved å arbeide seg inn fra 5<1-> og 3'-endene, vil imidlertid et større utvalgt område kunne beskyttes ved å plassere en respektiv nukleinsyreanalog i hver ende av det utvalgte område, idet en del av det utvalgte område får være uhybridisert mellom de to nukleinsyreanalogsekvensene. Den mellomliggende del av det utvalgte område skjermes mot adgang for eksonukleasen. Når eksonukleasen under de anvendte betingelser er i stand til bare å angripe fra 5<1-> eller 3<1->enden, kan det anvendes en enkelt nukleinsyreanalogsekvens for å skjerme hele den delen av nukleinsyren som ligger henholdsvis 3' eller 5' i forhold til nukleinsyreanalogen.

Når det anvendes en endonuklease som det angripende

reagens, vil en kort strekning av nukleinsyre eksponert uhybridisert mellom to nukleinsyreanalogoligomerer som ligger ved siden av hverandre på nukleinsyren, ikke desto mindre danne en del av det utvalgte område som beskyttes, i kraft av en eller annen

interaksjon mellom endebasene til de to nukleinsyreanalogsekvensene, eller på grunn av innvirkning fra nukleinsyreanalogen på aktiviteten av endonukleasen.

Nukleinsyreanalogen er fortrinnsvis en som omfatter en po-lymertråd som omfatter en sekvens av ligander bundet til en ryggrad laget av sammenbundne ryggradsrester, idet analogen er i stand til hybridisering til nukleinsyre med komplementær sekvens.

Nukleinsyreanalogryggraden er fortrinnsvis en polyamid-, polytioamid-, polysulfinamid- eller polysulfonamid-ryggrad.

De sammenbundne ryggradsrester er fortrinnsvis peptidbundne aminosyrerester.

Nukleinsyreanalogen er fortrinnsvis i stand til å hybridisere til en nukleinsyre med komplementær sekvens slik at det dannes et hybrid som er mer stabilt mot denaturering med varme, enn et hybrid mellom det vanlige deoksyribonukleotid som i sekvens tilsvarer analogen og nukleinsyren.

Nukleinsyreanalogen er fortrinnsvis en peptidnukleinsyre hvor ryggraden er en polyamidryggrad, idet hver av nevnte ligander er bundet direkte eller indirekte til et azanitrogen-atom i ryggraden, og idet de ligandbærende nitrogenatomer hovedsakelig er atskilt fra hverandre i ryggraden med fra 4 til 8 mellomliggende atomer.

Nukleinsyreanalogen er fortrinnsvis også i stand til å hybridisere til en dobbelttrådet nukleinsyre hvor én tråd har en sekvens som er komplementær til analogen, på en slik måte at den andre tråd fjernes fra den første tråd.

Fortrinnsvis har nukleinsyreanalogen den generelle formel 1:

hvor:

n er minst 2,

hver L1-! ? er uavhengig av hverandre valgt fra gruppen bestående av hydrogen, hydroksy, (Ci-C4)-alkanoyl, naturlig forekommende nukleobaser, ikke-naturlig forekommende nukleobaser, aromatiske rester, DNA-interkalatorer, nukleobasebindende grupper, heterosykliske rester og rapportørligander, men normalt vil minst én L være en nukleobasebindende gruppe, slik som en naturlig forekommende nukleobase, og fortrinnsvis minst 90% av gruppene L vil være slike nukleobasebindende grupper;

hver C^-<C>" er (CR<fi>R<7>)y hvor R<6> er hydrogen og R7 er valgt fra gruppen bestående av sidekjedene til naturlig forekommende alfa-aminosyrer, eller R<6> og R<7> er uavhengig av hverandre valgt fra gruppen bestående av hydrogen, (C2-C6)-alkyl, aryl, aralkyl, heteroaryl, hydroksy, (C!-C6)-alkoksy, (Ci-C6)-alkyltio, NR3R4 og SR<5>, hvor R<3> og R<4> er som definert nedenunder, og R<5> er hydrogen, (Ci-C6)-alkyl, hydroksy, alkoksy eller alkyltiosubstituert (Ci-C6)-alkyl eller R6 og R7 fullstendiggjør til sammen et alisyklisk eller heterosyklisk system,-

hver D<1->Dn er (CR<6>R<7>)Z hvor R<6> og R7 er som definert ovenfor;

hver y og z er null eller et helt tall fra 1 til 10, idet summen y+z er fra 2 til 10 (fortrinnsvis mer enn 2, og helst er hver y og z 1 eller 2);

hver G<1->G<n>"<1> er -NR<3C>O-, -NR<3>CS-, -NR<3>SO- eller -NR3S02-, orientert i én av de to retningene, hvor R3 er som definert nedenunder;

hver A<1->An og B<1->Bn er valgt slik at:

(a) A er en gruppe med formel (Ila), (Ilb), (lic) eller (Ild), og B er N eller R<3>N<+>; eller (b) A er en gruppe med formel (Ild) og B er CH;

hvor:

