JPH09506872A

JPH09506872A - Ｐｎａ／核酸複合体に対するポリクローナル抗体

Info

Publication number: JPH09506872A
Application number: JP7517108A
Authority: JP
Inventors: エンスユルゲンハイルディグ−ニールセン; プルーセック，カルル−ヨハン
Original assignee: ダコアクティーゼルスカブ
Priority date: 1993-12-23
Filing date: 1994-12-22
Publication date: 1997-07-08
Also published as: US5612458A; AU1310495A; DE69425072D1; WO1995017430A1; EP0739356A1; EP0739356B1; DE69425072T2; DK145493D0; DK0739356T3

Abstract

(57)【要約】本発明はPNA(ペプチド核酸)と核酸との間に生成した複合体に対するポリクローナル抗体、特に PNA／DNA または PNA／RNA 複合体に対するポリクローナル抗体に関する。好ましい PNA／DNA または PNA／RNA 複合体に対するポリクローナル抗体は一本鎖 PNA、二本鎖核酸または一本鎖核酸に結合しない。ペプチド核酸(PNA)は、ポリアミド主鎖に適当なリンカーにより結合している天然の核塩のような、多数のリガンドを担持するポリアミド主鎖を含む天然にはない新規に開発された化合物である。Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位の主鎖を持つ PNAオリゴマーは相補的核酸に驚異的な高親和性を有し、非常に安定で特異的な複合体を生成する。この性質は PNAオリゴマーを核酸の検出のためのハイブリダイズプローブとして適切なものとしている。PNAのハイブリダイズプローブとしての有用性は本発明の抗体によって非常に増加した。本発明の抗体は PNA−核酸複合体と反応する能力によって、生物試料中の核酸の捕獲、認識、検出、同定または定量に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 PNA／核酸複合体に対するポリクローナル抗体本発明はPNA(ペプチド核酸、 Peptide Nucleic Acid)との核酸の間に生成した複合体に対するポリクローナル抗体に関する。ペプチド核酸(PNA)は、アミド主鎖に適当なリンカーにより結合している天然の核塩基のような、多数のリガンドを担持するポリアミド主鎖を含む天然にはない新規に開発された化合物である。PNAオリゴマーは相補的核酸に驚異性な高親和性を有しており、非常に安定で特異的な複合体を生成する。この性質は上記 P NAオリゴマーを核酸の検出のためのハイブリダイズプローブとして適切なものとしている。PNAのハイブリダイズプローブとしての有用性は本発明の抗体によって非常に増加した。本発明の抗体は、PNA−核酸複合体と反応する能力によって、生物学の試料中の核酸の捕獲、認識、検出、同定または定量に有用である。発明の背景１またはそれよりも多い化学的または生物学的存在の捕獲、認識、検出、同定または定量はとりわけ組み換えDNA、人及び家畜の薬品、農業並びに食品科学の分野で有用である。特に、これらの技術はバクテリアやウイルスのような病因学の作因を検出及び同定するのに、バクテリアの抗生物質耐性のスクリーニングに、遺伝的疾患の診断の補助に、そしてガン細胞の検出に用いることができる。従来技術の核酸ハイブリダイズアッセイ技術は一般に相補的ポリヌクレオチドプローブの標識された型とのハイブリダイズを含む。核酸試料中の特定の塩基配列または目的遺伝子と標識化プローブの間のハイブリダイズは標識化ハイブリッドの検出によって決定する。標識化プローブの調製は、一般に放射能標識もしくは修飾したヌクレオチドの酵素的導入または検出可能な化学基に結合するかもしくは検出可能な化学基を生成するプローブの化学修飾を含む。標識化プローブの調製はしばしば時間がかかり高価であり、そしてプローブの能力をこわさずに相補的配列と検出可能にハイブリダイズするように行なわなければならない。試料とプローブの間のハイブリダイズの結果として生成した二重型のポリヌクレオチドを直接検出し、それによりプローブの化学的標識を回避する試薬はこの問題を克服するだろう。二本鎖核酸と結合するが一本鎖核酸と結合しない特異的な抗体の生成は、ポリクローナル抗血清が一本鎖核酸と交差反応する抗体を含有し得るという事実によって、理解しにくくなっている。ポリクローナル抗血清はまた一本鎖核酸に対する天然の抗体または免疫化の結果として生成する一本鎖核酸に対する抗体を含有し得る。モノクローナル抗体技術は、上述の問題を克服する所望の親和性及び特異性を有する抗体を選択する手段を提供する。