JP2002543813A

JP2002543813A - 多重標識分析

Info

Publication number: JP2002543813A
Application number: JP2000617205A
Authority: JP
Inventors: エム．リザルディ，ポール; アール．ラティマー，ダリン
Original assignee: Yale University
Current assignee: Yale University
Priority date: 1999-05-07
Filing date: 2000-05-05
Publication date: 2002-12-24
Also published as: EP1196632A2; CA2371843A1; WO2000068434A2; WO2000068434A3; AU4824800A; AU782408B2

Abstract

(57)【要約】ある試料内の多数の分析物を単一の分析で検出する方法が開示される。この方法は標的分子を信号でコードした後、コードした信号を解読するというやり方に基づいている。このコード化／解読によって、標的分子の検出が標的分子の化学的及び物理的性質から切り離される。基本的な形態で、開示された方法は、１つ以上のレポーター分子と１つ以上の標的試料とを結合させ、１つ以上の解読タグをレポーター分子と結合させ、その解読タグを検出するというやり方を用いる。レポーター分子は標的試料内の標的分子と関連する。一般に、レポーター分子は１つ以上の標的分子に対応し、解読タグは１つ以上のレポーター分子に対応する。したがって、特定解読タグの検出は対応するレポーター分子の存在を示す。さらに、特定レポーター分子の存在は、対応する標的分子の存在を示す。開示された方法の感度は、また、検出の前に信号増幅ステップを含めることによって高めることができる。この方法の医学的応用としては、細胞の表現型や複製状態（増殖又は休止）の分析、及び正常状態と疾病状態の組織検体や細胞標本の正常細胞と腫瘍細胞の評価、などがある。例えば、病理学者はこの方法を用いて表現型状態と悪性又は前悪性細胞を含むと考えられる病巣のタンパク質プロフィールとを結びつけることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景本発明は、総体的に、分子の検出の分野、特に単一の検定における多数の異な
る分子の検出の分野に属するものである。

【０００２】組織学的切片およびその他の細胞学的調製物中のタンパク質の分析は、常套的
には組織化学、免疫組織化学、または免疫蛍光の技術を用いて実施する。異なる
色で標識した抗体による免疫蛍光を実施することにより、細胞材料中に存在する
２、３または４種もの異なる抗原を同時に検出することが可能となった。将来、
時間分解蛍光が、６ないし１２の異なる抗体を同時に検出する、免疫蛍光法の拡
張を可能にするかも知れない。同様に、蛍光in situハイブリダイゼーションに
よるＲＮＡ検出によって細胞材料中の２ないし４種の異なるＲＮＡの検出が可能
であり、これもまた時間分解蛍光によって６ないし１２の異なるＲＮＡの検出へ
と拡張することができる。

【０００３】より多数のタンパク質またはＲＮＡの同時細胞学的検出を可能にする鋭敏な方
法への需要がある。理論的には、２０ないし５０の異なるタンパク質（またはＲ
ＮＡ）種の濃度の同時測定は、正常な発育、病期、薬物治療または遺伝子療法へ
の反応における、または環境曝露もしくはその他の故意もしくは偶然の介入の結
果としての、動的細胞プロセスの特定の状態に関して、多大な情報を与えるに相
違ない。

【０００４】比較的多数のタンパク質の存在および濃度を同時に測定することによる細胞の
研究（proteomicsと称する）は、現在、極めて時間のかかる仕事である。多数の
タンパク質の発現を研究するためには、二次元（２Ｄ）ゲル電気泳動が最も有効
な手段であるが、この技術はin situ細胞分析には容易に適合させることができ
ない。典型的には、１回の２Ｄゲル分析を実施するために数千の細胞が必要であ
る。不均質な組織試料中の異なるタンパク質発現プロフィールを明らかにするた
めには、少数の細胞で発現されるタンパク質を分析する能力が必要となるであろ
う。この能力は、異形成または前悪性細胞を有するかも知れない組織学的または
細胞学的標本の分析に最も関連している。癌の生長に先行し得るこのような細胞
は、それらが腫瘍を生ずる機会を得る前に、１０ないし５０細胞の小病巣として
存在している時に同定する必要がある。あいにく１０ないし５０の細胞から得ら
れるタンパク質の量は２Ｄゲル分析にとっては不充分であり、当該タンパク質を
標識するための放射性同位元素の使用をもってしても問題をはらんでいる。

【０００５】質量分析はタンパク質分析にとって有効なもう一つの技術である。しかしなが
ら、少数の細胞を含む試料中に存在するタンパク質の直接分析は、感度が不充分
であるため、従来の質量分析技術では不可能である。従来技術を用いる組織試料
の質量分析には最低１００００の細胞が必要である。

【０００６】マイクロアレーハイブリダイゼーション実験の分析のための現行法は、二色信
号読み出し系の使用に依拠している。例えば、Schena M、Shalon D、Davis R W
、Brown P O(1995)の相補的ＤＮＡマイクロアレーによる遺伝子発現パターンの
定量的監視（Science 270:467-70）は、一つの組織から調製したｃＤＮＡを色素
ｃｙ３で標識し、別の組織由来のｃＤＮＡを色素ｃｙ５で標識する実験を記載し
ている。標識化反応を行った後、標識された２種のＤＮＡを混合し、表面にｃＤ
ＮＡマイクロアレーを含んでいるガラススライド表面に接触させることによりハ
イブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション反応の終了時にこのマイクロアレ
ー表面を洗浄して非ハイブリダイズ材料を除去し、ｃｙ３とｃｙ５の蛍光強度を
別々に記録するよう設計された共焦点スキャン装置でガラススライドをスキャン
し、これを２個の異なるコンピューターファイルに保存する。次いでコンピュー
ターソフトウェアを用いてｃｙ５に対するｃｙ３の蛍光比をＤＮＡマイクロアレ
ー上の特定のドットアドレスの各々について算出する。この実験計画は、二つの
試料間のｍＲＮＡ発現比の比較を行うためには非常に有効である。

【０００７】 Gygi S P、Rist B、Gerber S A、Turecek F、Gelb M H、Aebersold R(1999)の
、アイソトープでコードされた親和標識を使用する複雑なタンパク質混合物の定
量分析（Nature Biotechnology 17:994:999）は、生体由来の複雑な混合物の中
の個別タンパク質の正確な定量および同時配列決定へのアプローチを記載してい
る。この方法は、アイソトープによりコードされた親和標識（ＩＣＡＴ）と呼称
される一群の新しい化学試薬およびタンデム質量分析に基づいている。これらの
著者は、二つの異なった実験状態の生物からタンパク質を抽出し、この二つの総
タンパク質の調製物の各々を、異なる質量を有する二つの異なるチオール反応性
ＩＣＡＴ標識で標識した。二つの標識タンパク質調製物を混合し、液体クロマト
グラフィーで分離し、質量分析によりオンラインで検出した。各々の個別タンパ
ク質ピークについて、質量分析により、タンパク質の同定と、２種のタンパク質
の量の割合の測定が可能となった。

【０００８】先駆的業績として、EkinsおよびChu(Ekins,R.P.およびChu,F.W.(1991)の多被
検体マイクロスポットイムノアッセイ−将来の微量分析「コンパクトディスク」
、Clinical Chemistry 37:1955-1967；Ekins,R.P.およびChu,F.W.(1994)の多検
体検定の開発、Trends in Biotechnology 12:89-94)は、相異なる特異抗体をマ
イクロスポットのアレーとして表面に被覆し、続いて抗原混合物を含有する複雑
な試料をこのアレーに結合させ、第二の抗体を使用して検出する検定を記載した
。この多重検定では、各アドレスに存在する信号が、試料中に存在する多数の抗
原の各濃度を示すものとして働く。著者は、これらのマイクロアレーは、平方セ
ンチメートル当たり１００００もの抗体のマイクロスポットを含むことができる
と示唆している。

【０００９】ところが、上記の方法を包含する全ての現存するマイクロアレー法の重大な限
界は、１回のマイクロアレー実験で６ないし８個以上の試料を分析できないとい
うことである。蛍光色素を検出に使用するとすると、７種以上の色素を使用する
場合には複数の色素のスペクトルの部分重複の問題がある。増幅不可能な質量標
識を使用する場合には、マイクロアレーの各抗体スポットに結合するタンパク質
分子の総数が比較的少ないという事実のため（典型的には、単純な二試料実験で
スポット当たり２００００ないし１００００００のタンパク質分子。多試料実験
ではさらに少ない）、質量分析検出工程の感度が不充分となる。

【００１０】故に、単一試料または一群の試料中の多数の異なる被検体を間接的に検出でき
る方法を提供することが、本発明の一つの目的である。

【００１１】故に、単一試料または一群の試料中の多数の異なるタンパク質を間接的に検出
できる方法を提供することが、本発明のもう一つの目的である。

【００１２】単一試料または一群の試料中の多数の異なるｍＲＮＡを間接的に検出できる方
法を提供することが、本発明のもう一つの目的である。

【００１３】単一試料または一群の試料中の多数の被検体の修飾状態を間接的に検出する方
法を提供することが、本発明のもう一つの目的である。発明の簡単な要約１回の検定で試料中の多数の被検体を検出する方法が開示される。この方法は
、信号を有する標的分子をコード化し、その後このコード化された信号を解読（
デコード）することに基づくものである。このコード化／解読は、或る標的分子
の検出を、その標的分子の化学的および物理的性質から切り離す。基本的形態に
おいて、開示された方法は、１またはそれ以上のレポーター分子と１またはそれ
以上の標的試料の結合、１またはそれ以上の解読タグおよびレポーター分子の結
合、ならびに解読タグの検出を含んでいる。レポーター分子は標的試料中の標的
分子と結合する。一般に、レポーター分子は１またはそれ以上の標的分子に対応
し、解読タグは１またはそれ以上のレポーター分子に対応する。したがって、特
定の解読タグが検出されるということは、対応するレポーター分子の存在を示す
。一方、特定のレポーター分子の存在は、対応する標的分子の存在を示す。

【００１４】この間接的な検出は、本質的に任意の化学的および物理的性質を有し得る解読
タグを挿入することにより、標的分子を、この標的分子の化学的および物理的性
質から切り離す。特に、解読タグは、検出にとって有用な特異的性質を有するこ
とができ、また、或る検定内部の解読タグは、互いに極めて秩序だった、または
組織化した関係を有することができる。検出時点で重要となるのは、（それらを
そのまま採用した場合の）標的分子の性質ではなく、解読タグの（自由に選択さ
れた）性質である。

【００１５】解読タグは、レポーター分子の標的分子特異的側面から切り離されているとい
うさらなる利点を有する。標識された分子を被検体に結合させ、その後この標識
を検出するという検出法とは異なり、開示された方法は、標識された分子の化学
的および物理的性質による限定を受けない。この事によって、より簡便な検出、
より鋭敏な検出、そしてより高度に多重化した検出計画が可能となる。

【００１６】開示された方法の感度は、検出前に信号増幅工程を含めることによって増強す
ることもできる。基本的形態において、増幅は、レポーター分子上のレポーター
信号を増幅することによって達成する。この事は、各々のレポーター分子に多数
のレポータータグが結合することをもたらす。次いで解読タグをレポータータグ
に結合させ、検出する。一般に、解読タグは１またはそれ以上のレポータータグ
に対応し（したがって、レポータータグが結合しているレポーター分子に対応す
る）、レポータータグはそれらが結合しているレポーター分子に対応する。した
がって、特定の解読タグの検出は、対応するレポータータグの存在を示す。一方
、特定のレポータータグの存在は、対応するレポーター分子の存在を示す。また
、特定のレポーター分子の存在は、対応する標的分子の存在を示す。レポーター
分子はさらに、多数のレポータータグを含むよう設計することもできる（本質的
には信号の検定前増幅を達成する）。

【００１７】開示された方法の一つの形態において、１またはそれ以上の標的試料と１また
はそれ以上のレポーター分子とを接触に至らせ、レポーター分子を標的試料中の
標的分子と結合するようにさせる。次いでこのレポーター分子を増幅して、各々
のレポーター分子のための多数のレポータータグを生成する。レポータータグは
レポーター分子と結合したままである。次いで１またはそれ以上の解読タグがレ
ポータータグと結合し、この解読タグが検出される。解読タグはレポーター分子
に対応し、レポーター分子は標的分子に対応する。この関係は、解読タグの検出
が、検出された解読タグに対応するレポーター分子の存在を示し、そしてレポー
ター分子の存在が標的分子の存在を示すことを意味する。

【００１８】開示された方法のもう一つの形態では、４またはそれ以上の標的試料と１また
はそれ以上のレポーター分子と接触に至らせ、レポーター分子を標的試料中の標
的分子と結合するようにさせるものである。各々の標的試料を異なる組のレポー
ター分子と接触させるが、レポーター分子の各組中のレポーター分子は、他の組
のレポーター分子中にあるレポーター分子とは異なっている。次に４またはそれ
以上の標的試料を混合し、１またはそれ以上の解読タグをレポーター分子と結合
させ、解読タグを検出する。相違する解読タグは相違する各レポーター分子に対
応し、その結果、各解読タグは標的試料のうちただ１個と対応する。この関係は
、解読タグの検出が、検出された解読タグに対応する標的分子の存在を示すこと
を意味する。さらに、相違する標的試料に対応する解読タグの検出は、対応する
標的試料中の同一の標的分子の存在を示す。

【００１９】開示された方法の別の形態では、１またはそれ以上の標的試料と１またはそれ
以上のレポーター分子とを接触させ、レポーター分子を標的試料中の標的分子と
結合するようにさせる。次いで１またはそれ以上の解読タグをレポーター分子と
結合させる。相違する解読タグは相違するレポーター分子の各々に対応し、解読
タグはレポーター分子に共有結合していない。次にこの解読タグを、レポーター
分子から分離することによって検出する。解読タグはレポーター分子に対応し、
レポーター分子は標的分子に対応する。この関係は、解読タグの検出が、検出さ
れた解読タグに対応するレポーター分子の存在を示し、レポーター分子の存在が
、レポーター分子に対応する標的分子の存在を示すことを意味する。

【００２０】開示された方法のもう一つの形態においては、１またはそれ以上の標的試料と
１またはそれ以上のレポーター担体とを接触に至らせる。レポーター担体は１ま
たはそれ以上の特異的結合分子、担体、および、担体に結合した多数の解読タグ
を包含する。レポーター担体がレポーター分子に結合した後、解読タグを検出す
る。解読タグはレポーター担体に対応し、レポーター担体は標的分子に対応する
。この関係は、解読タグの検出が、検出された解読タグに対応するレポーター担
体の存在を示し、レポーター担体の存在が、レポーター担体に対応する標的分子
の存在を示すことを意味する。

【００２１】好ましい態様において、標的分子、レポーター分子、および解読タグ間の１対
１対１対応が用いられる。このようにして、異なる型の標的分子の各々が、それ
に結合した、異なる、そして別個に検出可能な解読タグで終わる。特異的結合分
子とレポーター信号との組み合わせは、異なる標的分子（ここで、標的分子は化
学的に極めて多岐にわたっているかも知れない）を標準化された信号（レポータ
ー信号）へと効率的に変換する結果をもたらす。次いでこれらの標準化された信
号（これらは各標的分子をコード化している）を、一組の標準化条件を用いて検
出する（この間コード化が進められる）。コード化された信号（即ち、解読タグ
）の検出は、１回の検定で、効率的で簡便な多数の標的分子の検出をもたらす。

【００２２】解読タグは任意の適当な技術を用いて検出することができる。一般に、解読タ
グの性質は、選択された検出技術に対合または適合するように選ばれる。好まし
い態様において、開示された方法は、被検体についての空間的情報が集まるよう
な迅速検出技術を使用する。一つの例は、マトリックス支援レーザー脱着／電離
飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析および電気泳動（好ましくは顕微解剖
と共に使用）である。このような技術は、自動化および多数の試料および検定の
迅速なスループットが可能である。

【００２３】この、開示された方法は、組織顕微鏡標本中のタンパク質およびその他の被検
体の研究への多重アプローチを可能にする。免疫蛍光に比較して、この開示され
た方法は、多重化のための可能性が大きく増大している。本方法はまた、in sit
u ｍＲＮＡプロファイリングにも有用である。開示された方法は、多数の異なっ
たタンパク質の間接的検出を可能にする（例えば２０ないし５０。利用できる特
異抗体の数にのみ制限される）。

【００２４】この方法の医学適用には、細胞の表現型の状態（増殖または休止）の分析、な
らびに正常および病態の組織学的または細胞学的標本中の正常および腫瘍性細胞
の評価が包含される。例えば、病理学者は、この方法を使用して、或る表現型の
状態を、悪性または前悪性細胞を含むと思われる病変のタンパク質プロファイル
と結び付けることができる。発明の詳細な説明異なる標的分子の濃度を検定で同定し測定するための、特異的信号解読技術を
用いる方法が開示される。この方法は特に、プレート、表面、スライド、および
ビーズといった基質上で実施される検定にとって有用である。この方法は、細胞
または組織に存在する巨大分子の被検体の検出にとりわけ適している。例えば、
開示された方法は、細胞または組織試料中の特定の被検体に関連する表現型の状
態にとって有用である。

【００２５】開示された方法の、一つの形態は、各々の被検体の特異的認識、当該認識事象
の増幅、および増幅された信号の検出に基づいている。特異的認識は、問題の被
検体に特異的に結合またはその他の方法で相互作用する、特異的結合分子を用い
て達成する。この相互作用の増幅は、特異的結合分子にカップリングし、係留さ
れ、またはその他の方法で付着したレポーター信号によって仲介される。レポー
ター信号に（したがって特異的結合分子および被検体にも）結合し続ける多数の
レポータータグの産生に使用されるのは、レポーター信号、オリゴヌクレオチド
である。これは、レポーター信号の増幅によって、またはレポーター信号への分
岐ＤＮＡもしくはオリゴヌクレオチドデンドリマーのハイブリダイゼーションに
よって達成する。次いで、明確な、個別検出可能な属性を含むようコードされて
いる検出標識を、レポータータグにハイブリダイズさせる。様々な検出標識の検
出は、試料中の種々の被検体の間接的検出をもたらす。

【００２６】開示された方法において、多コピーのオリゴヌクレオチド（レポータータグと
呼ばれる）を生成することのできる信号増幅系を用いて、多数の被検体（これは
、タンパク質、核酸分子、または特異的に認識され得るその他の分子であってよ
い）を検定するが、ここでは、レポーター分子を、固体表面の特異的部位、具体
的には、被検体が位置する部位に、物理的につなぎ、または該部位と結合させる
。このような信号増幅系の一例は、分岐ＤＮＡである（Urdea、Biotechnology 1
2:926-928(1994)；Horn等、Nucleic Acids Res 23:4835-4841(1997)）。

【００２７】好ましい態様において、異なる配列および分子量のペプチド核酸（ＰＮＡ）分
子（Hanvey等、Science 258:1481-1485(1992)）を、ユニークなレポータータグ
に特異結合する任意の解読タグとして使用する。細胞学的試料の特異的領域に出
現するレーザー吸収を使用して、このＰＮＡ標識のマトリックス支援レーザー脱
着／電離飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量スペクトルを生成させ、これを分
光計内部に放出して質量分析により解析する。各ＰＮＡ解読タグの強度は、異な
るＤＮＡレポーターの相対量を示す。換言すると、ＰＮＡスペクトルは、ガラス
表面上の特定の位置にある、問題の被検体の相対量の間接的な指標である、スカ
ラー値を生成する。

【００２８】タンパク質検出のためには、例えば、好適なレポーター分子は、ＤＮＡオリゴ
ヌクレオチド（レポーター信号）に共有結合した特異抗体（特異的結合分子）を
包含する。各々の抗体は、問題となるタンパク質抗原に対し特異的である。共有
結合したオリゴヌクレオチドは、抗体を同定する働きをし、さらに、増幅された
、表面に局在するＤＮＡを含む信号を生成する働きをする、特異的ＤＮＡ配列を
包含する。増幅されたＤＮＡの、表面局在ＤＮＡ信号の一例は、Urdea、Biotech
nology 12:926(1994)、およびHong等、Nucleic Acids Res 23:4835-4841(1997)
に記載の分岐ＤＮＡ技術である。表面局在ＤＮＡ信号の別の例は、ローリングサ
ークル複製系によって生成されるタンデム反復ＤＮＡである（Lizardi等、Natur
e Genetics 19:225-232(1998)；Lizardiの米国特許第５８５４０３３号；ＰＣＴ
出願第ＷＯ９７／１９１９３号）。分岐ＤＮＡを増幅に使用する場合、各々の抗
体に結合しているＤＮＡオリゴヌクレオチドは、分岐ＤＮＡ構造の形成を開始す
る働きをする。これとは別に、各々の抗体に結合したＤＮＡオリゴヌクレオチド
は、（例えばプライマーとして働くことにより）ローリングサークル複製を開始
し、抗体結合の部位に局在し続ける大きなタンデムＤＮＡ分子を生成する働きを
することができる。

【００２９】多電気泳動タグ検定（ＭＥＴＡ）と呼ばれる別の態様においては、配列がコー
ド化され、大きさがコード化され、そして蛍光標識されている検出タグが、毛細
管電気泳動によって検出される。レーザー誘導蛍光とカップリングさせた毛細管
電気泳動は、異なる解読タグの定量的プロファイルの作製に使用される。各々の
蛍光ピーク強度は、各々の異なる解読タグの相対量を明らかにする。換言すると
、異なる解読タグのピークサイズは、試料中の問題の被検体の相対量を間接的に
指示するスカラー値である。材料レポーター分子レポーター分子は、特異的結合分子をレポーター信号と結び付ける分子である
。好ましくは、特異的結合分子およびレポーター信号は共有結合し、または互い
に係留されている。本明細書中で用いられる分子は直接または間接的に共有結合
する時カップリングする。間接的カップリングの一つの形態は、リンカー分子を
介するものである。レポーター信号は、確立された幾つかのカップリング反応の
いずれかにより、特異的結合分子にカップリングすることができる。例えば、He
ndrickson等、Nucleic Acids Res.、23(3)522-529(1995)は、オリゴヌクレオチ
ドを抗体にカップリングする好適な方法を記載している。

【００３０】本明細書で用いられる分子は、当該分子のうち１個の（またはこれに由来する
）ループが、別の分子の（またはこれに由来する）ループを通り抜けている時、
別の分子に係留されていると言う。この二つの分子は、それらが係留されている
時は共有結合によりカップリングしていない。係留は、マグカップの持ち手の穴
に通されている閉じたループの紐になぞらえることにより思い浮かべることがで
きる。一般に、係留は、片方または両方の分子がそのループの周りを自由に回転
できるように設計する。特異的結合分子特異的結合分子は、特定の分子または部分と特異的に相互作用する分子である
。特異的結合分子と特異的に相互作用する分子または部分は、本明細書中、標的
分子と称する。標的分子という語は、個別の両分子、ならびに特異的結合分子と
特異的に相互作用する、係る分子の一部、例えばタンパク質のエピトープを指す
ことが理解されるべきである。抗体、レセプター／リガンド対のいずれかの成員
、合成ポリアミド類（Dervan,P.B.およびR.W.Burli、ポリアミドによる配列特異
的ＤＮＡ認識、Curr Opin Chem Biol、1999、3(6):688-93頁。Wemmer,D.E.およ
びP.B.Dervan、ＤＮＡの小溝の標的化、Curr Opin Struct Biol、1977、7(3);35
5-61頁）、および特異的結合親和性を有するその他の分子が、レポーター結合分
子の親和部分として有用な特異的結合分子の例である。

【００３１】特定の標的分子と特異的に相互作用する特異的結合分子は、その標的分子に対
し特異的であると言われる。例えば、特異的結合分子が特定の抗原に結合する抗
体である場合、この特異的結合分子はその抗原に対し特異的であると言われる。
この抗原が標的分子である。特異的結合分子を含むレポーター分子もまた、特定
の標的分子に対し特異的であると言われる。特異的結合分子は好ましくは抗体、
リガンド、結合タンパク質、レセプタータンパク質、ハプテン、アプタマー、炭
水化物、合成ポリアミド類、またはオリゴヌクレオチドである。好ましい結合タ
ンパク質はＤＮＡ結合タンパク質である。好ましいＤＮＡ結合タンパク質はジン
クフィンガーモチーフ、ロイシンジッパーモチーフ、ヘリックス・ターン・ヘリ
ックスモチーフである。これらのモチーフは、同一の特異的結合分子中に合する
ことができる。

【００３２】レポーター結合因子の親和部分として有用な抗体は、市販品が入手可能である
か、または充分に確立された方法を用いて作製することができる。例えば、John
stoneおよびThorpe、Immunochemistry In Practice(Blackwell Scientific Publ
ications、オクスフォード、イングランド、1987)30-85頁は、ポリクローナルお
よびモノクローナル抗体の両者を作製するのに有用な一般法を記載している。こ
の書物の全体に、検定系における抗体の使用のための一般的技術および原理が数
多く記載されている。

【００３３】ジンクフィンガー、ジンクフィンガーモチーフ、およびそれらの相互作用の性
質は、Nardelli,J.、T.GibsonおよびP.Charnay、ジンクフィンガー−ＤＮＡ認識
：位置特異的突然変異誘発による塩基特異性の分析、Nucleic Acids Res、1992
、20(16):4137-44頁、Jamieson,A.C.、S.H.Kim、およびJ.A.Wells、変化したＤ
ＮＡ結合特異性を用いるジンクフィンガーのインビトロ選択、Biochemistry、19
94、33(19):5689-95頁、Chandrasegaran,S.およびJ.Smith、キメラ制限酵素：次
は何か？、Biol Chem、1999、380(7-8):841-8頁、ならびにSmith,J.、J.M.Berg
およびS.Chendrasegaran、キメラ制限酵素の基質特異性の詳細研究、Nucleic Ac
ids Res、1999、27(2):674-81頁に記載されている。

