JPH11507202A - Ｐｎａ／核酸複合体に結合することができるモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 PNA(ペプチド核酸)と核酸との間で形成された複合体、特に PNA／DNA 又は PNA／RNA 複合体に結合することができるモノクローナル抗体が記載される。好ましいモノクローナル抗体は、 PNA／DNA 又は PNA／RNA 複合体に結合することができるが、一本鎖 PNA、二本鎖核酸又は一本鎖核酸には結合することができない。 PNAは、そのいくつかは、適切なリンカーを通してその骨格に結合した天然の核塩基のような複数のリガンドを有するポリアミド骨格を有する新しく開発された非天然の化合物である。いくつかの PNAは、相補的な核酸について驚くほど高いアフィニティーを有し、極めて安定かつ特異的な複合体を形成することが示されている。新しく供される抗体は、これらの PNAを、ハイブリダイゼーションプローブとして極めて役立つものにする。供される抗体は、それらの PNA−核酸複合体と反応する能力により、生物サンプル中の核酸の捕獲、認識、検出、同定、又は定量に役立つ。

Description

【発明の詳細な説明】 PNA／核酸複合体に結合することができるモノクローナル抗体 本発明は、PNA（ペプチド核酸）と核酸との間に形成された複合体に結合する ことができるモノクローナル抗体に関する。 PNAは、そのいくつかは適切なリンカーを通して骨格に結合した天然のヌクレ オベースのような複数のリガンドを有するポリアミド骨格を有する新しく開発さ れた非天然の化合物である。いくつかの PNAは、極めて安定かつ特異的複合体を 形成する相補的核酸について驚くべき高アフィニティーを有することが示されて いる。このような PNAは核酸の検出のためのハイブリダイゼーションプローブと して適している。本発明によれば、このような PNAをハイブリダイゼーションプ ローブとして極めて有益なものにする抗体を提供する。 これらの抗体は、それらの PNA-核酸複合体に結合する能力により、生物サン プル中の核酸の捕獲、認識、検出、同定または定量に役立つ。 発明の背景 １又は複数の化学的又は生物学的物質の捕獲、認識、検出、同定又は定量は、 組換え DNA、ヒト及び獣医学、農業及び食品科学等の分野に役立つ。特に、これ らの技術は、バクテリア及びウイルスのような病因原を検出及び同定すること、 抗生物質耐性についてバクテリアをスクリーニングすること、遺伝病の診断を助 けること、及び癌細胞を検出することに用いることができる。 現在の技術における核酸ハイブリダイゼーションアッセイ技術は 、一般に、相補的核酸プローブの標識形態とのハイブリダイゼーションに関する 。サンプル中の核酸の特定の塩基配列と標識プローブとの間のハイブリダイゼー ションは、標識された複合体の検出によって測定される。標識されたプローブの 調製は、一般に、放射能標識されたヌクレオチドもしくは修飾ヌクレオチドの酵 素的組込み又は検出可能な化学基に付着しもしくはそれを形成するようなプロー ブの化学修飾に関する。標識されたプローブの調製は、しばしば時間を浪費して 高価であり、そしてその相補鎖と検出可能にハイブリダイズするプローブの能力 を破壊せずに行われなければならない。 サンプルと核酸プローブとの間のハイブリダイゼーションの結果として形成さ れ、それにより用いられるプローブの化学的標識を避ける核酸二本鎖を直接検出 するための試薬は、検出を容易にするであろう。 二本鎖核酸に結合するが一本鎖核酸に結合しないであろう特定のポリクローナ ル抗体の形成は、二本鎖核酸に対して生じたポリクローナル抗血清は、一本鎖核 酸と交差反応するであろう抗体を含み得るという事実によって複雑になる。ポリ クローナル抗血清は、一本鎖核酸に対する自然の抗体又は免疫化に用いられる免 疫原の分解の結果として生ずる一本鎖核酸に対する抗体も含み得る。 モノクローナル抗体技術を用いることにより、所定のアフィニティー及び特異 性を有するように抗体が選択される。 US 4,623,627及びUS 4,833,084から、慣用的核酸プローブと標的核酸との間に 形成された二本鎖に結合するモノクローナル抗体が知られている。 WO 92／20702 において、用語 PNAは、非環式骨格を有し、そして適切なリン カーを通してその骨格に結合した天然のヌクレオベースのような複数のリガンド を有する化合物を記載するのに用いられ る。その骨格が重合したＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位を含む PNAのよ うなデオキシリボース骨格と構造的に相同であり、ここでグリシンがリンカーに より天然の核塩基（ヌクレオベース）に結合している PNAは、 PNAの塩基配列に 相補的である塩基配列を有する核酸とハイブリダイズして、安定な PNA−核酸複 合体を形成することができる（Egholmら、Nature，Vol 365，566〜568(1993)） 。 このような PNAは、相補的な核酸配列と強く結合することが示されている。前 記 PNAと相補的核酸との間に形成された複合体の融点Ｔm は、 DNA又は RNAプロ ーブと核酸標的との間に形成された対応する二本鎖についてのＴm 値より塩基当 り典型的に１〜２℃高い。Ｔm は、核酸二本鎖の鎖の半分が解離又は変性する温 度として定義される。 本発明によれば、 PNAと核酸との間に形成された複合体を認識し、結合し、そ して検出することができる新規モノクローナル抗体を供する。 発明の概要 本発明の一態様は、 PNAと核酸との間に形成された複合体に結合することがで きるモノクローナル抗体である。 塩基対の特徴を有することを別にして、 PNA／核酸複合体及び核酸二本鎖、例 えば DNA／DNA 又は DNA／RNA 二本鎖は、好ましい PNA／核酸複合体の PNAは、 核酸二本鎖の対応する鎖と反対に、 PNAをアキラルかつ無電荷にする重合したＮ −（２−アミノエチル）グリシン単位を含み、ここでその骨格は各々のリン酸基 について１の陰イオンを含むヌクレオチドの配列である点で実質的に異なる特性 を有する。