JPH06506768A - タンパク質―核酸プローブおよびそれを用いたイムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質−核酸プローブおよび それを用いたイムノアッセイ 説明 技術分野 本発明は一般に免疫学および核酸化学の分野に関する。さらに詳細には、本発明 は、イムノアッセイにおける、検出可能なシグナルを増幅する手段としての核酸 ハイブリダイゼーションの利用に関する。

背景技術 核酸ハイブリダイゼーションは現在、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはその他の 物質の異質の混合物中に存在する特定のヌクレオチド配列を検出および定量する ために、遺伝学的研究、生物医学的研究および臨床診断に普通に用いられている 。基本的な核酸ハイブリダイゼーションアッセイでは、一本鎖の分析物の核酸（ ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）は、標識した核酸プローブに直接的または間接 的にハイブリダイズされ、そしてｔ＝ｉを含有する二本鎖が定量される。放射性 および非放射性の４Ｍ　ｍの両方が用いられている。

この基本的なアッセイには感度が不足している。分析物が、少ないコピー数また は薄い濃度で存在するとき、そのシグナルはバックグラウンドノイズとの識別が 不可能である。この基本スキームの変法が、異質の物質からの標的の二本鎖の分 離を促進し、および／または検出を促進する目的で分析物の配列を増幅するため に開発されている。しかし、これらの変法は一般に複雑となるので、手順に時間 がかかり、高いバックグラウンド、低感度のため定量化が困難となる。これらの 変法の一般的な考察については、国際特許公開第８９７０３８９１号を参照のこ と。

イムノアッセイもまた、血液サンプル、細胞抽出物およびその他の物質の異質混 合物中に存在する特定の抗原エピトープを検出および定量するために、遺伝学的 研究、生物医学的研究および臨床診断において普通に用いられている。基本的な イムノアッセイは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかの 抗体と標的の抗原との特異的な結合、およびその反応を検出する手段を含む。こ のような手段は直接イムノアッセイ、間接イムノアッセイおよびサンドイッチイ ムノアッセイを含む様々なアッセイに導入されている。しかしながら、本質的な 抗原／抗体相互作用の検出感度には、核酸ハイブリダイゼーションのところで上 述したのとほぼ同じ問題が存在している。

現在、ラジオイムノアッセイ、イムノペルオキシダーゼ、およびＥＬＩＳＡのよ うな様々な技術が、イムノアッセイに用いられている。しかしながら、ラジオイ ムノアッセイは危険で環境に悪い試薬を必要とするという欠点を有し、イムノペ ルオキシダーゼおよびＥＬＩＳＡはシグナル対ノイズ比が低くシグナル増幅に限 界があるという欠点がある。

本発明の第１の目的は、独特なポリヌクレオチド分子を利用したシグナル増幅方 法を提供することである。この分子は、イムノアッセイに使用するための核酸ハ イブリダイゼーションアッセイにおいて有用であることがわかっている。これら のアンプリファイアブローブは、高度に再現性のあるシグナル増大、高度に再現 性のあるシグナル対ノイズ比を提供し、そしてそれ自身定量できて再現性がある 。そして低濃度で存在する分析物抗原と特異的に結合することが可能であり、さ らに「ユニバーサルな」核酸レポータ一部分ともまた特異的に結合することがで き、安定な複合体を形成する。

同一出願人による、１９８９年９月１９日に特許された米国特許第４，８６８， １０５号は、その開示がここで参考として採用されている。この特許には、液相 ハイブリダイゼーションのサンドイッチアッセイが記載されている。この中で、 分析物核酸は、「ラベリングプローブ」および「キャプチャリングプローブ」に ハイブリダイズされる。このブローブー分析物複合体は、ハイブリダイゼーショ ンにより固体の支持体に結合される。このことにより、分析物オリゴヌクレオチ ドが固相複合体として溶液から除去され、それによって分析物が濃縮され、他の 試薬からのそれの分離が促進され、そしてそれの次の検出が増大される。

同一出願人によるＰＣＴ出願、１９９０年１１月１５日に公開された公開第Ｗ０ ９０／１３６６７号では、２つのドメインを有する直鎖および分枝状のマルチマ ーポリヌクレオチドプローブ、およびこれらのプローブを、核酸ハイブリダイゼ ーションアッセイにおいてシグナルアンブリファイアとして利用する方法をクレ ームしている。このうち、第１のドメインは目的の一本鎖のオリゴヌクレオチド 配列と相補的であり、そして第２のドメインは、一本鎖の標職したオリゴヌクレ オチドと相補的な多数の一本鎖のオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する。

同一出願人による同時係属中のＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ９１１００２１３号で は、３つのドメインを有するポリヌクレオチドプローブ、およびこれらのプロー ブを、核酸ハイブリダイゼーシヲンアッセイにおいて、シグナルアンブリファイ アとして利用する方法をクレームしている。このうち、第１のドメインは目的の 一本鎖のオリゴヌクレオチド配列と相補的であり、第２のドメインはバクテリア ファージのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの酵素活性のためのプロモーターと して作用することが可能であり、そして第３のドメインはポリメラーゼ活性の転 写鋳型として作用することが可能である。

タンパク質／ＤＮＡハイブリッド分子は、核酸ハイブリダイゼーシッンアノセイ においてプローブとして用いられ、ここでそのタンパク質部分はラベリング成分 として作用する（Ｃｚｉｃｈｏｓ、　Ｊ、ら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 、（１９８９）　１７：１５６３；米国特許第４，８７３．１８７号；　米国特 許第４．７３７．４５４号。

タンパク質／ＤＮＡハイブリッド分子はまた、イムノアッセイにおいてもプロー ブとして用いられている。米国特許第４、６９２．　ｓｏ９号には、タンパク質 およびそれに共有結合した放射性オリゴヌクレオチドを含有する放射性標識され たノ＼イブリフドブローブが記載されている。その放射性部分は、生物学的なア ッセイにおいてタンパク質部分の存在を示すために用いられる。Ｅ、Ｐ、Ａ、第 １５４８８４号は、タンパク質／ＤＮＡハイブリッド分子を開示している。この 中でタンパク質部分は標的のタンパク質を特異的に認識し、核酸部分はラベリン グ機能を提供する。

発明の要旨 本発明の１つの局面は、イムノアッセイにおいて検出可能なソゲナルのアンブリ ファイアとして使用するためのポリペプチド／ポリヌクレオチドハイブリッド分 子プローブである。

１つの実施態様において、「ポリメラーゼプローブ」は以下の３つのドメインを 含有する： （ａ）ポリペプチドであり、既知の抗原に対して特異的な抗体として機能する第 １のドメイン（Ａ）；（ｂ）二本鎖のポリデオキシリボヌクレオチドであり、Ｄ ＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの酵素活性のためのプロモーターとして機能し得 る第２のドメイン（Ｂ）；および（Ｃ）一本鎖または二本鎖のいずれかであり、 該第２のドメインに隣接している第３のドメイン（Ｃ）であって、該第２のドメ インのプロモーター活性のための鋳型として機能しドメインＢに隣接している第 ３のドメイン（Ｃ）であって、得るようにされている、ドメイン。

第２の実施態様は、イムノアッセイにおいて検出可能なシグナルのアンブリファ イアとして使用するためのポリペプチド／ポリヌクレオチドハイブリッド分子プ ローブである。この「マルチマープローブ」は以下の２つのドメインを含有する ： （ａ）ポリペプチドであり、既知の抗原と特異的に結合する抗体として機能する ことが可能な第１のドメイン（Ａ）；（ｂ）対象の一本鎖の核酸配列と特異的に 結合し得る、多数の一本鎖のオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する第２の ドメイン（Ｍ）；および （Ｃ）　第１のドメインと第２のドメインを結合させる手段。

本発明の別の局面は、上述のポリメラーゼプローブを使用して、イムノアッセイ における検出可能なシグナルを増幅する方法である。この方法は以下の工程を包 含する：（ａ）抗原分析物を、直接的または間接的に、固体の基質上に固定する 工程； （ｂ）以下のドメインを含有する第１の分子プローブと分析物とを、直接的また は間接的に結合する工程：（＋）結合ドメイン（Ａ）； （ｊ　１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの酵素活性のためのプロモーターと して機能し得る、二本鎖ＤＮＡ配列である、第２のドメイン（Ｂ）；および（１ １１）一本鎖または二本鎖のいずれかであり、（Ｃ）結合していないプローブを 除去する工程；該第２のドメインのプロモーター活性のための鋳型として機能し 得るようにされている、ドメイン；（Ｃ）結合していないプローブを除去する工 程；（ｄ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの活性によって、プローブ構築物の 第３のドメインＣの鋳型配列Ｃ′に相補的なＲＮＡオリゴマーの多数のコピーを 転写する工程；および（ｅ）該転写物を定量する工程。

本発明の別の局面は、上述したようなマルチマープローブの使用により、イムノ アッセイにおいて検出可能なシグナルを増幅するもう１つの方法である。この方 法は以下の工程を包含する： （ａ）分析物を直接的または間接的に固体の基質上に固定する工程； （ｂ）以下のドメインを含有するノ・イブリ、２ド分子プローブに分析物を、直 接的または間接的に結合させる工程：（＋）対象の抗原と特異的に結合する抗体 として機能し得るポリペプチドである、結合ドメイン（Ａ）；および（ｉ　ｆ） 一本鎖の標識されたオリゴヌクレオチドと特異的に結合する工程が可能である、 多数の一本鎖のＤＮＡオリゴヌクレオチドサブユニ／トを含有する第２のドメイ ン（Ｍ）；および （ｉ　Ｉ　１）第１のドメインと第２のドメインを結合させる手段； （ｄ）　ドメイン間プローブのサブユニット配列と実質的に相補的なヌクレオチ ド配列を含有する、−不備標識オリゴヌクレオチドを、第２のドメインのサブユ ニットにハイブリダイズさせる工程； （ｅ）結合していない標識オリゴヌクレオチドを除去する工程；そして （ｆ）該プローブと結合している標識オリゴヌクレオチドの量を定量する工程。

さらにもう１つの実施態様は、競合イムノアッセイにおいて、検出可能なシグナ ルを増幅する方法であり、この方法は以下の工程を包含する： （ａ）ハイブリッド分子を構築する工程であって、この分子中でドメインＡはハ ブテンとして機能することが可能なポリペプチドであり、このドメインは、ポリ メラーゼプローブのＢ／ＣドメインまたはマルチマープローブのＭドメインのい ずれかと結合している、工程； （ｂ）競合する分析物の存在下において、ハイブリッド分子を直接的または間接 的に固体の基質上に固定化する工程；（Ｃ）結合していないプローブを除去する 工程；および（ｄ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性によって、ＲＮＡオリ ゴマーの多数のコピーを転写する工程、およびこの転写物を定量する工程、（こ れは、ポリメラーゼプローブが使用される場合）；または （ｅ）　一本ｔａの標識オリゴヌクレオチドをＭドメインのサブユニットにハイ ブリダイズさせる工程、結合していない標識を除去する工程、および結合してい る標識を定量する工程（これは、マルチマープローブが使用される場合）。

