PT97580B - Sondas de preparacao de sondas de proteina-acido nucleico e imunoensaios que utilizam as mesmas - Google Patents
Sondas de preparacao de sondas de proteina-acido nucleico e imunoensaios que utilizam as mesmas Download PDFInfo
- Publication number
- PT97580B PT97580B PT97580A PT9758091A PT97580B PT 97580 B PT97580 B PT 97580B PT 97580 A PT97580 A PT 97580A PT 9758091 A PT9758091 A PT 9758091A PT 97580 B PT97580 B PT 97580B
- Authority
- PT
- Portugal
- Prior art keywords
- domain
- probe
- oligonucleotide
- stranded
- sequence
- Prior art date
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 209
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 65
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 51
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 51
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 32
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 28
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 61
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 46
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims description 44
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 37
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 29
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 27
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 23
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 23
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 22
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 22
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 22
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 22
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 20
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 19
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 19
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 19
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 18
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 18
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 17
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 17
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 15
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 11
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 10
- -1 ribonucleotide triphosphates Chemical class 0.000 claims description 10
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 9
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 8
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 claims description 7
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 claims description 7
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 7
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 6
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 6
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 5
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 claims description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 5
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical group [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 claims description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 5
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 5
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 5
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims description 4
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 claims description 4
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical group C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims description 3
- 150000002431 hydrogen Chemical group 0.000 claims description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Substances N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 claims description 3
- 108020001568 subdomains Proteins 0.000 claims description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 claims description 2
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical group [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 claims 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 24
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 10
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 7
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 5
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 4
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 4
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 3
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 3
- 125000000424 1,2-diol group Chemical group 0.000 description 2
- QLHLYJHNOCILIT-UHFFFAOYSA-N 4-o-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 1-o-[2-[4-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-4-oxobutanoyl]oxyethyl] butanedioate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCC(=O)OCCOC(=O)CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O QLHLYJHNOCILIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 150000003973 alkyl amines Chemical group 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 2
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 2
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- ZWIBGKZDAWNIFC-UHFFFAOYSA-N disuccinimidyl suberate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ZWIBGKZDAWNIFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 2
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 2
- 125000006245 phosphate protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N rGTP Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 2
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033072 DNA replication ATP-dependent helicase DNA2 Human genes 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100034114 DnaJ homolog subfamily C member 14 Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 101000927313 Homo sapiens DNA replication ATP-dependent helicase DNA2 Proteins 0.000 description 1
- 101000870166 Homo sapiens DnaJ homolog subfamily C member 14 Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091027568 Single-stranded nucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003172 anti-dna Effects 0.000 description 1
- 230000009833 antibody interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009831 antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- 238000013142 basic testing Methods 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000005081 chemiluminescent agent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000000464 effect on transcription Effects 0.000 description 1
- 239000005447 environmental material Substances 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108700004787 hepatitis C virus C100 Proteins 0.000 description 1
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical class OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003017 phosphorus Chemical class 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/01—DNA viruses
- G01N2333/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
- G01N2333/04—Varicella-zoster virus
- G01N2333/045—Cytomegalovirus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
DESCRIÇÃO
DA
PATENTE DE INVENÇÃO
N.°. 97.580
REQUERENTE: CHIRON CORPORATION
EPÍGRAFE: SONDAS DE PROTEINA-ACIDO NUCLEICO E IMUNOENSAIOE QUE UTILIZAM AS MESMAS
INVENTORES: Michael S. Urdea, cientista norte americano, residente em 100 Bunce Meadow Road, Alamo, Califórnia 94507, Estados Unidos da América
Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.
de Maio de 1990, nos Estados Unidos da América, sob ο N2. 519.212
INPI. MOD. 113 R F 18732
Titular: CHIRON CORPORATION
Epígrafe: SONDAS DE PROTEÍNA-ACIDO NUCLEICO E IMUNOENSAIOS QUE
UTILIZAM AS MESMAS
MEMÓRIA DESCRITIVA
Campo do invento presente invento relaciona-se de maneira geral com os campos da imunologia e quimica dos ácidos nucleicos. Mais especificamente, relaciona-se com o uso da hibridação de ácidos nucleicos como um meio de amplificar o sinal detectável em imunoensaios.
Antecedentes do invento
As hibridizações de ácidos nucleicos são agora vulgarmente utilizadas na investigação genética, investigação biomédica e diagnóstico clinico, para detectar e quantificar sequências de nucleótidos particulares que estão presentes em misturas heterogéneas de DNA, RNA, e/ou outros materiais. Num ensaio básico de hibridação de ácidos nucleicos, um analisado de ácido nucleico de cadeia simples (ou DNA ou RNA) é hibridizado, directa ou indirectamente a uma sonda de ácido nucleico marcada, e os duplexes que contêm a marcação são quantificados. Foram usados tanto marcadores radioactivos como não radioactivos.
Ao ensaio básico falta sensibilidade. Quando o
ou em analisado está presente num baixo número de cópias concentração diluida, o sinal não pode ser distinguido do ruido do background. Foram desenvolvidas variações do esquema básico para facilitar a separação dos duplexes alvo do material estranho, e/ou para amplificar as sequências de analisado com o objectivo de facilitar a detecçâo, mas estas variações pecam em geral por serem processos complexos e dispende-se muito tempo, por um elevado background, baixa sensibilidade, e dificuldade na quantificação. Para uma discussão geral destas variações ver a patente internacional com o número de publicação 89/03891.
Os imunoensaios são também vulgarmente utilizados na investigação genética, investigação biomédica e diagnóstico clinico para detectar e quantificar epitopos de antigénios particular que estão presentes em amostras heterogéneas de sangue, extractos celulares e outros materiais. Um imunoensaio básico envolve a ligação especifica de um anticorpo, ou monoclonal ou policlonal, a um antigénio alvo, e meios para detectar a reacção. Estes meios foram incorporados em vários ensaios incluindo imunoensaios directos, indirectos, e de sandwich. Contudo, a sensibilidade da detecçâo da interacçâo essencial antigénio/anticorpo apresentou muitos problemas semelhanres aos descritos acima para as hibridizações de ácidos nucleicos.
Várias técnicas, tais como radioimunoensaios, imunoperoxidase e ELISA são presentemente utilizados para imunoensaios. Contudo, os radioimunoensaios são desvantajosos por necessitarem da utilização de reagentes perigosos e prejudiciais ao ambiente e a imunoperoxidase e ELISA pecam pela baixa taxa de
sinal/ruido e estão limitados na amplificação de sinais.
primeiro objectivo do presente invento é fornecer métodos para a amplificação de sinal utilizando moléculas únicas de polinucleótidos, que mostraram ser úteis em ensaios de f
hibridação de ácidos nucleicos, para usar-em imunoensaios. Estas sondas amplificadoras fornecem um ganho altamente reproduzível em sinal, uma taxa sinal-ruido altamente reproduzível, são por si mesmas quantificáveis r reproduzíveis, e são capazes de se combinar especificamente com um analisado de antigénio presente a baixas concentrações, e também com metades de ácidos nucleicos universais registadoras para formar moléculas estáveis.
A patente norte americana de pertença comum da requerente com o número de série 4.868.105, emitida em 19 de Setembro de 1989, cuja descrição se encontra aqui incorporada para referência, descreve um ensaio de hibridação sandwich em fase solução no qual o analisado de ácido nucleico é hibridizado a uma sonda de marcação e a uma sonda de captura. 0 complexo sonda-analisado é acoplado por hibridação a um suporte sólido. Isto permite que o oligonucleótido do analisado seja removido da solução como um complexo de fase sólida, concentrando assim o analisado, facilitando a sua separação de outros reagentes, e incrementando a sua subsequente detecção.
pedido de patente PCT, de pertença comum da requerente, publicação no WO90/13667, publicada a 15 de Novembro de 1990, reivindica sondas polinucleotidicas multiméricas lineares e ramificadas que têm dois dominios, e métodos de utilização dessas sondas como amplificadoras de sinal em ensaios de hibridação de ácidos nucleicos. 0 primeiro dominio é complementar a uma sequência de oligonucleótidos de cadeia simples de interesse, e e segundo dominio compreende uma multiplicidade de sub-unidades oligonucleotidicas de cadeia simples que são complementares a um oligonucleótido de cadeia simples marcado.
pedido de patente PCT, No. PCT/US91/00213, reivindica sondas polinucleotidicas que têm três dominios, e métodos de utilização destas sondas como amplificadoras de sinal em ensaios de hibridação de ácidos nucleicos. 0 primeiro dominio é complementar a uma sequência de oligonucleótidos de cadeia simples de interesse, o segundo dominio é capaz de funcionar como um promotor para a actividade da enzima RNA polimerase dependente de DNA de um fago bacteriano, e o terceiro dominio é capaz de funcionar como um modelo para a transcrição da actividade polimerásica.
Moléculas híbridas de DNA/proteina têm sido usadas como sondas em ensaios de hibridação de ácidos núcleicos em que metade da proteina funciona como um componente marcador (Czichos, J., et al, Nucl. Acids. Res. (1989) 17:1563; patente norte americana com o No. 4.873.187; Patente Norte Americana com o No. 4.737.454.
As moléculas hibridas de DNA/proteina têm sido também utilizadas como sondas em imunoensaios. A Patente Norte Americana
No. 4.692.509 descreve uma sonda hibrida, radioactivamente marcada, compreendendo uma proteina e um oligonucleótido radioactivo ligado covalentemente. A metade radioactiva é usada para indicar a presença da metade da proteina num ensaio biológico. A E.P.A. No 154.884 descreve uma molécula hibrida de DNA/proteina em que a metade da proteina reconhece especificamente uma proteína alvo e a metade de ácido núcleico fornece a função de marcação.
Sumário do invento
Num aspecto, o invento refere-se a uma sonda molecular hibrida de polipéptido/polinucleótido, para ser utilizada como um amplificador dos sinais detectáveis em imunoensaios. Numa configuração a sonda polimerásica compreende três dominios:
(a) um primeiro dominio (A) que é um polipéptido e que funciona como um anticorpo especifico para um antigénio conhecido;
(b) um segundo dominio (B) que é um polidesoxiribonucleótido de cadeia dupla, capaz de funcionar como um promotor para a actividade da enzima RNA polimerase dependente de DNA; e (c) um terceiro dominio (C) que é de cadeia simples ou dupla e adjacente ao segundo dominio, de forma a que o terceiro dominio seja capaz de funcionar como um modelo para a actividade promotora do segundo dominio.
Uma segunda modalidade refere-se a uma sonda molecular hibrida de polipéptido/polinucleótido, para ser utilizada como um amplificador de um sinal detectável em imunoensaios. Esta sonda multimérica compreende dois dominios:
(a) um primeiro dominio (A) que é um polipéptido capaz de funcionar como um anticorpo e que se liga especificamente a um antigénio conhecido;
(b) um segundo dominio (M) compreendendo uma multiplicidade de sub-unidades oligonucleotidicas de cadeia
simples que sao capazes de se ligar específ icamente a uma sequência de ácido núcleico de cadeia simples de interesse; e (c) um meio de conjugar o primeiro e segundo dominios.
Um outro aspecto do invento é um método de amplificar um sinal detectável num imunoensaio através do uso das sondas polimerásicas descritas acima. Este método compreende:
(a) a imobilização do analisado antigénico, directa ou indirectamente, num substrato sólido;
(b) a ligação directa ou indirecta ao analisado de uma primeira sonda molecular compreendendo:
(i) um dominio de ligação (A);
(ii) um segundo dominio (B) que é uma sequência de DNA de cadeia dupla capaz de funcionar como um promotor para a actividade da enzima RNA polimerase dependente de DNA; e (iii) Um terceiro dominio (C) que é de cadeia simples ou dupla e adjacente ao dominio B, de forma a que o terceiro dominio seja capaz de funcionar como um modelo para a actividade promotora do segundo dominio;
(c) remoção da sonda não ligada;
(d) transcrição de múltiplas cópias de oligómeros de RNA que são complementares à sequência modelo, c', do terceiro dominio, C, da sonda construída pela via da actividade da RNA polimerase dependente de DNA; e (e) quantificação dos transcritos.