２つのタイプの化合物間の結果としての立体的及び構造 的交差は、 PNA／核酸複合体に特異的に結合する抗体が利用できるか否かを絶対 的に予測できないものにする。 本発明の他の態様は、 PNAと DNAとの間又は PNAと RNAとの間に形成された複 合体に結合することができるモノクローナル抗体である。 好ましい態様において、 PNAと核酸との間に形成された複合体に結合すること ができるモノクローナル抗体は、一本鎖 PNA、二本鎖核酸又は一本鎖核酸に結合 しない。 これらの実施形態の１つにおいて、モノクローナル抗体は、 PNAと DNAとの間 に形成された複合体に結合することができるが、 PNA／RNA 複合体、二本鎖 DNA 、 DNA／RNA 二本鎖、一本鎖 RNA又は一本鎖核酸に結合することができない。 これらの実施形態の他のものにおいて、モノクローナル抗体は、 PNAと RNAと の間に形成された複合体に結合することができるが、 PNA／DNA 複合体、二本鎖 DNA、 DNA／RNA 二本鎖、一本鎖 PNA又は一本鎖核酸には結合することができな い。 PNA／核酸複合体の特定の配列によるより高い程度で認識されるエピトープの 特異性が PNA／核酸複合体の構造により示されるモノクローナル抗体も本発明の 一部である。 本明細書に記載されるモノクローナル抗体は、一般に知られる技術を用いてハ イブリドーマから得ることができる。所定のホスト動物は、 PNAを核酸と接触さ せることにより形成された複合体で免疫化される。抗体を分泌するリンパ球は、 免疫化された動物から採取され、ミエローマ細胞と融合されてハイブリドーマを 形成する。 PNA−核酸複合体と結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞が選 択される。これらの選択されたハイブリドーマは、その分泌される抗体の単一ク ローン性を確実にするようサブクローンされる。免疫 化のための適切な複合体は、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位の骨格を有 する PNAと DNA又は RNAとの間に形成された複合体である。 テストサンプル中の特定の核酸配列を検出するための種々の方法が本発明の更 なる態様であり、それにより本抗体は、１又は複数の化学的又は生物学的物質の 捕獲、認識、検出、同定又は定量に役立つ。 本抗体は、ヒト及び獣医学の分野に極めて役立ち得る。本抗体は、クラミジア 又は淋菌の生物のようなヒトにおける感染源の存在もしくはその量又はエプスタ イン・バールウイルスもしくはパピロースウイルスの感染を検出するのに極めて 適するだろう。本抗体は、染色体ペインティングのような細胞遺伝学の一般的分 野にも役立つ。 本発明は、必要に応じて標識された本発明によるモノクローナル抗体、検出さ れるべき核酸配列と複合体を形成することができる PNA配列、及び視覚化システ ムを含むキットも提供する。 特定の実施形態の記載 本明細書に用いる場合、用語“モノクローナル抗体”は、全体の完全な抗体、 抗体フラグメント、又は一般に本明細書に記載される特徴を有する少くとも１の 抗体結合部位を含む抗体から誘導されたいずれの物質をも含むことを意図する。 イムノグロブリンの周知のクラス及びサブクラスのいずれの抗体も、例えば IgG 及び IgM等、並びに Fab，F(ab′)及びF(ab′)₂として慣用的に知られるIgフラ グメントのような活性フラグメントも含まれる。 用語“核酸”は、１のヌクレオシドの５′−位と他方のヌクレオシドの３′− 位との間のホスホジエステル架橋により一緒に連結さ れたデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのいずれかでしるサブユニ ットから構成されるヌクレオチドポリマーをも含む。それらは DNA又は種々のタ イプの RNAであり得る。用語“塩基”及び“核塩基(ヌクレオベース)”は、核酸 及び PNAのピリミジン及びプリン塩基について交換可能に用いられる。 PNAは、第３回固相シンポジウム(Solid-Phase Symposium)で供された“Improv ed Synthesis，Purification and Characterization of PNA Oligomers”に記載 される手順に従って合成されるか、又は PNAは、Per Septive Biosystems(Frami ngham，MA，USA)から得られる。 免疫化のために用いられる PNA−核酸複合体は、適切には、 PNAと DNAとの間 又は PNAと RNAとの間の複合体であり得る。核酸と PNAとの両方は別のペプチド ソースが全くないので、核酸複合体と PNA／核酸複合体との両方は、それ自身に 注射した時に、通常のホスト動物（即ち核酸に対する自己抗体を発生する傾向が ない動物）において本質的に非免疫原性であると予想されよう。これらの環境下 では、ホスト動物に対して外来の担体への非免疫原性抗原の慣用的コンジュゲー ションは、一般に、実用的でなく、労力が多く、そして更に抗原における構造的 変化を形成する危険を導くことが見い出されているが、核酸複合体に対する免疫 応答は、ポリ陰イオン性核酸複合体とポリ陽イオン性タンパク質誘導体、特にメ チル化アルブミン又はグロブリン種との間に形成された非共有結合性イオン性複 合体で、通常のホスト動物を免疫化することによって誘導される（US 4,623,627 、US 4,833,084）。 PNA／DNA 複合体に対する抗体が、 PNA／DNA 複合体及び卵白アルブミンのよ うなホスト動物に対して同種である非誘導化タンパク質を含む混合物で通常のホ スト動物を免疫化することによって生じ 得ることが、驚くべきことに発見された。この技術は、 PNA／RNA 複合体での免 疫化にも適用することができる。 PNA−DNA 複合体は、二本鎖又は一本鎖 DNAを、その DNA鎖の全部又は一部に 相補的である塩基配列を有する PNA分子と接触させ、その混合物を加熱して一本 鎖分子を形成し、そしてその混合物を室温までゆっくりと冷やすことによって調 製することができる。 