X er 0, S, Se, NR<3>, CH2 eller C(CH3)2;

Y er en enkeltbinding, O, S eller NR<4>;

hver p og q er null eller et helt tall fra 1 til 5, idet summen p+q ikke er mer enn 10;

hver r og s er null eller et helt tall fra 1 til 5, idet summen r+s ikke er mer enn 10;

hver R<1> og R<2> er uavhengig av hverandre valgt fra gruppen bestående av hydrogen, (C1-C4) -alkyl som kan være hydroksy-, alkoksy- eller alkyltiosubstituert, hydroksy, alkoksy, alkyltio, amino og halogen,- og

hver R<3> og R<4> er uavhengig av hverandre valgt fra gruppen bestående av hydrogen, (C1-C4)-alkyl, hydroksy-, alkoksy- eller alkyltiosubstituert (C1-C4)-alkyl, hydroksy, alkoksy, alkyltio og amino;

Q er -C02H, -C0NR'R", -SO3H eller -S02NR'R", eller et aktivert derivat av -C02H eller -S03H; og

I er -NR'R", hvor R' og R" uavhengig av hverandre er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, alkyl, aminobeskyt-telsesgrupper, rapportørligander, interkalatorer, chelatorer, peptider, proteiner, karbohydrater, lipider, steroider, nuk-leosider, nukleotider, nukleotiddifosfater, nukleotidtrifos-fater, oligonukleotider, inkludert både oligoribonukleotider og oligodeoksyribonukleotider, oligonukleosider og oppløselige og ikke-oppløselige polymerer.

Mer foretrukket omfatter nukleinsyreanalogen en forbindelse med den generelle formel III, IV eller V:

hvor:

hver L uavhengig av hverandre er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, fenyl, heterosykliske rester, naturlig forekommende nukleobaser og ikke-naturlig forekommende nukleobaser;

hver R7 er uavhengig av hverandre valgt fra gruppen bestående av hydrogen og sidekjedene til naturlig forekommende alfa-aminosyrer;

n er et helt tall som er større enn 1;

hver k, 1 og m er uavhengig av hverandre null eller et helt tall fra 1 til 5;

hver p er null eller 1;

Rh er OH, NH2 eller -NHLysNH2; og

R<1> er H eller -COCH3.

Fremgangsmåten for beskyttelse av en nukleinsyre beskrevet ovenfor, kan anvendes ved en fremgangsmåte for påvisning av en nukleinsyresekvens. Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for påvisning av tilstedeværelsen i en nukleinsyreprøve av en sekvens hvor fremgangsmåten omfatter eksponering av nukleinsyreprøven mot en nukleinsyreanalog som er i stand til å hybridisere på sekvensselektiv måte til sekvensen dersom den er til stede i nukleinsyreprøven, under hybridiseringsbetingelser slik at det dannes et kompleks mellom nukleinsyreanalogen og et område i nukleinsyren som inneholder sekvensen, eksponering av nukleinsyren mot et reagens som er i stand til å bryte ned nukleinsyren under slike betingelser at området i nukleinsyren som danner komplekset, beskyttes mot angrep fra reagenset mens det gjenværende av nukleinsyren brytes ned, og påvisning av tilstedeværelsen av komplekset.

Det vil være mange måter å påvise tilstedeværelsen av komplekset på. Disse kan deles opp i de som påviser komplekset som sådant, og de hvor komplekset brytes opp i sine bestanddeler av nukleinsyre og nukleinsyreanalog, og tilstedeværelsen av nukleinsyren eller nukleinsyreanalogen påvises. Eksistensen av komplekset kan utledes fra nukleinsyrens overlevelse.

I den første gruppen av fremgangsmåter kan man basere seg på forskjeller i egenskaper hos nukleinsyreanalogen og hydridet av nukleinsyre og nukleinsyreanalog. Tilstedeværelsen av komplekset påvises således fortrinnsvis ved å sammenligne forflytningen av komplekset ved elektroforese med forflytningen av nukleinsyreanalogen under lignende betingelser.

Nukleinsyreanalogen eller nukleinsyren bærer fortrinnsvis en påvisbar markør, idet egnede markører for nukleinsyreanalogen omfatter en fluorescerende markør, en radiomarkør, en enzymmarkør, biotin, en spinnmarkør, en kjemiluminescerende markør, en antigenmarkør eller en antistoffmarkør. Den mest foretrukne av disse er anvendelsen av en fluorofor eller en radioisotop som en markør, men generelt kan det anvendes hvilken som helst fremgangsmåte for merking som er anvendbar for peptider.

