JP2002522057A - 蛋白質・核酸融合分子ライブラリーを用いた化合物・蛋白質相互作用の同定 - Google Patents

蛋白質・核酸融合分子ライブラリーを用いた化合物・蛋白質相互作用の同定

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Abstract

(57)【要約】 本明細書において、次の段階を含む、化合物・蛋白質相互作用を検出する方法を開示する：（a）各要素が固相支持体上に固定された化合物ライブラリーを調製する段階；（b）単一反応槽において、化合物・融合物の複合体が形成される条件下で、該固定化化合物ライブラリーの各要素を蛋白質・核酸融合物ライブラリーの各要素と接触させる段階；（c）化合物・融合物の固定化複合体を単離する段階；（d）化合物と相互作用する融合物中の蛋白質を指標として、該化合物・融合物の複合体を検出する段階。好ましい態様においては、該融合物の核酸部分を識別することによって蛋白質が同定され、また、化合物若しくは固相支持体のいずれかに結合した検出可能なタグを識別することによって化合物が同定される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 本発明は概して核酸・蛋白質融合物に関するスクリーニング法を特徴とする。
【０００２】 コンビナトリアル・ケミストリー等の新しい合成法による、若しくは天然化合
物として薬学的に集積されてきた低分子化合物の膨大なコレクションに関して、
スクリーニング法は、蛋白質とこのような低分子化合物との間の結合相互作用を
同定するための効率のよい方法であると考えられる（TIBTECH, vol. 13, p. 115
, 1995）。しかしながら、多くのスクリーニング法では、広範なスクリーニング
が要求され、これが重要な問題となる。つまり、このような手法では、スクリー
ニングの材料をいつでもすぐに供給できることが最も重要な課題となるのである
。異なる標的蛋白質に関する低分子化合物ライブラリーのスクリーニングには、
十分な量の化合物を必要とする。また、規模の大きな化合物ライブラリー（例え
ば、化合物の種類に関して106 若しくはそれ以上の多様性を有するもの）のスク
リーニングには、多量のリコンビナント蛋白質が必要となる。また、スクリーニ
ングを迅速にかつ低コストで実施できるかという別の課題もある。 異なる標的
蛋白質に関する低分子化合物ライブラリーのスクリーニングは、これを連続的に
実施するのは一般的に時間のかかるものである。
【０００３】 最近、所望の性質に着目して、多様な蛋白質の混合物から特定の蛋白質を単離
する方法についての報告があった（Szostak 等、 Selection of Proteins Using
RNA-Protein Fusions, U.S.S.N. 09/007,005, January 14, 1998； U.S.S.N. 0
9/247,190, February 9, 1999；及び Roberts と Szostak、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA (1997) vol. 94, p. 12297-12302）。 これは、各々の蛋白質をそれを
コードしているRNAと共有結合で結合した蛋白質・RNA融合分子を用いることによ
って実施する方法である。この蛋白質・RNA融合法は、蛋白質・蛋白質相互作用
に基づくcDNAライブラリーのスクリーニング及び新規の遺伝子のクローニングに
利用できる（例えば、Szostak 等 Selection of Proteins Using RNA-Protein F
usions, U.S.S.N. 09/007,005, January 14, 1998； 及び U.S.S.N. 09/247,190
, February 9, 1999を参照）。
【０００４】発明の概要 本発明の目的は、低分子化合物を蛋白質・核酸融合物（例えば、蛋白質・RNA
融合物）のライブラリーで平行してスクリーニングすることにより、蛋白質・化
合物結合相互作用（および特に蛋白質・低分子相互作用）を効率よく同定するこ
とであり、それにより低分子・蛋白質の対に関するカタログを提供することであ
る。
【０００５】 従って、第一の局面において、本発明は、化合物・蛋白質相互作用を検出する
方法ｋを特徴とし、この方法は以下の段階を含む：すなわち、（a）化合物ライ
ブラリーの各要素が固相支持体に固定されている化合物ライブラリーを調製する
段階；（b）単一反応槽において、化合物・融合物の複合体が形成される条件下
で、固定化化合物ライブラリーの各要素を蛋白質・核酸融合物ライブラリーの各