Um outro aspecto do invento é um outro método para amplificar um sinal detectável num imunoensaio através do uso das sondas multiméricas descritas acima. Este método compreende:
(a) a imobilização do analisado, directa ou 'Ν indirectamente num substrato sólido;
(b) ligação directa ou indirecta ao analisado de uma sonda molecular hibrida compreendendo:
(i) um dominio de ligação (A) que é um polipéptido capaz de funcionar como um anticorpo que se liga especificamente a um antigénio de interesse; e (ii) um segundo dominio (M) compreendendo uma multiplicidade de sub-unidades de oligonucleótidos de DNA de cadeia simples que são capazes de se ligar especificamente a um oligonucleótido marcado de cadeia simples; e (iii) um meio de conjugar o primeiro e segundo domínios;
(c) remoção da sonda não ligada;
(d) hibridaçâo de oligonucleótidos marcados de cadeia simples que compreendem uma sequência nucleotidica que é substancialmente complementar à sequência da sub-unidade do dominio M da sonda, com as sub-unidades do segundo domino;
(e) remoção do oligonucleótido marcado não ligado; e (f) quantificação da quantidade de oligonucleótido marcado ligado à sonda.
Ainda outra configuração é um método de amplificação de um sinal detectável num imunoensaio competitivo que compreende:
(a) construção de uma molécula hibrida em que o dominio A é um polipéptido capaz de funcionar como um hapten, e este dominio é conjugado ou com o dominio B/C da sonda polimerásica ou com o dominio M da sonda multimérica;
(b) imobilização da molécula hibrida, directa ou indirectamente num substrato sólido, na presença de um analisado
competitivo;
(c) remoção da sonda não ligada; e ou (d) transcrição de múltiplas cópias de oligómeros de RNA pela via da actividade da RNA polimerase dependente de DNA e quantificação dos transcritos - isto na circunstância de ser utilizada uma sonda polimerásica; ou (e) hibridizar oligonucleotidos marcados de cadeia simples, às subunidades do dominio M, remover a marcação não ligada e quantificar a marcação ligada - isto na circunstância de ser utilizada uma sonda multimérica.
Breve descrição dos desenhos
A figura IA é uma representação esquemática de uma sonda amplificadora monomérica do tipo polimerase. As letras maiusculas designam os dominios, e as letras minúsculas designam cadeias dentro dos dominios. A letra impressa continua A designa uma cadeia baixa (lida da extremidade 3' para a 5', da esquerda para a direita) . 0 dominio A é um anticorpo que reconhece o epitopo alvo. 0 dominio B é o promotor para a RNA polimerase. A sequência c' é o modelo para a RNA polimerase. A sonda é sintetizada como uma cadeia simples. A sequência AAAAAAA na extremidade da região C representa o linker poli-A adicionado para permitir a auto-hibridação. A região A/T entre o dominio A e B é requerida opcionalmente para reter a totalidade da actividade do anticorpo.
A Figura 1B é a sequência de DNA de uma configuração da sonda amplificadora do tipo polimerásica. 0 dominio do promotor,
B, consiste na sequência de consenso do promotor do bacteriófago
T7 (5'-TAATACGACTCACTATA-3') mais 15 residuos 5' adicionais à 'SJ ;·'.....~ sequência promotora.
A Figura 1C é uma representação esquemática de uma sonda amplificadora multimérica do tipo polimerásica na qual o domínio A funciona como um anticorpo e os dominio B e C de dupla cadeia são auto-hibridizados.
A Figura ID é uma representação esquemática de sondas amplificadoras multiméricas nas quais o dominio A funciona como um anticorpo e o dominio M é compreendido de múltiplas sub-unidades oligoméricas. São descritos multimeros ramificados e combinados.
A Figura 2A é uma representação esquemática de um sistema de imunoensaio sandwich que incorpora a sonda amplificadora do tipo polimerásica. A proteina do analisado é indirectamente imobilizada num substrato sólido através da complexação com um primeiro anticorpo (por exemplo um anticorpo rab (coelho)); e juntada indirectamente à sonda amplificadora através da complexação com um segundo anticorpo ( por exemplo um anticorpo de rato).
A Figura 2B é uma representação esquemática de um sistema de sandwich hibridaçâo/imunoensaio. A proteina analisada é indirectamente imobilizada como descrito acima. 0 segundo anticorpo (de rato anti-analisado) é complexado com uma molécula híbrida de anticorpo/polinucleótido, no qual a metade da proteina funciona como um anticorpo anti-rato e a metade do polinucleótido é complementar à região a' do nucleótido da sonda amplificadora (neste caso uma sonda multimérica).
A Figura 3 descreve o uso dos transcritos da RNA polimerase como moléculas registadoras em imunoensaios. Após se ter formado o complexo sandwich que incorpora a sonda polimerásica, é adicionada RNA polimerase e múltiplos transcritos de RNA (c) complementares à sequência modelo (c') são produzidos. Estas sequências têm dois sub-dominios: cl que é complementar à sonda de captura, imobilizada num substrato sólido; e c2 que é complementar à sonda marcadora. Isto permite a imobilização indirecta da marcação e fácil quantificação do sinal de hibridação do ensaio. designa a marcação incorporada que pode ser radioactiva, quimioluminescente, fluorescente ou enzimâtica.
A Figura 4 (partes A-F) ilustra procedimentos utilizados para fazer multimeros tendo estruturas do tipo pente e/ou bifurcadas.
Descrição Detalhada do Invento
Definições
Um sinal detectável é um indicio transmissível da ocorrência de um evento bioquímico, tal como a hibridação de um ácido nucleico ou a ligação de um antigénio a um anticorpo. Este pedido descreve métodos de amplificação do sinal detectável em imunoensaios.
A RNA polimerase dependente de DNA é uma enzima que facilita a polimerizaçao de RNA de sequências especificas a partir de um modelo de DNA complementar.
Um domínio é uma região particular de uma molécula bioquímica caracterizada pela sua função.
Um epitopo é a porção de uma molécula imunogénica que
é especificamente reconhecida pelo, e se complexa com o seu anticorpo correspondente numa reacção imunológica.
Uma molécula hibrida de nucleótido/péptido compreende tanto resíduos de ácido nucleico como resíduos de aminoácidos, cada um num dominio funcional separado na molécula.
Um imunogénio é uma substância que pode reagir, de uma forma especifica, com um anticorpo.
Uma reacção imunológica é o reconhecimento especifico e ligação de um anticorpo ao epitopo do imunogénio. Um imunoensaio é um método de determinar a presença de um epitopo através da combinação de uma reacção imunológica com um meio para detectar e quantificar a reacção.
Um polidesoxiribonucleótido é uma molécula de DNA polimérica. Um polinucleótido é uma molécula de DNA ou RNA polimérica.
Um promotor é o local num polidesoxiribonucleótido a que se liga a enzima RNA polimerase para preparar a iniciação da transcrição.
A RNA polimerase dependente de RNA é uma enzima que facilita a polimerizaçâo de RNA de sequências especificas, a partir de um modelo de RNA complementar.
A transcrição é um processo, mediado por enzima, pelo qual o RNA é formado a partir de um modelo polinucleótido complementar.
A cadeia a montante de uma molécula de DNA de dupla cadeia é a cadeia cuja extremidade 5' está à esquerda, quando se lê a sequência da esquerda para a direita. A sequência desta cadeia está sempre presente acima da cadeia que lhe é
X complementar, a cadeia baixa, que é lida da extremidade 3' para a 5', da esquerda para a direita.
Modos de realização do invento
I-Sondas de amplificação.
A-Sondas polimerásicas
Um aspecto deste invento é uma sonda de amplificação de DNA (referida como sonda polimerase) contendo três dominios funcionais. Esta sonda é utilizada para incrementar o sinal detectável em imunoensaios.
primeiro dominio (A - Figura IA) é um polipéptido que funciona como um anticorpo com especificidade para o antigénio escolhido. A região funcional do polipéptido é seguida de uma região ou de residuos de aminoácidos ou de residuos de ácidos nucleicos, isto é, uma região espaçadora que não interfere substancialmente com a actividade do anticorpo. A actividade do anticorpo pode ser especifica para um epitopo do próprio analisado; contudo, numa configuração preferida, o anticorpo é direccionado para um determinante antigénico da imunoglobulina particular utilizada no ensaio descrito infra (por exemplo, IgG anti coelho, ou IgG anti humana - ver Figura 2A). Como requerido, o analisado entra em contacto com um anticorpo especifico, o excesso de anticorpo é removido e depois deixa-se a sonda de amplificação reajir com o anticorpo ligado.
Preferencialmente, o analisado é primeiramente imobilizado num substrato sólido para facilitar subsequentes procedimentos de lavagem. Esta imobilização pode ser directa (por exemplo, preparações biológicas contendo o analisado podem ser ligadas a ura filtro de nitrocelulose) ou indirectamente (por exemplo, um anticorpo especifico pode ser imobilizado num substrato sólido e o analisado é subsequentemente ligado ao anticorpo imobilizado).
segundo dominio (B - Figura IA), usualmente com um comprimento de 10 a 40 pares de bases, preferencialmente de 20 a 35 pares de bases, mais preferencialmente de 30 a 35 pares de bases, é de dupla cadeia, e funciona como um promotor de RNA polimerase directa do DNA. Este promotor é usualmente derivado de uma sequência promotora de um fago bacteriano, preferencialmente qualquer um dos fagos T3, T7 ou SP6, mais preferencialmente a partir do bacteriofago T7. Esta classe de RNA polimerases é altamente especifica para o promotor. 0 promotor T7 é provavelmente o melhor caracterizado (Figura 1B). São conhecidas as sequências de DNA de 17 promotores T7 e foi deduzida uma sequência de consenso: 5'-TAATACGACTCACTATA-3' (Oakley e Coleman, Proc. Nat. Acad. Sei. (1977) 74:4266; Dunn e Studier, J. Molec. Biol. (1983) 166:477). As sequências 3' do promotor na cadeia complementar (o segmento c', cuja extremidade 3' é adjacente à extremidade 5' do segmento b'), servem como modelo para transcrição e pode ser realizada a transcrição de muitas variações da sequência modelo (Figura 1B). Só a própria região promotora tem de ser de dupla cadeia (Milligan et al, Nuc. Acids. Res. (1987) 15:8783).
Extensões na extremidade 5' do promotor têm um reduzido efeito na transcrição. Por exemplo, numa configuração preferida, a região B consiste na sequência de consenso do promotor T7, mais as bases adicionais 5' à sequência de consenso, que são idênticas à sequência dos plasmideos pT7 (disponíveis pela US Biochemicals), até ao local de restrição PvuII (Figura 1B). Estas sequências podem ou não ser exteriores.
terceiro dominio (C - Figura IA) tem a direcção 3' para o segundo dominio e a cadeia c' deste dominio serve como modelo para o promotor do dominio B. 0 dominio C tem usualmente 30 a 80 nucleótidos de comprimento, preferencialmente de 35 a 50 nucleótidos, mais preferencialmente de 40 a 45 nucleótidos. Este dominio pode ser de cadeia simples ou dupla. A extremidade 3' da cadeia modelo c' (directamente adjacente ao promotor) é um residuo de citosina e, consequentemente, a usualmente extremidade guanosina.
O produto da transcrição de RNA (c) do dominio C funciona como uma molécula registadora para a presença e quantidade de analisado (Figura 3). A amplificação de sinal 1 4 ocorre porque cada modelo produz de 10 a 10 transcritos. A sequência deste dominio é concebida com sequências aleatórias, avaliadas por análise de computador para minimizar a possibilidade de reacções cruzadas com outras sondas no sistema.
A sequência do dominio C é concebida para detectar esquemas específicos e vários desses esquemas podem ser empregues para quantificar os transcritos. Por exemplo, o produto de transcrição (c) do dominio C pode ser dividido em dois subdominios - c^ e C2 (Figura 3). O sub-dominio cl é complementar a um transcrito da sonda de captura que foi imobilizado num substrato sólido, o sub-dominio C2 é complementar a uma sonda de marcação. Após a hibridação, a quantidade de marcação retida é da cadeia acima é usualmente um residuo de linearmente proporcional à quantidade de analisado presente na amostra original.
Numa configuração alternativa, o trancrito do dominio C tem apenas um único sub-dominio cj. 0 dominio C é transcrito na presença de ribonucleótidos trifosfatados marcados, e o transcrito marcado é subsequentemente ligado a um trancrito de sonda de captura imobilizado através do seu sub-dominio complementar οχ e quantificado.
