JPH11511642A

JPH11511642A - Ｐｎａ／核酸複合体に結合し得る組換え抗体

Info

Publication number: JPH11511642A
Application number: JP8513602A
Authority: JP
Inventors: ヨルェンヒュルディ−ニールセン，イェンス; プルセク，カルル−ヨハン
Original assignee: ダコアクティーゼルスカブ
Priority date: 1995-06-22
Filing date: 1995-12-01
Publication date: 1999-10-12
Also published as: AU4327296A; EP0837884A2; WO1996012397A3; WO1996012397A2

Abstract

(57)【要約】ＰＮＡ（ペプチド核酸）と核酸との間に形成される複合体、特にＰＮＡ／ＤＮＡあるいはＰＮＡ／ＲＮＡ複合体と結合できる組換え抗体もしくはその断片を記述する。好適な抗体はＰＮＡ／ＤＮＡあるいはＰＮＡ／ＲＮＡ複合体と結合するが、１本鎖のＰＮＡ、２本鎖の核酸もしくは１本鎖の核酸とは結合しない組換え抗体である。ＰＮＡは、適当なリンカ−を介して基本骨格に結合した天然の核酸塩基の様なリガンドを複数有するポリアミド基本骨格を持つ新しく開発された天然には存在しない化合物である。ＰＮＡのあるものは相補的核酸に極めて強い親和性を有しており、安定した特異的複合体を形成することが知られている。この様なＰＮＡは核酸検出用プロ−ブに好適である。今回提供する抗体はＰＮＡをハイブリダイゼ−ションプロ−ブとして利用する上で極めて有用である。提供される抗体はそのＰＮＡ−核酸複合体との反応を介して、生物試料中に存在する核酸を捕捉し、認識し、検出し、同定し、あるいは定量化する上で有用である。

Description

【発明の詳細な説明】ＰＮＡ／核酸複合体に結合し得る組換え抗体本発明はＰＮＡ（ペプチド核酸）と核酸の間で形成される複合体に結合し得る組換え抗体もしくは該抗体の断片に関する。ＰＮＡは新規に開発されたポリアミド基本骨格を有する天然には存在しない化合物であり、適当なリンカ−によって該基本骨格に結合された天然核酸塩基の様なリガンドを複数有している。ＰＮＡのあるものは、相補的核酸との間に極めて強い親和性を有しており、非常に安定で特異的な複合体を形成することが示されている。したがって、この様なＰＮＡは核酸検出用のハイブリダイゼ−ションプロ−ブに適している。本発明によれば、この様なＰＮＡに対する抗体はハイブリダイゼ−ションプロ−ブとして非常に有用である。これらの抗体は、ＰＮＡ／核酸複合体に結合する能力を介し生物試料中にある核酸の捕捉、認識、検出、同定あるいは定量に有用である。発明の背景１つ以上の化学的あるいは生物的物質を捕捉し、認識し、検出し、同定し、及び／または定量することは、組換えＤＮＡ、ヒトおよび動物を対象とする医学、農学や食品化学等の分野で有用である。特に、これらの技術は細菌やウイルスといった病原因子の検出や特定、抗生物質耐性細菌のスクリ−ニング、遺伝子疾患の診断の補助ならびに癌化細胞の検出に利用できる。従来の核酸ハイブリダイゼ−ションアッセイ技術は、一般的に標識型の相補的核酸プロ−ブとのハイブリダイゼ−ション工程を含む。試料中の核酸の特異的塩基配列と標識プロ−ブとの間のハイブリダイゼ−ションは標識複合体の検出によって決められる。一般的に標識プロ−ブの調製には放射線標識された、あるいは修飾された核酸を酵素的に取り込ませる工程、もしくはプロ−ブに化学修飾を行い検出可能な化学基を結合あるいは形成させる化学修飾の工程が含まれている。標識プロ−ブの調製は時間とコストのかかる作業であることが多く、またその作業はプロ−ブの相補的配列に検出可能な状態でハイブリダイズできる能力を障害しないように進めなければならない。試料と核酸プロ−ブの間にハイブリダイゼ−ションが形成されてできる核酸複合体を直接検出する為に試薬、すなわちプロ−ブの化学標識を必要としない該試薬は検出を容易にする。２本鎖の核酸には結合するが、１本鎖の核酸には結合しない特異的ポリクロ− ナル抗体を作成することは、２本鎖の核酸に対して作成したポリクロ−ナル血清には１本鎖の核酸に交差反応する抗体が含まれることから困難と考えられる。また、ポリクロ−ナル血清は１本鎖の核酸に対する天然の抗体もしくは免疫に使用した免疫源が分解してできる１本鎖の核酸に対する抗体も含むだろう。モノクロ−ナル抗体技術を利用すると、所望の親和性と特異性を有する抗体を選別することができる。米国特許第４，６２３，６２７号ならびに第４，８３３，０８４号には、通常の核酸プロ−ブと標識核酸より形成された複合体に結合するモノクロ−ナル抗体が開示されている。別種のモノクロ−ナル抗体として、モノクロ−ナル抗体の特異性に同じ型の特異性を有する組換体抗体がある。ＷＯ９２／２０７０２号においては、ＰＮＡという用語は、非環状構造基本骨格と適当なリンカ−により該基本骨格に結合した複数の天然の核酸塩基の様なリガンドを有する化合物を記載するのに用いられている。ＰＮＡは、その基本骨格の構造はデオキシリボ−ス基本骨格に同形であり、グリシンがリンカ−を介して天然の核酸塩基に結合して重合したＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位を含む様なＰＮＡであり、該ＰＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸とハイブリダイズしＰＮＡ−核酸複合体を形成し得るものである（Ｅｇｈｏｌｍら．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ３６５，５６６−５６８（１９９３））。この様なＰＮＡは相補的核酸配列に強固に結合することが示されている。この様なＰＮＡと相補的核酸により形成される複合体の融解温度、Ｔｍ値は通常ＤＮＡプロ−ブあるいはＲＮＡプロ−ブと標的核酸との間に形成される同等の複合体のＴｍ値に比べて、１塩基あたり１−２℃高い。Ｔｍ値は核酸複合体の半数の鎖が解離または変性している温度として定義されている。本発明は、ＰＮＡと核酸より形成される複合体を認識し、結合し、検出できる新規組換え抗体を提供する。発明の概要本発明の観点の１つはＰＮＡと核酸より形成された複合体に結合し得る組換え抗体あるいは該抗体の断片である。ＰＮＡ／核酸複合体は、塩基対を形成する性質以外の点ではＤＮＡ／ＤＮＡあるいはＤＮＡ／ＲＮＡ複合体の様な核酸複合体とは実質的に異なった性質を有しており、好適なＰＮＡ／核酸複合体中のＰＮＡは重合したＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位を含み、その基本骨格が各リン酸基について１陰イオンを含むヌクレオチド配列であるため、該核酸複合体の相手鎖とは反対に、ＰＮＡ非対称構造を有し、且つ荷電を持たない。その結果上記２つの化合物の間には立体的、立体配座上の違いが生じるため、抗体がＰＮＡ／核酸複合体に結合特性を有しているかどうか予想することは完全に不可能である。本発明の別の観点はＰＮＡとＤＮＡより形成される、あるいはＰＮＡとＲＮＡより形成される複合体に結合できる組換え抗体ないしその断片である。好適な実施態様では、ＰＮＡと核酸より形成される複合体に結合できる該組換え抗体あるいはその断片は１本鎖ＰＮＡ、２本鎖核酸もしくは１本鎖核酸には結合しない。これらの実施態様の１つでは、組換え抗体あるいはその断片はＰＮＡとＤＮＡよりなる複合体には結合できるが、ＰＮＡ／ＲＮＡ複合体や２本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ複合体、１本鎖ＰＮＡもしくは１本鎖核酸には結合できない。本発明の好適な実施態様は重鎖と軽鎖のＦａｂ領域より成るＦａｂ断片である。本発明はまた重鎖と軽鎖のＦａｂ領域を含む断片をコ−ドする組換えＤＮＡを含むベクタ−も提供する。これらベクタ−の２つはＤＳＭに供託されている（ＤＳＭ１００５１とＤＳＭ１００５２）。本発明の組換え抗体の別の好適な断片は、重鎖と軽鎖の可変領域がスペ−サ− により連結された、好ましくはペプチドスペ−サ−基で連結された”単鎖Ｆｖ断片”（ｓｃＦＶ断片）である。より高度に認識されるエピトープの特異性がＰＮＡまたは核酸の特異的配列によってよりもＰＮＡ／核酸複合体の立体配座によって規定される、組換え抗体も本発明の一部である。本明細書内に記載された組換え抗体は宿主動物、たとえばマウスやラビットをＰＮＡ／核酸複合体で免疫し、抗体産生細胞よりＲＮＡを分離し、分離ＲＮＡ中のｍＲＮＡから１本鎖ｃＤＮＡを調製し、特異オリゴヌクレオチド混合物を利用して該ｃＤＮＡより抗体をコ−ドする断片を増幅し、そして該増幅断片を発現可能なファ−ジミドに挿入し、重感染後に抗体断片をその表面に提示させ、該ファ−ジを細菌に感染させてファ−ジライブラリーを作成し、細菌細胞のパニングと再感染を繰り返して所望の抗体断片をコ −ドしているファ−ジを選別し、該ファ−ジを抗体断片産生用細菌に感染させ、あるいは抗体断片をコ−ドするＤＮＡを他の原核生物発現系あるいは真核生物発現系内で発現させて得ることができる。免疫に好適な複合体はＰＮＡとＤＮＡより成る、あるいはＰＮＡとＲＮＡよりなる複合体であり、かつＰＮＡが重合したＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位を含むものである。本発明の組換え抗体はまた免疫していない動物に由来する大規模な組換え免疫グロブリンライブラリ−からも得ることができ、また必要であれば逆位もしくは無作為突然変異を利用して選択した抗体の結合部位の親和性を上げることもできる。１つ以上の化学的もしくは生物学的実体物を捕捉し、認識し、検出し、同定し、あるいは定量化するのに本抗体が有用である試験サンプル中の特定の核酸配列を検出する多様な方法も本発明の観点である。本組換え抗体はヒトならびに獣医領域に極めて有効である。本抗体はクラミジアあるいは淋病菌の様な感染菌のヒト体内の存在、あるいは量の検出、あるいはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプシュタインバ−ルウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）あるいはパピロ−マウイルス（ＨＰＶ）の感染の検出に極めて好適である。本抗体はまた染色体染色の様な細胞遺伝学の一般分野にも有用である。本発明は、検出可能な標識された形である本発明による組換え抗体、検出する核酸配列の全てもしくは一部に相補的であるＰＮＡ配列、ならびに視認化システムを含むキットも提供する。図面の簡単な説明図１はＯｒｕｍら．