Ved en foretrukket utførelse av dette aspektet ved oppfinnelsen er nukleinsyreanalogen en merket nukleinsyreanalog fremstilt ved hjelp av en fremgangsmåte for merking av en nukleinsyreanalog som omfatter tilveiebringelse av en nukleinsyreanalog med et peptidmotiv som er i stand til å virke som et substrat for et enzym i en merkingsreaksjon, og utførelse av merkingsreaksjonen som omfatter omsetning av peptidmotivet til nukleinsyreanalogen under påvirkning av et enzym med en kilde for markøren.

Fortrinnsvis er markøren en radiomarkør.

Kilden for markøren er fortrinnsvis radioaktivt merket ATP. Enzymet er fortrinnsvis en proteinkinase.

Peptidmotivet er fortrinnsvis kemptidmotivet.

Merkingsreaksjonen er fortrinnsvis en fosforylering i en serinrest i peptidmotivet.

En alternativ fremgangsmåte for merking av en nukleinsyreanalog omfatter tilveiebringelse, fortrinnsvis i én ende av nukleinsyreanalogen, av en chelaterende rest som er i stand til å binde minst ett metallion ved chelatering, og chelatering av en radioisotop eller fluorofor direkte eller indirekte til denne. For eksempel vil et europiumion kunne chelateres ved hjelp av en egnet chelateringsrest båret av nukleinsyreanalogen slik at den virker som en fluorescerende markør.

En alternativ påvisningsfremgangsmåte i denne første gruppen gjør bruk av nukleinsyresekvensen som er beskyttet,

til å virke som et middel for sammenbinding av to nukleinsyreanalog se kvens er som ellers ikke ville inngå forbindelse. Dersom hver bærer en annerledes markørtype, kan forbindelsen mellom de to markørene påvises. Eksempelvis vil to nukleinsyreanalogoligomerer kunne hybridiseres til respektive ender av en målnukleinsyresekvens som danner en del av en større nukleinsyresekvens. Én nukleinsyreanalog merkes med en rest egnet for binding til en fast fase, f.eks. et chelaterende peptidmotiv, slik som His5. Den andre forsynes med en påvisbar markør, merkes f.eks. radioaktivt. Etter fordøyelse av ubeskyttet nukleinsyre overlates de to nukleinsyreanalogsekvensene sammenknyttet via hybridisering til den målnukleinsyrebeskyttede sekvens. Komplekset vil kunne fanges opp på et fast underlag som bærer chelaterbare nikkelioner, via chelatering ved hjelp av den første nukleinsyreanalog. Radioaktivt merket overskudd av andre nukleinsyreanalog kan vaskes bort og radioaktiviteten til den andre, merkede nukleinsyreanalog vil kunne påvises på det faste underlag eller etter eluering fra det.

Andre eksempler vil omfatte de som har ett nukleinsyre anal ogbær ende biotin som en rest egnet for binding til en fast fase i stedet for det chelaterende peptidmotiv, og den andre nukleinsyreanalog bundet til en påvisbar markør, f.eks. et enzym eller en fluorofor. Dersom den påvisbare markør er et enzym som er i stand til å katalysere fremstillingen av et påvisbart produkt, er analysen analog med det godt etablerte ELISA-prinsipp innen immunologisk analyse.

Alternative midler for å separere hybridisert nukleinsyreanalog fra ikke-hybridisert omfatter reversfase-eller ionebytterkromatografi, eller gelfiltrering. Det kan brukes en antistoffutvelgelsesfremgangsmåte hvor det anvendes et antistoff med spesifisitet for intakt nukleinsyre, eller med spesifisitet for hybridet av nukleinsyren og nukleinsyreanalogen .

I den andre gruppen av påvisningsfremgangsmåter denatureres komplekset mellom nukleinsyren og nukleinsyreanalogen, og overlevelsen av den beskyttede nukleinsyresekvens påvises, passende ved hjelp av kjente nukleinsyresekvenspåvisnings-metoder, slik som en hybridiseringsanalyse. Eventuelt vil nukleinsyresekvensen kunne underkastes en amplifikasjonsfrem-gangsmåte. LCR vil generelt være foretrukket for amplifisering av korte, beskyttede sekvenser og PCR for lengre.

Nukleinsyreamplifikasjonsfremgangsmåter, spesielt de velkjente PCR-fremgangsmåter, støter ofte på vanskeligheter når målsekvensen som skal amplifiseres, er til stede blant en større mengde av en annen nukleinsyre.

Slik det er vist ovenfor, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et lettvint middel for "opprensing" av en nuklein-syreprøve ved nedbrytning av all nukleinsyre som er til stede, bortsett fra målsekvensen, hvorved det gjøres mulig å utføre amplifikasjon mer lettvint, enten for analyse- eller preparativt formål.

Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for utførelse av en nukleinsyreamplifikasjon som omfatter beskyttelse av et utvalgt område i en nukleinsyre i en nukleinsyreprøve ved å hybridisere til nukleinsyren en nukleinsyreanalog som hybridiserer til den på en sekvensspesifikk måte, eksponering av prøven mot et nukleinsyreangripende reagens for å bryte ned nukleinsyren i prøven, bortsett fra det utvalgte område, denaturering av komplekset av nukleinsyre og dannet nukleinsyreanalog, og amplifisering av det utvalgte område.