Ainda noutra configuração, o transcrito do dominio C tem apenas o sub-dominio C2. 0 dominio C é transcrito na presença de ribonucleósidos trifosfatados biotinilados, e os transcritos são capturados em contas de avidina. 0 transcrito é depois hibridizado com uma sonda marcadora, através do seu sub-dominio complementar C2, e quantificado.
Vários outros métodos de marcação e quantificação de transcritos da sonda amplificadora são possíveis, incluindo o uso simultâneo de ribonucleótidos marcados e acoplamento com avidina/biotina, e serão óbvios para os especialistas na técnica.
Os dominios B e C das sondas polimerásicas podem ser preparados por clonagem, montagem enzimática, técnicas quimicas de ligações cruzadas, sintese quimica directa ou combinações destes. Quando preparadas por clonagem, as sequências de ácidos nucleicos que codificam a totalidade dos dominio B/C ou fragmentos destes podem ser feitas na forma de cadeia simples ou dupla por procedimentos convencionais de clonagem.
dominio B é de dupla cadeia, e o dominio C pode ser de cadeia simples ou dupla. Os dominios de dupla cadeia podem ser criados de duas formas; as cadeias podem ser clonadas
separadamente e hibridizadas subsequentemente as cadeias complementares; ou alternativamente, a sonda pode ser cionada como uma cadeia simples, autohibridizando-se o polinucleótido (por exemplo - b' c' c b ). Neste caso, quatro a dez nucleótidos adicionais, preferencialmente 5 a 7 nucleótidos, são adicionados à sequência como um espaçador entre c e c' para permitir um contorno adequado da região da dupla cadeia quando é autohibridizada. 0 espaçador é usualmente poli-A, mas pode ser modificado para minimizar as reacções cruzadas de hibridação entre várias sondas no ensaio.
dominio A pode ser conjugado com os dominios B/C, através de agentes de ligação interposta tais como ácidos nucleicos, aminoácidos, pontes de hidratos de carbono ou poliol, ou através de outros agentes de ligações cruzadas. 0 dominio B/C pode ser sintetizado com um residuo 5' de ácido nucleico que sofreu uma derivação para ter um grupo funcional que fornece um local de ligação para o dominio A, ou o residuo pode sofrer derivação após o oligonucleótido ter sido sintetizado para fornecer tal local. Um procedimento preferido para ligações 4 quimicas cruzadas é incorporar uma base de citosina modificada N na extremidade 5' do polinucleótido, como descrito na pulicação E.P.A., de pertença comum da requerente, com a publicação no 0225807.
Numa configuração mais preferida a conjugação do dominio B/C do DNA com o dominio A do anticorpo pode ser realizada de uma forma análoga à conjugação enzimática. 0 dominio B/C é sintetizado de forma a conter uma metade alquilamina. A alquilamina reage com um agente de ligações cruzadas heterobifuncional tal como o succinimidil 4-(maleimidometil) ciclohexano-l-carboxilato (SMCC). Após a purificação em coluna, o DNA pode reagir especificamente com funções sulfidrilicas (tal como o F(ab')2, ou pode ser modificado de forma a conter sulfidrilo (tal como quando modificado com N-succinimidil 3-(2piridilditio) propionato (SPDP) e depois reduzido). A conjugação directa da amina-DNA e amina-anticorpo também é possível com reagèntes homobifuncionais, mas é tipicamente mais difícil de controlar.
B-Sondas multiméricas
Uma outra configuração do invento, é uma sonda de amplificação de DNA (referida como sonda multimérica) contendo dois domínios funcionais, um primeiro domínio, A, que é o mesmo que o domínio A da sonda polimerásica descrita acima, e um segundo (Μ-Figura ID) que compreende várias subunidades repetitivas. Esta sonda, tal como sonda polimerásica descrita acima, é também utilizada para a amplificação de sinal em imunoensaios.
polinucleótido do dominio M pode ser um polímero linear ou ramificado da mesma sub-unidade repetitiva oligonucleotidica de cadeia simples ou diferentes subunidades oligonucleotidicas de cadeia simples. Estas sub-unidades são capazes de hibridizar especificamente e estavelmente com um nucleótido de cadeia simples de interesse, tipicamente um oligonucleótido marcado ou outro multimero. Estas unidades terão normalmente 15 a 50, preferencialmente de 15 a 30 nucleótidos de comprimento e têm um conteúdo de GC na ordem dos 40 a 60%. O número total de unidades de oligonucleótidos num multimero será geralmente da ordem dos 3 a 50, mais usualmente de 10 a 20. As unidades oligonucleotidicas do multimero podem ser compostas de RNA, DNA, nucleótidos modificados e combinações destes.
As sub-unidades oligonucleotidicas do multimero podem estar ligadas covalentemente em direcção umas ás outras através de pontes fosfodiéster ou através de agentes de ligação interposta, tais como ácidos nucleicos, aminoácidos, pontes de hidratos de carbono ou poliol, ou através de outros agentes de ligação cruzada que são capazes de entrecruzar cadeias de ácidos nucleicos ou de ácidos nucleicos modificados. O(s) sitio(s) de ligação podem ser nas extremidades da sub-unidade (com orientação normal 3'-5' ou com orientação aleatória), e/ou num ou mais nucleótidos internos na cadeia.
Em multimeros lineares as sub-unidades individuais são ligadas extremidade a extremidade de modo a formar um polímero linear. Num tipo de multimero ramificado emanam três ou mais unidades oligonucleotidicas, a partir do ponto de origem para formar uma estrutura ramificada. 0 ponto de origem pode ser outra sub-unidade oligonucleotidica ou uma molécula multifuncional à qual podem ser ligadas covalentemente pelos menos três unidades. Num outro tipo, há uma sub-unidade oligonucleotidica da cadeia principal com uma ou mais sub-unidades oligonucleotidicas pendentes. Este último tipo de multimeros são do tipo garfo, do tipo pente ou uma combinação dos tipo garfo e pente em estrutura. As unidades pendentes dependerão normalmente de nucleótidos modificados ou outra metade orgânica contendo grupos funcionais apropriados com os quais os oligonucleótidos possam ser conjugados ou ligados de outra forma. Ver Figura 1D.
multimero pode ser totalmente linear, totalmente ramificado, ou uma combinação de porções lineares e ramificadas. Preferencialmente haverá, pelo menos, dois pontos de ramificação no multimero, mais preferencialmente pelo menos 15, preferencialmente 15 a 50. 0 multimero pode incluir um ou mais segmentos de sequências de cadeia dupla.
O dominio M pode ser preparado por clonagem (se linear), por preparação enzimática, técnicas quimicas de reacções cruzadas, sintese quimica directa ou combinação destes. Estes métodos de sintese estão totalmente descritos no Pedido de Patente Internacional, de pertença comum da requerente, publicação No. 89/03891, publicado a 5 de Maio de 1989. No caso dos multimeros lineares preparados por clonagem, as sequências de ácido nucleico que codificam a totalidade do multimero ou fragmentos deste podem ser feitas na forma de cadeia simples ou dupla, através de procedimentos convencionais de clonagem. Quando feitos na forma de dupla cadeia, os multimeros/fragmentos são por fim desnaturados para fornecer multimeros/fragmentos de cadeia simples. Os multimeros podem ser clonados na forma de cadeia simples usando um vector fago convencional de cadeia simples tal como ο M13. Os fragmentos podem ser ligados enzimaticamente ou quimicamente para formar o multimero do dominio M. Quando preparadas enzimaticamente, as unidades individuais são ligadas com uma ligase como a ligase DNA T4 ou RNA, conforme o caso. Quando preparadas por entrecruzamento quimico, as unidades individuais podem ser sintetizadas com um ou mais ácidos nucleicos que sofreram uma derivação, de forma a possuirem grupos funcionais que fornecem os locais de ligação, ou derivados após o oligonucleótido ter sido sintetizado para fornecer tais locais.
Um procedimento preferido para o entrecruzamento quimico é 4 incorporar bases de citosina modificadas N nos nucleótidos, como descrito na E.P.A. com o No 225.07, a descrição da qual se encontra aqui incorporada para referência.
Quando preparados por síntese quimica directa, oligonucleótidos contendo ácidos nucleicos derivados ou moléculas multifuncionais equivalentes cujos grupos funcionais estão bloqueados, são feitos por técnicas convencionais de sintese de oligonucleótidos. Os grupos funcionais nao estão bloqueados e as unidades oligonucleotidicas sao sintetizadas a partir do(s)
I local(ais) nao bloqueado(s).
A estrutura genérica para as moléculas usadas para originar pontos de ramificação em multimeros é a seguinte:
r1 - O - R “ X i (!) ά2 em que R é uma metade orgânica, preferencialmente um ácido nucleico, R^ é um grupo hidróxilo protector que pode ser removido em condiçOes que não provoquem a remoção do ácido nucleico sintético de uma fase sólida, e nao removam os grupos protectores de nitrogénio ou fosfato exociclicos, X é um grupo contendo fósforo que facilita a sintese de ácido nucleico, tal como um grupo protector de fosforamidita, fosfonato ou fosfato, Y é um radical derivado de um grupo nucleofilico tal como uma amina, hidróxilo, sulfidrilo ou fosfato protegido, e R é R ou
um grupo protector ou bloqueador que pode ser removido e substituído com hidrogénio sem afectar . Em moléculas usadas
2 para originar ramificações bifurcadas ou tipo-garfo, R e R sao os mesmos; enquanto que, em moléculas usadas para originar ramificações do tipo-pente, R é um grupo bloqueador que é estável na presença de um reagente desbloqueador de R1. A Figura 4 ilustra esquematicamente o procedimento usado para a sintese de multimeros tendo ramos do tipo-pente, ramificações do tipogarfo, ou combinações destes.
A parte A da Figura 4 descreve um esquema de sintese convencional de oligonucleótidos para preparar um oligonucleótido linear, tal como o método automatizado da fosforamidita (Warner et al., DNA (1984) 3:401). O bloco a escuro representa um suporte sólido, N representa um nucleótido e p-N-ORi (Ri é equivalente ao r! abaixo), um convencional derivado de nucleótido tendo grupos protec tore s apropr i ado s.
A parte B mostra o procedimento para fazer o multimero do tipo pente. 0 composto: p-N-OR,^ ι
ι
I R2 representa uma base modificada da fórmula (2) abaixo. Uma unidade oligomérica de tamanho e sequência desejada é sintetizada e deixada no suporte. Uma ou mais bases de citosina modificadas N sao depois incorporadas na cadeia pelo dito procedimento automático. Preferencialmente, a base modificada tem a fórmula:
R3
I ζ
---------------em que Z é um nucleófilo tal como -0-, -NH-, -S-, PC>4=, e -0C-0- '
R é um grupo bloqueante ou protector tal como . um dimetoxitritil (DMT) ou pixil que é geralmente estabilizador de 2 3 bases e sensivel a ãcidos, R é hidrogénio ou metil, R é um grupo protector ou bloqueante que pode ser removido e substituído com hidrogénio çem afectar R1, tal como:
| ch3-c—CH2CH2—c— 0 II H .CH2-CH2'OC- | \<7/S-CH2CH2-O’C- |
| 0-0 | |
| O2N-^^^CH2CH2'O-C- | CH3O-CH2-CH2-O’CH2- |
R é a fosforamidite ou outro derivado de fósforo que permite a adição de nucleOtidos à posição 5' de uma cadeia oligonucleotídica durante a sintese quimica (por exemplo, um fosfodiéster, fosfotriéster, etc.), R é metil, hidrogénio, I, Br ou F, e X é um no inteiro no intervalo de 1 a 8 inclusivé. Quando mais do que uma base modificada é incorporada, elas são preferencialmente espaçadas por bases intermediárias na cadeia, de prefôncia um dimero -TT-. Unidades oligonucleotídicas adicionais podem ser incorporadas na cadeia principal seguindo-se a adição de bases modificadas e assim por diante.
3 grupo nucleófilo N é depois desprotegido (o R é removido) e são geradas a partir dele unidades oligonucleotídicas 1 adicionais pelo procedimento automático. Grupos residuais R na terminação da cadeia são removidos, e o multimero ramificado do tipo-pente é quebrado a partir do suporte.
