BG61315B1 - Protein-nucleic acid probes and method for immunoassays using same - Google Patents

Description

Изобретението се отнася до областта на имунологията и химията на нуклеиновите киселини. По-специално, то се отнася до използването на хибридизацията на нуклеиновите киселини като начин за подсилване на откриваем сигнал при имуноизследвания.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Хибридизацията на нуклеиновите киселини се използва рутинно при генетичните изследвания, биомедицинските проучвания и клиничната диагностика за откриване и количествено определяне на отделни нуклеотидни последователности, които присъстват в хетерогенни смеси на ДНК, РНК и/или други материали. При основната хибридизация на нуклеинови киселини се хибридизира едноверижна нуклеинова киселина за анализ (или ДНК или РНК) директно или ииндиректно към белязана проба на нуклеинова киселина, а белязаните дуплекси се определят количествено. Използват се както радиоактивни, така и нерадиоактивни маркери.

При основното изследване липсва чувствителност. Когато материалът за анализ (analyte) присъства в малък брой копия или с ниска концентрация, сигналът не може да бъде различен от фоновия шум. Разработени са варианти на основната схема за улесняване отделянето на дуплексите мишени от външния материал и/или за амплифициране на последователности, за анализ, с оглед улесняване на откриването, но тези варианти страдат обикновено от сложни и времеемки процедури, висок фон, слаба чувствителност и трудности при количествено определяне. Те са описани в WO 89/03891.

Имуноизследванията се използват също често при генетични проучвания, биомедицински изследвания и при клинични диагностики за откриване и количествено определяне на отделни антигенни епитопи, които присъстват в хетерогенни смеси на кръвни проби клетъчни екстракти и в други материали. Едно ос новно имуноизследване включва специфично свързване на антитяло, моноклонално или поликлонално, към антиген мишена и средства за откриване на реакцията. Такива средства са включени в различни изследвания, включително директни, индиректни и сандвичимуноизследвания. Все пак чувствителността за откриване на основното взаимодействие антиген/антитяло предлага същите проблеми като описаните по-горе хибридизация на нуклеинови киселини.

Напоследък се използват при имуноизследванията различни методики като радиоимуноизследване, имунопероксидаза и ELISA.

Радиоимуноизследванията изискват опасни и неблагоприятни за околната среда реактиви, а имунопероксидазата и ELISA имат слаб сигнал спрямо отношението на фоновия шум и са ограничени при усилването на сигнала.

Една от първите задачи на настоящето изобретение е да създаде методи за усилване на сигнала или използване на единични полинеуклеотидни молекули, които се оказват полезни при изследвания за хибридизация на нуклеинови киселини при използване в имуноизследвания. Тези усилващи проби предлагат високо възпроизводимо отношение на сигнал към шум, самите те са определими количествено и възпроизводими и са пригодни да се комбинират специфично с антиген за анализ, присъстващи в ниска концентрация и да образуват “универсални” пренасящи нуклеинови киселини и части за образуване на стабилни комплекси.

В US 4 868 105, чието описание е включено тук като литературна справка, се описва изследване в разтворима фаза на сандвичхибридизация, в което анализираната нуклеинова киселина хибридизира с “белязана проба” и със “захващаща проба”. Комплексът проба-анализирано вещество е свързан чрез хибридизацията към твърд матрикс. Това позволява анализираният олигонуклеодит да бъде отстранен от разтвора като твърдо-фазов комплекс, като с това се концентрира анализираното вещество, улеснявайки отделянето му от други реактиви и повишавайки последващото откриване.

В WO 90/13667 са описани линейни и разклонени мултимерни полинуклеотидни проби, които имат два домена и методи за използване на тези проби като усилватели на сигнала при изследвания за хибридизация на нуклеинова киселина. Първият домен е комплементарен на едноверижна оригонуклеотидна последователност, представляваща интерес, а вторият домен е съставен от множество едноверижни олигонуклеотидни субединици, които са комплементарни на един едноверижен белязан олигонуклеотид.

Патентното описание публикация № PCT/US 89/10213 претендира за полинуклеотидни проби, които имат три домена, както и методи за използване на тези проби като усилватели на сигнал при изследвания за хибридизация на нуклеинови киселини. Първият домен е комплементарен на една олигонуклеотидна последователност, вторият домен е способен да функционира като промотор за бактериална фагова ДНК-зависима РНК-полимеразна ензимна активност, а третият домен е способен да функционира като транскрипционна матрица за полимеразната активност.

Протеин/ДНК хибридни молекули се използват като проби при изследвания за хибридизация на нуклеинови киселини, когато протеиновата част функционира като маркерен компонент (виж /1/ и /2/.

Протеин/ДНК хибридни молекули са използвани също като проби при имуноизследвания. В /3/ се описва радиоактивно белязана хибридна проба, включваща протеин и ковалентно свързан радиоактивен олигонеуклеотид. Радиоактивната част се използва да показва присъствието на протеиновата част при биологично изследване. В /4/ се описва една протеин/ДНК хибридна молекула, в която протеиновата част разпознава специфично един протеин-мишена, а частта от нуклеинова киселина предлага реакция за белязане.

Един аспект на изобретението е полипептид/полинуклеотид-хибридна молекулна проба за използване като усилвател на откриваем сигнал при имуноизследвания. При едно изпълнение “полимеразната проба” обхваща три области:

(а) един първи домен (А) който е полипептид и функционира като антитяло, специфично за известен антиген;

(в) един втори домен (В) който е двуверижен полидезоксирибонуклеотид способен да функционира като промотор за ДНК-зависима РНК-полимеразна ензимна активност; и (С) един трети домен (С) който е или едно- или двуверижен и е съседен на втория домен, така че третият домен е в състояние да функционира като матрица за промоторната активност на втория домен.

Втори вариант на изпълнение е една полипептид/пролинуклеотид-хибридно молекулна проба за използване като усилвател за откриваем сигнал при имуноизследвания. Тази “мултимерна проба” обхваща два домена:

(а) един първи домен който е полипептид, способен да функционира като антитяло, което се свързва специфично към известен антиген;

(в) един втори домен, обхващащ множество от едноверижни олигонуклеотидни субединици, които са способни да се свързват специфично към едноверижни последователности на нуклеинова киселина;

(с) средство за концепция на първия и втория домен.

Друг аспект на изобретението е метод за подсилване на откриваем сигнал при имуноизследване чрез прилагане на полимеразните проби, описани по-горе. Този метод обхваща:

(a) имобилизиране на антиген за анализ, директно или индиректно върху твърд субстрат;

(b) директно или индиректно свързване към веществото за анализ на първа молекулярна проба, обхващащо:

(I) домен на свързване (А);

(II) втори домен (В), който е двуверижна ДНК последователност, способна да функционира като промотор за ДНК-зависима РНКполимеразна ензимна активност; и (III) трети домен (С), който е или едноили двуверижен и е съседен на домен В, така че третият домен е в състояние да функционира като матрица за промоторната активност на втория домен;

(c) отстраняване на несвързаната проба;

(d) транскрибиране на мултиплените копия на РНК олигомери, които са комплементарни на последователната матрица, на третия домен, С на пробата конструирана с помощта на ДНК зависима РНК-полимеразна активност;

(e) количествено определяне на транскриптите.

Друга страна на изобретението е друг метод за подсилване на откриваем сигнал при имуноизследване чрез използване на мултимерните проби, описано по-горе. Този метод включва:

(a) имобилизиране на анализираните вещества, директно или индиректно, върху твърд субстрат;

(b) директно или индиректно свързване към анализираното вещество на хибридна молекулна проба, обхващаща:

(I) домен на свързване (А), който е полипептид, способен да функционира като антитяло, което се свързва специфично към интересуващия ни антиген;и (II) един втори домен (М) обхващащ множество от едноверижни ДНК олигонуклеотидни субединици, които са способни да се свързват специфично към един едноверижен белязан олигонеуклеотид; и (III) средство за конюгиране на първия и втория домен;

(c) отстраняване на несвързаната проба;

(d) хибридизиране на едноверижни белязани от игонуклеотид, които обхващат една нуклеотидна последователност, която е комплементарна към последователната субединица на М домена с проба към субединиците на втория домен;

(e) отстраняване на несвързания белязан олигонуклеотид:

(f) количествено определяне на количеството на белязан олигонуклеотид свързан към пробата.

Друг вариант на приложение е един метод за подсилване на откриваем сигнал при компетитивно имуноизследване, обхващащо:

(a) конструиране на хибридна молекула, в която домен А е полипептид, способен да функционира като хаптен и този домен се конюгира или към В/С домена на полимеразната проба или към М домена на мултимерния домен;

(b) имобилизиране на хибридната молекула директно или индиректно върху твърд субстрат в присъствие на конкуриращо вещество за анализ;

(c) отстраняване на несвързаната проба;

и или (d) транскрибиране на мултиплени копия от РНК олигомери с помощта на ДНКзависима РНК-полимеразна активност и идентифициране и количествено определяне на транскриптите, в случай че се използва поли меразата проба; или (е) хибридизиране на едноверижни белязани олигонуклеотиди към субединиците на М домена, отстранявайки, несвързания маркер и количествено определяне на свързания маркер, в случай, че мултимерната проба е използвана

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ЧЕРТЕЖИТЕ

Фигура 1А е схематично представяне на подсилваща проба от мономерен полимеразен тип. Главните букви означават домените, а малките букви веригите в домена. Началната буква означава долната верига (чете се: 3' до 5' отляво надясно). Доменът А е едно антитяло, което разпознава епитоп мишена (последователност ID NO 8). Домен В е помотора за РНК-полимераза (послед.Ю N0:9), (послед.Ю N 0:10), (послед.Ю N 0:11) и (послед.Ю N0:12). Последователността с’ е матрица за РНК-полимеразата. Пробата се синтезира като едноверижна. ААААААА (послед. Ю N0:1) в края на областта С представлява поли-А линкер добавен, за да позволи самохибридизацията. А/Т областта между А и В домените се изисква по избор за поддържане на пълната активност на антитялото.

Фигура 1В е ДНК последователност на един вариант на изпълнение на подсилващата проба от полимеразен тип. Промоторният домен В се състои от консенсус последователност от пормотора на бактериофаг Т7 (5TAATACGACTCACTATA-3') (послед.Ю ИО:2)плюс 15 допълнителни остатъка 5' към промоторната последователност.