PNA−RNA 複合体は、 RNAを、その RNA配列の全部又は一 部に相補的である塩基配列を有する PNA分子に接触させ、その混合物を加熱し、 そしてその混合物を室温までゆっくりと冷やすことによって調製することができ よう。複合体形成は、その複合体のＴm を測定することにより又はポリアクリル アミドゲルで電気泳動を行うことによりキャラクタライズすることができる。 PNA−核酸複合体の１つの適切な量は、アジュバント及び担体と混合される。 適切な担体の例は、KLH(キーホール・リンペット（Keyhole Limpet）ヘモシアニ ン)、卵白アルブミン及びデキストランである。 (1975))の研究から得られた体細胞ハイブリダイゼーション技術により形成され るハイブリドーマ細胞の分泌物から収集することができる。この技術は公知であ り、種々の精密化及び改良が行われている。詳細は、Waldmann，M．C．H．(“Pr oduction of murine monoclonal antibodies”in Monoclonal Antibodies，Beve rly，P．C．L.，ed.，Churchhill Livingstone，London，1986)，Melchers，F. ら（Preface of“Lymphocyte Hybridomas”in Current Topics in Microbiology and Immunology 81，Springer-Verlag(New York 1978)，IX-XVII）；及び Yelt on，D．E.ら、“Plasmocytomas and Hybridomas”in Monoclonal Antibodies，K ennett et al，eds.，Plenum Press，New York，1980，3-17）に記載される。 PNA−核酸複合体に対する抗体を産生するリンパ球は、種々の部位、例えばリ ンパ節、脾臓又は末梢血液から得ることができる。その選択されるリンパ球は、 好ましくは、 PNA−核酸複合体、例えば PNAと DNAとの間又は PNAと RNAとの間 の複合体で免疫化されているホスト動物、例えばマウス又はラット、好ましくは マウスからの脾臓細胞である。マウスは、 PNA／DNA 複合体の混合物で、腹腔内 、皮下又は静脈内で免疫化することができ、ここで好ましくは実施形態における PNAは、重合したＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位、卵白アルブミン及び 適切なアジュバントを含む。 融合のため、種々の動物源のミエローマ細胞：例えば、マウス、ラット又はヒ トからのミエローマ細胞を用いることができる。しかしながら、遺伝的安定性の 理由のため、同じ動物種からの、最も好ましくはそれら動物種の同じ株からのリ ンパ球とミエローマ細胞とを融合することが好ましい。ネズミのリンパ球及びミ エローマ細胞が最も一般に用いられる。ミエローマ細胞は、好ましくはBALB／ｃ 株からのものであり、最も好ましくはミエローマ細胞系P3−X63 −Ag.8である。 ハイブリドーマを形成するためのリンパ球とミエローマ細胞との融合及び抗体 の選択は、それ自体周知である方法によって達成される。その選択されたハイブ リドーマは、適切な期間、試験管内で培養され、その培養液のアリコートがモノ クローナル抗体の豊富な画分を供するために取られる。本明細書に記載されるモ ノクローナル抗体は、モノクローナル抗体の精製のためのそれ自体周知である方 法を用いる精製によってこれらの画分から回収することができる。 本抗体は、 PNA−核酸複合体について高い程度の特異性を有する。二本鎖核酸 、二本鎖 PNA、一本鎖 PNA又は一本鎖核酸への大きな 程度の結合は観察されない。本抗体により認識されるエピトープの特異性は、 P NA又は核酸の特定の配列よりむしろ PNA−核酸複合体のコンホメーションによっ て示されるようである。 得られたクローンは、 PNA／DNA 複合体に特異的に結合することができる抗体 を産生した。これらのクローンでは、一本鎖 PNAもしくは DNA又は二本鎖 DNAも しくは二本鎖 PNA又は PNA／RNA との大きな反応は観察されなかった。 本抗体の高い特異性及びアフィニティーは、 PNAと生物サンプル中で検出され るべき核酸との間に形成された複合体の単離、検出及び定量に用いる場合に大き な利点を供する。これにより、 PNA／DNA 複合体について高い特異性を有する抗 体は、クラミジアもしくは淋菌生物のようなヒトにおける又は動物における感染 源を同定するための PNAベースの分析に特に価値がある。これらの抗体は、染色 体の特定の検出のような細胞遺伝学の一般的分野においても極めて役立つ。 PNA／RNA 複合体について高い特異性及びアフィニティーを有する本発明によ る抗体は、例えばmRNA又はrRNA配列を同定するための、 PNAベースの分析に特に 役立つ。 特定の使用により、抗体は、補酵素、酵素インヒビター及び酵素自体のような 酵素的に活性な基、蛍光標識、発色団、発光標識、特異的に結合できるリガンド 、例えばビオチン又はハプテンのような検出可能な標識と結合され得る。 本明細書に記載される抗体を用いてサンプル中の特定の核酸配列を検出するた めの方法は、 （ａ）サンプル中の検出されるべき特定の核酸配列と、検出されるべき核酸配 列の塩基配列に、複合体を形成するのに十分に相補的である塩基配列を有する P NAと、の間の複合体を形成し、ここで前 記複合体は本明細書に記載される抗体のための少くとも１のエピトープを有し、 （ｂ）PNA配列と検出されるべき核酸配列との間に形成されたいずれかの複合 体を、本明細書に記載される抗体と接触させ、そして （ｃ）抗体−PNA −核酸複合体の存在を決定する ステップを含み得る。 PNA配列は、適切には、検出されるべき核酸配列を含むサンプルとの接触の前 に固体支持体上に固定化されるか、又は抗体は、 PNA−核酸複合体との接触の前 に固体支持体上に固定化され得る。 