A parte C da Figura 4 descreve o procedimento geral para a produção de multimeros do tipo-pente. Mais uma vez, uma unidade oligomérica de tamanho e sequência desejada é sintetizada por técnicas convencionais e deixada no suporte. Um grupo bloqueado, bifuncional contendo fósforo (representado como XP na parte C), tal como uma fosforamidite bloqueada, é depois incorporado na cadeia por procedimento automático. Grupos preferidos bifuncionais contendo fósforo são fosforamiditas bloqueadas da fórmula
R - 0 - ch2 N(iPr)2
H - C - 0 - P
R - 0 - Íh2 OR1
em que R é o dito grupo hidróxilo protector, iPr é isopropil, e R^é metil ou beta-cianoetil. Mais preferencialmente
R é DMT e r! é beta-cianoetil.
Alternativamente, pode ser usada a base de citosina 4 modificada N em que Ri=R2 (por exemplo DMT).
Os dois grupos protectores são depois removidos e são geradas a partir deles unidades oligonucleotidicas pelo procedimento automático. Os grupos residuais R^ são removidos e o multimero bifurcado é quebrado a partir do suporte.
As partes D e E descrevem procedimentos em que dois ou mais multimeros bifurcados, multimeros do tipo-pente ou combinaçOes destes são conjuntamente cortados enzimaticamente ou quimicamente. Geralmente, os multimeros bifurcados e/ou do tipopente são preparados como acima e removidos do suporte. São depois combinados em solução usando procedimentos de ligação enzimáticos ou quimicos descritos acima.
A parte F mostra o procedimento para sintetizar um multimero múltiplo do tipo pente. Este procedimento é uma variação do procedimento ilustrado na parte B e envolve a incorporação de bases modificadas nas cadeias laterais dependentes e a criação de cadeias laterais secundárias de oligonucleótidos a partir delas.
Moléculas linker apropriadas para a clivagem podem ser incorporadas' nos multimeros, em locais pré-determinados, com o propósito de analizar a estrura do multimero ou como um meio para libertar segmentos pré-determinados (tal como a porção do multimero que se liga ao oligonucleótido marcado).
t
Subsequentemente à sintese e purificação do multimero estes linkers podem ser quebrados especificamente sem degradação adicional da estrutura de nucleótidos do multimero. Uma molécula linker do tipo preferido foi concebida para conter um grupo 1,2-diol (que pode ser quebrado selectivamente por periodatos), bem como um grupo hidróxilo protegido derivado de hidróxilo e fosforamidite para permitir que o linker seja incorporado em qualquer fragmento de DNA através de protocolos Standard da quimica da fosforamidite. Uma configuração preferida de um tal linker é o composto:
dmt-o-ch2ch2-ns ,CH, ^C\
ÇH’
I
CH, \ J
O-ft .N(iPr) < X
OCHi em que DMT e iPr estão definidos como previamente. Após a incorporação num fragmento de DNA e desprotecçâo completa, o fragmento contendo o linker tem a seguinte estrutura:
jj Λ
5'-H0-s' [DN*, \
COCH I
OH OH \ z çhco
NCH2CH2O-J-O-s’ (DNAj)j—OH em que DNAj e DNA2 representam sub-fragmentos de DNA que podem ser os mesmos ou diferentes. A reacção deste fragmento com periodato de sódio quebra o fragmento nos seguintes subC\ Ϊ ,NCH2CH20^*0-5'(DNA2] j'-0H 0 fragmentos: j
HO-1' (DNAJ 3-OP’OCH2CH2N 0 coc
OCO
Alternativamente, ο grupo 1,2-diol pode ser substituído por grupos linker que contêm uma ligação sensivel hidroxilamina, uma ligação sulfona sensivel à base, ou uma ligação disulfito sensivel ao tiol. Tais grupos linker podem ser derivados a partir de agentes convencionais de entrecruzamentos que são usados para conjugar proteínas com outras entidades. Da mesma forma podem ser usados outros grupos protectores que não o DMT.
Os aspectos funcionais da sonda polimerase podem ser combinados com a estrura da sonda multimérica através da sintese de uma sonda multimérica tendo um dominio M com sub-unidades compreendendo múltiplos dos dominios (B/C) do promotor/modelo da sonda polimerásica. Tal como as sondas multiméricas, as subunidades multiméricas podem ter um arranjo linear ou serem moléculas ramificadas.
Tal como nas sondas polimerásicas, o dominio A das sondas multiméricas pode ser conjugado com o dominio B através de agentes de ligação interposta tal com um ácido nucleico, um aminoácido, um hidrato de carbono ou pontes poliol, ou através de outros agentes de entrecruzamento. 0 dominio M pode ser sintetisado com um residuo de ácido nucleico 5' que sofreu um processo de derivação para ter um grupo funcional que fornece um local de ligação para o dominio A, ou o residuo pode sofrer a derivação após o oligonucleótido ter sido sintetizado de forma fornecer tal local. Um procedimento preferido para a
o citosina entrecruzamento quimico é incorporar uma base de 4 modificada N na extremidade 5' do polinucleótido como descrito nas vulgares publicações E.P.A. No 0225807 e na secção I(A),
Ί '‘S acima.
II-Imunoensaios
Um outro aspecto deste invento é a utilização de sondas amplificadoras em imunoensaios para detectar e quantificar a presença e concentração de analisado imunológico. Estas sondas amplificadoras são de duas classes: as sondas híbridas descritas na secção I acima (tanto as sondas polimerásicas como as multiméricas); ou as sondas polinucleotidicas descritas na Patentes Nortes Americanas com o Nos. de série 463.022 e 340.031.
Estas sondas são semelhantes às sondas híbridas, mas os dominios A compreendem uma sequência polinucleotidica em vez de um polipéptido.
analisado pode ser qualquer imunogénio conhecido de interesse. O analisado pode estar presente em baixas concentrações numa amostra preparada ou pode ser uma espécie minoritária numa mistura heterogénea de material biológico. 0 analisado pode estar presente numa variadade de fontes, por exemplo, fluidos biológicos ou tecidos, material alimentar, matérias ambientais, etc., ou pode ser sintetizado in vitro.
Numa primeira etapa, a amostra contendo o analisado é preparada por qualquer uma das variedades de métodos conhecidos pelos especialistas nesta técnica.
As sondas amplificadoras podem ser utilizadas para detectar um analisado em muitos protocolos de imunoensaios realizados ou em solução ou imobilizados numa fase sólida. Se o imunoensaio é realizado em solução, a amostra contendo o analisado pode estar ou ligada directamente à sonda amplificadora; indirectamente através de um ou mais anticorpos 'Ã específicos para o analisado; ou, se é utilizada um sonda polinucleotidica, em conjunção com uma molécula linker hibrida (discutida na secção II(B), a seguir). As sondas amplificadoras podem ser utilizadas desta forma na maioria dos protocolos de imunoensaios em solução. Ver, por exemplo, a Patente Norte
Americana com o No. 4.778.751.
Num imunoensaio que utilize uma fase sólida, o analisado (que pode ser um antigénio ou um anticorpo) ou é imobilizado directamente numa fase sólida; ou indirectamente através da ligação do analisado a um primeiro anticorpo que foi primeiramente ligado a uma fase sólida; ou por um ensaio sandwich (Figura 2A) no qual um segundo anticorpo reconhece o analisado e depois é reconhecido pelo primeiro anticorpo ligado à fase sólida.
Se o analisado vai ser directamente ligado à fase sólida, a amostra que contém o analisado é posta em contacto com um filtro de nitrocelulose ou meios semelhantes para não se ligar selectivamente às proteínas. Se o analisado é para ser ligado indirecta e selectivamente a uma fase sólida, um primeiro anticorpo, dirigido para um epitopo do analisado ou para um segundo anticorpo, é conjugado com a fase sólida e subsequentemente usado para ligar o analisado ou um segundo anticorpo ligado ao analisado.
A - Utilizando sondas hibridas
Um anticorpo adicional, dirigido para um segundo epitopo do analisado pode então ser usado como um linker entre o analisado e a sonda amplificadora. A sonda amplificadora, ou uma 'Ύ
sonda polimerásica ou uma sonda multimérica, cujo dominio A está dirigido para o segundo anticorpo, pode depois ser conjugada com o anticorpo linker, formando uma corda que consiste no primeiro anticorpo ligado à fase sólida, um segundo anticorpo, o analisado, o anticorpo linker, e a sonda amplificadora (Figura 2A).
B -Utilizando sondas polinucleotidicas
Numa configuração alternativa, a sonda amplificadora é uma das sondas polinucleotidicas multiméricas descritas na publicação internacional no 89/03891. Estas sondas diferem das sondas multiméricas hibridas péptido/nucleótido do presente pedido na medida em que o dominio A é uma sequência polinucleotidica e não um polipéptido funcionando como anticorpo. Consequentemente, tem que ser utilizado um linker hibrido anticorpo/polinucleótido para juntar indirectamente o analisado à sonda amplificadora (Figura 2B). Este linker hibrido tem um primeiro dominio, que é um polipéptido que funciona como anticorpo especifico para um epitopo do analisado ou um epitopo de um anticorpo que reconhece o analisado; e um segundo dominio que é uma sequência nucleotidica substancialmente complementar à sequência nucleotidica do dominio A da sonda amplificadora.
Da mesma forma, numa configuração alternativa, pode ser usada uma das sondas polimerásicas polinucleotidicas descritas no
Pedido de Patente Norte Americano com o No de série 463.022.
Estas sondas diferem das sondas polimerásicas hibridas do presente pedido na medida em que o dominio A é uma sequência polinucleotidica em vez de um polipéptido a funcionar como
X).
anticorpo. Estas sondas também requerem o uso de um linker hibrido como descrito acima.
Através do uso de uma sonda amplificadora polinucleotidica e um linker hibrido em vez das sondas amplificadoras descritas na secção I, acima, a sonda amplificadora pode ser um reagente universal, útil tanto para os ensaios de hibridação de ácidos nucleicos como para os imunoensaios.
C - Condições de hibridação e de ligação
Numa configuração preferida, o analisado é indirectamente imobilizado numa fase sólida, por exemplo uma placa de cúpulas 96 de cloreto de polivinilo (PVC). No ensaio sandwich descrito na Figura 2A, foram adicionados 50 μΐ do primeiro anticorpo (anti coelho a uma concentração de 20 μρ/πιΐ em NaHCO3 0,2 M) à cúpula. A cúpula é coberta e incubada por 2 horas à temperatura ambiente numa atmosfera humidificada. A solução é depois aspirada da cúpula. A cúpula é depois lavada duas vezes com tampão bloqueante contendo albumina de soro bovino, 3% em solução salina de tampão fosfato contendo azida de sódio 0,02%. A cúpula é de seguida incubada em tampão bloqueante durante 20 minutos à temperatura ambiente numa atmosfera humidificada e depois lavada mais duas vezes com o tampão bloqueante.
São adicionados 50 μΐ do segundo anticorpo (analisado anti-coelho também a uma concentração de 20 μg/ml) à cúpula e o procedimento descrito acima é repetido. De seguida são preparadas as séries de diluições do analisado, em tampão bloqueante. São adicionados 50 μΐ de cada diluição a uma cúpula. A placa é coberta e levada a incubar durante duas horas à temperatura ambiente numa atmosfera humidificada. A seguir a esta incubação, as cúpulas são lavadas quatro vezes com o tampão bloqueante. 0 terceiro anticorpo (analisado anti rato) é de seguida adicionado da mesma forma, seguindo-se a adição da sonda amplificadora hibrida. Dado que preparações de tecidos ocasionais podem conter anticorpos anti DNA, o tampão bloqueante, utilizado para as lavagens que seguem a adição da sonda, também contém DNA de esperma de salmão 20 μg/ml.
Quando são usadas sondas amplificadoras polinucleotidicas ou sondas multiméricas híbridas , a etapa de hibridação de ácidos nucleicos é seguida da complexaçâo do analisado e anticorpos. Usualmente, as condições de hibridação consistem num meio aquoso, preferencialmente um meio aquoso tamponado, o qual inclui vários aditivos. Estes aditivos podem incluir os polinucleótidos a serem hibridizados, sais (por exemplo, citrato de sódio de 0,017M a 0,17M e/ou cloreto de sódio de 0,17M a 1,7M), detergentes não iónicos tal como o NP-40 ou Triton x-100 (0,1 a 1%) que não interferem com o complexo antigénio/anticorpo, e ácidos nucleios de transporte. A mistura foi a incubar durante 15 a 75 minutos e a uma temperatura que variou de 35° a 55°C.