For å befri den beskyttede sekvens for amplifikasjon kan hybridet av nukleinsyre og nukleinsyreanalog denatureres ved hjelp av varme. Det kan anvendes hvilken som helst amplifika-sjonsf remgangsmåte, inkludert alle for tiden kjente fremgangsmåter, slik som PCR og dens varianter, LCR og 3SR.

I WO 93/25706 (PCT/EP93/01435) er det beskrevet en fremgangsmåte for sterilisering av en nukleinsyreamplifikasjon ved å hybridisere til amplifikasjonsproduktet en nukleinsyreanalog som vil forhindre eventuell amplifikasjon fra å virke som et ampli-fiserbart mål. Dette kan bli enda ytterligere forbedret i henhold til et fjerde aspekt av foreliggende oppfinnelse ved å beskytte et område i amplifikasjonsproduktet som utelukker minst ett primerbindende sete som er nødvendig for gjentakelse av amplifikasjonen, ved hjelp av en fremgangsmåte i overensstem-melse med det første aspektet av oppfinnelsen, bryte ned den gjenværende nukleinsyre, inkludert de primerbindende seter i amplifikasjonsproduktet, og påvise overlevelsen av den beskyttede nukleinsyre som omtalt ovenfor. Fortrinnsvis nedbrytes i det minste noe, helst alt, av de primerbindende sekvenser.

Nukleinsyreanalogen kan være til stede under en PCR-fremgangsmåte forutsatt at temperaturene som anvendes, er tilstrekkelig høye til å smelte nukleinsyreanalogen fra nukleinsyren, eller kan tilsettes ved slutten av amplifikasjonen. Det angripende reagens vil måtte tilsettes etter amplifikasjonen, men kan tilsettes fra et separat rom i et lukket amplifika-sjonsapparat slik at amplifisert produkt aldri har mulighet til å unnslippe og bli en forurensning. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig en fremgangsmåte for opparbeidelse av reaksjonsproduktet av en nukleinsyreamplifikasjonsfremgangsmåte, kjennetegnet ved at et utvalgt område i nukleinsyreproduktet fra amplifikasjonen beskyttes ved å danne et kompleks mellom nukleinsyren og en nukleinsyreanalog som hybridiserer til den på en sekvensselektiv måte, og nukleinsyren eksponeres mot et nukleinsyreangripende reagens, hvor komplekset er mer stabilt mot angrep fra reagenset enn utgangsnukleinsyren.

Oppfinnelsen vil bli illustrert ved hjelp av de følgende eksempler under henvisning til den ledsagende tegning hvor: figur 1 er et autoradiografi av en gel som viser resultatene fra eksemplene 3-5.

Én lettvint fremgangsmåte for fremstilling av en PNA som bærer en radioaktiv markør med høy, spesifikk aktivitet, særlig foretrukket for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse, er beskrevet i britisk patentsøknad nr. 9324 956.3, innlevert samtidig med den søknaden som det her er krevet prioritet fra. I henhold til en slik fremgangsmåte i dens foretrukne form fremstilles en PNA med en terminal kemptidforlengeIse som gjennomgår en reaksjon med <32>P-ATP formidlet ved hjelp av proteinkinase A, hvorved man får en <32>P-markør bundet til en serinrest. PNA-er med peptidforlengelser av ønskede aminosyre-sekvenser kan passende fremstilles ved hjelp av Boe- eller Fmoc-fastfaseteknikkene som er godt forstått innen fagområdet når først en utgangs-PNA-sekvens er blitt bygget opp på den faste bæreren som er egnet, ved å anvende Boe-fastfasesyntesen beskrevet i WO 92/20703.

Ifølge foretrukne former av det første aspekt av foreliggende oppfinnelse kan en nukleinsyreholdig sekvens som skal beskyttes, behandles med en PNA som har en sekvens som er komplementær til sekvensen av interesse. Dersom nukleinsyren er DNA, kan den være i dobbelttrådet form, og man vil kunne basere seg på nukleinsyreanalogens evne til å hybridisere til sin målsekvens i dobbelttrådet form. Det vil imidlertid kunne være nødvendig og vil normalt være ønskelig å denaturere den dobbelttrådede mål-DNA, vanligvis ved oppvarming. DNA-en kan være ganske uren, dvs. andre celleprodukter kan være til stede. DNA-en vil også kunne være hel genom-DNA eller total celle-RNA ekstrahert fra celler og ikke fordøyd til kortere lengder. DNA-en eller RNA-en vil også kunne være produktet av en nukleinsyreamplifikasjonsfremgangsmåte, slik som LCR eller PCR, eller en NASBA (3SR)-amplifikasjon. Foretrukne PNA-er vil binde sekvensselektivt med høy affinitet selv om mål-DNA-en er dobbelttrådet. Nukleinsyreprøven kan så behandles med en nuklease eller nukleaseblanding for å bryte ned alt av nukleinsyren som ikke er beskyttet ved hybridisering til PNA-en. PNA-en kan være til stede i vesentlig overskudd for å sikre at dersom det er selv bare én korrekt sekvens til stede i nukleinsyreprøven, vil den bli hybridisert og beskyttet.