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ２１，Ｎｏ１９，４４９１−４４９８（１９９３）のＰＣＲを用いたＦａｂ遺伝子断片作成に使用したＰＣＲプライマ−の概要である。図２はＯｒｕｍら．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ２１，Ｎｏ１９，４４９１−４４９８（１９９３）の方法による”跳躍−ＰＣＲアッセンブリ−”法を用いた組み換えＦａｂライブラリ−の構築を示す。各図はそれぞれ最初の増幅ＰＣＲ（Ａ）、リンカーアッセンブリ−（Ｂ）、最終アッセンブリ−（Ｃ）を示している。図３は様々なＰＮＡとＤＮＡからなる複合体を試験抗体として用いたＦａｂ− ファ−ジの力価を示している。様々なウエル当たりのＦａｂ−ファ−ジ数（１．００Ｅ＋０Ｘは１．００×１００Ｘである）についてのＯＤ４８０値を示した。試験した複合体は実施例１に記した。特異的実施態様の説明本明細書で使用する”組換え抗体”という用語は、組換えＤＮＡ技術の使用を含む工程により作成される、免疫グロブリンもしくはＦａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、キメラもしくは改造抗体、あるいは軽鎖もしくは重鎖モノマ−の様な天然の免疫グロブリンの断片類似体（Ｇ．ＷｉｎｔｅｒとＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ３４９，２９３−２９９（１９９１））を含む抗体分子を意味する。 ”核酸”という用語は、ホスホジエステル結合により結合しあったデオキシリボヌクレオチドあるいはリボヌクレオシドのいずれかであるサブユニットより成るヌクレオチドポリマ−を包含する。具体的にはＤＮＡあるいは各種ＲＮＡであろう。”塩基”ならびに”核酸塩基”という用語は共に核酸ならびにＰＮＡのピリミジン塩基とプリン塩基について相互に交換可能に用いられる。ＰＮＡは”ＩｍｐｒｏｖｅｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＰＮＡＯｌｉｇｏｍｅｒｓ”Ｓｏｌｉｄ−ＰｈａｓｅＳｙｍｐｏｓｉｕｍ第３版，ＯｘｆｏｒｄＵＫ，Ａｕｇ．３１−Ｓｅｐ．４，１９９４、記載の方法により合成されるか、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｆｒａｍｉｎｇａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）より得た。動物の免疫に使用するＰＮＡ−核酸複合体としては、ＰＮＡとＤＮＡより成る複合体あるいはＰＮＡとＲＮＡより成る複合体が好適であろう。両核酸とＰＮＡはペプチド源を欠いているため、両核酸複合体とＰＮＡ／核酸複合体それ自体を注射しても正常宿主動物（すなわち核酸に対する自己抗体産生が惹起されていない動物）では本質的に非免疫原的であると考えられる。この様な場合、通常用いられる非免疫原性抗原に宿主動物に対して異物であるキャリア−物質を結合させる方法は、実際的でなく面倒であり、またこの操作により抗原内に構造変化が生じる危険性があるが、実際にはポリアニオン性の核酸複合体とポリカチオン性の蛋白誘導体、特にメチル化アルブミンもしくはグロプリンから成る非共有結合性のイオン化複合体で正常宿主動物を免疫することで、核酸複合体に対する免疫反応を誘導した（米国特許第４，６２３，６２７号、米国特許第４，８３３，０８４号）。また驚くべきことに正常宿主動物を、ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体と卵アルブミンの様な宿主動物に異物である非誘導化蛋白の混合体で免疫することで、ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体に結合し得る抗体を作り出すことができ、組換えＤＮＡ技術を利用してこの抗体活性をクロ−ニングできることが判明しつつある。この技術はＰＮＡ／ＲＮＡ複合体を利用した免疫化にも応用できる。組換え抗体には通常のモノクロ−ナル抗体にはない数々の利点がある。第一の利点は、ファ−ジ表現法（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．ら．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ３４８、５５２−５５４（１９９０））を利用すれば、組換え抗体もしくは抗体断片を１０⁶−１０⁷の様々な反応体から数週以内に選別できることである。モノクロ−ナル抗体の場合、同じ期間では、２−５×１０³反応体から選別できるに過ぎない。第二の利点は、選別された反応体が問題の断片をコ−ドしているＤＮＡに物理的に結合しており、その後の実験に極めて広い柔軟性を有している点である。選別された反応体に変異を誘導したり、わずかに特性が異なる新しい特異反応体を選別することは比較的容易であり、この方法で抗体断片を認識し、標識し、結合し、あるいは精製するための様々なクロニ−ニング用の手がかりを得ることができる可能性がある。第三の利点は、様々な抗体断片、例えば重鎖と軽鎖の２つの可変領域を有するＦａｂ−断片あるいは軽鎖断片（ｓｃＦｖ−断片）を選別できる点である。選別された抗体断片は直接発現することもできるし、あるいは特別な目的に合わせて様々な複数の組み合わせもしくは抗体分子の異なる部分と組み合わせて修飾し発現することもできる。ＰＮＡ−ＤＮＡ複合体は、好適な緩衝液中に２本鎖もしくは１本鎖ＤＮＡと該ＤＮＡ配列の全てもしくは一部に相補的である塩基配列を有するＰＮＡ分子を混合し、さらに該混合物を加熱して１本鎖分子を形成してからこの混合物をゆっくりと室温まで冷却することにより調製できる。ＰＮＡ−ＲＮＡ複合体はＲＮＡを該ＲＮＡ配列の前部もしくは一部と相補的である塩基配列を有するＰＮＡ分子と混合し、該混合物を加熱してからゆっくりと室温まで冷却することで調製できる。ＰＮＡ−核酸複合体の一方成分の好適量をアジュバントとキャリア−と混合する。好適なキャリア−の例としてはＫＬＨ（キ−ホ−ルリムペットヘモシアニン）、オボアルブミンやデキストランである。本明細書記載の組換え抗体はＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．ら．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ３４８、５５２−５５４（１９９０）記載の抗体−ファ−ジ法ならびにＯｒｕｍら．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ２１，Ｎｏ１９，４４９１０４４９８（１９９３）の改良抗体ファ−ジ法を利用して構築することができる。簡単に説明すると、抗体−ファ−ジ法は以下の工程より成る：動物をＰＮＡ／ＤＮＡあるいはＰＮＡ／ＲＮＡ複合体の様なＰＮＡ／核酸複合体で免疫し、抗体産生細胞を分離し、逆転写反応によりｃＤＮＡを調製する。該ＤＮＡより重鎖と軽鎖のＦａｂ遺伝子断片を特異的に増幅し、このＤＮＡをｆｄ−ファ−ジの表面に抗体断片を発現、提示できるファ−ジミドに挿入するが、ファ−ジミドは完全な状態と感染性を保っている。細菌に感染させた後に所望の抗体断片を有する排出ファ−ジを選択的方法（パンニング）にて分離し、抗体断片の産生に使用する。抗体断片をコ−ドするＤＮＡはまた、完全抗体もしくは抗体の一部を発現させる目的で別種の原核生物発現系あるいは真核生物発現系に移入することができる。真核生物細胞株で発現させる利点の一つは、原核生物発現系で発現された抗体に比べてより効率的に完全抗体を産生できる可能性があることであり、同時に産生された抗体分子に二次修飾できることである。本発明では、組換え抗体あるいはその断片をコ−ドする組換えＤＮＡは、ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体で免疫したマウスの脾臓よりＲＮＡを分離し、標準的なｃＤＮＡ構成条件下にオリゴ（ｄＴ）でプライミングしたｍＲＮＡと４種類のデオキシリボヌクレオシド３リン酸と逆転写酵素を用いて第一鎖ｃＤＮＡを合成し、ついで重鎖および軽鎖Ｆａｂ遺伝子断片に相補的なオリゴヌクレオチドプライマ−を用いたポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により重鎖ならびに軽鎖Ｆａｂ遺伝子断片を増幅して調製した。ＰＣＲ技術は、加えた増幅希望ＤＮＡ領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマ−より伸長反応を繰り返し行う方法である。Ｔｈｅｒｍｕｓｂｒｏｃｋｉａｎｕｓより分離、精製された温度安定ＤＮＡポリメラ−ゼを用いて増幅を行う。本酵素は５’→３’エクソヌクレア−ゼ活性を有しており、一般に使用されているＴａｑＤＮＡポリメラ−ゼに比べてエラ−頻度は半分である。ＰＣＲ増幅産物はゲル電気泳動で精製した。ＰＣＲを用いたＦａｂ断片作成に使用したオリゴヌクレオチドプライマ−はＯｒｕｍら．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ２１、Ｎｏ１９，４４９１−４４９８（１９９３）に記載されている。オリゴヌクレオチドプライマ−の様々な混合体を使用する（図．１）。ＭＶＨ１−２５と記したプライマ−混合体は、混合体ＭＣＨ１−Ｇ１，Ｇ２Ａ，Ｇ２Ｂと組み合わせると重鎖の可変領域のＮ末端から最初の不変領域のＣ末端までの範囲を増幅することができる（ＶＨおよびＣＨ１領域）。ＭＶＫ１−２５は１種類のプライマ−ＭＣＫ１と組み合わせて、全軽鎖（ＶＫおよびＣＫ領域）を増幅することができる。図１中の枠はＦａｂ発現カセットの構造に含まれる様々な遺伝子 −断片を示す：Ｎ−末端アミノ酸から軽鎖Ｃ−末端とジスルフィド架橋を形成するヒンジ領域のシステイン残基までの重鎖を含むＦｄ鎖；軽鎖（カッパ）の全可変領域と不変領域に相当する軽鎖。増幅した重鎖と軽鎖が集合するのに用いられるＤＮＡ断片であるリンカ−、またＦｄ翻訳時の翻訳停止コドンを含むＤＮＡ、軽鎖発現時のリボソ−ム結合部位、ｐｅｌＢリ−ダ−配列のＮ−末端部分に相当するコーディング領域である。ｐｅｌＢリ−ダ−配列は発現したＦａｂ断片が細菌の周辺細胞質に移動するためのシグナルペプチドをコ−ドしている。囲み下に記したプライマ−は前方向プライマ−でありｍＲＮＡに相補的である。囲み上に記したプライマ−は逆方向プライマ−であり第一ｃＤＮＡに相補的である。ＰＣＲによる増幅の原理、ならびに重鎖と軽鎖断片の集合（ａｓｓｅｍｂｌｙ）については図２に示した。まずＦｄと軽鎖遺伝子断片が増幅される（第一増幅、図２Ａ）。