発明の詳細な説明 定義 「検出可能なシグナル」は、核酸ハイブリダイゼーションまたは抗原と抗体の結 合のような、生化学的な事象の発生を示す伝達できる徴候である。本出願では、 イムノアッセイの検出可能なシグナルをアンブリファイアする方法を記載する。

ｒＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」は、相補的なりＮＡ鋳盟から、特定の配列 のＲＮＡの重合を促進する酵素である。

「ドメイン」は、その機能によって特徴づけられた生化学的な分子の特定の領域 である。

「エピトープ」は、免疫原性のある分子のなかの部分であって、免疫学的反応に おいてその対応する抗体により特異的に認識され、そして、その抗体と複合体を 形成する部分である。

ヌクレオチド／ペプチドの「ハイブリッド」分子は、核酸残基とアミノ酸残基の 両方を含有し、それぞれの残基が分子の別々の機能ドメインに存在する分子であ る。

「免疫原」は、特異的に抗体と反応し得る基質である。

「免疫学的反応」は、抗体の、免疫原のエピトープへの特異的なｆＪ！　ｔＪｔ と結合である。「イムノアッセイ」は、免疫学的反応を、その反応を検出および 定量する方法と組み合わせることによって、エピトープの存在を決定する方法で ある。

「ポリデオキシリボヌクレオチド」は、ポリマーのＤＮＡ分子である。「ポリヌ クレオチド」は、ポリマーのＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。

「プロモーター」は、転写を開始するに先だって、ＲＮＡポリメラーゼ酵素が結 合する、ポリデオキシリボヌクレオチドの部位である。

ｒＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」は、相補的なＲＮＡ鋳型から、特定の配列 のＲＮＡの重合を容易にする酵素である。

「転写」は、その働きによりＲＮＡが相補的なボリヌクレオチド鋳型から生成さ れるような酵素によって媒介されるプロセスである。

二本鎖のＤＮＡ分子の［上側の鎖（ｕｐｐｅｒ　５ｔｒａｎｄ）　Ｊは・配列が 左から右へ読まれる場合、５′末端が左側である鎖のことである。この鎖の配列 は、常にそれと相補的な「下側の鎖（ｌｏｖｅｒ　５ｔｒａｎｄ）　Ｊ　（これ は左から右へ、３′　−から５′−へと読まれる）の上に存在する。

Ｂを　るための≦ ■−アンプリファイアブローブ Ａ−ポリメラーゼプローブ 本発明の１つの局面は、３つの機能的なドメインを含有するＤＮＡアンプリファ イアブローブ（「ポリメラーゼプローブ」と呼ぶ）である。このプローブは、イ ムノアッセイにおいて検出可能なシグナルを増大させるために用いられる。

第１のドメイン（図ＩＡのＡ）は、選択された抗原に対して特異性を有する抗体 として機能するポリペプチドである。

そのポリペプチドの機能領域の次には、アミノ酸または核酸残基のいずれかの領 域が続く。この領域はすなわち、スペーサー領域であり、これは実質的に抗体の 活性を妨害しな％ｓ。

その抗体活性は、分析物自身のエピトープに対して特異的であり得る；しかしな がら、好適な実施態様にお０ては、抗体は、以下のアッセイにおいて用いられる 特定のイムノグロビンの抗原決定基に対応している（例えば、抗うビｙ）ＩｇＧ 、または抗ヒトＩｇＧ−図２Ａ参照のこと）。実施されて（するＲｉｏｌ、　（ １９８３）１６８二４７？）−相補鎖トのプロモーターの３′末ように、分析物 は特異的な抗体と接触し、過剰の抗体は除去されて、次にアンプリファイアブロ ーブが結合している抗体と反応する。

好ましくは、次の洗浄操作を容易にするために、最初に分析物は固体の基質上に 固定化される。この固定化は直接（例えば、分析物を含有する生物の調製物はニ トロセルロースフィルターに結合され得る）、または間接（例えば、特異的な抗 体が固体の基質上に固定され、次にその分析物がその固定した抗体と結合され得 る）であり得る。

第２のドメイン（図ＩＡのＢ）は、通常長さがｌＯ側から４０個の塩基対であり 、好ましくは２０個から３５個の塩基対であり、さらに好ましくは３０個から３ ５個の塩基対である。そして二本鎖であり、ＤＮＡ配向のＲＮＡポリメラーゼプ ロモーターとして機能する。このプロモーターは、通常バクテリアファージのプ ロモーター配列に由来し、好ましくはファージＴ３．Ｔ７、またはＳＦ３のどれ かに由来し、さらに好ましくはバクテリアファージＴ７に由来している。このク ラスのＲＮＡポリメラーゼは、高いプロモーター特異性がある。おそら＜７７プ ロモーターは最もよく特徴が明らかにされている（図１８）。１７個のＴ７プロ モーター由来のＤＮＡ配列が既知であり、フンセンサス配列が推定されている： 　５’　−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ−３′　（ＳＥＱ　Ｉ　Ｄ　Ｎ ｏ　：　２）　（Ｏａｋｌｅｙ　ａｎｄ　Ｃｏｌｅｍａｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　（１９７７）　７４：４２６６；　Ｄｕｎｎ　ａｎｄ　 ５ｔｕｄｉｅｒ、　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ。

よび量のレポーター分子として機能する（図３）。シグナル増幅が起こるのは、 それぞれの鋳型が１０′から１０４の転写物を生成するからである。このドメイ ンの配列はランダムな配列で設計されていて、その系の他のプローブとの交差反 応の可能性を最少にするためにコンピューター分析で評価される。

Ｃドメインの配列は特定の検出スキームのために設計され、そのようなスキーム のいくつかは転写物を定量するために使用され得る。例えば、Ｃドメインの転写 生成物（Ｃ）は、２つのサブドメイン、すなわちＣ７およびＣ２にさらに分割さ れ得る（図３）。サブドメインＣ１は、固体の基質上に固定されている転写キャ プチャープローブと相補的である。サブドメインＣ２はラベリングプローブと相 補的である。／＼イブリダイゼーション後、保持している標識の量は、最初のサ ンプル中に存在する分析物の量に直線的に比例する。

他の実施態様においては、Ｃドメインの転写物はＣ，サブドメインのみを有する 。Ｃドメインは標識された三リン酸リボヌクレオチドの存在下で転写され、次に その標識された転写物は、その相補的なＣ，サブドメインを介して、固定された 転写キャプチャープローブと結合されて定量される。

さらにもう１つの実施態様においては、Ｃドメインの転写物はＣ２サブドメイン のみを有する。Ｃドメインはビオチン化された三リン酸リボヌクレオシドの存在 下で転写され、その転写物はアビジンビーズで捕捉される。次にその転写物は、 その相補的なｃ２サブドメインを介して、ラベリングプローブとアニールされて 定量される。

増幅するプローブの転写物を標識して検出する、いくつかの他の方法が可能であ り、標識リボヌクレオチドとアビジン／ビオチン結合の併用が含まれ、それは当 業者には自明である。

ポリメラーゼプローブのＢおよびＣドメインは、クローニング、酵素的構築、化 学的架橋技術、直接的化学合成またはそれらの組み合わせによってＭ！ｉ！され 得る。クローニングによって調製される場合、Ｂ／Ｃドメイン全体またはそのフ ラグメントをコードする核酸配列は、従来のクロー二／グ操作によって一本鎖ま たは二本鎖の形にされ得る。

Ｂドメインは二本鎖であり、Ｃドメインは一本鎖または二本鎖のいずれかであり 得る。二本鎖のドメインは２つの方法で生成され得る：鎖が別々にクローン化さ れ、次にその相補的な鎖がハイブリダイズされる；または代わりに、そのプロー ブは一本鎖の自己アニーリングするポリヌクレオチド（例λば、ｂ’ｃ’ｃｂ） としてクローン化される。この場合は、４個から１０個の付加ヌクレオチド、好 ましくは５個から７個のヌクレオチドをＣとＣ′の間にスペーサーとして配列に 加えると、それが自己アニールして二本鎖の適当な外形が現れる。スペーサーは 、通常ポリＡであるが、アツセイ中の様々なプローブ間のハイブリダイゼ一シヨ ン交差反応性を最少にするために、改変され得る。

核酸、アミノ酸、炭水化物またはポリオールブリフジのような間に入る結合物を 介して、または他の架橋剤を介して、ＡドメインはＢ／Ｃドメインと結合され得 る。Ｂ／Ｃドメインは、Ａドメインへ結合する部位を提供する官能基を有するよ うに誘導された５′−核酸残基とともに合成され得る。あるいはそのような残基 は、オリゴヌクレオチドが合成された後にそのような部位を提供するように誘導 され得る。化学的架橋の好ましい操作は、同一出願人によるＥ、Ｐ、Ａ、公開第 ０２２５８０７号に記載されているように、ポリヌクレオチドの５′末端に、Ｎ ４改変シトシンを組み入れることである。

さらに好ましい実施態様においては、Ｂ／ＣドメインＤＮＡとＡドメイン抗体と の結合は、酵素結合方法と同様の方法で行われ得る。Ｂ／Ｃドメインは、アルキ ルアミン部分を含有するように合成される。そのアルキルアミンは、スクシンイ ミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭ ＣＣ）のようなヘテロニ官能性架橋剤と反応される。カラム精製後、ＤＮＡは特 異的にスルフヒドリル官能基と反応され得る。抗体は反応性のあるスルフヒドリ ル（還元されたＦ（ａｂ’）２中などに）を含有し、またはスルフヒドリル（Ｎ −スクシンイミジル　３−　（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ ）で修飾されて還元されたときのような）を含有するように修飾され得る。ＤＮ Ａ−アミンと抗体−アミンの直接の結合もまた、ホモ三官能性試薬によって可能 であるが、典型的には、制御するのがより難しい。

Ｂ−マルチマープローブ 本発明のもう１つの実施態様は、２つの機能性ドメインを含有するＤＮＡアンプ リファイアブローブ（「マルチマープローブ」と呼ぶ）であり、第１のドメイン Ａは上述のポリメラーゼプローブのドメインＡと同じであり、第２のドメイン（ 図ＩＤのＭ）はいくつかの繰り返しのサブユニットを含有する。上述のポリメラ ーゼプローブのようにこのプローブもまた、イムノア、セイにおけるシグナル増 幅に用いられる。

Ｍドメインのポリヌクレオチドは、同じ繰り返しの一不備オリゴヌクレオチドサ ブユニット、または異なる一不備オリゴヌクレオチドサブユニットの、直鎖また は分枝のポリマーであり得る。これらのサブユニットは、目的の一本鎖のヌクレ オチド、典型的には標識されたオリゴヌクレオチド、またはほかのマルチマーに 特異的または安定にハイブリダイズすることが可能である。これらのユニットは 、通常長さが１５個から５０個のヌクレオチドであり、好ましくは１５個から３ ０個であり、そして４０％から６０％の範囲のＧＣ含量を有する。そのマルチマ ー中のオリゴヌクレオチドユニットの総数は、通常３個から５０個の範囲であり 、さらに通常は１０個から２０個の範囲である。そのマルチマーのオリゴヌクレ オチドユニットは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、改変されたヌクレオチドまたはその組み合 わせから構成され得る。