Reaksjonsproduktet kan underkastes elektroforese på en gel eller i et kapillarrør for å separere PNA som er hybridisert til nukleinsyre fra ikke-hybridisert PNA. Ettersom PNA er et hovedsakelig nøytralt molekyl som har en positiv ladning pr. molekyl vanligvis i den terminale amingruppe, oppviser den liten tilbøyelighet til å migrere under elektroforese. Nukleinsyrer er på den annen side svært negativt ladet, og hybridisering av PNA til et nukleinsyrefragment resulterer i et negativt ladet hybrid som vil migrere under elektroforese i motsatt retning av PNA-en selv. Dette bevirker en rask og svært spesifikk separasjon av den hybridiserte og ikke-hybridiserte PNA. Dersom PNA-en merkes passende, er det mulig å påvise ekstremt små mengder av den, og analysefremgangsmåten ifølge det andre aspektet av oppfinnelsen gir et utmerket forhold mellom signal og støy.

PNA-er er i stand til å skjelne nukleinsyresekvenser som atskiller seg med bare én rest. Følgelig gir de ovenfor beskrevne fremgangsmåter mulighet til en svært hurtig og enkel analyse som er i stand til å bestemme hvorvidt en prøve av genom-DNA inneholder en bestemt allelvariasjon innenfor et bestemt gen. Ettersom PNA-er med forskjellige lengder hybridisert til nukleinsyrer er lett separerbare under elektroforese, foreligger dessuten også muligheten for prøving av en nukleinsyreprøve med flere PNA-er samtidig, idet alt av den uhybridiserte nukleinsyre fordøyes bort, og idet alt av PNA/- nukleinsyrehybridene separeres ved elektroforese fra de uhybridiserte overskudds-PNA-er og fra hverandre. I en eneste analyse kan man således vise at en DNA-prøve inneholder, eventuelt på forskjellige gener, én eller annen bestemt kombinasjon av allelvariasjoner av interesse, f.eks. en som er funnet å gi opphav til en bestemt fenotype, slik som en sykdomstil-stand.

Eksempel 1

Fremstilling av en PNA- kemptidkimær

Fastfase-PNA-syntesen beskrevet i WO 92/20703, ble brukt til å bygge opp sekvensen: BOC-NH{CH2)5CONH-TG(Z)T.A(Z)C(Z)G(Z) .TC(Z)A{Z) .C(Z)A(Z)A-(Z).C(Z)TA{Z)-CONH-harpiks.

Den N-terminale Boc-gruppe ble fjernet ved behandling med TFA og brukt som et utgangspunkt for en standard fastfase-peptidsyntese av Boe-type for kemptidmotivet via linkeren 6-aminoheksansyre, hvorved man får kimæren: Boe-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Ser-(Bzl)-Leu-Gly-NH(CH2) 5CONH-TG(Z)T.A(Z)C(Z)G(Z) .TC(Z)A(Z) .C (Z) A (Z) A(Z) .C(Z)TA(Z) -CONH-har-piks.

Beskyttelsesgruppene ble fjernet og produktet spaltet fra harpiksen ved hjelp av lav-høy-TFMSA-fremgangsmåten. Rå-produktet ble renset ved hjelp av preparativ HPLC (reversfase-Cia-eluering med en gradient på A:0,1% TFA i vann ("MilliQ") og B:0,1% TFA, 10% vann, 90% acetonitril). Det rensede kimær-PNA-kemptid ble karakterisert ved hjelp av analytisk HPLC og FAB-MS.

Eksempel 2

Radioaktiv merking av kemptidmotivet ( Leu- Arg- Arg- Ala- Ser- Leu-Gly) ved hjelp av proteinkinase A

PNA-kemptidkimæren med formel:

H-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-TGTACGTCACAACTA-NH2

ble merket med <32>P i en reaksjonsblanding inneholdende:

PNA-kemptid, 10 fiW ......................... 5 fil

10 x proteinkinase A-buffer ................ 5 fil y <32>P ATP (>5 000 Ci/mmol; 50 fiCi/ fil) ...... 10 fil Proteinkinase A (Boehringer; 5 mU//il) ...... 0,2 fil H20 30 pl

Reaksjonsblandingen ble inkubert i 3 0 minutter ved 30 °C og så i 10 minutter ved 65 °C før den ble sentrifugert i 30 sekunder ved 15 000 g. Supernatanten ble overført til et nytt Eppendorf-rør. Vann ble tilsatt inntil 1 ml, og det merkede PNA-kemptid ble skilt fra uinkorporert y 32P-ATP ved hjelp av anionbytterkromatografi under anvendelse av en DEAE "Sephadex A-50" ani onby11 e rko1onne.