次に、上記２断片の反対側端に相補的なプライマ−が存在するＰＣＲ条件下に該断片を加えＰＣＲを行い、該断片それぞれにＬＩＮＫ断片を結合させた（ＬＩＮＫＥＲ集合、図２Ｂ）。同様の方法で、リンカ−で集合したＦｄと軽鎖断片を用いて最終集合を行った（図２Ｃ）。Ｆａｂ断片（Ｆｄ）の重鎖と軽鎖に相当する遺伝子断片は、図２Ｃに示すようなＤＮＡリンカ−を介した最終集合により無作為に対合する。増幅し集合したＤＮＡをＮｏｔ１とＳｆｉ１で消化し、それからＮｏｔ１とＳｆｉ１−切断ファ−ジミドｐＦＡＢ５ｃ．Ｈｉｓに連結した。ファ−ジミドｐＦＡＢ５ｃ．Ｈｉｓはｒｕｍら．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ２１、Ｎｏ１９，４４９１−４４９８（１９９３）に記載されているｐＦＡＢ５ｃに６ヒスチジンよりなる尾部を加え以後の組換え抗体精製が簡便にできるよう改良されたものである。ファ−ジミドｐＦＡＢ５ｃ．ＨｉｓはＪａｎＥｎｂｅｒｇ，ＴｈｅＲｏｙａｌＤａｎｉｓｈＳｃｈｏｏｌｏｆＰｈａｒｍａｃｙ、コペンハ−ゲン、デンマ−クより得た。連結と精製後、Ｂｉｏ−ＲａｄＥ．Ｃｏｌｉｐｕｌｓｅｒを用いてＤＮＡを電気的に適当な大腸菌株に移入した。パルスを加えた直後、新たに作成したＳＯＣ培地（２％ＢａｃｔｏＴｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％ＢａｃｔｏＹｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｍＭＮａＣｌ、２．５ｍＭＫＣｌ、１％グルコースと１０ｍＭＭｇＣｌ₂）を加え、細胞を１時間３７℃で攪拌し、選択的プレート上に塗布した。形質転換された細胞をヘルパーファージで重感染させ、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を加えて蛋白質合成を誘導した。細胞を沈殿させ、多様なＦａｂ断片をｇIII 蛋白への融合蛋白として提示しているファ−ジ粒子を上清に残した。抗原結合クロ−ンの選別に用いたパニングの手順は以下のとおりである：ストレプトアビジンをコ−ティングしたマイクロタイタ−プレ−トをビオチン化したＰＮＡ／ＤＮＡ複合体と反応させ、そして個別に誘導したクロ−ンの上清あるいは周辺細胞質を様々なＰＮＡ／ＤＮＡ複合体や１本鎖ＰＮＡやＤＮＡ、そしてＲＮＡやＤＮＡ／ＲＮＡ複合体に対する結合性を試験する前に、抗原選別（パニング）を３ないし４回繰り返して１０¹⁰−１０¹¹ファ−ジからなるファ−ジライブラリ−を構築する。本明細書記載のＦａｂ断片をコ−ドするＤＮＡはベクタ−ｐＦＡＢ５ｃ．Ｈｉｓの形で”ドイツ微生物ならびに細胞株コレクション”（ＤＳＭ１００５１とＤＳＭ１００５２）に供託した。上記記載Ｆａｂ断片はＮ−末端アミノ酸から、軽鎖のＣ−末端のシステインとの間にジスルフィド架橋を形成するのヒンジ部分にのシステインまでの重鎖と、軽鎖の全可変領域と全不変領域を含んでいるが、本明細書記載の別の好適な抗体断片でスペ−サ−基により結合された重鎖と軽鎖の可変領域だけを含む、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）と呼ばれる抗体である。スペーサー基は好ましくはペプチドスペーサーである。また、種々の複数のＦａｂ断片またはｓｃＦｖ（分離体、ｄｉａｂｏｄｙ）の構築体は本発明により期待される。本書記載の組換え抗体はまた免疫していない動物から得た大規模な組換え免疫グロブリンライブラリ−からも、例えばＭａｒｋｓら．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ１０，７７９−７８３（１９９２）、Ｇｒｉｆｆｉｔｈら．，ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ１２，Ｎｏ２，７２５−７３４（１９９３）、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ２１，Ｎｏ９，２２６５−２２６５（１９９３）およびＧｒａｍら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、Ｖｏｌ８９，３５７６−３５８０（１９９２）記載の方法を利用して得ることができる。必要であれば、Ｍａｒｋｓら．（１９９２）の上記発表内記載の鎖シャフリング法もしくはＧｒａｍら．（１９９２）およびＧｒｉｆｆｉｔｈｓら．（１９９３）の上記発表内記載のランダム突然変異法を利用して、選別された組換え抗体の特異性及び／または親和性を上げることができる。本組換え抗体はＰＮＡ−核酸複合体に対し高い特異性を有している。これらの抗体は２本鎖の核酸、１本鎖のＰＮＡあるいは１本鎖の核酸に対しては有意に結合することはない。本抗体により認識されるエピト−プの特異性は、ＰＮＡ／核酸複合体の特異的塩基配列よりむしろＰＮＡ−核酸複合体の立体配座により強く規定されると考えられる。本抗体が高い特異性と親和性を有することは、生物試料中で検出されるべきＰＮＡと核酸により形成される複合体の分離、検出、ならびに定量測定に極めて有利である。即ち、ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体に対する高い特異性を持った抗体は、クラミジアや淋菌の様なヒト体内の感染体ＤＮＡを特定するためのＰＮＡを基本としたアッセイに特に有用である。これらの抗体はまた染色体染色の様な細胞遺伝学の一般分野についても極めて有用である。ＰＮＡ／ＲＮＡ複合体に対して高い特異性と親和性を有する本発明の抗体は、ＰＮＡを基本としたｍＲＮＡあるいはｒＲＮＡ配列の特定の様なアッセイに特に有用である。利用の目的に応じて、本抗体に例えば補酵素や酵素阻害剤や酵素そのものといった酵素的活性基、蛍光標識体、発光標識体、の様な検出可能な標識体やビオチンあるいはハプテンといった特異的に結合するリガンドを結合することができる。本明細書記載の抗体はまた検出可能な様々な蛋白質、たとえば西洋ワサビペルオキシダ−ゼやグルコ−スオキシダ−ゼまたはアルカリホスファタ−ゼの様な蛋白質との融合蛋白としてクロ−ン化することもできる。また、例えば別の抗体により認識され、あるいは本抗体を他の分子に直接結合させるのに利用できる様な様々なペプチドタグをコ−ドするＤＮＡ断片を、抗体活性をコ−ドしているＤＮＡに直接クロ−ン化することもできる。本発明の抗体は試料中にある検出すべき特定の核酸配列と該特定核酸配列と複合体を形成できるＰＮＡより成るＰＮＡ／核酸複合体を検出するための様々な方法に利用できる。本書記載の抗体を利用して、試料中の特定の核酸配列を検出する方法は以下の工程より成る：（ａ）試料中にある検出対象の特定の核酸配列と、この検出対象核酸配列の塩基配列と複合体を形成できる程度十分に相補的であり、かつ形成された複合体は本書記載の抗体に対するエピト−プを少なくとも１つ有している、塩基配列を有するＰＮＡから複合体を形成する工程、（ｂ）ＰＮＡ配列と検出対象核酸配列から形成される複合体を本書記載の抗体に接触させる工程、ならびに（ｃ）抗体−ＰＮＡ−核酸複合体の存在を決定する工程。ＰＮＡ配列は検出対象の核酸配列を含む試料に接触する前に固相に好適に固定できるか、抗体をＰＮＡ−核酸複合体に接触する前に固相に固定化できる。検出対象の核酸配列が生物試料中に固相化されて存在している場合には、次の工程よりなる方法が利用できる（ａ）試料中にある検出対象の特定の核酸配列と、この検出対象核酸配列の塩基配列と複合体を形成できる程度十分に相補的であり、かつ形成された複合体は本書記載の抗体に対するエピト−プを少なくとも１つ有している、塩基配列を有するＰＮＡから複合体を形成する工程、（ｂ）ＰＮＡ配列と検出対象核酸配列から形成される複合体を本書記載の抗体に接触させる工程、ならびに（ｃ）抗体−ＰＮＡ−核酸複合体の存在を決定する工程。最初の工程で検出対象核酸配列を固定化する方法では、以下の工程から成る方法が好適である、（ａ）検出対象の核酸配列を固相に固定化する工程、（ｂ）試料中にある検出対象の特定の核酸配列と、この検出対象核酸配列の塩基配列と複合体を形成できる程度十分に相捕的であり、かつ形成された複合体は本書記載の抗体に対するエピト−プを少なくとも１つ有している、塩基配列を有するＰＮＡから複合体を形成する工程、（ｃ）ＰＮＡ配列と検出対象核酸配列から形成される複合体を本書記載の抗体に接触させる工程、ならびに（ｄ）抗体−ＰＮＡ−核酸複合体の存在を決定する工程。本発明の抗体の実施例を以下に記載する。記載の方法もしくは本発明の抗体を用いる他の方法を実施するためのキットには、標識されたあるいは標識されていない本発明の抗体の他に、検出対象の核酸配列の全部もしくは一部に相補的であるＰＮＡ配列と可視化システムを含む。可視化システムは酵素標識（例えば酵素標識抗体あるいは酵素標識ストレプトアビジン）と好適な基質を含むことができる。上記標識体は、本発明の抗体が標識されていない場合にはマウス免疫グロブリンエピト−プに対して反応性を有するものであり、本発明の抗体がハプテン基で標識されている場合にはビオチンや蛍光色素あるいはペプチドの様なハプテン基に対して反応性を有するものである。上記キットの基質システムは、ＰＮＡ／核酸複合体をＥＬＩＳＡ形式で測定する場合には可溶性発色反応物を形成するものから選択され、ＰＮＡ／核酸複合体を生体試料内もしくは膜上で測定する場合には不溶性発色反応産物を形成するものから選択される。応用例１：液中ハイブリダイゼ−ションと検出所望の核酸配列を含む試料に、該核酸配列の塩基配列に複合体を形成できる程度十分に相補的であり、該複合体が本書記載のＰＮＡ−核酸複合体は認識するが遊離体のＰＮＡあるいは核酸は認識しない抗体により追跡できるような塩基配列を有するＰＮＡと接触させることで、該所望の核酸配列を液中に測定することができる。これらの反応により、例えば比濁アッセイ法の様な方法で検出可能程度に大きな複合体を生じる。応用例２：液中ハイブリダイゼ−ションと固定化後検出所望の核酸配列は、該核酸配列と複合体を形成できるのに十分な程度に相補的な塩基配列を有するＰＮＡと接触させることで決定することができる。形成された複合体は、液中にある間に本書記載の標識抗体と接触させる。次に、形成されたＰＮＡ−核酸−抗体複合体を本書記載の抗体、例えば酵素に固定化された抗体を用いて捕捉する。未結合物質を洗い流してから、抗体の標識を検出することで結合したＰＮＡ−核酸−抗体複合体量を測定する。あるいは、所望の核酸配列と複合体を形成できる程度に十分に該配列に相補的な塩基配列を有するＰＮＡに、標識体、例えばビオチン、蛍光標識体、あるいはその他のＰＮＡ−核酸複合体を捕捉するのに好適なその他の標識体を持たせることができる。