【００３４】特異的結合分子の一つの形態は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチ
ド誘導体である。係る特異的結合分子は特異的核酸配列のために設計され、それ
を検出するために使用される。したがって、オリゴヌクレオチド特異的結合分子
のための標的分子は核酸配列である。標的分子は、より大きな核酸分子の中にあ
るヌクレオチド配列であってもよい。オリゴヌクレオチド特異的結合分子はレポ
ーター結合プローブと標的分子との特異的且つ安定なハイブリダイゼーションを
支持する任意の長さとすることができる。この目的のためには１０ないし４０の
ヌクレオチド長が好ましく、１６ないし２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチ
ド特異的結合分子が最も好ましい。オリゴヌクレオチド特異的結合分子はペプチ
ド核酸であることが好ましい。ペプチド核酸はＤＮＡと安定なハイブリッドを形
成する。この事により、その後の増幅および検出操作の間、ペプチド核酸特異的
結合分子が標的配列に強固に付着し続ける。

【００３５】この有用な効果は、Gasparro等、Nucleic Acids Res. 1994 22(14):2845-2852
(1994)に記載の三重らせん化学結合技術を利用することによる、オリゴヌクレオ
チド特異的結合分子を用いて得ることもできる。簡潔に述べると、このオリゴヌ
クレオチド特異的結合分子は、標的配列にハイブリダイズした時に三重らせんを
形成するよう設計する。一般に知られているように、これは、好ましくは主とし
てホモプリンまたは主としてホモピリミジン標的配列のいずれかを選択すること
によって達成される。特異的結合分子を構成する、対合するオリゴヌクレオチド
配列は、選択された標的配列に相補的であり、したがって、それぞれ主としてホ
モピリミジンまたは主としてホモプリンである。特異的結合分子（Gasparro等に
より記載された三重らせんプローブに相当する）は、化学的に連結したソラレン
誘導体を含んでいる。標的配列へのレポーター結合プローブのハイブリダイゼー
ションの際、三重らせんが形成される。この三重らせんを低波長紫外線に暴露す
ることにより、ソラレン誘導体が標的配列へのプローブの架橋を仲介する。レポーター信号レポーター信号は、レポーター分子の一部を形成し、レポーター分子の増幅ま
たは検出を可能にする分子または部分である。レポーター信号は、それらの信号
の増幅または解読タグへの結合のいずれかを可能にする任意の構造を有し得る。
１個のレポーター信号は１個の信号である。この１個の信号の増幅が多数の信号
（これがレポータータグと呼ばれる）の生成をもたらす。本明細書の他の箇所で
論ずるように、この増幅は、レポーター信号の実際の増幅（即ち、複製）を包含
するが、これに限定される訳ではない。好ましくは、レポーター信号は、ハイブ
リダイゼーション相手（例えば分岐ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドデンドリマ
ーをプローブと結合させる）として、またはＤＮＡ合成プライマーとしての働き
をするよう設計される。

【００３６】或る態様において、レポーター信号はオリゴヌクレオチドであり、分岐ＤＮＡ
分子またはオリゴヌクレオチドデンドリマーのテールに対するハイブリダイゼー
ション相手として働く配列を含む。プローブ配列の配列は任意に選択できる。同
一の検定において多数のオリゴヌクレオチドレポーター分子が使用される場合（
通常の状況）、各レポーター分子のためのレポーター信号配列は、標的の非特異
的検出の可能性を限定するため、実質上異なっていることが好ましい。

【００３７】別の態様において、レポーター分子のオリゴヌクレオチド部分は増幅標的サー
クル（ＡＴＣ）のためのローリングサークル複製プライマーとして働く、ローリ
ングサークル複製プライマー配列と呼ばれる配列を含んでいる。これは、加えら
れたＡＴＣのローリングサークル複製を可能にし、ここでは、得られるタンデム
配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）がレポーター分子にカップリングする。このため、
ＴＳ−ＤＮＡは標的分子の部位に効果的に固定化される。ローリングサークル複
製プライマー配列の配列は任意に選択できる。多数のレポーター分子を使用する
多重検定では、各レポーター分子のためのローリングサークル複製プライマー配
列は、標的の非特異的検出の可能性を限定するため、実質上異なっている。レポ
ーター分子のレポーター信号をローリングサークル複製プライマーとして使用す
る場合、このレポーター信号は、レポーター信号と増幅標的サークルのプライマ
ー相補性部分との特異的且つ安定なハイブリダイゼーションを支持する任意の長
さとすることができる。一般にこれは１０ないし３５ヌクレオチド長、好ましく
は１６ないし２０ヌクレオチド長である。

【００３８】別の態様において、レポーター分子のレポーター信号は、ローリングサークル
複製のための鋳型としての働きをする増幅標的サークルを含むことができる。Ａ
ＴＣの複製は、レポーター分子が標的分子に結合する部位にＴＳ−ＤＮＡを生成
する。この目的のため、ＡＴＣは、係留ループの周囲をＡＴＣで囲むことにより
特異的結合分子に係留されねばならない。これにより、ローリングサークル複製
の間、ＡＴＣは親和部分にカップリングしつつ自由に回転することができる。係
留ループは、ループを形成し且つ特異的結合分子にカップリングすることのでき
る任意の物質とすることができる。例えば、係留ループに直線状ポリマーを使用
することができる。

【００３９】増幅標的サークル（ＡＴＣ）は環状一本鎖ＤＮＡ分子であって、一般に４０な
いし１０００のヌクレオチド、好ましくは約５０ないし１５０のヌクレオチド、
最も好ましくは約５０ないし１００のヌクレオチドを含んでいる。ＡＴＣの一部
は、ＡＴＣをローリングサークル増幅（ＲＣＡ）にとって有用とする特異的機能
を有する。これらの部分は、プライマー補足部分およびレポータータグ部分と呼
ばれる。プライマー相補性部分およびレポータータグ部分は、増幅標的サークル
の必要要素である。ＡＴＣの特異的部分に対応しないＡＴＣのセグメントは、任
意に選択される配列であってよい。ＡＴＣは自己相補的ないかなる配列も持たな
いことが好ましい。ミスマッチまたはギャップの無い６ヌクレオチド以上の長さ
の相補的領域が無いならば、この条件を満たすと考えられる。

【００４０】増幅標的サークルは、複製された時、増幅標的サークルに対し相補的な配列の
多数反復を含む長いＤＮＡ分子を生ずる。この長いＤＮＡ分子は、本明細書にお
いてタンデム配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）と称する。ＴＳ−ＤＮＡは、プライマ
ー相補性部分およびレポータータグ部分に相補的な配列を含んでいる。ＴＳ−Ｄ
ＮＡ中のこれらの配列は、プライマー配列（これはローリングサークル複製プラ
イマーの配列と対合する）およびレポータータグと呼ばれる。増幅標的サークル
およびそれらの用途は、米国特許第５８５４０３３号にさらに記載されている。
レポータータグレポータータグは、本開示方法におけるレポーター分子の信号増幅の間に生成
され、解読タグが結合する分子または部分である。レポータータグは、解読タグ
結合に対する標的として役立ちうるあらゆるタイプの分子または部分でありえる
。レポータータグは、好ましくは増幅過程での生成物であるが、しかしその必要
性はない。例えば、多レポータータグはあらゆる望ましいやり方において合成で
きると共に、全部一緒にレポーター分子と結合することができる（この結果レポ
ーター分子の信号の「増幅」に影響を及ぼす）。好ましいレポータータグは、オ
リゴマー、オリゴヌクレオチド、または核酸配列である。

【００４１】オリゴマーレポータータグのオリゴマー塩基配列には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾
ＲＮＡまたはＤＮＡ、ペプチド核酸、メチルホスホネートＤＮＡ、および２’−
Ｏ−メチルＲＮＡまたはＤＮＡなどの修飾主鎖ヌクレオチド−様オリゴマーが挙
げられる。オリゴマーまたはオリゴヌクレオチドレポータータグはあらゆる任意
の配列を有することができる。唯一つの必要条件は復合標識との結合である（好
ましくはハイブリダイゼーションによる）。本開示方法において、多レポーター
タグは、単一レポーター信号（特異的結合性分子を介して標的分子と結合する）
と結合することになる。これらの多レポータータグの状況は信号増幅のために用
いられる技術に応じて決まる。このように、分岐ＤＮＡが用いられる場合、分岐
ＤＮＡ分子は分岐上に多レポータータグを包含する。オリゴヌクレオチドデンド
リマーが用いられる場合、レポータータグはデンドリマーの枝の上にある。ロー
リングサークル複製が用いられる場合、多レポータータグは増幅標的サークル配
列の相補体（少なくともレポータータグ配列の一つの相補体を含む）のタンデム
反復から生じる。この場合に、レポータータグはタンデム配列ＤＮＡ中にタンデ
ム反復する。

【００４２】オリゴヌクレオチドレポータータグは、それぞれ、レポータータグおよび解読
タグ間の特定の安定なハイブリダイゼーションを支持するあらゆる長さでありえ
る。この目的のために、１０〜３５ヌクレオチド長が好ましく、レポータータグ
は１５〜２０ヌクレオチド長が最も好ましい。

【００４３】本開示方法における使用のための分岐ＤＮＡは一般に知られる（Ｕｒｄｅａ，
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２：９２６〜９２８（１９９４）、およびＨｏ
ｒｎｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ２３：４８３５〜
４８４１（１９９７））。本明細書において用いられる分岐ＤＮＡ分子のテール
は、レポーター信号と相互作用するように設計された分岐ＤＮＡ分子の一部を指
す。一般に、各分岐ＤＮＡ分子は唯一つのテールを有するべきである。分岐ＤＮ
Ａの分岐（本明細書において分岐ＤＮＡの枝とも呼ばれる）はレポータータグ配
列を含有する。オリゴヌクレオチドデンドリマー（またはデンドリマーＤＮＡ）
も一般に知られる（Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄｓＲｅｓ．２５：４４４７〜４４５４（１９９７）、およびＯｒｅｎｔ
ａｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ７７：１５３〜１６３
（１９９９））。本明細書において用いられるオリゴヌクレオチドデンドリマ
ーのテールは、レポーター信号と相互作用するように設計されたデンドリマーの
一部を指す。一般に、各デンドリマーは唯一つのテールのみを有するべきである
。デンドリマーのデンドリマー鎖は、本明細書においてオリゴヌクレオチドデン
ドリマーの枝と呼ばれ、レポータータグ配列を含有する。解読タグ解読タグは、直接または間接にレポーター分子と結合できると共に、特異的に
検出することができるあらゆる分子または部分である。特に、個別の解読タグは
検出の際に識別可能であるべきである。解読タグは、好ましくは、オリゴヌクレ
オチド、炭水化物、合成ポリアミド、ペプチド核酸、抗体、リガンド、タンパク
質、ハプテン、ジンクフィンガー、アプタマー（aptamers）、または質量ラベル
である。

【００４４】好ましい解読タグは、特異的にオリゴヌクレオチドレポータータグにハイブリ
ダイゼーションすることが可能である分子である。最も好ましいのはペプチド核
酸解読タグである。オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸解読タグはあらゆる
任意の配列を有することができる。唯一つの必要条件はレポータータグへのハイ
ブリダイゼーションである。解読タグは、それぞれ、レポータータグおよび解読
タグ間の特定の安定なハイブリダイゼーションを支持するあらゆる長さでありえ
る。この目的のために、１０〜３５ヌクレオチド長が好ましく、レポータータグ
は１５〜２０ヌクレオチド長が最も好ましい。

【００４５】解読タグはあらゆる適する検出技術を用いて検出することができる。多くの分
子検出技術が知られ、本開示方法において用いることができる。例えば、解読タ
グは核磁気共鳴、電子常磁性共鳴、表面増強ラマン散乱、表面プラズモン共鳴、
蛍光、燐光、化学発光、共鳴ラマン、マイクロ波、質量分光器、またはこれらの
あらゆる組合せにより検出することができる。解読タグは質量分光器、電気泳動
、またはクロマトグラフィにより、分離および／または検出することができる。
解読タグは個別の蛍光、燐光、または化学発光放射寿命を介して時間的に識別す
ることができる。解読タグの組成および特性は、選択された検出方法に合致され
るべきである。

【００４６】解読タグは、好ましくは、飛行時間型（ＴＯＦ）質量分光分析法により分離し
、識別する（解読する）ために、マトリックス支援レーザー脱着／電離飛行時間
質量分析法（ＭＡＬＤＩ）により放出させるか、または電気泳動をさせることが
可能である。解読タグはレポータータグにハイブリダイゼーションできるあらゆ
るオリゴマー分子であることが可能である。例えば、解読タグはＤＮＡオリゴヌ
クレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）分子で
ありえる。本発明の好ましい解読タグはＰＮＡ分子である。

【００４７】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ検出のために、解読タグは、好ましくはペプチド核酸であ
り、各解読タグは分離および質量分光分析法における個別の検出を可能とする個
別の質量を有する。この目的のために、各解読タグはレポータータグに相補的な
同様の数のヌクレオチド塩基を有することが好ましい。これは質量が変ることを
可能とする一方で、さらに一致したハイブリダイゼーション特性を可能とする。
多標識分析において解読タグのセット用の質量スペクトルを最適化するために、
塩基組成および質量標識数（例えば、ＰＮＡに結合した８−アミノ−３，６−ジ
オキサオクタノイックモノマー数（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｔ．Ｊ．，Ｗ．Ｔａｎｇ，
ａｎｄＬ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｂｙｐｅｐ
ｔｉｄｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄａｆｆｉｎｉｔｙＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９
９７．１５（１２）：ｐ．１３６８〜７２））の組合せを用いることも好ましい
。

【００４８】毛細管電気泳動検出のために、解読タグは、好ましくは、各解読タグが長さお
よび蛍光ラベルの異なる組合せを有する蛍光ラベル化オリゴヌクレオチドである
。この目的のために、各解読タグはレポータータグに相補的な同じ数のヌクレオ
チドを有することが好ましい。各解読タグがレポータータグに相補的でない個別
の数のヌクレオチドを有することも好ましい。これは電気泳動の間で個別の解読
タグの分離を可能とする一方で、さらに一致したハイブリダイゼーション特性を
可能とする。レポーター担体レポーター担体は１以上の特異的結合性分子、担体、および複数の解読タグの
結合体である。レポーター担体は、ごく多くの解読タグを標的分子と結合させる
ために、本開示方法において用いられる。担体は多くの解読タグと特異的結合性
分子との結合を容易にするあらゆる分子または構造物でありえる。例には、リポ
ソーム、微粒子、ナノ微粒子、ビリオン（virions）、ファージミド（phagemids
）、および分岐ポリマー構造物が挙げられる。

【００４９】セレンはメチオニン中の硫黄と置換して、修飾アミノ酸セレンメチオニンをも
たらしうる。セレンウムは硫黄よりも約４７質量単位大きい。質量分光器は、特
定の比率でセレンメチオニンおよびメチオニンを包含するペプチドまたはタンパ
ク質を識別するために用いることが可能である。知られたセレン／硫黄比率を持
つ小さなタンパク質およびペプチドは、好ましくは、望ましい比率でのセレンメ
チオニンおよびメチオニンを包含する化学合成により生成される。より大きなタ
ンパク質またはペプチドは、大腸菌発現系、または望ましい比率でセレンメチオ
ニンおよびメチオニンを挿入するあらゆる他の発現系から副生成させることが可
能である（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，Ｗ．Ａ．，Ｊ．Ｒ．Ｈｏｒｔｏｎ，ａｎｄ
Ｄ．Ｍ．ＬｅＭａｓｔｅｒ，Ｓｅｌｅｎｏｍｅｔｈｉｏｎｙｌｐｒｏｔｅｉ
ｎｓｐｒｏｄｕｃｅｄｆｏｒａｎａｌｙｓｉｓｂｙｍｕｌｔｉｗａｖ
ｅｌｅｎｇｔｈａｎｏｍａｌｏｕｓｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ（ＭＡＤ）：ａｖｅｈｉｃｌｅｆｏｒｄｉｒｅｃｔｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．ＥｍｂｏＪ，
１９９０．９（５）：ｐ．１６６５〜７２、Ｃｏｗｉｅ，Ｄ．ａｎｄＧ．Ｃｏ
ｈｅｎ，ＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｂｙＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｏｆａｃｔｉｖｅａｌｔｅｒｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｃｏｎｔａｉｎｉ
ｎｇｓｅｌｅｎｉｕｍｉｎｓｔｅａｄｏｆｓｕｌｆｕｒ．Ｂｉｏｃｈｉ
ｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ，１９５７．２６：ｐ．２５
２〜２６１、およびＯｉｋａｗａ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｍｅｔａｌｌｏｓｅｌ
ｅｎｏｎｅｉｎ，ｔｈｅｓｅｌｅｎｉｕｍａｎａｌｏｇｕｅｏｆｍｅｔ
ａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒ
ｉｚａｔｉｏｎｏｆｉｔｓｃｏｍｐｌｅｘｗｉｔｈｃｏｐｐｅｒｉ
ｏｎｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１９９１．８８（８
）：ｐ．３０５７〜９．）。ビリオン微粒子、またはファージミド、または種々
のカプシドタンパク質、または特異的結合性分子の結合後のこれら固定セレン／
硫黄比率タンパク質またはペプチドを持つ集成体はレポーター担体の例である。
解読タグ（タンパク質またはペプチド）は、好ましくは、質量分光器（例えば、
マトリックス支援レーザー脱着・電離化、ＭＡＬＤＩ、質量分光器または第２イ
オン質量分光器、ＳＩＭＳ）により検出される。

【００５０】担体の一般的なクラスは薬剤送達のために設計された構造物および材料である
。多くのこうした担体は知られる。リポソームは担体の好ましい形態である。

【００５１】リポソームは主として燐脂質２分子層から成る人工構造物である。コレステロ
ールおよび脂肪酸も２分子層構造中に包含することが可能である。リポソームは
蛍光標識を装填し、特定の認識分子で外表面上を被覆することが可能である（Ｔ
ｒｕｎｃｈ，Ａ．，Ｍａｃｈｙ，Ｐ．ａｎｄＨｏｒａｎ，Ｐ．Ｋ．，１９８７
，Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂｅａｒｉｎｇｌｉｐｏｓｏｍｅｓａｓｍｕｌｔｉ
ｃｏｌｏｒｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｍａｒｋｅｒｓｆｏｒ
ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎｄｉｍａｇｉｎｇ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．Ｍｅｔｈｏｄｓ１００：５９〜７１）。しかし、バイオアッセイにおける蛍
光リポソームの使用は蛍光標識用の検出方法の制約により制限されてきた。蛍光
活性化細胞ソーターは一般に２または３の異なる励起−放出波長を有し、顕微鏡
は一般に３または４の励起−放出フィルターを有する。本開示方法のいくつかの
形態において、リポソームは任意の解読タグ用の担体として機能する。任意の標
識で装填されたリポソームレポーター担体をごく大きな多重度の標識を分離でき
る方法と組合せることにより、高度に多重使用されるアッセイを実施することが
可能となる。

【００５２】リポソーム、好ましくは単一層板状の小胞は、これら分子の化学的性質が予め
選択された検出方法により検出にうまく適した、ごく大きい数の（数千の）解読
タグ分子での内部分室の充填をもたらす確立された手順を用いて製造される。好
ましい検出方法および対応する任意の標識は以下の通りである：ａ）質量分光器
−オリゴペプチド標識；ｂ）電気泳動−ＤＮＡオリゴヌクレオチド標識；ｃ）液
体クロマトグラフィ−ＤＮＡ標識またはオリゴペプチド標識。従って、好ましく
は、一つの特定タイプの解読タグが各特定タイプのリポソーム−検出器用に用い
られる。

【００５３】各特定タイプのリポソームレポーター担体は特異的結合性分子と結合する。結
合は直接または間接であることが可能である。直接結合の例は、燐脂質２分子層
の表面上に共有結合された抗体を含有するリポソームである。代替の間接結合組
成物は、その表面上の任意配列の共有結合されたＤＮＡオリゴヌクレオチドを含
有するリポソームである；これらオリゴヌクレオチドは塩基相補性により特異的
なレポーター分子を認識するように設計される。レポーター分子は、それによっ
てこの複合体のＤＮＡ部分が特定的にリポソームレポーター担体上の相補配列と
ハイブリダイゼーションすることができる抗体−ＤＮＡ共有結合複合体を含むこ
とが可能である。このやり方で、リポソームレポーター担体は、間接にあらゆる
望ましい結合性分子と結合することが可能である一般薬剤となる。

【００５４】リポソームレポーター担体の使用は以下の実施例で説明することができる。

【００５５】１．リポソーム（好ましくは平均直径１５０〜３００ナノメーターの単一層板
状小胞）を押出し法を用いて製造する（Ｈｏｐｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｂａｌｌｙ，Ｍ．
Ｂ．，Ｗｅｂｂ，Ｇ．，ａｎｄＣｕｌｌｉｓ，Ｐ．Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃ
ａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ，１９８５，８１２：５５〜６５；
ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｒ．Ｃ．，ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｒ．Ｉ．，Ｍｅｎｃｏ，
Ｂ．，Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｋ．，Ｓｕｂｂａｒａｏ，Ｎ．，ａｎｄＨｕ，Ｌ
．ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ，１９９１，
１０６１：２９７〜３０３）。リポソーム製造の他の方法もまた用いることが可
能である。

【００５６】２．オリゴペプチド溶液を、リポソームの内部体積が特異的な対象検体の識別
をコード化−解読するのに役立つこの特定オリゴペプチドで装填されるように、
リポソーム製造の間４００マイクロモル濃度で用いる。内径２００ナノメーター
のリポソームは平均的に９６０のオリゴペプチド分子を含有する。リポソームの
別個の３調製品を押出し、それぞれを個別のオリゴペプチドで装填する。オリゴ
ペプチドは、それらそれぞれの質量がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光器により容易
に分離できるように選択される。

【００５７】３．３つのリポソーム調製品の外表面を、以下のように特定の抗体と接合させ
る：ａ）第１リポソーム調製品をｐ５３腫瘍抑制因子に特異的な抗体と反応させ
；ｂ）第２リポソーム調製品をＢｃＩ−２腫瘍タンパク質に特異的な抗体と反応
させ；ｃ）第３リポソーム調製品をＨｅｒ２／ｎｅｕ膜受容体に特異的な抗体と
反応させる。カップリング反応を、反応性アミノ基を包含する分子への抗体の共
有結合カップリング用の標準手順を用いて実施する（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，
Ｅ．Ｒ．，Ｈａｔｆｉｅｌｄ，Ｔ．Ｍ．，Ｊｏｅｒｇｅｒ，Ｒ．Ｄ．，Ｍａｊａ
ｒｉａｎ，Ｗ．Ｒ．，ａｎｄＥｖｅｒｓｏｌｅ，Ｒ．Ｃ．，１９９５，Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２３：５２２〜５２９；Ｈｅｒｍａ
ｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃ
ａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９９６，ｐｐ．５２８〜５６９；Ｓｃｈｅｆｆｏ
ｌｄ，Ａ．，Ａｓｓｅｎｍａｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｒｅｉｎｅｒｓ−Ｓｃｈｒａｍｍ
，Ｌ．，Ｌａｕｓｔｅｒ，Ｒ．，ａｎｄＲａｄｂｒｕｃｈ，Ａ．，２０００，
ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ１：１０７〜１１０）。リポソームの場合に
、反応性アミノ基はリポソームのホスファチジルエタノールアミン部分中に存在
するものである。

【００５８】４．標準ホルムアルデヒド−固定組織構造切片を担持するスライドガラスを、
リポソームの固定組織中に存在する対応タンパク質抗原への結合を可能とするた
めに、３０ｍMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍ
ＥＤＴＡ、０．１％ウシ血清アルブミンを含有する緩衝剤中に懸濁したすべての
３つのリポソーム調製品混合物と接触させる。１時間のインキュベーション後、
スライドを同じ緩衝剤（３０ｍMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１００ｍＭ塩化
ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ウシ血清アルブミン）で５分間にわたり
２回洗浄する。スライドを空気流で乾燥する。

【００５９】５．水中アセトニトリルの５０：５０混合物中の１０ｍｇ／ｍｌアルファ−シ
アノ−４−ヒドロキシ桂皮酸、０．１％トリフルオロ酢酸から成るマトリックス
溶液の薄い層でスライドを被覆する。スライドを空気流で乾燥する。

【００６０】６．スライドを、ＶｏｙａｇｅｒＤＥＰｒｏ機器（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ
ＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）の中に導入された
改造ＭＡＬＤＩプレートの表面上に置く。マシーンはイオン抽出遅れ時間２５０
ｎｓで陽イオン反射状態において運転する。

【００６１】７．質量スペクトルをスライド表面上の規定の位置から得る。コード化ポリペ
プチドの３ピークそれぞれの相対量を、リポソーム−検出器複合体により検出さ
れる抗原の相対比率を解読するために用いる。

【００６２】リポソーム担体方法は、組織構造切片上の検体の検出のみに限定されない。ソ
ート処理により得られる細胞も、本発明による分析のために用いることが可能で
ある（Ｓｃｈｅｆｆｏｌｄ，Ａ．，Ａｓｓｅｎｍａｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｒｅｉｎｅ
ｒｓ−Ｓｃｈｒａｍｍ，Ｌ．，Ｌａｕｓｔｅｒ，Ｒ．，ａｎｄＲａｄｂｒｕｃ
ｈ，Ａ．，２０００，ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ１：１０７〜１１０）
。標的試料あらゆる供給源からのあらゆる試料は本開示方法により用いることができる。
一般に、標的試料は標的分子を含有するか、または含有することが可能である試
料であるべきである。適する標的試料の例には、細胞試料、組織試料、細胞抽出
物、別の試料から精製された成分または留分、環境試料、培養物試料、組織試料
、身体流体、および生検試料が挙げられる。無数の他の試料供給源が知られ、ま
たは開発が可能であり、いずれもが本開示方法により用いることができる。本開
示方法による使用のための好ましい試料は細胞および組織の試料である。

【００６３】標的試料は複雑でも、簡単でも、またはその間のいずれであってもよい。例え
ば、標的試料は生体分子（例えば、組織試料）の複雑な混合物を含むことが可能
であり、標的試料は高度に精製されたタンパク質調製品、または単一タイプの分
子であることが可能である。標的分子は検出しようとするあらゆる分子または分
子の一部でありえる。従って、標的分子は物理的に分離された分子である必要は
ないが、しかしより大きな分子の一部であることは可能である。標的分子はまた
検体とも呼ばれる。捕獲アレー捕獲アレー（本明細書においてアレーとも呼ばれる）は、アレー上の識別され
た、または予め決定された位置に固定化された複数の捕獲タグを包含する。これ
に関連して、複数の捕獲タグはそれぞれが個別の構造を有する多くの捕獲タグを
指す。アレー上の各前決定位置（本明細書においてアレー要素と呼ばれる）は１
タイプの捕獲タグを有する（すなわち、その位置でのすべての捕獲タグは同じ構
造を有する）。各位置は捕獲タグの多くの複製を有する。アレー中の、異なる構
造の捕獲タグの空間的分離は、捕獲タグと結合することになる標的分子の個別の
検出および識別を可能とする。解読タグが捕獲アレー中の指定位置で検出される
場合、それは、そのアレー要素に対応する標的分子が標的試料中に存在したこと
を示す。