検出されるべき核酸配列が生物試料中に固定化された状態で存在するなら、 （ａ）試料中の検出されるべき特定の核酸配列と、検出されるべき核酸配列の 塩基配列に、複合体を形成するのに十分に相補的である塩基配列を有する PNAと 、の間の複合体を形成し、ここで前記複合体は本明細書に記載される抗体のため の少くとも１のエピトープを有し、 （ｂ）PNA配列と検出されるべき核酸配列との間に形成されたいずれかの複合 体を、本明細書に記載される抗体と接触させ、そして （ｃ）抗体−PNA −核酸複合体の存在を決定する ステップを含む方法を用いることができる。 最初のステップが、検出されるべき核酸配列の固定化である方法においては、 その方法は、適切には、 （ａ）検出されるべき核酸配列を固体支持体に固定し、 （ｂ）サンプル中の検出されるべき特定の核酸配列と、検出されるべき核酸配 列の塩基配列に、複合体を形成するのに十分に相補的である塩基配列を有する P NAと、の間の複合体を形成し、ここで前記複合体は本明細書に記載される抗体の ための少くとも１のエピト ープを有し、 （ｃ）PNA配列と検出されるべき核酸配列との間に形成されたいずれかの複合 体を、本明細書に記載される抗体と接触させ、そして （ｄ）抗体−PNA −核酸複合体の存在を決定する ステップを含み得る。 本発明の適用の例を以下に記載する。 本抗体を用いる上述の方法又は他の方法を行うためのキットは、標識又は非標 識形態における本抗体に加えて、検出されるべきヌクレオチド配列の全部又は一 部に相補的である PNA配列及び視覚化システムを含む。その視覚化システムは、 酵素コンジュゲート（例えば酵素接合抗体又は酵素接合ストレプトアビジン）及 び適切な基質を含み得る。そのコンジュゲートは、本抗体の非標識形態が用いら れる場合にマウスイムノグロブリンエピトープに、又は本抗体がハプテン基で標 識されている場合にビオチン、フルオレセイン又はペプチドのようなハプテン基 に対して反応性を有し得る。そのキットの基質システムは、 RNA／核酸複合体が ELISA形態で測定される場合には可溶性の有色反応生成物を形成するように選択 され得、又はその基質システムは、 PNA／核酸複合体が生物サンプル内又はメン ブラン上で測定される場合には不溶性有色反応生成物を形成するように選択され 得る。 適用１：溶液中でのハイブリダイゼーション及び検出 関心の核酸配列は、該核酸配列を含むサンプルを、該関心の核酸の塩基配列に 複合体を形成するのに十分に相補的である塩基配列を有する PNAを接触させ、次 に PNA−核酸複合体を認識するが遊離 PNA又は核酸を認識しない本明細書に記載 される抗体と接触させることによって溶液中で測定することができる。これらの 反応は、例えば比濁アッセイ形態において、検出することができる大きな複合体 を生ずるだろう。 適用２：固定化後の溶液ハイブリダイゼーション及び検出 関心の核酸配列は、それを、関心の核酸配列の塩基配列に複合体を形成するの に十分に相補的である塩基配列を有する PNAに接触させることにより測定するこ とができる。その形成された複合体は、まだ溶液中にある時、本明細書に記載さ れる標識された抗体と接触させられる。次に、その形成された PNA−核酸−抗体 複合体は、例えば固体支持体上に固定化されている、本明細書に記載される抗体 を用いて捕獲される。未結合の材料に洗い落とされ、そして結合した PNA−核酸 −抗体複合体の量が、抗体上の標識の検出によって測定される。 あるいは、関心の核酸の塩基配列に、複合体を形成するのに十分に相補的であ る塩基配列を有する PNAは、標識、例えばビオチン、蛍光標識、又は PNA−核酸 複合体の捕獲に適した他の成分を有し得る。未結合の材料は洗い落とされ、そし て結合した PNA−核酸−抗体複合体の量は、抗体上の標識の検出により、又は２ 次抗体検出システムを用いることにより、決定される。 適用３：捕獲アッセイ 古典的な捕獲アッセイは、認識、捕獲及び検出のステップを含み、そして種々 の方法で構成され得る。このようなアッセイの一例は以下に記載される。 PNA−核酸複合体に結合することができる抗体は、固体支持体に、例えば ELIS Aプレート上に固定化される。 PNA及びサンプルは混合されて、 ELISA−プレー トのウェル内の溶液中で反応させられる。 PNAとサンプル核酸との間の複合体が 形成されるなら、これらの複合体は、固定化された抗体により捕獲されるだろう 。未結合の材料は洗い落とされ、そして結合した PNA−核酸−抗体の量が測定さ れる。捕獲ステップは、 PNA−核酸複合体以外の認識可能な成分にも基づき得る 。このような成分は、例えばビオチン化 PNA、又は他のハプテン、ペプチド、又 はポリペプチドで標識された PNAであり得よう。 いくつかのアッセイ形態において、上述の２又はそれ超のステップは同時に行 うことができる。 適用４：固体支持体上に固定化された PNA／核酸複合体の検出 PNA又は核酸のいずれかが最初に固相支持体上に固定化された PNAと核酸との 間に形成された複合体は、本明細書に記載される抗体によって検出することがで きる。この検出は、酵素、蛍光マーカーもしくは他のシグナル形成システムに接 合された上記抗体を用いて直接的に、又は標的に結合した抗体を検出するために 一般に用いられる２次検出システムの１つを用いて間接的にのいずれかで行うこ とができる。考慮される固相支持体は、例えばナイロンもしくはニトロセルロー ス膜（サザン又はノーザンブロット）、組織セクション、細胞スメア、サイトス ピンもしくは染色体スプレッド（イン・シトゥ・ハイブリダイゼーション）、又 はプラスチック表面(ELISAフォーマット)のように極めて広範囲に理解されるべ きである。 このシステムは、一本鎖である非特異的に結合した PNAが、抗体が核酸と複合 体を形成する PNAのみを認識するのでシグナルを生じないであろうので、これら の技術に含まれる通常の極めて広範囲の洗浄手順が大きく削減され得る点で利点 を有する。 適用５：バイオセンサーシステム 生物サンプル中の核酸の検出及び定量は、 Pharmaciaからの BIAcoreバイオセ ンサーシステムのようなバイオセンサーシステムを用いて行うことができる。