Фигура 1С схематично представлява мултимерна подсилваща проба от полимеразен тип, в която домен А функционира като антитяло и двуверижните В и С домени са самохибридизиращи се.

Фигура 1D схематично представлява мултимерни подсилващи проби, в които домен А функционира като антитяло, а М доменът е съставен от множество олигомерни субединици. Посочени са както разклонени, така и подобните на гребен олигомери.

Фигура 2А схематично представя изследване чрез сандвич система за имуноизследване, която система включва подсилващата проба от полимеразен тип. Анализираният протеин е индиректно имоби4 '61315 лизиран върху твърд субстрат чрез комплексиране с едно първо антитяло, например “rab” (заешко) антитяло; и индиректно свързан към подсилващата проба чрез комплексиране с второ антитяло (например мишо антитяло). 5

Фигура 2В схематично представя сандвич хибридизационна система за имуноизследване. Анализираният протеин е индиректно имобилизиран както по-горе. Второто антитяло (миши антианалит) е комплексирано с хербицидно антитяло/полинуклеотидна молекула, в която протеинната част функционира като мишо анти-антитяло, а полинуклеотидната част е комплементарна на а’ нуклеотидната област на последващата проба (в този случай мултимерна проба).

Фигура 3 дава използването на РНКполимеразните транскрипти като информационни молекули при имуноизследване. След като сандвич комплексът, който включва полимеразната проба е образуван, се добавя РНКполимераза и се продуцират РНК-транскрипти (с) комплементарни на матрицата - последователност (с’). Тези последователности имат два под-домена: cl, който е комплементарен 25 на захващащата проба, имобилизирана върху твърд субстрат; и с2, който е комплементарен към белязаната проба. Това позволява индиректно имобилизиране на маркера и количествено изследване на сигнала от хибридизационното изследване. означава инкорпорирания маркер, който може да е радиоактивен, хемилуминисцентен, флуоресцентен или ензиматичен.

Фигура 4 (части А - F) илюстрират 35 методите, използвани за получаване на мултимери с подобни на гребен и/или разклонени структури.

Подробно описание на изобретението Дефиниции “Откриваем сигнал” е един трнсмисионен показател за появата на биохимично събитие, като хибридизация на нуклеинови киселини или свързване на антиген с антитяло. В същността се описват методи за усилване на откриваем сигнал при имуноизследване.

“ДНК-зависима РНК-полимераза” е един ензим, който улеснява полимеризирайето на РНК със специфична последователност от комплементарна ДНК - матрица. 50 “Доменът” е определена област от биохимична молекула, характеризираща се със своята функция.

“Епитоп” е тази част от една имуногенна молекула, която специфично се разпознава от и се свързва в комплекс със съответното си антитяло при имунологична реакция.

Една нуклеотид/пептидна “хибридна” молекула включва както остатъци на нуклеинови киселини, така и остатъци на аминокиселини, всеки в отделен функциона лен домен на молекулата.

“Имуноген” е вещество, което реагира по специфичен начин с едно антитяло.

“Имунологична реакция” е специфично разпознаване и свързване на антитяло към епи15 топа на имуногена. “Имуноизследване” е метод за определяне присъствието на епитоп чрез комбиниране на имунобиологична реакция с проба за откриване и количествено определяне на реакцията.

“Полидезоксирибонуклеотид” е една полимерна ДНК молекула. “Полинуклеотид” е една полимерна ДНК или РНК молекула.

“Промоторът” е край на един полидезоксирибонуклеотид, към който РНКполимеразен ензим се свързва препартивно за иницииране на транскрипция.

“РНК зависима РНК-полимераза” е ензим, който улеснява полимеризацията на РНК със специфична последователност от ед30 на комплементарна РНК матрица.

“Транскрипцията” е процес, посредстван от ензим, чрез който се образува РНК от комплементарна полинуклеотидна матрица.

“Горна верига” на двуверижна ДНК молекула е верига, чийто 5'-край е от ляво, като последователността се чете от ляво надясно. Последователността на тази верига е представена винаги над тази за нейната комплементарна “долна верига”която се разчита от 3' 40 към 5'- края, от ляво надясно.

Начин за осъществяване на изобретението

- Засилващи проби А - Полимеразни проби

Един аспект на това изобретение е ДНК подсилваща проба (отбелязвана като “полимеразна проба”), съдържаща три функционални домена. Тази проба се използва за повишаване на откриваем сигнал при имуноизследвания.

Първият домен (А - фигура 1А) е полипептид, който функционира като антитя5 ло със специфичност за избрания антиген. Функционалният участък на полипсптида се следва от област с остатъци или от аминокиселини или от нуклеинови киселини, т.е. разделяща област, която не се включва в активността на антитялото. Активността на антитялото може да е специфична за един епитоп на самото вещество за анализ; при едно предпочитано изпълнение, антитялото е насочено към антигенен детерминат от определен имуноглобин, използван при описаното по-долу изследване (например антизаешки имуноглобулин Ig G или античовешки Ig G -виж фиг.2А). Както се прилага, веществото за анализът контактува с едно специфично антитяло, в излишък се отстранява, а подсилващата, проба се оставя тогава да реагира със свързаното антитяло.

За предпочитане, веществото за анализ първо се имобилизира върху твърд субстрат за улесняване на последващите процедури на промиване. Това имобилизиране може да е директно (например биологични препарати, съдържащи аналита могат да бъдат свързани към нитроцелулозен филтър) или индиректно (например специфично антитяло може да бъде имобилизирано върху твърд субстрат и аналитът впоследствие да бъде свързан към имобилизирано антитяло).

Вторият домен (В - фиг.1А) обикновено 10 до 40 базови двойки дължина, за предпочитане 20 до 35 базови двойки, още повече за препоръчване 30 до 35 базови двойки, е двуверижен и функционира като ДНК-насочен РНК полимеразен промотор. Този промотор произхожда обикновено от поромоторната последователност на бактериален фаг, за предпочитане някой от фагите ТЗ,Т7 или SP6,3a предпочитане от бактериофаг Т7. Този клас РНК полимерази е силно специфичен към промотора. Промоторът от Т7 е охарактеризиран най-добре (фигура 1В). ДНК последователностите от 17 Т7 промотора са известни и е изведен консенсус последователност: 5'ТААТАССАСТСАСТАТА-ЗДпоследов. D N 0:2) (виж /4/ и /5/. Последователности 3' до промотора върху комплементарната верига (с’ елемент, чийто 3’ край е съседен на 5' в края на Ь’ сегмента) служат като матрици за транскрипция, а транскрипцията на много вариращи последователности мишени може да бъде пригодена (фигура 1В). Само самата про моторна област трябва да бъде двуверижна (виж./6/).

Удължаването на 5' края на промотора има слаб ефект върху транскрипцията. Например, при едно предпочитано изпълнение В областта се състои от консенсус последователност на Т7 промотора, плюс допълнителни бази от 5' до консенсус последователността, които са идентични на последователността от Т7 плазмидите (могат да се получат от US Biochemicals) до Pvu II рестрикционния сайт (фигура 1В). Тези последователности могат да са или да не са външни.

Трети домен (С - фигура 1 А) е директно от 3' до втория домен, а с’ веригата на този домен служи като матрица за промотора на В домена. Доменът С е обикновено с дължина от 30 до 80 нуклеотида, за предпочитане 35 до 50 нуклеотида и най-много за предпочитане 40 до 45 нуклеотида. Този домен може да е едно или двуверижен 3' краят на с’ верижната матрица (директно съседна на промотора) е обикновено цитозинов остатък и следователно 5' краят на горната верига е обикновено гуанозинов остатък.

Продуктът (С) на РНК транскпирцията на С домена функционира като информационна молекула за присъствието и количеството на анализираното вещество (фигура 3). Засилването на сигнала се явява, защото всяка матрица продуцира от 10' до 10⁴ транскрипта. Последователността на този домен е означена със случайна последователност, изчислена посредством компютърен анализ, така че да се сведе до минимум възможността за кръстосана реакция с други проби в системата.

Последователността на домен С се построява за специфична схема на откриване и няколко такива схеми могат да бъдат използвани за количествено определяне на транскриптите. Например, транскрипционният продукт (с) на С домена може да бъде подразделен на два поддомена (С] и с₂) (фигура

3). Под-домен Cj е комплементарен на пробата, залавяща транскрипта, която е имобилизирана върху твърд субстрат. Под-домен с₂ е комплементарен на проба за белязане. След хибридизацията, количеството на задържания маркер е линейно пропорционално на количеството анализирано вещество, присъствува6

61315 ' що в изходната проба.

При едно друго изпълнение, транскриптът на С домена има само един с поддомен. Доменът С е транскрибиран в присъствието на белязани рибонуклеотидни трифосфати и белязаният транскрипт впоследствие се свързва към имобилизирана проба за залавяне на транскриптите чрез комплементарния c_t поддоменен и се определя количествено.

При друго изпълнение, транскриптът на С домена има само един с₂ поддомен. Доменът С се транскрибира в присъствието на биотинилирани рибонуклеотид трифосфати, а транскриптите се залавят от авидинови перли. Тогава транскриптът се хибридизира към пробата за белязане чрез своя комплементарен с₂ поддомен и се определя количествено.

Възможни са няколко други методи за белязане и откриване на транскрипти на подсилващи проби, включително едновременно използване на белязани рибонуклеиди и на авидин/биотиново свързване и те са известни на специалистите в тази област.

В и С домените на полимеразни проби могат да бъдат получени чрез клониране, ениматично свързване, химически методи за кръстосано съединяване, директен химичен синтез или комбинация от тях. Когато се получава чрез клониране, последователностите от нуклеинови киселини, които кодират целия В/С домен или негови фрагменти могат да се получат като едно- или двуверижна форма а чрез обикновените методи за клониране.