【００６４】レポーター分子および検出器標識もアレー中に固定することができる。本開示
方法の異なる様式は、固定化されるか、ラベル化されるか、または標識化される
個別の成分により実施することができる。レポーター分子および解読タグのアレ
ーは、以下および本明細書における捕獲タグに関して他で記載するように、作成
し用いることができる。

【００６５】捕獲アレーに使用するための固形状基板は、捕獲タグが直接、または間接に結
合しうるあらゆる固形材料を包含することができる。これには、アクリルアミド
、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンビニル
アセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレ
ンオキシド、ガラス、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリアンヒドライド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフマレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸などの材料が挙げられる。固形状基板は、薄いフィルムまたは膜、ビーズ、ボトル、皿、繊維、織繊維、造形ポリマー、粒子および微粒子を含むあらゆる有用な形態を有することができる。固形状基板に対する好ましい形態はマイクロタイタープレートである。マイクロタイタープレートの最も好ましい形態は標準９６穴タイプである。

【００６６】平面アレー技術は多年にわたり用いられてきた（Ｓｈａｌｏｎ，Ｄ．，Ｓ．Ｊ
．Ｓｍｉｔｈ，ａｎｄＰ．Ｏ．Ｂｒｏｗｎ，ＡＤＮＡｍｉｃｒｏａｒｒａ
ｙｓｙｓｔｅｍｆｏｒａｎａｌｙｚｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘＤＮＡｓ
ａｍｐｌｅｓｕｓｉｎｇｔｗｏ−ｃｏｌｏｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐ
ｒｏｂｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ，１９９６．６
（７）：ｐ．６３９〜４５、Ｓｉｎｇｈ−Ｇａｓｓｏｎ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，
Ｍａｓｋｌｅｓｓｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎｏｆｌｉｇｈｔ−ｄｉｒｅｃｔ
ｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓｕｓｉｎｇ
ａｄｉｇｉｔａｌｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒａｒｒａｙ．ＮａｔＢｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ，１９９９．１７（１０）：ｐ．９７４〜８、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
，Ｅ．Ｍ．，Ｕ．Ｍａｓｋｏｓ，ａｎｄＪ．Ｋ．Ｅｌｄｅｒ，Ａｎａｌｙｚｉ
ｎｇａｎｄｃｏｍｐａｒｉｎｇｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｅｑｕｅｎ
ｃｅｓｂｙｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｔｏａｒｒａｙｓｏｆｏｌ
ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｕｓｉｎｇｅｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔａｌｍｏｄｅｌｓ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９２．１３（４）：
ｐ．１００８〜１７、Ｎｉｚｅｔｉｃ，Ｄ．，ｅｔａｌ．，Ｃｏｎｓｔｒｕｃ
ｔｉｏｎ，ａｒｒａｙｉｎｇ，ａｎｄｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙｓｃｒｅｅ
ｎｉｎｇｏｆｌａｒｇｅｉｎｓｅｒｔｌｉｂｒａｒｉｅｓｏｆｈｕ
ｍａｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓＸａｎｄ２１：ｔｈｅｉｒｐｏｔｅｎ
ｔｉａｌｕｓｅａｓｒｅｆｅｒｅｎｃｅｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｐｒｏｃ
ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１９９１．８８（８）：ｐ．３２３３
〜７、ＶａｎＯｓｓ，Ｃ．Ｊ．，Ｒ．Ｊ．Ｇｏｏｄ，ａｎｄＭ．Ｋ．Ｃｈａ
ｕｄｈｕｒｙ，ＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＤＮＡ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ａｎｄ
ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ｂｌｏｔｔｉｎｇｏｎｃｅｌｌｕｌｏ
ｓｅｎｉｔｒａｔｅａｎｄｏｔｈｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｓ．ＪＣｈｒ
ｏｍａｔｏｇｒ，１９８７．３９１（１）：ｐ．５３〜６５、Ｒａｍｓａｙ，Ｇ
．，ＤＮＡｃｈｉｐｓ：ｓｔａｔｅ−ｏｆ−ｔｈｅａｒｔ．ＮａｔＢｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ，１９９８．１６（１）：ｐ．４０〜４、Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．，
ｅｔａｌ．，Ｐａｒａｌｌｅｌｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅａｎａｌｙｓｉ
ｓ：ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｍｏｎｉｔｏ
ｒｉｎｇｏｆ１０００ｇｅｎｅｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃ
ｉＵＳＡ，１９９６．９３（２０）：ｐ．１０６１４〜９、Ｌｉｐｓｈｕｌｔ
ｚ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｈｉｇｈｄｅｎｓｉｔｙｓｙｎｔｈｅｔｉｃ
ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｒｒａｙｓ．ＮａｔＧｅｎｅｔ，１９
９９．２１（１Ｓｕｐｐｌ）：ｐ．２０〜４、Ｐｅａｓｅ，Ａ．Ｃ．，ｅｔ
ａｌ．，Ｌｉｇｈｔ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ａｒｒａｙｓｆｏｒｒａｐｉｄＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓ
ｉｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１９９４．９１（１１
）：ｐ．５０２２〜６、Ｍａｉｅｒ，Ｅ．，ｅｔａｌ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎｏｆｒｏｂｏｔｉｃｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｔｏａｕｔｏｍａｔｅ
ｄｓｅｑｕｅｎｃｅｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔａｎａｌｙｓｉｓｂｙｏ
ｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ．ＪＢｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ，１９９４．３５（２〜３）：ｐ．１９１〜２０３、Ｖａｓｉｌｉｓ
ｋｏｖ，Ａ，Ｖ．，ｅｔａｌ．，Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏ
ａｒｒａｙｏｆｇｅｌ−ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｃｏｍｐｏｕｎｄｓｏ
ｎａｃｈｉｐｂｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ，１９９９．２７（３）：ｐ．５９２〜４，５９６〜８，６００ｐ
ａｓｓｉｍ、およびＹｅｒｓｈｏｖ，Ｇ．，ｅｔａｌ．，ＤＮＡａｎａｌｙ
ｓｉｓａｎｄｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓｏｎｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅｍｉｃｒｏｃｈｉｐｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ
，１９９６．９３（１０）：ｐ．４９１３〜８）。こうしたアレーは、広範囲の
支持体組成物、例えばナイロン、セルロース、ガラス、ガラス上のポリマー、お
よび他の多くの非透過性または透過性支持体上に構築することが可能である。ア
レースポットサイズおよびスポット充填密度は、用いられる工程（複数を含む）
および材料（複数を含む）に応じてごく広範囲にわたり変動する。

【００６７】オリゴヌクレオチドの固形状基板への固定化の方法はよく確立されている。オ
リゴヌクレオチド捕獲タグは確立されたカップリング方法を用いて基板に結合す
ることができる。例えば、適する結合方法は、Ｐｅａｓｅｅｔａｌ．，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１（１１）：５０２２〜５０２
６（１９９４）、およびＫｈｒａｐｋｏｅｔａｌ．，ＭｏｌＢｉｏｌ（Ｍ
ｏｓｋ）（ＵＳＳＲ）２５：７１８〜７３０（１９９１）に記載されている。カ
ゼイン−被覆スライド上の３’−アミンオリゴヌクレオチドの固定化方法は、Ｓ
ｔｉｍｐｓｏｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ９２：６３７９〜６３８３（１９９５）に記載されている。オリゴヌクレオチ
ドの固形状基板への結合の好ましい方法は、Ｇｕｏｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌｅ
ｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２：５４５６〜５４６５（１９９４）に記載され
ている。

【００６８】固形状基板上のオリゴヌクレオチドのアレー製造用方法も知られる。こうした
技術の例はＦｏｄｏｒらによる米国特許第５，８７１，９２８号、Ｂｒｅｎｎｅ
ｒによる米国特許第５，６５４，４１３号、米国特許第５，４２９，８０７号、
およびＰｅａｓｅらによる米国特許第５，５９９，６９５号に記載されている。

【００６９】好ましいけれども、与えられた捕獲アレーが単一単位または構造であることは
必要でない。捕獲タグのセットはあらゆる数の固形支持体上に配分することが可
能である。例えば、一方の極で、各捕獲タグは個別の反応管またはコンテナ中に
固定することが可能である。

【００７０】アレー中のオリゴヌクレオチド捕獲タグも、類似のハイブリド安定性を有する
ように設計することができる。これは、こうした捕獲タグへの断片のハイブリダ
イゼーションをより有効にし、ミスマッチハイブリダイゼーションの発生率を減
少させるであろう。オリゴヌクレオチド捕獲タグのハイブリド安定性は、知られ
た公式および熱力学の原理を用いて計算することができる（例えば、Ｓａｎｔａ
Ｌｕｃｉａｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３５：３５５５〜３
５６２（１９９６）；Ｆｒｅｉｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：９３７３〜９３７７（１９８６）；Ｂｒｅｓｌａ
ｕｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３
：３７４６〜３７５０（１９８６）を参照すること）。オリゴヌクレオチド捕獲
タグのハイブリド安定性は、例えば化学的に捕獲タグを変更することによりさら
に類似性を増すこと（ハイブリド安定性の平滑化と呼ぶことができる工程）がで
きる（Ｎｇｕｙｅｎｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２
５（１５）：３０５９〜３０６５（１９９７）；Ｈｏｈｓｉｓｅｌ，Ｎｕｃｌｅ
ｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２４（３）：４３０〜４３２（１９９６））。ハイ
ブリド安定性は、特定条件下でハイブリダイゼーションを行うことにより平滑化
することができる（Ｎｇｕｙｅｎｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２７（６）：１４９２〜１４９８（１９９９）；Ｗｏｏｄｅｔａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２（６）：１５８５
〜１５８８（１９８５））。

【００７１】オリゴヌクレオチド捕獲タグのハイブリド安定性を平滑化する別の方法は、捕
獲タグの長さを変えることである。これは、すべての捕獲タグが類似のハイブリ
ド安定性（可能な限り）を有するように、各捕獲タグのハイブリド安定性の調整
を可能とするであろう。捕獲タグからの単一ヌクレオチドの添加または欠失は固
定増分だけ捕獲タグのハイブリド安定性を変えるので、捕獲アレー中の捕獲タグ
のハイブリド安定性は等しくないことが理解される。この理由により、本明細書
において用いられるハイブリド安定性の類似性は、捕獲タグのハイブリド安定性
類似性のあらゆる増加（または、言い替えると捕獲タグのハイブリド安定性相違
のあらゆる減少）を指す。

【００７２】オリゴヌクレオチド捕獲タグの試料断片へのハイブリダイゼーションおよびラ
イゲーションの効率も、異なるハイブリダイゼーション条件にさらすことができ
る捕獲アレーの部分またはセグメントにおける類似のハイブリド安定性の捕獲タ
グを組分けすることにより改善することができる。この要領で、ハイブリダイゼ
ーション条件は捕獲タグの特定クラス用に最適化できる。捕獲タグ捕獲タグは、捕獲タグを有する化合物または複合体を捕獲するか、または分離
するために用いることができるあらゆる化合物である。好ましくは、捕獲タグは
リガンド結合性分子または抗体などの別の化合物に結合するか、またはそれと相
互作用をするリガンドまたはハプテンなどの化合物である。捕獲タグおよび捕獲
性成分間のこうした相互作用は、また、ハプテンおよび抗体またはリガンドおよ
びリガンド−結合性分子間のような特定の相互作用であることが好ましい。

【００７３】核酸プローブに関連して説明される好ましい捕獲タグは、Ｓｙｖｎｅｎｅｔ
ａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１４：５０３７（１９８６
）に記載されている。好ましい捕獲タグには核酸中に包含することができるビオ
チンが含まれる。基板上での試料断片を捕獲することは、いくつかの方法により
達成することが可能である。一つの実施形態において、捕獲ドックは基板に接着
されるか、または結合される。捕獲ドックは、断片上の捕獲タグに結合するか、
またはそれと相互作用することにより、試料断片の接着を仲介する化合物または
部分である。基板上に固定された捕獲ドックは基板上において断片の捕獲を可能
とする。こうした捕獲は、後の段階を妨害するかもしれない反応成分を洗い流す
便利な手段を提供する。

【００７４】本開示方法における使用のための基板は、アッセイ成分が接着し、結合されう
るあらゆる固形材料を含むことができる。基板の例には、アクリルアミド、セル
ロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテ
ート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキ
シド、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン、フルオロカーボン、ナイ
ロン、シリコンゴム、ポリアンヒドライド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ
オルトエステル、ポリプロピルフマレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン
、およびポリアミノ酸などの材料が挙げられるがそれらに限定されない。基板は
、薄いフィルムまたは膜、ビーズ、ボトル、皿、繊維、織繊維、造形ポリマー、
粒子および微粒子を含むあらゆる有用な形態を有することができる。基板の好ま
しい形態はプレートおよびビーズである。ビーズの最も好ましい形態は磁気ビー
ズである。

【００７５】一つの実施形態において、捕獲タグおよび捕獲ドックはオリゴヌクレオチドで
ありえる。オリゴヌクレオチドの基板への固定化および結合のための方法は十分
に確立されている。例えば、適する結合方法は、Ｐｅａｓｅｅｔａｌ．，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１（１１）：５０２２〜５０
２６（１９９４）、およびＫｈｒａｐｋｏｅｔａｌ．，ＭｏｌＢｉｏｌ（
Ｍｏｓｋ）（ＵＳＳＲ）２５：７１８〜７３０（１９９１）に記載されている。
カゼイン被覆スライド上の３’−アミノオリゴヌクレオチドの固定化方法は、Ｓ
ｔｉｍｐｓｏｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ９２：６３７９〜６３８３（１９９５）に記載されている。オリゴヌクレオ
チドの固形状基板への結合の好ましい方法は、Ｇｕｏｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ
ｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２：５４５６〜５４６５（１９９４）に記載さ
れている。

【００７６】別の実施形態において、捕獲タグおよび捕獲ドックは抗−ハイブリド抗体であ
りえる。基板に抗体を固定化するための方法は十分に確立されている。固定化は
、標準固定化化学法を用いる、例えば、アミノ化表面、カルボキシル化表面また
はヒドロキシル化表面への結合により達成することができる。結合剤の例には、
ブロモシアン、スクシンイミド、アルデヒド、塩化トシル、アビジン−ビオチン
、光架橋性薬剤、エポキシドおよびマレイミドがある。好ましい結合剤はグルタ
ルアルデヒドである。これらおよび他の結合剤、および結合におけるそれらの使
用の方法は、Ｐｒｏｔｅｉｎｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ：ｆｕｎｄａｍｅ
ｎｔａｌｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＲｉｃｈａｒｄＦ．Ｔａｙ
ｌｏｒ，ｅｄ．（Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９１）、Ｊｏｈｎ
ｓｔｏｎｅａｎｄＴｈｏｒｐｅ，ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＩｎ
Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８７）ｐａｇｅｓ２０９
〜２１６ａｎｄ２４１〜２４２、およびＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＡｆｆｉ
ｎｉｔｙＬｉｇａｎｄｓ，ＣｒａｉｇＴ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎｅｔａｌ
．，ｅｄｓ．（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）に記載され
ている。抗体は、基板内に存在する反応性側基に抗体上の遊離アミノ基を化学的
に架橋することにより、基板に結合することができる。例えば、抗体は、グルタ
ルアルデヒドまたはカルボジイミドを架橋剤として用いて、遊離アミノまたはカ
ルボキシル基を含有する基板に化学的に架橋することが可能である。この方法に
おいて、遊離抗体を含有する水性溶液は、グルタルアルデヒドまたはカルボジイ
ミドの存在下において固形状基板によりインキュベートされる。グルタルアルデ
ヒドとの架橋のために、反応物は、ｐＨ７．４で０．１Ｍカコジル酸ナトリウム
などの緩衝溶液中の２体積％グルタルアルデヒドによりインキュベートすること
ができる。他の標準固定化化学法は当業者により知られる。選別タグ選別タグは、選別タグを有する化合物または複合体を、それを有しないものか
ら仕分けするか、または分離するために用いることができるあらゆる化合物であ
る。一般に、すべての捕獲タグは選別タグでありえる。また、選別タグは、検出
されえて標識化成分のソート処理を仲介できる化合物および部分を含む。こうし
た形態の選別タグは、一般に捕獲タグでもない。例えば、蛍光部分は、部分で標
識された成分をそうでないもの（または異なる標識を持つもの）から仕分けする
ことを可能としうる。しかし、こうした蛍光部分は、それが相互作用し捕獲され
うる適する捕獲ドックを有することを必ずしも必要としない。好ましくは、選別
タグは選別を仲介できる蛍光ラベルなどのラベルである。方法本開示方法は、信号により標的分子をコード化し、次ぎにコード化された信号
を解読することに基づく。このコード化／解読は、標的分子の検出を、標的分子
の化学的および物理的特性とは無関係にしてしまう。基本形態において、本開示
方法は１以上のレポーター分子の、１以上の標的試料との結合、１以上の解読タ
グの、レポーター分子との結合、および解読タグの検出を包含する。レポーター
分子は標的試料（複数を含む）中の標的分子と結合する。一般に、レポーター分
子は１以上の標的分子に対応し、解読タグは１以上のレポーター分子に対応する
。従って、特定の解読タグの検出は対応するレポーター分子の存在を示す。その
結果として、特定のレポーター分子の存在は対応する標的分子の存在を示す。

【００７７】この間接検出は、本質的にあらゆる任意な化学的および物理的特性を有しうる
解読タグを間に入れることにより、標的分子の検出を標的分子の化学的および物
理的特性から切り離す。特に、解読タグは検出に有用な特定の特性を有すること
ができ、アッセイ内の解読タグは高度に整理、または構築された相互関係を有す
ることができる。検出点で問題となるのは、標的分子の特性（それらをそれらが
あるように捉える）よりはむしろ解読タグの（自由に選択された）特性である。

【００７８】解読タグは標的分子−レポーター分子の特定態様から切り離されるといった追
加の利点を有する。ラベル化分子が検体に結合され次いでラベルを検出する検出
方法とは異なり、本開示方法はラベル化分子の化学的および物理的特性により限
定されない。これはさらに便利な検出、さらに高感度な検出、およびさらに高度
に多重化された検出機構を可能にする。

【００７９】本開示方法の感度は、また、検出前の信号増幅段階を含むことにより強化する
ことができる。基本形態において、増幅はレポーター分子上のレポーター信号を
増幅することにより達成される。これは、各レポーター分子と結合した多くのレ
ポータータグをもたらす。その後、解読タグはレポータータグと結合し、検出さ
れる。一般に、解読タグは１以上のレポータータグに対応し（こうして、レポー
タータグが結合するレポーター分子に対応する）、レポータータグはそれらが結
合するレポーター分子に対応する。よって、特定の解読タグの検出は対応レポー
タータグの存在を示す。その結果として、特定のレポータータグの存在は対応レ
ポーター分子の存在を示す。その結果として、特定のレポーター分子の存在は対
応標的分子の存在を示す。レポーター分子は、また、多くのレポータータグ（本
質的に信号の前アッセイ増幅を達成する）を含むように設計することができる。

【００８０】一般に、標的試料は複数の異なる標的分子を含んでいると期待されるか、また
は含んでいるかと疑われるものである。各レポーター分子の特異的結合性分子は
一つの標的分子と相互作用するように選択される。特異的結合性分子のセットは
試料中のすべての対象標的分子と相互作用するように選択することができる。標
的試料は、好ましくは、表面に固定化されるか、定着されるか、または接着され
る。あるいは、レポーター分子は、固定化、定着化、または接着化の前に、試料
、または試料源と結合することができる。いずれの場合も、解読タグを標的分子
と結合させ、解読タグの位置を検出することによる方法において、表面上の標的
分子の位置が決定されることを可能とする。

【００８１】本開示方法を実施する時、あらゆる数のレポーター分子を用いることができる
。本開示方法は、単一アッセイにおける多くの標的分子の検出に特に有用である
。この多重化は、本開示方法において、標的分子の化学的性質および解読タグの
化学的性質からの解放および解読タグ中に実現されうる多コード化により便利に
なされる。従って、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以
上、２０以上、４０以上、８０以上、または１００以上のレポーター分子が本開
示方法の単一の実施において用いられることが好ましい。用いることのできるレ
ポーター分子の数はこれらの範囲に限定されず、あらゆるサブレンジを包含でき
る。例えば、３０以上、５５以上、７２以上などのレポーター分子が用いられう
る。すべての包含されるサブレンジは特定的に考慮される。多標識分析本開示方法の一つの形態において、１以上の標的試料および１以上のレポータ
ー分子を接触させて、レポーター分子が標的試料中の標的分子と結合することを
可能とする。その後、レポーター分子は増幅されて各レポーター分子に対して多
レポータータグが生成される。レポータータグはレポーター分子と結合したまま
残る。その後、１以上の解読タグがレポータータグと結合し、解読タグが検出さ
れる。解読タグはレポーター分子に対応し、レポーター分子は標的分子に対応す
る。この関係は、解読タグの検出が検出された解読タグに対応するレポーター分
子の存在を示し、レポーター分子の存在がレポーター分子に対応する標的分子の
存在を示すことを意味する。

【００８２】本開示方法のこの形態は、試料中検体の特定認識、認識事象の増幅、および増
幅信号の検出に基づく。特定認識は、対象検体と特定に結合するか、または別の
方法で相互作用する特異的結合性分子により達成される。この相互作用の増幅は
、特異的結合性分子に結び付けられるか、係留されるか、または別の方法で接着
されるレポーター信号により仲介される。レポーター信号と（従って特異的結合
性分子および検体とも）結合して残る多レポータータグを生成するために用いら
れるものは、レポーター信号、オリゴヌクレオチドである。これは、例えば、レ
ポーター信号の増幅またはレポーター信号に対する分岐ＤＮＡまたはオリゴヌク
レオチドデンドリマーのハイブリダイゼーションにより達成される。その後、個
別に検出可能な属性を包含するようにコード化された検出タグがレポータータグ
にハイブリダイゼーションされる。種々の検出タグの検出は試料中の種々検体の
間接的な検出をもたらす。

【００８３】本方法の鍵は、それぞれ異なる検体に対する個別のレポーター信号の使用、次
いで種々のレポーター信号との個別のレポータータグの結合、および続いての種
々のレポータータグに対する個別の解読タグのハイブリダイゼーションである。
この要領で、それぞれの異なるタイプの検体は、最後には、それと結合する個別
の分離検出可能な解読タグと一緒になる。特異的結合性分子およびレポーター信
号の組合せは、異なる検体（検体は広範に化学的に異なる）の標準信号（レポー
ター信号）中への有効な変換をもたらす。その後、これらの標準信号（各検体用
にコード化される）は増幅され、標準条件の単一セットを用いて（この間にコー
ド化は前に進む）検出される。コード化され増幅された信号（すなわち、解読タ
グ）の検出は、単一アッセイにおいて多検体の効果的で便利な検出をもたらす。

【００８４】本開示方法のこの形態の実施例は以下の基本段階を有する：（ａ）１以上の標的試料およびそれぞれがレポーター信号および特異的結合性
分子を含む１以上のレポーター分子を接触させること。レポーター信号は、好ま
しくは、特異的結合性分子に結び付けられるかまたは係留されるオリゴヌクレオ
チドである。各レポーター分子の特異的結合性分子は異なる標的分子と相互作用
するように選択される。

【００８５】（ｂ）レポーター信号を増幅して、各レポーター信号に対する多レポータータ
グを生成すること。そこではレポータータグがレポーター信号と結合したままで
残っている。各レポーター分子のレポーター信号から生成されるレポータータグ
は、好ましくは他のレポーター分子のレポーター信号から生成されるレポーター
タグとは異なる。

【００８６】（ｃ）解読タグをレポータータグに結合させること。そこでは異なる解読タグ
がそれぞれ異なるレポータータグに対応する。

【００８７】（ｄ）レポータータグと結合した解読タグを検出すること。検出された解読タ
グは標的試料中の標的分子の位置と量を示す。多試料の多標識分析本開示方法の別の形態において、４以上の標的試料および１以上のレポーター
分子を接触させて、レポーター分子が標的試料中の標的分子と結合することにな
ることを可能とする。各標的試料をレポーター分子の個別のセットと接触させる
。レポーター分子の各セット中のレポーター分子はレポーター分子の他セット中
のレポーター分子とは異なる。その後、４以上の標的試料を共に混合し、１以上
の解読タグをレポーター分子と結合させ、解読タグを検出する。個別の解読タグ
は、各解読タグが唯一の標的試料に対応するように、それぞれ個別のレポーター
分子に対応する。この関係は、解読タグの検出が検出された解読タグに対応する
標的分子の存在を示すことを意味する。さらに、個別の標的試料に対応する解読
タグの検出は対応する標的試料中の同じ標的分子の存在を示す。

【００８８】本方法のこの形態において、レポーター分子が共有結合的にレポーター分子を
標的分子に結合することにより、標的分子と結合することは好ましい。例えば、
レポーター分子は、標的分子の合成の間にレポーター分子を組み込むことによる
か、またはレポーター分子上の反応基を標的分子と反応させることにより標的分
子と結合することができる。レポーター分子を標的分子中に組み込むための好ま
しい方法は、レポーター分子中に、核酸分子の合成を開始するために用いられる
プライマー部分を包含することである。

【００８９】本開示方法のこの形態の実施例は以下の基本段階を有する：（ａ）４以上の標的試料および１以上のレポーター分子を接触させること。そ
こでは各標的試料がレポーター分子の個別のセットとの接触に持ちこまれる。レ
ポーター分子の各セット中のレポーター分子はレポーター分子の他セット中のレ
ポーター分子とは異なり、レポーター分子は標的試料中の標的分子と結合する。

