RO113496B1 - Proba moleculara hibrida polipeptida/polinucleotida si metoda de amplificare a unui semnal detectabil intr-o determinare imunologica - Google Patents
Proba moleculara hibrida polipeptida/polinucleotida si metoda de amplificare a unui semnal detectabil intr-o determinare imunologica Download PDFInfo
- Publication number
- RO113496B1 RO113496B1 RO92-01380A RO9201380A RO113496B1 RO 113496 B1 RO113496 B1 RO 113496B1 RO 9201380 A RO9201380 A RO 9201380A RO 113496 B1 RO113496 B1 RO 113496B1
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- domain
- sample
- analyte
- stranded
- sequence
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 73
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 title claims description 31
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 30
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 29
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 29
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 title 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 185
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 55
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 55
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 32
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 32
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims description 84
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 78
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 51
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 47
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 43
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 35
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 28
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 27
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 26
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 26
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 26
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 25
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 23
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 23
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 22
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 21
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 21
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 19
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 19
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 17
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 15
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 claims description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 11
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 11
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 claims description 11
- -1 ribonucleotide triphosphates Chemical class 0.000 claims description 11
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 9
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 claims description 8
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 8
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 7
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 7
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 5
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 5
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 5
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 4
- ZGEGCLOFRBLKSE-UHFFFAOYSA-N methylene hexane Natural products CCCCCC=C ZGEGCLOFRBLKSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical group [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 3
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 claims description 3
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 2
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 claims description 2
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 claims description 2
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 claims 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims 2
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 claims 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 claims 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 claims 1
- BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N hydridophosphorus(.) (triplet) Chemical class [PH] BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 5
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 3
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 3
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 3
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 3
- 108020001568 subdomains Proteins 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 3
- 125000000424 1,2-diol group Chemical group 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 244000141359 Malus pumila Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 150000003973 alkyl amines Chemical class 0.000 description 2
- 235000021016 apples Nutrition 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- DMSZORWOGDLWGN-UHFFFAOYSA-N ctk1a3526 Chemical compound NP(N)(N)=O DMSZORWOGDLWGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- ZWIBGKZDAWNIFC-UHFFFAOYSA-N disuccinimidyl suberate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ZWIBGKZDAWNIFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N rGTP Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 235000007265 Myrrhis odorata Nutrition 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 240000004760 Pimpinella anisum Species 0.000 description 1
- 235000012550 Pimpinella anisum Nutrition 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101710086015 RNA ligase Proteins 0.000 description 1
- 108091027568 Single-stranded nucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003172 anti-dna Effects 0.000 description 1
- 230000009833 antibody interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009831 antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000005081 chemiluminescent agent Substances 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007596 consolidation process Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000000464 effect on transcription Effects 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 231100001261 hazardous Toxicity 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000011905 homologation Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical class OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- SXADIBFZNXBEGI-UHFFFAOYSA-N phosphoramidous acid Chemical group NP(O)O SXADIBFZNXBEGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003017 phosphorus Chemical class 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000010517 secondary reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/01—DNA viruses
- G01N2333/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
- G01N2333/04—Varicella-zoster virus
- G01N2333/045—Cytomegalovirus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pathology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Prezenta invenție se referă la o probă moleculară hibridă polipeptidă/ polinucleotidă și la o metodă de amplificare a unui semnal detectabil într-o determinare imunologică, în general în domeniul imunologiei și a chimiei acidului nucleic. Mai precis, se referă la utilizarea hibridizării acidului nucleic ca mijloc de amplificare a semnalelor detectabile în determinări imunologice.
In momentul de față, hibridizările acidului nucleic sunt utilizate în mod obișnuit în cercetarea genetică, în cercetarea biomedicală și în diagnosticarea clinică, în scopul de a detecta și a stabili cantitativ anumite secvențe de nucleotide care sunt prezentate în amestecuri heterogene de ADN, ARN și/sau alte materiale. In determinarea de bază a hibridizării acidului nucleic, acesta este hibridizat direct sau indirect, acid nucleic analit cu unică catenă (fie ADN fie ARN], la o probă de acid nucleic marcat, și duplexurile conținând marcaj sunt evaluate cantitativ.
Au fost utilizate ambele marcaje, atât radioactive cât și cele care nu sunt radioactive.