Se as condições utilizadas para a hibridação dos nucleótidos marcados com as subunidades multiméricas causam instabilidade nos complexos antigénio/anticorpo, a etapa de hibridação pode ser precedida pelo tratamento do complexo com uma proteina de entrecruzamento tal como o gluteraldeido, ou um método similar de estabilizar o complexo. Uma vez estabilizado o
complexo proteico, as condições para a hibridação do ácido nucleico podem ser alteradas de forma a incluir SDS (até 1%); solventes não aquosos tais como a dimetilformamida, dimetilsulfóxido, e formamida; e temperaturas até 70°C.
E importante ajustar as condições de hibridação de ácidos nucleicos para manter a estabilidade dos complexos antigénio/anticorpo. Por exemplo, a hibridação de pequenos pedaços de sequências complementares pode ser conseguida a baixas temperaturas. Numa configuração preferida, as regiões complementares de cadeia simples têm 12 a 20 bases. Numa configuração preferida, a temperatura de hibridação é de 35 a 40°C. Além disso, dado que os únicos oligonucleótidos de cadeia simples presentes nesta etapa são as cadeias complementares, pode ser tolerada uma elevada rigidez e consequentemente baixas concentrações de sais (0,3 M Na).
1-Sonda multimêrica
Se é utilizada uma sonda multimêrica, o oligonucleótido marcado que é substancialmente complementar ao polinucleótido repetitivo do domínio M, é subsequentemente adicionado sob condições que permitem que ele seja hibridizado com as unidades oligonucleotidicas complementares do multimero. 0 resultante complexo de ácido nucleico marcado de fase sólida é depois separado do excesso de oligonucleótido marcado, através de lavagens, para remover oligonucleótidos marcados não ligados, e lido.
A amplificação pode ser multiplicada através do uso de mais do que tuna espécie de multimeros (como definido pela
sequência da sub-unidade) no ensaio. Nestas circunstâncias, é concebido um segundo multimero para se ligar à sequência repetitiva do primeiro multimero e o complexo é subsequentemente marcado com um oligonucleótido que é substancialmente complementar à sequência repetitiva do segundo multimero. Qualquer número de multimeros pode ser ligado em séries de forma a conseguir ainda uma maior amplificação.
2-Sonda polimerásica
Se é utilizada uma sonda polimerásica, a RNA polimerase especifica para a região do promotor (dominio B) da sonda amplificadora é depois adicionada sob as condições de transcrição apropriadas e são produzidas múltiplas cópias de RNA (c) do modelo do dominio C (c’). A quantidade de transcrito é proporcional à quantidade de analisado na preparação inicial.
As condições de transcrição consistem num meio aquoso, de preferência um meio aquoso tamponado, com sais apropriados, usualmente incluindo sal de magnésio, rATP, rUTP, rGTP, rCTP, uma enzima RNA polimerase e usualmente inclui vários agentes desnaturantes, transportadores proteicos e inibidores da RNAase. A incubação é usualmente durante 15 a 90 minutos, usualmente 60 minutos; e a uma temperatura que é óptima para a enzima escolhida, usualmente de 35°C a 42°C, usualmente 37°C.
A sequência do dominio C é concebida para um esquema de detecção especifico e vários de tais esquemas podem ser utilizados para quantificar os transcritos. Por exemplo, o produto da transcrição (c) do dominio C pode ser sub-dividido em 2 sub-dominios - οχ e C2 (Figura 2B). O sub-dominio σχ é
complementar a uma sonda de captura de transcrito que foi imobilizada num substrato sólido. 0 sub-dominio C2 é complementar à sonda marcada. Após a hibridação, a quantidade de marcação retida é linearmente proporcional à quantidade de analisado presente na amostra original.
Numa configuração alternativa , o transcrito do dominio C tem apenas o sub-dominio cj. 0 dominio C é transcrito na presença de ribonucleótidos trifosfatados marcados, e o transcrito marcado é subsequentemente ligado a uma sonda de captura de trancrito imobilizada através do seu sub-dominio complementar c^ e quantificada.
Ainda noutra configuração, o transcrito do dominio C tem apenas o sub-dominio 02. 0 dominio C é transcrito na presença de ribonucleósidos trifosfatados biotinilados e o transcrito é capturado em contas de avidina. O transcrito é depois hibridizado a uma sonda marcada através do seu sub-dominio complementar C2 e quantificado.
São possíveis muitos outros métodos de marcação e detecçâo de trancritos da sonda amplificadora, incluindo o uso simultâneo de ribonucleótidos marcados e acoplamento avidina/biotina, e serão óbvios para os especialistas nesta técnica.
3-ConsideraçOes gerais
A fase sólida que é usada no ensaio pode ser em partículas ou ser a superfície sólida da parede de qualquer recipiente, por exemplo, tubos de centrífuga, colunas, placas de cúpulas de microtitulação, filtros, tubos, etc.
Preferencialmente, as particulas a serem utilizadas serão de um tamanho entre 0,4 e 200 microns, mais usualmente de 0,8 a 4,0 microns. As particulas podem ser de qualquer material conveniente, tal como latex ou vidro. O primeiro anticorpo especifico para o analisado, ou para um segundo anticorpo que é especifico para o analisado, pode estar estavelmente ligado à superficie sólida através de grupos funcionais por procedimentos conhecidos.
As sondas marcadas, se forem utilizadas sondas polimerásicas, incluirão sequências complementares ao subdominio C2 dos transcritos da sonda amplificadora; e se forem utilizadas sondas multiméricas, as sondas marcadas incluirão sequências complementares às unidades repetitivas do dominio Β. A sonda marcada incluirá uma ou mais moléculas (marcações), que fornecerão directa ou indirectamente um sinal detectável. As marcações podem se ligar a membros individuais da sequência complementar, ou podem estar presentes como membros terminais ou caudas terminais tendo uma multiplicidade de marcações. Foram registados na literatura vários meios para fornecer marcações ligadas à sequência. Ver, por exemplo, Urdea et al., Nucl. Acids. Res. (1988) 16:4937, Leary et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1983) 80:4045; Renz and Kurz, Nucl. Acids. Res. (1984) 12:3435; Richardson and Gumport, Nucl. Acids. Res. (1983) 11:6167; Smith et al., Nucl. Acids. Res. (1985) 13:2399; Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem. (1984) 138:267. As marcações podem se ligar ou covalentemente ou não covalentemente à sequência complementar. As marcações que podem ser utilizadas incluem radionuclideos, fluorescentes, quimioluminescentes, corantes, enzimas, substratos
*4 enzimáticos, cofactores enzimáticos, inibidores enzimáticos, subunidades enzimáticas, iões metálicos, e semelhantes. Marcações especificas ilustrativas incluem fluoresceina, rodamina, vermelho do Texas, ficoeritrina, umbeliferona, luminol, NADPH, galactosidase, peroxidase de rábano bastardo, etc. Ver Urdea et al para uma comparação com os métodos de marcação sem radioisótopos.
As sondas marcadas podem ser preparadas de forma conveniente por sinteses quimicas tais como as descritas na publicação E.P.A. no 225807, de pertença da requerente. Através do fornecimento de um grupo terminal que tem uma funcionalidade conveniente, várias marcações podem ser agrupadas pela sua funcionalidade. Assim, podem fornecer-se diversas funcionalidades como carboxi, tiol, amina, hidrazina ou outra funcionalidade às quais as várias marcações se podem juntar sem afectar prejudicialmente a formação de duplexes com a sequência. Como já foi indicado, pode ter-se uma molécula com uma pluralidade de marcações agrupadas na sequência complementar à sequência marcadora. Alternativamente, pode ter-se um ligando ligado à sequência marcadora e usar um receptor marcado para se ligar ao ligando para fornecer o complexo do analisado marcado.
Dependendo da natureza da marcação, podem ser usadas várias técnicas para detectar a presença de marcação. Para fluorescentes, estão disponíveis um grande número de fluorómetros. Com enzimas, pode ser fornecido tanto um produto fluorescente como um colorido, e determinados fluorometricamente, espectofotometricamente ou visualmente. As várias marcações que foram utilizadas em imunoensaios e as técnicas aplicáveis a imunoensaios podem ser utilizadas com os ensaios referidos.
procedimento utilizado nas estapas de separação do ensaio irá variar dependendo da natureza da fase sólida. Para partículas, a centrifugação ou filtração permitiram a separação das partículas, desprezando o sobrenadante ou isolando o sobrenadante. Quando as partículas são ensaiadas, as partículas serão completamente lavadas no local do ensaio, usualmente de uma a cinco vezes, com um meio tamponizado apropriado contendo detergente, por exemplo, PBS com SDS. Quando o meio de separação é uma parede ou suporte, o sobrenadante pode ser isolado ou desprezado e a parede é lavada da mesma forma que a indicada para as partículas.
D-Imunoensaios competitivos
As sondas amplificadoras hibridas do invento em questão podem também ser utilizadas como um meio para marcar antigénios em imunoensaios competitivos. No ensaio tipico, excesso de anticorpo, policlonal ou monoclonal, preferencialmente monoclonal, que se liga especificamente ao analisado, é imobilizado numa fase sólida, usualmente numa placa de cúpulas múltiplas. Uma concentração padrão de antigénio marcado é misturada com uma série de diluições da amostra que se supõe conter uma quantidade desconhecida de analisado. As diluições separadas são depois expostas ao anticorpo imobilizado e é medida a quantidade de marcação ligada. A capacidade do analisado não marcado de competir com o analisado marcado é usada para calcular a quantidade de analisado na amostra.
Numa configuração, uma metade do polinucleótido do dominio B/C da sonda polimerásica é conjugado com um imunogénio competitivo. Esta molécula hibrida é depois usada como o antigénio marcador descrito acima. Após a ligação competitiva, a polimerase (especifica para o dominio B do promotor) é adicionada e o produto da transcrição é ensaiado como descrito na secção I(A), acima.
Numa outra configuração, uma metade do polinucleótido do dominio M da sonda multimérica é conjugada com um imunogénio competitivo. Esta molécula hibrida é depois usada como o antigénio marcador descrito acima. Após a ligação competitiva, o dominio M é marcado e quantificado como descrito acima.
Para que o imunogénio se junte ao DNA, a utilização de reagentes homobifuncionais tais como o disuccinimidil suberato (DSS), etileno glicol bis(succinimidilsuccinato) (EGS), ou pfenileno diisotiocianato (DITC), são provavelmente métodos de acoplamento mais úteis do que os descritos na secção I(A), acima.
Kits para realizar os imunoensaios de amplificação de acordo com o invento compreenderão, numa combinação empacotada, os seguintes reagentes: uma fase sólida que é capaz ou de se ligar ao analisado antigénio ou, alternativamente, tem ligado a si um primeiro anticorpo de ligação se o formato do ensaio é aquele em que o analisado é indirectamente ligado à fase sólida através de um primeiro anticorpo ligado ou através de um segundo anticorpo; opcionalmente um segundo linker e terceiros anticorpos que são específicos para o analisado, e uma sonda linker hibrida se o formato do ensaio é aquele em que se utiliza uma sonda amplificadora polinucleotidica; a sonda amplificadora; a apropriada RNA polimerase feita directamente de (
DNA e sondas de captura de transcritos imobilizados (se é utilizada uma sonda amplificadora polimerásica). Estes reagentes estarão tipicamente em recipientes separados no kit. 0 kit pode também incluir tampões de hibridação, soluções de lavagem, controlos negativos e positivos e instruções escritas para realizar o ensaio.
Os exemplos que se seguem estão apresentados como ilustrações, não limitações, do presente invento. Outras configurações dentro do espirito e campo do invento surgirão para os especialistas destas técnicas.