セ ンサーチップ上の固定化されたリガンドとの生物分子の相互作用は、消えてゆく （evanescent）光を用いて 表面で測定される。そのシステムは、リガンドが親水性デキストランマトリック スに固定され得るセンサーチップ、センサー表面への被検体及び試薬の輸送のた めの小型流体カートリッジ、SPR(表面プラスモン共鳴)ディテクター、オートサ ンプラー並びにシステム制御及び評価ソフトウェアーを含む。特異的リガンドは 、アミン、チオール又はアルデヒド化学物質を通して又は例えばビオチン−アビ ジン相互作用により生物特異的に共有結合で固定化される。 本明細書に記載される抗体は、用いられるバイオセンサーシステムのセンサー チップに、例えば BIAcoreシステムにおけるセンサーチップのデキストラン層に 結合され得る。サンプルは PNAと混合され、そしてサンプル中の核酸と、関心の 核酸の塩基配列に複合体を形成するのに十分に相補的である塩基配列を有する P NAと、の間に形成されるように、インキュベートされる。サンプルは、バイオセ ンサーのフローシステムを通過し、センサーチップに結合した抗体は、このよう な複合体が形成されたなら、 PNA−核酸複合体に特異的に結合するだろう。バイ オセンサーシステムに用いられる SPR検出に基づいて、この結合は、表面に結合 した材料の量によってシグナルを発生するだろう。 適用６：細胞内で結合した PNAの検出 適切な条件下で、 PNAは、生きている細胞又は固定化された細胞、例えば細胞 系、造血細胞、及び動物／ヒト組織（治療適用において重要である）の細胞壁に 浸透することができる。個々の細胞における異なる標的とハイブリダイズした P NAを検出することができることが重要であり得る。このような場合、ハプテン又 は他のリポーター分子での PNAのラベリングは、これが PNAの細胞内への浸透を 阻害又は妨害し得るので有利でない。（凍結又は固定した組織バイオプシーにお ける）免疫組織化学、又は（例えば界面活性剤、アセ トン又はアルコールで処理した細胞での）フローサイトメトリーのいずれかによ る標的とハイブリダイズする PNAの検出が重要である。細胞培養物に添加され、 又は生きている動物に投与された PNAの結合及び／又は組織分布を検出すること ができることも有利である。このような検出は、本明細書に記載されるように供 される抗体で可能となる。 以下の実施例において、本発明の特定の実施形態が供される。これらの実施例 は、本発明を限定することを意図しない。 実施例 実施例１ PNA ／核酸複合体及び一本鎖 核塩基がメチレンカルボニルリンカーを通して結合している重合したＮ−（２ −アミノエチル）グリシン単位を含む PNAを、“Improved Synthesis，Purifica ton and characterization of PNA Oligomers”，(第３回固相シンポジウム、 O xford UK，Aug．31-Sept．4，1994)，並びに M．Egholmら（J．Am．Chem．Soc． 114，1895-1897(1992)）及び M．Egholmら（J．Chem．Soc．chem．Commun．800- 801(1993)）に記載されるように合成して精製するか、又は前記 PNAを Per Sept ive Biosystemから得た。用いた PNAの塩基配列は、好ましくは、 PNA分子中の 自己ハイブリダイゼーションを避けるために実質的に非自己相補的である。プリ ン及びピリミジンの数は、三重らせん形状よりむしろ二重らせん形状の形成を許 容するためにほぼ等しい。 標準の381Aサイクル／手順を用いて、Applied Biosystems Incからのabi 381A DNAシンセサイザーで DNA配列を合成した。用いたモノマーは、Applied Biosys tems Synthesizerのための標準β−シアノエチルホスホアミジトであった。 RNA 配列を、DNA Technology A ps（Science Park Aarhus，Gustav Wieds Vej 10，DK-8000 Aarhus）から購入し た。 PNA及び DNA配列は標識されても非標識であってもよく、必要に応じて１又は 複数のリンカー単位、好ましくは１又は２のリンカー単位を含み得、ここで２つ のリンカー単位は端と端とが結合されている。リンカーは、全ての場合、“−li nk−”として記載され、それと独立して、標識された PNAもしくは DNA配列又は リンカー単位の数が加えられる。 PNAは、次の方法でビオチンで標識することができる：１又は２単位の２−（ アミノエトキシ）エトキシ酢酸（AEEA）を樹脂（上述）上の PNAに結合させ、そ してビオチンを次のように結合させる。２つの溶液を用いた。第１の溶液は 0.2 ＭのＮ−エチルジシクロヘキシルアミンを含む DMF中５％のｓ−コリジン中 0.1 Ｍビオチンを含んでおり、第２の溶液は DMF中0.18ＭのHBTU（２−（１Ｈ−ベン ゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサ フルオロホスフェート）を含んでいる。その２つの溶液を２：１の比で混合し、 その混合液を約１分、放置した後、それを、１又は２単位のAEEAが結合した樹脂 と組み合わせた。 DNAのビオチン標識のために、次の２つの手順を用いることができる。 DNAオ リゴマーの５′末端のラベリングのため、リンカー(Spacerホスホルアミジト、C lontech Laboratories)をオリゴマーの５′−OHに連結し、次にビオチンラベリ ング試薬(Biotin CEホスホルアミジト、22−0001−35，Cruachem Limited)と反 応させた。オリゴマーの３′末端におけるラベリングのため、Biotin−CPG 支持 体(３′−Biotin−ON CPG cat # RP−5225−2 K．J．Ross Peter 第１の試薬はリンカー（Spacerホスホルアミジト、Clontech Labor atoreies，Inc.）であり、モノマー試薬をオリゴマーを合成するために加えた。 