Determinarea de bază este lipsită de sensibilitate. Când analitul este prezent în număr mic de transcrieri sau în concentrație diluată, semnalul nu poate fi distins de zgomotul de fond. Au fost dezvoltate variații ale schemei de bază pentru a facilita separarea duplexurilor țintă de materialul străin și/sau pentru a amplifica secvențele analit, în scopul de a facilita detecția, dar aceste variații au avut în general dezavantajul unor proceduri complexe și cu pierdere de timp, fond mare, sensibilitate scăzută și dificultăți în evaluarea cantitativă, așa cum s-a arătat și în literatura de specialitate în domeniu.
Determinările imunologice sunt utilizate de asemenea în mod obișnuit în cercetarea genetică, cercetarea biomedicală și diagnosticile clinice pentru a detecta și evalua cantitativ epitopi antigenici particulari care sunt prezenți în amestecuri heterogene de probe de sânge, extracte celulare și alte ma teriale. O determinare imunologică de bază, implică legarea specifică a unui anticorp, monoclonal sau policlonal, la un antigen țintă și la un mijloc pentru detectarea reacției. Astfel de mijloace au fost încorporate în diverse determinări imunologice directe, indirecte și de tip sandviș. Totuși, sensibilitatea interacțiunii esențiale antigen/anticorp a prezentat în mare parte aceleași dificultăți ca cele descrise mai sus pentru hibridizările de acid nucleic.
In prezent, sunt utilizate pentru determinări imunologice, diverse tehnici cum ar fi determinări radioimunologice, cu imunoperoxidază și de tip ELISA. Totuși, determinările radioimunologice au dezavantajul că se cere utilizarea unor reactivi periculoși care nu sunt sănătoși pentru mediul înconjurător, iar imunoperoxidaza și metoda ELISA au dezavantajul unui raport semnal față de zgomot scăzut și sunt limitate la amplificare de semnal.
Se cunoaște o metodă de determinare a hibridizării tip sandviș în faza de soluție, în care acidul nucleic de analizat este hibridizat la o “probă de marcare” și la o “probă de capturare”. Complexul probă analit este cuplat prin hibridizare la un suport solid. Acest lucru permite îndepărtarea oligonucleotidei de analizat din soluție, sub formă de complex în fază solidă, astfel concentrând analitul, se ușurează separarea acestuia de ceilalți reactivi, și se îmbunătățește detecția sa ulterioară.
Se cunosc probe de polinucleotide multimerice, liniare sau ramificate, care au două domenii și metode de utilizare a acestor probe ca amplificatpri de semnal la determinările cu hibridizare de acid nucleic. Primul domeniu este complementar unei secvențe oligonucleotidice cu catenă unică de interes, și al doilea domeniu este alcătuit dintr-o multitudine de subunități oligonucleotidice cu unică catenă, care sunt complementare la o oligonucleotidă marcată, cu unică catenă.
Se cunosc, de asemenea, probe de polinucleotide care au trei domenii,
RO 113496 Bl precum și metode pentru utilizarea acestor probe ca amplificatori de semnal la determinările cu hibridizare de acid nucleic. Primul domeniu este complementar la o secvență cu unică catenă de oligonucleotida de interes, al doilea domeniu este capabil să funcționeze ca promotor pentru activitatea enzimei ARN polimeraza dependentă de un fag ADN bacterial și al treilea domeniu este capabil să funcționeze ca templat transcripțional pentru activitatea polimerazei.
Moleculele proteină/hibrid ADN au fost utilizate ca probe, în determinările de hibridizare a acidului nucleic în care porțiunea de proteină funcționează ca un component marcator.
Moleculele hibrid de proteină/ ADN au fost utilizate de asemenea, ca fiind probe în determinările imunologice. In literatura de specialitate, se descrie o probă hibrid marcată radioactiv, care conține o proteină și o oligonucleotidă radioactivă legată covalent. Porțiunea radioactivă este utilizată pentru a indica prezența porțiunii de proteină într-o probă biologică.
Se cunoaște de asemenea, o moleculă proteină/ADN hibrid, în care porțiunea de proteină recunoaște în mod specific o țintă proteinică, și porțiunea de acid nucleic oferă o funcțiune de marcate.