“В” доменът е двуверижен, а С доменът може да е или едноверижен или двуверижен. Двойноверижните домени могат да бъдат получени по два начина: веригите могат да бъдат клонирани отделно и впоследствие да бъдат хибридизирани комплементарните вериги, или алтернативно, пробата може да бъде клонирана като едноверижен и самохибридизиращ се полинуклеотид (например Ь’,с’, с, Ь). В този случай се добавят четири до десет допълнителни нуклеотида, за предпочитане 5 до 7 нуклеотида се добавят към една последователност като раздалечител между с и с’, за да се позволи правилно заобикаляне на двуверижната област, когато тя се самохибридизира. Раздалечителят е обикновено поли-А, но може да бъде модифициран за свеждане до минимум хибридизационната кръстосана реактивност между различни проби при изследването.

А доменът може да бъде конюгиран към В/С домена чрез междинно поставени свързващи средства като нуклеинова киселина, аминокиселина, въглехидрат или полиолни мостове или чрез други омрежващи елементи. В/С доменът може да бъде синтезиран с 5' остатък от нуклеинова киселина, която е получена като производно, така че да има една функционална група, която предлага сайт на свързване за А домена или остатъкът може да бъде производно след като олигонуклеотидът е бил синтезиран, така че да предлага такъв сайт. Един предпочитан метод за химическо омрежване е да се включи една N⁴ -модифицирана цитозинова база към 5'-края на полинуклеотида, както е описано в ЕРА 0225807.

При друго изпълнение конюгацията на В/С домена от ДНК към А домена от антитялото може да се извърши по начин, аналогичен на ензимното конюгиране. В/С доменът се синтезира, така че да съдържа алкиламинова част. Алкиламинът реагира с един хетеробифункционален напречно свързващ елемент като сукцинимидил 4-(малеимидометил)циклохексан-1-карбоксилат. (SMCC). След колонно пречистване, ДНК може специфично да реагира със сулфхидрилни функционални групи. Едно антитяло може да съдържа реактивен сулфхидрил (както в редуциран F(ab’)₂ или може да бъде модифициран, така че да съдържа сулфхидрил (както когато е модифициран с Nсукцинимидил 3 (2-пиридилдитио) пропионат (SPDP), който се редуцира. Възможно е също директно конюгиране ДНК-амин към антитяло-амин с хомобифункционални реактиви, но е типично по-трудно за контролиране.

В - Мултимерни проби

Друг вариант за осъществяване на изобретението е ДНК подсилваща проба (отбелязана като “мултимерна проба”) съдържаща два функционални домена, един първи домен А, който е същия като домен А на полимеразната проба, описана по-горе и втори (М - фигура 1D), който съдържа няколко повтарящи се субединици. Тази проба, подобно на полимеразната проба описана по-горе, също се използва за подсилване на сигнала при имуноизследвания.

Полинуклеотидът на М домена може да е линеен или разклонен полимер от същата едноверижна повтаряща се олигонуклеотидна субсдсница или различна едноверижна олигонуклеотидна субединица. Тези субединици са способни да хибридизират специфично и стабилно с едноверижен нуклеотид представляващ интерес, типично белязан олигонуклеотид или дург мултимер. Тези единици са нормално с дължина 15 до 50, за предпочитане 15 до 30 нуклеотида със GC съдържание от 40 до 60%. Общият брой нуклеотидни единици в мултимера са обикновено от 3 до 50, обикновено 10 до 20. Олигонуклеотидните единици на мултимера могат да са съставени от РНК, ДНК, модифицирани нуклеотиди или от комбинации от тях.

Олигонуклеотидните субединици на мултимера могат да бъдат ковалентно свързани директно помежду си чрез фосфодиестерни връзки или чрез междинно поставени свързващи елементи като нуклеинова киселина, аминокиселина, карбохидрат или полиолни мостове или чрез други напречно свързващи елементи, които са пригодни за напречно свързване на нуклеинови киселини или вериги на модифицирани нуклеинови киселини. Сайтът(овете) за свързване може да са в краищата на субединицата (при нормална 3' - 5' или при случайна ориентация) или към повече нуклеотиди във веригата.

При линейните мултимери отделните субединици са свързани край към край за оформяне на линеен полимер. При един тип разклонен мултимер три или повече олигонклеотидни единици излизат от една изходна точка за оформяне на разклонена структура. Изходната точка може да е друга олигонуклеотидна субединица или функционална молекула, към която може да са ковалентно свързани най-малко три единици. При един друг тип има олигонуклеотиден скелет на субединицата с една или повече допълнителни олигонуклеотидни субединици. Този тип мултимери са “с фуркетна”, “подобни на гребен” структура или комбинация от двете. Допълнителните единици са нормално зависещи от модифициран нуклеотид или друга органична част, имаща подходящи функционални групи, към които олигонуклеотидите могат да бъдат конюгирани или прикачени по друг начин (виж фигура 1D).

Мултимерът може да бъде изцяло линеен, изцяло разклонен или да е комбинация от линейни и разклонени части. За предпочитане има най-малкото две точки на разклонение в мултимера, по-за предпочитане най-малкото 15 и за предпочитане 15 до 50. Мултимерът може да включва един или повече сегменти на двуверижни последователности.

Домен М може да бъде приготвен чрез клониране (ако е линеен), ензиматично свързване, химическо напречно свързване, директен химичен синтез или комбинация от всички. Тези методи на синтез са изцяло включени в WO 89/03891, публикуван на 5 май, 1989 година. В случая с линейни мултимери, приготвени чрез клониране, последователностите на нуклеинови киселини, кодиращи целия мултимер или негови фрагменти може да бъде оформен като едно- или двуверижна форма чрез обикновените методи на клониране. Когато са изработени в двуверижна форма, мултимерите/фрагментите са задължително денатурирани, за да предоставят едноверижни мултимери/ фрагменти. Мултимери могат да бъдат клонирани в едноверижна форма при използване на обикновени едноверижни фагови вектори като М13. Фрагменти могат да бъдат свързани ензиматично или химически за оформяне на мултимера на М домена. Когато се свързват ензиматично отделните единици се легират с една лигаза, като Т4 ДНК или РНК лигаза, какъвто може да е случаят. Когато се получават чрез химически напречно свързване, отделните единици могат да бъдат синтезирани с една или повече нуклеинови киселини, които са производни с функционални групи, които предлагат сайтове на свързване или са изведени след като олигинуклеотидът е синтезиран, така че да осигури такива сайтове. Предпочитан метод за напречно свързване е да се включи ЬР-модифицирана цитозинова база в нуклеотида, както е описано в ЕРА N 225 807, изводите от който са включени тук.

Когато се приготвят чрез директен химичен синтез, олигонуклеотидите, съставящи производни нуклеинови киселини или еквивалентни многофункционални молекули, чиито функционални групи са блокирани, могат да бъдат получени чрез обикновени техники за синтез. Функционалните групи са отблокирани и олигонуклеотидните единици се синтезират от отблокираните сайтове.

Една генерична структура за молекулите, използвани за получаване на точки на разклоняване в мултимерите, е както следва:

R* - Ο - R - X (1)

I

У

I 5

R² където R е органична част, за предпочитане нуклеинова киселина, R¹ е хидроксилна защитна група, която може да бъде отстра- 10 нена при условия, които не отстраняват синтетичната нуклеинова киселина от твърдата фаза и не отстраняват екзоцикличния азот или фосфатните защитни групи, X е една съдържаща фосфор група, която улеснява синтеза- 15 та на наклеинова киселина, като защитна фосфорамидитна, фосфатна или фосфонатна група, Y е радикал, произхождащ от нуклеофилна група като амино, хидроксил, сулфхидрил или защитен фосфат и R² и R¹ или 20 блокираща или защитна група, която може да бъде отстранена и заместена с водород, без засягане на R¹. В молекулите, използвани за получаване на разклонени или “Форкетни” клонове, R’ е R² са еднакви; докато в молекули, 25 използвани за получаване на “подобно на гребен” разклоняване R² е блокираща група, която е стабилна в присъствие на R¹ деблокиращ реактив. Фигура 4 илюстрира схематично използваните методи за синтезиране на 30 мултимери, имащи “подобни на гребен”, “Форкетни” разклонения или комбинация от тях.

Част А от фигура 4 представя обикновената схема за олигонуклеотиден синтез за 35 получаване на линеен олигонуклеотид като автоматизиран фосфорамидитен метод (виж /7/). Тъмният блок представя твърда опора, N представлява един нуклеодит и p-N-ORj (R₂ е еквивалентен на R¹ по-долу), едно обикновено 40 нуклеотидно производно, с подходящи защитни групи.

Част В показва метода за получаване на “подобен на гребен” мултимер. Съединението 45

Р - N - OR.

I о I R₂ 50 представлява модифицирана база на формула (2) по-долу. Една олигомсрна единица с желана големина и последователност се синтезира и остава върху опората. Една или повече 1Ч⁴-модифицирани цитозинови бази се включват тогава във веригата чрез споменатата автоматична процедура. За предпочитане, модифицираната база е с формула

в която Z е нуклеофил като -0-, NH-, S-,PO₄= и

Ϊ

-OC-0-,R’ е блокираща или защитна група като диметокситритил (ДМТ) или пиксил, който обикновено е стабилен на основи и чувствителен на киселина, R² е водород или метил, R³e блокираща или защитна група, която може да бъде отстранена и заместена с водород, без да се засяга R¹ като

η ϋ

S-CH₂CH,-O-CII ² · о сн₃о-сн₂-сн₂-о-сн₂R⁵e фосфорамидит или друго фосфорно производно, което позволява добавянето на нуклеотиди към 5' позицията на една олигонуклеотидна верига по време на химическия синтез, например фосфодиестер, фосфотриестер и т.н., R⁶ е метил, водород, бром, йод или флуор, a X е показател в обхвата от 1 до 8 включително. Когато е включена повече от една модифицирана база те са, за предпочитане, раздалечени чрез междинни бази във веригата, най-много за предпочитане един -ТТ+димер. Допълнителни олигонуклеотидни единици могат да бъдат включени в схемата, с последващи допълнителни модифицирани бази и т.н.

ЬИнуклеофилната група тогава се лишава от защита (R³ се отстранява) и се създават олигонуклеотидни единици чрез автоматизираната процедура. Остатъчните R¹ групи в края на веригата се отстраняват и разклоненията “подобен на гребен” мултимер се отцепва от опората.