全ての PNA配列は、(DNAの５′末端に相当する)“Ｈ−”で示されるアミノ末 端から、（DNAの３′末端に相当する）“CONH₂”で示されるＣ末端に記載される 。全ての DNA配列は、５′末端から３′末端に記載される。以下のテスト複合体 ／化合物を用いた： Ｈ12．45−mer の DNA配列（Ｕ１）及び３単位の15−mer PNA 配列 （Ｕ２）を含む非標識 PNA／DNA 複合体（免疫原）。 45−mer DNA(Ｕ１)の塩基配列は次の通りであった。 15−mer PNA(Ｕ２)の塩基配列は次の通りであった。 Ｌ１． DNA配列の５′末端に結合したビオチンを有する一本鎖45−mer DNA 配列 (ssDNA)。 45−mer DNA(Ｌ１)の塩基配列は次の通りであった。 Ｌ２． DNA配列の３′末端に結合したビオチンを有する45−mer DNA配列（Ｌ２ ）。 45−mer DNA の塩基配列（Ｌ２）は次の通りであった。 Ｈ２．ビオチンが45−mer DNA 配列の３′末端に結合している45−mer DNA 配列 （Ｌ２）及び３単位の15−mer PNA 配列（Ｕ２）を含む PNA／DNA 複合体。 DNA 配列に結合したビオチン成分とは別に、この複合体は、免疫化に用いられる複合 体に相当する 。 45−mer DNA(Ｌ２)の塩基配列は次の通りであった。 15−mer PNA(Ｕ２)の塩基配列は次の通りであった。 Ｌ４．免疫化に用いられる複合体中の15−mer PNA に相当し、５′末端において ビオチンで標識された塩基配列を有する一本鎖15−mer PNA 配列(ssPNA)。15-me r PNA(Ｌ４)の塩基配列は次の通りであった。 Ｌ３．ビオチンが DNA配列の５′末端に結合している15−mer DNA 配列（Ｌ３） 。この15−mer DNA(Ｌ３)の塩基配列は次の通りであった。 Ｈ３．ビオチンが 15mer DNA配列の５′末端に結合している15−mer DNA 配列（ Ｌ３）及び15−mer PNA 配列（Ｕ２）を含む PNA／DNA 複合体。 この15−mer DNA(Ｌ３)の塩基配列は次の通りであった。 15−mer PNA(Ｕ２)の塩基配列は次の通りであった。 Ｈ４．15−mer DNA 配列（Ｌ３）及び相補的15−mer DNA 配列（Ｕ４）を含む D NA／DNA 複合体。ビオチンは、Ｌ3 15−mer DNA 配列の５′末端に結合している 。 この15mer DNA(Ｌ３)の塩基配列は次の通りであった。 15−mer DNA(Ｕ４)の塩基配列は次の通りであった。 Ｈ20．免疫原に類似し、３′末端においてビオチンで標識された45−mer DNA 配 列（Ｌ２）及び３単位の15−mer DNA 配列（Ｕ４）からなる大きな DNA/DNA 複 合体。この複合体の２つの鎖の配列は（Ｈ２及びＨ４の記載に関して）上述され る。 Ｌ５． PNAがアミノ末端においてビオチンで標識されている20−mer PNA 配列。 20−mer PNA(Ｌ５)の塩基配列は次の通りであった。 Ｈ７． PNAがアミノ末端においてビオチンで標識されている20−mer PNA 配列及 び免疫化に用いた複合体の配列と異なる塩基配列を有する20−mer DNA を含む P NA／DNA 複合体。 20−mer PNA(Ｌ５)の塩基配列は次の通りであった。 この20−mer DNA(Ｕ６)の塩基配列は次の通りであった。 Ｌ６．５′末端に結合したビオチンを有する17−mer DNA 配列。 17−mer DNA(Ｌ６)の塩基配列は次の通りであった。 Ｈ８．その塩基配列は上述の複合体と異なるが、後述の複合体Ｈ９に関連する17 −mer PNA 配列及び17−mer DNA 配列を含む PNA／DNA 複合体。この複合体の D NA鎖は、５′末端でビオチンで標識されている。 17−mer DNA(Ｌ６)の塩基配列は次の通りであった。 17−mer PNA(Ｕ７)の塩基配列は次の通りであった。 Ｌ７．アミノ末端においてビオチンで標識された17−mer PNA 配列。 17−mer PNA(Ｌ７)の塩基配列は次の通りであった。 Ｈ９．その塩基配列が上述の複合体と異なるが、上述の複合体Ｈ８に関連する17 −mer PNA 配列及び DNA配列を含む PNA/DNA 複合体。この複合体の PNA鎖は、 アミノ末端においてビオチンで標識されている。 17−mer DNA(Ｕ８)の塩基配列は次の通りであった。 17−mer PNA(Ｌ７)の塩基配列は次の通りであった。 Ｌ８．アミノ末端においてビオチンで標識された19−mer PNA 配列。 19−mer PNA(Ｌ８)の塩基配列は次の通りであった。 Ｈ10．19−mer PNA 配列（Ｌ８）及びその PNA配列に相補的な塩基配列を有する 19−mer RNA 配列（Ｕ９）を含む PNA/RNA 複合体。この複合体の PNA鎖はアミ ノ末端においてビオチンで標識されている。 19−mer PNA(Ｌ８)の塩基配列は次の通りであった。 19−mer RNA(Ｕ９)の塩基配列は次の通りであった。 Ｈ22．19−mer PNA 配列（Ｌ８）及び PNA塩基配列に相補的な塩基配列を有する 19−mer DNA 配列（Ｕ26）を含む PNA/DNA 複合 体。この複合体の PNA鎖は、そのアミノ末端においてビオチンで標識されている 。 19−mer PNA(Ｌ８)の塩基配列は次の通りである。 19−mer DNA(Ｕ26)の塩基配列は次の通りである。 Ｈ29．15−mer PNA 配列（Ｕ27）及び30−mer DNA 配列（Ｌ11）を含む PNA／DN A 。30−mer DNA 配列はその３′末端においてビオチンで標識されている。その PNA配列はその DNA配列の中心部分と相補的であり、 PNA／DNA 複合体に、５′ −及び３′−の両方での一本鎖 DNAオーバーハングを生ずる。 30−mer DNA(Ｌ11)の塩基配列は次の通りであった。 15−mer PNA(Ｕ27)の塩基配列は次の通りであった。 Ｈ30．ビオチンが 45mer−DNA 配列の５′末端に結合している45−mer DNA 配列 （Ｌ12）及び３単位の15−mer PNA 配列（Ｕ13）を含む PNA／DNA 複合体。 