そのマルチマーのオリゴヌクレオチドサブユニットは、リン酸ジエステル結合を 介して、あるいは核酸、アミノ酸、炭水化物またはポリオールブリッジのような 間にはさまれた結合物質を介して、あるいは核酸または修飾された核酸鎖を架橋 することが可能である他の架橋剤を介して、互いに直接に共有結合され得る。結 合の部位（単数または複数）は、サブユニット（通常の３’　−５’　の方向ま たはランダムな方向の）の末端、および／または鎖の１つ以上の内部のヌクレオ チドであり得る。

直鎖のマルチマーでは、個々のサブユニットは末端と末端とが結合されて直鎖状 のポリマーが生成される。１つの型の分枝状のマルチマーでは、３つ以上のオリ ゴヌクレオチドがオリジンの点から発して分枝構造を生成する。そのオリジンの 点は、別のオリゴヌクレオチドサブユニット、または少なくとも３つのユニ、） が共有結合され得る多官能性分子であり得る。別の型には、１つ以上のペンダン ト（ｐｅｎｄａｎｔ）オリゴヌクレオチドサブユニットを有するオリゴヌクレオ チドサブユニットバソクボーンがある。これらの後者の型のマルチマーには、構 造が「フォーク状（ｆｏｒｋ−１ｉｋｅ）　Ｊ、「櫛状（Ｃｏｍｂ−１ｉｋｅ） 　Ｊまたは「フォーク状」と「櫛状」との組み合わせのものがある。このペンダ ントユニットは通常、改変されたヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドが結 合され得るあるいは付着され得る、適当な官能基を有する他の有機部分に依存す る。図ＩＤを膠原のこと。

そのマルチマーは全体が直鎖状か、全体が分枝状か、または直鎖部分と分枝部分 の組み合わせであり得る。好ましくはマルチマー中に少なくとも２個の分枝点が あり、さらに好ましくは少なくとも１５個あり、好ましくは１５個から５０個あ る。そのマルチマーは二本鎖の配列の１つ以上のセグメントを含有し得る。

ドメインＭは、クローニング（もし直鎖状ならば）、酵素的構築、化学的架橋技 術、直接的化学合成またはそれらの組み合わせによって調製され得る。これらの 合成方法は、１９８９年５月５日に公開された、同一出願人による国際特許出願 、公開第８９１０３８９１号にすべて開示されている。クローニングによって： Ａ製される直鎖状のマルチマーの場合、マルチマー全体またはそのフラグメント をフードする核酸配列は、従来のクローニング操作によって一本鎖または二本鎖 の形にされ得る。二本鎖の形にされる場合、最終的にはマルチマー／フラグメン トは変性されて一本鎖のマルチマー／フラグメントが提供される。マルチマーは 、Ｍ１３のような従来の一本鎖のファージベクターを用いて、−不備の形でクロ ーン化され得る。フラグメントは酵素的または化学的に結合されてドメイン間マ ルチマーが生成され得る。酵素的に構築される場合、個々のユニットは、場合に より、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼのようなりガーゼで連結され る。化学的架橋によって調製される場合、個々のユニットは、結合部位を提供す る官能基を有するように誘導された１つ以上の核酸とともに合成され得る。ある いはオリゴヌクレオチドが合成された後にそのような部位を提供するように誘導 される。化学的架橋の好ましい操作は、同一出願人によるＥ、Ｐ、Ａ。

第２２５８０７号に記載されているように（この開示は参考としてここに採用さ れている）、Ｎ′改変シトシン塩基をヌクレオチドに取り込むことである。

直接化学合成によってｇ製される場合、誘導された核酸、または、その官能基が ブロックされている当価の多官能性分子を含有するオリゴヌクレオチドは、従来 のオリゴヌクレオチド合成技術によって生成される。その官能基のブロックがは ずされ、そしてオリゴヌクレオチドユニットはブロックされていない部位（単数 または複数）から合成される。

マルチマー中の分枝点を発生させるときに用いられる分子の一般的構造は以下に 示す通りである：ここで、Ｒは有機部分であり、好ましくは核酸であり、Ｒ１は 、固相から合成した核酸を除去せずかつ環外の窒素またはリン酸保護基を除去し ない条件下において、除去され得るヒドロキシル保護基であり、Ｘは、保護され たホスホルアミダイト、ホスホネートまたはリン酸基のような、核酸合成を容易 にするリン含有基であり、Ｙは、アミン、ヒドロキシル、スルフヒドリルまたは 保護されたリン酸のような核基から誘導されるラジカルであり、モしてＲ２は、 Ｒ１、またはＲ１に影響することなく除去されそして水素に置換される、ブロッ キング基もしくは保護基である。二叉の分枝または「フォーク状」の分枝を発生 させるのに用いられる分子において、Ｒ１とＲ２は同じである一一方、「櫛状」 の分枝を発生させるのに用いられる分子においては、Ｒ２は、Ｒ１脱ブロッキン グ試薬の存在下で安定なブロッキング基である。図４は、「櫛状」の分枝、「フ ォーク状」の分枝、またはその組み合わせを有するマルチマーを合成する際に用 いられる操作を図式的に説明している。

図４のバートＡは、自動化ホスホルアミダイト法（Ｗａｒｎｅｒら、ＤＮＡ　（ １９８４）　ｉ：４０１）のような、直鎖状のオリゴヌクレオチドを調製するた めの従来のオリゴヌクレオチド合成スキームを示している。黒いブロックは、固 体の支持体を示し、Ｎはヌクレオチドを表し、そしてｐ−Ｎ−ＯＲ＋　（Ｒ＋は 下記のＲ１に対応する）は、適当な保護基を有する従来のヌクレオチド誘導体を 示している。

バートＢは、櫛状のマルチマーを製造する手順を示している。

は、下記の構造式（２）の改変された塩基を示している。所望のサイズおよび配 列を有するオリゴマーユニットは、支持体上で合成され、そこに残される。次に １個以上のＮ４改変シト７ン塩基が上記自動化手順によって鎖にとり込まれる。

好ましくは、改変塩基は次のような構造式を有する。

ここでｚは−０−１−ＮＨ−、−５−１Ｐ０４：、および　Ｏのような０Ｃ−Ｏ − 求核基、Ｒ１は一般に塩基に安定性で酸に感受性の、ジメトキシトリチル（ＤＭ Ｔ）あるいはピキンルのような阻止あるいは保護基、Ｒ２は水素あるいはメチル 、Ｒ３はのような、Ｒ１に影響を及ぼすことなく取り除がれ水素に置換される、 阻止あるいは保護基、Ｒ５は、化学合成中にオリゴヌクレオチド鎖の５゛位置へ のヌクレオチド付加を可能にする、ホスホルアミダイトあるいはリン誘導体く例 えば、リン酸ジエステル、リン酸トリエステルなど）、Ｒ６は、メチル、水素、 １、Ｂ「、あるいはＦｌ　そしてＸは、１から８の範囲の（１と８とを含む）整 数である。１個より多い改変塩基が組み込まれるとき、好ましくは鎖の介在塩基 によって、最も好ましくは−ＴＴ−二量体によって一定の間隔があけられる。付 加的なヌクレオチドユニットは、付加的な改変塩基等に続いて、骨格に組み込ま れる。

次に請求核基を脱保護しくＲ３を取り除＜）、自動化手順によってそこから付加 的なオリゴヌクレオチドユニットを生成する。鎖の末端の残基Ｒ１基を取り除き 、分枝した「櫛状の」マルチマーを支持体から切り離す。

図４のパートＣは、「フォーク状の」マルチマーを製造スる　゛一般的な手順を 示している。再び、所望のサイズと配列のオリゴマーユニットを従来法で合成し 、支持体上に残す。次に、ブロッキングホスホルアミダイトのようなブロッキン グされた二官能性のリン含有基（パートｃでＸＰと表示）を自動化手順によって 、鎖に組み込む。好ましい二官能性リン含有基は、下記の構造式で示される、阻 止されたホスホルアミダイト；ここでＲは該ヒドロキシル保護基、ｉＰｒはイソ プロピル、およびＲ１はメチルあるいはβ−ンアノエチル；である。最も好まし くは、ＲはＤＭＴであり、そしてＲ１はβ−シアノエチルである。

あるいは％　Ｒ”Ｒ２であるＮ４改変シトシン塩基（例えばＤＭＴ）を使用し得 る。

次に２つの保護基を取り除き、目動化手順によりそこから付加的なオリゴヌクレ オチドユニットを得る。残基Ｒ１基を取り除き分枝状のマルチマーを支持体から 切り離す。

パートＤおよびＥは、２回以上二またに分かれたマルチマー、「櫛状の」マルチ マー、あるいはそれらの組み合わせのマルチマーを酵素的にあるいは化学的につ なぎ合わせる手順を示している。一般的に、分枝状の、および／あるいは「櫛状 の」マルチマーは上述のように調製され、そして支持体から取り除かれる。次に 上述のように酵素的なあるいは化学的な結合手順を用いて、溶液中でつなぎ合わ せる。

パートＦは、複数の「１ｌｉｉＩ状の」マルチマーを合成する手順を示している 。この手順はパートＢで示した手順の変法であり、ぶら下がった側鎖での改変塩 基の組み込みに関与し、そこから第２のオリゴヌクレオチド側鎖を生しる。

適切な切断可能なリンカ−分子をマルチマーの構造を分析する目的で、あるいは 所定のセグメント（標識オリゴヌクレオチドに結合するマルチマーの部分）を放 出するための手段として、マルチマーの所定の部位に組み込み得る。マルチマー 合成と精製に続いて、これらのリンカ−はマルチマーのヌクレオチド構造の付随 的な分解を伴わずに特異的に切断され得る。好ましい型のリンカ−分子は、該リ ンカ−が標準的なホスホルアミダイト化学プロトコールによって、任意のＤＮＡ フラグメントに組み込まれ得るために、保護されたヒドロキシル基およびホスホ ルアミダイトから誘導されたヒドロキシル基、ならびに、１．２−ジオール基（ 過ヨウ化物によって選択的に切断され得る）を含有するように設計する。このよ うなリンカ−の好ましい実施態様は、下記の化合物である：ここでＤＭＴおよび ｉＰｒは前述のように定義される。ＤＮＡフラグメントに組み込まれ、完全に脱 保護した後、リンカ−含有フラグメントは次のような構造を有する： ここでＤＮＡ、およびＤＮＡ２はＤＮＡサブフラグメントを表しており、同じで も異ってもよい。このフラグメントを過ヨウ素酸ナトリウムと反応させると、次 のようなサブフラグメントに切断さ・れる。

（以下余白） あるいは、１．２−ジオール基は、ヒドロキシルアミン感受性結合、塩基感受性 スルポン結合、あるいはチオール感受性ジスルフィド結合を含むリンカ−グルー プで置換され得る。このようなリンカ−グループは、タンパク質を他の物質に結 合させるために用いられる従来の架橋剤から誘導され得る。同様にＤＭＴ以外の 保護基が使用され得る。