二本鎖DNA（米国特許第4,623,627 号）または DNA-RNAハイブリッドと選択的に結合する上記のようなモノクローナル抗体が製造され、試料核酸中の目的とする特定の塩基配列と既知の相補配列との間に生成した二重型の検出に用いられてきた。核酸類似PNA（ペプチド核酸）を作ることから生じる新規な選択肢は、検出プローブとして PNAオリゴマーを用いること及び PNA−核酸複合体に結合する抗体を生成することである。ペプチド核酸(PNA)はWO92／20702 号に適当なリンカーによってポリアミド主鎖に結合した天然の核塩基のような多数のリガンドを担持するポリアミド主鎖を含む化合物として記載されている。主鎖が構造的にデオキシリボース主鎖と異体同形（homomorphous）であって、核塩基が結合しているＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位から成る PNAは、相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズして PNA−核酸複合体を生成することができる（Egholm 他、「Nature」Vol 365、第 566〜568 頁(1983)）。発明の概要本発明の一面は PNAと核酸の間に生成した複合体に結合するポリクローナル抗体である。塩基対合の特徴を共有していることは別として、PNA／核酸複合体及び核酸二重型、たとえば DNA/DNA または DNA/RNA 二重型は、各リン酸基につき１個のアニオンを含有するヌクレオチドの配列を主鎖とする核酸二重型の対応する鎖とは異なり、アキラルであり且つ非荷電であるＮ−（２−アミノエチル）グリシンオリゴマー又はポリマーから成る主鎖を有する点において、実質的に異なる性質を有している。前記二つの型の化合物間の立体的及びコンフォメーションの差異が、PNA/核酸複合体に特異的に結合する抗体を利用できるかどうかをまったく予想できないようにしている。本発明の他の面は、PNAと DNA、または PNAと RNAとの間に生成した複合体に結合するポリクローナル抗体である。好ましい態様においては、PNAと核酸との間に生成した複合体に対するポリクローナル抗体は、一本鎖 PNA、二本鎖核酸または一本鎖核酸に結合しない。これらの態様の一つにおいては、抗体は PNAと DNAとの間に生成した複合体に結合するが、PNA/RNA 複合体、二本鎖DNA，DNA／RNA ハイブリッド、一本鎖 PNA または一本鎖核酸には結合しない。これらの態様の他の一つにおいては、抗体は PNAと DNAとの間に生成した複合体に結合するが、PNA／RNA 複合体、二本鎖DNA，DNA／RNA ハイブリッド、一本鎖 PNAまたは一本鎖核酸とは結合しない。塩基配列にかかわりなく PNA／核酸複合体に結合するポリクローナル抗体も本発明の一部である。本発明のポリクローナル抗体は、PNAに核酸を接触することによって生成した複合体、特にＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位を持つ PNAと DNAまたは R NAとの間に生成した複合体で宿主動物を免疫することによって得ることができる。試料中の特定の核酸配列を検出するための種々の方法は本発明の付加的な面であって、本発明による抗体は、１またはそれよりも多い化学的または生物学的存在の捕獲、認識、検出、同定または定量に用いることができる。該抗体は人または家畜の分野で非常に有用である。特に期待されるのは、本発明の抗体を、人の伝染性作因、たとえばクラミジア属もしくは淋菌性の微生物の存在もしくは量またはエプスタイン・バールウイルスもしくはパピローマウイルスによる感染を検出するのに用いることである。本発明の抗体は染色体の彩色のような細胞遺伝学の一般的分野にも有用である。本発明は検出可能な標識された型で存在し得る本発明の抗体、被検出核酸配列に相補的である PNA及び検出システムを含有するキットを提供する。具体的な態様の記載本発明の抗体に関しては、すべての完全な抗体、抗体断片、多官能性抗体凝集体または一般的には本明細書に記載されている特徴を有している少くとも一つの抗体結合部位を含む任意の抗体から誘導された物質を含むことを意図するものである。任意の既知のクラスまたはサブクラスの免疫グロブリンの抗体、たとえばIgG，IgMなど及び活性断片、たとえば通常scFv，Fab ，F(ab′)及びF(ab′)₂として知られるIg断片が期待される。核酸という用語は、１つのヌクレオシドの５′−位置及び他のヌクレオシドの３′−位置の間のリン酸ジエステル架橋によって結合したデオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドのいずれかであるサブユニットから構成されるヌクレオチドポリマーに及ぶ。それらは DNAまたは種々の型の RNAであってもよい。塩基及び核塩基という用語は核酸及び PNAのピリミジン及びプリン塩基と交換可能に用いられる。