Част С от фигура 4 представя общата процедура за получаване на “Форкетни” мултимери. Отново, една олигомерна единица с желана големина и последователност, се синтезира чрез обикновените техники и се оставя върху опората. Блокирана, бифункционална съдържаща фосфор група (представена като XP в част С), както и блокиран фосфорамидът се включва тогава във веригата чрез автоматизираната процедура. Предпочитани бифункционални съдържащи фосфор групи са блокирани фосфорамидити с формула

R - О - СН₂ N(iPr)₂

Н - С - 0 - Р

R - О - ^Н₂ OR¹ в която R е споменатата хидроксилна защитна група, iPr е изопропил и R¹ е метил или бета-цианоетил. За предпочитане R е ДМТ и R¹ е бета-цианоетил.

Алтернативно, N⁴ -модифицираната цитозинова база, където R, = R₂ (например ДМТ) може да бъде използвана.

Двете защитни групи тогава се отстраняват и се получават допълнителни олигонуклеотидни единици от тях чрез автоматизираната процедура. Остатъчните R¹ групи се отстраняват и разклоненият мултимер се отцепва от опората.

Части Д и Е представят методи, при които два или повече разклонени мултимера, “по добни на гребен” мултимери или комбинации от тях, се слепват заедно ензиматично или химически. Обикновено разклонените и/или “подобни на гребен” мултимери се получават както по-горе и се отстраняват от опората. Тогава те се комбинират в разтвор, използвайки ензиматични или химически методи на свързване, както е описано по-горе.

Част F показва метод за синтезиране на множествен “подобен на гребен” мултимер. Тази процедура е вариант на метода, посочен в част В и включва вграждане на модифицирани бази в зависещите странични вериги и генериране на вторични олигонуклеотидни странични вериги от тях.

Подходящи, способни да се отцепят молекули, могат да бъдат вградени в мултимерите на предварително определени сайтове за целите на анализиране на структурата на мултимера или като средство за освобождаване на предварително определени сегменти (като частите от мултимера, който свързва към белязаните олигонуклеотиди). След синтеза на мултимера и пречистването, тези линкери могат да бъдат специфично отценени без допълнително разрушаване на нуклеотидната структура на мултимера. Предпочитан тип на линкерна молекула се построява, така че да съдържа една 1,2-диолна група (която може да бъде отцепена селективно чрез периодати), както и една защитена хидроксилна и произхождаща от фосфорамидит хидроксилна група, която позволява линкерът да бъде вграден във всеки ДНК фрагмент чрез стандартни фосфоримидитни химически обработ'·· Предпочитан вариант на такъв линкер е съединението:

където ДМТ и iPr са както е посочено по-горе. След включване в ДНК фрагмент и цялостно премахване на защитата, съдържащият линкер фрагмент има следната структура /Нз

I \

соен ^NCHjCHjO-P-O-*' {ONAJ ’-ОК ' 0 — снсо t I он он където ДНК! и ДНК₂ представляват подфрагменти, които могат да са еднакви или ί /“’

KO-’ (DNAj’-OP-OCHjCHiN, \ х“ сос_% 0 различни. Реакцията на този фрагмент с натриев перйодат разцепва фрагмента на следващите подфрагменти:

CKjо

X ¹¹«,

NCKiCHjOP-O-’ (DNAjl’-OH \ /С _#ссо

Алтернативно, 1,2-диолната група може да бъде заместена със свързващи (линкерни) групи, които съдържат един чувствителен на хидроксиламин линкер, един чувствителен на сулфон линкер или един чувствителен към тиол линкер. Такива свързващи групи могат да произхождат от обикновени напречно свързващи агенти, които се използват за конюгиране на протеини с други съставки. Подобно, могат да се използват защитни групи, различни от ДМТ.

Функционалните страни на полимеразната проба могат да бъдат комбинирани със структурата на мултимерната проба чрез синтезиране на мултимерна проба, която има М домен със субединици, обхващащи множество от промотор/матрица (В/С) домени на полимеразната проба. Подобно на мултимерните проби, мултимерните субединици могат да бъдат или в линейна форма или разклонени молекули.

Подобно на полимеразните проби А доменът на мултимерните проби може да бъде конюгиран с М домена чрез междинни свързващи елементи като нуклеинова киселина, аминокиселина, въглехидрат или полиолни мостове или чрез други напречно свързващи елементи. М доменът може да бъде синтезиран с един 5'- остатък на нуклеонова киселина който е производен, така че да има функционална група, осигуряваща сайт на свързване за А домена или остатъкът може да се получи като производно след като олигонуклеотидът е бил синтезиран за получаване на такъв сайт. Предпочитан метод за химическо напречно свързване за включване на 1Ч⁴-модифицирана цитозинова база в 5’-края на полинуклеотида, както е описано в ЕР 0225807 и в раздел I (А) по-горе.

II - Имуноизследвания

Друга страна на изобретението използва подсилващи проби при имуноизследвания за откриване и количествено определяне на присъствието и концентрацията на вещество за имунологичен анализ. Тези подсилващи проби са от два класа: хибридни проби, включени в раздел I по-горе (или полимеразни проби или мултимерни проби); или полинуклеотидните проби, включени в /8/. Тези проби са подобни на хибридните, но с А домени съдържащи полинуклеотидна последователност, а не полипептид.

Веществото за анализ може да е всеки известен имуноген, представляващ интерес. То може да присъства в ниска концентрация в една проба или може да е вид с по-ниско съдържание в хетерогенна смес от биологичен материал. Веществото за анализ може да присъства в различни източници, например биологични течности или тъкани, хранителни материали, материали от околната среда и т.н., или може да бъде синтезирано in vitro.

При първия етап, пробата съдържаща веществото за анализ, се приготвя по който и да е от различните известни методи.

Подсилващи проби могат да бъдат използвани за откриване на анализирани вещества по-голям брой начини на имуноизследване - извършени или в разтвор или имобилизирани върху твърда фаза. Ако имуноизследва нето се извършва в разтвор, пробата, съдържаща веществото за анализ е или свързана към подсилващата проба директно, индиректно чрез едно или повече антитела специфични за анализа или, ако се използва полинуклеотидна проба, във връзка с хибридна свързваща молекула (разгледано в точка II). Подсилващи проби могат да се използват по този начин при повечето методи за имуноизследване в разтвор. Виж пример /9/.

При имуноизследване, използващо твърда фаза, веществото за анализ, което може да е или антиген или антитяло, е или имобилизирано директно върху твърда фаза, индиректно чрез свързване на веществото за анализ към първо антитяло, което първо е било свързано към твърда фаза или чрез сандвичево изследване (фигура 2А), при което второто антитяло разпознава веществото и, обратно, се разпознава чрез първото антитяло, свързано към твърдата фаза.

Ако веществото за анализ трябва да бъде директно свързано към твърда фаза, пробата, която го съдържа се поставя в контакт с нитроцелулозен филтър или с подобно средство на неселективно свързващ протеин. Ако веществото трябва да бъде директно и селективно свързано към твърда фаза, първо антитяло, насочено към негов епитоп или към второ антитяло, се конюгира към твърдата фаза и впоследствие се използва за свързване на веществото или едно второ антитяло свързано към него.

А - Използване на хибридни проби

Допълнително антитяло, насочено към втори епитоп на веществото за анализ може тогава да се използва като линкер между веществото и посдилващата проба. Подсилващата или полимеразна проба или мултимерна проба, чийто А домен е насочен към второ антитяло, може да бъде конюгиран към свързващо антитяло, оформящо ивица, състояща се от първото антитяло свързано към твърда фаза, второ антитяло, веществото за анализ, едно свързващо антитяло, и подсилващата проба (фиг.2А).

В - Използване на олигнуклеотидни проби

При друго приложение, подсилващата проба, използвана тук, е една от полинуклеотидните мултимерни проби, разгледани в / 10/.

Тези проби се различават от пептил/ нуклеотид хибридните мултимерни проби, от настоящата заявка, при незабавно приложение, на това, че домен А е по-скоро олигонуклеотидната последователност, а не функциониращ като антитяло полипептид. Следователно антитяло/полипептид хибриден линкер трябва да бъде използван за индиректно прикачване на веществото за анализ към подсилващата проба (фигура 2В). Този хибриден линкер има и първи домен, който е полипептид, и функционира като антитяло, специфично за епитоп на веществото или на антитяло, което го разпознава и еидн втори домен допълнителен към нуклеотидната последователност на А домена на подсилващата проба.

Аналогично, при друго приложение, една от полинуклеотидните полимеразни проби, посочена в /11/, може също да се използва. Тези проби се различават от хибридните полимеразни проби при незабавно приложение по това, че доменът А е по-скоро полинуклеотидна последователност, а не функциониращ като антитяло полипептид. Тези проби също изискват използването на хибриден линкер, както е описано по-долу.

Чрез използване на полинуклеотидни подсилващи проби и хибриден линкер, а не хибридно подсилваща проба, описана в точка I по-горе, подсилващата проба може да бъде “универсален” реактив, използваем както за хибридизационни изследвания на нуклеинова киселина, така и за инумоизследвания.

С - Условия на свързване и хибридизиране

При едно предпочитано приложение, веществото за анализа е индиректно имобилизирано върху твърда фаза, например блюдо от поливинилхлорид с 96 ямки. При сандвичевото изследване, посочено на фигура 2А, 50 от първото антитяло (антизаешко в концентрация от 20 g/ml в 0,2 М натриев бикарбонат) се поставят в ямка. Ямката се покрива и се инкубира 2 часа при стайна температура във влажна атмосфера. Тогава разтворът се изсмуква от ямката и се промива два пъти с блокиращ буфер, съдържащ 3% говежди серумен албумин във фосфатен буфер във физиологичен разтвор, съдържащ 0,02% натриев азид. След това ямката се инкубира с блокиращ буфер за 20 минути при стайна температура във влажна атмосфера и тогава се про мива още два пъти с блокиращ буфер.