要素と接触させる段階；（c）化合物・融合物の固定化複合体を単離する段階；
および（d）融合物中の蛋白質が化合物と相互作用することの指標として、化合
物・融合物の複合体を検出する段階。
【０００６】 好ましい態様において、蛋白質・核酸融合物は、蛋白質・RNA融合物、蛋白質
・DNA融合物、若しくはDNA・RNAハイブリッドに融合した蛋白質のいずれかであ
り；固相支持体はビーズであり；各ビーズは、検出可能な単一の標識と共にコー
ドされており；蛋白質・核酸融合物の複合体中の化合物は、ビーズに結合した該
検出可能な単一の標識で同定され；該検出可能な標識は、ペプチド標識、核酸標
識、化学的標識、蛍光標識、若しくはラジオ・フリーケンシー・タグであり；固
相支持体はチップであり且つ化合物ライブラリーはチップ上にアドレス化可能な
アレイとして固定され；蛋白質・核酸融合物ライブラリーの各要素は、検出可能
な標識が施され；化合物・融合物複合体若しくはその構成要素は、固相支持体か
ら遊離させることにより回収され；本法は、さらに固相支持体からの蛋白質・核
酸融合物の回収、及び蛋白質の同定を含み；蛋白質の同定は、蛋白質・核酸融合
物の核酸部分の配列によって決定され；且つ、化合物は低分子である。
【０００７】 関連する局面において、本発明は、化合物・蛋白質相互作用を検出する方法を
特徴とし、この方法は以下の工程を含む：すなわち、（a）固相支持体上に固定
された化合物を調製し、（b）固定化化合物を蛋白質・核酸融合物が化合物と結
合する条件下で蛋白質・核酸融合物ライブラリーと接触させ、（c）蛋白質・核
酸融合物中の蛋白質が化合物と相互作用することの指標として、結合した蛋白質
・核酸融合物を検出する。
【０００８】 好ましい態様において、該蛋白質・核酸融合物は、蛋白質・RNA融合物、蛋白
質・DNA融合物、若しくはDNA・RNAハイブリッドに融合した蛋白質のいずれかで
あり、該蛋白質・核酸融合物は、検出可能な標識を施され、該相互作用は、検出
可能な標識と固相支持体との結合を指標とするものである。結合した蛋白質・核
酸融合物は、固相支持体から遊離させて回収する。本法は、さらに固相支持体か
らの蛋白質・核酸融合物の回収、及び蛋白質の同定を含む。蛋白質の同定は、蛋
白質・核酸融合物の核酸部分の配列によって成される。固相支持体は、 カラム
、スライドガラス、チップ、若しくはビーズである。また、該化合物は低分子の
化合物である。
【０００９】 本明細書において用いられる「ライブラリー」とは、少なくとも2分子（例え
ば、化合物若しくは蛋白質・核酸融合物等の分子）から成る集合体を意味する。
化合物ライブラリーは、好ましくは、少なくとも102若しくは103の要素を含み、
より好ましくは、少なくとも104、105、若しくは106の要素を含む。蛋白質・核
酸ライブラリー（例えば、蛋白質・RNAライブラリー）は、好ましくは、少なく
とも102、若しくは103の要素を含み、より好ましくは、少なくとも104、105、若
しくは106の要素を含み、最も好ましくは、少なくとも1010、若しくは1012の要
素を含む。
【００１０】 「DNA・RNAハイブリッド」とは、相補的RNA鎖とハイブリダイズしたDNA鎖を意
味する。通常、DNA鎖は、RNA分子の逆転写によって生ずる。
【００１１】 「アドレス化可能なアレイ」とは、その対象物の同定が知られているか、若し
くは容易に決定できる、固相表面上に固定された対象物の固着パターンを意味す
る。
【００１２】 「低分子」とは、その分子量が、10,000ダルトン以下の化合物、好ましくは10
00ダルトン以下の化合物、最も好ましくは500ダルトン以下の化合物を意味する
。
【００１３】 本発明により、多くの利点が提供される。例えば、本法により、スクリーニン
グするのに必要な材料の量が減少する。標準的なスクリーニングでは、各化合物
は空間的に分離された槽の中の単一の蛋白質を用いてスクリーニングが成される
ため、かなりの量の蛋白質と低分子化合物が必要である。しかしながら、結合相
互作用を調べるための低分子化合物による蛋白質・核酸融合分子ライブラリーの
スクリーニングは、同一反応槽にて平行して実施することができる。さらに、標
的蛋白質をクローン化、過剰発現、若しくは単離する必要はなく、蛋白質・核酸
融合分子としてスクリーニングを行い、それをコードする核酸によって同定を行
う。さらには、本小型化スクリーニング法により材料コストがさらに低減されう
る。このようなコストの低減は、本法によって容易となり、また低分子と融合物
との複合体の同定に関する検出方法の選択によってのみ制限される。
【００１４】 さらに、本発明は化合物のスクリーニングの実施に要する時間に関して利点を