ポリメラーゼプローブの機能的な局面は、ポリメラーゼプローブの多数のプロモ ーター／テンプレート（Ｂ／Ｃ）　ドメインを含むサブユニットを用いて、Ｍド メインを有するマルチマープローブを合成することによって、マルチマープロー ブ構造と結合され得る。マルチマープローブのように、多数のサブユニットは直 鎖状でも分枝した分子でもよい。

ポリメラーゼプローブのように、マルチマープローブのＡドメインは、核酸、ア ミノ酸、炭水化物、あるいはポリオール架橋のような介入される架橋剤、あるい は他の架橋剤を介してＭドメインに結合され得る。Ｍドメインは、Ａドメインに 対する結合部位を供する官能基を有するように誘導体化された、５゛核酸残基を 用いて合成し得るし、あるいはこのような部位を供するようにオリゴヌクレオチ ドを合成した後で、該残基を誘導体化し得る。化学的な架橋の好ましい手順は、 同一出願人によるＥ、Ｐ、Ａ公開番号０２２５８０？および前記セクンゴン！（ Ａ）に記載のように、Ｎ′改変シトシン塩基をポリヌクレオチドの５°末端に挿 入する方法である。

１１−イムノアッセイ 本発明の別の局面では、免疫学的な分析物の存在および濃度を検出および定量す るためのイムノアッセイに、アンプソファイアプローブを使用する。このアンプ リファイアブローブは２つのクラスからなる：前記セクションＩに記載のハイブ リッドプローブ（ポリメラーゼプローブあるいはマルチマープローブ）、あるい は米国出願番号４６３．０２２および米国出願番号３４０．０３１に記載のポリ ヌクレオチドプローブである。これらのプローブはハイブリッドプローブに類似 しているが、ポリペプチドでなくポリヌクレオチド配列を含むＡドメインを有す る。

分析物は、既知のあらゆる重要な免疫原であり得る。分析物は調製した試料に低 濃度で存在し得、あるいは生物学的物質の不均一な混合物中の小数種であり得る 。分析物は、例えば生物学的流動体あるいは組織、食物、環境物質等のさまざま な種に存在し得、あるいはインビトロで合成し得る。

最初の工程で、当業者に既知の種々の方法の何れかによって分析物を含む試料を 調製する。

アンプリファイアブローブを、溶液中あるいは固相に固定して行う多くのイムノ アッセイプロトコールにおいて、分析物を検出するために使用することができる 。もしイムノアッセイを溶液中で行うならば、分析物を含む試料は、アンプリフ ァイアブローブに直接的に結合されるか、分析物に対して特異的な１個以上の抗 原によって間接的に結合されるかし、あるいは、もしポリヌクレオチドプローブ を使用するならば、ハイブリノドリンカ−分子（後出のセクションＩＩ（Ｂ）で 述べる）との結合において、結合される。アンプソファイアプローブは、この方 法でほとんどの可溶性のイムノアッセイプロトコールに利用し得る。例えば米国 特許番号４．７７８．７５１を参照。

固相を利用するイムノアッセイにおいては、分析物（抗原でも抗体でも有り得る ）は固相に直接的に固定されるか、最初に固相に結合された第１抗原に分析物が 結合することにより間接的に固定化されるか、あるいは第２抗原が分析物を認識 し、次に分析物が固相に結合された第１抗原によって認識されるサンドイッチア ッセイ（図２Ａ）によって固定化される。

もし分析物が直接的に固相に結合されるのなら、分析物を含むｇＬ４はニトロセ ルロースフィルターあるいは非特異的に結合するタンパク質に対する類似の手段 に接触される。もし分析物が間接的にかつ選択的に固相に結合されるのなら、分 析物のエピトープあるいは第２抗原に対する第１抗原は固相に結合され、続いて 分析物あるいは分析物に結合した第２抗原に結合するのに使用される。

Ａ−ハイブリッドプローブの使用 次に、分析物とアンプリファイアブローブとの間のリンカ−として、分析物の第 ２のエピトープに特異的な他の抗体を使用し得る。次に、ポリメラーゼプローブ あるいはマルチマープローブの何れかであり、そのＡドメインが第２抗原に特異 的であるアンプリファイアブローブをリンカ−抗体に結合し得、固相に結合され た第１抗体、第２抗体、分析物、リンカ−抗体、およびアンプリファイアブロー ブからなる一連のもの（ストリング）を形成する（図２Ａ）。

Ｂ−ポリヌクレオチドプローブの使用 地の実施態様においては、使用するアンプリファイアブローブハ、国際公開番号 ８９１０３８９１に記載のポリヌクレオチドマルチマープローブの一種である。

このプローブは、本出願のペプチド／ヌクレオチドハイブリッドマルチマープロ ーブとは、そのドメインＡが、抗体として機能するポリペプチドでなくポリヌク レオチド配列である点で異なっている。続いて、抗体／ポリヌクレオチドハイブ リッドリンカ−を、分析物のアンプリファイアブローブへの間接的な結合に使用 する（図２Ｂ）。このハイブリッドリンカ−は、分析物のエピトープあるいは分 析物を認識する抗体のエピトープに対する、特異的な抗体として機能するポリペ プチドである第１のドメイン、およびアンプリファイアブローブのＡドメインの ヌクレオチド配列に対して実質的に相補的であるヌクレオチド配列である第２の ドメインを有する。

同様に他の実施態様においては、米国出願番号４６３．０２２に記載のポリヌク レオチドポリメラーゼプローブの１つを使用し得る。これらのプローブは、本出 願のプローブとは、そのドメインＡが抗体として機能するポリペプチドでなくポ リヌクレオチド配列である点で異なっている。これらのプローブも上述のハイブ リッドリンカ−を使用することが必要である。

ポリヌクレオチドアンプリファイアブローブ、および上述のセクションＩに記載 のハイブリッドアンプリファイアブローブでな（ハイブリッドリンカ−を使用す ることによって、アンプソファイアプローブは、核酸ハイブリダイゼーシコンア ッセイおよびイム／アッセイの両方に有用な「普遍的な」試薬になり得る。

Ｃ−結合およびハイブリダイゼーションの条件好ましい実施態様においては、分 析物は、例えば９６ウエル′　のポリビニルクロリド（ＰＶＣ）プレートのよう な固相に間接的に固定される。図２Ａに示したサンドイッチアッセイにおいては 、ｓｏμｌの第１抗体（０，２Ｍ　Ｎａ）ＩＣＯ３中２０Ｍｇ／ｍｌの濃度の抗 ウサギ抗体）をウェルに加える。ウェルをおおい、加湿下室温で２時間インキュ ベートする。次に溶液をウェルから吸引する。

次にウェルを、０．０２％のアジ化ナトリウムを含むリン酸ａ衝化生理食塩水中 に３％のウシ血清アルブミンを含有するブロノ牛ングバッファーで２回洗浄する 。次に、ウェルを加湿下室温で２０分間ブロッキングバッファーとともにインキ ュベートし、そしてブロッキングバッファーでもう２回洗浄する。

５０μｌの第２抗体（これも２０Ｍｇ／ｍｌの濃度のウサギ抗分析物）をウェル に加え、上述の処置を繰り返す。分析物中のブロッキングバッファー中の次の希 釈系列を調製する。各希釈液の５０μｌをウェルに加える。プレートをおおい、 加湿下室温で２時間インキュベートする。インキュベーションに続いて、ウェル をブロッキングバッファーで４回洗浄する。次に第３抗体（マウス抗分析物）を 同様の様式で加え、続いてハイブリッドアンブリファイアプローブを加える。時 々、組織調製物が抗ＤＮＡ抗体を含んでいることがあるので、プローブの添加に 続いて行われる洗浄に使用するブロッキングバッファーにも、２０Ｍｇ／ｍ　ｌ のサケ精子ＤＮＡを含ませる。

ポリヌクレオチドアンブリファイアプローブあるいはハイブリッドマルチマープ ローブを使用する際は、分析物と抗体との複合化に続いて、核酸ハイブリダイゼ ーション工程を行う。通常ハイブリダイゼーションン条件は、種々の添加物を含 む水性媒体、特に緩衝化水性媒体でなる。これらの添加物には、ハイブリダイズ させるポリヌクレオチド、塩（例えば、０．０１７Ｍから０．１７Ｍのクエン酸 ナトリウムおよび／または０．１７Ｍから１．７Ｍの塩化ナトリウム）　、ＮＰ −４０あるいはトリトンＸ−１００（０，１から１．０％）のような抗原／抗体 の複合を妨げない非イオン性界面活性剤、およびキャリア核酸が含まれる。混合 物を３５℃から５５℃で１５から７５分間インキュベートする。

もし標識オリゴヌクレオチドの多量体サブユニットに対するハイブリダイゼーシ ョンの条件が、抗原／抗体複合体の不安定化を誘引するのなら、複合体をグルタ ルアルディトのようなタンパク質架橋剤で処理するか、あるいは複合体を安定化 させる類似の方法をハイブリダイゼーション工程に先だって行う。一旦タンパク 質複合体を安定化すると、核酸ハイブリダイゼーシコン条件を、５ＤＳ（１％ま で）、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルフオキシド、およびホルムアミドの ような非水性溶媒を含むように変更し得、温度を７０°Ｃまで上げられる。

抗原／′抗体複合体の安定性を維持するように核酸ハイブリダイゼーンコンの条 件を調節することが重要である。例えば、相補配列のより短い一区切りのノ＼イ プリダイゼーンヨンは、より低い温度で行われる。好ましい実施態様においては 、相補的な一本鎖の領域は１２から２０塩基である。好ましい実施態様において は、ハイブリダイゼーション温度は、３５から４５℃である。さらに、この工程 で存在する唯一の一本鎖オリゴヌクレオチドは相補鎖であるから、より高い緊縮 性とその結果としての低い塩濃度（ＯＪＭ　Ｎａ　）が許容される。

１−マルチマープローブ もしマルチマープローブを使用するのなら、続いて、Ｍドメインの繰り返し、ポ リヌクレオチドに実質的に相補的な標識オリゴヌクレオチドを、相補的な多量体 のオリゴヌクレオチドユニットとのハイブリダイズを可能にする条件下で加える 。

次に得られる固相標識核酸複合体を、結合していない標識オリゴヌクレオチドを 取り除くための洗浄によって、余剰の標識オリゴヌクレオチドから分離して測定 する。

増幅は、アッセイにおいてｌｆｉより多い多量体（サブユニット配列で定義され る）を用いることにより増やし得る。このような例では、第２の多量体は第１の 多量体の繰り返し配列に結合するよう設計され、次にその複合体は、第２の多量 体の繰り返し配列に実質的に相補的なオリゴヌクレオチドで標識される。多数の 多量体がこの方式によって、この列に結合し得、より多く増幅できる。