【００９０】（ｂ）４以上の標的試料を一緒に混合すること。

【００９１】（ｃ）１以上の解読タグをレポーター分子と結合させること。そこでは各解読
タグが唯一の標的試料に対応するように、個別の解読タグがそれぞれ個別のレポ
ーター分子に対応する。

【００９２】（ｄ）解読タグを検出すること。解読タグは、検出の間、または前に、レポー
ター分子から解離する。解読タグの検出は、検出された解読タグに対応する標的
分子の存在を示す。個別の標的試料に対応する解読タグの検出は、対応する標的
試料中の同じ標的分子の存在を示す。

【００９３】本方法のこの形態は、段階（ｃ）の前に、各レポーター分子に対する多レポー
タータグを生成するために、レポーター分子を増幅することをも含むことができ
る。レポータータグはレポーター分子と結合したままで残る。各レポーター分子
から生成されたレポータータグは他のレポーター分子から生成されたレポーター
タグとは異なり、解読タグは解読タグをレポータータグと結合することによりレ
ポーター分子と結合する。

【００９４】本方法のこの形態の好ましい実施形態において、各レポーター分子は、レポー
ター分子の同じセット中の各レポーター分子が同じレポーター信号を有するよう
に、レポーター信号を包含することができる。その後、レポーター分子の増幅は
レポーター信号を増幅することにより達成される。複数の解読タグは各標的試料
に対応することができる。

【００９５】レポーター分子は、共有結合的にレポーター分子を標的分子に結合することに
より、標的分子と結合することができる。例えば、レポーター分子は、標的分子
の合成の間にレポーター分子を組み込むことにより、標的分子と結合することが
できる。あるいは、レポーター分子は、レポーター分子上の反応基を標的分子と
反応させることにより、共有結合的に標的分子に結合することができる。各レポ
ーター分子は、そこでプライマー部分が標的分子の合成を開始する、プライマー
部分およびレポーター信号を含むことができる。その後、解読タグは、解読タグ
をレポーター信号と結合することにより、レポーター分子と結合することができ
る。レポーター信号はオリゴヌクレオチドでありえて、解読タグはレポーター信
号に相補的であるペプチド核酸でありえる。

【００９６】本方法のこの形態はごく多数の実験試料を比較するために有用である。一般の
場合に、大きなバッチの実験動物は薬剤で処理され、脳、肝臓、腎臓、膀胱、肺
、および卵巣または睾丸などの特定器官は分析用に採取される。こうした実験は
、６種の異なる組織が４点時間で採取される２４の実験動物を必要とするであろ
う。その後、先行技術を用いて、各実験器官−時間点から抽出されたｍＲＮＡま
たはタンパク質が同じ器官または組織からの対照ｍＲＮＡまたはタンパク質と比
較される２４マイクロアレー実験を実施しなければならない。これら２４の実験
はかなりの時間および資源（２４マイクロアレーの甚大なコストを含めて）を消
費する。

【００９７】本開示方法の一つの実施形態は、単一のマイクロアレー実験におけるｍＲＮＡ
試料全パネルの多重化、または併行分析を可能とする。本開示方法の別の実施形
態は、単一のマイクロアレー実験におけるタンパク質試料全パネルの多重化、ま
たは併行分析を可能とする。両方の実施形態の実施例は以下に記載される。

【００９８】第１に、実験動物を薬剤で処理する。毒性効果を研究するために、メッセンジ
ャーＲＮＡが時間ゼロ（薬剤投与直前）、および別の３点時間（１、２、３日）
での実験動物の６種の異なる組織生検から抽出される。全体で２４の個別のｍＲ
ＮＡ調製品が得られる。

【００９９】メッセンジャーＲＮＡは以下のようにラベルされる：ｃＤＮＡの第１鎖は逆転
写酵素を用いて生成され、ＲＮＡ鎖はアルカリにより破壊される。エタノール沈
降反応後、ＲＮＡは、その５’−末端で２０塩基の任意のＤＮＡジップ配列（レ
ポーター信号）に繋ぎ止められた任意の８量体（特異的結合性分子）を用いる任
意のプライミングにより複製され、ジップ配列は、好ましくは５０％イソＧおよ
びイソＣ残基を含む（ＣｏｌｌｉｎｓＭＬ，ＩｒｖｉｎｅＢ，Ｔｙｎｅｒ
Ｄ，ＦｉｎｅＥ，ＺａｙａｔｉＣ，ＣｈａｎｇＣ，ＨｏｒｎＴ，Ａｈｌ
ｅＤ，ＤｅｔｍｅｒＪ，ＳｈｅｎＬＰ，ＫｏｌｂｅｒｇＪ，Ｂｕｓｈｎ
ｅｌｌＳ，ＵｒｄｅａＭＳ，ＨｏＤＤ（１９９７）Ａｂｒａｎｃｈｅｄ
ＤＮＡｓｉｇｎａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｓｓａｙｆｏｒ
ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｔａｒｇｅ
ｔｓｂｅｌｏｗ１００ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｍｌ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄｓＲｅｓ２５：２９７９〜２９８４）。それぞれの２４の異なるｍＲＮ
Ａ調製品に対して、独特の任意の８量体−ジップ配列が用いられ、（Ｇｅｒｒｙ
ＮＰ，ＷｉｔｏｗｓｋｉＮＥ，ＤａｙＪ，ＨａｍｍａｒＲＰ，Ｂａｒａ
ｎｙＧ，ＢａｒａｎｙＦ（１９９９）ＵｎｉｖｅｒｓａｌＤＮＡｍｉｃ
ｒｏａｒｒａｙｍｅｔｈｏｄｆｏｒｍｕｌｔｉｐｌｅｘｄｅｔｅｃｔｉ
ｏｎｏｆｌｏｗａｂｕｎｄａｎｃｅｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｓ．
ＪＭｏｌＢｉｏｌ２９２：２５１〜６２）に記載される規則により設計さ
れる。

【０１００】それぞれが独特のジップ配列を包含するすべての２４の任意に特発されたｃＤ
ＮＡ調製品を、ハイブリダイゼーション用に用いられる前に一緒に集める。集め
たプローブをガラススライド上に作製されたｃＤＮＡマイクロアレーにハイブリ
ダイゼーションさせる。１夜のハイブリダイゼーション後、スライドを標準手順
を用いて洗浄し、その後、各２４の任意のプライマージップオリゴヌクレオチド
に相補的な抗−ジップオリゴズを含有するイソＧおよびイソＣに結合された、２
４の個別の分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）増幅集成体（ＨｅｎｄｒｉｃｋｓＤＡ，Ｓ
ｔｏｗｅＢＪ，ＨｏｏＢＳ，ＫｏｌｂｅｒｇＪ，ＩｒｖｉｎｅＢＤ，Ｎ
ｅｕｗａｌｄＰＤ，ＵｒｄｅａＭＳ，ＰｅｒｒｉｌｌｏＲＰ（１９９５）
ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎｏｆＨＢＶＤＮＡｉｎｈｕｍａｎｓｅｒ
ｕｍｕｓｉｎｇａｂｒａｎｃｈｅｄＤＮＡ（ｂＤＮＡ）ｓｉｇｎａｌ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｓｓａｙ．ＡｍＪＣｌｉｎＰａｔｈｏｌ
１０４：５３７〜４６）によりハイブリダイゼーションさせる。過剰ｂＤＮＡ
の洗浄後、それぞれが単一の特定ｂＤＮＡ増幅化標識配列にハイブリダイゼーシ
ョンすることが可能であり、それぞれが個別の分子量を有する２４ＰＮＡ質量標
識（これらは解読タグである）により、スライドをハイブリダイゼーションさせ
る。

【０１０１】洗浄後、マイクロアレーをマトリックス溶液で覆い、乾燥し、質量分光計の中
に置く。レーザー光線を各マイクロアレードットに向けて順次送りだし、すべて
のドットに対してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを生成した。個別のＰＮＡ
質量標識に対応する各ピークの強度は、各組織時間点における各標識（マイクロ
アレー上のスポット当たり全体で２４データポイントに対して）に対応するｍＲ
ＮＡの発現を測定するために記録される。

【０１０２】ｍＲＮＡプロファイリングを含んだ上述実施例において、全部で２４の実験動
物から６種の異なる組織について異なる４時間点でアッセイを行う。同様に、タ
ンパク質は各試料から抽出することが可能である。各タンパク質調製品は、ＤＮ
Ａオリゴヌクレオチドの共有結合により標識することができる。その後、すべて
の２４のタンパク質調製品を一緒に混合し、抗体マイクロアレーに接触させる。
非結合タンパク質を洗浄後、ｂＤＮＡオリゴを増幅し、ＰＮＡ解読タグを結合さ
せる。信号読取りは質量分光器（電気泳動およびＨＰＬＣはあまり好ましくない
選択である）により行われる。この実験はマイクロアレー上にそれに対する同源
の抗体が存在する各タンパク質の相対的な発現レベルに関するデータを生み出す
。相対的なタンパク質発現レベルはすべての２４実験時間点に対して得られる。

【０１０３】第２の実施例において、実験動物を薬剤で処理する。毒性効果を研究するため
に、タンパク質が時間ゼロ（薬剤投与直前）および別の３点時間（１、２、３日
）での実験動物の６種の個別組織生検から抽出される。全体で２４の個別のタン
パク質調製品が得られる。

【０１０４】各タンパク質調製品は、以下のように独特のＤＮＡオリゴヌクレオチドにより
標識される：タンパク質調製品を、何もない場合に反応性スルフヒドリル基を導入するため
に２−イミノチオランと反応させる。その一方の末端において反応性アミノ基を
含有するＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＳＵＬＦＯ−ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ，
Ｉｎｃ）などのヘテロ二官能価架橋剤と反応する。チオール含有タンパク質は活
性化オリゴヌクレオチドと一緒にインキュベートされて、共有結合タンパク質−
ＤＮＡ付加体を形成する。大部分のタンパク質分子に対して、この共有結合付加
体の形成はその同源抗体に結合しようとするタンパク質の能力には干渉しない。

【０１０５】それぞれが共有結合的に結合された独特のＤＮＡ標識配列を包含するすべての
２４のタンパク質調製品を、抗体マイクロアレー実験に用いる前に一緒に集める
。集めたタンパク質を、ガラススライド上の個別の位置に幾十、幾百、または幾
千の特定抗体をスポッテイングすることにより作製されたマイクロアレーに接触
させる（ＥｋｉｎｓａｎｄＣｈｕ，１９９１）。１夜のインキュベーション
後、スライドを、標準免疫アッセイ手順を用いて洗浄し、その後、２４の個別の
分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）増幅集成体によりハイブリダイゼーションさせる（Ｈｅ
ｎｄｒｉｃｋｓｅｔａｌ．，１９９５）。

【０１０６】過剰ｂＤＮＡの洗浄除去後、それぞれが単一の特定ｂＤＮＡ増幅化標識配列に
ハイブリダイゼーションすることが可能であり、それぞれが独特の分子量を有す
る２４の個別のＰＮＡ質量標識により、スライドをハイブリダイゼーションさせ
る。洗浄後、マイクロアレーをマトリックス溶液で覆い、乾燥し、質量分光計の
中に置く。レーザー光線を各マイクロアレードットに向けて順次送りだし、ＭＡ
ＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルをすべてのドットに対して生成する。２４の個別
のＰＮＡ質量標識に対応する各ピークの強度は、各２実験試料からの各標識化タ
ンパク質（それぞれがマイクロアレー表面上のその特定同源抗体に結合される）
の相対量を測定するために、マイクロアレー上の各ドットで記録される。増幅なしの多標識分析本開示方法の解読タグは、標的分子−レポーター分子の特定態様から解放され
る利点を有する。ラベル化分子が検体に結合され、次いでラベルを検出するよう
な検出方法とは異なり、本開示方法はラベル化分子の化学的および物理的特性に
より限定されない。これは、さらに便利な検出、さらに感度の高い検出、および
さらに高度に多重化された検出機構を可能とする。

【０１０７】本開示方法の別の形態において、１以上の標的試料および１以上のレポーター
分子を接触させて、レポーター分子が標的試料中の標的分子と結合することにな
ることを可能とする。その後、１以上の解読タグはレポーター分子と結合する。
個別の解読タグはそれぞれ個別のレポーター分子に対応し、解読タグはレポータ
ー分子に共有結合的には結合しない。その後、解読タグはレポーター分子から解
読タグを解離することにより検出される。解読タグはレポーター分子に対応し、
レポーター分子は標的分子に対応する。この関係は、解読タグの検出は検出され
た解読タグに対応するレポーター分子の存在を示し、レポーター分子の存在はレ
ポーター分子に対応する標的分子の存在を示すことを意味する。

【０１０８】本開示方法のこの形態の実施例は以下の基本段階を有する：（ａ）１以上の標的試料、および標的試料中の標的分子と結合する１以上のレ
ポーター分子を接触させること。

【０１０９】（ｂ）１以上の解読タグをレポーター分子と結合させること。個別の解読タグ
がそれぞれ個別のレポーター分子に対応する。解読タグはレポーター分子に共有
結合的には結合しない。

【０１１０】（ｃ）解読タグを検出すること。解読タグは、検出の間、または前に、レポー
ター分子から解離する。解読タグはレポーター分子に対応する。レポーター分子
は標的分子に対応する。解読タグの検出は検出された解読タグに対応するレポー
ター分子の存在を示し、レポーター分子の存在はレポーター分子に対応する標的
分子の存在を示す。

【０１１１】本方法のこの形態の好ましい実施形態において、各レポーター分子は、各レポ
ーター分子の特異的結合性分子が個別の標的分子と相互作用するように、１以上
の特異的結合性分子を含むことができる。

【０１１２】本方法のこの形態は、段階（ｃ）の前に、各レポーター分子に対する多レポー
タータグを生成するためにレポーター分子を増幅することも含むことができる。
レポータータグはレポーター分子と結合したまま残る。各レポーター分子から生
成されたレポータータグは他のレポーター分子から生成されたレポータータグと
は異なり、解読タグは解読タグをレポータータグと結合させることによりレポー
ター分子と結合する。

【０１１３】本方法のこの形態の実施例として、２ドメイン、検出ドメイン（特異的結合性
分子）およびコード化ドメイン（レポーター信号）、５’−ＧＣＡＴＣＧＣＡＴＣＧＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡ−３
’ を含有する核酸構築体（レポーター分子）を考慮する。

【０１１４】下線部配列、５’−ＧＣＡＴＣＧＣＡＴＣＧＧＡＴＣＧＡＴＣＧ−３は、対象
の同源１本鎖核酸標的分子位置に特異的にハイブリダイゼーションするレポータ
ー分子の特異的結合性分子を表す。この構築体の残り部分、５’−ＡＣＧＧＧ
ＧＣＡＧＡ−３’はレポーター分子のレポーター信号を示す。レポーター信号配
列のすべてまたは部分に相補的であるＰＮＡは、解読タグとして機能することが
可能である。ＰＮＡ：ＤＮＡ二量体の結合はＤＮＡ：ＤＮＡ二量体の結合よりも
強い（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｍ．Ｃ．ａｎｄＦ．Ｐ．Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｔ
ｈｅｒｍａｌＳｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＰＮＡ／ＤＮＡａｎｄＤＮＡ／
ＤＮＡｄｕｐｌｅｘｅｓｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｓｃａｎｎｉｎ
ｇｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，１９９９
．２７（２４）：ｐ．４８０１〜６；Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｆ．ｐ．，Ｓ．Ｒｏｂｉ
ｎｓｏｎ，ａｎｄＪ．Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ，Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｃｏ
ｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＰＮＡ／ＤＮＡａｎｄＤＮＡ／ＤＮＡｈｙｂｒ
ｉｄｉｚａｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎｓａｔａｍｂｉｅｎｔｔｅｍｐｅ
ｒａｔｕｒｅ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，１９９９．２７（２４）
：ｐ．４７９２〜８００）、従って、ＰＮＡは同じ配列のＤＮＡ鎖の存在下にお
いてこの構築体に結合されたままで残る。レポーター信号および解読タグ中のイ
ソＣおよびイソＧの使用（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，Ａｂｒ
ａｎｃｈｅｄＤＮＡｓｉｇｎａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｓｓａ
ｙｆｏｒｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ
ｔａｒｇｅｔｓｂｅｌｏｗ１００ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｍｌ．Ｎｕｃｌ
ｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，１９９７．２５（１５）：ｐ．２９７９〜８４；
Ｓｗｉｔｚｅｒ，Ｃ．Ｙ．，Ｓ．Ｅ．Ｍｏｒｏｎｅｙ，ａｎｄＳ．Ａ．Ｂｅｎ
ｎｅｒ，Ｅｎｚｙｍａｍａｔｉｃｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅｂ
ａｓｅｐａｉｒｂｅｔｗｅｅｎｉｓｏｃｙｔｉｄｉｎｅａｎｄｉｓｏ
ｇｕａｎｏｓｉｎｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３．３２（３９）：ｐ
．１０４８９〜９６；Ｈｏｒｎ，Ｔ．，Ｃ．Ａ．Ｃｈａｎｇ，ａｎｄＭ．Ｌ．
Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，１９９５．３６：ｐ．
２０３３〜２０３６）は、これらの配列を標的配列とハイブリダイゼーションで
きなくする。

【０１１５】この実施例方法の使用の説明として、以下を考慮する。

【０１１６】１本鎖核酸を同源復号ＰＮＡと混合することにより、構築体を生成する。セッ
ト内に、こうした構築体を個別に生成する。対象のＤＮＡ標的分子を、修飾プラ
イマーを持つＰＣＲにより増幅する。得られるＤＮＡ鎖が３’ビオチン部を含有
し、５’末端がホスホジエステル連鎖よりもむしろ少なくとも４個のホスホロチ
オエート連結ヌクレオチドを含有するように、プライマーを設計する。

【０１１７】二本鎖ＰＣＲアンプリコンをＴ７遺伝子６により消化して１本鎖ＤＮＡを生じ
る（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ，Ｔ．Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｔｈｅｕｓｅｏｆｐ
ｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｐｒｉｍｅｒｓａｎｄｅｘｏｎｕｃｌｅ
ａｓｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｆｏｒｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏ
ｆｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓａｎｄｔ
ｈｅｉｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｂｙｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅｈｙｂｒｉｄ
ｉｚａｔｉｏｎ．ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓＡｐｐｌ，１９９４．３（５）：ｐ
．２８５〜９１）。構築体のセットを、プローブ配列と同源ＤＮＡ試料とのハイ
ブリダイゼーション用の条件下において試料と接触させる。混合物を、ＰＣＲア
ンプリコンズがビオチン−アビジン相互作用により捕獲され、過剰および不一致
の構築体が洗浄除去されるアビジン被覆穴に移す。それらの結合解読タグを持つ
レポーター分子をＤＮＡ標的分子から解放するために、低塩洗浄を行う。液相を
多ＰＮＡ解読タグ検出用の自動試料採取器の穴に移す。

【０１１８】各ＰＮＡ解読タグ配列は、独特に解読タグを識別するその独特な質量スペクト
ルにより検出される。検出器は、例えばＥｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙＴｉｍｅ−
ｏｆ−ＦｌｉｇｈｔＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒである。質量分光計
源において、オリゴヌクレオチドはＰＮＡ解読配列から解離され、ＰＮＡが検出
される。あるいは、復号配列はクロマトグラフィ的にまたは電気泳動的に分離可
能な部分でありえる。多標識分析用のあらゆるこれら技術の使用は、幾百、また
はなお幾千の異なる解読タグの検出および識別を可能とし、その結果として幾百
、またはなお幾千の異なる標的分子を識別する。

【０１１９】好ましい構築体は、改善分子スイッチ（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．，ｅｔａ
ｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｐｒｏｃｅｓｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｉ
ｍｐｒｏｖｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｗｉｔｃｈ，１９９２．Ｕｎｉｔｅｄ
ＳｔａｔｅｓＰａｔｅｎｔ５，１１８，８０１）を利用するであろう。一
方の末端で発蛍光団および他の末端でクエンチャーによりラベル化された関連プ
ローブ分子は、分子ビーコン（Ｔｙａｇｉ，Ｓ．，Ｄ．Ｐ．Ｂｒａｔｕ，ａｎｄ
Ｆ．Ｒ．Ｋｒａｍｅｒ，Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａ
ｃｏｎｓｆｏｒａｌｌｅｌｅｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ．ＮａｔＢ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９８．１６（１）：ｐ．４９〜５３；Ｔｙａｇｉ，Ｓ
．ａｎｄＦ．Ｒ．Ｋｒａｍｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎｓ：ｐｒ
ｏｂｅｓｔｈａｔｆｌｕｏｒｅｓｃｅｕｐｏｎｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ
ｏｎ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９６．１４（３）：ｐ．３０３〜８
；Ｍａｒｒａｓ，Ｓ．Ａ．，Ｆ．Ｒ．Ｋｒａｍｅｒ，ａｎｄＳ．Ｔｙａｇｉ，
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅｖａｒｉａｔｉｏｎｓｕｓｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃ
ｏｎｓ．ＧｅｎｅｔＡｎａｌ，１９９９．１４（５〜６）：ｐ．１５１〜６；
Ｖｅｔ，Ｊ．Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｏｆｆｏｕｒｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓｕｓｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃ
ａｄＳｃｉＵＳＡ，１９９９．９６（１１）：ｐ．６３９４〜９；Ｍａｎｇ
ａｎｅｌｌｉ，Ｒ．，ｅｔａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎｏｆ１０ｓｉｇｍａｆａｃｔｏｒｇｅｎｅｓｉｎＭｙｃ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ，１９９９．３１（２）：ｐ．７１５〜２４）と呼ばれてきており、それらの
線形等価プローブ配列（Ｂｏｎｎｅｔ，Ｇ．，ｅｔａｌ．，Ｔｈｅｒｍｏｄｙ
ｎａｍｉｃｂａｓｉｓｏｆｔｈｅｅｎｈａｎｃｅｄｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｉｔｙｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄＤＮＡｐｒｏｂｅｓ．ＰｒｏｃＮａ
ｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１９９９．９６（１１）：ｐ．６１７１〜６
）よりも優れた検出特定性を有することが実証されてきた。ビーコンは、読出し
発蛍光団のスペクトルの重なりのせいで多重化の程度において限定される。最新
の発明において、分子スイッチの特定性は開発され、著しく高度な多重読出しが
可能になっている。こうした構築体の実施例は以下である。

【０１２０】５’−ＸＭＧＣＡＴＣＧＣＡＴＣＧＧＡＴＣＧＡＴＣＧＮＹＡＣＧＧＧＧＣＡ
ＧＡ−３’ 式中、ＭおよびＮは（一般に小さい）数の塩基を示し；ＸおよびＹは互いに相補
的である一般に５〜８塩基の短い配列であり；および、検出および復号ドメイン
は上に示した通りである。ハイブリダイゼーション条件下において、この構築体
は標的配列にハイブリダイゼーションするプローブ配列と競合する「ステップア
ンドループ」構造（ＸおよびＹが互いにハイブリダイゼーションされる）を形成
する。レポーター担体による多標識分析本開示方法の別の形態において、１以上の標的試料および１以上のレポーター
担体を接触させる。レポーター担体は１以上の特異的結合性分子、担体、および
担体と結合した複数の解読タグを含む。レポーター担体がレポーター分子と結合
して後、解読タグは検出される。解読タグはレポーター担体に対応し、レポータ
ー担体は標的分子に対応する。この関係は、解読タグの検出が検出された解読タ
グに対応するレポーター担体の存在を示し、レポーター担体の存在がレポーター
担体に対応する標的分子の存在を示すことを意味する。

【０１２１】本開示方法のこの形態の実施例は以下の基本段階を有する：（ａ）１以上の標的試料、および１以上の特異的結合性分子、担体、および担
体と結合した複数の解読タグを含む１以上のレポーター担体を接触させること。

【０１２２】（ｂ）解読タグを検出すること。解読タグがレポーター担体に対応し、レポー
ター担体が標的分子に対応する。解読タグの検出は検出された解読タグに対応す
るレポーター担体の存在を示し、レポーター担体の存在はレポーター担体に対応
する標的分子の存在を示す。

【０１２３】担体はリポソームでありえる。各レポーター担体は、好ましくは、少なくとも
１，０００の解読タグを包含する。解読タグは、好ましくは、質量分光器、電気
泳動、またはクロマトグラフィにより検出される。担体は、その中で解読タグが
セレン置換メチオニンを含有するウイルス性タンパク質であるウイルス性粒子で
もありえて、そこで解読タグが質量分光器により検出されてその結果個別の解読
タグはセレンベースの質量差により識別される。

【０１２４】各レポーター担体の特異的結合性分子は、個別の解読タグがそれぞれ個別のレ
ポーター担体に対応するように、個別の標的分子と相互作用することができる。
解読タグは検出の間、または前に、レポーター担体から解離することができる。
他の特徴本開示方法のすべての形態は種々の特定成分または追加段階を用いて実施する
ことができる。例えば、レポーター分子は分岐ＤＮＡを用いて増幅することがで
きる。このために、各レポーター分子がレポーター信号を含み、各分岐ＤＮＡが
多レポータータグおよびレポーター信号と結合するテールを含むことが好ましい
。

【０１２５】レポーター分子はローリングサークル増幅を用いて増幅することもできる。こ
のために、各レポーター分子がレポーター信号を含むことが好ましく、そこでは
レポーター信号が増幅標的サークルのローリングサークル複製を特発し、複製が
タンデム配列ＤＮＡを生成するように、増幅標的サークルがレポーター信号に相
補的な１以上の配列を含む。タンデム配列ＤＮＡは複数のレポータータグを含有
する。

【０１２６】レポーター分子はオリゴヌクレオチドデンドリマーを用いても増幅することが
できる。解読タグは、好ましくは、オリゴヌクレオチド、炭水化物、ペプチド核
酸、抗体、リガンド、タンパク質、ハプテン、ジンクフィンガー、アプタマー（
aptamers）、または質量ラベルである。