Den spesifikke aktivitet til PNA-kemptidet ble beregnet ved 1 x 10<8> cpm/ fig PNA-kemptid.

Eksempel 3

Påvisning av DNA- sekvens via beskyttelse ved hjelp av PNA

Den 15-mer PNA som bærer det radioaktivt merkede kemptidmotiv slik det ble laget i eksempel 2, ble inkubert i 15 minutter separat med hver av de følgende nukleinsyrer:

1. Ingen (se figur 1, felt 1).

2. Komplementær DNA-15-mer. (Se figur 1, feltene 2 og 5).

3. DNA-10-mer komplementær til en del av sekvensen til

PNA-en. (Se figur 1, felt 3).

4. DNA-4 0-mer 5<1>CTAGAGGATCTAGTTGTGACGTACAGGATCTTTTTCA-

TAG-3 inneholdende en 15-basesekvens som er komple-

mentær til PNA-en i midten av sekvensen. (Se figur 1, feltene 4 og 6).

I hvert tilfelle ble 4 fil av en 10 /xM oppløsning av oligonukleotidet blandet med 5 fil av den merkede PNA i et 10 fil reaksjonsvolum inneholdende 30 mM NaAc (pH 5,0), 50 mM NaCl, 10 mM ZnCl2 og 55 volum% glyserol. Inkubasjon i 15 minutter fant sted ved romtemperatur.

I tilfellet med én av to reaksjoner under anvendelse av 40-mer-DNA-en og i tilfellet med én av to reaksjoner under anvendelse av 15-mer-DNA-en ble 15 enheter mangobønnenuklease tilsatt, og reaksjonsblandingene ble inkubert ved 37 °C i 5 minutter.

Alle reaksjonene ble avsluttet ved å tilsette 10 fil påfyllingsbuffer (30 volum% glyserol, 0,25% (vekt/volum) brom-fenolblått, 0,25% xylencyanol, 0,01% SDS), og reaksjonsblandingene ble underkastet elektroforese i en 10% polyakrylamidgel og deretter autoradiografi.

Resultatene er vist i figur 1, feltene 1-6. I felt 1 kjøres den merkede PNA alene, og det ses ingenting ettersom den er immobil på gelen. I felt 2 hybridiseres den merkede PNA til 15-mer-DNA-en, og det ses et bånd for hybriden. I felt 3 hybridiseres den merkede PNA til 10-mer-DNA-en, og det kan ses at det fremstilte bånd klart lar seg skjelne fra båndet i felt 2 ved den avstanden som det har beveget seg som følge av for-skjellen i størrelsen til de to oligo-DNA-ene som er involvert. I felt 4 er PNA-en hybridisert til 4 0-mer-DNA-en og

igjen muliggjør den avstanden som båndet har beveget seg på gelen, at man kan skjelne mellom 1SPNA/<10>DNA- og <l5>PNA/<15>DNA-hybridene og <15>PNA/<40>DNA-hybriden.

I felt 5 ser man resultatet av nukleasefordøyelse i tilfellet med <15>PNA/<15>DNA-hybriden. Båndet er det samme som i felt 2, noe som viser at nukleasen ikke har vært i stand til å bryte ned den hybridiserte DNA. Felt 6 viser resultatet av nukleasefordøyelsen av <15>PNA/<40>DNA-hybriden. Igjen er båndet som i felt 2, noe som viser at bare den delen av DNA-en som er hybridisert til PNA-en, er beskyttet mot nukleasen. Den indre 15-mer-sekvensen i 40-mer-DNA-en som er komplementær til PNA, er derfor blitt påvist ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet ovenfor under henvisning til felt 6.

Eksempel 4

Beskyttelse av RNA mot nuklease ved hjelp av PNA

PNA-Tio som bærer kemptidmotivet, ble merket som i eksempel 2. Den merkede PNA ble inkubert med en blanding av polyadenylerte RNA-er i henhold til den følgende fremgangsmåte. PNA (5 fil) ble inkubert med 4 fil 100 ng/pl RNA-transkripter (Gibco BRL) blandet in vi tro i et 10 fil reaksjonsvolum som inneholder andre bestanddeler, og under tids-og temperaturbetingelser som i eksempel 3. En likt inkubert blanding ble videre inkubert med mangobønnenuklease som i eksempel 3, og reaksjonsblandingene ble fremstilt for og underkastet elektroforese og autoradiografert som i eksempel 3. Resultatene ses i feltene 7 og 8 i figur 1.

Felt 7 viser en uoppløst "stige" med forskjellige størrelser av PNA/RNA-hybrider. I felt 8 har nukleasen oppløst "stigen" i et enkeltbånd ved å skjære bort alle RNA-ene til An-delen beskyttet av PNA-en.