от второто антитяло (заешки антианалит, също при концентрация от 20 / ml се добавят към ямката и се повтаря процедурата, описана по-горе. Приготвя се 5 следваща серия от разреждания на анализираното вещество в блокиращ буфер. 50 от всяко разреждане се добавят към ямка. Блюдото се покрива и се инкубира за 2 часа при стайна температура във влажна атмосфера, след което ямките се промиват четирикратно с блокиращ буфер. Третото антитяло (миши антианалит) се добавя след това по същия начин, последвано от добавянето на хибридната подсилваща проба. Тъй като случайна тъканни 15 препарати могат да съдържащ анти-ДНК антитела, използваният буфер за промиването, което следва добавянето на пробата, също съдържа 20 /ml ДНК от сперма на пъстърва.

Когато се използват нуклеотидни под- 20 силващи проби или хибридни мултимерни проби, една стъпка на хибридизиране на нуклеинова киселина следва комплексирането на аналита и антитялото. Обикновено, условията на хибридизиране се състоят от водна среда, специално буферна водна среда, която включва различни добавки. Тези добавки могат да включват полинуклеотидите, които ще бъдат хибридизирани, соли (например натриев цитрат0,017 до 0,17 и/или натриев хлорид 0,17 30 до 1,7 , нейонни детергенти като NP-40 или Тритон Х-100 (0,1 до 1,0%), които не взаимодействат с комплекса антиген/антитяло и носители на нуклеинови киселини. Сместа се инкубира 15 до 75 минути при 35 до 55°С. 35

Ако използваните условия за хибридизиране на белязания олигонуклеотид до мултимерни подединици причинява нестабилност на комплексите антиген/антитяло, ходът на хибридизиране може да бъде предхождан от третиране на комплекса с протеинов напречно свързващ линкер, като глутаралдехид или подобен метод за стабилизиране на комплекса. След като веднъж протеиновият комплекс е стабилизиран, условията за хибридизиране на 45 нуклеинова киселина могат да бъдат променени, така че да включват SDS (до 1 %), неводни разтворители, като диметилформамид, диметилсулфоксид и формамид и температури до 70°С. 50

Важно е да се настроят условията за хибридизиране на нуклеинова киселина за под61315 държане стабилността на комплексите антиген/антитяло. Например,хибридизирането на по-къси пътеки от комплементарни последователности може да се извърши при по-ниски температури. При едно предпочитано изпълнение, допълнителните едноверижни участъци са от 12 до 20 бази, а температурата на хибридизиране е 35 до 45°С. Освен това, тъй като само едноверижните олигонуклеотиди, присъстващи при този етап са комплементарни, необходима е по-висока точност и следователно по-ниска концентрация на соли (0,3 М Na).

1- Мултимерна проба

Ако се използва мултимерна проба, се добавя белязан олигонуклеотид, който е комплементарен на повтарящия се полинуклеодит от М домена, който прибавя при условия, които позволяват той да хибридизиа с комплементарните олигонуклеотидни единици на мултимера. Полученият комплекс на белязана нуклеинова киселина в твърда фаза се отделя тогава от белязания олигонуклеотид в излишък чрез промиване за отстраняване на несвързания белязан олигонуклеотид и се отчита. 25 Подсилването може да бъде повишено чрез използването на повече от един вид мултимер (както се определя чрез последователността на подединицата) при изследването. В такива случаи се предвижда втори мултимер за свързване на повторна последователност на първия мултимер и комплексът се бележи след това с един олигонуклеотид, който е комплементарен към повторната последователност на втория мултимер. Всякакъв брой мултимери могат да се свързват в серии по този начин за постигане на по-голямо подсилване.

2- Полимеразна проба Ако се използва, полимеразна проба

РНК полимеразата, специфична за промотор40 ния участък (домен В) на подсилваната проба е следващата, която се добавя при подходящи условия на транскрипция и се продуцират мултиплени РНК-ови копия (с) на С домена матрица (с’). Количеството транскрипт е пропорционално на количеството на аналита в изходния препарат.

Условията за транскрипция се състоят от водна среда, за предпочитане буферирана, с подходящи соли, включващи обикновено магнезиева сол гАТР, rUTP, rGTP, гСТР, един РНК полимеразен ензим и включк! обикновено различни денатуриращи елементи, белтъч13 ни носители и инхибитори на рибонуклеаза. Инкубирането е обикновено за 15 до 90 минути, обикновено 60 минути и при температура, която е оптимална за избрания ензим, обикновено 35 до 42°С, обикновено 37°С.

Последователността на С домена е проектирана за специфична схема за откриване и няколко такива схеми могат да бъдат използвани за количествено определяне на транскриптите. Например, транскрипционният продукт (с) на С домена може да бъде подразделен на два субдомена - с_] и с₂ (фиг.2В). Субдомен Cj е комплементарна към проба залавяща транскрипти, която е имобилизирана върху твърд субстрат. Субдомен с₂ е комплементарен към проба за белязане. След хибридизиране количеството на задържан маркер е линейно пропорционално на количеството на аналит наличен в изходната проба.

При едно друго изпълнение транскриптът на С домена има само един с₍ субдомен. С доменът се транскрибира в присъствие на белязани рибонуклеотидни трифосфати и белязаният транскрипт е впоследствие свързан към белязана проба, залавяща транскрипт чрез свой комплементарен Cj субдомен и се определя количествено.

При друго изпълнение транскриптът на С домена има само с₂ субдомен. Домен С е транскрибиран в присъствие на биотинилирани рибонуклеинови трифосфати и транскриптите се залавят към авидиниви перли. Тогава транскриптът се хибридизира към белязана проба чрез неговия комплементарен субдомен с₂ и се определя количествено.

Възможни са няколко други методи за белязане и откриване на транскрипти на подсилваща проба, включително едновременното използване на белязани рибонуклеотиди и куплиране авидин/биотин, които са очевидни за специалистите в тази област.

- Общи обсъждания

Твърдата фаза, която се използва при изследването, може да се състои от частички или да бъде твърдата повърхност на стените на всеки от различните съдове, например центрофужни епруветки, колони, микротитърни блюда с ямки, филтри, епруветки, и т.н. За предпочитане се използват частици с големина в обхвата от около 0,4 до 200 , по-обичайно от 0,8 до 4,0 . до 200 , . Частиците могат да бъдат от всеки обикновен материал, напри мер латекс или стъкло. Първото антитяло, специфично за аналита или за едно второ антитяло, което е специфично за аналита, може да бъде стабилно прикрепено към твърдата повърхност чрез функционални групи по известните методи.

Бележещите проби, ако се използват полимеразни проби, включват последователности комплементарни към с₂ субдомена на транскриптите на подсилващата проба, акогато се използват мултимерни проби, бележещите проби включват последователности комплементарни към повтарящите се единици на В домена. Бележещата проба ще включва една или повече молекули (“маркери”), които директно или индиректно предоставят откриваем сигнал. Маркерът може да е свързан към отделни членове на комплементарната последователност или може да присъства като краен член или крайна опашка с голям брой маркери. В литературата се съобщава за различни средства за създаване на маркери, свързани към последователността. Например виж /11/, /12/, /13/, /14/, /15/, /16/ и /17/. Маркерите могат да бъдат свързани или ковалентно или нековалентно към комплементарната последователност. Маркери, които могат да бъдат използвани, включват радионуклиди, флуоресценти, хемиолуминисценти, багрила, ензими ензимни, субстрати, ензимни кофактори, ензимни инхибитори, ензимни подединици, метални йони и други подобни. Илюстративно, специфични маркери включват флуоресцеин, родамин, Тексаско червено, фикоеритрин, умбелиферон, луминол, NADPH, галактозидаза, пероксидаза от хрян и т.н. Виж /12/ за сравняване на методите за нерадиоизотопно белязане.

Бележещите проби могат да бъдат подходящо изготвени чрез химичен анализ, като описания в /18/. Чрез снабдяване с крайна група, която има благоприятна функционалност, различни маркери могат да бъдат обединени по функционалност. Така може да се осигури карбокси, тиол, амин, хидразин или друга функционалност, към които различните маркери могат да бъдат присъединени без да засягат разрушително образуването на дуплекси с последователността. Както вече беше посочено, може да има молекула с множественост маркери свързани към последователността, комплементарно на беле жещата последователност. От друга страна, може да има един лиганд свързан към бележещата последователност и да сс използва белязаният рецептор за свързване към лиганда за получаване на белязан аналитен комплекс.

В зависимост от естеството на маркера, могат да бъдат използвани различни методики за откриване наличността на маркер. За флуоресцентни материали са на разположение голям брой флуоресцентомери. С ензими може да бъде създаден и определен или флуоросцентен или цветен продукт чрез флуорометрия, спектрофотометрия или визуално. Различните маркери, които се използват при имуноизследвания и методиките приложими за имуноизследвания, могат да бъдат използвани при изследване на обекта.

Методът, използва при етапа на отделяне при изследването варира в зависимост от естеството на твърдата фаза. За частици се използва центруфугиране или филтриране за отделяне на частиците, отстраняване на супернантата или изолирането й. Когато се изследват частиците, те се промиват основно от един до пет пъти с подходяща буферирана среда съдържаща детергент например PBS с SDS. Когато средството за сепариране е стена или опора, супернатантата може да бъде изолирана или отстранена, а стената да бъде промита по същия начин, както е посочено за частиците.

Компететивно имуноизследване

Хибридните подсилващи проби от настоящото изобретение могат също да се използват като средство за белязане на антиген при едно компететивно имуноизследване. При типично изследване, излишък на антитяло, поликлонално или моноклонално, за предпочитане моноклонално, което се свързва специфично към аналита, се имобилизира върху твърда фаза, обикновено в блюдо с голям брой ямки. Една стандартна концентрация от белязан антиген се смесва със серийни разреждания на проба, за която се приема, че съдържа неизвестно количество от аналит. Отделните разреждания се излагат тогава на имобилизираното антитяло и се измерва количеството на свързания маркер. Способността на небелязания аналит да конкурира с белязания аналит се използва за изчисляване количеството на аналит в пробата.

При едно изпълнение полинуклеотидна част от В/С домена на полимеразната проба се конюгира към компетитивен имуноген. Тази хибридна молекула се използва тогава като белязан антиген, както е описано по-горе. След компетитивното свързване, се добавя полимераза (специфична за промотора на В домена) и транскрипционният продукт се изследва, както е описано в точка 1(A) по-горе.