第３回固体相シンポジウム（オックスフォード英国、８月31日〜９月４日1994 年）で提出された「PNAオリゴマーの改良された合成、精製及び特徴（Improved Synthesis，Purification and Characterization of PNA Oligomers）」に記載された手順に従って PNAを合成する。本発明による動物の免疫化のために用いられる PNA−核酸複合体は PNAと DNA または RNAとを含んでもよい。核酸及び PNAの両方が多様なペプチド源を欠いているので、核酸二重型及び PNA／核酸複合体はそれ自体を注射した時に普通の宿主動物（すなわち、核酸に対して自己抗体を生成する傾向のない動物）においては本質的に非免疫原性であると予想されるであろう。これらの情況においては、非−免疫原と宿主動物にとって外来性の担体との慣用の複合は、一般に実際的ではないし、面倒であり、さらに、抗原に構造的な変化を引き起こすリスクを誘発することが分かったのに対し、核酸二重型に対しての免疫応答は、通常の宿主動物をポリ−アニオン性核酸二重型及びポリ−カチオン性タンパク質誘導体、特にメチル化アルブミンまたはグロブリン種の間に生成した非共有性、イオン性複合体で免疫することによって引き出された（米国特許第 4,623,627号、米国特許第 4,833,084号）。本発明によると、今、驚くべきことに、PNA／DNA 複合体に対する抗体は、通常の宿主動物を、PNA／DNA 複合体及び宿主動物に対して異種性の非誘導体化タンパク質、たとえば、オボアルブミンを含む混合物で免疫化することによって生じさせ得ることを発見した。この技術を PNA／RNA 複合体を用いての免疫化に応用できる。 PNA-DNA複合体は、二本鎖 DNAまたは一本鎖 PNAを、DNA配列の全部または一部に相補的である塩基配列を有する PNA分子と接触させ、混合物を加熱して一本鎖分子を生成させ、混合物をゆっくりと室温まで冷却させることにより製造することができる。PNA-RNA複合体は、RNAを RNA配列の全部または一部に相補的である塩基配列を有する PNA分子と接触させ、混合物を加熱し、混合物を室温までゆっくりと冷却させることにより製造できる。適当な量の PNA−核酸複合体の１つをアジュバントと混合する。免疫原は適当な担体、たとえばKLH（キーホールリムペットヘモシアニン）、オボアルブミン及びデキストランに複合体化し、またはせずに用いてもよい。本発明のポリクローナル抗体は、PNAがＮ−（２−アミノエチル）グリシン主鎖を有している PNA／DNA 複合体、オボアルブミン及び適当なアジュバントの混合物で至を免疫することによって得ることができる。免疫化計画及び採血は別な方法でHarboe及びIngildの「Scand．J．Immunolo．」Vol 17、増刊10、第345〜3 51頁（1983年）に記載されたように行った。PNA／DNA 複合体に高い特異性を有するポリクローナル抗体は、免疫された兎の血清から得られた。多くの動物がポリクローナル抗体の生産のための宿主動物として適当である。表１から分るように PNA及び45単量体単位−DNA に対して生じたポリクローナル抗体は、PNA／DNA 及びPNA／RNA 複合体と強く反応したが、二本鎖DNA，DNA／ RNA −ハイブリッド、一本鎖 DNAまたは一本鎖 PNAとは強く反応しなかった。抗体は四つの異なった PNA／DNA 複合体と強く反応し、抗体が PNAまたは DNA中のいかなる特異的塩基配列よりも PNA/DNA 複合体のコンフォメーションを認識することを示す点で塩基配列が異なっていた。本発明のポリクローナル抗体は、PNAがＮ−（２−アミノエチル）グリシン主鎖を有しているPNA／DNA 複合体、オボアルブミン及び適当なアジュバントの混合物で兎を免疫することにより得ることができる。免疫化計画及び採血は別な方法でHarboe及びIngildの「Scand．J．Immunolo．」Vol 17、増刊10、第345〜351 頁（1983年）に記載されたように行った。多くの動物がポリクローナル抗体の生産のための宿主動物として適当である。本発明の抗体は PNA−核酸複合体の高度の特異性により特徴づけられる。それらはいかなる有意の程度であっても、二本鎖核酸、一本鎖 PNAまたは一本鎖核酸と結合しない。本発明によって認識されるエピトープの特異性は、PNAまたは核酸のいかなる特異的配列によるよりも PNA−核酸複合体のコンフォメーションによって指令されるように見える。本発明による抗体の高特異性及び高親和性は、生物試料中の被検出 PNAと核酸の間に生成した PNA−核酸複合体の単離、検出及び定量に用いる時、重要な利益をもたらす。したがって、PNA／DNA 複合体に対し高特異性を有する抗体は人における伝染性作因、たとえばクラミジア属または淋菌性の微生物の同定に特に価値がある。これらの抗体は、染色体の彩色のような細胞遺伝学の一般的分野にも非常に有用である。 PNA／RNA 複合体に対し高特異性及び高親和性を有する本発明の抗体は、RNAプローブに基づく分析、たとえば、特定の微生物に特異的なmRNAまたはrRNA配列を同定するのに特に有用である。