45−mer DNA(Ｌ12)の塩基配列は次の通りであった。 15−mer PNA(Ｕ13)の塩基配列は次の通りであった。 Ｈ31．ビオチンが45−mer DNA 配列の３′末端に結合している45−mer DNA 配列 （Ｌ13）及び３単位の15−mer PNA 配列（Ｕ13）を含む PNA／DNA 複合体。 Ｌ13の塩基配列は先のＬ12の塩基配列と同一である。 Ｌ13の配列は次の通りである。 15−mer PNA(Ｕ13)の配列は次の通りであった。 Ｈ32．ビオチンがＬ７の５′末端に結合している17−mer PNA 配列、Ｌ７及びＵ 28を含む PNA／PNA 複合体(dsPNA)。 Ｌ７の塩基配列は次の通りであった。 Ｕ28の塩基配列は次の通りであった。 dsDNA. 異なる一本鎖 PNA又は DNA配列及び上述の複合体と別に、ウシ胸腺 DNA のフラグメント（Sigma D−1501； 200〜1000bpを含むフラグメントに転化され たもの）を含む二本鎖DNA（dsDNA）も、これらのモノクローナル抗体の特異性を テストするのに用いた。 適切な緩衝液(例えば 50mM Tris−HCl 、pH 7.6、50mM NaCl)中で、核酸を、 その核酸配列の全部又は一部と相補的である塩基配列を有する PNAと混合し、そ の混合物を加熱して一本鎖分子を形成し、そしてその混合物を室温までゆっくり 冷やすことにより、 PNA／核酸複合体を調製する。 複合体形成を以下に記載されるようにキャラクタライズした。 Ｔm 測定：加熱設備(Peltier加熱要素)と共に“セルホルダー”を備えた Lamd a 2S UV／VIS スペクトロメーター（Perkin Elmer）で、 PNA／DNA 及び PNA／R NA 複合体のＴm 測定を行った。 ３mLの 50mM Tris−HCl 、pH 7.6、50mM NaCl緩衝液中２nmol複合体の最終容 量を調製するために、適切な量の各々の鎖及びその緩衝液を、3.6mL NUNC Cryo Tube内で混合する。その混合液を10分間 、95℃に加熱し、室温までゆっくりと冷やす（３〜４時間）。約 2.8mLを、ふた 及び撹拌磁石を備えた３mL石英キュベットに移す。そのキュベットの温度を、20 ℃から始めて95℃まで、 0.2℃／分の速度で増加させる。 260nmの吸光度を連続 的に測定する。Ｔm 値を、融解曲線の第１誘導体の最高点として測定する。 アクリルアミドゲル電気泳動： TBE緩衝液(89mM Tris−borate、２mM EDTA)中 で20％ポリアクリルアミドゲル内でその複合体を走らせることによっても、複合 体形成をテストした。その複合体をNytran 13Nフィルター紙（Schleicher & Sch uell）に移した。複合体を、その複合体のラベルに従って視覚化した。ビオチン 又はフルオレセイン標識のいずれかを含む複合体を、各々アルカリホスファター ゼ（AP）接合ストレプトアビジン又は抗フルオレセイン抗体を用いて視覚化した 。非標識の複合体は、臭化エチジウムで染色することによりポリアクリルアミド ゲルにおいて直接、又は WO 95／17430 に記載されるポリクローナル PNA／核酸 抗体、次に二次抗体、例えばブタ抗ウサギ／APを用いることにより、視覚化した 。結合したAPコンジュゲートは、色原混合物 NBT／BCIPを用いて視覚化した。 ドット・ブロット：複合体の希釈列（ドット当り20ng／２ng）をNytran 13Nフ ィルター紙（Schleicher & Schuell）上にスポットした。上述のように視覚化を 行った。 実施例２ モノクローナル抗体の生産 免疫原の調製及び免疫化 免疫化のために用いた抗体、 PNA／DNA 複合体Ｈ12を、２mLの全量で、次のも のを混合することによって調製した。 0.939mg the 45−mer ポリデオキシリボヌクレオチド（DNA） 1.145mg the 15−mer PNA 配列 50mM Tris−HCl 、pH 7.5 50mM NaCl その混合物を加熱ブロック中で92℃に加熱し、そして室温まで冷やした。 PNA ／DNA 複合体の最終濃度は1.04mg／mLであった。複合体形成を、実施例１に記載 されるようにテストした。 1.04mg／mLの濃度で調製された PNA／DNA 複合体に、卵白アルブミンを 250mg ／mLの濃度で加えた。この混合物を更に、１：１ｖ／ｖの比較でフロイントの不 完全アジュバントと混合し、約３週間の間隔で、腹腔内又は皮下に５回、雌のBA LB／ｃマウスを免疫化するのに用いた。 ハイブリドーマの生産 融合を行う３日前に、 PNA／DNA 複合体及び卵白アルブミンの混合物にアジュ バントを加えずに、腹腔内に免疫化した。免疫化したマウスからの脾臓細胞及び 融合パートナーとしてのミエローマ細胞P3−X63 −Ag.8での標準的融合手順を用 いて融合を行った。 ハイブリドーマのスクリーニング： 融合後14日に最初のスクリーニングを行い、以下に記載される ELISAシステム で、二次層としてＨ２複合体を用いて、陽性シグナルを供するものとして50のク ローンを選択した。Ｈ２は、免疫化に用いられる PNA／DNA 複合体のビオチン化 型である。陽性クローンを培養し、その上清を後述の ELISAシステムで再テスト した。細胞の希釈の制限、その後の ELISAでの上清のスクリーニングにより、ク ローン性を確認した。ハイブリドーマを、10％胎児ウシ血清が補給されたRPMI16 40培地中で標準条件下で増殖させた。 特異性のテスト： 特異的抗体活性の同定は、異なる PNA／核酸複合体で得られた結果に基づいて いる。ストレプトアビジンでコートされたマイクロタ イタープレート（Maxi Sorp，Nunc）を、室温で１時間、 THT中 100ng／mlの濃 度で、ビオチン化 PNA／DNA 複合体と共にインキュベートした。 THTで洗った後 (Denley WeWash 4)、ハイブリドーマからの上清又は10％胎児ウシ血清中のこれ らの希釈液を別個のウェルに加え、そして室温で２時間、標準としてインキュベ ートした。その上清を次の通り：１：２，１：４，１：８，１：16，１：32，１ ：64及び１：128 に２倍希釈した。