【０１２７】別の実施形態において、標的分子はホーミング分子でありえる。段階（ａ）の
前に、標的試料または標的試料の供給源はホーミング分子にさらされる。結果と
して、検出された解読タグに対応するホーミング分子の存在が、ホーミング分子
が特異的な標的試料中の分子の存在を示す。例えば、組織試料の供給源は、検出
された解読タグに対応するホーミング分子の存在が、ホーミング分子が特異的な
組織試料中の細胞または分子の存在を示すように、ホーミング分子にさらすこと
ができる。この実施形態のために、標的分子は、好ましくは腫瘍ホーミングペプ
チドであり、その結果として、検出された解読タグに対応する腫瘍ホーミングペ
プチドの存在が組織試料中の腫瘍細胞の存在を示す。好ましい実施形態において
、組織試料の供給源である生体はホーミング分子にさらすことができるし、また
は組織試料は組織試料が切片化された後にホーミング分子にさらすことができる
。

【０１２８】標的試料が細胞である場合、細胞は他の細胞から仕分けできる。例えば、細胞
は細胞標識の存在、不在、または量の違いに基づき仕分けされる。

【０１２９】本開示方法は、標的試料が生体であり、段階（ａ）の後に、レポーター分子を
含む誘導標的試料が生体から作成される場で実施することができる。本開示方法
は、また、標的試料が組織であり、段階（ａ）の後に、レポーター分子を含む誘
導標的試料が組織から作成される場で実施することができる。誘導標的試料は、
好ましくは組織から作成された組織切片である。

【０１３０】別の実施形態において、各解読タグは個別のレポータータグに対応することが
でき、各レポータータグは個別のレポーター分子に対応することができ、各レポ
ーター分子は個別の標的分子に対応することができるし、または組合せができる
。あるいは、各解読タグは単一レポータータグに対応することができ、各レポー
タータグは単一レポーター分子に対応することができ、各レポーター分子は単一
標的分子に対応することができるし、または組合せができる。または、各解読タ
グは多レポータータグに対応することができ、各レポータータグは多レポーター
分子に対応することができ、各レポーター分子は多標的分子に対応することがで
きるし、または組合せができる。

【０１３１】本開示方法は、また、段階（ｂ）の後に、標的試料および個別の標的分子がこ
うしたアレーの個別の要素と結合することになる１以上の捕獲アレーを接触させ
る段階を含むことができる。結果として、解読タグが結合するアレー要素はその
アレー要素に対応する標的分子の標的試料中の存在を示す。捕獲アレーは捕獲タ
グを包含することができ、そこでは各アレー要素が個別の捕獲タグを含む。捕獲
タグは、好ましくはオリゴヌクレオチド、抗体、ハプテン、リガンド、または組
合せである。捕獲アレーは、好ましくはビーズ、プレート、またはスライドを含
む。

【０１３２】解読タグは、個別の蛍光、燐光、または化学発光の発光寿命を介して時間的に
識別できる。解読タグは、好ましくは、核磁気共鳴、電子常磁性共鳴、表面増強
ラマン散乱、表面プラズモン共鳴、蛍光、燐光、化学発光、共鳴ラマン、マイク
ロ波、質量分光器、または組合せにより検出可能である。解読タグは、好ましく
は、質量分光器、電気泳動、またはクロマトグラフィにより検出される。

【０１３３】別の実施形態において、解読タグはペプチド核酸でありえて、解読タグは質量
分光器により検出できる。このために個別の解読タグは質量において異なるべき
である。この実施形態において、各レポーター分子は特異的結合性分子を含むこ
とができ、そこでは各レポーター分子の特異的結合性分子が個別の標的分子と相
互作用し、レポータータグはオリゴヌクレオチドでありえて、且つそこでは解読
タグはレポータータグに相補的であるペプチド核酸である。あるいは、各解読タ
グはレポータータグに相補的である同じ数のヌクレオチド塩基を有することがで
きる。この場合に、各解読タグは異なる数の８−アミノ−３，６−ジオキサオク
タン酸モノマーを含み、解読タグはマトリックス支援レーザー脱着／電離化飛行
時間型分光分析法により検出されることが好ましい。

【０１３４】解読タグは、各解読タグが長さおよび蛍光ラベルの個別の組合せを有する蛍光
的にラベル化されたオリゴヌクレオチドでもありえる。この場合に、各レポータ
ータグはオリゴヌクレオチドであり、各解読タグは同じ数のレポータータグに相
補的なヌクレオチドを有することが好ましい。この組合せのために、同じ蛍光ラ
ベルを有する各解読タグはレポータータグに相補的でない個別の数のヌクレオチ
ドを有し、解読タグは標的試料の顕微解剖および顕微解剖された試料の電気泳動
により検出される。

【０１３５】同じ標的分子の異なる修飾状態を含む標的分子は、１以上の標的試料中にあり
える。例えば、修飾は、断片化、開裂、リン酸化、グリコシル化、メチル化、ア
ルキル化、２量化、誘導化、脱プリン、コンフォメーション、またはリボシル化
でありえる。標的分子が同じタンパク質の異なるリン酸化状態を含む場合、各レ
ポーター分子は異なるリン酸化状態における異なるタンパク質と相互作用するこ
とができ、標的試料中の標的分子の検出は標的試料中のタンパク質のリン酸化状
態を示す。標的分子が同じタンパク質の異なるグリコシル化状態を含む場合、各
レポーター分子は異なるグリコシル化状態における異なるタンパク質と相互作用
することができ、標的試料中の標的分子の検出は標的試料中のタンパク質のグリ
コシル化状態を示す。標的分子が同じタンパク質の異なるポリ−ＡＤＰリボシル
化状態を含む場合、各レポーター分子は異なるポリ−ＡＤＰリボシル化状態にお
ける異なるタンパク質と相互作用することができ、標的試料中の標的分子の検出
は標的試料中のタンパク質のポリ−ＡＤＰリボシル化状態を示す。標的分子が同
じタンパク質の異なる断片化を含む場合、各レポーター分子は異なる断片化物と
相互作用することができ、標的試料中の標的分子の検出は標的試料中のタンパク
質の断片化を示す。標的分子が同じタンパク質の異なるコンフォメーション状態
を含む場合、各レポーター分子は異なるコンフォメーション状態における異なる
タンパク質と相互作用することができ、標的試料中の標的分子の検出は標的試料
中のタンパク質のコンフォメーション状態を示す。少なくとも一つの標的分子が
プリオンタンパク質である場合、コンフォメーション状態はタンパク質のプリオ
ンコンフォメーションおよびタンパク質の非プリオンコンフォメーションを含む
ことができる。

【０１３６】解読タグの存在、量、存在および量、または不在の型は、標的分子のカタログ
を構成する。標的分子が２以上の標的試料中にある場合、各標的試料と結合した
解読タグの存在、量、存在および量、または不在の型は、その標的試料中の標的
分子のカタログを構成し、本方法はさらに１以上のカタログを１以上の他のカタ
ログと比較することを含む。

【０１３７】標的分子、レポーター分子、または解読タグは、各標的分子、レポーター分子
、または解読タグがアレー中の個別の位置に固定化され、解読タグを検出するこ
とがアレー中の解読タグの存在、量、存在および量、または不在を検出すること
により達成されるアレー中にありえる。アレー中の解読タグの位置、量、または
位置および量がアレー中の解読タグの型を構成する場合、アレー中の解読タグの
型は、個別の１以上の標的分子を用いて別個の手順において測定されたアレー中
の解読タグの型と比較することができる。アレー中の解読タグの型は、複数の異
なる１以上の標的分子を用いて複数の別個の手順において測定されたアレー中の
解読タグの型とも比較することができる。

【０１３８】標的分子が細胞と結合する場合、レポーター分子は標的分子と結合することが
できる。各レポーター分子が選別タグを含む場合、細胞は選別タグに基づき分類
することができる。標的分子は、好ましくはレポーター分子が細胞上のタンパク
質と結合するような細胞上の細胞表面タンパク質である。

【０１３９】各レポーター分子が特異的結合性分子を含む場合、特異的結合性分子は、好ま
しくは、抗体、リガンド、結合性タンパク質、受容体タンパク質、ハプテン、ア
プタマー、炭水化物、またはオリゴヌクレオチドである。特異的結合性分子が結
合性タンパク質である場合、それは、好ましくは、１以上のジンクフィンガーモ
チーフ、ロイシンジッパーモチーフ、ヘリックス・ターン・ヘルックス・モチー
フ、または組合せを含むＤＮＡ結合性タンパク質である。

【０１４０】解読タグは、好ましくは解読タグの存在、量、存在および量、または不在を測
定することにより検出される。解読タグは高圧液体クロマトグラフィにより分離
し検出することができる。標的試料は、測定される標的分子の位置が表面上の標
的分子の位置であるように、表面に固定化し、定着し、または接着することがで
きる。成分の対応好ましい実施形態において、標的分子、レポーター分子、および解読タグ間の
１対１対１対応が用いられる。この要領で、それぞれの個別タイプの標的分子は
、最後には、それと結合した個別に分離して検出可能な解読タグと一緒になる。
特異的結合性分子およびレポーター信号の組合せは、個別の標的分子（標的分子
は広範に化学的に発散することが可能である）の標準化信号（レポーター信号）
への効果的な変換をもたらす。その後、これらの標準化信号（これらは各標的分
子に対してコード化される）は標準化条件の単一セットを用いて（その間にコー
ド化が前に進む）検出される。コード化信号（すなわち、解読タグ）の検出は単
一アッセイにおける多標的分子の有効で便利な検出をもたらす。

【０１４１】標的分子、レポーター分子、レポータータグ、および解読タグは、種々の異な
る様式で互いに写像することができる。例えば、各解読タグは個別のレポーター
タグに対応することができ、各レポータータグは個別のレポーター分子に対応す
ることができ、各レポーター分子は個別の標的分子に対応することができ、また
はこれら関係の組合せがありえる。各解読タグは単一レポータータグに対応する
ことができ、各レポータータグは単一レポーター分子に対応することができ、各
レポーター分子は単一標的分子に対応することができ、またはこれら関係の組合
せがありえる。各解読タグは多レポータータグに対応することができ、各レポー
タータグは多レポーター分子に対応することができ、各レポーター分子は多標的
分子に対応することができ、またはこれら関係の組合せがありえる。多くの他の
関係組合せも可能である。解読タグ検出解読タグは適当などのような方法で検出してもよい。一般に、解読タグの性質
は、選ばれた検出方法とマッチするように、あるいは両立するように、選ばれる
。好ましい実施の形態では、開示された方法で分析物についての空間的な情報を
集めることができる迅速な検出方法が用いられる。好ましくは、解読タグは、核
磁気共鳴、電子常磁性共鳴、表面増強ラマン散乱、表面プラズモン共鳴、蛍光、
燐光、化学ルミネッセンス、共鳴ラマン、マイクロ波、質量分析、又はこれらの
組み合わせ、によって検出される。解読タグは、好ましくは、質量分析、電気泳
動、又はクロマトグラフィーによって分離及び／又は検出される。解読タグは、
蛍光、燐光、又は化学発光放出の寿命の差によって時間的に識別できる。

【０１４２】好ましい検出方法は、解読タグの位置と量を決定することができるようなもの
である。これを達成する好ましい方法は、マトリックス支援レーザー脱着／電離
飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）による検出、および標的試料の顕微解
剖と顕微解剖された試料の毛細管電気泳動による検出などである。

【０１４３】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ検出の場合、解読タグは、好ましくはペプチド核酸であり
、その場合各解読タグは質量分析において分離及び別々の検出が可能になるよう
に異なる質量を有する。このためには、各解読タグがレポータータグと相補的な
ヌクレオチド塩基を同数有することが好ましい。又、各解読タグが異なる数の質
量タグ、例えば８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノイック・モノマー、を有
することが好ましい。これによって質量が変化することを許しながら、より一貫
性のあるハイブリダイゼーション特性が得られる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ検出にお
けるペプチド核酸の利用は、Baucom et al., Anal. Chem. 69: 4894-4898 (1997
),およびButler et al., Anal. Chem. 68: 3283-31287 (1996) に一般的に記述
されている。

【０１４４】毛細管電気泳動による検出の場合、解読タグは蛍光標識されたオリゴヌクレオ
チドであることが好ましく、その場合各解読タグが長さと蛍光ラベルの異なる組
み合わせを有する。このためには、各解読タグがレポータータグと相補的なヌク
レオチドを同数有することが好ましい。また、各解読タグはレポータータグと相
補的でないヌクレオチドを異なる数有することが好ましい。これによって、電気
泳動で異なる解読タグの分離を可能にしながら、より一貫性あるハイブリダイゼ
ーション特性が得られる。

【０１４５】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ検出を用いる開示された方法は次のように要約される：１．異なるレポーター分子の混合物を試料に接触させて、試料の表面におけ
る標的分子へのレポーター分子の特異的結合を行わせ、その後過剰な未結合レポ
ーター分子を除去する。

【０１４６】２．核酸増幅システムを用いて、表面に結合したレポータータグを生成し、
レポータータグの発生量が結合したレポーター分子の数に比例するようにする。

【０１４７】３．表面に解読タグの混合物を接触させる。解読タグは、異なる組成及び／
又は異なる質量ラベルを含むから、分子量によって識別できる。解読タグの混合
物をレポータータグと結合させる；つぎに、過剰な解読タグを除去する。

【０１４８】４．質量分析のために、表面をレーザー脱着電離のための適当なマトリック
スでコーティングして処理する。

【０１４９】５．スライドを質量分析計に入れ、レーザーを順次表面の特定の場所に導い
て特定の領域で脱着電離を行わせて、解読タグを放出させる。異なる質量の各解
読タグの量を測定して、各特定クラスの結合したレポーター分子の数の相対尺度
を得る。次に、表面の多くの異なる場所でレーザー脱着プロセスを繰り返す。レポーター分子の増幅レポーター分子は任意の適当な方法によって増幅することができる。多くの増
幅方法が知られており、開示された方法に合わせて使用することができる。増幅
の形態は、一般的にはレポーター分子の性質に関連し、特に、増幅されるレポー
ター信号の性質に関連するであろう。増幅方法の一つの主要な部類は核酸増幅法
である。この方法は、一般に、レポーター信号がオリゴヌクレオチド、又は他の
核酸又は核酸誘導体であるときに最も有益である。本明細書で用いる場合、レポ
ーター分子の増幅とは、レポーター分子の一部である（レポーター信号という形
の）信号と比べたときの、（レポータータグという形の）レポーター分子に関連
した信号の増加を意味する。

【０１５０】レポーター信号は、分岐ＤＮＡ、ローリングサークル増幅、又はオリゴヌクレ
オチド・デンドリマー、によって増幅することが好ましい。分岐ＤＮＡは一般に
レポーター信号と相補的なテールを有し、また、多数のレポータータグを有する
。信号増幅のための分岐ＤＮＡの利用は、Urdea, Biotechnology 12: 926-928 (
1994)、およびHorn et al., Nucleic Acid Res 23: 4835-4841 (1997)に一般的
に記述されている。信号増幅のためのデンドリマーの利用はShchepinov et al.,
Nucleic Acid Res 25: 4447 -4454 (1997)、およびOrentas et al., J. Virol.
Methods 77: 153-163 (1999) に一般的に記述されている。ローリングサークル
増幅では、レポーター信号が増幅標的サークルのローリングサークル複製を開始
させる。増幅標的サークルはレポータータグと相補的な配列を一つ以上含むので
、複製では、タンデム配列ＤＮＡが複数のレポータータグを含むタンデム配列Ｄ
ＮＡが生成される。ローリングサークル増幅は米国特許第5,854,033号に記述さ
れている。修飾状態の分析分子はいろいろな状態で存在することができる。例えば、タンパク質にはいろ
いろなリン酸化状態がある。開示された方法は標的試料における標的分子のいろ
いろな修飾状態を分析のために利用することができる。そのような修飾としては
、断片化、開裂、リン酸化、メチル化、アルキル化、二量化、誘導体化、脱プリ
ン化、コンフォメーション、あるいはリボシル化、などがある。基本的な形とし
ては、これは、異なる修飾状態に異なる標的分子を、その異なる修飾状態に特異
的な異なるレポーター分子と相互作用させることで遂行される。

【０１５１】その一例は、リン酸化されたタンパク質の多重化プロフィールの生成である。
この実施の形態では、タンパク質のリン酸化された形態 vs. リン酸化されない
形態の（又は、タンパク質の異なるリン酸化状態の間の）状況を多数の（各々が
あるタンパク質の異なるリン酸化状態に特異的な）抗体の組を用いてモニターす
ることができる。電気泳動分析又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によって得られた解
読タグ信号が多数のタンパク質のいろいろなリン酸化状態の比を与えるものとし
て解釈され、この情報を細胞の生理的状態と関連づけることができる。この実施
の形態は、信号伝達に関与するタンパク質について用いることが好ましい。この
実施の形態に適したタンパク質および抗体の例はGioeli et al., Cancer Res 59
(2): 279-84 (1999)、およびNg et al., Science 283 (5410): 2085-2089 (1999
)に記述されている。開示された方法を用いて、同様に、標的分子の断片化、開
裂、リン酸化、メチル化、アルキル化、二量化、誘導体化、脱プリン化、コンフ
ォメーション、あるいはリボシル化、の多重化プロフィールを得ることができる
。

【０１５２】いくつかのペプチド開裂手段が知られており（Means, G. E. and R. E. Feene
y, Chemical Modification of Proteins. 1971, San Francisco, : Holden-Day.
x, 254; Lundblad, R. L., Chemical reagents for protein modification. 2n
d ed. 1991, Boca Raton: CRC Press. 345.）、溶液、表面、又はマトリックス
で利用できる。いくつか例を挙げると次のようなものがある：カルボキシル・サ
イドでの特異的開裂のための臭化シアノーゲンによるメチオニン含有ペプチド結
合の開裂、システインのデヒドロアラニンへの変換とその後の加水分解によるシ
ステイン含有ペプチド結合の開裂、Ｎ−クロロサクシニミドによるアミノ・サイ
ドでのトリプトファン含有ペプチド結合の開裂、およびカルボキシル・サイドで
の特異的開裂を生ずるヒドロキシるアミンによるアスパラギン−グリシン含有ペ
プチド結合の開裂。

【０１５３】抗体によって認識されるタンパク質コンフォメーションの変化は、そのような
抗体を用いて評価することができる。プリオンはコンフォメーション及び機能に
おいて無限に継続することができるタンパク質である。いくつかの生物的プロセ
スおよび疾病にそれが関与していると言われている（Prusiner, S. B., Prions.
Proc Natl Acad Sci U S A, 1998. 95(23): p.13363-83; Li, L. and S. Lindq
uist, タンパク質をベースとする遺伝のエレメントを創り出す. Science, 2000.
287(5453):p. 661-4 ）。プリオン・タンパク質のいろいろな状態を認識する抗
体が開発されている（Hardt, M., T. Baron, and M. H. Groschup, 異常プリオ
ン・タンパク質をモノクローナルおよびポリクローナル抗体によって検出する免
疫組織化学的方法の比較研究. J Comp Pathol, 2000. 122(1): p. 43-53; Korth
, c., P. Streit, and B. Oesch, プリオン・タンパク質の原生の疾病に関連し
た形態に特異的なモノクローナル抗体. Methods Enzymol, 1999. 309:p. 106-22
）。試料処理標的試料は、レポーター分子が関連づけられる前でも後でもいろいろな仕方で
処理することができる。通常の場合、標的試料は、問題とする源から分離又は精
製される。例えば、細胞は生体又は組織から単離できるし、組織は生体から単離
できる。あるいは、細胞の内容又は成分を細胞から単離できる。他の処理も可能
である。例えば、細胞、組織、又は生体を、標的試料の単離又は調製の前にレポ
ーター分子に曝露することもできる。この方法を継続又は完了する前に標的試料
が処理される場合、処理された標的試料は誘導標的試料と呼ぶことができる。別
に断らない限り、標的試料という用語は標的試料と誘導標的試料の両方を指す。

【０１５４】標的試料、又は標的試料の源、は、レポーター分子に曝露する前、又は試料調
製の前、に標的分子で“染める”ことができる。この実施の形態では、標的分子
は他の何らかの分子又は特徴と関連づけられるようになる。例えば、組織試料を
、問題の特定タンパク質に結合する標的分子で染めることができる。このような
標的分子を、ここではホーミング分子と呼ぶ。そして、これらのタンパク質の存
在と場所は、開示された方法で、レポーター分子を標的分子と関連づけることに
よって決定することができる。同様な効果は、標的試料をレポーター分子自身で
染めることによって達成できる。

【０１５５】組織試料を切片にする前でも後でも、組織試料をホーミング分子に曝露するこ
とができる。ある好ましい実施の形態では、標的分子は腫瘍−ホーミング・ペプ
チドである。検出された解読タグに対応する腫瘍−ホーミング・ペプチドの存在
は組織試料の中に腫瘍細胞が存在することを示す。

【０１５６】標的試料が細胞である場合、又は細胞から得られる場合、その細胞を他の細胞
から選別することができる。特に、細胞はある細胞マーカーの存在、不在、又は
量の差に基づいて選別できる。ＦＡＣＳは、このような細胞選別を実行するのに
有用な方法である。いくつかの実施の形態では、選別タグをレポーター分子に含
めて、この選別タグを用いて選別を遂行することができる。

【０１５７】この方法のいくつかの実施の形態では、細胞は、標的試料の調製又はレポータ
ー分子との結合の前に選別することができる。例えば、末梢リンパ球やマクロフ
ァージなどの血液中の細胞は蛍光活性化セルソーターを用いて異なる小集団に選
別することができる。選別は、タンパク質や炭水化物などの細胞表面マーカーの
存在又は不在又は測定できる量の差、に基づいている。細胞の選別の後、細胞小
集団を個別のマイクロタイター・ウエルに取ったり、適当に調製された顕微鏡ス
ライドの表面に置いたりして、そこで通常の細胞学の手順によって定着させるこ
とができる。選別された細胞は、比較的均一な小集団であり、タンパク質やｍＲ
ＮＡなどの細胞成分の相対比はどの細胞でも非常に類似していると思われるので
、開示された方法で分析するのに理想的に適している。

【０１５８】細胞選別は、また、開示された方法の間に行うこともできる。すなわち、免疫
システムの細胞は、ＣＤサブタイプなどの細胞表面マーカーによって選別するこ
とができる。レポーター分子の一部が細胞選別ステップを可能にするための追加
の信号成分を含むように分析をセットアップすることができる。この実施の形態
で好ましい追加の信号成分は蛍光色素である。例えば、色素ｃｙ３を特異的ＤＮ
Ａレポータータグと共有結合で結びつけ、タグは細胞表面の決定因子ＣＤ４に対
して特異的な抗体と共有結合で結合するようにできる。同様に、色素ｃｙ５を別
の特異的ＤＮＡレポータータグと共有結合で結びつけ、タグは細胞表面の決定因
子ＣＤ８に対して特異的な抗体と共有結合で結合するようにできる。他の１８の
特異的抗体（他の、内部又は表面のタンパク質である細胞タンパク質に向けられ
た）が１８の異なるＤＮＡレポータータグと共有結合で結びつけられる。しかし
、これらのタグは蛍光色素を含まない。２０のレポーター分子の組（１８の非蛍
光レポーターと２つの蛍光レポーターを含む）がヒトの血液からの細胞集団と混
合される。次に、細胞はｃｙ３およびｃｙ５蛍光に基づいて、蛍光活性化セルソ
ーターを用いて選別され、３つの異なる細胞プール：すなわち、高ＣＤ４，高Ｃ
Ｄ８，およびその他全部という３つのプールが得られる。次に、これらの細胞プ
ールについて、別々に、２０の抗体レポーター・システム全部についての多重タ
グ分析が行われる。この分析ステップでは、質量分析によって検出される特異的
解読タグの量に基づいてＣＤ４およびＣＤ８信号、ならびに他の１８の信号が同
時に得られる。この分析によって、３つの細胞プールの各々についてタンパク質
発現レベルのカタログが生成される。

【０１５９】標的試料及び標的分子は、また、基体に固定することもできる。好ましくは、
標的分子は捕獲アレーに結合され、異なる標的分子がアレーの異なる要素と結合
される。こうして、解読タグが検出されるアレー要素の同一性によって関連する
標的分子が同定される。一般に、捕獲アレーとの標的分子の結合は、基体に固定
された捕獲タグとの結合による。捕獲タグの好ましい形はオリゴヌクレオチド、
抗体、ハプテン、及びリガンドである。

【０１６０】開示された方法は、全体として組織の代謝状態を表す一定の分析物のパネルの
検出に用いることができる。例えば、実験動物からの組織生検標本を取って癌の
存在の可能性を検査することができる。組織切片が調製され、複数のオリゴヌク
レオチド・タグが付けられた抗体で分析される。このタグが付けられた抗体は特
異的腫瘍抗原、ケモカイン、サイトカイン、及び腫瘍ホーミング・ペプチドに特
異的に結合するものである（Pasqualini R, Koivunen E, Kain R, Lahdenranta
J, Sakamoto M, Stryhn A, Ashmun RA, Shapiro LH, Arap W, Ruoslahti E. ア
ミノペプチダーゼＮは腫瘍ホーミング・ペプチドのレセプタであり血管形成抑制
の標的である, Cancer Res 2000 60:722-727; Pasqualini R. ファージ・ペプチ
ド・ライブラリーによる血管ターゲッティング, Q J Nucl Med 1999 43: 159-16
2）。腫瘍ホーミング・ペプチドは、ユニークなタイプの腫瘍との結合の特異性
に基づいて選ばれたオリゴペプチドである。実験動物に複数の腫瘍ホーミング・
ペプチドの等モル数混合物を注射すると、動物のいろいろな組織は腫瘍細胞が存
在するかどうかに応じてペプチドを保持する。腫瘍組織で結合する腫瘍ホーミン
グ・ペプチドの実際の濃度は腫瘍のステージおよびグレードによって異なる。腫
瘍ホーミング・ペプチドの混合物を用い、この方法の組織分析を用いることによ
って、組織切片の任意の数の場所における腫瘍ホーミング・ペプチドのパネル全
部の相対比が得られる。組織における注射されたペプチドの保持を調べて得られ
るこの多重分析物プロフィールは、体内で生ずる腫瘍マーカー、成長因子、サイ
トカイン、等と組み合わせて、動物の疾病状態と関連づけることができる。標的分子のパターンとカタログ解読タグの存在、量、存在及び量、又は不在、のパターンは標的分子のカタロ
グを構成する。このカタログを標的試料の指紋として用いることができ、同様な
仕方で異なる標的試料から得られる他のカタログと比較するのに特に有用である
。標的分子、レポーター分子、又は解読タグがあるアレーの中にある場合、その
アレーにおける解読タグの存在、量、存在及び量、又は不在、はそのアレーにお
ける解読タグのパターンを構成する。このパターンを、異なる一つ以上の標的分
子を用いて別の手順で決定されたアレーにおける解読タグのパターンと比較する
ことができる。多数の標的試料から得られた多数のパターンをこのようにして比
較することができる。実施例１：分岐ＤＮＡ増幅及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ検出を用いるタンパク質の検
出以下は、タンパク質を検出するために用いられる開示された方法の一つの実施
の形態を説明するものであり、この実施の形態ではレポーター信号は分岐ＤＮＡ
を用いて増幅され、解読タグはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いて検出される。