本発明の抗体の特定の使用に依存して、抗体は検出可能な標識、たとえば補酵素、酵素阻害剤及び酵素自身のような酵素的に活性な基、蛍光体、発色団、発光体、特異的に結合し得るリガンド、たとえばビオチンまたはハプテンで連結してもよい。本発明による抗体は特定の核酸配列を検出するための多数の異なった方法の価値ある手段であって、たとえばその方法は、（ａ）試料中の特定の被検出核酸配列と被検出核酸配列に対し相補的である PNA 配列との間に複合体を生成させ、該複合体は本発明の抗体に対する少くとも一つのエピトープを有するものであり、（ｂ）該 PNAと被検出核酸配列の間に生じた任意の複合体と本発明の抗体とを接触させ、（ｃ）抗体− PNA−核酸複合体の存在を決定する方法を含む。（ｃ）における抗体− PNA−核酸複合体を捕獲できるように、（ａ）における PNAは被検出核酸配列と接触する前に固相に固定すること、または（ｂ）において用いられる抗体は PNA−核酸複合体と接触する前に固相に固定することができる。被検出核酸配列が生物学の標本において、固定された状態で存在するなら、（ａ）標本中で特定の被検出核酸配列と被検出核酸配列に相補的である PNA配列との間に複合体を生成させ、該複合体は本発明による抗体に対する少くとも一つのエピトープを有するものであり、（ｂ）該 PNA配列と被検出核酸配列との間に生成した任意の複合体と本発明の抗体とを接触させ、（ｃ）抗体− PNA−核酸複合体の存在を決定するを含む方法が用いられる。他の方法では、被検出核酸の固定化が方法における最初の段階であり、（ａ）被検出核酸配列を固相に固定化し、（ｂ）試料中の特定の被検出核酸配列と被検出核酸配列に相補的である PNA配列との間に複合体を生成させ、該複合体は本発明による抗体に対する少くとも一つのエピトープを有するものであり、（ｃ）該 PNA配列と被検出核酸配列の間に生成した任意の複合体と本発明の抗体とを接触させ、（ｄ）抗体− PNA−核酸複合体の存在を決定する方法を含む。本発明の抗体の特に魅力ある応用を下記に示す。本発明による抗体を利用する記載された方法及び他の方法を実施するキットは、標識されたまたは標識されない型の本発明の抗体に加えて、被検出ヌクレオチド配列に相補的である PNA配列、すなわち PNAプローブ及び検出システムを含む。検出システムは基質と反応して着色した溶解性のまたは不溶の反応生成物を生成することができる酵素を含み得る。応用１：溶液中のハイブリダイズ及び検出目的ポリヌクレオチド配列は、目的の配列に相補的な PNA分子と接触させ、次いで、本発明の抗体と接触させ、PNA−核酸複合体を認識させるが遊離の PNAまたは核酸を認識させないことにより、溶液中で定量することができる。これらの反応は、たとえば比濁分析方式中で検出することができる大きな複合体を生じるだろう。応用２：溶液ハイブリダイズ及び固定化後の検出目的ポリヌクレオチド配列は、目的の配列に相補的な PNAオリゴマーとそれを接触させることによって定量できる。生成した複合体は、いまだ溶液中にある間に、標識されたまたは標識されない型の本発明の抗体と接触させる。生成した P NA−核酸−抗体複合体を次いで、たとえば固相に固定されている本発明の抗体を用いて捕獲する。結合していない物質は洗浄して除き、PNA−核酸−抗体複合体に結合した量を、抗体上の標識によるか、固定化された抗体が検出する抗体の種の代替する種から誘導されたものであるなら、第２の抗体検出システムを用いるかのいずれかで定量する。代わりに、目的の配列に対して相補的な PNAオリゴマーは、PNA−核酸複合体を捕獲するのに適当な成分、たとえば、ビオチン、フルオレセインまたは他のハプテンで標識してもよい。結合していない物質を洗浄して除き、結合した PNA− 核酸−抗体複合体の量を抗体上の標識または第２の抗体検出システムのいずれかを用いて定量する。応用３：捕獲アッセイ伝統的な捕獲アッセイは連続する認識、捕獲、検出の段階よりなる。このようなアッセイは多くの異なった方法よりなってもよい。一つの特に興味ある例の概要を下記に示す。 PNA−核酸複合体に結合できる抗体を固体の支持体、たとえばELISAプレートに連結するかまたは固定化する。PNAオリゴマー及び試料を混合し、ELISAプレートのウェルの中で溶液中で反応させる。PNAと試料核酸の間の複合体が生成したら、これらの複合体を固定化された抗体により捕獲する。結合していない物質を洗浄して除き、検出システムに対し、利用できる結合部位を確保するために、 PNA オリゴマーを加え、結合した核酸と反応させる。この発明の抗体、たとえば酵素と複合している抗体を加え、生成した PNA−核酸複合体と反応させる。洗浄後、適当な酵素基質を加え、結合した物質の量を測定する。上記の２またはそれよりも多い段階を同時に実行することも可能であろう。PN A−核酸複合体よりも、他の認識部分に基づく捕獲または検出段階のいずれかを組み立てることも可能であろう。