При едно друго изпълнение полинуклеотидна част от М домена на мултимерната проба се конюгира към компетитивен имуноген. Тази хибридна молекула се използва тогава като белязан антиген, описан по-горе. След компетитивното свързване, М доменът се бележи и се определя количествено, както е описано по-горе.

За имуноген, свързан към ДНК, хомобифункционални реактиви като дисукцинимидил субстрат (DSS), етиленгликол бис(сукцинимидил) сукцинат (EGS) или р-фенилен диизотиоцианат (DITC), са вероятно по-полезни методи за свързване, отколкото описаните в точка 1(A) по-горе.

Комплекти за извършване на подсилени имуноизследвания, съгласно изобретението, съдържат в сбита комбинация следващите реактиви: една твърда фаза, която или е способна да свързва антиген аналит или, от друга страна има едно първо свързващо антитяло, свързано с нея, ако формата на изследване е такава, при която аналитьт е индиректно свързан към твърдата фаза чрез свързване на първото антитяло или чрез второ антитяло; по избор линкер второ и трето антитяло, които са специфични за аналита, и една хибридна линкерна проба, ако формата на изследване е такава, при която се използва полинуклеотидната подсилваща проба; амплифицираща проба се използва подходящо насочвана от ДНК РНК-полимераза и имобилизирани проби залавящи транскрипти (ако полимеразна подсилваща проба бъде използвана; и една подходяща бележеща проба. Тези реактиви са типично в отделни съдове в комплекта. Комплектът може също да включва хибридизационни буфери, разтвори за промиване, отрицателни и положителни контроли и писмени инструкции за извършване на изследването.

Примери за изпълнение на изобретението

Следващите примери са представени като илюстрации, но без да ограничават изобретението.

Пример 1. Имуноизследване за присъствие на HCV антиген в серум от човек.

Това изследване е проектирано за изпитване директно за наличност на С-100 антиген на вируса на хепатит С. Общото провеждане на това имуноизследване е както е описано по-горе. Микротитърни блюда се приготвят при използване на кози антимиши като първо антитяло. Това антитяло се имобилизира в ямките на микротитърно блюдо с 96 ямки. Второто антитяло е мишо моноклонално антитяло специфично за епитопа на HCV-100. Двойни разреждания на серум от индивиди, които трябва да бъдат изследвани за HCV, се приготвят в блокиращ буфер и се инкубират в микротитрационните ямки заедно с подходящи неинфектирани контроли. Третото антитяло е комбинация от поликлонални заешки антитела, които разпознават всеки от HCV антигените. Крайното антитяло е хибридна Т7 полимеразна подсилваща проба. Полипептидната част на домен А функционира като кози антизаешко антитяло и завършва имуноизследването “сандвич”.

След добавяне на Т7 полимеразната проба, транскрипцията на домен С се извършва чрез инкубиране на комплекса в 20 μ\ разтвор, съдържащ 40 шМ трие солна киселина, при pH 8, 20 шМ магнезиев двухлорид, 10 шМ спермидин, 10 тМ дитиотреитол, 0,15 mg/ml говежди серумен албумин, 1,25 шМ от всеки от гАТР, rCTP, rGTP, rUTP, 1600 единици/ml RNa3HH и 2000 единици/ml Т7 РНК полимераза. Тази смес се инкубира при 37°С за 1 час. Транскрипцията завършва чрез добавянето на 20 ml разтвор, съдържащ 8 X SSC и 0,2% SDS, а цялата смес се пренася в нови ямки, съдържащи имобилизирана залавяща проба със с,' последователности. Захващането на транскриптите от домен С (фиг.З) става чрез инкубиране при 55°С за 1 час, последвано от две промивания с 0,1 X SSC, 0,1% SDS.

Тогава транскриптите на домен С се бележат чрез добавяне на 50 fmol белязана с ензим проба (проба с₂') в 40 μ 1 4 X SSC 100 mg/ ml поли А за 15 минути при 55°С. Най-после комплексът се промива два пъти с 0,1 X SSC, 0,1% SDS, последвано от две промивания с 0,1 X SSC.

За откриване на АР, се използва задействаната с ензим диоксетанова реакция (виж /19/ и /20/). Процедурата за откриване е както следва: за етапа за белязане се добавят към всяка ямка 20 μ 1 НМ буфер с АР проба и ямките се инкубират при 55°С за 15 минути. Супернатантата се отстранява и ямките се промиват два пъти с 380μ 1 0,1 X SSC и 1 % SDS. Ямките се промиват тогава два пъти с 380// 1 от 0,1 х SSC за отстраняване на всяко остатъчно SDS. Добавят се 20 μ 1 3,3 х 10 ⁴ М диоксетан в СТАВ буфер към всяка ямка. Ямките се потупват слабо така, че реактивът да падне на дъното и се разбъркват слабо за разпределяне на реактива равномерно по дъното. Ямките се покриват с капачето на микротитърната паничка и се инкубират при 37°С за 1 час. Тогава ямките се отчитат с луминометър и се определят количествено по отношение на една стандартна крива, получена с познати количества на антиген.

Пример 2. Имуноизследване за наличността на антитяло за HCV в серум от човек

Микротитърни панички се покриват найнапред с HCV-100 антиген от вируса на хепатит С. Непосредствено преди добавянето се приготвя разтвор, съдържащ покриващ буфер (50 шМ натриев борат, pH 9,0), 31 ml/паничка BSA (25 mg/ml), HCV-100 (2,50 /zg/ml). След размесване за 5 min се добавя 0,2 ml/ ямка от разтвора към паничките, те се покриват и се инкубират за два часа при 37°С, след което разтворът се отстранява чрез изсмукване. Ямките се промиват два пъти с 0,4 ml промивен буфер (100 тМ натриев фосфат, pH 7,4, 140 тМ натриев хлорид, 0,1 % казеин, 1% (тегло/обем) тритон Х-100, 0,01% (тегло/обем) хибитан. След отстраняване на промивния разтвор, се добавя 200 μ\/ямка от Посткот разтвор (10 тМ натриев фосфат, pH 7,2, 150 шМ натриев хлорид, 0,1% (тегло/ обем) казеин, 3% захароза и 2 тМ фенилметилеулфонил флуорид (PMSF), паничките се покриват хлабаво за предотвратяване на изпаряването и се оставят да стоят при стайна температура за 30 min. Тогава кладенчетата се изсмукват за отстраняване на разтвора и се изсушават чрез лиофилизиране за една нощ без нагряване на платото.

За извършване на имуноизследването 20 1 от двойните разреждания на серумните проби или контроли се добавят към ямките, съдържащи 200 μ\ разредител за пробите (100 тМ натриев фосфат, pH 7,4, 500 тМ натриев хлорид, 1 mM EDTA, 0,1% (тегло/обем) казеин, 0,01% (тегло/обем) хибитан, 1% (тегло/обем) Тритон Х-100, 100 /zg/ml дрождев екстракт. Паничките се запечатват и се инкубират при 37°С за 2 h, след което разтворът се отстранява чрез изсмукване и ямките се промиват три пъти с 400 μ\ от промивния буфер (съдържащ PBS Туин 20).

След добавянето на серумни проби ямките се третират, както в пример 1 по-горе, с изключение на това, че заешки античовешки серум се замества при трето антитяло (заешки антианалит).

Пример 3. Използване на мултимерни проби при откриването на HCV инфекция

И в двата примера по-горе мултимерните проби могат да бъдат заместени с полимеразни проби. Всичките етапи са същите във всеки пример до добавянето на подсилващата проба, освен разбира се, че една мултимерна проба се използва вместо полимеразна проба. След свързването на подсилващата проба, се добавя един разтвор с 50 fmol на белязана олигонуклеотидна последователност със съществена хомоложност с мултимерната подединица на домен М. Тази белязана с ензим проба се добавя в 50 μ\ 4 х SSC, 100 /zg/ml поли А за 15 min при 55°С. Накрая комплексът се промива два пъти с 0,1 х SSC, 0,1% SDS, с последващо двукратно промиване с 0,1 х SSC.

За откриване на АР се използва задействана от ензим диоксетанова реакция (виж / 27/ и /28/) доставена от Лумиген Инк. Методът за откриване е както следва: За етапа на белязане се добавят 20 μ\ НМ буфер към АР пробата към всяка ямка и ямките се инкубират при 55°С за 15 min. Супернатантата се отстранява и ямките се промиват два пъти с 380 μ\ 0,1 х SSC и 0,1% SDS. Тогава ямките се промиват два пъти с 380 μ\ 0,1 х SSC за отстраняване на всеки остатъчен SDS. 20 μ 1 от 3,3 х ΙΟ'⁴ М диоксетан СТАВ буфер се добавят към всяка ямка. Ямките си почукват леко, така че реактивът да падне на дъното и се разбърква нежно за разпределяне на реактива равномерно по дъното. Ямките се покриват с капака на микротитърните панички и се инкубира при 37°С за един час. Тогава ямките се отчитат с луминометър и се определят количествено по отношение на стандартна крива, получена с известни количества антиген.

Пример 4. Използване на полинуклеотидни полимеразни проби при откриването на HCV инфекция

Във всеки от примерите 1 или 2 по-горе, полинуклеотидните полимеразни проби могат да бъдат заместени с хибридни полимеразни проби. Всичките етапи са същите във всеки пример чак до добавянето на третото антитяло, което е комбинация от поликлонални заешки антитела, които разпознават всеки от HCV антигените. Това се последва от добавянето на 50 μΐ хибридна линкерна молекула в концентрация от 20 /zg/ml в 0,2 М натриев бикарбонат. Това инкубиране се извършва според същата схема както при предишните инкубирания на антитяло. Хибридната линкерна молекула има един първи домен, който функционира като антизаешко антитяло и се свързва към всички по-рано свързани заешки трети антитела. Вторият домен на хибридния линкер е олигонуклеотид с 15 остатъка, последователността на който е комплементарна на домен А на полинуклеотидната полимеразна проба. След инкубиране и промиване се добавя полимеразна проба в 50 μΐ хибридизационен буфер (0,3 М натриев хлорид, 0,1% ΝΡ40) и се инкубира за 60 минути при 40°С. След инкубиране излишъкът на пробата се отстранява и комплексът се промива три пъти с хибридизационен буфер. Домен В се транскрибира и транскрипцията се определя количествено, както е описано в пример 1.