有する。特に、本明細書に記載の方法は、標的蛋白質のライブラリーを、リガン
ドを含みうるライブラリーで平行してスクリーニングすることにより、リガンド
（例えば、低分子リガンド）の同定に要する時間を短縮することができる。標準
的なスクリーニング法、つまり連続的に異なった蛋白質に対する結合についてス
クリーニングする低分子化合物ライブラリーのスクリーニングとは対照的に、本
法では、単一アッセイにおいて低分子化合物を蛋白質・核酸融合物ライブラリー
でスクリーニングすることができる。従って、本発明では、蛋白質ライブラリー
の各要素へ結合する低分子化合物ライブラリーの各要素のスクリーニングを非常
に高効率に実施することができる。
【００１５】 本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明
らかになると思われる。
【００１６】詳細な説明 本発明の方法は、化合物を蛋白質・核酸融合物のライブラリー（例えば、蛋白
質・RNA融合物）でスクリーニングし、それにより化合物・蛋白質対のカタログ
が得られることにより、蛋白質・化合物（および、好ましくは、蛋白質・低分子
化合物）の結合相互作用の効率的な同定を容易にする。必要に応じて、化合物ラ
イブラリーを、単一のスクリーニングにおいて、蛋白質・核酸融合物のライブラ
リーに対してスクリーニングしてもよい。好ましい態様において、スクリーニン
グ及び/若しくは結果判定の簡素化のために、化合物または該融合物のいずれか
が固相支持体（例えば、ビーズ、チップ、スライドガラス、若しくはカラム）上
に固定される。さらに、化合物・蛋白質対の同定を容易にする目的で、化合物（
または、固定化の行われる固相支持体）を特定の化合物または化合物ファミリー
に特徴的であるような検出可能な標識を用いて標識してもよい。
【００１７】 スクリーニングの好ましい標的は低分子であるが、本発明の方法でスクリーニ
ングされる化合物はいかなるものであってもよい。
【００１８】 本発明の上記及びその他の局面を、以下にさらに詳しく説明する。これらの実
施例は、本発明を説明する目的で示されるものであって、これらのみに限定され
るものではない。
【００１９】スクリーニング・アッセイ法 上記のように、蛋白質・核酸融合物（例えば、 蛋白質・RNA融合物）に対する
化合物のスクリーニングは、多くの異なる様式で実施することができる。一つの
特定の様式を図1に示している。この方法では、単一化合物がカラム、若しくは
その他の固相の表面に、多様な標準的方法のうちのいずれかを用いて固定化され
る。次に非特異的結合を低減させるために、固相に結合した低分子化合物を、BS
A若しくは他の不活性蛋白質を含むスクリーニング用緩衝液でインキュベートす
る。次に、緩衝液を除去し、化合物を表出している固相を蛋白質・核酸融合物ラ
イブラリーの溶液と共にインキュベートした後、非特異的に結合した融合分子を
除去するためにスクリーニング用緩衝液で洗浄する。その後、特異的に結合した
蛋白質・核酸融合物を溶出する（例えば、結合していない低分子化合物を含む緩
衝液で親和性溶出を行う）。溶出した融合分子の核酸（例えば、RNA）部分を「
識別」することによって、低分子化合物に結合した蛋白質が同定される。かかる
「識別」は後述のような方法で行われる。
【００２０】 また、複数の化合物のスクリーニングを複数の蛋白質・核酸融合物に対して同
時に行ってもよい。このようなタイプのスクリーニングを異なる二通りの様式で
行った例が、図2及び3に示されている。 これらの様式では、コード化された（
アドレス化可能な）低分子化合物ライブラリーがビーズ、若しくはチップ等その
他の表面上に固定化されている。次に非特異的結合を低減するために、固相結合
化ライブラリーを、BSA若しくは他の不活性蛋白質を含むスクリーニング用緩衝
液でインキュベートする。次に、緩衝液を除き、低分子化合物ライブラリーを融
合物ライブラリーと共にインキュベートする。その後、非特異的に結合した融合
分子を除去するためにスクリーニング用緩衝液で洗浄する。低分子に特異的に結
合した蛋白質・核酸融合分子を検出する、若しくは、ビーズが用いられている場
合には、分別し回収する。識別コード（またはタグ若しくはアドレス）を用いて
、低分子化合物を同定し、さらに結合した融合分子の核酸部分の識別によって蛋
白質の同定を（後述のように）行う。
【００２１】 異なる遺伝子型、及び異なる表現型の蛋白質・核酸融合分子が、同一の低分子
化合物に結合する場合がある。それゆえ、必要に応じて、融合分子の結合画分を
集め、増幅し、よりストリンジェントな条件（例えば、蛋白質・核酸融合物の濃