２−ポリメラーゼプローブ もしポリメラーゼプローブを使用するのなら、続いて、アンプリファイアブロー ブのプロモーター領域（ドメインＢ）に特異的なＲＮＡポリメラーゼを適切な転 写条件下で加え、Ｃドメインテンプレート（ｃ’）の多数のＲＮＡコピー（Ｃ） を生産する。

転写物の量は、開始の調製での分析物の量に比例する。

転写条件は、水性媒体、好ましくは通常はマグネシウム塩を含む適当な塩、ｒＡ ＴＰ、　ｒＵＴＰ、　ｒＧＴＰ、　ｒＣＴＰ、　ＲＮＡポリメラーゼ酵素を含む 緩衝化水性媒体で、通常は種々の変性剤、タンパク質キャリア、およびＲＮアー ゼ阻害剤からなる。インキュベーションは通常は１５から９０分、通常は６０分 であり、選択した酵素に最適の温度で、通常は３５℃から４２°Ｃ５通常は３７ °Ｃで行う。

Ｃドメインの配列を特異的な検出スキームのために設計し、それらのスキームの 数種を転写物の定量に使用する。例えばＣドメインの転写産物（ｅ）は、２つの サブドメイン−０１およびＣ２（図２Ｂ）に再分割し得る。サブドメインＣ１は 、固相に固定化された転写キャプチャープローブに相補的である。サブドメイン Ｃ２はラベリングプローブに相補的である。ハイブリダイゼーシ璽ンの後に残存 する標識の量は、元の試料に存在する分析物の量に直線的に比例する。

他の実施態様においては、Ｃドメインの転写物はＣ，サブドメインのみを有する 。Ｃドメインを標識リボヌクレオチド三リン酸の存在化で転写し、次に標識転写 物を固定化転写キャプチャープローブに、相補的なＣ１サブドメインを介して結 合させて定量する。

しかしながら他の実施態様においては、Ｃドメインの転写物はＣ２す７ドメイン のみを有する。Ｃドメインをビオチン化すボヌクレオシド三リン酸の存在下で転 写し、次に転写物をアビジンビーズ上に捕獲する。次に転写物を、その相補的な Ｃ２サブドメインを介してラベリングプローブにアニールして定量する。

アンブリファイングプローブの転写物を標識し検出するいくつかの他の方法が使 用し得、この方法には、標識リボヌクレオチドとアビジン／ビオチンカップリン グを同時に使用する方法が含まれ、これらは当業者に公知である。

３−一般的な考察 アッセイに使用する固相は粒子でもあり得るし、例えば遠心分離用のチューブ、 カラム、マイクロタイタープレートウェル、フィルター、チューブなどのような 種々の容器の固体壁表面でもあり得る。好ましくは約０．４から２００ミクロン の範囲の大きさの粒子が使用され、さらに通常は約０．８から４６０ミクロンで ある。粒子は、ラテックス、ガラスのような従来のあらゆる物質であり得る。分 析物、あるいは分析物に特異的な第２抗体に特異的な第１抗体は、既知の方法で 官能基を介して固相に安定に結合され得る。

もしポリメラーゼプローブを使用するのなら、ラベリングプローブは、アンプリ ファイアブローブの転写物の０２サブドメインに相補的な配列を含む。マルチマ ープローブを使用するのなら、ラベリングプローブは、Ｂドメインの繰り返しユ ニットに相補的な配列を含む。ラベリングプローブは、直接的にあるいは間接的 に検出可能なシグナルを提供する１個以上の分子（「標識」）を含む。標識は相 補的配列の個々のメンバーに結合し得、あるいは複数の標識を有する末端メンバ ーあるいは末端テールとして存在する。配列に結合される標識を供給する種々の 方法が文献に報告されている。例えば、Ｕｒｄｅａら、Ｎｕｃｌ、Ａｃｔ　ｓ　 Ｒｅｓ、（１９８８）　１６：４９３７、Ｌｅａｒｙら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　（１９８３）　８０：４０４５、Ｒｅｎｚお よびＫｕｒｚ。

Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９８４）　ｕ：３４３５、Ｒｉｃｈａ ｒｄｓｏｎおよびＧｕｗ＋ｐｏｒｔ、　Ｎｕｅｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（ １９８３）　ｌｌ二６１６７、Ｓｍ１ｔｈ　ら、Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９８５）　１３：２３９９、Ｍｅｉｎｋｏｔｈおよ びＷａｈｌ、加重Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９８４）　ｌｕ＋２６７を参照のこと 。標識は相補配列に共有結合で、あるいは非共有結合により結合され得る。使用 し得る標識には、放射性核種、蛍光物質、化学発光物質、色素、酵素、酵素基質 、酵素補因子、酵素阻害剤、酵素サブユニット、金属イオンなどが含まれる。特 異的な標識の例として、フルオレノセイン、ローダミン、テキサスレッド、フィ コエリスリン、ウンベリフェロン、ルミノール、ＮＡＤＰＨ，カラクトシダーゼ 、ホースラディツシュパーオキシダーゼなどが挙げられる。非放射性同位体１ｍ 方法との比較のためにＵｒｄｅａらの文献を参照のこと。

ラベリングプローブは、同一出願人によるＥ、Ｐ、Ａ公開番号２２５８０７に記 載の化学合成法等により簡便に調製できる。便利な官能性ををする末端基を提供 することによって、種々の標識がその官能性によって結合され得る。従って、種 々の標識が配列の二重構造に有害な影響を及ぼす事なく結合し得る、カルボキン 、チオール、アミン、ヒドラジン、あるいは他の官能性を供給し得る。既に示し たように、ラベリング配列に相補的な配列に結合し得る複数の標識を有する分子 を得ることができる。あるいは、ラベリング配列に結合されるリガンドを宵し得 、標識分析物複合体を供給するりガントへの結合のための標識レセプターを使用 し得る。

標識の存在を検出するために、標識の性質によって種々の技法を使用し得る。蛍 光物質に対しては、種々の蛍光計を利用することができる。酵素とともに蛍光あ るいは着色生成物を供給し得、蛍光比色、分光光度あるいは視覚により測定し得 る。イムノアッセイに使用する種々の標識およびイムノアッセイに適用可能な技 法を、本アッセイに使用し得る。

アッセイの分離工程に用いられる方法は、固相の性質によって変化する。粒子の 場合、遠心あるいは濾過により粒子を分離し、上澄みが排除されあるいは上澄み が単離される。粒子をアッセイする段階では、例えばＳＤＳを含むＰＢＳのよう な洗浄剤を含む適切な緩衝化媒体で完全に、通常１から５回、粒子を洗浄する。

分離物質が壁あるいは支持体である場合、上澄みを単離し、あるいは排除し、壁 を粒子の場合に示したのと同様の方法で洗浄する。

Ｄ、競合イムノアッセイ 本発明のハイブリッドアンプリファイアブローブは、競合イムノアッセイにおい て、抗原を標識するための方法に使用し得る。典型的なアッセイにおいて、過剰 のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、好ましくは分析物に特異的に結合 するモノクローナル抗体を固相、通常は複数ウェルのプレートに固定する。標準 的な濃度の標識抗原を、未知量の分析物を含むと考えられる試料の一連の希釈液 と混合する。次に、各希釈液を固定した抗原にさらし、結合された標識の量を測 定する。非標識分析物が標識分析物と競合する能力は、試料中の分析物濃度を計 算するために用いられる。　−一つの実施態様において、ポリメラーゼプローブ のＢ／Ｃドメインのポリヌクレオチド部分を、競合免疫原に結合させる。

次に、このハイブリッド分子を前述の標識抗原として使用する。競合結合の後、 ポリメラーゼ（Ｂドメインプロモーターに対して特異的）を加え、転写産物を前 出のセクシ目ンＩ（Ａ）に記載の方法でアッセイする。

他の実施態様において、マルチマープローブのＭドメインポリヌクレオチド部分 を競合免疫原に結合する。次に、このノ＼イブリッド分子を前述の標識抗原とし て使用する。競合結合の後、Ｍドメインを標識し、前述の方法で定量する。

免疫原をＤＮＡと結合させるために、ジスクシニミジルスベラート（ＤＳＳ）、 エチレングリコール旦ス（スクシニミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、あるいは ｐ−フェニレンジインチオシアネート（ＤＩＴＣ）のような同一二官能性の試薬 は、前出のセクション１（Ａ）に記載のカップリング方法よりも、おそらくはよ り有用である。

本発明の増幅されたイムノアッセイを行うためのキ・７トは、詰め合わせの組み 合わせとして以下の試薬を含む：抗原分析物を結合し得るか、あるいは、もし分 析物が結合された第１抗体あるいは第２抗体を介して固相に間接的に結合される ようなアッセイ形式では、代替的に既に固相に結合されている結合用の第１抗体 を有する固相；必要に応じて、分析物に特異的なリンカ−である第２あるいは第 ３抗体、そしてもしポリヌクレオチドアンプリファイアブローブを使用するアツ セイ形式であれば、ハイブリダイノドリンカ−プローブ；アンプリファイアブロ ーブ；適当なりＮＡに対するＲＮＡポリメラーゼおよび固定化された転写キャブ チャーブローブ（ポリメラーゼアンブリファイアプローブを使用する場合）；お よび適当なラベリングプローブ。これらの試薬は典型的には、キ・、＋−中の別 々の容器に入れられる。キットには、ノ＼イブリダイゼーンコンハノファ一、洗 浄溶液、陰性および陽性のコントロールおよびアッセイを実施するための説明書 が含まれる。

以下の実施例は、例として示すものであって本発明を限定するものではない。本 発明の意図する範囲内の他の実施態様が当業者には明らかである。

（以下余白） 支血桝上−１上血遺匹上工ｊ１虹■爪二直　についてのイムノこのアッセイは、 Ｃ型肝炎ウィルスのＣ−１００抗原の存在を直接に検査するために設計される。

このイムノアッセイのための一般的なプロトコールは、前述されたとおりである 。第１抗体としてヤギ抗マウス抗体を使用するマイクロタイタープレートを用意 する。この抗体を９６ウエルのマイクロタイタープレートのウェル中に固定化す る。第２抗体は、ｌ（Ｃ’／　Ｃ−１００１１７）エピトープに特異的なマウス モノクローナル抗体である。ＨＣＶについてスクリーニングしようとする個体か らの血清の同一の２つの希釈物をプロソキングバッファー中で調製し、適切な非 感染コントロールと並列してマイクロタイターのウェル中でインキュベートする 。第３抗体は、各ＨＣＶ抗原を認識するポリクローナルウサギ抗体の組み合わせ である。最後の抗体は、ハイブリッドエフポリメラーゼアンプリファイアブロー ブである。ドメインＡのポリペプチド部分は、ヤギ抗ウサギ抗体として機能し、 「サンド仁ノチ」イムノアツセイを完成させる。