【０１６１】１．分岐ＤＮＡ分析は、パラフォルムアルデヒドで固定された組織の標準的
な組織検体又は細胞検体を含むガラス・スライドの表面で、組織又は細胞試料の
表面における４つの異なるタンパク質を検出するという目的で行われる。４つの
異なる抗体（特異的結合分子：Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）が用いられ、各々は問題として
いるある特定タンパク質に対して特異的である。各抗体は、特定オリゴヌクレオ
チド（レポーター信号：Ａｏ１，Ｂｏ２，Ｃｏ３，Ｄｏ４）と共有結合で結合し
、各抗体に分岐ＤＮＡの結合部位となる特異的なＤＮＡタグが与えられる。４つ
の異なる分岐ＤＮＡレポーターが用いられ（Ａｏ１−Ｂｒ１，Ｂｏ２−Ｂｒ２，
Ｃｏ３−Ｂｒ３，Ｄｏ４−Ｂｒ４）、各レポーターは少なくとも１，０００のＤ
ＮＡレポータータグのツリーを含んでいる。分岐ＤＮＡ分析が完了した後、表面
は何千という結合した抗体分子を含み、各抗体分子は自分自身の特異的な分岐Ｄ
ＮＡのツリーによって（レポーター信号を介して）結合する。組織内の４つのタ
ンパク質の分布が均一でない場合、表面に結合した抗体の分布ももちろん不均一
になる。したがって、何千という分岐ＤＮＡレポータータグＢｒ１，Ｂｒ２，Ｂ
ｒ３，Ｂｒ４の鎖の表面分布も不均一になる。

【０１６２】２．この表面に４つの異なるペプチド核酸（ＰＮＡ）解読タグ（ＰＮＡ１，
ＰＮＡ２，ＰＮＡ３，ＰＮＡ４）の混合物を接触させる。ＰＮＡｓは同じ長さ（
１０塩基）であるが、レポータータグ配列の各々と完全に相補的な４つの異なる
配列を有する。さらに、ＰＮＡｓは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのための質量ラベルと
して１つ、２つ、３つ、又は４つのＮＨ₂末端８−アミノ−３，６−ジオキサオ
クタン酸モノマー（各１４６Daltons）を含んでいるので、分子量によって識別
できる。４つのＰＮＡｓの混合物を、ガラス・スライドの表面で１５分間放置し
てハイブリダイズさせ、その後スライドを洗浄してハイブリダイズしなかったＰ
ＮＡが除去される。

【０１６３】３．スライドを３−ヒドロキシピコリン酸、ピコリン酸、およびヂアンモニ
ウム・クエン酸の１０：１：１混合物（Smirnov et al., Analytical Biochemis
try 238: 19 (1996)）の薄い層で覆い、放置乾燥させて、レポータータグを、Ｐ
ＮＡ解読タグと一緒に、最適な時間遅延で脱着が生ずるのに適した小さい分子の
マトリックスの中に埋め込む。

【０１６４】４．スライドを質量分析器に入れ、レーザー光線を組織の特定場所に導き、
約５００平方ミクロンの特定部位でレーザー脱着を行ってＰＮＡ分子を放出させ
る（図１.３）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを解釈して、４つのＰＮＡ
解読タグ（ＰＮＡ１，ＰＮＡ２，ＰＮＡ３，ＰＮＡ４）の各々の量を記録し、そ
れによって間接的に各タンパク質（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）の相対量を測定する。各ス
ポットでのレーザー脱着の時間は迅速なので（数秒のオーダー）、個々の測定を
表面の異なる場所で順次行うことができる。実施例２：ローリングサークル増幅とＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ検出を用いたタンパク
質検出以下は、タンパク質を検出するために用いられる開示された方法の一つの実施
の形態を説明するものであり、この実施の形態ではレポーター信号はローリング
サークル増幅を用いて増幅され、解読タグはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いて検出さ
れる。

【０１６５】１．ローリングサークル増幅は、パラフォルムアルデヒドで固定された組織
の標準的な組織検体又は細胞検体を含むガラス・スライドの表面で、組織又は細
胞試料の表面における４つの異なるタンパク質を検出するという目的で行われる
。各々が問題の１つの特定タンパク質に対して特異的である４つの異なる抗体（
特異的結合分子：Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）が用いられる。各抗体は、特定オリゴヌクレ
オチド（レポーター信号：Ａｏ１，Ｂｏ２，Ｃｏ３，Ｄｏ４）と共有結合で結合
して、各抗体にローリングサークル増幅のプライマーの役目をする特異的なＤＮ
Ａタグが与えられる。４つの異なる増幅標的サークルが用いられ（Ａｏ１−ＡＴ
Ｃ１，Ｂｏ２−ＡＴＣ２，Ｃｏ３−ＡＴＣ３，Ｄｏ４−ＡＴＣ４）、各増幅標的
サークルは一つ以上のレポータータグ補体を含む。増幅標的サークルは、レポー
ター信号をローリングサークル複製プライマーとして用いて複製されて、少なく
とも１，０００ＤＮＡレポータータグを含むタンデム配列ＤＮＡを形成する。ロ
ーリングサークル増幅が完了した後、表面は何千という結合した抗体分子を含み
、各抗体分子は自分自身の特異的なタンデム配列ＤＮＡ（ＴＳ１，ＴＳ２，ＴＳ
３，ＴＳ４）と（レポーター信号を介して）結合する。組織内の４つのタンパク
質の分布が不均一である場合、表面に結合した抗体の分布ももちろん不均一にな
る。したがって、タンデム配列ＤＮＡのレポータータグＴＳ１，ＴＳ２、ＴＳ３
，ＴＳ４の表面分布も不均一になる。

【０１６６】２．この表面に４つの異なるペプチド核酸（ＰＮＡ）解読タグ（ＰＮＡ１，
ＰＮＡ２，ＰＮＡ３，ＰＮＡ４）の混合物を接触させる。ＰＮＡｓは同じ長さ（
１０塩基）であるが、レポータータグ配列の各々と完全に相補的な４つの異なる
配列を有する。さらに、ＰＮＡｓは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのための質量ラベルと
して１つ、２つ、３つ、又は４つのＮＨ2末端８−アミノ−３，６−ジオキサオ
クタン酸モノマー（各１４６Daltons）を含んでいるので、分子量によって識別
できる。４つのＰＮＡｓの混合物を、ガラス・スライドの表面で１５分間放置し
てハイブリダイズさせ、その後スライドを洗浄してハイブリダイズしなかったＰ
ＮＡが除去される。

【０１６７】３．スライドを３−ヒドロキシピコリン酸、ピコリン酸、およびヂアンモニ
ウム・クエン酸の１０：１：１混合物（Smirnov et al., Analytical Biochemis
try 238: 19 (1996)）の薄い層で覆い、放置乾燥させて、レポータータグを、Ｐ
ＮＡ解読タグと一緒に、最適な時間遅延で脱着が生ずるのに適した小さい分子の
マトリックスの中に埋め込む。

【０１６８】４．スライドを質量分析器に入れ、レーザー光線を組織の特定場所に導き、
約５００平方ミクロンの特定部位でレーザー脱着を行ってＰＮＡ分子を放出させ
る（図１.３）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを解釈して、４つのＰＮＡ
解読タグ（ＰＮＡ１，ＰＮＡ２，ＰＮＡ３，ＰＮＡ４）の各々の量を記録し、そ
れによって間接的に各タンパク質（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）の相対量を測定する。各ス
ポットでのレーザー脱着の時間は迅速なので（数秒のオーダー）、個々の測定を
表面の異なる場所で順次行うことができる。実施例３：分岐ＤＮＡ増幅と毛細管電気泳動検出を用いたメッセンジャーＲＮＡ
検出以下は、ｍＲＮＡを検出するために用いられる開示された方法の一つの実施の
形態を説明するものであり、この実施の形態ではレポーター信号は分岐ＤＮＡを
用いて増幅され、解読タグは毛細管電気泳動を用いて検出される。

【０１６９】１．分岐ＤＮＡ分析は、パラフォルムアルデヒドで固定された組織の標準的
な組織検体又は細胞検体を含むガラス・スライドの表面で、組織又は細胞試料の
表面における４つの異なるｍＲＮＡを検出するという目的で行われる。４つの異
なるｍＲＮＡプローブ（特異的結合分子；Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）が用いられ、各々は
問題としているある特定ｍＲＮＡに対して特異的である。各プローブは特定オリ
ゴヌクレオチド（レポーター信号：Ａｏ１，Ｂｏ２，Ｃｏ３，Ｄｏ４）と共有結
合で結合し、各ｍＲＮＡプローブに分岐ＤＮＡの結合部位となる特異的ＤＮＡタ
グが与えられる。４つの異なる分岐ＤＮＡレポーターが用いられ（Ａｏ１−Ｂｒ
１，Ｂｏ２−Ｂｒ２，Ｃｏ３−Ｂｒ３，Ｄｏ４−Ｂｒ４）、各レポーターは少な
くとも１，０００のＤＮＡレポータータグのツリーを含んでいる。分岐ＤＮＡ分
析が完了した後、表面は何千という結合したプローブ分子を含み、各プローブ分
子は自分自身の特異的な分岐ＤＮＡのツリーによって（レポーター信号を介して
）結合する。組織内の４つのｍＲＮＡの分布が均一でない場合、表面に結合した
プローブの分布ももちろん不均一になる。したがって、何千という分岐ＤＮＡレ
ポータータグＢｒ１，Ｂｒ２，Ｂｒ３，Ｂｒ４の鎖の表面分布も不均一になる（
図１.１）。

【０１７０】２．この表面に、４つの異なるレポータータグ配列の各々と相補的である４
つの異なる蛍光標識されたＤＮＡタグ（解読タグ；ＤＮＡ１，ＤＮＡ２，ＤＮＡ
３，ＤＮＡ４）の混合物を接触させる。これらの解読タグは長さが異なり（２０
、２１、２２，及び２３塩基）、各々２０塩基だけがレポータータグと相補的で
ある。余分な塩基は、解読タグの質量に差をつける役目をする。蛍光ＤＮＡタグ
を、ガラス・スライドの表面で２０分間放置してハイブリダイズさせ、その後ス
ライドを洗浄してハイブリダイズしなかった解読タグを除去する（図１.２、太
い線は大きいＤＮＡｓを表す）。

【０１７１】３．スライドをArcturus Engineering 製レーザー解剖顕微鏡にのせ、１細
胞乃至１，０００細胞を含む、問題とするいろいろな部分を顕微解剖する。

【０１７２】４．レーザー解剖顕微鏡のプラスチック・キャップに付着した顕微解剖され
た細胞物質を４０μｌの９０％ホルムアミド・ゲル・ローディング・バッファー
に溶解する。この物質を別のチューブに移し、毛細管電気泳動装置に入れ、毛細
管の先端を小さな４０μｌの試料に接触させて電圧をかける。

【０１７３】５．蛍光解読タグのプロフィールを記録し、いろいろなピーク強度を対応す
るタグと関連づけて、各プローブによって認識されたｍＲＮＡ分析物の相対的発
現プロフィールを生成する。実施例４：ローリングサークル増幅と毛細管電気泳動検出を用いたメッセンジャ
ーＲＮＡ検出以下は、ｍＲＮＡを検出するために用いられる開示された方法の一つの実施の
形態を説明するものであり、この実施の形態ではレポーター信号はローリングサ
ークル増幅を用いて増幅され、解読タグは毛細管電気泳動を用いて検出される。

【０１７４】１．ローリングサークル増幅は、パラフォルムアルデヒドで固定された組織
の標準的な組織検体又は細胞検体を含むガラス・スライドの表面で、組織又は細
胞試料の表面における４つの異なるｍＲＮＡを検出するという目的で行われる。
４つの異なるｍＲＮＡプローブ（特異的結合分子；Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）が用いられ
、各々は問題としているある特定ｍＲＮＡに対して特異的である。各プローブは
特定オリゴヌクレオチド（レポーター信号：Ａｏ１，Ｂｏ２，Ｃｏ３，Ｄｏ４）
と共有結合で結合し、各ｍＲＮＡプローブにローリングサークル増幅のプライマ
ーとなる特異的ＤＮＡタグが与えられる。４つの異なる増幅標的サークルが用い
られ（Ａｏ１−ＡＴＣ１，Ｂｏ２−ＡＴＣ２，Ｃｏ３−ＡＴＣ３，Ｄｏ４−ＡＴ
Ｃ４）、各増幅標的サークル一つ以上のレポータータグ補体を含む。増幅標的サ
ークルは、レポーター信号をローリングサークル複製プライマーとして用いて複
製されて、少なくとも１，０００のＤＮＡレポータータグを含むタンデム配列Ｄ
ＮＡを形成する。ローリングサークル増幅が完了した後、表面は何千という結合
したｍＲＮＡプローブを含み、各ｍＲＮＡプローブは自分自身の特異的なタンデ
ム配列ＤＮＡ（ＴＳ１，ＴＳ２，ＴＳ３，ＴＳ４）と（レポーター信号を介して
）結合する。組織内の４つのｍＲＮＡの分布が不均一である場合、表面に結合し
たｍＲＮＡプローブの分布ももちろん不均一になる。したがって、タンデム配列
ＤＮＡレポータータグＴＳ１，ＴＳ２、ＴＳ３，ＴＳ４の表面分布も不均一にな
る。

【０１７５】２．この表面に、４つの異なるレポータータグ配列の各々と相補的である４
つの異なる蛍光標識されたＤＮＡタグ（解読タグ；ＤＮＡ１，ＤＮＡ２，ＤＮＡ
３，ＤＮＡ４）の混合物を接触させる。これらの解読タグは長さが異なり（２０
、２１、２２，及び２３塩基）、各々２０塩基だけがレポータータグと相補的で
ある。余分な塩基は、解読タグの質量に差をつける役目をする。蛍光ＤＮＡタグ
を、ガラス・スライドの表面で２０分間放置してハイブリダイズさせ、その後ス
ライドを洗浄してハイブリダイズしなかった解読タグを除去する（図１.２、太
い線は大きいＤＮＡｓを表す）。

【０１７６】３．スライドをArcturus Engineering 製レーザー解剖顕微鏡にのせ、１細
胞乃至１，０００細胞を含む、問題とするいろいろな部分を顕微解剖する。

【０１７７】４．レーザー解剖顕微鏡のプラスチック・キャップに付着した顕微解剖され
た細胞物質を４０μｌの９０％ホルムアミド・ゲル・ローディング・バッファー
に溶解する。この物質を別のチューブに移し、毛細管電気泳動装置に入れ、毛細
管の先端を小さな４０μｌの試料に接触させて電圧をかける。

【０１７８】５．蛍光解読タグのプロフィールを記録し、いろいろなピーク強度を対応す
るタグと関連づけて、各プローブによって認識されたｍＲＮＡ分析物の相対的発
現プロフィールを生成する。実施例５：分岐ＤＮＡ増幅と毛細管電気泳動検出を用いたタンパク質の検出以下は、タンパク質を検出するために用いられる開示された方法の一つの実施
の形態を説明するものであり、この実施の形態ではレポーター信号は分岐ＤＮＡ
を用いて増幅され、解読タグは毛細管電気泳動を用いて検出される。

【０１７９】１．分岐ＤＮＡ分析は、パラフォルムアルデヒドで固定された組織の標準的
な組織検体又は細胞検体を含むガラス・スライドの表面で、組織又は細胞試料の
表面における４つの異なるタンパク質を検出するという目的で行われる。４つの
異なる抗体（特異的結合分子；Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）が用いられ、各々は問題として
いるある特定タンパク質に対して特異的である。各抗体は特定オリゴヌクレオチ
ド（レポーター信号：Ａｏ１，Ｂｏ２，Ｃｏ３，Ｄｏ４）と共有結合で結合し、
各抗体に分岐ＤＮＡの結合部位となる特異的ＤＮＡタグが与えられる。４つの異
なる分岐ＤＮＡレポーターが用いられ（Ａｏ１−Ｂｒ１，Ｂｏ２−Ｂｒ２，Ｃｏ
３−Ｂｒ３，Ｄｏ４−Ｂｒ４）、各レポーターは少なくとも１，０００のＤＮＡ
レポータータグのツリーを含んでいる。分岐ＤＮＡ分析が完了した後、表面は何
千という結合した抗体分子を含み、各抗体分子は自分自身の特異的な分岐ＤＮＡ
のツリーによって（レポーター信号を介して）結合する。組織内の４つのタンパ
ク質の分布が均一でない場合、表面に結合した抗体の分布ももちろん不均一にな
る。したがって、何千という分岐ＤＮＡレポータータグＢｒ１，Ｂｒ２，Ｂｒ３
，Ｂｒ４の鎖の表面分布も不均一になる。

【０１８０】２．この表面に、４つの異なるレポータータグ配列の各々と相補的である４
つの異なる蛍光標識されたＤＮＡタグ（解読タグ；ＤＮＡ１，ＤＮＡ２，ＤＮＡ
３，ＤＮＡ４）の混合物を接触させる。これらの解読タグは長さが異なり（２０
、２１、２２，及び２３塩基）、各々２０塩基だけがレポータータグと相補的で
ある。余分な塩基は、解読タグの質量に差をつける役目をする。蛍光ＤＮＡタグ
を、ガラス・スライドの表面で２０分間放置してハイブリダイズさせ、その後ス
ライドを洗浄してハイブリダイズしなかった解読タグを除去する（図１.２、太
い線は大きいＤＮＡｓを表す）。

【０１８１】３．スライドをArcturus Engineering 製レーザー解剖顕微鏡にのせ、１細
胞乃至１，０００細胞を含む、問題とするいろいろな部分を顕微解剖する。

【０１８２】４．レーザー解剖顕微鏡のプラスチック・キャップに付着した顕微解剖され
た細胞物質を４０μｌの９０％ホルムアミド・ゲル・ローディング・バッファー
に溶解する。この物質を別のチューブに移し、毛細管電気泳動装置に入れ、毛細
管の先端を小さな４０μｌの試料に接触させて電圧をかける。

【０１８３】５．蛍光解読タグのプロフィールを記録し、いろいろなピーク強度を対応す
るタグと関連づけて、各抗体によって認識されたタンパク質分析物の相対的発現
プロフィールを生成する。実施例６：ローリングサークル増幅と毛細管電気泳動検出を用いたタンパク質の
検出以下は、タンパク質を検出するために用いられる開示された方法の一つの実施
の形態を説明するものであり、この実施の形態ではレポーター信号はローリング
サークル増幅を用いて増幅され、解読タグは毛細管電気泳動を用いて検出される
。

【０１８４】１．ローリングサークル増幅は、パラフォルムアルデヒドで固定された組織
の標準的な組織検体又は細胞検体を含むガラス・スライドの表面で、組織又は細
胞試料の表面における４つの異なるタンパク質を検出するという目的で行われる
。４つの異なる抗体（特異的結合分子；Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）が用いられ、各々は問
題としているある特定タンパク質に対して特異的である。各抗体は特定オリゴヌ
クレオチド（レポーター信号：Ａｏ１，Ｂｏ２，Ｃｏ３，Ｄｏ４）と共有結合で
結合し、各抗体にローリングサークル増幅のプライマーとなる特異的ＤＮＡタグ
が与えられる。４つの異なる増幅標的サークルが用いられ（Ａｏ１−ＡＴＣ１，
Ｂｏ２−ＡＴＣ２，Ｃｏ３−ＡＴＣ３，Ｄｏ４−ＡＴＣ４）、各増幅標的サーク
ル一つ以上のレポータータグ補体を含む。増幅標的サークルは、レポーター信号
をローリングサークル複製プライマーとして用いて複製されて、少なくとも１，
０００のＤＮＡレポータータグを含むタンデム配列ＤＮＡを形成する。ローリン
グサークル増幅が完了した後、表面は何千という結合した抗体分子を含み、各抗
体分子は自分自身の特異的なタンデム配列ＤＮＡ（ＴＳ１，ＴＳ２，ＴＳ３，Ｔ
Ｓ４）と（レポーター信号を介して）結合する。組織内の４つのタンパク質の分
布が不均一である場合、表面に結合した抗体の分布ももちろん不均一になる。し
たがって、タンデム配列ＤＮＡレポータータグＴＳ１，ＴＳ２、ＴＳ３，ＴＳ４
の表面分布も不均一になる。

【０１８５】２．この表面に、４つの異なるレポータータグ配列の各々と相補的である４
つの異なる蛍光標識されたＤＮＡタグ（解読タグ；ＤＮＡ１，ＤＮＡ２，ＤＮＡ
３，ＤＮＡ４）の混合物を接触させる。これらの解読タグは長さが異なり（２０
、２１、２２，及び２３塩基）、各々２０塩基だけがレポータータグと相補的で
ある。余分な塩基は、解読タグの質量に差をつける役目をする。蛍光ＤＮＡタグ
を、ガラス・スライドの表面で２０分間放置してハイブリダイズさせ、その後ス
ライドを洗浄してハイブリダイズしなかった解読タグを除去する（図１.２、太
い線は大きいＤＮＡｓを表す）。

【０１８６】３．スライドをArcturus Engineering 製レーザー解剖顕微鏡にのせ、１細
胞乃至１，０００細胞を含む、問題とするいろいろな部分を顕微解剖する。

【０１８７】４．レーザー解剖顕微鏡のプラスチック・キャップに付着した顕微解剖され
た細胞物質を４０μｌの９０％ホルムアミド・ゲル・ローディング・バッファー
に溶解する。この物質を別のチューブに移し、毛細管電気泳動装置に入れ、毛細
管の先端を小さな４０μｌの試料に接触させて電圧をかける。

【０１８８】５．蛍光解読タグのプロフィールを記録し、いろいろなピーク強度を対応す
るタグと関連づけて、各抗体によって認識されたタンパク質分析物の相対的発現
プロフィールを生成する。

【図面の簡単な説明】

【図１】増幅用の分岐ＤＮＡを使用する、開示された方法の例を示す図式である。第１
区画は、それらと同起源のレポーター信号（それぞれＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）に
結合した、異なる分岐ＤＮＡ分子（Ｂｒ１、Ｂｒ２、Ｂｒ３、およびＢｒ４）を
示す。レポーター信号は（それらが結合してレポーター分子を形成している特異
的結合分子を介して）表面の標的分子に結合している。第２区画は、結合してい
る分岐ＤＮＡ分子上の同起源レポータータグとハイブリダイズした、ペプチド核
酸解読タグ（ＰＮＡ１、ＰＮＡ２、ＰＮＡ３、およびＰＮＡ４）を示す。第３区
画は、質量分析による分析のための解読タグのレーザー脱着／電離化を示す。

【図２】増幅用の分岐ＤＮＡを使用する、開示された方法の例を示す図式である。第１
区画は、それらと同起源のレポーター信号に結合した、異なる分岐ＤＮＡ分子（
Ｂｒ１、Ｂｒ２、Ｂｒ３、およびＢｒ４）を示す。レポーター信号は、それらが
カップリングしてレポーター分子を形成している特異的結合分子（抗体Ａ、Ｂ、
ＣおよびＤ）を介して表面の標的分子（抗原ａ、ｂ、ｃ、およびｄ）に結合して
いる。第２区画は、結合している分岐ＤＮＡ分子上の同起源レポータータグとハ
イブリダイズした、ペプチド核酸解読タグ（ＰＮＡ１、ＰＮＡ２、ＰＮＡ３、お
よびＰＮＡ４）を示す。第３区画は、質量分析による分析のための解読タグのレ
ーザー脱着／電離化を示す。

【図３】増幅用の分岐ＤＮＡを使用する、開示された方法の例を示す図式である。第１
区画は、それらと同起源のレポーター信号に結合した、異なる分岐ＤＮＡ分子（
Ｂｒ１、Ｂｒ２、Ｂｒ３、およびＢｒ４）を示す。レポーター信号は、それらが
カップリングしてレポーター分子を形成している特異的結合分子（抗原ａ、ｂ、
ｃ、およびｄ）を介して表面の標的分子（抗体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）に結合して
いる。第２区画は、結合している分岐ＤＮＡ分子上の同起源レポータータグとハ
イブリダイズした、ペプチド核酸解読タグ（ＰＮＡ１、ＰＮＡ２、ＰＮＡ３、お
よびＰＮＡ４）を示す。第３区画は、質量分析による分析のための解読タグのレ
ーザー脱着／電離化を示す。