度がより低い条件）下で、同定されたリガンドと共に再びインキュベートする。
所望のリガンド親和性を有する受容体の単離（例えば、最も親和性の高い受容体
の選択）が可能な限り、何回この工程を繰り返し実施してもよい。
【００２２】 さらに、同定後、固相に結合した化合物と融合分子との結合相互作用を、標準
的な結合測定法で、結合していないリガンド若しくは結合していない蛋白質を化
合物・融合物複合体に加えて確認を行うか、若しくは分析することができる。
【００２３】 本発明のスクリーニングは、未知の化合物・蛋白質相互作用の同定に利用でき
、若しくは相互作用（例えば、リガンドと受容体間）に関する一般的情報が取得
可能な環境下で実施することができる。後者の場合、偏りのあるライブラリーを
スクリーニングに用いてもよい。このようなライブラリーには、特定のクラスの
化合物（若しくは蛋白質）または単一化合物（若しくは蛋白質）の修飾物が含ま
れる。通常、このような偏りをもたらす要素は、リガンドの標的受容体に対する
平均的な親和性を増加させ、リガンドを一方向に配向させる傾向を有する（例え
ば、Chen等、JACS (1993) vol. 115, p. 12591-12592参照）。この種の方法は、
例えば、受容体の標的部位に結合するリガンドの同定を容易にする。
【００２４】蛋白質・核酸融合物の調製 上記のように 本法は蛋白質・RNA融合物、蛋白質・DNA融合物、及び蛋白質と
ハイブリッドDNA・RNA分子との融合物を含むいかなる蛋白質・核酸融合物集団に
も適用可能である。
【００２５】 本明細書に記載の方法に使用される蛋白質・RNA融合分子のランダムなライブ
ラリーは、例えば、Szostak 等（Selection of Proteins Using RNA-Protein Fu
sions, U.S.S.N. 09/007,005, 1月14日, 1998、およびU.S.S.N.09/247,190, 2月
9日, 1999）、RobertsとSzostak（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) vol. 94
, p. 12297-12302）、若しくはKuimelis等 (Addressable Protein Arrays, U.S.
S.N. 60/080,686, 4月3日, 1998、およびU.S.S.N.09/282,734, 3月31日, 1999)
等の文献に記載の方法で調製できる。 また、細胞性のRNA・蛋白質融合分子のラ
イブラリーは、mRNA、若しくは3'-非翻訳領域を欠いたcDNAから、例えば、Lipov
sek等の方法 （Methods for Optimizing Cellular RNA-Protein Fusion Formati
on, U.S.S.N. 60/096,818, 8月17日, 1998）及びHammond等の方法（Methods for
Producing Nucleic Acids Lacking 3'-Untranslated Regions and Optimizing
Cellular RNA-Protein Fusion Formation, U.S.S.N. , 8月17日, 1999）で
調製できる。
【００２６】 このような蛋白質・RNA融合物の標識には、任意の標準的な標識方法、及び任
意の検出可能な標識（例えば、放射性標識、蛍光標識、及び化学発光標識を含む
）を利用できる。必要に応じて、放射性標識されたアミノ酸（例えば、35S、若
しくは14C標識アミノ酸）の存在下で、または放射性標識したヌクレオチド（例
えば、35S若しくは32P標識したヌクレオチド）の存在下で融合物若しくは融合物
の構成要素を生成させることにより、融合物を放射性標識してもよい。また、融
合分子を蛍光標識してもよい。一つの具体例として、DNAリンカー（例えば、Rob
ertsとSzostakの文献のdA27dCdCPリンカー（Proc. Natl. Acad. Sci. U27 (1997
) vol. 94, p. 12297-12302））をフルオレセイン・フォスフォールアミダイト
・マーカー（Glen Research 製、Sterling、VA）で修飾し、このリンカーを用
いて蛍光性の蛋白質・RNA融合物を合成する。さらにまた別法として、Robertsと
Szostakの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) vol. 94, p. 12297-12302
;およびSelection of Proteins Using RNA-Protein Fusions, U.S.S.N. 09/007,