未結合の物質を洗い流してから、抗体の標識体を検出するか第二抗体を用いた検出系を利用して結合ＰＮＡ−核酸−抗体複合体量を測定する。応用例３：捕捉アッセイ典型的な捕捉アッセイは；認識、捕捉、ならびに検出の工程より成るが、他の工程から成る方法も可能である。例えば以下の様なアッセイ法である。ＰＮＡ−核酸複合体と結合できる抗体を固相、例えばＥＬＩＳＡプレ−トに固定化する。ＰＮＡと試料を混合しＥＬＩＳＡプレ−トのウエル内で液中で反応させる。ＰＮＡと試料の核酸の間で複合体が形成されると、これらの複合体は固定化された抗体により捕捉される。非結合物質を洗い流してから、結合したＰＮＡ −核酸−抗体複合体量を測定する。ＰＮＡ−核酸複合体以外の認識可能な基を利用しても捕捉することができる。この様な基としては、ビオチン化ＰＮＡあるいは他のハプテン、ペプチドもしくはポリペプチドで標識されたＰＮＡがある。上記記載の２つ以上の工程を同時に実施するアッセイ方法もある。応用例４：固相に固定化したＰＮＡ／核酸複合体の検出ＰＮＡあるいは核酸のいずれかが最初に固相に固定化されたＰＮＡと核酸より成る複合体は本書記載の抗体を利用して検出することができる。この検出は酵素を標識した抗体や、蛍光マ−カ−に標識された抗体、あるいはその他のシグナルを出すシステムに標識された抗体を用いて直接実施することもできるし、あるいは標的に結合した抗体を検出するために通常使用される二次的な可視化システムを利用して間接的に実施することもできる。想定される固相は極めて広い範囲に及ぶと考えられ、例えばナイロン膜もしくはニトロセルロ−ス膜（サザンブロットあるいはノーザンブロット法）、組織切片、細胞塗抹標本、細胞遠心法、染色体展開法（インサイトウハイブイリダイゼ−ション）あるいはプラスチック表面（ＥＬＩＳＡ法）などでがある。従来の方法では洗浄操作は通常きわめて徹底的行わなければならないが、本方法では抗体が核酸と複合体を形成するＰＮＡだけを認識することから、１本鎖ＰＮＡによる非特異的結合は信号を発しないという利点がある。応用例５；バイオセンサ−システム生物試料中の核酸の検出と定量はＰｈａｒｍａｃｉａ社のＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサ−システムの様なバイオセンサ−システムを用いて実施できる。センサ −チップ上に固定化されたリガンドに相互作用した生体分子をエバネセント光を用いて表面で測定する。このシステムは親水性デキストランマトリックス中にリガンドが固定化されたセンサ−チップ、分析物と試薬をセンサ−表面まで運ぶための小型液体カ−トリッジ、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）検出器、自動サンプリング装置、ならびにシステム制御および測定用ソフトウエア−を含む。特異的リガンドはアミン、チオ−ルもしくはアルデヒドを介してセンサ−チップに化学的に、あるいはビオチン−アビジン反応のような生物特異的方法により強固に固定化されている。本書記載の抗体は、利用するバイオセンサ−システムのセンサ−チップ、例えばＢＩＡｃｏｒｅシステムのセンサ−チップのデキストラン層に結合することができる。試料をＰＮＡと混合、反応させて、試料中の核酸と該核酸配列と複合体を形成できるに十分な程度に相補的な塩基配列を有するＰＮＡとの間に複合体を形成させる。このサンプルをバイオセンサ−システムのフロ−システムを通過させ、ＰＮＡ−核酸複合体が形成されていればセンサ−チップに結合した抗体が該複合体を特異的に結合する。バイオセンサ−システムによるＳＰＲ検出により、上記結合より表面に結合した物質量に対応したシグナルが発生する。応用例６；細胞中の結合ＰＮＡの検出好適な条件下ではＰＮＡは生細胞あるいは固定細胞、例えば細胞株、血液幹細胞、ならびに動物／ヒト組織（治療用途に重要）の細胞壁を通過することができる。個々の細胞の中の異なる標的とハイブリダイズしたＰＮＡを検出できることは重要なことである。この様な場合、ＰＮＡをハプテンもしくはその他のレポ− タ−分子で標識することは、これらの標識体がＰＮＡが細胞内に入ることを阻害もしくは干渉するため有益なことではないだろう。免疫組織学的方法（凍結あるいは固定された組織生検中）もしくはフロ−サイトメトリ−（例えば表面活性剤、アセトンもしくはアルコ−ルで処理した細胞）で標的とハイブリダイズしたＰＮＡを検出することは重要である。また、細胞培養に加えたＰＮＡあるいは生きた動物に投与したＰＮＡの結合及び／または組織分布を検出できることも有益である。この様な検出は本書記載の抗体を用いて実施できる。以下の実施例を用いて本発明の特異的態様を示す。これらの実施例はいかなる形でも本発明を限定しない。実施例実施例１ＰＮＡ／核酸複合体と単鎖メチレンカルボニルリンカ−で核酸塩基を結合された重合Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位を含むＰＮＡを、３ｒｄＳｏｌｉｄ−ＰｈａｓｅＳｙｍｐｏｓｉｕｍ，ＯｘｆｏｒｄＵＫ，Ａｕｇ，３１−Ｓｅｐｔ．４，１９９４，に記載の”ＩｍｐｒｏｖｅｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＰＮＡＯｌｉｇｏｍｅｒｓ”ならびにＭ．Ｅｇｈｏｌｍら．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４，１８９５−１８９７（１９９２）ならびにＭ．Ｅｇｈｏｌｍら．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．８００−８０１（１９９３）記載の方法にしたがって合成し精製したか、あるいは同様のＰＮＡをＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓより得た。使用したＰＮＡの塩基配列はＰＮＡ内で自己ハイブリダイゼ−ションしない様に非自己相補的なものが好ましい。プリンとピリミジンの数はほぼ同数であり、これにより３重螺旋構造ではなく２重螺旋構造を形成するようにした。ＤＮＡ配列は標準的な３８１Ａサイクル／操作法に従いＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の３８１ＡＤＮＡ合成装置を用いて合成した。使用したモノマ−は通常のＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社合成装置用β−シアノエチルホスフォアミドである。ＲＮＡ配列は”ＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｐｓ，ＳｃｉｅｎｃｅＰａｒｋＡａｒｈｕｓ，ＧｕｓｔａｖＷｉｅｄｓＶｅｊ１０，ＤＫ−８０００Ａａｒｈｕｓ”より得た。ＰＮＡとＤＮＡ配列は標識されているか、あるいは未標識であり、１つかそれ以上のリンカ−ユニットを含む場合もあり、好ましくは２つのリンカ−ユニットは末端同士が結合している１つか２つのリンカ−単位を含む。リンカ−は標識されたＰＮＡあるいはＤＮＡオリゴマ−に関わらず、あるいは加えられるリンカ− ユニットの数に関係なくいずれの場合も”−ｌｉｎｋ−”と記される。ＰＮＡオリゴマ−は次の様にしてビオチンで標識できる：２−（アミノエトキシ）エトキシ酢酸（ＡＥＥＡ）を１もしくは２単位含むリンカ−を樹脂上（上記参照）のＰＮＡオリゴマ−に結合してからビオチンを次のようにして結合する。２種類の溶液を使用する。第１液には０．２ＭのＮ−エチルジシクロヘキシルアミンを含むＤＭＦの５％−コリジン液として０．１Ｍビオチンを含んでおり、第２液はＤＭＦに０．１８ＭＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１− イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフロロリン酸）を含んでいる。この２種類の液を２：１の割合で混合し、この混合液をおよそ１分間放置してから１もしくは２ユニットのＡＥＥＡの付いたＰＮＡオリゴマ−を結合した樹脂と混ぜた。ＤＮＡをビオチン標識するには次の方法が利用できる。ＤＮＡオリゴマ−の５ ’末端を標識するには、リンカ−（Ｓｐａｃｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ、ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をオリゴマ−の５’−ＯＨに接続し、それからビオチン標識化試薬（ビオチンＣＥフォスフォラミド、２２−０００２−３５、ＣｒｕａｃｈｅｍＬｉｍｉｔｅｄ）と反応させた。オリゴマ−の３’末端を標識するために、ビオチン−ＣＰＧ支持体（３’−ビオチン−ＯＮＣＰＧカタログ番号ＲＰ−５２２５−２Ｋ，Ｊ．ＲｏｓｓＰｅｔｅｒｓｅｎ，ＡｇｅｒｎＡｌｌｅ３，ＤＫ−２９７０Ｈｏｒｓｈｏｌｍ）からＤＮＡ合成を開始させた。第１試薬はリンカー（Ｓｐａｃｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ、ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）であり、モノマ−試薬を加えてオリゴマ−を合成した。全てのＰＮＡ配列は”Ｈ−”（ＤＮＡの５’−末端に相当）と記したアミノ末端側より”ＣＯＮＨ₂”（ＤＮＡの３’−末端に相当）と記したＣ−末端に向けて記載した。全てのＤＮＡ配列は５’−末端から３’−末端に向けて記した。以下の試験複合体／化合物を使用した；Ｈ１２．４５ｍｅｒのＤＮＡ配列（Ｕ１）と３単位の１５ｍｅｒのＰＮＡ配列（Ｕ２）から成る未標識のＰＮＡ／ＤＮＡ複合体（免疫源）。４５ｍｅｒＤＮＡ（Ｕ１）の塩基配列は次の通りである：５’−ＧＣＡＡＡＴＧＣＴＣＴＡＧＧＣＧＣＡＡＡＴＧＣＴＣＴＡＧＧＣＧＣＡＡＡＴＧＣＴＣＴＡＧＧＣ−３’ １５ｍｅｒのＰＮＡ（Ｕ２）の塩基配列は次の通りである：Ｈ−ＧＣＣＴＡＧＡＧＣＡＴＴＴＧＣ−ＣＯＮＨ₂ Ｌ２．ＤＮＡの３’−末端にビオチンの結合した４５ｍｅｒのＤＮＡ配列（Ｌ２）．４５ｍｅｒのＤＮＡ（Ｌ２）の塩基配列は次の通りである：５’−ＧＣＡＡＡＴＧＣＴＣＴＡＧＧＣＧＣＡＡＡＴＧＣＴＣＴＡＧＧＣＧＣＡＡＡＴＧＣＴＣＴＡＧＧＣ−ｌｉｎｋ−Ｂｉｏ−３’。Ｈ２．４５ｍｅｒのＤＮＡ配列（Ｌ２）と３単位の１５ｍｅｒのＰＮＡ配列（Ｕ２）から成るＰＮＡ／ＤＮＡ複合体で、４５ｍｅｒのＤＮＡの３’−末端にビオチンが結合している。ＤＮＡにビオチンが結合している以外は、この複合体は免疫源として用いた複合体に同じである。４５ｍｅｒのＤＮＡ（Ｌ２）の塩基配列は以下の通りである：５’−ＧＣＡＡＡＴＧＣＴＣＴＡＧＧＣＧＣＡＡＡＴＧＣＴＣＴＡＧＧＣＧＣＡＡＡＴＧＣＴＣＴＡＧＧＣ−ｌｉｎｋ− Ｂｉｏ−３’ １５ｍｅｒのＰＮＡ（Ｕ２）の塩基配列は次の通りである：Ｈ−ＧＣＣＴＡＧＡＧＣＡＴＴＴＧＣ−ＣＯＮＨ₂ Ｈ３．