Exemplo 1 - Imunoensaios para a presença de antigénio
HCV em soro humano
Este ensaio está concebido para detectar directamente a presença do antigénio C-100 do virus da Hepatite C. 0 protocolo geral para este imunoensaio está descrito acima. São preparadas placas de microtitulaçâo utilizando rato-anti-cabra como o primeiro anticorpo. Este anticorpo é imobilizado nas cúpulas da placa de cúpulas de microtitulaçâo 96. 0 segundo anticorpo é um anticorpo monoclonal de rato especifico para um epitopo do C-100 do HCV. Diluições em duplicado do soro de indivíduos a serem visualizados para o HCV são preparadas em tampão bloqueante e incubadas em cúpulas de microtitulaçâo juntamente com os controlos não infectados apropriados. 0 terceiro anticorpo é uma combinação de anticorpos policlonais de coelho que reconhecem cada um dos antigénios do HCV. 0 anticorpo final é uma sonda hibrida amplificadora de polimerase T7. A metade polipeptidica do dominio A funciona como um anticorpo coelho-anti-cabra e completa 1...... .—------- . ..zl/''·.
^S 7 o imunoensaio sandwish.
Após a adição da sonda polimerásica T7, a transcrição do dominio C é efectuada através da incubação do complexo em 20 μΐ de uma solução contendo Tris HCl 40 Mm (pH 8), MgCl2 20 mM, NaCl 10 mM, Espermidina 1 mM, ditiotreitol 10 mM, albumina de soro bovino 0,15 mg/ml, rATP, rCTP, rGTP, rUTP cada a 1,25 mM, RNasin 1600 unidades/ml, e RNA polimerase T7, 2000 unidades/ml. A mistura é incubada a 37°C durante uma hora. A transcrição termina com a adição de 20 μΐ de uma solução contendo 8xSSC e SDS 2% e toda a mistura é transferida para novas cúpulas contendo uma sonda de captura imobilizada com as sequências C]/. A captura dos transcritos do dominio C (Figura 3) é efectuada através da incubação a 55°C durante uma hora seguida por duas lavagens com 0,lxSSC, SDS 0,1%.
Os transcritos do dominio C são depois marcados pela adição de 50 fmoles de sonda de enzima marcada (C2f) em 40 μΐ de 4xSSC, poli A 100μg/ml durante 15 minutos a 55°C. Finalmente o complexo foi lavado duas vezes com 0,lxSSC, SDS 0,1%, seguindo-se duas lavagens com 0,lxSSC.
Para a detecção AP, é utilizada uma reacção de dioxetano dirigido para o enzima (Schapp et al. (1987) Tet. Lett. 28:1159-1162, e Patente Norte Americana com o No. 4.857.652), obtida a partir da Lumigen Inc. 0 procedimento de detecção é o que se segue. Para a etapa de marcação são adicionados 20 μΐ de tampão HM com a sonda AP a cada cúpula e as cúpulas são incubadas a 55°C durante 15 minutos. 0 sobrenadante é removido e as cúpulas são depois lavadas duas vezes com 380 μΐ de 0,lxSSC e SDS 0,1%. As cúpulas são depois lavadas duas vezes com 380 μΐ de 0,lxSCC para remover o SDS restante. São adicionados a cada cúpula 20 μΐ -4 de dioxetano 3,3x10 M em tampão CTAB. As cúpulas são batidas levemente de forma a que o reagente caia para o fundo e se espalhe gentilmente para distribuir o reagente ao longo de todo o fundo. As cúpulas são cobertas com o selador de placas de microtitulação e incubadas num forno a 37°C durante uma hora. As cúpulas são depois lidas num luminómetro, e quantificadas relativamente a uma curva padrão feita com quantidades conhecidas de antigénio.
Exemplo 2 - Imunoensaio para a presença de anticorpo para o HCV em soro humano
As placas de microtitulação são primeiramente cobertas com o antigénio C-100 de HCV do virus da hepatite C. E preparada uma solução contendo tampão de cobertura (borato de Na 50 mM, pH 9,0), 21 ml/placa, BSA (25 μg/ml), HCV C-100 (2,50 μg/ml), imediatamente antes da adição. Após misturar durante 5 minutos, são adicionados 0,2 ml/cúpula de solução às placas, são cobertas e incubadas durante 2 horas a 37°C, após as quais a solução é removida por aspiração. As cúpulas são lavadas uma vez com 0,4 ml de tampão de lavagem (fosfato de Na lOOmM, pH 7,4, NaCl 140 mM, caseína 0,1%, Triton X-100 1% (p/v), hibitano 0,01% (p/v)). Após remover a solução de lavagem, são adicionados 200μ1/ούρηΐ3 de solução Postcoat (fosfato de Na lOmM, pH 7,2, NaCl 150 mM, caseina 0,1% (p/v), sucrose 3% e fenilmetilsulfonilflureto (PMSF) 2mM, as placas são cobertas levemente para prevenir a evaporação, e permanecem à temperatura ambiente durante 30 minutos. As cúpulas são depois aspiradas para remover a solução, e secas por liofilizaçâo ao longo da noite, sem prateleira de aquecimento.
Para realizar o imunoensaio, são adicionados 20 μΐ de duplicados de diluições das amostras de soro ou controlos, às cúpulas contendo 20 μΐ de diluente de amostra (fosfato de Na 100 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, caseina 0,1% (p/v), hibitano 0,01% (p/v), Triton X-100 1% (p/v), extrato de levedura 100 μg/ml). As placas são seladas, e incubadas a 37°C durante 2 horas, após as quais a solução é removida por aspiração, e as cúpulas são lavadas 3 vezes com 400 μΐ de tampão de lavagem (PBS contendo Tween 20 0,05%).
Subsequentemente à adição das amostras de soro, as cúpulas são tratadas como no Exemplo 1, acima, com a excepção de que o soro de coelho anti humano é substituido pelo terceiro anticorpo (coelho anti-analisado).
Exemplo 3 - Uso de sondas multiméricas na detecção da infecção por HCV
Em qualquer um dos dois exemplos acima, as sondas multiméricas podem ser substituídas por sondas polimerásicas. Todas as etapas são as mesmas de cada exemplo até à adição da sonda amplificadora, com a exepçâo óbvia de que é usada uma sonda multimérica em vez de uma sonda polimerásica. Subsequentemente à ligação da sonda amplificadora, é adicionada uma solução com 50 fmoles de uma sequência de oligonucleótidos marcados com homologia substancial para a subunidade multimérica do dominio M. Esta sonda enzimática marcada foi adicionada em 40 μΐ de 4xSSC, poli A 100μg/ml durante 15 minutos a 55°C. Pinalmente o complexo foi lavado duas vezes com 0,lxSSC, SDS 0,1%, seguindo-se duas
lavagens com 0,lxSSC.
Para a detecção AP, é utilizada uma reaçcâo de dioxetano dirigido para o enzima (Schapp et al. (1987) Tet. Lett.
28; 1159-1162 e Patente Norte Americana com o No. 4.857.652), obtida a partir da Lumigen Inc. 0 procedimento de detecção é o que se segue. Para a etapa de marcação são adicionados 20 μΐ de tampão HM com a sonda AP a cada cúpula e as cúpulas são incubadas a 55°C durante 15 minutos. 0 sobrenadante é removido e as cúpulas são depois lavadas duas vezes com 380 μΐ de 0,lxSSC e SDS 0,1%.
As cúpulas são depois lavadas duas vezes com 380 μΐ de 0,lxSCC para remover o SDS restante. São adicionados a cada cúpula 20 μΐ -4 de dioxetano 3,3x10 M em tampão CTAB. As cúpulas são batidas levemente de forma a que o reagente caia para o fundo e se espalhe gentilmente para distribuir o reagente ao longo de todo o fundo. As cúpulas são cobertas com o selador de placas de microtitulação e incubadas num forno a 37°C durante uma hora. As cúpulas são depois lidas num luminómetro, e quantificadas relativamente a uma curva padrão feita com quantidades conhecidas de antigénio.
Exemplo 4_ Uso de_sondas_polimerásicas polinucleotidicas na detecção de infecção por HCV
Em ambos os Exemplos 1 e 2 acima, as sondas polimerásicas polinucleotidicas podem ser substituídas pelas sondas polimerásicas hibridas. Todas as etapas são as mesmas em cada exemplo até à adiçaõ do terceiro anticorpo que é uma combinação de anticorpos policlonais de coelho que reconhecem cada antigénio do HCV. Isto é seguido da adição de 50 μΐ de uma **'****». η Γ~ «*£5ΖΣΓ
X molécula linker hibrida a uma concentração de 20 gg/ml em NaHC03 0,2 M. Esta incubação é conduzida de acordo com os mesmos protocolos de todas as incubações de anticorpos anteriores. A molécula linker hibrida tem um primeiro dominio que funciona como um anti-corpo anti-coelho e se liga com todos os terceiros anticorpos de coelho ligados anteriormente. O segundo dominio do linker hibrido é um oligonucleótido com 15 residuos, a sequência dos quais é substancialmente complementar ao dominio A da sonda polimerásica polinucleotidica. Após a incubação e lavagem, a sonda polimerásica é adicionada em 50 μΐ de tampão de hibridação (NaCl 0,3 Μ, NP-40 0,1%) e incubada durante 60 minutos a 40 °C. Após a incubação, o excesso de sonda é removido e o complexo é lavado 3 vezes com o tampão de hibridação. O dominio B é transcrito e o transcrito é quantificado como descrito no Exemplo 1.
Exemplo 5 - Uso de sondas multiméricas polinucleotidicas na detecção de infecções por HCV
Este ensaio é idêntico ao descrito no Exemplo 4, até à adição da sonda polinucleotidica. A subsequente hibridação da marcação com as sub-unidades do dominio M e quantificação da marcação são as mesmas que no Exemplo 3.
Exemplo 6 - Uso de sondas multiméricas polinucleotidicas na detecção de IgG humana imobilizada
Foi preparado um polinucleótido ramificado do tipo pente tendo 15 cadeias laterais dependentes, cada uma contendo três locais (total de 45 locais) complementares a uma sonda
2% marcada e uma molécula terminal de biotina ligada à cadeia principal, como descrito acima.
Foi imobilizada a IgG humana a várias concentrações num suporte sólido. A IgG imobilizada foi incubada em IgG anti humana de cabra biotinilada purificada por afinidade (concentração de biotina 40 ng), e o excesso de antisoro foi retirado do suporte por lavagem. O suporte foi depois incubado em 200 ng de avidina-D e depois em 100 fm ou 500 fm do polinucleótido ramificado tipo pente, com as lavagens apropriadas. O suporte foi depois incubado com sonda oligonucleotidica marcada de peroxidase de rábano bastardo complementar aos locais de ligação da sonda marcada no polinucleótido. As leituras de densidade óptica (D.O) foram feitas a 492/620 nm.
Com o prpósito de comparar, foram feitos ensaios como os acima usando um polinucleótido com apenas um local de ligação na sonda marcada.
A tabela a seguir apresenta os resultados deste teste.
Concentração IgG humana 45 locais 1 local 45 locais 1 local (ng/ml)_100@fm 100@fm 500@fm_500êfm
| 100 | 1,116 | 0,005 | 2,505 | 0,002 |
| 50 | 1,089 | 0,002 | 1,564 | 0,001 |
| 25 | 0,432 | 0,001 | 1,295 | 0,001 |
| 12,5 | 0,303 | 0,001 | 0,451 | 0 |
Como referido, o polinucleótido com 45 locais fornece um sinal mais elevado do que o polinucleótido apenas com um local.
Outras variações e aplicações das várias sondas de amplificação descritas neste pedido a métodos de imunoensaios
J.
serão óbvias para os especialistas nesta técnica, e pretende-se que estejam dentro do espirito do presente invento.
Claims (35)
1- Uma sonda molecular para uso como um amplificador de sinal em imunoensaios, caracterizada pelo facto de compreender:
(a) um primeiro dominio (A) que ê um polipéptido e funciona como um anticorpo especifico para um antigénio conhecido;
(b) um segundo dominio (B) que é um polinucleótido de cadeia dupla, capaz de funcionar como um promotor para a actividade da enzima de polimerase de RNA dependente de DNA; e (c) um terceiro dominio (C) que é quer de cadeia simples ou dupla, e é adjacente ao segundo dominio, de tal forma que o terceiro dominio é capaz de funcionar como um padrão para a actividade promotora do segundo dominio.
2- Uma sonda, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a actividade da polimerase de RNA dependente do DNA é proveniente do bacteriófago T7.
3 ’ -CCC TCT ACA CCA ACA GCA TGA ATC GCT TTA TGA CAG GCT CAG C-5 ·
3'-GAC CGA ATA GCT TTA ATT ATG CTG AGT GAT AT-5'
3'-ATT ATG CTG AGT GAT AT-5'
3- Uma sonda, conforme reivindicado na reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo facto de o segundo dominio B ter, pelo menos, 10, e não mais do que 40 nucleótidos em comprimento.