005, 1月14日, 1998,およびU.S.S.N.09/247,190, 2月9日, 1999）に従い調製し
た蛋白質・RNA融合物、またはLipovsek等の方法（Methods for Optimizing Cell
ular RNA-Protein Fusion Formation, U.S.S.N. 60/096,818, 8月17日, 1998）
またはHammond等の方法（Methods for Producing Nucleic Acids Lacking 3'-Un
translated Regions and Optimizing Cellular RNA-Protein Fusion Formation,
U.S.S.N. , 8月17日, 1999）に従い調製した細胞性RNA・蛋白質融合物を、
蛍光標識したオリゴヌクレオチドに対する融合物と塩基対形成させる（例えば、
蛍光性ポリ-dTオリゴヌクレオチドをdA27dCdCPリンカーと塩基対形成させる）こ
とにより標識する。
【００２７】 また、蛋白質・DNA融合物も同様の方法で標識できる。かかる蛋白質・DNA融合
物は、例えば、Lohse等（DNA-Protein Fusions and Uses Thereof, U.S.S.N. 60
/110,549, 12月2日, 1998）が報告している方法で生成させてもよい。さらにま
た別法として、上記の標識方法を蛋白質の融合物のDNA・RNAハイブリッド部分（
すなわち、各々の一方の鎖）に対して用いてもよい。かかるハイブリッド融合物
は、例えば、標準的な方法を用いてRNA・蛋白質融合物を逆転写の工程で処理し
生成させる。
【００２８】化合物の調製 本発明のスクリーニング方法の実施については、いかなる化合物ライブラリー
であっても利用可能である。かかるライブラリーは、天然由来のものでもよく、
また合成的（若しくは、半合成的）抽出物、若しくは当技術分野における公知の
方法で得られた化学的ライブラリーでもよい。 薬剤研究開発の分野における当
業者であれば、本発明のスクリーニング法にとって化合物の正確な由来は重要な
問題ではないことが理解されると思われる。天然化合物源の例としては、次のよ
うなものが挙げられるが、これらのみに限定されるわけではない：すなわち、植
物、真菌、原核生物、若しくは動物、ならびに既存の化合物の修飾物。これらに
は限定されないが、例えば糖質、脂質、ペプチド、及び核酸を基とする化合物を
含む任意の化合物のランダム合成若しくは指向的（directed）合成（例えば、半
合成、若しくは全合成）で生成させるための多くの方法が利用可能である。合成
化合物ライブラリーは、市販のものを入手することもでき、また当技術分野で公
知の方法により生産してもよい。さらに、必要に応じて、ライブラリー、若しく
は化合物は標準的な化学的、物理学的、若しくは生化学的方法で容易に修飾が可
能である。
【００２９】 本発明の特定の方法において、化合物の相互作用は、検出可能な標識若しくは
「タグ」が、化合物若しくはその結合している固相支持体（例えば、ビーズ）の
いずれかに結合した結果として同定される。低分子化合物のコード化ライブラリ
ーは、例えば、Combs等（JACS (1996) vol. 118, p. 287-288）の文献による方
法で、ビーズ上に調製できる。さらに、コード化法には複数のものが利用可能で
あり、これらには、ペプチド及び核酸のコード（Kerr等、JACS (1993) vol. 115
, p. 2529-2531;およびBrenner & Lerner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992)
vol. 89, p. 5381-5383）、化学的タグ(Ohlmeyer等、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1993) vol. 90, p. 109222-10926;およびMaclean等、Proc. Natl. Acad. S
ci. USA (1997) vol. 94, p. 2805-2810); 蛍光体のタグ (Yamashita & Weinsto
ck (SmithKline Beecham Corporation), W095/32425 (1995);およびSebestyen等
、Pept. Proc. Eur. Pept. Symp. 22nd 1992 (1993), p. 63-64)、及びラジオ・
フリーケンシー・タグ(Nicolaou等、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1995) vol.