Ｔ７ポリメラーゼブローブを添加した後、ドメインＣの転写は、この複合体を、 ４０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ（ｐＨ８＞、２０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０　ｍ Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭスペルミジン、１０　ｍＭジチオスレイトール、０．１５ 　ｍｇ／ｍｌ　ウシ血清アルブミン、ｒＡＴＰ、　ｒＣＴＰ、　ｒＧＴＰ、　ｒ ｌＪＴＰカイそれぞれ１．２５−Ｍ、　１６００単位／ｍｌ　ＲＮアシン、およ び２０００単位／ｗ＋Ｉ　Ｔ７１１ＮＡポリメラーゼからなる溶液２０μｌ中で インキユベートすることにより実施する。この混合物を３７°Ｃで１時間インキ ュベートする。８　ｘ　ＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳを含有する溶液２０μｍを 添加して転写を停止させ、混合物全体を、ＣＩ’配列を有する固定化キャプチャ ープローブを含む新しいウェルに移し変える。ドメインＣの転写物の捕捉（図３ ）は、５５°Ｃで１時間インキュベートし、その後０．１　ｘ　ＳＳＣ，０，１ ％ＳＯＳで２回洗浄することによって実行される。

次に、ドメインＣの転写物を、４０μｌの４　ｘ　ＳＳＣ，１００μｇ／ｌのポ リＡ中の酵素標識プローブ（ｃ２’）Ｓｏ　ｆ■Ｏ１を５５℃で１５分間添加す ることにより標識する。最後に、この複合体を０．１ｘ　ＳＳＣ，０，１％ＳＤ Ｓで洗浄し、続いて０．Ｉ　Ｘ　ＳＳＣで２回洗浄する。

ＡＰ検出のために、Ｌｕｍｉｇｅｎ　Ｉｎｃ、から得られる、酵素が引き金とな って起こるジオキセタン反応（Ｓｃｈａｐｐ（１９８７）ら、Ｔｅｔ。

Ｌｅｔｔ、　２８：　１１５９−１１６２および米国特許第４．８５７．６５２ 号）を行う。

検出方法は、以下のように行う。標識工程では、ＡＰプローブを有する）ＩＭブ ノファ−２０μｍを各ウェルに添加し、それらのウェルを５５°Ｃで１５分間イ ンキュベートする。上清を除去して、各ウェルを３８０μｌの０．１　ｘ　ＳＳ Ｃおよび０．１％ＳＤＳで２回洗浄する。次に、それらのウェルを３８０μｌの ０．１　ｘ　ＳＳＣで２回洗浄して、残存する全てのＳＤＳを取り除く。ＣＴＡ Ｂバッファー中の３．３　ｘ　１０−’　Ｍジオキセタン２０μｍを各ウェルに 添加する。これらのウェルを軽くたたいて試薬が底に沈むようにし、この試薬が 底金体に均一に分布するようゆっくりと回す。ウェルをマイクロタイタープレー トのシールで覆い、３７℃のオーブンで１時間インキコベートする。次にウェル をルミノメータ−で読み、既知量の抗原について作成された標準曲線と比較して 定量する。

２−ヒト　におするＨＣＹに文・　る　の　についてのイムノアツセイ マイクロタイタープレートをまず、Ｃ型肝炎ウィルスからのＨＣＶ　ｃ−ｔｏｏ 抗原でコートする。コーティングバッファー（５０ｍＭホウ酸ナトリウム、　ｐ ［Ｉ　９．０）、２１１ｙプレート、ＢＳＡ　（２５ｕ　ｇ／ｍｌ）、）ＩｃＶ 　Ｃ−１００（２，５０ｕｇ／ｍｌ）を含む溶液を添加の直前に調製する。この 溶液を０．２ｍｌ／ウェルでプレートに添加し、５分間混合した後、それらを覆 って３７℃で２時間インキュベートし、その後この溶液を吸引によって取り除く 。これらのウェルを０．４ｍｌの洗浄バッフｙ　−（１００ｍＭ　リン酸ナトリ ウム、ｐＨ７，４、；４０　ｍＭ　ＮａＣｌ、　０．１％　カゼイン、１％　（ ｖ／Ｖ）　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，０，０１％（ｖ／ｖ）ヒビテン）で１回 洗浄する。洗浄溶液を除去した後、２００７１１／ウエルのコート後溶液（１０ ■Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，２、＋５０　ｍＭ　ＮａＣ１，０，１％　（ｖ ／ｖ）カゼイン、３％ンヨ糖、および２　ｓＭフェニルメチルスルホニルフルオ ライド（ＰＭＳＦ＞）を添加し、プレートをゆったりと覆って気化するのを防ぎ 、そして室温に３０分間放置する。次にこれらのウェルを吸引して溶液を取り除 き、棚の加温なしに、１晩凍結乾燥する。

イムノアッセイを遂行するために、血清サンプルまたはコントロールの同一の２ つの希釈液２０μｌをサンプル希釈物（１００ｍＭ　リン酸ナトリウム、ｐＨ７ ，４，５００ｍＭ　ＮａＣ１，１ｉ＋Ｍ　ＥＤＴＡ、０．１％（ｖ／ｖ）カゼイ ン、０．０１％（ｖ／ｖ）　）ｌｉｂｉｔａｎｅ、　１％Ｔｒｉｔ。

ｎ　Ｘ−１００，１００μｇ／ｍｌ酵母抽出液）　２００　μＩを含むウェルに 添加する。これらのプレートをシールし、３７℃で２時間インキュベートし、そ の後この溶液を吸引により除去して、そしてこれらのウェルを４００μｌの洗浄 バッファー（０，０５％Ｔｖｅｅｎ　２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄する。

血清サンプルの添加に引き続いて、これらのウェルを、ウサギ抗ヒト血清を第３ 抗体（ウサギ抗分析物抗体）で置き換えたこと以外、上記実施例１と同様にして 処理する。

３−ＨＣＶ　の　にお（るマルチマープローブの菓皿上記２つの実施例のいずれ かにおいて、マルチマープローブがポリメラーゼプローブと置き換えることがで きる。各実施例において全ての工程が、マルチマープローブがポリメラーゼプロ ーブよりも使用されるということを除いて、アンブリファイアプローブを添加す るところまで同じである。アンプリファイアブローブと結合させた後、ドメイン Ｍの多量体サブユニ、トと実質的な相同性を有する標識オリゴヌクレオチド配列 ５０　ｆｍｏｌを含む溶液を添加する。この酵素標識プローブを、４０μｍの４ 　ｘ　ＳＳＣ，１００μｇ／ｍｌポリＡ中ポリ５分間５５°Ｃで添加する。最後 に、この複合体を、０．１　ｘ　ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳで２回洗浄し、さらに ０．１　ｘ　ＳＳＣで２回洗浄した。

ＡＰ検出のために、Ｌｕｍｉｇｅｎ　Ｉｎｃ、から得られる、酵素が引き金とな って起こるジオキセタン反応（Ｓｃｈａｐｐ＜１９８７）ら、Ｔｅｔ。

Ｌｅｔｔ、　２８：　１１５９−１１６２および米国特許第４，８５７．６５２ 号）を行う。

検出方法は、以下のように行う。標識工程では、ＡＰプローブを有するＨＭバッ ファー２０μｌを各ウェルに添加し、それらのウェルを５５℃で１５分間インキ ュベートする。上演を除去して、各ウェルを３８０μｍの０．１　ｘ　ＳＳＣお よび０．１％ＳＤＳで２回洗浄する。次に、それらのウェルを３８０μｍの０． Ｉ　Ｘ　ＳＳＣで２回洗浄して、残存する全てのＳＤＳを取り除く。ＣＴＡＢバ ッファー中の３３　ｘ　１０−’　Ｍジオキセタン２０μｌを各ウェルに添加す る。これらのウェルを軽くたたいて試薬が底に沈むようにし、この試薬が底全体 に均一に分布するようゆっくりと回す。ウェルをマイクロタイタープレートのシ ールで覆い、３７℃のオーブンで１時間インキュベートする。次にウェルをルミ ノメータ−で読み、既知量の抗原について作成された標準曲線と比較して定量す る。

４−）ＩＣ’／、　の　におするポリヌクレオチドポリメラーゼプローブの 上記実施例１または２のいずれかにおいて、ポリヌクレオチドポリメラーゼプロ ーブを、ハイブリッドポリメラーゼプローブで置き換えることができる。各実施 例において全ての工程が、ＨＣＶ抗原のそれぞれを認識するポリクローナルウサ ギ抗体の組み合わせである第３抗体を添加するところまで同じである。続いて、 ５０μｌのハイブリッドリンカ−分子を、０゜２　Ｍ　ＮａＨＣＯ３中２０μｇ ／ｍ　Ｉの濃度で添加する。このインキュベーションを、全ての前記抗体インキ ュベーションと同様のプロトコールに従って実施する。このハイブリッドリンカ −分子は抗ウサギ抗体として機能し、あらかじめウサギの第３抗体に結合された 全てのものに結合する第１のドメインを有する。

ハイブリッドリンカ−の第２ドメインは１５残基を有するオリゴヌクレオチドで あり、その配列はポリヌクレオチドポリメラーゼプローブのドメインＡと実質的 に相補的である。インキュベーションと洗浄の後、ポリメラーゼプローブをハイ ブリダイゼーシ目ンバソファー（０，３Ｍ　ＮａＣ１，０，１％ＮＰ−４０）　 ５０μｌに添加し、４０℃で６０分間インキュベートする。インキュベージロン の後、過剰なプローブを除去して、複合体をノ＼イブリダイゼーシランバソファ ーで３回洗浄する。ドメインＢを転写させて、転写物を実施例１のように定量す る。

５−ＨＣＶ　の　にお（るボリヌクレオチドマルチマニヱ三ニゲ」１月 このアッセイは、ポリヌクレオチドプローブを添加するところまで実施例４と同 一である。それに続く標識のドメイン間サブユニ’ｙ　）へのハイブリダイゼー シプンと標識の定量は、実施例３と同様である。

６−　したヒトＩＧの　におするポマヌクレオチドマルチマーブローブの １５の従属側鎖のそれぞれが標識プローブに相補的な３つの部位（全部で４５部 位）と、骨格に結合する末端ピオチン分子を有している、櫛状の分枝ポリヌクレ オチドを上記のように調製する。

ヒトＩｇＧを様々な濃度で固体支持体に固定化させた。固定化したＩｇＧをビオ チン化されたアフィニティー精製のヤギ抗ヒトＩｇＧ（ビオチン濃度４０　ｎｇ ）とインキユベートし、過剰の抗血清を支持体から洗い流した。次にこの支持体 を、２００　ｎＨのアビジンＤと、さらに５００　ｆｍの櫛状ポリヌクレオチド とインキユベートし、そして適切な洗浄を行った。次にこの支持体を、ポリヌク レオチド上の標識プローブ結合部位に相補的なホースラディノシュペルオキシダ ーゼで標識したオリゴヌクレオチドプローブとインキユベートした。吸光度（０ ，Ｄ、　）の読みは、４９２／６２０　ｎ■で行った。

比較を目的とするアッセイを、１つのみの標識プローブ結合部位を有するポリヌ クレオチドを使用して、上記のように行った。

下記の表は、これらのテスト結果を示す。

１００　１１１６　０．００５　２．５０５　０．００２５０　１．０Ｂ９　０ ．００２　１．５６４　０．００１２５　０．４３２　０．００１　１．２９５ 　０．００１１２．５　０．３０コ　０．００１　０．４５１　０記録されたと ころによると、４５部位のポリヌクレオチドは、単一部位ポリヌクレオチドより もよりも高いシグナルを発し配列表 々なアンプリファイアブローブの他の改変および適用は、当業者に自明であり、 本発明の範囲内であることが意図されるものである。