Proba moleculară hibrid polipeptidă/polinucleotidă, conform invenției, cuprinde un prim domeniu (A), care este o polipeptidă capabilă să funcționeze ca un anticorp care se leagă în mod specific la un antigen cunoscut și un al doilea domeniu (B) care poate fi o polideoxiribonucleotidă cu dublă catenă capabilă să funcționeze ca promotor pentru activitatea unei enzime ARN polimeraza dependentă de ADN și un al treilea domeniu (C) care este, fie cu o simplă, fie cu o dublă catenă și adiacent la domeniu al doilea, astfel încât al treilea domeniu să fie capabil să funcționeze ca un templat pentru activitatea de promotor al celui de al doilea domeniu, fie un doilea domeniu (M) cuprinzând o mulțime de subunități oligonucleotidice cu simplă ca tenă, care sunt capabile să se lege în mod specific la o secvență de acid nucleic cu simplă catenă, de interes, și, în ambele situații, mijloace pentru conjugarea primului și celui de al doilea domeniu.
Metoda de amplificare a unui semnal detectabil într-o determinare imunologică, în conformitate cu prezenta invenție, cuprinde etapa de construire a unei molecule hibride în care primul domeniu este o polipeptidă capabilă să funcționeze ca o heptenă și acest domeniu este conjugat la domeniul al doilea/al treilea (B/C) al probei de polimerază sau, la un domeniu [M] al probei de multimer după care urmează etapele:
(a) imobilizarea sau nu a analitului, analitului antigenic sau a moleculei hibride, direct sau indirect pe un substrat solid, respectiv în prezența sau absenta unui analit competitiv;
(b) legarea directă sau indirectă de analit și de proba moleculară cuprinzând:
i] un domeniu (A) de legătură ii] un al doilea domeniu (B) care este o secvență ADN cu dublă catenă capabilă să funcționeze ca un promotor pentru activitatea enzimei ARN polimerază dependentă de ADN, și iii] un al treilea domeniu (C) care este fie cu simplă, fie cu dublă catenă și adiacent domeniului (B) astfel încât cel de al treilea domeniu este capabil să funcționeze ca un templat pentru activitatea promotorului celui de al doilea domeniu sau, o probă moleculară hibridă cuprinzând: (i) un domeniu (A) de legătură care este o polipeptidă capabilă să funcționeze ca un anticorp ce se leagă în mod specific la un antigen de interes; [ii] un al doilea domeniu [M] cuprinzând o mulțime de subunități oligonucleotidice de ADN cu simplă catenă, subunități oligonucleotidice care sunt capabile să se lege în mod specific la o oligonucleotidă marcată cu simplă catenă și (iii) mijloace pentru conjugarea primului și celui de al doilea domeniu;
(c) îndepărtarea probei nelegate;
(d) transcrierea de copii multiple
RO 113496 Bl de oligomeri ARN care sunt complementari față de secvența de templat c’ al celui de al treilea domeniu (C) al probei de construct prin intermediul activității ARN polimerazei dependentă de ADN sau, hibridizarea oligonucleotidelor marcate cu simplă catenă care cuprind o secvență nucleotidică care este în cea mai mare parte complementară la secvența de subunitate a probei celui de al doilea domeniu la subunitățile din cel de al doilea domeniu și respectiv, transcrierea de copii multiple de oligomeri ARN prin intermediul activității polimerazei ARN dependentă de ADN și evaluarea cantitativă a transcripțiilor - aceasta în cazul în care se utilizează o probă de polimerază; sau, hibridizarea oligonucleotidelor marcate, cu simplă catenă, la subunitățile domeniului și îndepărtarea marcatului nelegat și evaluarea cantitativă a marcatului legat - aceasta în cazul în care se utilizează o probă multimer.
Avantajul prezentei invenții este că se oferă metode de amplificare de semnal, utilizând molecule de polinucleotidă, care s-au dovedit utile în determinările cu hibridizare de acid nucleic și care sunt folosite în determinările imunologice. Aceste probe amplificatoare oferă o intensificare foarte reproductibilă a semnalului, un raport semnal la zgomot cu înaltă reproductibilitate, care sunt ele însele evaluabile cantitativ și reproductibile, și sunt capabile să se combine în mod specific cu un antigen analit prezent la concentrații scăzute, și de asemenea cu porțiuni de raportor de acid nucleic “universal” pentru a forma complecși stabili.