34, p. 2289-2291; 及びMoran等、JACS (1995) vol. 117, p. 10787-10788)等
が含まれる。このような標識は、上記の参考文献に記載の方法で識別できる。
【００３０】 また、アドレス化可能な化合物ライブラリー（例えば、低分子化合物）は、チ
ップ表面等の固相表面上に調製される。化合物のチップ表面上への固定化には様
々な方法があり、いずれもが利用可能である。好ましい方法としては、フォトリ
ソグラフィー（Affymetrix社、Santa Clara, CA）、機械的ミクロスポッティン
グ（Schena等、Science (1995) vol. 270, p. 467-470; Synteni, Fremont, CA
）及びインク射出法（Incyte Pharmaceuticals社、Palo Alto, CA；及びProtoge
ne社, Palo Alto, CA）が挙げられる。
【００３１】化合物・融合物の相互作用の同定 化合物（例えば、コード化化合物）と蛋白質・核酸融合物との相互作用を同定
するために、化合物もしくは融合物に結合された標識の検出手段、または必要に
応じて、化合物・融合物対を単離し、それらの同定若しくは「アドレス」の決定
手段が提供される任意の方法を利用してもよい。
【００３２】 一つの特定の例においては、化合物・蛋白質対（例えば、低分子・蛋白質対）
は、ビーズ上で単離され同定される。ビーズに結合した標識を検出するために、
好ましくは、ビーズ樹脂をプレート上に広げた後、例えば、蛍光標識、若しくは
放射性標識を走査する（例えば、ホスフォールイメージャーを利用して放射性標
識を検出する）。ビーズ上の低分子に結合する蛋白質・核酸融合分子は、ビーズ
を物理的に分類することにより単離できる。また、蛍光標識した融合分子に結合
したビーズは、蛍光活性化セルソータ（FACS）で分別してもよい。選別されたビ
ーズはそれぞれ個々に空間的に分離される（例えば、96穴マイクロタイタープレ
ートのウェルに分別する）。RNA・蛋白質融合物の場合には、個々のビーズに結
合した分子は、RNA部分の逆転写により同定でき、続いてRoberts ＆ Szostak（P
roc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) vol. 94, p. 12297-12302）及びSzostak 等 （Selection of Proteins Using RNA-Protein Fusions, U.S.S.N. 09/007,005,
1月14日, 1998,およびU.S.S.N.09/247,190, 2月9日, 1999）の記載に従ってDNA
の配列を決定できる。個々のビーズ上の化合物（例えば、低分子化合物）をコー
ドするタグは上記のようにして識別できる。
【００３３】 また、チップ表面上のリガンド・受容体対はチップ表面上の放射活性若しくは
蛍光を走査することにより検出できる。チップ上で相互作用している対のアドレ
スを知ることによって、その化合物（例えば、低分子化合物）を同定できる。ア
ドレスの取得可能なマイクロコレクター、若しくはその他の任意の標準的な方法
（例えば、Kuimelis等、Addressable Protein Arrays, U.S.S.N. 60/080,686, 4
月3日, 1998,およびU.S.S.N.09/282,734, 3月31日, 1999）を用いて、チップ表
面から融合分子を得ることができる。回収された融合分子は、上記のように融合
物の核酸部分の特徴を調べることで同定可能である。
【００３４】ビーズ形式を用いた化合物のスクリーニング 上述のように、化合物をビーズ固相支持体に固定化し、化合物と相互作用可能
な蛋白質・核酸融合物、具体的にはRNA・蛋白質融合物のスクリーニングに用い
ることができる。この方法に関する一つの実際例では、ヒト肝臓のcDNAライブラ
リー（Maxim Biotech製、South San Francisco, CA）からジヒドロ葉酸還元酵素
（DHFR）遺伝子をクローン化する。この構築物は、C末端にDYKDDDDK-ASAペプチ
ドタグ（配列番号： 1）を有するDHFR遺伝子の全長を含む。DHFRのRNA・蛋白質
融合物の調製は、DHFR コーディング領域の配列をPCRで増幅し、RobertsとSzost
ak（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) vol. 94, p. 12297-12302）及びSzost
ak等（Selection of Proteins Using RNA-Protein Fusions, U.S.S.N. 09/007,0
05, 1月14日, 1998,およびU.S.S.N.09/247,190, 2月9日, 1999）の文献に記載の