（Ａ）氏名　：　ンオッティ、　トー７ス　イー。

（１）一般的情報： （ｉ）出願人　：　アーチ゛ア、　マイケル　ニス。

（ｉ　ｉ）発明の名称：タンパク質−核酸プローブおよびそれを用いたイムノア ッセイ （ｉｉｉ）配列数：１２ （ｉｖ）関連住所： （Ａ）住所人　＝　フイレル　アント′　７本う（Ｂ）番地　：　ミドに１４− にドｏ−）’５４５、　ス４−ト　２００（Ｃ）市　：　メン口　八゛−り （Ｄ）州　：　カリフォルニア （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：　９４０２５ （ｖ）コンピューター読み出し形管： （Ａ）媒体型：フロノビ−ディスク （Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ　ＰＣ互換用（Ｃ）操作システム：　ＰＣ−Ｄ ＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ＜Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース＃１．Ｏ，バー ジョン＃１２５ （ｖｉ）現在の出願データ： （Ａ＞出願番号：　ＰＣＴ／ＵＳ９１１０２９２５（Ｂ）出願日＋　１９９１年 ５月６日 （Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）代理人／事務所情報： （Ｂ）登録番号：　２１．０１３ （Ｃ）照会／記録番号：　２３００−００４６゜５１（ｉｘ）電話回線情報： （Ａ）１ｉ話：　４１５−３２７−７２５０（Ｂ）テレファックス：４１５〜３ ２７−２９５１（Ｃ）テレックス：　７０６１４１ （以下余白） （２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｈｏｗｌの情報：（＋）配列の特色： （Ａ）長さニア塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー不備 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１：入ＭｕＪ講入 ＜２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・２の情報：〈１）配列の特色： （Ａ）長さ＝１７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー不備 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２：ＴＡＡＴＡＣにＡＣＴ　ＣＡＣＴＡ ＴＡ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３の情報：（ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー不備 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３：ＴＡＴＡＧＴＣＡＧＴ　ＣにＴＡＴ ＴＡ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋４の情報；（＋）配列の特色： （Ａ）長さ：３２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー不備 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　）ＩＱ：４：ＣＴＧＧＣτＴ八τＣＧへＡＡＴ ＴＡＡτＡ　ＣにＡＣＴＣＡＣＴＡ　τ八（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５の情報 ：（ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：３２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー不備 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋５＋ＴＡＴＡＣＴＧＡＧＴ　ＣＧＴｋＴ ＴＭＴＴ　ＴＣにＡＴＡＡにＣＣＡＧ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ＝４３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー不備 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ＞配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１：ＧＧＧ入ＧＡＴにＴＧ　Ｃττに ＴＣＣ；ＴＡＣＴＴＡＧＣＧＡＡＡＴ　ＡＣＴＧＴＣＣＧＡＧ　τＣＧ（２）Ｓ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２の情報：（ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ＝４３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー不備 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ＞配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１２：ＣＣＣＴＣＴＡＣＡＣＣＡＡＣＭ ；ＣＡＴＧ　ＡＡＴＣＣ；ＣＴＴＴＡ　ＴｃＡｃＡｃｃｃＴｃ　ＡＧＣＡ−−Ａ ３．−←０− ＊）ｔ、ｌ、−ｙ〜２．；：）−５，；；）１１．；−１−１！；：；１．；！ ：１２．；ｊニー１．；ｊ）−、！１：）、−１１，、、、A、、、，２、、、 、、、，２，ｂ−、、、、、、、、、、、、ｊｌ、、、、、、２．、、、、、、 、、、、、、ｃ’−＜　Ａ　＞　＜　Ｂ　（Ｔ７ブ０ぞｍ−ター　）　〉５’　 ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣ−ＧＣＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣ ＡＣＴＡＴＡ、、。

抜４＄　−３１−ＭＭｘ頃品ＧＡｃｃｃＡＡｒＡＧＣＴＴＴＡＡｒｒＡｒｃｃＴ ＧＡｃｒｃＡ＝ｘ＝　、　、　。

、、、ＣＣＣＴＣＴＡＣＡＣＣＡＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＴＣＧＣＴＴＴＡＴＧＡ ＣＡＧＧＣＴＣＡＧＣく　二 図面の簡単な説明 図１Ａは、モノマーポリメラーゼ型のアンプリファイアブローブの図式である。

大文字はドメインを表し、小文字はドメイン内の鎖を表す。プライム文字は、下 側の鎖を表す（左から右へ３′から５′）。Ａドメインは標的のエピトープを認 識する抗体である（ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：８）。ＢドメインはＲＮＡポリメラー ゼのプロモーターである（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９）、（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ： 　１０）、（ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：１１）および（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２）。

Ｃ°配列は、ＲＮＡポリメラーゼの鋳型である。プローブは一本鎖として合成さ れる。Ｃ領域の端のＡＡＡＡＡＡＡ　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）は、自己アニ ーリングをさせるために添加したポリＡリンカ−を表す。ＡドメインとＢドメイ ンとの間のＡ　／　Ｔ　ｇ域は、十分な抗体活性を保持するために随意必要とな る。

図ＩＢは、ポリメラーゼ型のアンプリファイアブローブの１つの実施態様のＤＮ Ａ配列である。プロモータードメインＢは、バクテリアファージのＴ７プロモー ターのコンセンサス配列（５’　−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ−３” ）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）と、このプロモーター配列の５′側の１５個の付 加残基から成る。

図ＩＣは、マルチマーポリメラーゼ型のアンプリファイアブローブの図式である 。このプローブ中で、Ａドメインは抗体として機能し、二本鎖のＢおよびＣドメ インは自己アニーリングする。

図ＩＤは、マルチマーアンプリファイアブローブの図式である。このプローブ中 で、Ａドメインは抗体として機能し、Ｍドメインは多数のオリゴマーサブユニッ トを含有する。二叉分枝したマルチマーと櫛状（ｃｏｍｂ−１ｉｋｅ）マルチマ ーの両方が示されている。

図２Ａは、ポリメラーゼ型のアンプリファイアブローブを用いた、サンドイッチ イムノアッセイ系の図式である。分析物のタンパク質は、第１の抗体（例えば「 ラブ（ｒａｂ）Ｊ（ラビット）−抗体）との複合体を形成することにより、固体 の基質上に間接的に固定され；そして第２の抗体く例えばマウス抗体）と複合体 を形成することによりアンプリファイアブローブと間接的に結合している。

図２Ｂは、サンドイッチハイブリダイゼーション／イムノアッセイ系の図式であ る。分析物のタンパク質は上述のように間接的に固定される。第２の抗体（マウ ス−抗分析物）は、ハイブリッド抗体／ポリヌクレオチド分子と複合体を形成し ている。ハイブリッド分子中では、タンパク質部分は抗マウス抗体として機能し 、ポリヌクレオチド部分はアンプソファイアプローブ（この場合、マルチマープ ローブ）のａ′　ヌクレオチド領域と相補的である。

図３は、イムノアッセイにおけるレポーター分子としてのＲＮＡポリメラーゼの 転写物の利用を示す。ポリメラーゼプローブを用いるサンドインチ複合体を形成 させた後、ＲＮＡポリメラーゼを添加されると、鋳型配列（Ｃ′）と相補的な多 数のＲＮＡ転写物（Ｃ）が生成される。これらの配列は２つのサブドメインを有 する：ｃｌはキャプチャープローブと相補的であり、固体の基質上に固定されて いる；そしてＣ２はラベリングプローブと相補的である。このことにより、標識 が間接的に固定されて、ハイブリダイゼーションアソセイングナルが簡単に定量 できる。「＊」は放射性、化学発光性、蛍光性、または酵素的であり得る、取り 込まれた標識を表す。

図４（バートＡからＦ）は、「櫛状」および／または分枝状構造を有するマルチ マーを作成する際に用いる手順を例証している。

Ｆｉｇｕｒｅ　３ ４コ 寸 ユ０ マ ＝＝ 大？ 国際調査報告 フロン１へページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、　ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、 ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、　ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、Ａ Ｔ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，ＤＥ、　ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ。

ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、ＭＣ，ＭＧ、　ＮｉＷ、ＮＬ、Ｎ Ｏ，ＰＬ、ＲＯ，ＳＤ、ＳＥ、ＳＵ