Deci, un aspect al invenției este o probă hibrid de moleculă polipeptidă/ polinucleotidă care este utilizată ca amplificator al semnalului detectabil în determinări imunologice. Intr-o întruchipare, “proba de polimerază” cuprinde trei domenii:
(a) un prim domeniu (A) care este polipeptidă și funcționează ca un anticorp specific pentru un antigen specific;
(bj un al doilea domeniu [B] care este polioxiribonucleotidă cu dublă catenă capabilă să funcționeze ca promotor pentru activitatea unei enzime ARN polimerază dependente de ADN;
(c) un al treilea domeniu [C] care este fie cu unică catenă fie cu dublă catenă și adiacent la al treilea domeniu, astfel încât al treilea domeniu este capabil să funcționeze ca un templat pentru activitatea de promotor al celui de al doilea domeniu.
O a doua întruchipare este o probă hibrid molecular polipeptidă/ polinucleotidă pentru utilizare ca amplificator al semnalului detectabil în deteminări imunologice. Această “probă multimerică” cuprinde două domenii:
(a) un prim domeniu (AJ care este polipeptidă capabilă să funcționeze ca un anticorp care se leagă în mod specific la un antigen cunoscut;
(b) un al doilea domeniu (M) conținând o multitudine de subunități oligonucleotidice, cu unică catenă care sunt capabile să se lege în mod specific la o secvență de acid nucleic cu unică catenă, de interes; și (c) un mijloc pentru a cupla primul și al doilea domeniu.
Un alt aspect al prezentei invenții, este o metodă de amplificare a unui semnal detectabil într-o determinare imunologică prin utilizarea probelor de polimerază descrise mai sus. Această metodă cuprinde:
(a) imobilizarea analitului antigenic direct sau indirect pe un substrat solid;
(b) legarea directă sau indirectă de analit a unei prime probe moleculare cuprinzând:
(i) un domeniu (A) de legare;
(ii) un al doilea domeniu (B) care este o secvență de ADN cu catenă dublă capabilă să funcționeze ca un promotor pentru activitatea enzimei ARD polimerază dependentă de ADN; și (iii) un al treilea domeniu (C) care este fie cu unică catenă fie cu dublă catenă și adiacent la domeniul (B), astfel încât al treilea domeniu este capabil să funcționeze ca un templat pentru activitatea promotorului celui de al doilea
RO 113496 Bl domeniu;
(c) îndepărtarea probei nelegate;
(d) transcrierea de copii multiple de oligomeri ARN care sunt complementari față de secvența de templet c’, a celui de al treilea domeniu (C), a probei de construct prin intermediul activității ARN polimerazei dependente de ADN; și (e) evaluarea cantitativă a transcripturilor.
Un alt aspect al prezentei invenții, este o altă metodă de amplificare a unui semnal detectabil într-o determinare imunologică prin utilizarea probelor multimere descrise mai sus. Această metodă cuprinde:
(a) imobilizarea analitului direct sau indirect pe un substrat solid;
(b) legarea directă sau indirectă la analit a unei probe moleculare hibride cuprinzând:
(i) un domeniu (A) de legare care este o polipeptidă capabilă să funcționeze ca un anticorp care se leagă în mod specific la un antigen de interes; și (ii) un al doilea domeniu (M) cuprinzând o multitudine de subunități oligonucleotidice de ADN cu unică catenă care sunt capabile să se lege în mod specific la o oligonucleotidă marcată, cu unică catenă; și (iii) un mijloc pentru cuplarea primul și al doilea domeniu;
(c) îndepărtarea probei nelegate;
(d) hibridizarea oligonucleotidelor marcate, cu unică catenă care cuprind o secvență care este în cea mai mare parte complementară la secvența de subunitate a probei de domeniu (M) la subunitățile din cel de al doilea domeniu;
(e) îndepărtarea oligonucleotidelor marcate nelegate;
(f) evaluarea cantitativă a cantității de oligonucleotidă marcată legată la probă.