１５ｍｅｒのＤＮＡ配列（Ｌ３）と１５ｍｅｒのＰＮＡ配列（Ｕ２）から成るＰＮＡ／ＤＮＡ複合体で、１５ｍｅｒのＤＮＡの５’−末端にビオチンが結合している。１５ｍｅｒのＤＮＡ（Ｌ３）の塩基配列は以下の通りである：５’−Ｂｉｏ−ｌｉｎｋ−ＧＣＡＡＡＴＧＣＴＣＴＡＧＧＣ− ３’ １５ｍｅｒのＰＮＡ（Ｕ２）の塩基配列は次の通りである：Ｈ−ＧＣＣＴＡＧＡＧＣＡＴＴＴＧＣ−ＣＯＮＨ₂ Ｈ２０．３’末端がビオチンで標識された４５ｍｅｒのＤＮＡ配列（Ｌ２）と３単位の１５ｍｅｒのＤＮＡ配列（Ｕ４）から成る免疫源であるＤＮＡ／ＤＮＡ複合体。この複合体を形成する２種類の鎖の配列は上記の通りである（Ｈ２とＨ４の記載参照）。Ｈ７．２０ｍｅｒのＰＮＡ配列と免疫源に用いた複合体の配列と異なる塩基配列を有する２０ｍｅｒのＤＮＡ配列から成るＰＮＡ／ＤＮＡ複合体で、該ＰＮＡ配列のアミノ末端がビオチンで標識されたもの。２０ｍｅｒのＰＮＡ（Ｌ５）の塩基配列は次の通りである。Ｂｉｏ−ｌｉｎｋ−ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＡＴＡＴＴＧＧＣＡＡＣ−ＣＯＮＨ₂ ２０ｍｅｒのＤＮＡ（Ｕ６）の塩基配列は次の通りである：５’−ＧＴＴＧＣＣＡＡＴＡＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧ−３’ Ｈ８．１７ｍｅｒのＰＮＡ配列と前記の複合体と異なる塩基配列を有するが、以下記載する複合体Ｈ９に関連している１７ｍｅｒのＤＮＡ配列から成るＰＮＡ／ＤＮＡ複合体。本複合体のＤＮＡは５’末端がビオチンで標識されている。１７ｍｅｒのＤＮＡ（Ｌ６）の塩基配列は次の通りである。Ｂｉｏ−ｌｉｎｋ−ＡＴＴＧＴＴＴＣＧＧＣＡＡＴＴＧＴ− ３’ １７ｍｅｒのＰＮＡ（Ｕ７）の塩基配列は以下の通りである：Ｈ−ｌｉｎｋ−ＡＣＡＡＴＴＧＣＣＧＡＡＡＣＡＡＴ−ＣＯＮＨ₂ Ｈ９．１７ｍｅｒのＰＮＡ配列と前記の複合体と異なる塩基配列を有するが、上記の複合体Ｈ８に関連している１７ｍｅｒのＤＮＡ配列から成るＰＮＡ／ＤＮＡ複合体。本複合体のＰＮＡ鎖はアミノ末端がビオチンで標識されている。１７ｍｅｒのＤＮＡ（Ｕ８）の塩基配列は次の通りである。５’−ＡＴＴＧＴＴＴＣＧＧＣＡＡＴＴＧＴ−３’ １７ｍｅｒのＰＮＡ（Ｌ７）の塩基配列は以下の通りである：Ｂｉｏ−ｌｉｎｋ−ＡＣＡＡＴＴＧＣＣＧＡＡＡＣＡＡＴ− ＣＯＮＨ₂ Ｌ８．アミノ末端がビオチン標識された１９ｍｅｒのＰＮＡ配列。１９ｍｅｒのＰＮＡ（Ｌ８）の塩基配列は以下の通りである：Ｂｉｏ−ｌｉｎｋ−ＴＴＣＡＡＣＴＣＴＧＴＧＡＧＴＴＧＡＡ−ＣＯＮＨ₂ Ｈ１０．１９ｍｅｒのＰＮＡ配列（Ｌ８）と、該ＰＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列である１９ｍｅｒのＲＮＡ配列（Ｕ９）より成るＰＮＡ／ＲＮＡ複合体。該複合体のＰＮＡ鎖のアミノ末端はビオチンで標識されている。１９ｍｅｒのＰＮＡ（Ｌ８）の塩基配列は以下の通りである：Ｂｉｏ−ｌｉｎｋ−ＴＴＣＡＡＣＴＣＴＧＴＧＡＧＴＴＧＡＡ−ＣＯＮＨ₂ １９ｍｅｒのＲＮＡ（Ｕ９）の塩基配列は以下の通りである：５’−ＵＵＡＡＡＣＵＣＡＣＡＧＡＧＵＵＧＡＡ−３’ Ｈ２２．１９ｍｅｒのＰＮＡ配列（Ｌ８）と、該ＰＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列である１９ｍｅｒのＤＮＡ配列（Ｕ２６）より成るＰＮＡ／ＤＮＡ複合体。該複合体のＰＮＡ鎖のアミノ末端はビオチンで標識されている。１９ｍｅｒのＰＮＡ（Ｌ８）の塩基配列は以下の通りである：Ｂｉｏ−ｌｉｎｋ−ＴＴＣＡＡＣＴＣＴＧＴＧＡＧＴＴＧＡＡ−ＣＯＮＨ₂ １９ｍｅｒのＤＮＡ（Ｕ２６）の塩基配列は以下の取りである：５’−ＴＴＣＡＡＣＴＣＡＣＡＧＡＧＴＴＧＡＡ−３’ Ｈ２９．１５ｍｅｒのＰＮＡ配列（Ｕ２７）と３０ｍｅｒのＤＮＡ配列（Ｌ１１）より成るＰＮＡ／ＤＮＡ複合体。該３０ｍｅｒのＤＮＡ配列の３’末端はビオチンで標識されている。ＰＮＡ配列はＤＮＡの中央部分に相補的であり、その結果該ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体の５’−と３’−を１本鎖ＤＮＡが覆い被さっている。３０ｍｅｒのＤＮＡ（Ｌ１１）の塩基配列は以下の通りである：５’−ＧＣＴＧＡＣＧＴＴＣＣＧＣＡＣＡＴＧＴＣＡＡＣＣＡＴＡＴＧＴ−ｌｉｎｋ−Ｂｉｏ−３’ １５ｍｅｒのＰＮＡ（Ｕ２７）の塩基配列は以下の取りである：Ｈ−ｌｉｎｋ−ＧＴＴＧＡＣＡＴＧＴＧＣＧＧＡ−ＣＯＮＨ₂ Ｈ３０．５’末端にビオチンが結合している４５ｍｅｒのＤＮＡ配列（Ｌ１２）と３単位の１５ｍｅｒのＰＮＡ配列（Ｕ１３）より成るＰＮＡ／ＤＮＡ複合体。４５ｍｅｒのＤＮＡ（Ｌ１２）の塩基配列は以下の通りである：Ｂｉｏ−ｌｉｎｋ−ＴＣＣＧＣＡＣＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＧＣＡＣＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＧＣＡＣＡＴＧＴＣＡＡＣ −３’。１５ｍｅｒのＰＮＡ（Ｕ１３）の塩基配列は以下の通りである：Ｈ−ＧＴＴＧＡＣＡＴＧＴＧＣＧＧＡ−ＣＯＮＨ₂。Ｈ３１．３’末端にビオチンが結合している４５ｍｅｒのＤＮＡ配列（Ｌ１３）と３単位の１５ｍｅｒのＰＮＡ配列（Ｕ１３）より成るＰＮＡ／ＤＮＡ複合体。Ｌ１３の塩基配列は上記Ｌ１２の塩基配列と同じである。したがって、Ｌ１３の配列は次の通りである。５’−ＴＣＣＧＣＡＣＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＧＣＡＣＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＧＣＡＣＡＴＧＴＣＡＡＣ−ｌｉｎｋ− Ｂｉｏ−３’。１５ｍｅｒのＰＮＡ（Ｕ１３）の塩基配列は以下の通りである：Ｈ−ＧＴＴＧＡＣＡＴＧＴＧＣＧＧＡ−ＣＯＮＨ₂。Ｈ３２．２種類の１７ｍｅｒのＰＮＡ配列、Ｌ７とＵ２８より成るＰＮＡ／ＰＮＡ複合体（ｄｓＰＮＡ）で、Ｌ７の５’末端にはビオチンが結合している。Ｌ７の塩基配列は以下の通りである：Ｂｉｏ−ｌｉｎｋ−ＡＣＡＡＴＴＧＣＣＧＡＡＡＣＡＡＴ− ＣＯＮＨ₂。Ｕ２８の塩基配列は以下の通りである：Ｈ−ＡＴＴＧＴＴＴＣＧＧＣＡＡＴＴＧＴ−ＣＯＮＨ₂。ＰＮＡ／核酸複合体は、好適な緩衝液（例えば５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、５０ｍＭＮａＣｌ）中に核酸と該核酸の全部もしくは一部に相補的である塩基配列を有するＰＮＡを混合し、該混合物を加熱して１本鎖の分子を形成させた後にゆっくりと室温まで冷却して形成する。複合体形成の特徴を以下に記す。Ｔｍ決定：ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体およびＰＮＡ／ＲＮＡ複合体のＴｍはＬａｍｂｄａ２ＳＵＶ／ＶＩＳ分光光度計（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に加熱装置（ペルチェ加熱エレメント）付き”セルホルダ−”を装着して測定した。３ｍｌの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、５０ｍＭＮａＣｌ緩衝液中の複合体の最終量が２ｎｍｏｌに調整するために、３．６ｍｌのＮＵＮＣＣｒｙｏチューブ内に好適な量の各鎖と緩衝液を混合した。混合体を９５℃で１０分間加熱し、それからゆっくりと（３から４時間）室温まで冷却した。これからおよそ２．８ｍｌを取り、３ｍｌの水晶製の蓋と攪拌マグネットの付いたキュベットに移した。キュベットの温度を２０℃から９５℃まで０．２℃／分のスピードで上げた。２６０ｎｍの吸光度を連続的に測定した。Ｔｍ値は融解曲線の一次導関数の最高点より求めた。アクリルアミドゲル電気泳動；ＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭＴｒｉｓ−ホウ酸、２ｍＭＥＤＴＡ）中での２０％ポリアクリルアミドゲルを用いた複合体の泳動でも複合体形成を試験した。複合体はＮｙｔｒａｎ１３Ｎ濾紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）に写し取る。複合体は複合体に結合した標識体を利用して視認する。ビオチンあるいは蛍光標識体を含む複合体はアルカリホスファタ− ゼ（ＡＰ）標識−ストレプトアビジンもしくは−抗蛍光体抗体を用いて視認することができる。未標識複合体はポリアクリルアミンドゲルをエチジウムブロマイドで染色して直接視認化するか、ＷＯ９５／１７４３０記載のＰＮＡ／核酸ポリクロ−ナル抗体で染色し、さらに二次抗体、例えばブタ抗ウサギ／ＡＰと反応させることで視認化する。結合したＡＰ標識体は発色基質混合体ＮＢＴ／ＢＣＩＰを用いて視認化する。ドットブロット：複合体の希釈列（ドット当たり２０ｎｇから２ｎｇまで）をＮｙｔｒａｎ１３Ｎ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）濾紙上にドットする。上記同様にして視認化する。実施例２免疫免疫に使用した抗原（ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体Ｈ１２）は以下のものを総量２ｍＬに混合して調整した：０．９３９ｍｇ４５ｍｅｒのポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）１．１４５ｍｇ１５ｍｅｒのＰＮＡオリゴマ− ５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５５０ｍＭＮａＣｌ上記混合物をヒ−トブロックで９２℃に加熱してからゆっくりと室温まで冷却する。ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体の最終濃度は１．０４ｍｇ／ｍｌであった。複合体形成を実施例１記載の方法で試験した。１．０４ｍｇ／ｍｌ濃度のＰＮＡ／ＤＮＡ複合体に、２５０ｍｇ／ｍｌ濃度になるようにオボアルブミンを加えた。この混合体にさらにフレンドの不完全アジュバントを１：１ｖ／ｖで混合し、雌のＰＡＬＢ／ｃマウスにおよそ３週間の間隔で５回腹腔内あるいは皮下に投与して免疫した。実施例３ＲＮＡの分離、Ｆａｂ断片をコ−ドするＤＮＡの増幅とクロ−ニングＲＮＡの分離上記記載の免疫したマウスから脾臓を取り出し、直ぐに１０ｍｌの４Ｍグアニジンチオシアネ−ト、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．