このような部分はビオチン化 PNAオリゴマーまたは他のハプテン、ペプチドもしくはポリペプチドで標識した PNAオリゴマーであり得る。応用４：固相上の PNA／核酸複合体の検出 PNAオリゴマーと核酸（PNAまたは核酸のいずれかが固相上に固定されている）の間に生成した複合体を本発明の抗体によって検出することができる。この検出は直接に酵素、蛍光性標識もしくは他のシグナル発生システムと複合した抗体を用いるか、間接的に、標的に結合した抗体を検出するのに普通に用いられる第２検出システムの一つを用いるかのいずれかにより実行できる。考慮される固相はたとえばナイロンもしくはニトロセルロース膜（サザンまたはノザンブロット）、組織断片(in situハイブリダイズ)またはプラスチック表面(ELISA方式)のように非常に広い意味で解釈すべきである。抗体は核酸にハイブリダイズした PNAのみを認識するので、一本鎖である非特異的に結合した PNAオリゴマーはシグナルのもとにはならないであろうから、このシステムはこれらの技術に含まれる通常は非常に高価な洗浄手順を最少限に減少することができる。同じ理由で、この型の分析は、PNAオリゴマーの非特異的結合により引き起こされる背景（background）に伴う問題を少くするであろう。応用５：バイオセンサーシステムバイオセンサー表面を用いる機能的な反応検出の１例は、たとえば BIAコアバイオセンサーシステム(Pharmacia)により用いられている、表面プラスモン共鳴(SPR)検出システムである。生物分子(biomolecule)とセンサーのチップ上の固定化されたリガンドとの相互作用を次第に消えていく（evanesent）光を用いて表面で測定する。該システムは、リガンドを親水性デキストランマトリックス中に固定することができるセンサーチップ、被分析物及び試薬をセンサーの表面に運ぶための小型の流体工学カートリッジ、SPR検出機、自動試料検査器(autosampler)並びにシステムの制御及び評価のソフトウエアを含む。特異的なリガンドはセンサーのチップにアミン、チオールまたはアルデヒド化学作用により、またはたとえばビオチン−アビジン相互作用により生物特異的に、共有結合で固定化される。この発明の抗体を BIAコアバイオセンサーシステム（または他の型のバイオセンサーシステム）において用いられるセンサーのチップのデクストラン層に連結する。試料を PNAオリゴマーと混合し、インキュベートして PNAと用いられた P NAオリゴマーに対して相補的な試料核酸の間に複合体を生成する。試料を BIAコアの流動システムを通過させ、デキストラン表面に連結した抗体は、そのような複合体が生成したとすれば、PNA−核酸複合体と結合するだろう。 BIAコアにより用いられた SPR検出に基づいて、この結合は表面に結合した物質の量に依存してシグナルを発生するだろう。応用６：細胞中の結合した PNAの検出適当な条件の下では、PNAオリゴマーは、生きているまたは固定化された細胞、たとえば、細胞系、造血細胞及び動物／ヒト組織（治療的応用において重要）の細胞壁を浸透することができる。個々の細胞中で異なった標的と反応した PNA オリゴマーを検出できることは重要であろう。PNAオリゴマーのハプテンまたは他のレポーター分子での標識化は、細胞中への浸透を抑制する（妨げる）ので、有利ではない。免疫組織化学（凍結または固定化組織生体組織検査）または、流動細胞計測法（たとえば、洗浄剤、アセトンまたはアルコールで処理した細胞上で）いずれかによるか、または細胞培養に加えたもしくは生きている動物に投与した PNAの結合及び／または組織分布を検出するための生体構成での反応した PNAオリゴマーの検出は非常に重要である。次の例は本発明の種々の面を説明する。これらの例はどのような方法であれ本発明を限定することを意図していない。例例１．PNA／DNA複合体の調製 PNAオリゴマー、すなわち、主鎖が DNAのデオキシリボース主鎖と構造的に異体同形であり、核塩基がメチレンカルボニル結合により結合しているＮ−（２− アミノエチル）グリシン単位からなる分子を、第３回固体相シンポジウム（オックスフォード英国、８月31日〜９月４日1994年）で提出された「PNAオリゴマーの改良された合成、精製及び特徴」中に及びM．Egholm他及び「J．Am．Chem．So c．」114、第1895〜1897頁（1992年）及びM．Egholm他の「J．Chem．Soc．Chem ．Commun．」第800〜801頁（1983年）により記載されているように合成し、精製した。用いられた PNAの塩基配列は、PNA分子中での自己−ハイブリダイズを回避するために好ましくは実質上非−自己−相補的である。プリン及びピリミジンの数は、三重らせん構造よりも二重らせん構造の生成を可能とするためにほぼ等しい。 DNAオリゴマーは、Applied Biosystemsからのabi 381A DNA合成機上で標準381 Aサイクル／手順を用いて合成した。使用されたモノマーはApplied Biosystems Synthesizerのための標準β−シアノエチルホスホアミダイト（phosphoamidite）であった。