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. １．イムノアッセイにおいてシグナルアンプリファイアとして使用する分子プロ ーブであって、該プローブが、（ａ）ポリペプチドであり、既知の抗原に特異的 な抗体として機能する第１ドメイン（Ａ）、 （ｂ）ＤＮＡ依存性ＲＭポリメラーゼ酵素活性に対するプロモーターとして機能 し得る二本鎖ポリヌクレオチドである第２ドメイン（Ｂ）、および （ｃ）該第２ドメインに隣接する一本鎖または二本鎖であり、その結果該第２ド メインの該プロモーター活性に対する鋳型として機能し得る第３ドメイン（Ｃ） 、を含む、分子プローブ。
2. ２．前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性がバクテリオファージＴ７に由来 する、請求項１に記載のプローブ。
3. ３．前記第２ドメインＢの長さが少なくとも１０個でありおよび４０個未満のヌ クレオチドである、請求項１または２に記載のプローブ。
4. ４．前記第３ドメインＣの長さが少なくとも３０個でありおよび８０個未満のヌ クレオチドである、請求項３に記載のプローブ。
5. ５．前記ポリメラーゼ活性が前記バクテリオファージＴ７に由来し、前記第２ド メインＢの配列が、【配列があります】（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）【配列があ ります】（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）を含有する、請求項２に記載のプローブ。
6. ６．前記ポリメラーゼ活性がバクテリオファージＴ７由来である、請求項２に記 載のプローブであって、前記第２ドメインＢのヌクレオチド配列が 【配列があります】 （ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４） 【配列があります】 （ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５） である、プローブ。
7. ７．前記第３ドメインＣのヌクレオチド配列の上側ストランドの５′残基が前記 第２ドメインＢに隣接しており、かつグアノシン残基である、請求項１、２、３ 、４、５または６に記載のプローブ。
8. ８．前記第３ドメインＣの配列が 【配列があります】（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）【配列があります】（ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：７）である、請求項１、２、３、４、５、６または７に記載のプロ ーブ。
9. ９．前記第２ドメインＢのＤＮＡヌクレオチド配列の上側ストランドの３′末端 が、前記ドメインＣのヌクレオチド配列の上側ストランドの５′末端に結合して いる、請求項８に記載のプローブ。
10. １０．前記第３ドメインＣの転写物が２つのサブドメインを有し、該２つのサブ ドメインが、 （ａ）オリゴヌクレオチドキャプチャーリンカーとハイブリダイズし得、該キャ プチャーリンカーが固体基質上に固定化されたポリヌクレオチドにハイブリダイ ズし得る第１サブドメインＣ１、および （ｂ）オリゴヌクレオチド標識リンカーに結合し得、該標識リンカーが定量可能 なプローブと結合し得る第２サブドメインＣ２、 である、請求項１に記載のプローブ。
11. １１．前記第２および第３ドメインであるＢおよびＣを含有する機能性ユニット が複数の反復ユニットの中に存在する、請求項１に記載のプローブ。
12. １２．イムノアッセイにおいて検出可能なシグナルを増幅する方法であって、該 方法が、 （ａ）結合ドメイン（Ａ）、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素活性に対する プロモーターとして機能し得る二本鎖ＤＮＡ配列である第２ドメイン（Ｂ）、お よびドメインＢに隣接する一本鎖または二本鎖であり、その結果該第２ドメイン の該プロモーター活性に対する鋳型として機能し得る第３ドメイン（Ｃ）、を含 む生化学的分子プローブを分析物と直接的または間接的に結合させ、 （ｂ）結合していないプローブを除去し、（ｃ）前記プローブ構築物の第３ドメ インＣの鋳型配列であるｃ′に相補的なＲＮＡオリゴマーの複数のコピーを、Ｄ ＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性により転写し、そして（ｄ）該ＲＮＡ転写物 を定量すること、を包含する、方法。
13. １３．前記分析物を直接的または間接的に固体基質に最初に固定化する、請求項 １２に記載の方法。
14. １４．ドメインＡが抗体として機能し得るポリペプチドであり、および前記プロ ーブをドメインＡを介して直接的または間接的に前記分析物に結合する、請求項 １２または１３に記載の方法。
15. １５．（ａ）前記プローブのドメインＡが一本鎖のポリヌクレオチドであり、お よび （ｂ）前記分析物を、下記の２つのドメインを有するタンパク質／ポリヌクレオ チドハイブリツドリンカ一分子を介して前記分子プローブに間接的に結合する、 方法であって、ここで （ｉ）第１ドメインが、該プローブのドメインＡの配列に実質的に相補的な一本 鎖のポリヌクレオチドであり、および（ｉｉ）第２ドメインが、該分析物に対し て特異的であるか、あるいは前記分析物に特異的な抗体のエピトープに対して特 異的な抗体として機能する、請求項１２または１３に記載の方法。
16. １６．前記第２ドメインＢがバクテリオファージＴ７のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリ メラーゼに由来する、請求項１２、１３、１４または１５に記載の方法。
17. １７．（ａ）前記プローブの第３ドメインＣを標識リボヌクレオチド三リン酸の 存在下で転写し、 （ｂ）該第３ドメインの転写物が、固体基質上に固定化されたオリゴヌクレオチ ドキャプチャープローブに相補的な第１サブドメインＣ１を有し、そして （ｃ）該転写物を固定化し、そして定量する、請求項１２、１３、１４、１５ま たは１６に記載の方法。
18. １８．（ａ）前記第１プローブの第３ドメインＣをビオチン化リボヌクレオチド 三リン酸の存在下で転写し、（ｂ）該第３ドメインの転写物が、標識オリゴヌク レオチドプローブに相補的な第１サブドメインｃ２を有し、（ｃ）該転写物をア ビジン化固体基質上に固定化し、そして（ｄ）該転写物を定量する、 請求項１２、１３、１４、１５または１６に記載の方法。
19. １９．（ａ）前記プローブの第３ドメインＣを標識リボヌクレオチド三リン酸お よびビオチン化リボヌクレオチド三リン酸の両方の存在下で転写し、 （ｂ）該転写物をアビジン化固体基質上に固定化し、そして（ｃ）該転写物を定 量する、 請求項１２、１３、１４、１５または１６に記載の方法。
20. ２０．（ａ）前記プローブの第３ドメインＣの転写物が、（ｉ）オリゴヌクレオ チドキャプチャープローブに相補的であり、該キャプチャープローブが固体基質 上に固定化されている、第１サプドメインｃ１、および（ｉｉ）標識オリゴヌク レオチドプローブに相補的な第２ドメインｃ２である、２つのサブドメインを有 し、（ｂ）該転写物を該キャプチャープローブにハイブリダイズさせ、 （ｃ）該標識プローブを該転写物にハイブリダイズさせ、そして （ｄ）該標識プローブを定量する、 請求項１２、１３、１４、１５または１６に記載の方法。
21. ２１．前記第１のプローブの第２および第３ドメインであるＢおよびＣを含むユ ニットが複数の反復Ｂ／Ｃユニット中に存在する、請求項１２に記載の方法。
22. ２２．イムノアッセイにおいてシグナルアンプリファイアとして使用する分子プ ローブであって、該プローブが、（ａ）既知の分析物に特異的に結合する抗体と して機能し得ろポリペプチドを含む第１ドメイン（Ａ）、および（ｂ）対象の一 本鎖核酸配列に特異的に結合し得る一本鎖オリゴヌクレオチドサブユニットを多 数含む第２ドメイン（Ｍ）、を含有する、分子プローブ。
23. ２３．前記第２ドメインＭの各オリゴヌクレオチドユニットが１５個から５０個 の塩基対を有し、および４０％から６０％の範囲のＧＣ含有量を有する、請求項 ２２に記載のプローブ。
24. ２４．前記分子が直鎖構造を有する、請求項２２に記載のプローブ。
25. ２５．前記分子が分枝構造を有する、請求項２２に記載のプローブ。
26. ２６．前記第２ドメインのオリゴヌクレオチドサブユニットの少なくとも一部分 を、下記の構造式を有する化合物に由来する多官能性部分を介して連結する、請 求項２２に記載のプローブ： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）ここで、Ｒは有機部分、好ましくは核 酸であり、Ｒ１は合成核酸を固相から除去せず環構造外の窒素またはリン酸を保 護する基を除去しない条件下で除去し得るヒドロキシル保護基であり、Ｘは核酸 合成を促進するリン含有基であり、Ｙは求核基由来のラジカルであり、そしてＲ ２はＲ１であるかまたはＲ１に影響を与えることなしに除去されて水素で置き換 え得るブロック基または保護基である。
27. ２７．前記オリゴヌクレオチドサブユニットの少なくとも一部分が下記構造式で 示される化合物に由来する多官能性部分を介して連結される、請求項２２に記載 のプローブ：▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、Ｚは求核基であり、Ｒ１は一般に塩基に安定であり、および酸に感受性 の保護基であり、Ｒ２は水素またはメチルであり、Ｒ３はＲ■に影響を与えるこ となく除去されて水素で置き換えられ得る保護基であり、Ｒ５は化学合成の間オ リゴヌクレオチド鎖の５′位にヌクレオチドを添加し得るリン誘導体であり、Ｒ ６はメチル、水素、Ｉ、Ｂｒ、またはＦであり、およびＸは１から８の整数であ る。
28. ２８．前記オリゴヌクレオチドサブユニットの少なくとも一部分が下記構造式で 示される化合物に由来する多官能性部分を介して連結されるプローブであって、 ▲数式、化学式、表等があります▼ここで、Ｒがヒドロキシル保護基であり、ｉ Ｐｒがイソプロピルであり、そしてＲ１がメチルまたはβ−シアノエチルである 、請求項２２に記載のプローブ。
29. ２９．イムノアッセイにおいて抗原を検出し定量するために使用される検出可能 なシグナルを増幅する方法であって、該方法が、 （ａ）結合ドメイン（Ａ）と、一本鎖標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズ し得る一本鎖ＤＮＡオリゴマーサブユニットを多数含む第２ドメイン（Ｍ）とを 含有する生化学的な分子プローブを直接的または間接的に分析物に結合させ、（ ｂ）結合していないプローブを除去し、（ｃ）ドメインＭプローブのサブユニッ ト配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖標識オリゴヌクレオチ ドを第２ドメインのサブユニットにハイブリダイズさせ、（ｄ）結合していない 標識オリゴヌクレオチドを除去し、そして （ｅ）該プローブに結合した標識オリゴヌクレオチドの量を定量すること、 を包含する、方法。
30. ３０．前記分析物を固体基質上に直接的または間接的に固定化する、請求項２９ に記載の方法。
31. ３１．ドメインＡが抗体として機能し得るポリペプチドであり、および前記プロ ーブをドメインＡを介して前記分析物に直接的または間接的に結合する、請求項 ３０に記載の方法。
32. ３２．前記ドメインＡのポリペプチドが、前記分析物に特異的に結合する抗体の エピトープに対して特異的に結合する、請求項３１に記載の方法。
33. ３３．（ａ）前記プローブのドメインＡが一本鎖ポリヌクレオチドであり、およ び （ｂ）前記分析物が、下記２つのドメインを有するタンパク質／ポリヌクレオチ ドハイブリッドリンカー分子を介して該分子プローブに間接的に結合する方法で あって、該２つのドメインが、 （ｉ）該プローブのドメインＡの配列に実質的に相補的な一本鎖オリゴヌクレオ チド配列である第１ドメイン、および （ｉｉ）該分析物に特異的な抗体として機能する第２ドメインである、請求項２ ９に記載の方法。
34. ３４．該競合イムノアッセイにおいて検出可能なシグナルを増幅する方法であっ て、該方法が、 （ａ）（ｉ）免疫原として機能し得る第１ドメイン（Ａ）、（ｉｉ）ＤＮＡ依存 性ＲＮＡポリメラーゼ酵素活性のためのプロモーターとして機能し得る二本鎖ポ リヌクレオチドである第２ドメイン（Ｂ）、および （ｉｉｉ）第２ドメインに隣接する一本鎖または二本鎖であり、その結果該第２ ドメインの該プロモーター活性に対する鋳型として機能し得る第３ドメイン（Ｃ ）、を含む分子プローブを構築し、 （ｂ）競合する分析物の存在下で固体基質上で直接的または間接的に該プローブ を固定化し、 （ｃ）結合していないプローブを除去し、（ｄ）該プローブ構築物の第３ドメイ ンＣの鋳型配列ｃ′に相補的なＲＮＡオリゴマーの複数コピーを、ＤＮＡ依存性 ＲＮＡポリメラーゼ活性により転写し、そして （ｅ）該ＲＮＡ転写物を定量すること、を包含する、方法。
35. ３５．競合イムノアッセイにおいて検出可能なシグナルを増幅する方法であって 、該方法が、 （ａ）（ｉ）免疫原として機能し得る第１ドメイン（Ａ）、および（ｉｉ）対象 の一本鎖核酸配列に特異的に結合可能な一本鎖オリゴヌクレオチドサブユニット を多数含む第２ドメイン（Ｍ）を含む分子プローブを構築し、 （ｂ）該プローブを競合性分析物の存在下で固体基質上に直接的または間接的に 固定化させ、 （ｃ）結合していないプローブを除去し、（ｄ）該ドメインＭプローブのサブユ ニット配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖標識オリゴヌクレ オチドを第２ドメインのサブユニットにハイブリダイズさせ、（ｅ）結合してい ない標識オリゴヌクレオチドを除去し、そして （ｆ）該プローブに結合した標識オリゴヌクレオチドの量を定量すること、 を包含する、方法。