【図４】増幅用の分岐ＤＮＡを使用する、開示された方法の例を示す図式である。第１
区画は、それらと同起源のレポーター信号に結合した、異なる分岐ＤＮＡ分子（
Ｂｒ１、Ｂｒ２、Ｂｒ３、およびＢｒ４）を示す。レポーター信号（'、''、'''
および''''）は、それらがカップリングしてレポーター分子を形成している特異
的結合分子を介して標的分子（抗原ａ）に結合している。標的分子は、表面の捕
捉標識（抗体Ａ）との相互作用を介して表面に固定化されている。異なるレポー
ター信号が、異なる標的試料中の同一の標的分子に結合している。第２区画は、
結合している分岐ＤＮＡ分子上の同起源レポータータグとハイブリダイズした、
ペプチド核酸解読タグ（ＰＮＡ１、ＰＮＡ２、ＰＮＡ３、およびＰＮＡ４）を示
す。第３区画は、質量分析による分析のための解読タグのレーザー吸収／イオン
化を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年１１月２２日（２００１．１１．２２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ラティマー，ダリンアール．アメリカ合衆国，コネチカット 06513，イーストヘブン，カッターズルックアウト 15 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA26 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 FB01 FB02 FB03 FB05 FB06 FB07 4B024 AA11 AA12 CA02 CA09 HA13 HA14 4B063 QA01 QA11 QA18 QQ02 QQ42 QR56 QR62 QR82 QS25 QS34 【要約の続き】価、などがある。例えば、病理学者はこの方法を用いて表現型状態と悪性又は前悪性細胞を含むと考えられる病巣のタンパク質プロフィールとを結びつけることができる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料内の多数の標的分子を検出する方法であって、該方法が
：（ａ）１つ以上の標的試料と１つ以上のレポーター分子を接触させるステップ、
ここでレポーター分子は標的試料内の標的分子と結合する；（ｂ）レポーター分子を増幅して各レポーター分子に対して多数のレポータータ
グを生成するステップ、ここでレポータータグは該レポーター分子と結合したま
まとなる；（ｃ）１つ以上の解読タグをレポータータグと結合させるステップ；（ｄ）該解読タグを検出するステップ；を含み、検出のさい、又はその前に、解読タグはレポーター分子から解離し、
解読タグはレポーター分子に対応しており、レポーター分子は標的分子に対応し
ており、解読タグの検出は検出された解読タグに対応するレポーター分子の存在
を示し、レポーター分子の存在は該レポーター分子に対応する標的分子の存在を
示すことを特徴とする方法。
【請求項２】各レポーター分子が１つ以上の特異的結合性分子を含み、各
レポーター分子の該特異的結合性分子は異なる標的分子と相互作用し、各レポー
ター分子から生成されるレポータータグは他のレポーター分子から生成されるレ
ポータータグと異なり、異なる解読タグが各異なるレポータータグに対応するこ
とを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】該レポーター分子が分岐ＤＮＡを用いて増幅されることを特
徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】各レポーター分子がレポーター信号を含み、各分岐ＤＮＡは
多数のレポータータグと該レポーター信号と結合しているテールを含むことを特
徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】レポーター分子がローリングサークル増幅を用いて増幅され
ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】各レポーター分子がレポーター信号を含み、該レポーター信
号が増幅標的サークルの複製を開始させ、該増幅標的サークルはレポーター信号
と相補的な１つ以上の配列を含み、複製はタンデム配列ＤＮＡを生成し、該タン
デム配列ＤＮＡは複数のレポータータグを含むことを特徴とする請求項５に記載
の方法。
【請求項７】レポーター分子がオリゴヌクレオチドデンドリマーを用いて
増幅されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】解読タグが、オリゴヌクレオチド、炭水化物、ペプチド核酸
、合成ポリアミド、抗体、リガンド、タンパク質、ハプテン、ジンクフィンガー
、アプタマー（aptamers）、又は質量ラベルであることを特徴とする請求項１に
記載の方法。
【請求項９】標的分子がホーミング分子であり、ステップ（ａ）の前に、
標的試料又は標的試料の源がホーミング分子に曝露され、検出された解読タグに
対応するホーミング分子の存在が標的試料におけるホーミング分子が特異的な分
子の存在を示すことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】標的試料が組織試料であり、ステップ（ａ）の前に、該組
織試料がホーミング分子に曝露され、検出された解読タグに対応するホーミング
分子の存在が組織試料におけるホーミング分子が特異的な細胞又は分子の存在を
示すことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】標的分子が腫瘍ホーミング・ペプチドであり、検出された
解読タグに対応する腫瘍ホーミング・ペプチドの存在が組織試料におけるホーミ
ング分子が特異的な腫瘍細胞の存在を示すことを特徴とする請求項１０に記載の
方法。
【請求項１２】組織試料の源である生体がホーミング分子に曝露されるこ
とを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】標的試料が組織試料であり、該組織試料が切片化された後
に該組織試料がホーミング分子に曝露されることを特徴とする請求項９に記載の
方法。
【請求項１４】標的試料が細胞であり、該細胞が他の細胞から選別された
ものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】細胞がある細胞マーカーの存在、不在、又は量の差に基づ
いて選別されていることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】標的試料が生体であり、ステップ（ａ）の後、レポーター
分子を含む誘導標的試料が該生体から調製されることを特徴とする請求項１に記
載の方法。
【請求項１７】標的試料が組織であり、ステップ（ａ）の後、レポーター
分子を含む誘導標的試料が該組織から調製されることを特徴とする請求項１に記
載の方法。
【請求項１８】該誘導標的試料が該組織から調製される組織切片であるこ
とを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】各解読タグが異なるレポータータグに対応し、各レポータ
ータグが異なるレポーター分子に対応し、各レポーター分子が異なる標的分子、
又はある組み合わせ、に対応することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】各解読タグが単一のレポータータグに対応し、各レポータ
ータグが単一のレポーター分子に対応し、各レポーター分子が単一の標的分子、
又はある組み合わせ、に対応することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】各解読タグが多数のレポータータグに対応し、各レポータ
ータグが多数のレポーター分子に対応し、各レポーター分子が多数の標的分子、
又はある組み合わせ、に対応することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】さらに、ステップ（ｂ）の後に；標的試料と１つ以上の捕獲アレーを接触させるステップを含み；異なる標的分子が該アレーの異なる要素に結合し、解読タグが結合しているアレ
ー要素は標的試料の中に該アレー要素に対応する標的分子の存在を示すことを特
徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】該捕獲アレーが捕獲タグを含み、各アレー要素が異なる捕
獲タグを含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】該捕獲タグが、オリゴヌクレオチド、抗体、ハプテン、リ
ガンド、又は組み合わせ、であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】該捕獲アレーがある基質を含むことを特徴とする請求項２
２に記載の方法。
【請求項２６】該基質がビーズ、プレート、又はスライドであることを特
徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】少なくとも二つの解読タグが異なる蛍光、燐光、又は化学
発光の寿命によって時間的に識別されることを特徴とする請求項１に記載の方法
。
【請求項２８】該解読タグが、核磁気共鳴、電子常磁性共鳴、表面増強ラ
マン散乱、表面プラズモン共鳴、蛍光、燐光、化学ルミネッセンス、共鳴ラマン
、マイクロ波、質量分析、又はこれらの組み合わせ、によって検出可能であるこ
とを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２９】該解読タグが、質量分析、電気泳動、又はクロマトグラフ
ィーによって検出されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３０】該解読タグがペプチド核酸であり、該解読タグが質量分析
によって検出され、異なる解読タグは質量が異なることを特徴とする請求項１に
記載の方法。
【請求項３１】各レポーター分子が特異的結合性分子を含み、各レポータ
ー分子の該特異的結合性分子は異なる標的分子と相互作用し、該レポータータグ
はオリゴヌクレオチドであり、該解読タグは該レポータータグと相補的であるペ
プチド核酸であることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】該特異的結合性分子がオリゴヌクレオチドであり、該特異
的結合性分子が標的分子にハイブリダイズし、該特異的結合性分子の各々は標的
分子にハイブリダイズしていないときはステム・アンド・ループを形成し、該特
異的結合性分子が標的分子にハイブリダイズするときにはステムが破壊されるこ
とを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】解読タグが、解読タグの存在、量、存在及び量、又は不在
、を決定することによって検出されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３４】該解読タグはペプチド核酸であり、各解読タグが異なる質
量を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３５】各レポータータグがオリゴヌクレオチドであり、各解読タ
グが該レポータータグと相補的な同数のヌクレオチド塩基を有することを特徴と
する請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】各解読タグが異なる数の８−アミノ−３，６−ジオキサオ
クタン酸モノマーを含むことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】該解読タグがマトリックス支援レーザー脱着／電離飛行時
間質量分析法によって検出されることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】該解読タグが蛍光標識されたオリゴヌクレオチドであり、
各解読タグが長さと蛍光ラベルの異なる組み合わせを有することを特徴とする請
求項１に記載の方法。
【請求項３９】各レポータータグがオリゴヌクレオチドであり、各解読タ
グが該レポータータグと相補的な同数のヌクレオチドを有することを特徴とする
請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】同じ蛍光ラベルを有する各解読タグが異なる数のレポータ
ータグと相補的でないヌクレオチドを有することを特徴とする請求項３９に記載
の方法。
【請求項４１】該解読タグが標的試料の顕微解剖と顕微解剖された試料の
電気泳動によって検出されることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】該標的分子が１つ以上の標的試料内にあり、標的分子が同
じ標的分子の異なる修飾状態を含み、該修飾が断片化、開裂、リン酸化、グリコ
シル化、メチル化、アルキル化、二量化、誘導体化、脱プリン、コンフォメーシ
ョン、又はリボシル化であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４３】該標的分子は同じタンパク質の異なるリン酸化状態を含み
、レポーター分子の各々は異なるリン酸化状態に異なるタンパク質と相互作用し
、該標的試料における該標的分子の検出が該標的試料における該タンパク質のリ
ン酸化状態を示すことを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】該標的分子は同じタンパク質の異なるグリコシル化状態を
含み、レポーター分子の各々は異なるグリコシル化状態に異なるタンパク質と相
互作用し、該標的試料における該標的分子の検出が該標的試料における該タンパ
ク質のグリコシル化状態を示すことを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】該標的分子は同じタンパク質の異なるポリ−ＡＤＰリボシ
ル化状態を含み、レポーター分子の各々は異なるポリ−ＡＤＰリボシル化状態に
異なるタンパク質と相互作用し、該標的試料における該標的分子の検出が該標的
試料における該タンパク質のポリ−ＡＤＰリボシル化状態を示すことを特徴とす
る請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】該標的分子は同じタンパク質の異なる断片を含み、レポー
ター分子の各々は異なる断片と相互作用し、該標的試料における該標的分子の検
出が該標的試料における該タンパク質の断片を示すことを特徴とする請求項４２
に記載の方法。
【請求項４７】該標的分子は同じタンパク質の異なるコンフォメーション
状態を含み、レポーター分子の各々は異なるコンフォメーション状態に異なるタ
ンパク質と相互作用し、該標的試料における該標的分子の検出が該標的試料にお
ける該タンパク質のコンフォメーション状態を示すことを特徴とする請求項４２
に記載の方法。
【請求項４８】該標的分子の少なくとも１つはプリオン・タンパク質であ
り、該コンフォメーション状態があるタンパク質のプリオン・コンフォメーショ
ンと該タンパク質の非プリオン・コンフォメーションを含むことを特徴とする請
求項４７に記載の方法。
【請求項４９】解読タグの存在、量、存在及び量、又は不在、のパターン
が該標的分子のカタログを構成することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５０】該標的分子が二つ以上の標的試料にあり、各標的試料に結
合した解読タグの存在、量、存在及び量、又は不在、のパターンが該標的試料に
おける該標的分子のカタログを構成し、該方法はさらに１つ以上のカタログを１つ以上の他のカタログと比較するステ
ップを含むことを特徴とする請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】該標的分子、レポーター分子、又は解読タグがあるアレー
にあり、各標的分子、レポーター分子、又は解読タグが該アレーの異なる場所で
固定され、解読タグの検出が該アレーにおける解読タグの存在、量、存在及び量
、又は不在、を検出することによって行われることを特徴とする請求項１に記載
の方法。
【請求項５２】該アレーにおける解読タグの場所、量、又は場所及び量、
が該アレーにおける解読タグのパターンを構成し、該方法はさらに、該アレーにおける解読タグのパターンを１つ以上の異なる標
的分子を用いて別の手順で決定されたアレーにおける解読タグのパターンと比較
するステップを含むことを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】さらに：該アレーにおける解読タグのパターンを複数の異なる１つ以上の標的分子を用
いる複数の別々の手順で決定されたアレーにおける解読タグのパターンと比較す
るステップを含むことを特徴とする請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】該標的分子が細胞に結合しており、該レポーター分子が該
標的分子に結合しており、各レポーター分子が選別タグを備え、該細胞は該選別
タグに基づいて選別されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５５】該標的分子が細胞上の細胞表面タンパク質であり、レポー
ター分子が細胞上のタンパク質と結合していることを特徴とする請求項５４に記
載の方法。
【請求項５６】該解読タグが高圧液体クロマトグラフィーによって分離さ
れ検出されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５７】各レポーター分子が特異的結合性分子を含み、該特異的結
合性分子が抗体、リガンド、結合タンパク質、受容体タンパク質、合成ポリアミ
ド、ハプテン、アプタマー、炭水化物、又はオリゴヌクレオチド、であることを
特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５８】該結合タンパク質が、１つ以上のジンクフィンガー・モチ
ーフ、ロイシンジッパー・モチーフ、ヘリックス・ターン・ヘリックス・モチー
フ、又はその組み合わせ、を含むＤＮＡ結合タンパク質であることを特徴とする
請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】該標的試料が固定化、定着、又は表面に付着されているこ
とを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６０】決定される該標的分子の場所が該表面上の該標的分子の場
所であることを特徴とする請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】試料内の多数の標的分子を検出する方法であって、該方法
が：（ａ）４つ以上の標的試料と１つ以上のレポーター分子を接触させるステップ、
ここで各標的試料は異なるレポーター分子の組と接触させられ、各レポーター分
子の組におけるレポーター分子は他のレポーター分子の組におけるレポーター分
子と異なっており、レポーター分子は標的試料の中の標的分子と結合する；（ｂ）４つ以上の標的試料を混合するステップ；（ｃ）１つ以上の解読タグをレポーター分子と結合させるステップ、ここで異な
る解読タグは各異なるレポーター分子に各解読タグがただ１つの標的試料と対応
するように対応している；（ｄ）解読タグを検出するステップ；を含み、検出のさい、又はその前に、解読タグはレポーター分子から解離し、
解読タグの検出は検出された解読タグに対応する標的分子の存在を示し、異なる
標的試料に対応する解読タグの検出は対応する標的試料における同じ標的分子の
存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項６２】さらに、ステップ（ｃ）の前に；レポーター分子を増幅して各レポーター分子に対して多数のレポータータグを
生成するステップ；を含み、レポータータグはレポーター分子と結合したままで
あり、各レポーター分子から生成されたレポータータグは他のレポーター分子か
ら生成されたレポータータグと異なっており、解読タグは解読タグをレポーター
タグと結合することによってレポーター分子に結合することを特徴とする請求項
６１に記載の方法。
【請求項６３】該レポーター分子が分岐ＤＮＡを用いて増幅されることを
特徴とする請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】各レポーター分子がレポーター信号を含み、各分岐ＤＮＡ
が多数のレポータータグと該レポーター信号と結合するテールとを含むことを特
徴とする請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】該レポーター分子がローリングサークル増幅を用いて増幅
されることを特徴とする請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】各レポーター分子がレポーター信号を含み、該レポーター
信号が増幅標的サークルのローリングサークル複製を開始させ、該増幅標的サー
クルは該レポーター信号と相補的な１つ以上の配列を含み、複製によってタンデ
ム配列ＤＮＡが生成され、該タンデム配列ＤＮＡは複数のレポータータグを含む
ことを特徴とする請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】該レポーター分子がオリゴヌクレオチドデンドリマーを用
いて増幅されることを特徴とする請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】各レポーター分子がレポーター信号を含み、同じレポータ
ー分子の組のレポーター分子は同じレポーター信号を有し、レポーター分子の増
幅は該レポーター信号を増幅することによって遂行されることを特徴とする請求
項６２に記載の方法。
【請求項６９】複数の解読タグが各標的試料に対応していることを特徴と
する請求項６１に記載の方法。
【請求項７０】該レポーター分子が、該レポーター分子を共有結合で該標
的分子と結合させることによって標的分子に結合することを特徴とする請求項６
１に記載の方法。
【請求項７１】該レポーター分子は、標的分子の合成の際に該レポーター
分子が取り込まれることによって該標的分子に結合することを特徴とする請求項
７０に記載の方法。
【請求項７２】各レポーター分子がプライマー部分とレポーター信号とを
含み、該プライマー部分が標的分子の合成を開始させ、解読タグとレポーター信
号とを結合させることによって解読タグがレポーター分子と結合することを特徴
とする請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】該レポーター信号がオリゴヌクレオチドであり、解読タグ
は該レポーター信号と相補的であるペプチド核酸であることを特徴とする請求項
７２に記載の方法。
【請求項７４】該レポーター分子は、該レポーター分子の反応基を標的分
子と反応させることによって標的分子と共有結合で結合されることを特徴とする
請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】解読タグが、オリゴヌクレオチド、炭水化物、ペプチド核
酸、合成ポリアミド、抗体、リガンド、タンパク質、ハプテン、ジンクフィンガ
ー、アプタマー、又は質量ラベルであることを特徴とする請求項６１に記載の方
法。
【請求項７６】標的分子がホーミング分子であり、ステップ（ａ）の前に
、標的試料又は標的試料の源が該ホーミング分子に曝露され、検出された解読タ
グに対応するホーミング分子の存在が標的試料内の該ホーミング分子が特異的な
分子の存在を示すことを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項７７】該標的試料が組織試料であり、ステップ（ａ）の前に、組
織試料の源が該ホーミング分子に曝露され、検出された解読タグに対応するホー
ミング分子の存在が該組織試料内の該ホーミング分子が特異的な細胞又は分子の
存在を示すことを特徴とする請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】標的分子が腫瘍ホーミング・ペプチドであり、検出された
解読タグに対応する腫瘍ホーミング・ペプチドの存在が該組織試料における腫瘍
細胞の存在を示すことを特徴とする請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】組織試料の源である生体がホーミング分子に曝露されるこ
とを特徴とする請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】該標的試料が細胞であり、該細胞が他の細胞から選別され
たものであることを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項８１】該細胞がある細胞マーカーの存在、不在、又は量の差に基
づいて選別されることを特徴とする請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】標的試料が生体であり、ステップ（ａ）の後、レポーター
分子を含む誘導標的試料が該生体から調製されることを特徴とする請求項６１に
記載の方法。
【請求項８３】標的試料が組織であり、ステップ（ａ）の後、レポーター
分子を含む誘導標的試料が該組織から調製されることを特徴とする請求項６１に
記載の方法。
【請求項８４】各解読タグが異なるレポーター分子に対応し、各レポータ
ー分子は異なる標的分子、又はある組み合わせ、に対応することを特徴とする請
求項６１に記載の方法。
【請求項８５】各解読タグがある単一のレポーター分子に対応し、各レポ
ーター分子はある単一の標的分子、又はある組み合わせ、に対応することを特徴
とする請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】各解読タグが多数のレポーター分子に対応し、各レポータ
ー分子は多数の標的分子、又はある組み合わせ、に対応することを特徴とする請
求項８４に記載の方法。
【請求項８７】さらに、ステップ（ｂ）の後に：混合された標的試料と捕獲アレーとを接触させるステップ；を含み、異なる標的分子がアレーの異なる要素と結合し、解読タグが結合して
いるアレー要素が該標的試料における該アレー要素に対応する標的分子の存在を
示すことを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項８８】該捕獲アレーが捕獲タグを備え、各アレー要素が異なる捕
獲タグを含むことを特徴とする請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】該捕獲タグがオリゴヌクレオチド、抗体、ハプテン、リガ
ンド、又はある組み合わせ、であることを特徴とする請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】該捕獲アレーが基体を含むことを特徴とする請求項８７に
記載の方法。
【請求項９１】該基質がビーズ、プレート、又はスライドを含むことを特
徴とする請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】少なくとも二つの解読タグが異なる蛍光、燐光、又は化学
ルミネッセンス発光の寿命によって時間的に識別されることを特徴とする請求項
６１に記載の方法。
【請求項９３】該解読タグが、核磁気共鳴、電子常磁性共鳴、表面増強ラ
マン散乱、表面プラズモン共鳴、蛍光、燐光、化学ルミネッセンス、共鳴ラマン
、マイクロ波、質量分析、又はある組み合わせ、によって検出可能であることを
特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項９４】該解読タグが、質量分析、電気泳動、又はクロマトグラフ
ィーによって検出されることを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項９５】該解読タグがペプチド核酸であり、該解読タグが質量分析
によって検出され、異なる解読タグは質量が異なることを特徴とする請求項６１
に記載の方法。
【請求項９６】各レポーター分子がレポーター信号および特異的結合性分
子を含み、各レポーター分子の該特異的結合性分子は異なる標的分子と相互作用
し、該レポーター信号はオリゴヌクレオチドであり、該解読タグは該レポーター
信号と相補的であるペプチド核酸であることを特徴とする請求項６１に記載の方
法。
【請求項９７】該解読タグが、該解読タグの存在、量、存在及び量、又は
不在、を決定することによって検出されることを特徴とする請求項６１に記載の
方法。
【請求項９８】該解読タグはペプチド核酸であり、各解読タグが異なる質
量を有することを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項９９】各レポーター分子があるレポーター信号を含み、各レポー
ター信号がオリゴヌクレオチドであり、各解読タグが該レポーター信号と相補的
な同数のヌクレオチド塩基を有することを特徴とする請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】各解読タグが異なる数の８−アミノ−３，６−ジオキサ
オクタン酸モノマーを含むことを特徴とする請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】該解読タグがマトリックス支援レーザー脱着／電離飛行
時間質量分析法によって検出されることを特徴とする請求項９８に記載の方法。
【請求項１０２】該解読タグが蛍光標識されたオリゴヌクレオチドであり
、各解読タグが長さと蛍光ラベルの異なる組み合わせを有することを特徴とする
請求項６１に記載の方法。
【請求項１０３】各レポーター分子がレポーター信号を含み、各レポータ
ー信号がオリゴヌクレオチドであり、各解読タグが同数の該レポーター信号と相
補的なヌクレオチドを有することを特徴とする請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】同じ蛍光ラベルを有する各解読タグが異なる数のレポー
タータグと相補的でないヌクレオチドを有することを特徴とする請求項１０３に
記載の方法。
【請求項１０５】該解読タグが標的試料の顕微解剖と顕微解剖された試料
の電気泳動によって検出されることを特徴とする請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０６】該解読タグがジンクフィンガーであることを特徴とする
請求項６１に記載の方法。
【請求項１０７】該標的分子が１つ以上の標的試料内にあり、標的分子が
同じ標的分子の異なる修飾状態を含み、該修飾が断片化、開裂、リン酸化、グリ
コシル化、メチル化、アルキル化、二量化、誘導体化、脱プリン、コンフォメー
ション、又はリボシル化であることを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項１０８】該標的分子は同じタンパク質の異なるリン酸化状態を含
み、レポーター分子の各々は異なるリン酸化状態に異なるタンパク質と相互作用
し、該標的試料における該標的分子の検出が該標的試料における該タンパク質の
リン酸化状態を示すことを特徴とする請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】該標的分子は同じタンパク質の異なるグリコシル化状態
を含み、レポーター分子の各々は異なるグリコシル化状態に異なるタンパク質と
相互作用し、該標的試料における該標的分子の検出が該標的試料における該タン
パク質のグリコシル化状態を示すことを特徴とする請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１０】該標的分子は同じタンパク質の異なるポリ−ＡＤＰリボ
シル化状態を含み、レポーター分子の各々は異なるポリ−ＡＤＰリボシル化状態
に異なるタンパク質と相互作用し、該標的試料における該標的分子の検出が該標
的試料における該タンパク質のポリ−ＡＤＰリボシル化状態を示すことを特徴と
する請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１１】該標的分子は同じタンパク質の異なる断片を含み、レポ
ーター分子の各々は異なる断片と相互作用し、該標的試料における該標的分子の
検出が該標的試料における該タンパク質の断片を示すことを特徴とする請求項１
０７に記載の方法。
【請求項１１２】該標的分子は同じタンパク質の異なるコンフォメーショ
ン状態を含み、レポーター分子の各々は異なるコンフォメーション状態に異なる
タンパク質と相互作用し、該標的試料における該標的分子の検出が該標的試料に
おける該タンパク質のコンフォメーション状態を示すことを特徴とする請求項１
０７に記載の方法。
【請求項１１３】該標的分子の少なくとも１つはプリオン・タンパク質で
あり、該コンフォメーション状態はあるタンパク質のプリオン・コンフォメーシ
ョンと該タンパク質の非プリオン・コンフォメーションとを含むことを特徴とす