５％サルコシル、０．１Ｍβ−メルカプトエタノ−ル（全てＳｉｇｍａ社）液に移した。全ての液はいずれも氷上に維持した。１０分後、脾臓をＰｏｌｙｔｒｏｎホモゲナイザ−で全速でおよそ１０秒間ホモゲナイズした。続いて１ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０と１０ｍｌのフェノ−ル／クロロホルム／イソアミルアルコ −ル（１２５：２４：１）、ｐＨ４．７を上記ホモゲネートに加えて激しく混合した。この混合体を１００００ｒｐｍ（ＪＡ２０ロ−タ−、Ｂｅｃｋｍａｎ遠心機）で２０分間、４℃で遠心分離した。ＲＮＡを含む上清を新しいチュ−ブに移し、１当量のフェノ−ル／クロロホルム／イソアミルアルコ−ル（１２５：２４：１）、ｐＨ４．７を加えて激しく混合し、使用前に遠心分離した。上清を新しいチュ−ブに移し、残った有機層を７．５ｍｌの４Ｍグアニンジンチオシアネ−ト、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．５％サルコシル、０．１Ｍβ−メルカプトエタノ−ル、０．７５ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０でさらに抽出した。このサンプルを前記同様に混合し、遠心分離した。ＲＮＡ含有上清を一つに集めた。総容積は１２．５ｍｌであり、それからＲＮＡを−２０℃の１用量のイソプロピルアルコ−ルで最短３０分間処理して沈殿させた。ＲＮＡは１２０００ｒｐｍ、３０分、４℃で遠心分離して集めた。ペレットを０．５ｍｌの４Ｍグアニジンチオシアネ−ト、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．５％サルコシル、０．１Ｍβ−メルカプトエタノ− ルに再懸濁してＲＮＡを溶解し、この溶解液をエッペンドルフチュ−ブに移して、さらに５０μｌの２Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０と０．５ｍｌのフェノ−ル／クロロホルム／イソアミルアルコール（１２５：２４：１），ｐＨ４．７を加えた。激しく混合した後、試料を微量遠心機にかけて最高速度で５分間遠心分離した。上清を新しいチュ−ブに移し、ＲＮＡを−２０℃の１用量のイソプロピルアルコ−ルで最短３０分間処理して沈殿させた。ＲＮＡは最高速度、３０分、４ ℃の遠心分離して集めた。さらに上記の作業を繰り返してＲＮＡを抽出し沈殿させた。ペレットは０．７ｍｌのＤＥＰＣ（ジエチルピロカ−ボネイト）処理したＨ₂ Ｏに再懸濁して、さらに７０ μｌの２Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０と０．７ｍｌのフェノ−ル／クロロホルム／イソアミルアルコ−ル（１２５：２４：１），ｐＨ４．７を加えた。これを激しく混合した後、この混合体を微量遠心機にかけて最高速度で５分間遠心分離した。上清を新しいチュ−ブに移し、ＲＮＡを− ２０℃の１用量のイソプロピルアルコ−ルで最短３０分間処理して沈殿させた。ＲＮＡは最高速度、３０分、４℃の遠心分離して集めた。ペレットを８０％エタノ−ルで洗浄し、さらにＲＮＡペレットをＳｐｅｅｄＶａｃで短時間乾燥させた。ＲＮＡはＤＥＰＣ処理Ｈ₂Ｏで溶解してから−７０ ℃に保管した。収量はおよそ２６０ｎｍの光密度より算定して１８７μｇ総細胞ＲＮＡであった。ｃＤＮＡ合成５０μｇの総ＲＮＡと１．２５μｇのオリゴ（ｄＴ）₁₈を混合してから１０分間７０℃で反応させて変性させ、さらに短時間氷の上で冷却した。逆転写反応はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭIII （ＧｉｂｏｃｏＢＲＬ）を用いて以下の条件にて実施した：５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３室温７５ｍＭＫＣｌ１０ｍＭＤＴＴ３ｍＭＭｇＣｌ₂ 各０．５ｍＭｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ変性したＲＮＡを反応チュ−ブに加え、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭIII ＲＮａｓｅＨ逆転写酵素６００Ｕを加える前に反応液５０μｌを４５℃で３分間反応させる。逆転写反応は４５℃で１時間行った。それからｃＤＮＡを通常の方法にしたがって沈殿させ、最後に１５μｌのＨ₂Ｏに再懸濁し、−２０℃で凍結保存した。ＰＣＲ増幅Ｆｄとカッパ鎖をまず別々にＰＣＲで増幅し、ついでＯｒｕｍら．（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｃｈ，Ｖｏｌ２１，Ｎｏ１９、４４９１−４４９８（１９９３）に必須事項が記載されたアッセンブリ−ＰＣＲを行った。ＤｙＮＡｚｙｍｅ温度安定ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＦｉｎｎｚｙｍＯｙ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を以下の条件にて使用した：１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃にてｐＨ８．８）１．５ｍＭＭｇＣｌ₂ ５０ｍＭＫＣｌ０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００各０．１ｍＭｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ０．２μＭ前方向プライマ−（図１参照）０．２μＭ逆方向プライマ−（図１参照）調製したｃＤＮＡの半分をＦｄ鎖増幅用の鋳型に用いて、残りの半分をカッパ鎖の増幅用に用いた。各鎖について合計３つの５０μｌの反応を行った。ｃＤＮＡを反応チュ−ブに加えて、９４℃の第１反応（変性）の後に、５０μｌ反応当たり１ＵのＤｙＮＡｚｙｍｅを加えた。反応はＤＮＡサ−マルサイクラ−（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）を用いて２５サイクル（変性９４℃−１分：アニ−リング５５℃−１分；伸長７２℃−１分）行った。増幅産物を沈殿させてからメ−カ−使用説明書にしたがってＪｅｔＳｏｒｐ（Ｇｅｎｏｍｅｄ）を用いてゲル精製した。カッパ鎖とＦｄ鎖ライブラリ−は別々にＰＣＲ反応して（ステップＢ、図２）特異断片と結合し（図１および２のＬＩＮＫ）最後のアッセンブリ−ＰＣＲで２つのライブラリ−が組合わせること、ならびに１ステップで完全なレパ−トリ− のクロ−ニングができるようにした。反応はプライマ−濃度がそれぞれ０．２５ μＭであること以外は上記に同じ条件で行った。カッパ鎖用の反応の鋳型ＤＮＡとして１００μｌのＰＣＲ産物当たり、精製した最初のカッパＰＣＲ産物５ｎｇと７ｎｇの結合断片を利用した。Ｆｄ反応を行う為に、１００μｌのＰＣＲ反応当たり１０ｎｇの精製した最初のＦｄＰＣＲ産物と１４ｎｇの結合断片を加えた。最初に９４℃、５分間変性した後に１．５ＵのＤｙＮＡｚｙｍｅを１００μｌ反応液当たりに加え、次いで２５サイクル（Ｆｄ）あるいは２１サイクル（カッパ）（９４℃−１分；６５℃−１分；７２℃−１分）の増幅を行った。増幅産物を沈殿させてからメ−カ−使用説明書にしたがってＪｅｔＳｏｒｐ（Ｇｅｎｏｍｅｄ）を用いてゲル精製した。次に最後の反応で、上記別々に増幅伸長した２つの鎖を、プライマ−濃度が５ μＭであり、鋳型としておよそ４ｎｇの精製し、伸長したカッパ鎖とＦｄ鎖を反応液１００μｌ当たりに加えること以外は最初の反応と同じアッセイ条件のＰＣＲによりつないだ（ステップＣ、図２）。最初の９４℃の５分の変性の後に、１００μｌ反応液当たり１ＵのＤｙＮＡｚｙｍｅを加え、２５サイクル（９４℃− １．５分；６９℃−１分；７２℃−２分）で増幅を行った。増幅産物を沈殿させてからメ−カ−使用説明書にしたがってＪｅｔＳｏｒｐ（Ｇｅｎｏｍｅｄ）を用いてゲル精製した。クロ−ニング増幅産物をメ−カ−取扱説明書に従いＳｆｉ１およびＮｏｔ１制限酵素（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）で切断し、それからＪｅｔＳｏｒｐ（Ｇｅｎｏｍｅｄ）を利用してゲル精製した。クロ−ニングに好適なベクタ−はｆ１の様な複製起点やペニシリン耐性の様な選択用のマ−カ−配列、プロモ−タ−等の発現調節配列ならびにｐｅｌＢリ−ダ −の様な、細菌の周囲細胞質域に発現蛋白を導くためのシグナル配列から成るものである。さらに様々な配列を取り込むための複数の制限酵素部位が求められる。好適なベクタ−の一つはｐＦＡＢ５ｃ．Ｈｉｓである。ファ−ジミドｐＦＡＢ５ｃ．ＨｉｓはＯｒｕｍら．（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｃｈ，Ｖｏｌ２１，Ｎｏ１９、４４９１−４４９８（１９９３）記載のｐＦＡＢ５ｃを改良したものであり、６つのヒスチジンから成る尾部が加えられたことにより続く組換え抗体の精製を簡便になっている。ファ−ジミドｐＦＡＢ５ｃ．ＨｉｓはＲｏｙａｌＤａｎｉｓｈＳｃｈｏｏｌｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，ＤｅｎｍａｒｋのＪａｎＥｎｇｂｅｒｇ教授より得た。使用した発現ベクタ−はＥａｇ１消化により構築できる。この処置によりΔｇ III をベクタ−より取り除くことができ、Ｆａｂ断片を遊離型のＦａｂとして発現させることができる；すなわちファ−ジｇIII 蛋白に融合しない形で発現できる。この処置により、Ｆａｂ断片をファ−ジの表面に提示させる能力も同時に失う。本書で使用したベクタ−ｐＦＡＢ５ｃ．Ｈｉｓは増幅産物に用いたものと同じ制限酵素Ｓｆｉ１とＮｏｔ１で処理してからＪｅｔＳｏｒｐでゲル精製した。ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ社製Ｔ４ＤＮＡライゲ−ス４単位を用いて、合計１００μｌ中、以下の条件で室温、３時間反応させ、およそ４００ｎｇの消化、精製ベクタ−を４００ｎｇの消化、精製ＰＣＲ増幅産物と結合した。６６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ５ｍＭＭｇＣｌ₂ １ｍＭＤＴＴ１ｍＭＡＴＰｐＨ７．５（２０℃）この反応は２重に行った。連結後、混合液を一度フェノ−ル／クロロホルム／イソアミルアルコ−ル（２５：２４：１）で抽出し、さらに水相についてクロロホルムで抽出を行った。最後に、ＤＮＡを通常の条件下にエタノ−ルで沈殿させた。