Un alt aspect al prezentei invenții, este o metodă de amplificare a semnalului detectabil într-o determinare imunologică competitivă care cuprinde:
(a) construirea unei molecule hibride în care doemniul (A) este o polipeptidă capabilă să funcționeze ca o hep8 tenă și acest domeniu este conjugat fie la un domeniu B/C al probei de polimerază fie la un domeniu (M) al probei de multimer;
(b) imobilizarea moleculei hibrid, direct sau indirect de un substrat solid în prezența unui analit competitiv;
(c) îndepărtarea probei nelegate:
(d) transcrierea unor copii multiple de oligomeri ARN prin intermediul activității polimerazei ARN dependente de ADN și evaluarea cantitativă a transcripturilor - aceasta în cazul că se utilizează o probă de polimerază; sau (e) hibridizarea oligonucleotidelor cu unică răsucire, marcate, la subunitățile domeniului și, îndepărtând marcatul nelegat și evaluând cantitativ marcatul legat - aceasta în situația în care se utilizează o probă muiltimer.
Se dau, în continuare, 6 exemple de realizare a invenției, în legătură cu fig.
1...4, care reprezintă:
- fig. 1A, este o reprezentare schematică a unei probe de amplificator de tip polimerază monomerică, și literele din partea de jos desemnează catenele dintr-un domeniu. O primă literă desemnează o catenă inferioară (de citit 3' - la 5', de la stânga la dreapta). Domeniul A, este un aniticorp care recunoaște un epitop țintă. Domeniul B este promotorul pentru ARN polimerază. Secvența c este tempaltul pentru ARN polimerază. Proba este sintetizată ca o unică catenă AAAAAAA la capătul regiunii C, reprezintă linkerul poli-A adăugate pentru a permite autoconsolidarea. Regiunea A/T între domeniul A și B este cerută opțional pentru a menține activitatea de anticorp;
- fig. 1B, este secvența ADN a unei întruchipări a probei amplificatoare de tip polimerază. Domeniul promotor B constă din secvența de consens a promotorului T7 bacteriofag (5'TAATACGACTCACTATA-3') plus 1 5 reziduuri suplimentare 5', la secvența de promotor;
- fig. 1C, este o reprezentare schematică a unei probe amplificatoare
RO 113496 Bl de tip polimerază multimerică în care domeniul A funcționează ca un anticorp, și domeniile B și C dublu cuaternare sunt autoconsolidatoare;
- fig. 1D, este o reprezentare schematică a probelor amplificatoare multimerice în care domeniul A funcționează ca un anticorp și domeniul M este alcătuit din subunități oligomerice multiple. Sunt reprezentați atât multimerii ramificați cât și cei sub formă de pieptene;
- fig. 2A, este o reprezentare schematică a unui sistem de determinare imunologică de tip sandviș care încorporează proba amplificatoare de tip polimerază. Proteina analit este imobilizată indirect pe un substrat solid prin complexare cu un prim anticorp Tab” (de iepure); și îmbinată indirect la proba amplificatoare prin complexare cu un al doilea anticorp (de exemplu un anticorp de șoarece);
- fig. 2B, este o reprezentare schematică a unui sistem de determinare imunologică/hibridizare de tip sandviș. Proteina analit este imobilizată indirect ca mai înainte. Al doilea anticorp (de șoarece - antianalit) este complexat cu o moleculă hibrid anticorp/polinucleotidă în care porțiunea de proteină funcționează ca un anti-anticorp de șoarece și porțiunea de polinucleotidă este complementară la regiunea a’ de nucleotidă a probei amplificatoare (în acest caz, o probă multimer);
- fig. 3, este o reprezentare a utilizării transcripturilor de ARN polimerază ca molecule raportoare într-o determinare imunologică după ce se formează complexul de tip sandviș care încorporează proba de polimerază, se adaugă ARN polimerază și sunt produse transcripturile (c) multiple de ARN complementare la secvența de templat (c’J. Aceste secvențe au două sub-domenii; cn care este complementar la o probă de capturare, imobilizată pe un substrat solid; și c2 care este complementar la o probă de marcare. Aceasta permite imobilizarea indirectă a marcatului și determinarea cantitativă ușoară a semnalului probei de hibridizare. Se desemnează marcatul încorporat care poate fi radioactiv, chemiluminiscent, fluorescent sau enzimatic;
- fig. 4, (Părțile A-F) ilustrează procedeele utilizate pentru obținerea multimerilor având structurile “de tip pieptene” și/sau bifurcați.