Пример 5. Използване на полинуклеотидни мултимерни проби при откриването на HCV инфекция

Това изследване е идентично с описаното в пример 4 до добавянето на полинуклеотидната проба. След това хибридизирането на маркера към подединиците на област М е същото както в пример 3.

Подобен на гребен полинуклеотид, с 15 зависещи странични вериги, всяка съдържаща три сайта (общо 45 сайта) комплементарен към белязана проба и една терминална биотинова молекула, прикачена към скелета, се приготвя както е описано по-горе.

Човешки Ig G при различни концентрации се имобилизира върху твърд носител. Имобилизираният Ig G се инкубира с биотинилиран афинитетно пречистен кози античовешки Ig G (концентрация на биотин 40 ng) и излишният антисерум се отмива от носителя. Тогава носителят се инкубира с 200 ng авидин-D и тогава с 100 fm или 500 fm от подоб17 ния на гребен разклонен полинуклеотид, при подходящо промиване. Тогава носителят се инкубира с белязана с пероксидаза от хрян нуклеотидна проба, комплементарна към свързващите сайтове на белязаната проба върху 5 полинуклеотида. Отчитането на оптичната плътност (O.D.) се извършва при 492/620 nm.

За целите на сравняване се извършват изследвания както по-горе при използване на полинуклеотид само с един свързващ сайт на белязаната проба.

Таблицата по-долу представя резултатите от тези изпитвания:

Конц. на човешки	Оптическа плътност (O.D.)
IgG (ng/ml)	45 сайт	1 сайт	45 сайт	1 сайт
	по 100 fm	по 100 fm	по 500 fm	по 500 fm

100	1,116	0,005	2,505	0,002
50	1,089	0,002	0,564	0,001
25	0,432	0,001	0,295	0,001
12,5	0,303	0,001	0,451	0

Както е съобщено, 45 сайт-ов полинуклеотид предлага много по-силен сигнал отколкото едносайтовия полинуклеотид.

Други варианти и приложения на различните подсилващи проби, описани в настоящата заявка са очевидни за специалистите в областта и влизат в обхвата на изобретението.

Списък на последователности (1) Обща информация:

(I) Предлагащ: Urdea, Michael S.

(II) Заглавие на изобретението: Проби на база на протеин-нуклеинова киселина и метод за използването им при имуноизследвания (III) Брой на последователностите: 12 (IV) Адрес за кореспонденция: Irell and Manella (B) Улица: 545 Middlefield Road Suite 200 (C) Град: Мунло Парк (D) Щат: Калифорния (E) Страна: САЩ (F) ZIP 4025 (V) Отчитана с компютър форма:

(A) Среден тип: флопи диск (B) Компютър: IBM PC съгласуван (C) Работна система: PC-DOS/MS-DOS (D) Софтуер: Патент # 1.1, Версия # 1,25 (91) Сегашни данни за приложение:

(A) Номер на прилагане: PCT/US 81/ 02925 (B) Дата на попълване: 06 май 1991 (С) Класификация:

(VIII) Пълномощни/агент информация:

(A) Име: Ciotti, Thomas, Е.

(B) Регистрационен номер: 21013 (C) Литература/номер на списъка: 23000047.51 (8Х) Информация за телекомуникация:

(A) Телефон: 415-327-7250 (B) Телефакс: 415-327-2952 (C) Телекс: 706141 (2) Информация за последов. ID N0:1:

(А) Характеристика на последователност:

(A) Дължина: 7 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верига: единична (D) Топология: линейна (1) Описание на последователност: Последов. ID N0:1:

ААААА (2) Информация за последов. ID N0:2 (1) Характеристика на последователност (A) Дължина: 17 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верига: единична (D) Топология: линейна (XI) Описание на последователност: Последов. I 0:2:

TAATACGACTATA (2) Информация за последов. ID N0:3:

(1) Характеристика на последователност:

(Л) Дължина: 17 базови двойки (B) Тип: Нуклеинова киселина (C) Верига: единична (D) Топология: линейна 5 (XI) Описание на последователност: последов. ID N0:3:

TATAGT CGTATTA (2) Информация за последов. ID N0:4!

(1) Характеристика на последователност: 10 (A) Дължина: 32 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верига: единична (D) Топология: линейна (XI) Описание на последователност: 15 последов. ID N0:4:

KTKGCTATC АААТТААТА

CGACTACTA ТА (2) Информация за последов. ID N0:5:

(1) Характеристика на последователност: 20 (A) Дължина: 32 базови двойки

Тип: Нуклеинова киселина (B) (C) Верига: единична (D) Топология: линейна 25 (XI) Описание на последователност: Последов. ID N0:5:

TATATGAGT CGTATTAATT TCGMTAAGCC AG (2) Информация за последов. ID N0:6: 30 (1) Характеристика на последователност:

(A) Дължина: 43 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верига: единична (D) Топология: линейна 35 (XI) Описание на последователност: Последов. I 0:6

GGGHGTGTG GTTTCGTAC TTAGCGAAAT ACTGTCCGAG TCG (2) Информация за послед. ID N0::5: 40 (1) Характеристика на последователност:

(A) Дължина: 43 базови двойки (B) Тип: Нуклеинова киселина (C) Верига: единична (D) Топология: линейна 45 (XI) Описание на последователност: Последов. I 0:7:

CGACTCGGAC AGTATTTCGC TAAGTACGAC ААССАСАТСТ ССС (2) Информация за последов. ID N0:8: 50 (I) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 10 базови двойки (B) Тип: Нуклеинова киселина (C) Верига: единична (D) Топология: линейна (XI) Описание на последователност:

Последов. ID N0:8:

АААААААА (2) Информация за последов. ID N0:9 (I) Характеристика на последователност:

(A) Дължина: 41 базови двойки (B) Тип: Нуклеинова киселина (C) Верига: единична (D) Топология: линейна (XI) Описание на последователност:

Последов. ID N0:9:

ТТТТТТТТТС

TGGCTTATCG

AAATTAATAC GACTCACTAT А (2) Информация за последователност ID N0:10:

(1) Характеристика на последователност (A) Дължина: 41 базови двойки (B) Тип: Нуклеинова киселина (C) Верига: единична (D) Топология: линейна (XI) Описание на последователност: Последов. ID N0:10:

ATAGTGAGT CGTATTAATT

TCGATAAGCC AGAAAAAAAA A (2) Информация за последов. ID N0:11:

(I) Характеристика на последователност:

(A) Дължина: 43 базови двойки (B) Тип: Нуклеинова киселина (C) Верига: единична (D) Топология: линейна (XI) Описание на последователност: Последов. ID N0:11:

GGGAGATGTG GTTGTCGTAC TTAGCGAAAT ACTGTCCGCAG TCG

Информация за последов. ID N0:12:

(I) Характеристика на последователност:

(A) Дължина: 41 базови двойки (B) Тип: Нуклеинова киселина (C) Верига: единична (D) Топология: линейна (XI) Описание на последователност: Последов. ID N0:12:

СССТСТЯСАС CAACAGCATC AATCGCTTA TGACAGGCTC AGC

Claims (35)

1. Патентни претенции

   1. Молекулярна проба за използване като усилвател на сигнали при имуноизследвания, съдържаща (включваща):

   първи домен (А), който е полипептид и функционира като антитяло, специфично за познат антиген;

   втори домен (В), който е двуверижен полинуклеотид, способен да функционира като промотор на ензим с активност на ДНКзависима РНК-полимераза;

   трети домен (С), който е или едно- или двуверижен и е съседен на втория домен, така че третият домен е в състояние да функционира като матрица за промоторната активност на втория домен.
2. 2. Проба съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че ДНК-зависещата РНКполимеразна активност произхожда от бактериофаг Т7.
3. 3. Проба съгласно претенция 1 или 2, характеризираща се с това, че вторият домен Вее дължина най-малко 10 и не повече от 40 нуклеотида.
4. 4. Проба съгласно претенция 3, характеризираща се с това, че третият домен Сее дължина най-малко 30 и не повече от 80 нуклеотида.
5. 5. Проба съгласно претенция 2, характеризираща се с това, че полимеразната активност произхожда от бактериофаг Т7 и последователността за втория домен В включва последователността:

   5-ТАА ТАС GAC ТСАСТТА-3'

   З-АТТ ATG CTG AGT GAT АТ-5'
6. 6. Проба съгласно претенция 2, характеризираща се с това, че полимеразната активност произхожда от бактериофаг Т7, в който нуклеотидната последователност на втория домен В е:

   5-CTG GCT TAT CGA ААТ ТАА ТАС GAC ТСА СТА ТА-3'

   3’-GAC CGA АТА GCT ТТА ATT ATG CTG AGT GAT АТ-5’
7. 7. Проба съгласно претенции от 1 до 6, в която 5' остатъкът от горната верига на нуклеотидната последователност на третия домен С е съседен на втория домен Вие гуанизинов остатък.
8. 8. Проба съгласно претенции от 1 до 7, в която последователността на третия домен е:

   5-GGG AGA TGT GGT TGT CGT ACT TAG CGA ААТ ACT GTC CGA

   3’-CCC TCT ACA CCA ACA GCA TGA ATC GCT TTA TGA CAG GCT CAG C-5'
9. 9. Проба съгласно претенция 8, в която 3' края на горната верига на ДНК нуклеотидната последователност на втория домен В е прикачена към 5' края на горната верига на нуклеотидната последователност на домен С.
10. 10. Проба съгласно претенция 1, в която транскриптът на третия домен С има два субдомена:

    (а) първи субдомен С_р който е способен да хибридизира с един олигонуклеотид залавящ линкер, като залавящият линкер е способен да хибридизира с един полинуклеотид, имобилизиран върху твърд субстрат; и (в) втори субдомен С₂, който е способен да се свързва към един нуклеотиден белязан линкер, като белязаният линкер е способен да се свързва към количествено определяема проба.
11. 11. Проба съгласно претенция 1, в която една функционална единица обхваща втория и третия домен В и С, които присъстват в мултиплени повтарящи се единици.
12. 12. Метод за засилване на един откриваем сигнал при имуноизследване, характеризиращ се с това, че се състои от:

    (а) директно или индиректно свързване към вещество за анализ на биохимична молекулярна проба, включваща един свързващ домен (А), един втори домен (В), който е двуверижна ДНК последователност, способна да функционира като промотор за ДНК-зависима РНК-полимеразна ензимна активност, и един трети домен (С), който е или едно- или двуверижен и е съседен на домен В, така че третият домен е способен да функционира като матрица за промоторната активност на втория домен;

    (в) отстраняване на несвързаната проба;

    (c) транскрибиране на мултиплени копия на РНК олигомери, които са комплементарни на последователността с’ на матрицата, на третия домен С на конструкцията на пробата, чрез ДНК-зависима РНК-полимеразна активност;

    (d) количествено определяне на РНК транскриптите.
13. 13. Метод съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че веществото за ана лиз се имобилизира най-напред директно или индиректно върху твърд субстрат.
14. 14. Метод съгласно претенция 12 или 13, характеризиращ се с това, че домен А е полипептид способен да функционира като антитяло и пробата е свързана директно или индиректно към веществото за анализ чрез домен А.
15. 15. Метод съгласно претенция 12 или

    13, характеризиращ се с това, че:

    (а) домен А на пробата е едноверижен олигонуклеотид; и (в) веществото за анализ е индиректно свързано към молекулярната проба посредством протеин/полинуклеотид хибридна линкерна молекула с два домена:

    (I) един първи домен, който е едноверижна полинуклеотидна последователност комплементарна на последователността на домен А на пробата;

    (II) един втори домен, който функционира като антитяло, специфично за анализираното вещество или за един епитоп на антитяло, което е специфично за анализираното вещество.
16. 16. Метод съгласно претенции 13, 14 или 15, характеризиращ се с това, че вторият домен В произхожда от ДНК-зависима РНК-полимераза на бактериофага Т7.
17. 17. Метод съгласно претенции 12, 13,

    14, 15 или 16, характеризиращ се с това, че:

    (а) третият домен С на пробата се транскрибира в присъствие на белязани рибонуклеотидни трифосфати;

    (в) транскриптите на третия домен имат първи субдомен С_р комплементарен към една олигонуклеотидна залавяща проба, която се имобилизира върху твърд субстрат; и (с) споменатите транскрипти се имобилизират и се определят количествено.
18. 18. Метод съгласно претенции 12, 13, 14, 15 или 16, характеризиращ се с това, че:

    (а) третият домен С на първата проба се транскрибира в присъствие на биотилинирани рибонуклеотидни трифосфати;

    (в) транскриптът на третия домен има един първи субдомен С_г, който е комплементарен на една белязана олигонуклеотидна проба;

    (c) транскриптите се имобилизират върху авидинилиран твърд субстрат; и (d) транскриптите се определят количествено.
19. 19. Метод съгласно претенции 12, 13, 14, 15 или 16, характеризиращ се с това, че:

    (а) третият домен С на пробата се транскрибира в присъствие както на белязани, така и на биотилинирани нуклеотидни трифосфати;

    (в) транскриптите се имобилизират върху авидинилиран твърд субстрат; и (с) транскриптите се определят количествено.
20. 20. Метод съгласно претенции 12, 13, 14, 15 или 16, характеризиращ се с това, че:

    (а) транскриптът на третия домен С на пробата има два субдомена:

    (I) един първи субдомен С_р който е комплементарен на една олигонуклеотид-залавяща проба, като залавящата проба се имобилизира върху твърд субстрат; и (II) един втори субдомен С₂, който е комплементарен на белязана нуклеотидна проба;

    (в) транскриптът се хибридизира към залавящата проба;

    (c) белязаната проба се хибридизира към споменатия транскрипт; и (d) белязаната проба се определя количествено.
21. 21. Метод съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че единицата, съдържаща втория и третия домен В и С, на първата проба присъстват като мултиплени повтарящи се В/С единици.
22. 22. Молекулярна проба за използване като усилвател на сигнал при имуноизследване, състояща се от:

    (а) един първи домен (А), съдържащ полипептид способен да функционира като антитяло, което се свързва специфично към известно вещество за анализ; и (в) един втори домен (М), съдържащ множество едноверижни олигонуклеотидни подединици, които са способни да се свързват специфично към интересуваща ни едноверижна аминокиселинна последователност.
23. 23. Проба съгласно претенция 22, характеризираща се с това, че всяка олигонуклеотидна единица на втория домен М, обхваща около 15 до 50 бази и има GC състав от около 40 до около 60%.
24. 24. Проба съгласно претенция 22, характеризираща се с това, че молекулата е с линейна структура.
25. 25. Проба съгласно претенция 22, характеризираща се с това, че молекулата е с разклонена структура.
26. 26. Проба съгласно претенция 22, характеризираща се с това, че поне една част от олигонуклеотидните подединици на втория домен са свързани посредством една многофункционална част, произхождаща от съединение с формула

    R, - 0 - R - X (I)

    II

    У

    I

    R.

    в която R е органична част, за предпочитане нуклеинова киселина, R¹ е хидроксилна защитна група, която може да бъде отстранена при условия, при които не се отстранява синтетична нуклеинова киселина от твърдата фаза и не се отстраняват екзоцикличната азотна или фосфатна защитна група, X е фосфорсъдържаща група, която улеснява синтезата на нуклеинови киселини, Υ е радикал, произхождащ от една нуклеофилна група, и R² е R¹ или блокираща или защитна група, която може да се отстрани и замести с водород, без да се засяга R¹.
27. 27. Проба съгласно претенция 22, характеризираща се с това, че най-малко една част от олигонуклеотидните подединици са свързани чрез една многофункционална част, получена от съединение с формула в която Ζ е нуклеофил, R¹ е защитна група, която е обикновено стабилна към основи и чувствителна към киселини, R² е водород или метил, R³ е защитна група, която може да бъде отстранена и заместена с водород без да се засегне R¹, R⁵ е фосфорно производно, което позволява добавянето на нуклеотиди към 5' позицията на олигонуклеотидната верига по време на химичния синтез, R⁶ е метил, водород, йод, бром или флуор и X е показател от 1 до 8 включително.
28. 28. Проба съгласно претенция 22, характеризираща се с това, че най-малко една част от олигонуклеотидните единици са свързани чрез една многофункционална част, произхождаща от съединение с формула

    R - О - СН₂ N(iPr)₂ '/

    Н - С - 0 - Р.

    I\

    R - О - СН₂OR където R е споменатата хидроксилна защитна група, в която iPr е изопропил и R¹ е метил или /?-цианоетил.
29. 29. Метод за подсилване на откриваем сигнал, използван за откриване и за количествено определяне на антиген при имуноизследване, характеризиращ се с това, че:

    (а) биохимична молекулярна проба, включваща един свързващ домен (А) и един втори домен (М), който включва множество едноверижни ДНК олигомерни подединици, способни да хибридизират с едноверижен белязан олигонуклеотид се свързва директно или индиректно към едно вещество за анализ;

    (в) отстраняване на несвързаната проба;

    (c) хибридизиране на едноверижни белязани олигонуклеотиди, което обхваща една нуклеотидна последователност, която е комплементарна на последователността на подединицата на домен М от пробата към подединици на втория домен;

    (d) отстраняване на белязания олигонуклеотид;и (e) количествено определяне на количеството белязан олигонуклеотид, свързан към пробата.
30. 30. Метод съгласно претенция 29, характеризиращ се с това, че веществото за анализ първо се имобилизира директно или индиректно върху твърд субстрат.
31. 31. Метод съгласно претенция 30, характеризиращ се с това, че доменът А е един полипептид способен да функционира като антитяло и пробата е свързана директно или индиректно към веществото за анализ чрез домен А.
32. 32. Метод съгласно претенция 31, ха рактеризиращ се с това, че полипептидът от домен А се свързва специфично към един епитоп на антитяло, което се свързва специфично към веществото за анализ.
33. 33. Метод съгласно претенция 29, характеризиращ се с това, че:

    (а) домен А на пробата е едноверижен полинуклеотид; и (в) веществото за анализ е индиректно свързано към молекулярната проба посредством една протеин/полинуклеотид хибридна линкерна молекула с два домена:

    (I) първи домен, който е едноверижна полинуклеотидна последователност по същество комплементарна на последователността на домен А на пробата;

    (II) втори домен, който функционира като антитяло, специфично за веществото за анализ.
34. 34. Метод за подсилване на откриваем сигнал при компетитивно имуноизследване, характеризиращ се с това, че:

    (а) се конструира молекулярна проба, състояща се от:

    (I) първи домен (А), който е способен да функционира като имуноген;

    (II) втори домен (В), който е двуверижен полинуклеотид, способен да функционира като промотор на ДНК-зависима РНК-полимеразна ензимна активност; и (III) трети домен (С), който е или едноверижен или двуверижен и е съседен на втория домен, така че третият домен е способен да действа като матрица за промоторната активност на втория домен;

    (в) имобилизира се проба директно или индиректно, върху твърд субстрат в присъствие на конкуриращо вещество за анализ;

    (c) отстранява се несвързаната проба;

    (d) транскрибират се множествени копия на РНК олигомери, които са комплементарни на последователността с’ на матрицата на третия домен С, на пробата посредством ДНК-зависима РНК-полимеразна активност;

    (e) транскриптите се определят количествено.
35. 35. Метод за подсилване на откриваем сигнал при компетитивно имуноизследване, характеризиращ се с това, че:

    (а) се конструира молекулярна проба, включваща:

    (I) един първи домен (А), който е способен да функционира като антиген; и (II) втори домен (М), включващ множество едноверижни олигонуклеотидни подединици, които са способни да се свързват специфично към едноверижна последователност на нуклеинова киселина, представляваща интерес;

    (в) имобилизира се пробата директно или индиректно, върху твърд субстрат в присъствие на конкуриращо вещество за анализ;

    (c) отстранява се несвързаната проба;

    (d) хибридизират се едноверижните белязани олигонуклеотиди, които включват една нуклеотидна последователност, която е комплементарна на последователността на подединицата на домен М на пробата, с подединиците на втория домен;

    (e) отстраняване на несвързания белязан олигонуклеотид; и (f) количествено определяне на количеството на белязания олигонуклеотид, свързан към пробата.