このペレットを２回７０％のエタノ−ルで洗浄し、短時間ＳｐｅｅｄＶａｃで乾燥させた後にＤＮＡを１５μｌのＨ₂Ｏに再懸濁した。実施例４大腸菌の形質転換ＢｉｏＲａｄ社製Ｅ．ｃｏｌｉＰｕｌｓｅｒの０．１ｃｍエレクトロポレ−ションキュベット（ＢｉｏＲａｄ）に１μｌの電気反応性の大腸菌細胞（ＴＯＰ１０Ｆ’／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を入れ、これに実施例３で得たＤＮＡを１８ｋＶ／ｃｍの電場強度で条件で導入した。パルスを加えた直後にキュベットを新たに調製した１ｍｌのＳＯＣ培地で噴射洗浄し、細胞を１時間３７℃で振とう培養した。ライブラリ−の大きさは上記処置で電気導入した細胞を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと０．５％のグルコ−スを添加したＬＢ培地に移す前に、適当に希釈したものを選択プレ−トに播いて決めた。ヘルパ−ファ−ジに重感染させる前に、３７℃でおよそ８時間振とう培養し（ＯＤ₆₀₀がおよそ１．５）、培養液の残りからプラスミドＤＮＡを調整した（Ｑｉａｇｅｎプラスミド調整）。宿主大腸菌の特徴Ｔｏｐ１０Ｆ’：Ｆ’｛ｌａｃ１^qＴｎ１０（Ｔｅｔ^R）｝ｍｃｒＡΔ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ− ｍｃｒＢＣ）θ８０ｌａｃＺΔＭ１５ΔｌａｃＸ７４ｄｅｏＲｒｅｃＡ１ａｒａＤ１３９Δ（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９７ｇａｌＵｇａｌＫｒｐｓＬｅｎｄＡ１ｎｕｐＧ．実施例５Ｆａｂ断片のファ−ジ提示と抗原結合ファ−ジの選別（パニング）１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと１２μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを添加した５０ｍｌのＬＢ培地に１−５×１０⁸形質転換細胞を接種し、３７℃でＯＤ₆₀₀がおよそ０．５になるまで振とうした。Ｒ４０８ヘルパ−ファ−ジ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を５０−１００倍量加え、感染前に３７℃で２０分間ゆっくりと振とうした。続いて、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１００μＭになるよう加え、一晩室温にておよそ２５０ｒｐｍで振とうしながら培養した。細胞をペレット化させた後、ファ−ジを１時間、４℃で４％ＰＥＧ₆₀₀₀と０．５ＭのＮａＣｌと反応させて沈殿させ、ＪＡ２０ロ−タ−／Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離装置を用いて４℃、３０分間、２０，０００ｒｐｍの速度で遠心分離して集めた。沈殿をおよそ１ｍＬの上清に再懸濁してから微量遠心分離装置、３０分、４℃、最高速度で遠心分離した。最後にファ−ジを４００μｌのＰＢＳ（１３７ｍＭＮａＣｌ、２．７ｍＭＫＣｌ、４．３ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ、１．４ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７．３）に再懸濁し、洗浄遠心を行った後にファ− ジを新しいチュ−ブに移した。新しく調整したファ−ジは直ぐに次の作業：力価測定とパンニングに利用した。力価測定は対数的の増殖している大腸菌Ｔｏｐ１０Ｆ’５０μｌに適当に希釈体より得た１μｌのファ−ジを感染させ、２０分間、３７℃の培養後、細菌を選択寒天培地に移して行った。ファ−ジの力価は次の日にコロニ−数から計算した。パンニング：ストレプトアビジンを固相化したマイクロタイタ−プレ−ト（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，ＮＵＮＣ）とビオチン化したＰＮＡ／ＤＮＡ複合体（Ｈ２）５０ｎｇと３７℃で最低２時間反応させるか、４℃で一晩反応させた。ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体はＴＨＴ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、０．１ＭＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で希釈した。ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体を結合させた後、マイクロタイタ−ウエルの残った結合部位を４％の脱水化スキムミルク（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）ＰＢＳ液（ＰＢＳＭ）で約２時間、３７℃で処理してブロックした。最後に、このウエルを３−５回０．５％Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ液（ＰＢＳＴ）で洗浄した。１０¹⁰−１０¹¹ファ−ジ（調製済みファ−ジ、５０−７５μｌ）に１μｇ／１００μｌのストレプトアビジンを付加してからマイクロタイタ−ウエルに加え、３７℃で揺すりながら１時間半から２時間反応させた。３００μｌのＰＢＳＴによる洗浄を様々な回数行い（第一パンニングの間に３回；その後のパンニング毎に５−１０回）。結合したファ− ジを１００μｌの０．１％トリプシン（ＤＡＫＯＳ２０１２）ＰＢＳ液で３０分間室温処理して溶出した。溶出液を２ｍｌの対数増殖期の大腸菌ＴＯＰＱＰＦ ’に加え、３７℃で２０分間反応させてから、溶出ファ−ジを適当に希釈して選択寒天プレ−ト上に広げて力価測定した。残った細胞を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと０．５％のグルコースを添加した５０ｍｌのＬＢ培地中に３７℃で振とうしながら一晩培養し継代した。翌日、溶出ファ−ジの力価を測定してから、本実施例記載の方法に従い５０ｍＬの培養液を用いて重感染させ、前記同様にして次のパンニングのためのファ−ジを調整した。パンニング操作とスクリ−ニングを４回繰り返し、所望の結合特性を有する単一コロニ−を分離した。単一コロニ−を分離し５ｍｌの１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ培地中に接種し、３７℃で振とうしならばＯＤ₆₀₀が０．８−１になるまで培養した。それからＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになる様加え、室温での培養を一晩継続した。その後、細胞を沈殿させて、さらにＰＢＳに再懸濁してからドライアイス／エタノ−ルでの凍結と室温、水槽内での融解を４回繰り返した。遠心分離を行った後、上清をＥＬＩＳＡで分析した。次のクロ−ンを得た：マウス抗ＰＮＡ／ＤＮＡクロ−ン５，マウス抗ＰＮＡ／ＤＮＡクロ−ン６ならびにマウス抗ＰＮＡ／ＤＮＡクロ−ン１６。実施例６選択した陽性クロ−ンの解析Ｆａｂ断片を用いたＥＬＩＳＡの結果ストレプトアビジンを固相化したマイクロタイタ−プレ−ト（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）をビオチン化したＰＮＡ／ＤＮＡ複合体の１００ｎｇ／ｍＬ濃度のＴＨＴ液と３７℃で最低２時間反応させるか、あるいは４℃で一晩反応させた。ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体と結合させた後、プレ−トをＴＨＴ緩衝液で洗浄してから４％の脱水化スキムミルクのＰＢＳ液（ＰＢＳＭ）を１時間半から２時間作用させてウエルへの非特異的結合をブロックした。ＴＨＴで洗浄し（ＤｅｎｌｅｙＷｅＷａｓｈ４）てから組換えＦａｂ断片を別々のウエルに加え、３７℃で揺すりながら通常は２時間反応させた。ＨＲＰ標識ヤギ抗マウス１ｇＧ（ＤＡＫＯ）とＰＯＤ（ＤＡＫＯ）をメ−カ−の取扱説明書に従い使用して、結合した断片を検出した。１５−３０分後１ＭのＨ₂ＳＯ₄を加えて検出反応を停止してからＯＤ₄₉₀でプレ−トを測定した（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｃｉｃｅｓ）。異なる作業ステップ間の洗浄は全てＴＨＴ（ＤｅｎｌｅｙＷｅＷａｓｈ４）を用いて行った。さらに最初に分離したクロ−ンから得たＦａｂについて、表１にある様々なＰＮＡ／核酸複合体との反応性を解析した。結果にはＯＤ₄₉₀値とバックグランド値を示したが、バックグランド値は０．１以下であったので差し引かなかった。肩に記した１−４の数字は、結果を得たストレプトアビジンを固相化したマイクロタイタ−プレ−トの違いを示している。Ｆａｂ断片も様々な調製ロットを使用しているため、得られた絶対値をプレ−ト間で比較することはできない。表１に示すように、本発明のＦａｂ断片は強さにばらつきはあるものの調べたほとんどのＰＮＡ／ＤＮＡ複合体と反応した。試験したＰＮＡ／ＤＮＡ複合体の塩基配列は実施例１に記載したように多様であるが、得られた結果からは抗体の反応性が塩基配列に関係していないことが示された。反応性がなかった例は、１本鎖ＰＮＡもしくはＤＮＡ、あるいは２本鎖のＤＮＡもしくはＰＮＡ／ＲＮＡであった。以上より、本組換え抗体はＰＮＡ−核酸複合体に対して高い特異性を有している。本組換え抗体により認識されるエピト−プの特異性は高いが、この特異性はＰＮＡ／核酸複合体の特異塩基配列よりはむしろＰＮＡ−核酸複合体の立体配座により規定されている。Ｆａｂ−ファ−ジ融合体を用いたＥＬＩＳＡの結果マイクロタイタ−プレ−トを上記のストレプトアビジンで固相化したが、本例ではこのプレ−トを当モル量の様々なＰＮＡ／ＤＮＡ複合体と反応させた、即ち各複合体について、１００ｎｇ／ｍｌの液１００μｌの代わりに３．７４ｎＭ液１００μｌを用いて各ウエルを固相化した。非特異的結合は４％のスキムミルクのＰＢＳ液を２時間反応させてブロックした。ＴＨＴ液で洗浄した後、実施例５に記載した単クロ−ンＦａｂ−ファ−ジを様々な数量各ウエルに加えた。プレ− トは３７℃で揺すりながら２時間反応させた。Ｆａｂ−ファ−ジの結合はＨＲＰ標識ラビット抗ファ−ジ抗体（ＤＡＫＯ）およびＯＰＤ／クエン酸（ＤＡＫＯ）をメ−カ−の取扱説明書に従い使用して検出した。検出反応は上記同様に停止し、ＯＤ₄₉₀値を測定した。各ステップ間の洗浄はＴＨＴを用いて行った。異なる３種類のクロ−ンより得たＦａｂ−ファ−ジの反応性は極めて類似していた。各種のＰＮＡ／ＤＮＡ複合体を試験抗原として使用した場合のＦａｂ−ファ−ジ、クロ−ン６の力価を図３に示した。