兎を免疫するために用いた抗原は、１モルの45−単量体単位合成ポリデオキシリボヌクレオチド(DNA)及び３モルの15−単量体単位 PNAオリゴマーを加えて作った。45−単量体単位のポリデオキシリボヌクレオチドは15ヌクレオチドの３繰り返し単位及び15−単量体単位の PNAオリゴマーが、15−単量体単位のポリデオキシリボヌクレオチドの塩基配列に相補的な塩基配列をもつように設計した。 45−単量体単位のポリデオキシヌクレオチドの塩基配列は次のとおりであった； 15−単量体単位の PNAオリゴマーの塩基配列は次のとおりであった；兎の免疫化のための抗原を次のものを総量6.01mlで混合することにより調製した。 106 OD₂₆₀45−単量体単位ポリデオキシリボヌクレオチド(DNA) 106 OD₂₆₀15−単量体単位 PNAオリゴマー 50mM Tris−HCl，PH7.5 50mM NaCl （注：１ODの45−単量体単位 DNAの１ODの15−単量体単位 PNAオリゴマーに対する比は DNA及び PNAに対し同一の吸光係数を用いてモル比約１：３に等しい。）混合物を加熱区画中で92℃に加熱し、ゆっくりと室温まで冷却した。この溶液を真空遠心機中で蒸発させ、600μｌのH₂O中に再懸濁させた。PNA／DNA ハイブリッドの最終濃度は約10mg／mlであった。複合体の生成は、20％ポリアクリルアミドゲル(TBE−緩衝液、89 mM Tris− ホウ酸塩、２ mM EDTA)中でビオチン標識 PNA／DNA 複合体の電気泳動、それに続くニトロセルロース膜への転移及びアルカリホスファターゼ（AP）複合体化ストレプトアビジン複合体及び基質 NBT／BCIPを用いる視覚化によって特徴づけた。例２．試験システム特異的な抗体活性の同定は、異なった ELISA方式で得られた結果を基準とした。ミクロ滴定プレートをストレプトアビジンで塗布し、続いて過剰の結合部位を阻止した。特異性を試験するために用いた複合体／化合物をビオチンで標識した。ビオチンで標識した PNAは Boc合成のための「固相」原理を用いて生産する。２単位の２−（アミノエトキシ）エトキシ酢酸（AEEA）を含むリンカーを樹脂（上記参照）上の PNAオリゴマーに結合させ、次の方法でビオチンを結合する。二つの溶液を用いた。第１の溶液は DMF中に 0.1Ｍの５％ｓ−コリジンと２当量のＮ−エチルジシクロヘキシルアミンを含み、第２の溶液は DMF中に0.18ＭのHBTV （２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）を含んでいた。二つの溶液を２：１の比で混合し、混合物を約１分間置いてから、PNAオリゴマーに２単位のAEEAが結合している樹脂と結合した。 DNA のビオチン標識化のために二つの手順を用いた。DNAオリゴマーの５′末端における標識化のために、スペーサー(スペーサーホスホアミダイト、Clontec h Laboratories)をオリゴマーの５′−OHに連結し、次いでビオチン標識化剤（ビオチンCEホスホアミダイト、22−0001−35，Cruachem Limited）と反応させた。オリゴマーの３′末端における標識化のために、DNA合成をビオチン−CPG 支持体（３′− ビオチン−ON CPG cat # RP-5225-2 K．J．Ross Petersen，Agerm Alle 3，DK-2 970 Horsholm）から始めた。最初の試薬はスペーサー（スペーサーホスホアミダイト、Clontech Laboratories Inc.）でモノマー試薬をオリゴマーの合成のために加えた。 RNA オリゴマーを「DNA Technology Aps，Science Park Aarhus，Gustar Wied s vej 10，DK-8000 Aarhus」から購入した。次の検出システムを用いた。１層：ストレプトアミジン２層： 100μｌのビオチン化試験複合体／化合物(100ng／ml) ３層：本発明によるポリクローナル抗体の希釈物４層：HRP（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）と複合体化した抗−兎抗体。基質：OPD(ｏ−フェニレンジアミン) 次の試験複合体／化合物を用いた。Ａ．45−単量体単位 DNA及び３単位の15−単量体単位 PNAを含む PNA／DNA 複合体であって、免疫化のために用いた複合体と同じ塩基配列を有し、ビオチンは上記のように DNAの３′末端に結合している。Ｂ．免疫化に用いた複合体中の45−単量体単位の DNAの三つの15ヌクレオチド長さの配列の一つに一致する一本鎖15−単量体単位DNA(ss DNA)であって、上記のように５′末端でビオチンによって標識化されている。Ｃ．免疫化に用いられた複合体中の15−単量体単位の PNAに一致する塩基配列を有する一本鎖15−単量体単位PNA(ss PNA)であって、上記のように５′末端をビオチンで標識化されている。