4- Uma sonda, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizada pelo facto de o terceiro dominio C ter, pelo menos, 30, e não mais do que 80 nucleótidos em comprimento.
5'-GGG AGA TGT GGT TGT CGT ACT TAG CGA AAT ACT GTC CGA GTC G-3'
5'-CTG GCT TAT CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTA TA- 3'
5'-TAA TAC GAC TCA CTA TA- 3'
5- Uma sonda, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizada pelo facto de a actividade da polimerase ser proveniente do bacteriófago T7 e a sequência para o segundo domínio B compreender a sequência:
6- Uma sonda, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizada pelo facto de a actividade da polimerase ser proveniente do bacteriófago T7, e sendo a sequência nucleotidica do segundo dominio B:
7- Uma sonda, conforme reivindicado nas reivindicaçOs 1, 2, 3, 4, 5, ou 6, caracterizada pelo facto de o resíduo 5' da cadeia superior da sequência nucleotidica do terceiro dominio C, ser adjacente ao segundo dominio B, e ser um resíduo guanosina.
8- Uma sonda, conforme reivindicado na reivindicação 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizada pelo facto da sequência do terceiro dominio C ser:
9- Uma sonda, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizada pelo facto da extremidade 3' da cadeia superior da sequência nucleotidica de DNA do segundo dominio B ser ligada à extremidade 5' da cadeia superior da sequência nucleotidica do dominio C.
10- Uma sonda, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizada pelo facto de o transcrito do terceiro dominio C possuir dois sub-dominios:
(a) um primeiro sub-dominio, οχ, que é capaz de hibridizar com um linker de captura de oligonucleótido, sendo este linker capaz de hibridizar com um polinucleótido imobilizado num substrato sólido; e (b) um segundo sub-dominio, C2, que é capaz de se ligar a um linker de marcação oligonucleotidico, sendo este capaz de se ligar a uma sonda quantificâvel.
11- Uma sonda, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizada pelo facto de uma unidade funcional com o segundo e terceiro dominios, B e C, estar presente em múltiplas unidades de repetição.
12- Um método de amplificação de um sinal detectável, num imunoensaio, caracterizado pelo facto de compreender:
(a) ligação directa ou indirecta, a um analito, de uma sonda molecular bioquímica, compreendendo um primeiro dominio (A), um segundo dominio (B), que é uma sequência de DNA de cadeia dupla capaz de funcionar como um promotor para a aetividade da enzima da polimerase de RNA dependente de DNA, e um terceiro dominio (C) que é de cadeia simples ou dupla, e adjacente ao dominio B, de tal forma que o terceiro dominio seja capaz de funcionar como um padrão para a aetividade do promotor do segundo dominio;
(b) remoção da sonda não ligada;
(c) transcrição de múltiplas cópias de oligómeros de RNA, que são complementares à sequência padrão, c', do terceiro dominio C, da construção da sonda através de uma aetividade da polimerase de RNA dependente de DNA; e (d) quantificação dos transcritos de RNA.
13, 14, 15 ou 16, caracterizado pelo facto de:
s (a) o transcrito do terceiro dominio, C, da sonda, possuir dois sub-dominios:
(I) um primeiro sub-dominio, cl, que é complementar de uma sonda oligonucleotidica de captura, sendo esta imobilizada num substrato sólido; e (II) um segundo sub-dominio, c2, que é complementar de uma sonda oligonucleotidica marcada;
(b) o transcrito é hibridizado com a sonda de captura;
(c) a sonda marcada é hibridizada com o referido transcrito; e (d) a sonda marcada é quantificada.
13- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 12, caracterizado pelo facto de o analito ser primeiro imobilizado, directa ou indirectamente, sobre um substrato sólido.
14- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo facto de o terceiro dominio A ser um polipéptido capaz de funcionar como um anticorpo, e sendo a sonda ligada directa ou indirectamente ao analito através do dominio A.
15- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo facto de:
(a) o dominio A da sonda ser um polinucleótido de cadeia simples; e (b) o analito ser indirectamente ligado à sonda molecular através de uma molécula linker hibrida proteina/polinucleótido com dois dominios:
(I) um primeiro dominio, que é uma sequência polinucleotidica de cadeia simples, substancialmente complementar à sequência do dominio A da sonda; e (II) um segundo dominio que funciona como um anticorpo, especifico para o analito, ou para um epitopo de um anticorpo que é especifico para o analito.
16- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 12, 13, 14 ou 15, caracterizado pelo facto de o segundo dominio B ser proveniente de uma polimerase de RNA dependente de DNA do bacteriófago T7.
17- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 12, 13, 14, 15 ou 16, caracterizado pelo facto de:
(a) um terceiro dominio C da sonda ser transcrito na presença de trifosfatos ribonucleotídicos marcados;
(b) os transcritos do terceiro dominio possuirem um primeiro sub-dominio, οχ, complementar a uma sonda de captura oligonucleotidica que está imobilizada sobre um substrato sólido;
e (c) os ditos transcritos são imobilizados e quantificados.
18- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 12, 13, 14, 15 ou 16, caracterizado pelo facto de:
(a) um terceiro dominio C da primeira sonda ser transcrito na presença de trifosfatos ribonucleotídicos biotinilados;
(b) o transcrito do terceiro dominio possuir um primeiro sub-dominio, C2, que é complementar de uma sonda oligonucleotidica marcada;
(c) os transcritos são imobilizados sobre um substrato sólido avidinilatado; e (d) os transcritos são quantificados.
19- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 12, 13, 14, 15 ou 16, caracterizado pelo facto de:
(a) o terceiro dominio, C, da sonda, ser transcrito na presença de trifosfatos ribonucleotídicos, quer marcados, quer biotinilatados;
(b) os transcritos são imobilizados sobre um substrato sólido avidinilatado; e (c) os transcritos são quantificados.
20- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 12,
21- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 12, caracterizado pelo facto de uma unidade que compreende o segundo e terceiro domínios, B e C, da primeira sonda estarem presentes em múltiplas unidades de repetição B/C.
22- Uma sonda molecular para uso como um amplificador de sinal, em imunoensaios, caracterizada pelo facto de compreender:
(a) um primeiro dominio, (A), compreendendo um polipéptido capaz de funcionar como um anticorpo que se liga especificamente a um analito conhecido; e (b) um segundo dominio, (M), compreendendo uma multiplicidade de sub-unidades de oligonucleótidos de cadeia simples que são capazes de se ligar, especificamente, a uma sequência de ácido nucleico de cadeia simples, de interesse.
23- Uma sonda, conforme reivindicado na reivindicação 22, caracterizada pelo facto de em cada unidade de oligonucleótido do segundo dominio, M, compreender cerca de 15 a 50 bases, e possuindo um teor de GC na gama de cerca de 40% a cerca de 60%.
24- Uma sonda, conforme reivindicado na reivindicação 22, caracterizada pelo facto de a molécula possuir uma estrutura linear.
25- Uma sonda, conforme reivindicado na reivindicação 22, caracterizada pelo facto de a molécula possuir uma estrutura ramificada.
26- Uma sonda, conforme reivindicado na reivindicação 22, caracterizada pelo facto de, pelo menos, uma porção das unidades oligonucleotidicas do segundo dominio estarem ligadas através de uma metade multifuncional proveniente dum composto da fórmula:
R1 - 0 - R - X ι
ι
Y (1) ι
em que R é uma metade orgânica, preferivelmente um ãcido nucleico, r\ é um grupo protector hidroxilo que pode ser removido sob condições que não removam o ácido nucleico sintético de uma fase sólida, e não removam grupos protectores de fosfato ou nitrogénio exociclicos, X é um grupo contendo fósforo que facilita a sintese de ácido nucleico, Y é um radical derivado de 2 1 um grupo nucleociclico, e R é R ou um grupo bloqueador ou protector que pode ser removido e substituído por nitrogénio sem afectar o R1.
27- Uma sonda, conforme reivindicado na reivindicação 22, caracterizada pelo facto de, pelo menos, uma porção das sub-unidades de oligonucleótidos estarem ligadas através de uma metade multi-funcional proveniente de um composto da fórmula:
em que Z é um nucleófilo, R1 é um grupo protector que é 2 geralmente base-estável, e sensível aos ácidos, R é hidrogénio 3 ou metilo, R ê um grupo protector que pode ser removido e 1 5 substituído por hidrogénio, sem afectar o R , R é um derivado do fósforo que possibilita a adição dos nucleótidos à posição 5' de g
uma cadeia oligonucleotídica durante a síntese quimica, R é metilo, hidrogénio, I, Br, ou F, e X é um número inteiro de 1 a 8, inclusivé.
28- Uma sonda, conforme reivindicado na reivindicação 22, caracterizada pelo facto de, pelo menos, uma porção das subunidades de oligonucleótidos estar ligada, através de uma metade multi-funcional, proveniente de um composto da fórmula:
R - 0 w CH5 j
I 2 /
H - C - 0 - P
N(iPX-) 2
R - 0 - CH2 em que R é o referido grupo protector hidroxilo, iPr é isopropilo, e R1 é metilo ou beta-cianoetilo.
Esta sonda serve para detectar 1 e quantificar o antigénio num imunoensaio, caracterizado pelo facto de compreender:
(a) a ligaçao directa ou indirecta, a um analito, de uma sonda molecular bioquímica, compreendendo um dominio de ligaçao (A), e um segundo dominio (M), que compreende uma multiplicidade de sub-unidades oligoméricas de DNA de cadeia simples capaz de hibridizar com um oligonucleótido marcado por cadeia simples;
(b) remoção da sonda não ligada;
(c) hibridizaçao de oligonucleótidos marcados de cadeia simples, que compreendem uma sequência de nucleótido que· é .substancialmente complementar à sequência da sub-unidade da sonda do dominio M, e às sub-unidades do segundo dominio;
(d) remoção do oligonucleótido marcado e nao ligado; e (e) quantificação da quantidade de oligonucleótido marcado ligado à sonda.
30- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 29, caracterizado pelo facto de o analito ser primeiramente imobilizado, directa ou indirectamente, num substrato sólido.
31- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 30, ¥
caracterizado pelo facto do dominio A ser um polipéptido capaz de funcionar como um anticorpo, e sendo a sonda ligada, directa ou indirectamente, ao analito, através do dominio A.
32- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 31, caracterizado pelo facto do polipéptido do dominio A se ligar especif icamente a um epitopo de um anticorpo, que se liga especificamente ao analito.
33- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 29, caracterizado pelo facto de:
(a) o dominio A da sonda ser um polinucleótido de cadeia simples; e (b) o analito ser indirectamente ligado à sonda molecular através de uma molécula linker hibrida proteina/polinucleótido com dois dominios;
(I) um primeiro dominio que é uma sequência polinucleotidea de cadeia simples, substancialmente complementar à sequência do dominio A da sonda; e (II) um segundo dominio que funciona como um anticorpo, especifico para o analito.
34- Um método de amplificação de um sinal detectãvel num imunoensaio competitivo, caracterizado pelo facto de compreender:
(a) construção de uma sonda molecular, compreendendo:
(III) um terceiro dominio (C), que é, quer de cadeia simples ou dupla, ou adjacente ao segundo dominio, de tal modo que o terceiro dominio seja capaz de funcionar como um padrão para a actividade promotora do segundo dominio;
(b) imobilização da sonda, directa ou indirectamente, sobre um substrato sólido, na presença de um analito de competição;
(c) remoção da sonda não ligada;
(d) transcrição de múltiplas cópias de oligómeros de RNA, que são complementares da sequência padrão, c', do terceiro dominio C, da construção da sonda através da actividade da polimerase de RNA, dependente de DNA; e (e) quantificação dos transcritos de RNA.
35- Um método de amplificação de um sinal detectável num imunoensaio competitivo, caracterizado pelo facto de compreender:
(a) construção de uma sonda molecular, compreendendo:
(I) um primeiro dominio (A), que é capaz de funcionar como um imunogénio; e (II) um segundo dominio (M.), compreendendo uma multiplicidade de sub-unidades de olígonucleótidos de cadeia simples, que são capazes de se ligar especificamente a uma sequência de ácido nucleico de cadeia simples, de interesse.