Exemplul 1. Imunodeterminare pentru prezența unui antigen HCV În ser uman. Această determinare este destinată pentru testarea directă a prezenței antigenului C-100 a virusului Hepatitei C. Plăcuțele de microtitrare sunt preparate utilizând ca prim anticorp, un anticorp de capră - anti-șoarece. Acest anticorp este imobilizat în adânciturile unei plăcuțe de microtitrare cu 96 de cavități. Al doilea anticorp este un anticorp monoclonal de șoarece pentru un epitrop al HCV C-100. Sunt preparate diluții, în duplicate, ale serului de la indivizii care sunt pentru testat pentru HCV. Aceste diluții sunt preparate în tampon blocant și apoi incubate în cavitățile plăcuței împreună cu controale adecvate și neinfestate. Al treilea anticorp este o combinație de anticorp de iepure, policlonali, care recunosc fiecare dintre antigenele HVC. Anticorpul final este o probă amplificatoare de polimerază T7 hibridă. Porțiunea de polipeptidă a domeniului A funcționează ca un anticorp de caprăanti-iepure și completează sandvișul imunodeterminării.
După adăugarea probei de polimerază T7, se efectuează transcrierea domeniului c prin incubarea complexului în 20 pl de soluție conținând 40 mM Tris Hcl (pH=8), 20 mM’ MgCI2, 10 mM NaCI, 1mM Spermidină, 10 mM ditiotreitol, 0,15 mg/ml albumină din ser bovin, 1,25 mM din fiecare din rATP, rCPT, rGTP, rUTP, 1600 unități/ml Rășină și 2000 unități/ml polimerază T7 ARN. Aceste amestec este incubat la temperatura de 37°C, timp de o oră. Transcrisul este terminat prin adăugarea 20 pl dintr-o soluție ce conține 8 x SSC și 0,2 % SDS după care întreg amestecul este transferat în noi adâncituri care conțin proba imobilizată de captare
RO 113496 Bl cu secvențe c1. Captarea transcrisurilor domeniului C (din fig. 3) se efectuează prin incubare la temperatura de 55°C, timp de o oră și folosind o soluție care conține 0,1 x SSC și 0,1 % SDS.
Transcrisurile domeniului sunt apoi marcate prin adăugarea a 50 fmol de probă de enzimă marcată (ca'J în 40 pl de 4 x SSC, 100 pg/ml poli A, timp de 15 min și la temperatura de 55°C. In final, complexul este spălat de două ori cu 0,1 x SSC, 0,1 % SDS, urmat de două spălări cu 0,1 x SSC.
Pentru detecția de AP, se folosește o reacție ce utilizează o enzimă dioxetan activat, așa cum este cunoscut în literatura de specialitate. Procedeul de detecție este realizat așa cum se va arăta în cele ce urmează. Pentru etapa de marcare se adaugă, în fiecare adâncitură, câte 20 pl HM tampon cu proba de AP, după care aceste adâncituri sunt incubate la temperatura de 55°C, timp de 15 min. In continuare, supernatantul este îndepărtat și apoi adânciturile sunt spălate de câte două ori cu câte 380 pl de 0,1 x SSC, 0,1 % SDS pentru a îndepărta restul de SDS. La fiecare adâncitură, se adaugă apoi 20 pl la 3,3 x 104 M dioxetan în tampon CTAB. Adânciturile sunt lovite ușor, așa încât reactivul să cadă spre fundul adânciturii și aceasta este rotită ușor pentru a se distribui reactivul uniform pe fundul adânciturii. Cavitățile sunt apoi acoperite cu un capac etanș al plăcuței de microtitrare și se incubează într-un cuptor la temperatura de 37°C, pe o perioadă de o oră. Adânciturile sunt apoi citite cu un luminometru, și evaluate cantitativ față de o curbă standard generală care conține cantități cunoscute de antigen.