Eksempel 5

Påvisning av enkeltbaseparvariasjon i 15- mer- DNA

Den 15-mer-merkede PNA brukt i eksempel 3, ble hybridisert til to forskjellige DNA-er under to forskjellige temperaturbetingelser på følgende måte.

Den merkede PNA ble hybridisert til komplementær 15-mer-DNA ved inkubasjonstemperaturer på henholdsvis 55 og 65 °C, og i hvert tilfelle ble reaksjonsblåndingen behandlet ved den temperaturen med mangobønnenuklease. I andre hen-seender var betingelsene som i eksempel 3. To like inkuba-sjoner fant sted under anvendelse av den enkeltbaseutilpassede 15-mer-DNA 51 -TAGTTGCGACGTACA -3' ved de samme to temperaturene med etterfølgende tilsetning av mangobønnenuklease. De resulterende autoradiografier ses i feltene 9 til 12 i figur 1.

I felt 9 er resultatet av hybridiseringen av PNA-en til dens fullstendig komplementære DNA ved 65 °C med nukleasenedbrytning et bånd som tilsvarer beskyttelse av DNA-en ved hjelp av PNA-en. Felt 10 viser resultatet av hybridisering ved 65 °C med den utilpassede enkeltbase. DNA-en er ikke beskyttet, og det ses ikke noen hybrid. Felt 11 viser resultatet av

forsøket ved 55 °C med den fullstendig komplementære sekvens,

og felt 12 viser resultatet av forsøket ved 55 °C med enkelt-utilpasningen. I begge disse feltene påvises den beskyttede

DNA.

Smeltepunktet for den perfekt tilpassede 15-mer-hybrid er 69 °C. Under de strenge hybridiseringsbetingelsene pålagt ved å arbeide nært opp til dette smeltepunktet, skjelner PNA-en mellom den perfekt tilpassede DNA og enkeltbase-utilpasningen med smeltepunkt 61 °C. Ved 55 °C dannes imidlertid hybrider både med den perfekte tilpasning og enkeltbaseutilpasningen, noe som ville bli forutsagt ut fra smeltepunktene til hybridene.

Claims

1. Fremgangsmåte for påvisning av tilstedeværelsen av en nukleinsyresekvens i en prøve, karakterisert ved at prøven eksponeres mot en nukleinsyreanalog som er i stand til å hybridisere på sekvensselektiv måte til sekvensen dersom den er til stede i prøven, under slike hybridiseringsbetingelser at det dannes et kompleks mellom nukleinsyreanalogen og nukleinsyren som inneholder sekvensen, nukleinsyren eksponeres mot et reagens som er i stand til å bryte ned nukleinsyren under slike betingelser at sekvensen til nukleinsyrekomplekset beskyttes mot angrep fra reagenset mens det gjenværende av nukleinsyren brytes ned, og tilstedeværelsen av komplekset påvises.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at påvisningen av tilstedeværelsen av komplekset er basert på en egenskap ved komplekset av nukleinsyren og nukleinsyreanalogen som er forskjellig fra nukleinsyreanalogen.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at komplekset av nukleinsyreanalog hybridisert til nukleinsyren atskilles fra ikke-hybridisert nukleinsyreanalog.

4. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved at tilstedeværelsen av komplekset påvises ved å denaturere komplekset og påvise at sekvensen er intakt.

5. Fremgangsmåte ifølge kravene 1, 2, 3 eller 4, karakterisert ved at reagenset er en nuklease.

6. Fremgangsmåte ifølge kravene 1, 2, 3 eller 4, karakterisert ved at nukleinsyreanalogen omfatter en polymerstreng som omfatter en sekvens av ligander bundet til en ryggrad laget av sammenbundne ryggradsrester, hvor analogen er i stand til hybridisering til en nukleinsyre med komplementær sekvens.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at nukleinsyreanalogryggraden er en polyamid-, polytioamid-, polysulfinamid- eller polysulfonamidryggrad.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at de sammenbundne ryggradsrester er peptidbundne aminosyrerester.

9. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, karakterisert ved at nukleinsyreanalogen er i stand til å hybridisere til en nukleinsyre med komplementær sekvens, hvorved det dannes et hybrid som er mer stabilt mot denaturering ved hjelp av varme, enn et hybrid mellom det kon-vensjonelle deoksyribonukleotid som i sekvens tilsvarer analogen, og nukleinsyren.

10. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, karakterisert ved at nukleinsyreanalogen har den generelle formel 1: hvor: n er minst 2, hver av L1-!/1 er uavhengig av hverandre valgt fra gruppen bestående av hydrogen, hydroksy, (Ci-C4)-alkanoyl, naturlig forekommende nukleobaser, ikke-naturlig forekommende nukleobaser, aromatiske rester, DNA-interkalatorer, nukleobasebindende grupper, heterosykliske rester og rapportør, hver av C1-^ er {CR<6>R<7>)y hvor R<6> er hydrogen og R<7> er valgt fra gruppen bestående av sidekjedene til naturlig forekommende alfa-aminosyrer, eller R<6> og R<7> er uavhengig av hverandre valgt fra gruppen bestående av hydrogen, (Ci-Ce)-alkyl, aryl, aralkyl, heteroaryl, hydroksy, (Ci-Cg) -alkoksy, (Ci-Cs)-alkyltio, NR3R4 og SR<S>, hvor R3 og R<4> er som definert nedenunder, og R<5> er hydrogen, (Ci-Cg)-alkyl, hydroksy, alkoksy eller alkyltiosubstituert (Ci-C6)-alkyl, eller R<6> og R7 fullstendiggjør til sammen et alisyklisk eller heterosyklisk system, hver av D<1>-Dn er (CR6R7)Z hvor R<6> og R<7> er som definert ovenfor, hver av y og z er null eller et helt tall fra 1 til 10, idet summen y+z er fra 2 til 10, hver av G<1->G<n>"<1> er -NR<3>C0-, -NR<3>CS-, -NR<3>S0- eller -NR<3>S02-, orientert i begge retninger, hvor R<3> er som definert nedenunder, hver av A1- Ari og B<1->Bn er valgt slik at: (a) A er en gruppe med formel (Ila) , (Hb) , (He) eller (Ild), og B er N eller R<3>N<+>, eller (b) A er en gruppe med formel (Ild) og B er CH, hvor: X er 0, S, Se, NR<3>, CH2 eller C(CH3)2, Y er en enkeltbinding, 0, S eller NR<4>, hver av p og q er null eller et helt tall fra 1 til 5, idet summen p+q ikke er mer enn 10, hver av r og s er null eller et helt tall fra 1 til 5, idet summen r+s ikke er mer enn 10, hver R<1> og R2 er uavhengig av hverandre valgt fra gruppen bestående av hydrogen, (Ci-C4)-alkyl som kan være hydroksy-, alkoksy- eller alkyltiosubstituert, hydroksy, alkoksy, alkyltio, amino og halogen, og hver R<3> og R4 er uavhengig av hverandre valgt fra gruppen bestående av hydrogen, (C3-C4)-alkyl, hydroksy-, alkoksy- eller alkyltiosubstituert {Ci-C4)-alkyl, hydroksy, alkoksy, alkyltio og amino, Q er -C02H, -CONR1 R", -S03H eller -S02NR'R", eller et aktivert derivat av -C02H eller -S03H, og I er -NR1 R", hvor R' og R" uavhengig av hverandre er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, alkyl, aminobeskyt-telsesgrupper, rapportøriigander, interkalatorer, chelatorer, peptider, proteiner, karbohydrater, lipider, steroider, nuk-leosider, nukleotider, nukleotiddifosfater, nukleotidtrifos-fater, oligonukleotider, inkludert både oligoribonukleotider og oligodeoksyribonukleotider, oligonukleosider og oppløselige og ikke-oppløselige polymerer.

11. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, karakterisert ved at nukleinsyreanalogen omfatter en forbindelse med den generelle formel III, IV eller V: hvor: hver L uavhengig av hverandre er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, fenyl, heterosykliske rester, naturlig forekommende nukleobaser og ikke-naturlig forekommende nukleobaser, hver R7 er uavhengig av hverandre valgt fra gruppen bestående av hydrogen og sidekjedene til naturlig forekommende alfa-aminosyrer, n er et helt tall som er større enn 1, hver k, 1 og m er uavhengig av hverandre null eller et helt tall fra 1 til 5, hver p er null eller 1, Rh er OH, NH2 eller -NHLysNH2, ogR<1> er H eller COCH3.

12. Fremgangsmåte for utførelse av en nukleinsyreamplifikasjon, karakterisert ved at et utvalgt område i en nukleinsyre i en nukleinsyreprøve beskyttes ved å hybridisere til nukleinsyren en nukleinsyreanalog som hybridiserer til den på en sekvensspesifikk måte, prøven eksponeres mot et nukleinsyreangripende reagens som bryter ned nukleinsyren i prøven, bortsett fra det utvalgte område, komplekset av nukleinsyre og dannet nukleinsyreanalog denatureres, og det utvalgte område amplifiseres.

13. Fremgangsmåte for opparbeidelse av reaksjonsproduktet av en nukleinsyreamplifikasjonsfremgangsmåte, karakterisert ved at et utvalgt område i nukleinsyreproduktet fra amplifikasjonen beskyttes ved å danne et kompleks mellom nukleinsyren og en nukleinsyreanalog som hybridiserer til den på en sekvensselektiv måte, og nukleinsyren eksponeres mot et nukleinsyreangripende reagens, hvor komplekset er mer stabilt mot angrep fra reagenset enn utgangsnukleinsyren.