製造元の説明に従って、 HRP接合ウサギ抗マ ウスIgG(DAKO)及びOPD(ｏ−フェニレンジアミン)(DAKO)で、結合した抗体の検出 を行った。検出反応を、１Ｍの H₂SO₄で10〜15分後に停止させ、そして最後にそ のプレートをOD₄₉₂（Molecular Devices）で読んだ。異なるステップ間の全ての 洗浄は、 THTで行った。特異性をテストするために用いた複合体／化合物は実施 例１に記載される。 テスト結果 その上清を上述のテストシステムでテストした。融合Ｆ86のクローンの２つ（ 1B11及び1G12）からの上清は、表１に示すように PNA／DNA 複合体に有利に結合 することを示した。上清を１：２に希釈した後に得られた 492nmにおける光学密 度が、実施例１に記載されるテスト複合体／化合物を用いて、上清のテストで示 される。（抗体を削除することにより測定した）バックグラウンド値は 0.150未 満であり、表１に供されるOD値から引かれていない（ndは測定しなかったことを 示す）。 表１に示すように、２つのクローンF86 1B11及びF86 1G12からの上清は、種々 の強度であるが、 PNA／DNA 複合体のほとんどと反応した。テストした PNA／DN A 複合体の塩基配列は、実施例１に示すように種々であり、その得られた結果は 、抗体応答が塩基配列に全く依存しないか又は少ししか依存しないことを示した 。一本鎖 PNAもしくは DNA又は二本鎖 DNAもしくは PNA又は PNA／RNA ではほと んど有意な反応は見られなかった。 これにより、本モノクローナル抗体は、 PNA／核酸複合体に高程度の特異性を 有する。本抗体により認識されるエピトープの特異性は、 PNA／核酸複合体の特 定の塩基配列よりむしろ PNA／核酸複合体のコンホメーションにより高い程度、 示されるようである。 その上清のイムノグロブリンのクラスを、Igクラスの決定のための標準的 ELI SAシステムでテストした。両方のクローンからの抗体は、 IgM型のものであるこ とが見い出された。 実施例２に記載される免疫化したマウスからの脾臓細胞と融合パートナーP3− X63 −Ag.8との他の融合から、２つのクローンF88 1C10及び F88 6E5を得た。こ れらのクローンの反応性は、クローンF86 1B11で得られた結果と一致した。これ らのクローンF88 1C10及びF88 6E5も IgM型のものであることが見い出された。 クローンF86 1B11は、1995年３月31日に ECACCに寄託した（寄託番号ECACC 95 053111）。 Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン骨格を含む PNAが、現在の研究に用いられ ているが、これに限定されるべきでない。他の骨格のタイプを有する PNAは、そ の RNAが核酸と安定な複合体を形成することができる限り、同様に用いることが できる。 本願請求項の優先権の基礎であるデンマーク特許出願第 718／95号の開示は引 用により組み込まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＭ，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＵＡ，ＵＺ，Ｖ Ｎ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． PNA(ペプチド核酸)と核酸との間で形成された複合体に結合することがで きることを特徴とするモノクローナル抗体。 ２．一本鎖 PNA、二本鎖核酸、又は一本鎖核酸に結合しないことを特徴とする 請求項１に記載のモノクローナル抗体。 ３． PNAと DNAとの間で形成された複合体に結合するが、 PNA／RNA 複合体、 二本鎖 DNA、 DNA／RNA 、二本鎖、一本鎖 PNA又は一本鎖 DNAには結合しないこ とを特徴とする請求項２に記載のモノクローナル抗体。 ４．その PNAがＮ−（２−アミノエチル）グリシンの骨格を有する PNA／DNA 複合体でホスト動物を免疫化し、該動物からの抗体生産性細胞を、新形成性細胞 と融合してハイブリドーマを形成し、 PNAと DNAとの間で形成された複合体に結 合する抗体を生産するハイブリドーマを選択し、該ハイブリドーマを培養し、そ して必要に応じて前記抗体を精製することにより得られうることを特徴とする請 求項３に記載のモノクローナル抗体。 ５．その PNAがＮ−（２−アミノエチル）グリシンの骨格を有する PNA／RNA 複合体でホスト動物を免疫化し、該動物からの抗体生産性細胞を、新形成性細胞 と融合してハイブリドーマを形成し、 PNAと RNAとの間で形成された複合体に結 合する抗体を生産するハイブリドーマを選択し、該ハイブリドーマを培養し、そ して必要に応じて前記抗体を精製することにより得られうることを特徴とする請 求項２に記載のモノクローナル抗体。 ６．検出可能に標識された形態であることを特徴とする請求項１〜５のいずれ かに記載のモノクローナル抗体。 ７．請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生 することができるハイブリドーマ細胞系。 ８．前記ハイブリドーマ細胞系がECACC 95053111である請求項４に記載のモノ クローナル抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞系。 ９．請求項７又は８に記載のハイブリドーマ細胞系から得られうるモノクロー ナル抗体。 10．サンプル中の検出されるべき特定の核酸配列と該特定の核酸配列と複合体 を形成することができる PNAとの間で形成された PNA／核酸複合体を検出するた めの請求項１〜６又は９のいずれかに記載のモノクローナル抗体の使用。 11．サンプル中の特定の核酸配列を検出するためのキットであって、請求項１ 〜６又は９のいずれかに記載の抗体と、前記検出されるべき核酸配列と複合体を 形成することができる PNA配列と、視覚化システムと、を含むキット。