Ｄ．免疫化に用いた複合体の配列とは異なる塩基配列を有する20− 単量体単位の PNA及び20−単量体単位の DNAを含む PNA／DNA 複合体であって、 PNAは上記のように５′末端をビオチンで標識されている。用いられた配列はであった。Ｅ．Ｄに記載した、すなわち、免疫化に用いた塩基配列とは異なった塩基配列を有する一本鎖15−単量体単位PNA(ss PNA)。Ｆ．17−単量体単位の PNA及び DNAを含む PNA／DNA 複合体であって、塩基配列はＡ及びＤにおける PNA／DNA 配列とは異なるものであり、複合体はDNA(F1)の５′末端またはPNA(F2)の５′末端のいずれかをビオチンで標識化されていた。次の配列を用いた。Ｇ．上記Ｆ１に記載された塩基配列を有する一本鎖 DNA。Ｈ．19−単量体単位の PNA及び19−単量体単位の RNAを含む PNA／RNA 複合体。Ｉ．子牛の胸腺 DNAの断片を含む二本鎖DNA(シグマＤ−1501；200〜1000bpを含む断片に変えた）。Ｊ．Ｈにおける19−単量体単位の RNA及び相補的 DNA配列を含む DNA／RNA 二重型。例３．ポリクローナル抗体の生産約５mgまでの例１に記載された抗体（最終濃度約10mg／ml）を0.1mlのオボアルブミン溶液（10mgのシグマＡ−7641ロット70H8210 ／0.1 ＭのNaClのml，0.015ＭのNaN₃）及び0.01mlの 1.5Ｍ NaN₃に加え、この混合物を 0.5mlのTitermax # R1 アジュバント（Vaxcel Inc.，Norcross，Georgia ，USA）中に段階的にぐるぐる回しながら混合した。免疫化の前に、この免疫化組成物の量は、約１ml（最初の４つの免疫化）または0.1ＭのNaCl，0.015ＭのNa N₃を加えて、混合することによって２ml（続きの免疫化）に合わせるかのいずれかであった。５匹の兎を免疫化について各約0.5mg PNA／DNA（総量）の用量で皮下に、最初の４免疫化に対しては 0.1mlの量の免疫化組成物を注射することによって、続く免疫化に対しては 0.2mlを注射することによって免疫化した。免疫化の前に血液試料を採取し、抗体活性の分析のための試料を最初の免疫化の８週及び10週後に採取した。免疫化のスケジュール及び採血は、Harboe及びIngild Aの「Scand．J ．Immunol.，」Vol 17増刊10号第 345〜351 頁（1983年）に記載されているとおりであった。５匹の兎の免疫化前及び免疫化後10週に採取された血清を例２に記載した試験システムで分析した。血清を１：250 からはじめて２倍に希釈し(１：250，１： 500，１：1000，１：2000，１：4000，１：8000，１：16000，１：32000)、ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合化豚抗−兎免疫グロブリンを視覚化のために用いた。表１に一つの代表例からの結果を示す。抗体を１：500 に希釈することによって得られた 492nmでの光学密度を例２に記載した試験複合体／化合物Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ及びＪを用いる血清の試験について示す。表１に示すように免疫化後10週の採血から採取した血清は PNA／DNA 複合体（Ａ，Ｄ，Ｆ１及びＦ２）及び PNA／RNA 複合体（Ｈ）と強く反応したが、免疫化前に採取した血清には著るしい反応は見られなかった。これらの抗原を用いて免疫化後10週の血清の希釈物を試験した時に用量応答カーブが得られた。上記の他のいずれ抗原で血清を試験した時にも、著るしい反応は見られなかった。したがって、ポリクローナル抗体は PNA／核酸と反応し、この反応は塩基配列には依存しないようにみえる。例２に記載した試験複合体／化合物Ａ，Ｈ及びＪ及びこれらの複合体に含まれる個々のPNA，DNA及び RNA鎖を用いて、フイルタードットアッセイ（filter dot assay）でもまた血清を試験した。dsDNAの二つの配合物、二つの相補的オリゴヌクレオチドからなる一つの配合物及びプラスミド DNAをこのドットブロットアッセイで分析した。試験化合物をフイルター上に20，10，５または 2.5ngの量で点在させ、TS 緩衝液(50mMのTris−HCl，500mMのNaCl，PH9.0)中の 0.5％のカゼインで１：200 0に希釈した血清で続き、そしてフイルター上に試験化合物によって捕獲された抗体をアルカリホスファターゼ複合体化ヤギ抗兎Igで視覚化した。唯一の陽性反応は、例２のPNA／DNA 複合体Ａで５ngの検出限界で見られた。血清をサザンブロット方式で試験した。３セットの四つの異なった DNAオリゴヌクレオチドを変性した20％ポリアクリルアミドゲル上に負荷した。用いられた DNAオリゴヌクレオチドの二つは例２でＡ及びＦ１と記載したものであり、他の二つは関連のない DNAオリゴマーであった。