る請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】解読タグの存在、量、存在及び量、又は不在、のパター
ンが該標的分子のカタログを構成することを特徴とする請求項６１に記載の方法
。
【請求項１１５】該標的分子が二つ以上の標的試料にあり、各標的試料に
結合した解読タグの存在、量、存在及び量、又は不在、のパターンが該標的試料
における該標的分子のカタログを構成し、該方法はさらに１つ以上のカタログを１つ以上の他のカタログと比較するステ
ップを含むことを特徴とする請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】該標的分子、レポーター分子、又は解読タグがあるアレ
ーにあり、各標的分子、レポーター分子、又は解読タグが該アレーの異なる場所
で固定され、解読タグの検出が該アレーにおける解読タグの存在、量、存在及び
量、又は不在、を検出することによって遂行されることを特徴とする請求項６１
に記載の方法。
【請求項１１７】該アレーにおける解読タグの場所、量、又は場所及び量
、が該アレーにおける解読タグのパターンを構成し、該方法はさらに、該アレーにおける解読タグのパターンを１つ以上の異なる標
的分子を用いて別の手順で決定されたアレーにおける解読タグのパターンと比較
するステップを含むことを特徴とする請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】さらに：該アレーにおける解読タグのパターンを複数の異なる１つ以上の標的分子を用
いる複数の別々の手順で決定されたアレーにおける解読タグのパターンと比較す
るステップを含むことを特徴とする請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】該標的分子が細胞に結合しており、該レポーター分子が
該標的分子に結合しており、各レポーター分子が選別タグを備え、該細胞は該選
別タグに基づいて選別されることを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項１２０】該標的分子が細胞上の細胞表面タンパク質であり、レポ
ーター分子が細胞上のタンパク質と結合していることを特徴とする請求項１１９
に記載の方法。
【請求項１２１】該解読タグが高圧液体クロマトグラフィーによって分離
され検出されることを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項１２２】各レポーター分子が特異的結合性分子を含み、該特異的
結合性分子が抗体、リガンド、結合タンパク質、レセプタ・タンパク質、合成ポ
リアミド、ハプテン、アプタマー、炭水化物、又はオリゴヌクレオチド、である
ことを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項１２３】該結合タンパク質が、１つ以上のジンクフィンガーモチ
ーフ、ロイシンジッパー・モチーフ、ヘリックス・ターン・ヘリックス・モチー
フ、又はある組み合わせ、を含むＤＮＡ結合タンパク質であることを特徴とする
請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】該標的試料が固定化、定着、又は表面に付着されている
ことを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項１２５】決定される該標的分子の場所が該表面上の該標的分子の
場所であることを特徴とする請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】試料内の多数の標的分子を検出する方法であって、該方
法が：（ａ）１つ以上の標的試料と１つ以上のレポーター分子とを接触させるステッ
プ、ここでレポーター分子は標的試料における標的分子と結合する；（ｂ）１つ以上の解読タグをレポーター分子と結合させるステップ、ここで異
なる解読タグは各異なるレポーター分子に対応し、解読タグはレポーター分子と
共有結合されない；（ｃ）解読タグを検出するステップ；を含み、検出のさい、又はその前に、解読タグはレポーター分子から解離し、
解読タグはレポーター分子に対応し、レポーター分子は標的分子に対応し、解読
タグの検出は検出された解読タグに対応する標的分子の存在を示し、レポーター
分子の存在は該レポーター分子に対応する標的分子の存在を示すことを特徴とす
る方法。
【請求項１２７】各レポーター分子が一つ以上の特異的結合性分子を含み
、各レポーター分子の該特異的結合性分子は異なる標的分子と相互作用すること
を特徴とする請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】さらに、ステップ（ｂ）の前に；レポーター分子を増幅して各レポーター分子に対して多数のレポータータグを
生成するステップ；を含み、該レポータータグはレポーター分子と結合したまま
であり、各レポーター分子から生成されたレポータータグは他のレポーター分子
から生成されたレポータータグと異なっており、解読タグは解読タグをレポータ
ータグと結合することによってレポーター分子に結合させることを特徴とする請
求項１２６に記載の方法。
【請求項１２９】該レポーター分子が分岐ＤＮＡを用いて増幅されること
を特徴とする請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】各レポーター分子がレポーター信号を含み、各分岐ＤＮ
Ａが多数のレポータータグと該レポーター信号と結合するテールとを含むことを
特徴とする請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】該レポーター分子がローリングサークル増幅を用いて増
幅されることを特徴とする請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３２】各レポーター分子がレポーター信号を含み、該レポータ
ー信号が増幅標的サークルのローリングサークル複製を開始させ、該増幅標的サ
ークルは該レポーター信号と相補的な１つ以上の配列を含み、複製によってタン
デム配列ＤＮＡが生成され、該タンデム配列ＤＮＡは複数のレポータータグを含
むことを特徴とする請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】該レポーター分子がオリゴヌクレオチドデンドリマーを
用いて増幅されることを特徴とする請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３４】該解読タグが、オリゴヌクレオチド、炭水化物、ペプチ
ド核酸、合成ポリアミド、抗体、リガンド、タンパク質、ハプテン、ジンクフィ
ンガー、アプタマー、又は質量ラベルであることを特徴とする請求項１２６に記
載の方法。
【請求項１３５】標的分子がホーミング分子であり、ステップ（ａ）の前
に、標的試料又は標的試料の源が該ホーミング分子に曝露され、検出された解読
タグに対応するホーミング分子の存在が標的試料内の該ホーミング分子が特異的
な分子の存在を示すことを特徴とする請求項１２６に記載の方法。
【請求項１３６】該標的試料が組織試料であり、ステップ（ａ）の前に、
組織試料の源が該ホーミング分子に曝露され、検出された解読タグに対応するホ
ーミング分子の存在が該組織試料内の該ホーミング分子が特異的な細胞又は分子
の存在を示すことを特徴とする請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】標的分子が腫瘍ホーミング・ペプチドであり、検出され
た解読タグに対応する腫瘍ホーミング・ペプチドの存在が該組織試料における腫
瘍細胞の存在を示すことを特徴とする請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】組織試料の源である生体がホーミング分子に曝露される
ことを特徴とする請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３９】該標的試料が組織試料であり、該組織試料が切片化され
た後に該組織試料がホーミング分子に曝露されることを特徴とする請求項１３５
に記載の方法。
【請求項１４０】該標的試料が細胞であり、該細胞が他の細胞から選別さ
れたものであることを特徴とする請求項１２６に記載の方法。
【請求項１４１】該細胞がある細胞マーカーの存在、不在、又は量の差に
基づいて選別されることを特徴とする請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】標的試料が生体であり、ステップ（ａ）の後、レポータ
ー分子を含む誘導標的試料が該生体から調製されることを特徴とする請求項１２
６に記載の方法。
【請求項１４３】標的試料が組織であり、ステップ（ａ）の後、レポータ
ー分子を含む誘導標的試料が該組織から調製されることを特徴とする請求項１２
６に記載の方法。
【請求項１４４】該誘導標的試料が該組織から調製される組織切片である
ことを特徴とする請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】各解読タグが異なるレポーター分子に対応し、各レポー
ター分子が異なる標的分子、又はある組み合わせ、に対応することを特徴とする
請求項１２６に記載の方法。
【請求項１４６】各解読タグが単一のレポーター分子に対応し、各レポー
ター分子が単一の標的分子、又はある組み合わせ、に対応することを特徴とする
請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】各解読タグが多数のレポーター分子に対応し、各レポー
ター分子が多数の標的分子、又はある組み合わせ、に対応することを特徴とする
請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４８】さらに、ステップ（ｂ）の後に：混合された標的試料と１つ以上の捕獲アレーとを接触させるステップ；を含み、異なる標的分子がアレーの異なる要素と結合し、解読タグが結合して
いるアレー要素が該アレー要素に対応する標的分子の該標的試料における存在を
示すことを特徴とする請求項１２６に記載の方法。
【請求項１４９】該捕獲アレーが捕獲タグを備え、各アレー要素が異なる
捕獲タグを含むことを特徴とする請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】該捕獲タグがオリゴヌクレオチド、抗体、ハプテン、リ
ガンド、又はある組み合わせ、であることを特徴とする請求項１４８に記載の方
法。
【請求項１５１】該捕獲アレーが基体を含むことを特徴とする請求項１４
８に記載の方法。
【請求項１５２】該基体がビーズ、プレート、又はスライドを含むことを
特徴とする請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】少なくとも二つの解読タグが異なる蛍光、燐光、又は化
学ルミネッセンス発光の寿命によって時間的に識別されることを特徴とする請求
項１２６に記載の方法。
【請求項１５４】該解読タグが、核磁気共鳴、電子常磁性共鳴、表面増強
ラマン散乱、表面プラズモン共鳴、蛍光、燐光、化学ルミネッセンス、共鳴ラマ
ン、マイクロ波、質量分析、又はある組み合わせ、によって検出可能であること
を特徴とする請求項１２６に記載の方法。
【請求項１５５】該解読タグが、質量分析、電気泳動、又はクロマトグラ
フィーによって検出されることを特徴とする請求項１２６に記載の方法。
【請求項１５６】該解読タグがペプチド核酸であり、該解読タグが質量分
析によって検出され、異なる解読タグは質量が異なることを特徴とする請求項１
２６に記載の方法。
【請求項１５７】各レポーター分子がレポーター信号および特異的結合性
分子を含み、各レポーター分子の該特異的結合性分子は異なる標的分子と相互作
用し、該レポーター信号はオリゴヌクレオチドであり、該解読タグは該レポータ
ー信号と相補的であるペプチド核酸であることを特徴とする請求項１５６に記載
の方法。
【請求項１５８】該特異的結合性分子がオリゴヌクレオチドであり、該特
異的結合性分子が標的分子にハイブリダイズし、該特異的結合性分子の各々は標
的分子にハイブリダイズしていないときはステム・アンド・ループを形成し、該
特異的結合性分子が標的分子にハイブリダイズするときにはステムが破壊される
ことを特徴とする請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】解読タグが、解読タグの存在、量、存在及び量、又は不
在、を決定することによって検出されることを特徴とする請求項１２６に記載の
方法。
【請求項１６０】該解読タグはペプチド核酸であり、各解読タグが異なる
質量を有することを特徴とする請求項１２６に記載の方法。
【請求項１６１】各レポーター分子があるレポーター信号を含み、各レポ
ーター信号がオリゴヌクレオチドであり、各解読タグが該レポーター信号と相補
的な同数のヌクレオチド塩基を有することを特徴とする請求項１６０に記載の方
法。
【請求項１６２】各解読タグが異なる数の８−アミノ−３，６−ジオキサ
オクタン酸モノマーを含むことを特徴とする請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】該解読タグがマトリックス支援レーザー脱着／電離飛行
時間質量分析法によって検出されることを特徴とする請求項１６０に記載の方法
。
【請求項１６４】該解読タグが蛍光標識されたオリゴヌクレオチドであり
、各解読タグが長さと蛍光ラベルの異なる組み合わせを有することを特徴とする
請求項１２６に記載の方法。
【請求項１６５】各レポーター分子がレポーター信号を含み、各レポータ
ー信号がオリゴヌクレオチドであり、各解読タグが同数の該レポーター信号と相
補的なヌクレオチドを有することを特徴とする請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】同じ蛍光ラベルを有する各解読タグが異なる数のレポー
タータグと相補的でないヌクレオチドを有することを特徴とする請求項１６５に
記載の方法。
【請求項１６７】該解読タグが標的試料の顕微解剖と顕微解剖された試料
の電気泳動によって検出されることを特徴とする請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６８】該解読タグがジンクフィンガーであることを特徴とする
請求項１２６に記載の方法。
【請求項１６９】該標的分子が１つ以上の標的試料内にあり、標的分子が
同じ標的分子の異なる修飾状態を含み、該修飾が断片化、開裂、リン酸化、グリ
コシル化、メチル化、アルキル化、二量化、誘導体化、脱プリン、コンフォメー
ション、又はリボシル化であることを特徴とする請求項１２６に記載の方法。
【請求項１７０】該標的分子は同じタンパク質の異なるリン酸化状態を含
み、レポーター分子の各々は異なるリン酸化状態に異なるタンパク質と相互作用
し、該標的試料における該標的分子の検出が該標的試料における該タンパク質の
リン酸化状態を示すことを特徴とする請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７１】該標的分子は同じタンパク質の異なるグリコシル化状態
を含み、レポーター分子の各々は異なるグリコシル化状態に異なるタンパク質と
相互作用し、該標的試料における該標的分子の検出が該標的試料における該タン
パク質のグリコシル化状態を示すことを特徴とする請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７２】該標的分子は同じタンパク質の異なるポリ−ＡＤＰリボ
シル化状態を含み、レポーター分子の各々は異なるポリ−ＡＤＰリボシル化状態
に異なるタンパク質と相互作用し、該標的試料における該標的分子の検出が該標
的試料における該タンパク質のポリ−ＡＤＰリボシル化状態を示すことを特徴と
する請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７３】該標的分子は同じタンパク質の異なる断片を含み、レポ
ーター分子の各々は異なる断片と相互作用し、該標的試料における該標的分子の
検出が該標的試料における該タンパク質の断片を示すことを特徴とする請求項１
６９に記載の方法。
【請求項１７４】該標的分子は同じタンパク質の異なるコンフォメーショ
ン状態を含み、レポーター分子の各々は異なるコンフォメーション状態に異なる
タンパク質と相互作用し、該標的試料における該標的分子の検出が該標的試料に
おける該タンパク質のコンフォメーション状態を示すことを特徴とする請求項１
６９に記載の方法。
【請求項１７５】該標的分子の少なくとも１つはプリオン・タンパク質で
あり、該コンフォメーション状態はあるタンパク質のプリオン・コンフォメーシ
ョンと該タンパク質の非プリオン・コンフォメーションとを含むことを特徴とす
る請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７６】解読タグの存在、量、存在及び量、又は不在、のパター
ンが該標的分子のカタログを構成することを特徴とする請求項１２６に記載の方
法。
【請求項１７７】該標的分子が二つ以上の標的試料にあり、各標的試料に
結合した解読タグの存在、量、存在及び量、又は不在、のパターンが該標的試料
における該標的分子のカタログを構成し、該方法はさらに１つ以上のカタログを１つ以上の他のカタログと比較するステ
ップを含むことを特徴とする請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７８】該標的分子、レポーター分子、又は解読タグがあるアレ
ーにあり、各標的分子、レポーター分子、又は解読タグが該アレーの異なる場所
で固定され、解読タグの検出が該アレーにおける解読タグの存在、量、存在及び
量、又は不在、を検出することによって遂行されることを特徴とする請求項１２
６に記載の方法。
【請求項１７９】該アレーにおける解読タグの場所、量、又は場所及び量
、が該アレーにおける解読タグのパターンを構成し、該方法はさらに、該アレーにおける解読タグのパターンを１つ以上の異なる標
的分子を用いて別の手順で決定されたアレーにおける解読タグのパターンと比較
するステップを含むことを特徴とする請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８０】さらに：該アレーにおける解読タグのパターンを複数の異なる１つ以上の標的分子を用
いる複数の別々の手順で決定されたアレーにおける解読タグのパターンと比較す
るステップを含むことを特徴とする請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８１】該標的分子が細胞に結合しており、該レポーター分子が
該標的分子に結合しており、各レポーター分子が選別タグを備え、該細胞は該選
別タグに基づいて選別されることを特徴とする請求項１２６に記載の方法。
【請求項１８２】該標的分子が細胞上の細胞表面タンパク質であり、レポ
ーター分子が細胞上のタンパク質と結合していることを特徴とする請求項１８１
に記載の方法。
【請求項１８３】該解読タグが高圧液体クロマトグラフィーによって分離
され検出されることを特徴とする請求項１２６に記載の方法。
【請求項１８４】各レポーター分子が特異的結合性分子を含み、該特異的
結合性分子が抗体、リガンド、結合タンパク質、レセプタ・タンパク質、合成ポ
リアミド、ハプテン、アプタマー、炭水化物、又はオリゴヌクレオチド、である
ことを特徴とする請求項１２６に記載の方法。
【請求項１８５】該結合タンパク質が、１つ以上のジンクフィンガーモチ
ーフ、ロイシンジッパー・モチーフ、ヘリックス・ターン・ヘリックス・モチー
フ、又はある組み合わせ、を含むＤＮＡ結合タンパク質であることを特徴とする
請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８６】該標的試料が固定化、定着、又は表面に付着されている
ことを特徴とする請求項１２６に記載の方法。
【請求項１８７】決定される該標的分子の場所が該表面上の該標的分子の
場所であることを特徴とする請求項１８６に記載の方法。
【請求項１８８】試料内の多数の標的分子を検出する方法であって、該方
法が：（ａ）１つ以上の標的試料と１つ以上のレポーター担体とを接触させるステッ
プ、ここでレポーター担体は１つ以上の特異的結合性分子、担体、及び該担体に
結合した複数の解読タグを含む；（ｂ）解読タグを検出するステップ；を含み、解読タグはレポーター担体に対応し、レポーター担体は標的分子に対応
し、解読タグを検出することは検出された該解読タグに対応するレポーター担体
の存在を示し、レポーター担体の存在は該レポーター担体に対応する標的分子の
存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項１８９】該担体がリポゾームであることを特徴とする請求項１８
８に記載の方法。
【請求項１９０】各レポーター担体が少なくとも１，０００の解読タグを
含むことを特徴とする請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９１】該解読タグが、質量分析、電気泳動、又はクロマトグラ
フィーによって検出されることを特徴とする請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９２】該担体がウイルス粒子であり、該解読タグがセレン置換
メチオニンを含むウイルス・タンパク質であり、該解読タグが質量分析によって
検出され、異なる解読タグがセレンによる質量差によって識別されることを特徴
とする請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９３】各レポーター担体の特異的結合性分子が異なる標的分子
と相互作用し、異なる解読タグが各異なるレポーター担体に対応することを特徴
とする請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９４】解読タグが、検出のさい、又はその前に、レポーター担
体から解離することを特徴とする請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９５】標的分子がホーミング分子であり、ステップ（ａ）の前
に、標的試料又は標的試料の源が該ホーミング分子に曝露され、検出された解読
タグに対応するホーミング分子の存在が標的試料内の該ホーミング分子が特異的
な分子の存在を示すことを特徴とする請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９６】該標的試料が組織試料であり、ステップ（ａ）の前に、
組織試料の源が該ホーミング分子に曝露され、検出された解読タグに対応するホ
ーミング分子の存在が該組織試料内の該ホーミング分子が特異的な細胞又は分子
の存在を示すことを特徴とする請求項１９５に記載の方法。
【請求項１９７】標的分子が腫瘍ホーミング・ペプチドであり、検出され
た解読タグに対応する腫瘍ホーミング・ペプチドの存在が該組織試料における腫
瘍細胞の存在を示すことを特徴とする請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９８】組織試料の源である生体がホーミング分子に曝露される
ことを特徴とする請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９９】該標的試料が組織試料であり、該組織試料が切片化され
た後に該組織試料がホーミング分子に曝露されることを特徴とする請求項１９５
に記載の方法。
【請求項２００】該標的試料が細胞であり、該細胞が他の細胞から選別さ
れたものであることを特徴とする請求項１８８に記載の方法。
【請求項２０１】該細胞がある細胞マーカーの存在、不在、又は量の差に
基づいて選別されることを特徴とする請求項２００に記載の方法。
【請求項２０２】標的試料が生体であり、ステップ（ａ）の後、レポータ
ー担体を含む誘導標的試料が該生体から調製されることを特徴とする請求項１８
８に記載の方法。
【請求項２０３】標的試料が組織であり、ステップ（ａ）の後、レポータ
ー担体を含む誘導標的試料が該組織から調製されることを特徴とする請求項１８
８に記載の方法。
【請求項２０４】該誘導標的試料が該組織から調製される組織切片である
ことを特徴とする請求項２０３に記載の方法。
【請求項２０５】各解読タグが異なるレポーター担体に対応し、各レポー
ター担体が異なる標的分子、又はある組み合わせ、に対応することを特徴とする
請求項１８８に記載の方法。
【請求項２０６】各解読タグが単一のレポーター担体に対応し、各レポー
ター担体が単一の標的分子、又はある組み合わせ、に対応することを特徴とする
請求項２０５に記載の方法。
【請求項２０７】各解読タグが多数のレポーター担体に対応し、各レポー
ター担体が多数の標的分子、又はある組み合わせ、に対応することを特徴とする
請求項２０５に記載の方法。
【請求項２０８】さらに、ステップ（ａ）の後に：混合された標的試料と１つ以上の捕獲アレーとを接触させるステップ；を含み、異なる標的分子がアレーの異なる要素と結合し、解読タグが結合して
いるアレー要素が該アレー要素に対応する標的分子の該標的試料における存在を
示すことを特徴とする請求項１８８に記載の方法。
【請求項２０９】該捕獲アレーが捕獲タグを備え、各アレー要素が異なる
捕獲タグを含むことを特徴とする請求項２０８に記載の方法。
【請求項２１０】該捕獲タグがオリゴヌクレオチド、抗体、ハプテン、リ
ガンド、又はある組み合わせ、であることを特徴とする請求項２０８に記載の方
法。
【請求項２１１】該捕獲アレーが基体を含むことを特徴とする請求項２０
８に記載の方法。
【請求項２１２】該基体がビーズ、プレート、又はスライドを含むことを
特徴とする請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１３】少なくとも二つの解読タグが異なる蛍光、燐光、又は化
学ルミネッセンス発光の寿命によって時間的に識別されることを特徴とする請求
項１８８に記載の方法。
【請求項２１４】該解読タグが、核磁気共鳴、電子常磁性共鳴、表面増強
ラマン散乱、表面プラズモン共鳴、蛍光、燐光、化学ルミネッセンス、共鳴ラマ
ン、マイクロ波、質量分析、又はある組み合わせ、によって検出可能であること
を特徴とする請求項１８８に記載の方法。
【請求項２１５】該解読タグが、質量分析、電気泳動、又はクロマトグラ
フィーによって検出されることを特徴とする請求項１８８に記載の方法。
【請求項２１６】該解読タグがペプチド核酸であり、該解読タグが質量分
析によって検出され、異なる解読タグは質量が異なることを特徴とする請求項１
８８に記載の方法。
【請求項２１７】各レポーター担体の該特異的結合性分子は異なる標的分
子と相互作用し、該解読タグはペプチド核酸であることを特徴とする請求項２１
６に記載の方法。
【請求項２１８】解読タグが、解読タグの存在、量、存在及び量、又は不
在、を決定することによって検出されることを特徴とする請求項１８８に記載の
方法。
【請求項２１９】該解読タグはペプチド核酸であり、各解読タグが異なる
質量を有することを特徴とする請求項１８８に記載の方法。
【請求項２２０】各解読タグが異なる数の８−アミノ−３，６−ジオキサ
オクタン酸モノマーを含むことを特徴とする請求項２１９に記載の方法。
【請求項２２１】該解読タグがマトリックス支援レーザー脱着／電離飛行
時間質量分析法によって検出されることを特徴とする請求項２１９に記載の方法
。
【請求項２２２】該解読タグが蛍光標識されたオリゴヌクレオチドであり
、各解読タグが長さと蛍光ラベルの異なる組み合わせを有することを特徴とする
請求項１８８に記載の方法。
【請求項２２３】該解読タグが標的試料の顕微解剖と顕微解剖された試料
の電気泳動によって検出されることを特徴とする請求項２２２に記載の方法。
【請求項２２４】該解読タグがジンクフィンガーであることを特徴とする
請求項１８８に記載の方法。
【請求項２２５】該標的分子が１つ以上の標的試料内にあり、標的分子が
同じ標的分子の異なる修飾状態を含み、該修飾が断片化、開裂、リン酸化、グリ
コシル化、メチル化、アルキル化、二量化、誘導体化、脱プリン、コンフォメー
ション、又はリボシル化であることを特徴とする請求項１８８に記載の方法。
【請求項２２６】該標的分子は同じタンパク質の異なるリン酸化状態を含
み、特異的結合性分子の各々は異なるリン酸化状態に異なるタンパク質と相互作
用し、該標的試料における該標的分子の検出が該標的試料における該タンパク質
のリン酸化状態を示すことを特徴とする請求項２２５に記載の方法。
【請求項２２７】該標的分子は同じタンパク質の異なるグリコシル化状態
を含み、特異的結合性分子の各々は異なるグリコシル化状態に異なるタンパク質
と相互作用し、該標的試料における該標的分子の検出が該標的試料における該タ
ンパク質のグリコシル化状態を示すことを特徴とする請求項２２５に記載の方法
。
【請求項２２８】該標的分子は同じタンパク質の異なるポリ−ＡＤＰリボ
シル化状態を含み、特異的結合性分子の各々は異なるポリ−ＡＤＰリボシル化状
態に異なるタンパク質と相互作用し、該標的試料における該標的分子の検出が該
標的試料における該タンパク質のポリ−ＡＤＰリボシル化状態を示すことを特徴
とする請求項２２５に記載の方法。
【請求項２２９】該標的分子は同じタンパク質の異なる断片を含み、特異
的結合性分子の各々は異なる断片と相互作用し、該標的試料における該標的分子
の検出が該標的試料における該タンパク質の断片を示すことを特徴とする請求項
２２５に記載の方法。
【請求項２３０】該標的分子は同じタンパク質の異なるコンフォメーショ
ン状態を含み、特異的結合性分子の各々は異なるコンフォメーション状態に異な
るタンパク質と相互作用し、該標的試料における該標的分子の検出が該標的試料
における該タンパク質のコンフォメーション状態を示すことを特徴とする請求項
２２５に記載の方法。
【請求項２３１】該標的分子の少なくとも１つはプリオン・タンパク質で
あり、該コンフォメーション状態はあるタンパク質のプリオン・コンフォメーシ
ョンと該タンパク質の非プリオン・コンフォメーションとを含むことを特徴とす
る請求項２３０に記載の方法。
【請求項２３２】解読タグの存在、量、存在及び量、又は不在、のパター
ンが該標的分子のカタログを構成することを特徴とする請求項１８８に記載の方
法。
【請求項２３３】該標的分子が二つ以上の標的試料にあり、各標的試料に
結合した解読タグの存在、量、存在及び量、又は不在、のパターンが該標的試料
における該標的分子のカタログを構成し、該方法はさらに１つ以上のカタログを１つ以上の他のカタログと比較するステ
ップを含むことを特徴とする請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３４】該標的分子、又はレポーター担体があるアレーにあり、
各標的分子、又はレポーター担体が該アレーの異なる場所で固定され、解読タグ
の検出が該アレーにおける解読タグの存在、量、存在及び量、又は不在、を検出
することによって遂行されることを特徴とする請求項１８８に記載の方法。
【請求項２３５】該アレーにおける解読タグの場所、量、又は場所及び量
、が該アレーにおける解読タグのあるパターンを構成し、該方法はさらに、該アレーにおける解読タグのパターンを１つ以上の異なる標
的分子を用いて別の手順で決定されたアレーにおける解読タグのパターンと比較
するステップを含むことを特徴とする請求項２３４に記載の方法。
【請求項２３６】さらに：該アレーにおける解読タグのパターンを複数の異なる１つ以上の標的分子を用
いて複数の別々の手順で決定されたアレーにおける解読タグのパターンと比較す
るステップを含むことを特徴とする請求項２３５に記載の方法。
【請求項２３７】該標的分子が細胞に結合しており、該レポーター担体が
該標的分子に結合しており、各レポーター担体が選別タグを備え、該細胞は該選
別タグに基づいて選別されることを特徴とする請求項１８８に記載の方法。
【請求項２３８】該標的分子が細胞上の細胞表面タンパク質であり、該レ
ポーター担体が細胞上のタンパク質と結合していることを特徴とする請求項２３
７に記載の方法。
【請求項２３９】該解読タグが高圧液体クロマトグラフィーによって分離
され検出されることを特徴とする請求項１８８に記載の方法。
【請求項２４０】該特異的結合性分子が抗体、リガンド、結合タンパク質
、レセプタ・タンパク質、合成ポリアミド、ハプテン、アプタマー、炭水化物、
又はオリゴヌクレオチド、であることを特徴とする請求項１８８に記載の方法。
【請求項２４１】該結合タンパク質が、１つ以上のジンクフィンガーモチ
ーフ、ロイシンジッパー・モチーフ、ヘリックス・ターン・ヘリックス・モチー
フ、又はある組み合わせ、を含むＤＮＡ結合タンパク質であることを特徴とする
請求項２４０に記載の方法。
【請求項２４２】該標的試料が固定化、固定、又は表面に付着されている
ことを特徴とする請求項１８８に記載の方法。
【請求項２４３】決定される該標的分子の場所が該表面上の該標的分子の
場所であることを特徴とする請求項２４２に記載の方法。