曲線は様々なウエル当たりのＦａｂ −ファ−ジ数についてのＯＤ₄₉₀値を示している。（１．００Ｅ＋０×は１．０^O ^X ×１００Ｘを意味している）図３は個々のＰＮＡ／ＤＮＡ複合体に対する抗体反応性の用量−反応曲線を示している。これらの結果から、異なるＰＮＡ／ＤＮＡ複合体に対して抗体の反応性が様々であることが確認できる。２本鎖ＰＮＡに対するＦａｂ−ファ−ジの反応性についても試験した。ＰＮＡ／ＰＮＡ複合体（Ｈ３２）は実施例１に報告している。Ｈ３２のＯＤ₄₉₀値と３種類のクロ−ンより得られたＦａｂ−ファ−ジのＯＤ₄₉₀値は、１本鎖ＰＮＡ（Ｌ８）および１本鎖ＤＮＡ（Ｌ２）のＯＤ₄₉₀値に近いものであった。ヤギ抗マウスカッパ二次抗体を用いた検出検出ステップでカッパ鎖に対する抗マウス二次抗体を利用してＥＬＩＳＡアッセ−を行った。この抗体はアルカリホスファタ−ゼ標識体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）であり、検出はＰＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルフォスファタ−ゼ；Ｓｉｇｍａ）の１Ｍジエタノ−ルアミン／０．５ｍＭＭｇＣｌ液を用いて行った。ＯＤ₄₀ ₅ 値を表２に示す：これらの結果より、カッパ鎖が発現されたＦａｂ断片中に存在していることが示された。競合ＥＬＩＳＡアッセイ組換えＦａｂ断片の反応性を免疫源存在下に調べた（ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体Ｈ１２；Ｈ２ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体の非ビオチン化型）。組換え抗体断片を含む周辺細胞質分画をＨ１２ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体の量を最終２μｇ／ｍｌまで増やしながら反応させた。混合体は結合Ｈ２ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体を含むＥＬＩＳＡウエルに移す前に、およそ１時間、３７℃で前反応させた。アッセイは一般のＥＬＩＳＡ操作に従い実施した。使用した２種類の陰性コントロ−ルはＦａｂ断片を発現していない周辺細胞質抽出物と不活性型マウスモノクロ−ナル抗体（ＤＡＫＯ商品コ−ドＸ０９３１）である。２μｇＨ１２／ｍｌからＨ１２複合体無しの状態にするとＯＤ測定値が２−２．５倍増加したのに対し、２種類の陰性コントロ−ルを測定した場合にはバックグランド値を越えるシグナルは得られなかった。サブタイプの決定組換え断片の抗体サブタイプを、サブタイプ特異的抗体（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３）と反応させてＨＲＰ標識ヤギ抗ラビット抗体で検出する通常の方法にしたがったＥＬＩＳＡアッセイで調べた。ＯＤ₄₉₀測定値を表３に示した。陰性クロ−ンはｐＦＡＢ５ｃ．Ｈｉｓ（元のプラスミド）を形質導入した大腸菌培養体から調製した周辺細胞質抽出物、即ちＦａｂ断片を発現していないものである。結果から、Ｆａｂ断片が全てのＩｇＧサブタイプであることが示された。ドットブロット解析ドットブロットアッセイにはＮＹＴＲＡＮＮＹ１３Ｎ０．４５μｍ膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｈｕｅｌｌ）を使用した。Ｈ２ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体を２０ｎｇ／ドットから０．６２５ｎｇ／ドットまでの２倍希釈液と、希釈緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）のみ含む陰性コントロールをこの膜上にドットした。膜は次の様にして試験した：１．ドットを風乾した後、複合体を２分間紫外線固定した。２．０．５％のカゼインＴＳ液を６５℃で作用させて膜をブロッキングした。反応は揺すりながら室温でおよそ１時間行った。３．膜を周辺細胞質分画と室温で一晩反応させた。４．膜を洗浄する：３回１０分間のＴＳＴ洗浄。５．検出抗体と１時間半反応させた：ヤギ抗マウス／ＡＰ標識（ＤＡＫＯ）、０．５％のＴＳ液にて希釈。６．ステップ４に従い洗浄。７．ＮＢＴ／ＢＣＩＰで染色ドット当たり１０ｎｇ以下の場合には、３種類全てのクロ−ンのＦａｂ断片との間で陽性反応が認められた。陰性コントロ−ルはｐＦＡＢ５ｃ．Ｈｉｓを形質導入した大腸菌から調整した周辺細胞質抽出物である。陰性コントロ−ルとの間に反応は見られなかった。試薬液：ＴＳ：０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、０．５ＭＮａＣｌＴＳＴ：０．５％ＴｗｅｅｎのＴＳ液ＮＢＴ：ニトロブル−テトラゾリウム（Ｓｉｇｍａ）ＢＣＩＰ：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、ｐ−トルイジン塩（Ｓｉｇｍａ）。ＮＢＴ／ＢＣＩＰ：７５ｍｇ／ｍｌＮＢＴ，５０ｍｇ／ｍｌＢＣＩＰ。染色は０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、０．０５ＭＭｇＣｌ₂、０．１ＭＮａＣｌの１：４００希釈液を用いて行った。クロ−ンのＤＮＡ解析選択した３種類のクロ−ン（それぞれマウス抗ＰＮＡ／ＤＮＡクロ−ン５，クロ−ン６，クロ−ン１６）よりプラスミドＤＮＡを調整し、メ−カ−の取扱説明書（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）に従い制限酵素分析により解析した。Ｓｆｉ１＋Ｎｏｔ１消化からは、それぞれおよそ１７００ｂｐと４６００ｂｐの大きさの２種類の断片が得られた。Ｐｓｔ１消化からはそれぞれおよそ４００ｂｐ、１６００ｂｐ、ならびに４２ −４３００ｂｐの大きさの断片が得られた。制限酵素解析の範囲では３種類のクロ−ンの間に差は認められなかった。部分的配列解析からも、３種類のクロ−ンが極めて近似していることが推測された。クロ−ン６あるいはクロ−ン１６配列をｐＦＡＢ５ｃ．Ｈｉｓ配列に挿入したハイブリッドベクタ−を１９９５年、７月１９日にＤＳＭに供託している（それぞれＤＡＭ１００５１とＤＳＭ１００５２）。本例ではＮ−（２−アミノエチル）グリシン骨格を有するＰＮＡを使用したが、これに限定されるものではない。別の基本骨格を有するＰＮＡも、ＰＮＡが核酸との間に安定した複合体を形成するものであれば本例同様の方法で使用できる。本出願の優先日を主張するデンマ−ク特許出願番号７１７／９５号の開示内容は参照により組み入れる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/531 Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＧ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ＰＮＡ（ペプチド核酸）と核酸との間に形成される複合体に結合することができることを特徴とする組換え抗体あるいは該抗体の断片。２．１本鎖のＰＮＡ、２本鎖の核酸、あるいは１本鎖の核酸とは結合しないことを特徴とする請求項１記載の組換え抗体。３．ＰＮＡとＤＮＡとの間に形成される複合体には結合するが、ＰＮＡ／ＰＮＡ複合体、１本鎖もしくは２本鎖のＤＮＡ、ＤＮＡ／ＰＮＡ複合体、ＲＮＡあるいは１本鎖ＰＮＡとは結合しないことを特徴とする請求項２記載の組換え抗体。４．重鎖と軽鎖のＦａｂ領域を含む断片であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の組換え抗体。５．宿主動物をＮ−（２−アミノエチル）グリシン骨格を有するＰＮＡとＤＮＡの間に形成される複合体で免疫し、抗体産生細胞からＲＮＡを分離し、分離した該ＲＮＡのｍＲＮＡから１本鎖のｃＤＮＡを作成し、特異的オリゴヌクレオチド混合体を利用して抗体をコ−ドする該ｃＤＮＡの断片を増幅し、その増幅物を発現可能なファ−ジミドに挿入し、重感染後抗体断片をその表面に提示させ、該ファ−ジを細菌に感染させてファ−ジライブラリ−を作成し、選択後、パンニングと細菌への感染を繰り返し行い、所望の抗体断片をコ−ドするファ−ジと抗体断片を産生させる細菌に感染させるための該ファ−ジを用い、もしくは抗体断片をコ−ドするＤＮＡを別の原核生物あるいは真核生物の発現システムを用いて、発現させることを特徴とする請求項４記載のＦａｂ断片。６．重鎖と軽鎖のＦａｂ領域からなる断片であり、宿主動物をＮ−（２−アミノエチル）グリシン骨格を有するＰＮＡとＲＮＡの間に形成される複合体で免疫し、抗体産生細胞からＲＮＡを分離し、分離した該ＲＮＡのｍＲＮＡから１本鎖のｃＤＮＡを作成し、特異的オリゴヌクレオチド混合体を利用して抗体をコ−ドする該ｃＤＮＡの断片を増幅し、その増幅物を発現可能なファ−ジミドに挿入し、重感染後抗体断片をその表面に提示させ、該ファ− ジを細菌に感染させてファ−ジライブラリ−を作成し、選択後、パンニングと細菌への感染を繰り返し行い、所望の抗体断片をコ−ドするファ−ジと抗体断片を産生させる細菌に感染させるための該ファ−ジを用い、もしくは抗体断片をコ− ドするＤＮＡを別の原核生物あるいは真核生物の発現システムを用いて、発現させることを特徴とする請求項２記載の組換え抗体。７．認識、シグナリング、結合あるいは精製のためにタグを結合させた請求項１から６のいずれか１項に記載の組換え抗体。８．請求項１から７のいずれか１項に記載の組換え抗体もしくはその断片をコ −ドする挿入体を含む組換えＤＮＡ。９．複製起源、選択のためのマ−カ−配列、発現制御配列、シグナル配列ならびに制限酵素部位を更に含むハイブリッドベクタ−であることを特徴とする請求項８記載の組換えＤＮＡ。１０．ベクタ−ｐＦＡＢ５ｃ．Ｈｉｓに挿入された請求項１から７のいずれか１項に記載の組換え抗体をコ−ドするＤＮＡを含むことを特徴とする請求項９のハイブリッドベクタ−。１１．ハイブリッドベクタ−がＤＳＭ１００５１である請求項１０に記載のハイブリッドベクタ−。１２．ハイブリッドベクタ−がＤＳＭ１００５２である請求項１０に記載のハイブリッドベクタ−。１３．請求項１から７のいずれか１項に記載の組換え抗体あるいはその断片を使用した、試験サンプル中の検出対象である特定の核酸配列と、該特定核酸配列と複合体を形成できるＰＮＡとの間に形成されたＰＮＡ／核酸複合体を検出する方法。１４．請求項１から７のいずれか１項に記載の組換え抗体あるいはその断片、検出対象の核酸と複合体を形成することができるＰＮＡ配列、そして視認化のためのシステムを含むサンプル中の特的核酸を検出するためのキット。