電気泳動後、DNAオリゴヌクレオチドをニトラン（Nytran）、ニトロセルロース膜に転移させた。一つのフイルターはＡ（例２から）に記載された PNAオリゴマーでハイブリダイズし、一つのフイルターはＦ１（例２から）に記載された PNAオリゴマーでハイブリダイズし、最後のフイルターはこれらの二つの PNAオリゴマーの混合物でハイブリダイズした。未反応部位を遮断後、膜を本発明によるポリクローナル抗体で30℃で２時間インキュベートした（希釈１：2000）。結合した抗体はアルカリホスファターゼ複合体化ヤギ抗兎Ig及び基質 NBT／BCIPを用いて視覚化された。ハイブリダイズに用いられた PNAオリゴマーに相補的な DNAオリゴヌクレオチドを含有するレーンだけが、用いられた DNAオリゴヌクレオチドのサイズに対して予期されたバンドを起こさせた。したがって、本発明によるポリクローナル抗体は、ニトロセルロース膜上のサザンブロットに生成した PNA／DNA 複合体を認識する。Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン基幹を含む PNAが PNAの好ましい型であるけれども、これは限定ととるべきではない。他の型の基幹をもつ PNAも、PNAが核酸と安定な複合体を生成する限り、同様に用い得ることが期待される。免疫化学、核酸化学及び関連分野の当業者に明確であるような本発明を実施するための上記方法の変更は次の請求の範囲の範囲内であることを意図するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＧ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．PNA(ペプチド核酸)と核酸との間に生成した複合体に結合することを特徴とするポリクローナル抗体。２．一本鎖 PNA、二本鎖核酸または一本鎖核酸とは結合しないことを特徴とする請求項１に記載の抗体。３．PNAと DNAとの間に生成した複合体に結合するが、PNA／RNA 複合体、二本鎖DNA，DNA／RNA −ハイブリッド、一本鎖 PNAまたは一本鎖核酸には結合しないことを特徴とする請求項２記載の抗体。４．宿主動物をＮ−（２−アミノエチル）グリシン主鎖を有する PNAと DNAとの間に生成した複合体で免疫することによって得られることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の抗体。５．塩基配列にかかわりなく PNA／DNA 複合体に結合することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の抗体。６．宿主動物をＮ−（２−アミノエチル）グリシン主鎖を有する PNAとRNA との間に生成した複合体で免疫することによって得られることを特徴とする請求項１または２記載の抗体。７．検出可能に標識された型の請求項１〜６のいずれかに記載の抗体。８．試料中の特定の核酸配列を検出する方法であって、（ａ）試料中の特定の被検出核酸配列と被検出核酸配列に相補的である PNA配列との間に複合体を生成させ、該複合体は請求項１〜７のいずれかに記載の抗体に対する少くとも一つのエピトープを有しているものであり、（ｂ）該 PNA配列と被検出核酸配列との間に生成した任意の複合体と請求項１〜７のいずれかに記載の抗体とを接触させ、（ｃ）抗体− PNA-核酸複合体の存在を決定することを含んでなる方法。９．（ｂ）で用いられた抗体が PNA−核酸複合体との接触の前に固相に固定化されることを特徴とする請求項８に記載の方法。 10．（ａ）の PNA配列が被検出核酸配列との接触の前に固相に固定化されることを特徴とする請求項８に記載の方法。 11．生物学の標本において固定状態で存在する特定の核酸配列を検出する方法であって、（ａ）標本中の特定の被検出核酸配列と被検出核酸配列に相補的である PNA配列との間に複合体を生成させ、該複合体は請求項１〜７のいずれかに記載の抗体に対する少くとも一つのエピトープを有するものであり、（ｂ）該 PNA配列と被検出核酸配列との間に生成した任意の複合体と請求項１〜７のいずれかに記載の抗体とを接触させ、（ｃ）抗体− PNA−核酸複合体の存在を決定することを含んでなる方法。 12．試料中の特定の核酸配列を検出する方法であって、（ａ）被検出核酸配列を固相に固定化し、（ｂ）試料中の特定の被検出核酸配列と被検出核酸配列に相補的である PNA配列との間に複合体を生成させ、該複合体は請求項１〜７のいずれかに記載の抗体に対する少くとも一つのエピトープを有するものであり、（ｃ）該 PNA配列と被検出核酸配列との間に生成した任意の複合体と請求項１〜７のいずれかに記載の抗体とを接触させ、（ｄ）抗体− PNA−核酸複合体の存在を決定する方法を含んでなる方法。 13．試料中の特定の核酸配列を検出するためのキットであって、前記キットは請求項１〜７のいずれかに記載の抗体、該核酸配列に相補的である PNA配列及び検出システムを含有してなる前記キット。