(b) imobilização da sonda, directa ou indirectamente, num substrato sólido, na presença de um analito de competição;
(c) remoção da sonda não ligada;
(d) hibridização de olígonucleótidos marcados, de cadeia simples, que compreendem uma sequência nucleotidica que é substancialmente complementar da sequência sub-unitária da sonda do dominio M, e às sub-unidades do segundo dominio;
(e) remoção do oligonucleótido marcado não ligado; e (f) quantificação da quantidade de oligonucleótido marcado, ligado à sonda.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US51921290A | 1990-05-04 | 1990-05-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PT97580A PT97580A (pt) | 1992-03-31 |
| PT97580B true PT97580B (pt) | 1998-08-31 |
Family
ID=24067357
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PT97580A PT97580B (pt) | 1990-05-04 | 1991-05-06 | Sondas de preparacao de sondas de proteina-acido nucleico e imunoensaios que utilizam as mesmas |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0528870B1 (pt) |
| JP (1) | JP3034304B2 (pt) |
| KR (1) | KR0171617B1 (pt) |
| AT (1) | ATE174121T1 (pt) |
| AU (1) | AU659798B2 (pt) |
| BG (1) | BG61315B1 (pt) |
| CA (1) | CA2081455A1 (pt) |
| DE (1) | DE69130564T2 (pt) |
| HU (1) | HUT64623A (pt) |
| IE (1) | IE911534A1 (pt) |
| PT (1) | PT97580B (pt) |
| RO (1) | RO113496B1 (pt) |
| RU (1) | RU2107730C1 (pt) |
| WO (1) | WO1991017442A1 (pt) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05503422A (ja) * | 1990-01-10 | 1993-06-10 | バイエル コーポレイション | 核酸ハイブリダイゼーションアッセイでの信号増幅用レポーター分子としてのｄｎａ依存性ｒｎａポリメラーゼ転写産物 |
| US5629153A (en) * | 1990-01-10 | 1997-05-13 | Chiron Corporation | Use of DNA-dependent RNA polymerase transcripts as reporter molecules for signal amplification in nucleic acid hybridization assays |
| EP0648281A4 (en) * | 1991-09-10 | 1997-06-04 | Jack D Love | TARGETED AMPLIFICATION OF DNA AND RNA AND SIGNAL AMPLIFICATION. |
| JPH05149949A (ja) * | 1991-11-26 | 1993-06-15 | Nisshin Flour Milling Co Ltd | 新規な微量物質測定法 |
| WO1993015229A2 (en) * | 1992-02-04 | 1993-08-05 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Amplification of assay reporters by nucleic acid replication |
| AU4596893A (en) * | 1992-05-29 | 1993-12-30 | Gen Trak, Inc. | Signal amplification probe and methods of use |
| ES2044784B1 (es) * | 1992-06-12 | 1994-09-01 | Inia | Procedimiento para la deteccion e identificacion de patogenos virales y subvirales. |
| US5985548A (en) * | 1993-02-04 | 1999-11-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Amplification of assay reporters by nucleic acid replication |
| WO1994026932A1 (en) * | 1993-05-13 | 1994-11-24 | United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Nucleic acid tagged immunoassay |
| WO1996005847A1 (en) * | 1994-08-22 | 1996-02-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | A method of sequencing proteins by epitope ordering and protein restriction mapping |
| US5753787A (en) * | 1995-04-10 | 1998-05-19 | Yale University | Nucleic acids encoding ancylostoma secreted protein |
| SE504798C2 (sv) | 1995-06-16 | 1997-04-28 | Ulf Landegren | Immunanalys och testkit med två reagens som kan tvärbindas om de adsorberats till analyten |
| WO1997047968A1 (en) * | 1996-06-10 | 1997-12-18 | Laboratory Of Molecular Biophotonics | Highly sensitive fluorescent immunoassay |
| US5922553A (en) * | 1996-11-21 | 1999-07-13 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method of detecting protein by immuno RNA |
| GB9718921D0 (en) * | 1997-09-05 | 1997-11-12 | Brax Genomics Ltd | Catalytically generated mass labels |
| EP1098990B1 (en) * | 1998-12-10 | 2006-04-12 | Daniel P. Cashman | Blocked-polymerase polynucleotide immunoassay method and kit |
| US7611869B2 (en) | 2000-02-07 | 2009-11-03 | Illumina, Inc. | Multiplexed methylation detection methods |
| US7582420B2 (en) | 2001-07-12 | 2009-09-01 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
| CA2450139A1 (en) * | 2001-06-11 | 2002-12-19 | Illumina, Inc | Multiplexed detection methods |
| WO2003048388A2 (en) * | 2001-12-07 | 2003-06-12 | The University Of Liverpool | Immuno polymerase chain reaction assay |
| US9618510B2 (en) | 2013-03-13 | 2017-04-11 | Meso Scale Technologies, Llc. | Assay methods |
| US10114015B2 (en) | 2013-03-13 | 2018-10-30 | Meso Scale Technologies, Llc. | Assay methods |
| US10408823B2 (en) | 2014-05-15 | 2019-09-10 | Meso Scale Technologies, Llc. | Assay methods |
| KR20260021093A (ko) | 2019-03-01 | 2026-02-12 | 메소 스케일 테크놀러지즈, 엘엘시 | 면역검정 방법에서 사용을 위한 전기화학발광성 표지화된 프로브, 이의 사용 방법 및 이를 포함하는 키트 |
| CN114544937B (zh) * | 2020-11-11 | 2023-04-07 | 艾克发(北京)生物技术有限公司 | 一种多重信号放大系统及其在免疫吸附间接法检测中的应用 |
| ES3030311T3 (en) | 2021-05-25 | 2025-06-27 | Cavidi Ab | Method for sensitive analyte detection assays and kits therefor |
| CN114277090A (zh) * | 2021-12-17 | 2022-04-05 | 宁波熙宁检测技术有限公司 | Aav8中和抗体检测方法和检测试剂盒 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4299916A (en) * | 1979-12-26 | 1981-11-10 | Syva Company | Preferential signal production on a surface in immunoassays |
| FI63596C (fi) * | 1981-10-16 | 1983-07-11 | Orion Yhtymae Oy | Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser |
| US4556643A (en) * | 1982-07-26 | 1985-12-03 | Agracetus | Assay method and probe for polynucleotide sequences |
| US4748111A (en) * | 1984-03-12 | 1988-05-31 | Molecular Diagnostics, Inc. | Nucleic acid-protein conjugate used in immunoassay |
| US4957858A (en) * | 1986-04-16 | 1990-09-18 | The Salk Instute For Biological Studies | Replicative RNA reporter systems |
| US4749647A (en) * | 1984-06-22 | 1988-06-07 | Genetic Systems Corporation | Polymerization-induced separation assay using recognition pairs |
| US4828979A (en) * | 1984-11-08 | 1989-05-09 | Life Technologies, Inc. | Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection |
| US4868105A (en) * | 1985-12-11 | 1989-09-19 | Chiron Corporation | Solution phase nucleic acid sandwich assay |
| US4910300A (en) * | 1985-12-11 | 1990-03-20 | Chiron Corporation | Method for making nucleic acid probes |
| US4882269A (en) * | 1985-12-13 | 1989-11-21 | Princeton University | Amplified hybridization assay |
| CA1339351C (en) * | 1987-10-15 | 1997-08-26 | Michael S. Urdea | Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same |
| WO1990002819A1 (en) * | 1988-09-08 | 1990-03-22 | The Salk Institute For Biological Studies | Replicative rna-based amplification detection systems |
-
1991
- 1991-05-06 IE IE153491A patent/IE911534A1/en unknown
- 1991-05-06 PT PT97580A patent/PT97580B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-05-06 RU RU92016387A patent/RU2107730C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1991-05-06 DE DE69130564T patent/DE69130564T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-05-06 RO RO92-01380A patent/RO113496B1/ro unknown
- 1991-05-06 AT AT91908991T patent/ATE174121T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-05-06 HU HU9203445A patent/HUT64623A/hu unknown
- 1991-05-06 CA CA002081455A patent/CA2081455A1/en not_active Abandoned
- 1991-05-06 KR KR1019920702987A patent/KR0171617B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1991-05-06 AU AU77912/91A patent/AU659798B2/en not_active Ceased
- 1991-05-06 EP EP91908991A patent/EP0528870B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-06 WO PCT/US1991/002925 patent/WO1991017442A1/en not_active Ceased
- 1991-05-06 JP JP3508881A patent/JP3034304B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-11-03 BG BG97041A patent/BG61315B1/bg unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU9203445D0 (en) | 1993-01-28 |
| HUT64623A (en) | 1994-01-28 |
| BG61315B1 (en) | 1997-05-30 |
| RO113496B1 (ro) | 1998-07-30 |
| EP0528870A1 (en) | 1993-03-03 |
| PT97580A (pt) | 1992-03-31 |
| KR0171617B1 (ko) | 1999-05-01 |
| DE69130564T2 (de) | 1999-07-29 |
| ATE174121T1 (de) | 1998-12-15 |
| AU659798B2 (en) | 1995-06-01 |
| RU2107730C1 (ru) | 1998-03-27 |
| EP0528870B1 (en) | 1998-12-02 |
| JPH06506768A (ja) | 1994-07-28 |
| DE69130564D1 (de) | 1999-01-14 |
| AU7791291A (en) | 1991-11-27 |
| JP3034304B2 (ja) | 2000-04-17 |
| CA2081455A1 (en) | 1991-11-05 |
| BG97041A (bg) | 1993-12-24 |
| EP0528870A4 (en) | 1993-06-09 |
| WO1991017442A1 (en) | 1991-11-14 |
| IE911534A1 (en) | 1991-11-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5656731A (en) | Nucleic acid-amplified immunoassay probes | |
| EP0528870B1 (en) | Protein-nucleic acid probes and immunoassays using same | |
| CA1272443A (en) | Solution-phase dual hybridization assay for detecting polynucleotide sequences | |
| AU641393B2 (en) | Improved amplified nucleic acid hybridization assays for HBV | |
| JP2710159B2 (ja) | 複製型ｒｎａリポーター・システム | |
| ES2209033T5 (es) | Oligonucleotidos marcados. | |
| FI86311B (fi) | Hybridiseringsbestaemning av nukleinsyror medelst anvaendning av detekterbara antihybridantikroppar. | |
| US20100273145A1 (en) | Assay method utilizing polynucleotide sequences | |
| PT96458B (pt) | Utilizacao de transcritos de rna polimerase dependentes de dna como moleculas registadoras para amplificacao de sinal em ensaios de hibridazacao de acidos nucleicos | |
| WO2000034519A1 (en) | Blocked-polymerase polynucleotide immunoassay method and kit | |
| JPS60262055A (ja) | 核酸のハイブリツド形成分析法およびそれに用いる試薬系 | |
| JP2012019797A (ja) | ディップスティック検定における改良型結合相互作用 | |
| JP2000515367A (ja) | シグナル増幅法 | |
| CA2129444A1 (en) | Amplification of assay reporters by nucleic acid replication | |
| EP0146039A2 (en) | Hybridization assay with immobilization of hybrids by antihybrid binding | |
| JP2595201B2 (ja) | Ｄｎａ分子もしくはプローブおよび該ｄｎａ分子もしくはプローブの調製方法 | |
| EP0209702A1 (en) | Solid-phase hybridization assay using anti-hybrid antibodies | |
| JPH0670799A (ja) | ハイブリダイゼーション法 | |
| CA1250232A (en) | Hybridization assay with immobilization of hybrids by anti-hybrid binding | |
| EP1098990B1 (en) | Blocked-polymerase polynucleotide immunoassay method and kit | |
| JP4538586B2 (ja) | 標的抗原の検出方法 | |
| Osterhaus | DNA Hybridization as a Tool in Diagnosing Infectious Diseases. Comparison with Other Methods | |
| HK1003719B (en) | Amplification of assay reporters by nucleic acid replication |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB1A | Laying open of patent application |
Effective date: 19911014 |
|
| FG3A | Patent granted, date of granting |
Effective date: 19980519 |
|
| PC3A | Transfer or assignment |
Free format text: 19990628 CHIRON DIAGNOSTICS CORPORATION US |
|
| MM4A | Annulment/lapse due to non-payment of fees, searched and examined patent |
Free format text: LAPSE DUE TO NON-PAYMENT OF FEES Effective date: 20071119 |