方法で融合物を形成させて行う。融合物はオリゴdTセルロース親和性クロマトグ
ラフィー（Edmonds等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1971) vol. 68:1336）で
精製し、スーパースクリプトII（Superscript II）逆転写酵素を用いて製造元の
説明書に従い逆転写を行う。10μLの1X 緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水、1 M Na
Cl, 1 mg/ml BSA、0.1 mg/ml剪断DNA、1％ v/v Triton X-100）に溶かしたDHFR
融合物（100 fmol）を500μLのエッペンドルフチューブ中で、10μLの予め平衡
化したメトトレキセート-アガロース （Kaufmanの方法、Methods Enzymol. (197
4) vol. 34:272-81）と混合した。このスラリーを30分間周囲温度で5分毎にかき
混ぜながらインキュベートした。その後このスラリーを、3000 rpmで1分間エッ
ペンドルフチューブで微量遠心機に供した。液体を除き、メトトレキセート-ア
ガロースを500μL の1X 緩衝液で3回洗浄した。メトトレキセート-アガロースに
50μL の30μM メトトレキセートを加え37℃で30分間インキュベートすることに
より、融合物を溶出した。
【００３５】 この相互作用アッセイ法の結果を図4に示している。この図では、翻訳過程で
融合物に取り込まれた35S-メチオニン標識を測定することにより、全融合分子の
何％が相互作用したかをモニターしたものである。この図に示されているように
、第3回目の洗浄液には有意な量の融合分子は含まれていなかった。さらに、マ
トリックス中に含まれる融合物全量のうち、86％がビーズを充填したカラムを素
通りし、残りの14％がメトトレキセートで効率よく溶出された。
【００３６】用途 本法は、化合物・蛋白質結合相互作用に関する小型若しくは大型のライブラリ
ーをスクリーニングするための効率の良い手段を提供する。さらに、本法は、あ
る化合物に対する、若しくは化合物のライブラリーに対する蛋白質・核酸融合物
をスクリーニングするのに利用され得る。
【００３７】 単一化合物に対する融合分子ライブラリーをスクリーニングするための商業的
用途に関しては、特段の制限はなく、以下のような用途が含まれる：すなわち、
融合分子のランダムプールからの所望の低分子に結合する蛋白質の同定、細胞性
mRNA・蛋白質融合分子のプール（または、DNA・蛋白質融合物若しくはハイブリ
ッド融合体の誘導体のプール）から細胞性標的物質を単離することにより、所与
の薬剤の作用機序を明らかにすること、さらに細胞性mRNA-蛋白質（または、DNA
・蛋白質若しくはハイブリッド・蛋白質）融合分子のプールから大多数若しくは
全標的蛋白質を単離することにより、所与の薬剤の副作用プロフィールを明らか
にし、それによって副作用を低減させた改良型薬剤が得られる。
【００３８】 コード化された（アドレス化可能な）化合物ライブラリーに対する融合分子ラ
イブラリーのスクリーニングの用途には、これらに制限されないが、新規の鉛化
合物（例えば、リガンド若しくは酵素阻害剤）を得るために行う低分子化合物ラ
イブラリーの核酸・蛋白質（例えば、細胞性mRNA・蛋白質）融合分子ライブラリ
ーによるスクリーニング、潜在的な標的物質（例えば、受容体若しくは酵素）を
調べるために行う核酸・蛋白質（例えば、細胞性mRNA・蛋白質）融合分子ライブ
ラリーの低分子化合物ライブラリーによるスクリーニング、及び蛋白質ライブラ
リーの要素と低分子化合物ライブラリーの要素との結合相互作用のマッピング等
が挙げられ、それによりリガンド・蛋白質対に関するカタログが提供される。
【００３９】 本明細書において言及されたすべての特許および文献は、参照として本明細書
に組み入れられる。
【００４０】 その他の態様は、特許請求の範囲に含まれるものである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 固相支持体に固定化された化合物の蛋白質・核酸融合物のライブ
ラリーによるスクリーニング法の例を模式的に示した図である。
【図２】 ビーズに固定化された化合物ライブラリーの蛋白質・核酸融合物
ライブラリーによるスクリーニング法の例を模式的に示した図である。
【図３】 マイクロチップ上に固定化されたアドレス化可能な化合物アレイ
の蛋白質・核酸融合物ライブラリーによるスクリーニング法の例を模式的に示し
た図である。
【図４】 ビーズ固相支持体上のRNA・蛋白質融合物に対する化合物の結合
を示したグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ 33/543 ５２１ 33/543 ５２１ 33/566 33/566 33/68 33/68 37/00 １０２ 37/00 １０２ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB01 CB17 CB20 CB21 DA13 DA14 DA36 DA80 FA37 FB03 FB06 FB07 FB12 FB15 FB16 JA20 4B024 AA11 AA20 CA04 EA04 HA14 4B029 AA07 AA23 BB15 BB20 CC03 CC10 FA12 4B063 QA01 QA13 QQ42 QR32 QR56 QR82 QR83 QS03 QS34 QX02

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 以下の段階を含む、化合物・蛋白質相互作用を検出する方法
    ： （a）化合物ライブラリーの各要素を固相支持体上に固定化した化合物ライブラ
    リーを調製する段階、 （b）単一反応槽において、化合物・融合物の複合体形成が起こりうる条件で、
    該固定化化合物ライブラリーの各要素を蛋白質・核酸融合物ライブラリーの各要
    素と接触させる段階、 （c）化合物・融合物の固定化複合体を単離する段階、および （d）化合物と融合物中の蛋白質との相互作用を指標として、該化合物・融合物
    の複合体を検出する段階。
  2. 【請求項2】 蛋白質・核酸融合物が蛋白質・RNA融合物、蛋白質・DNA融合
    物、若しくはDNA・RNAハイブリッド分子に融合した蛋白質である、請求項1記載
    の方法。
  3. 【請求項3】 固相支持体がビーズである、請求項1記載の方法。
  4. 【請求項4】 ビーズが独自の検出可能な標識でコード化されている、請求
    項3記載の方法。
  5. 【請求項5】 複合化された蛋白質・核酸融合物の化合物が、ビーズと結合
    した独自の検出可能な標識で同定される、請求項4記載の方法。
  6. 【請求項6】 検出可能な標識がペプチド標識、核酸標識、化学標識、蛍光
    標識、若しくはラジオ・フリーケンシー・タグである、請求項4記載の方法。
  7. 【請求項7】 固相支持体がチップであり、化合物ライブラリーがチップ上
    にアドレス化可能なアレイとして固定されている、請求項1記載の方法。
  8. 【請求項8】 蛋白質・核酸融合物ライブラリーの各構成要素が検出可能に
    標識されている、請求項7記載の方法。
  9. 【請求項9】 化合物・融合物の複合体、若しくはその構成要素が、固相支
    持体から遊離されることにより回収される、請求項1記載の方法。
  10. 【請求項10】 蛋白質・核酸融合物を固相支持体から回収する段階、および
    該蛋白質を同定する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
  11. 【請求項11】 蛋白質が蛋白質・核酸融合物の核酸部分の配列から同定され
    る、請求項10記載の方法。
  12. 【請求項12】 化合物が低分子化合物である、請求項1記載の方法。
  13. 【請求項13】 以下の段階を含む、化合物・蛋白質相互作用を検出する方法
    ： （a）固相支持体上に固定化された化合物を調製する段階、 （b）蛋白質・核酸融合物が該化合物と結合可能な条件下で該蛋白質・核酸融合
    物ライブラリーと該固定化化合物とを接触させる段階、 （c）該蛋白質・核酸融合物中の蛋白質と該化合物との相互作用を指標として、
    結合した蛋白質・核酸融合物を検出する段階。
  14. 【請求項14】 蛋白質・核酸融合物が、蛋白質・RNA融合物、蛋白質・DNA融
    合物、若しくは若しくはDNA・RNAハイブリッド分子に融合した蛋白質である、請
    求項13記載の方法。
  15. 【請求項15】 蛋白質・核酸融合物が検出可能な標識を施され、相互作用が
    該検出可能な標識の該固相支持体への結合により検出される、請求項13記載の方
    法。
  16. 【請求項16】 結合した蛋白質・核酸融合物が固相支持体から遊離されるこ
    とにより回収される、請求項13記載の方法。
  17. 【請求項17】 蛋白質・核酸融合物を固相支持体から回収する段階、および
    該蛋白質を同定する段階をさらに含む、請求項13記載の方法。
  18. 【請求項18】 蛋白質が該蛋白質・核酸融合物の核酸部分の配列から同定さ
    れる、請求項17記載の方法。
  19. 【請求項19】 固相支持体がカラム、スライドガラス、チップ、若しくはビ
    ーズである、請求項13記載の方法。
  20. 【請求項20】 化合物が低分子化合物である、請求項13記載の方法。
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