Exemplul 2. Imunodeterminări pentru prezența anticorpului la HCV În ser uman. Plăcuțele de microtitrare sunt mai întâi acoperite cu antigenul HCV ΟΙ 00 din virusul Hepatitei C. înainte de adăugare, se prepară o soluție care conține tampon de acoperire la suprafață (50 mM borat de sodiu, pH=9,0), 21 ml/plăcuță, BSA (25 pg/ml), HCV ΟΙ 00 (2,50 pg/ml). După o amestecare de cinci minute, se adaugă în plăcuțe câte 0,2 ml/adâncitură din soluție, și apoi acestea sunt acoperite și incubate la temeperatura de 37°C, pe o perioadă de două ore, după care soluția este îndepărtată prin aspirație. Adânciturile sunt spălate o dată cu câte 0,4 ml tampon (100 mM tampon de sodiu, pH=7,4, 140 mM clorură de sodiu, 0,1% caseină, 1% (g/v) Triton X-100, 0,01% (g/v) Hibitan. După îndepărtarea soluției de spălare, se adaugă 200 pl/cavitate din soluția de acoperire (10 mM fosfat de sodiu, pH=7,2, 150 mM clorură de sodiu, 0,1% (g/v) caseină, 3% sucroză și 2 mM fenilmetilsulfonil-fluorură-PMSF), după care plăcuțele sunt acoperite ușor pentru a preveni evaporarea și apoi sunt lăsate să stea la temperatura camerei pe o perioadă de 30 min. Adânciturile sunt apoi aspirate pentru a îndepărta soluția, și apoi sunt liofilizate la sec, peste noapte, fără a se încălzi raftul.
Pentru a realiza imunodeterminarea, în adâncituri se adaugă 20 pl soluții duplicat din probele de ser sau din probele de control care conțin 200 pl de diluant de probă (100 mM fosfat de sodiu, pH=7,4, 500 mM clorură de sodiu, 1 mM EDTA, 0,1% (g/v) caseină, 0,01% (g/v) Hibitan, 1% (g/v) Triton X100, 100 pg/ml extract de drojdie). In continuare, plăcuțele sunt acoperite etanș și apoi incubate la temeperatura de 37°C pe o perioadă de 2 h, după care soluția este îndepărtată prin aspirare, și apoi cavitățile sunt spălate de trei ori cu câte 400 pl tampon de spălare, care PBS în amestec cu 0,05 % Tween 20.
Ulterior adiției de probe de ser, cavitățile sunt tratate așa cum s-a arătat în cadrul exemplului 1 de mai sus, cu excepția că serul iepure anti-uman este înlocuit cu al treilea anticorp (iepure-antianalit).
Exemplul 3. Utilizarea probelor multimer în detectarea infectării cu HCV. In fiecare din cele două exemple care sau descris mai sus, probele de multimer pot fi înlocuite cu probe de polimerază. Toate etapele sunt aceleași cum s-a arătat mai sus, până la adăugarea
RO 113496 Bl probei de amplificare, cu excepția că se utilizează mai degrabă o probă de multimer decât o probă de polimerază. Ulterior legării probei amplificatoare, se adaugă o soluție cu omologare mare cu subunitatea multimerică a domeniului M. Această probă enzimă-marcat se adaugă la 40 pl de 4 x SSC, 100 pg/ml poliA, timp de 15 min și la temperatura de 55°C. In final, complexul a fost spălat de două ori cu 0,1 x SSC, 0,1% SDS, urmată de două spălări cu 0,1 x SSC.
Pentru detectarea AP, se folosește o reacție enzimă-dioxetan activat, așa cum este cunoscut din literatura de specialitate. Procedeul de detecție se realizează, după cum se va relata în cele ce urmează. Pentru etapa de marcare, la fiecare adâncitură 20 pl tampon HM cu proba AP, și adânciturile sunt incubate la temperatura de 55°C, timp de 15 min. Supernatantul, în continuare, este îndepărtat, iar adânciturile sunt spălate de câte două ori cu câte 38 pl de 0,1 x SSC și 0,1 % SDS. Adânciturile sunt apoi spălate de două ori cu 38 pl de 0,1 x SSC, pentru a îndepărta orice urmă de SDS rezidual. In fiecare cavitate, se adaugă câte 20 pl 3,3 x lO^M dioxetan în tampon CTAB. Cavitățile sunt lovite ușor astfel încât reactivul cade către fund, și sunt rotite ușor pentru a se distribui uniform pe fundul cavităților. Adânciturile sunt apoi acoperite cu capacul etanș al plăcuței de microtitrare și apoi sunt incubate într-un cuptor temperatura de 37°C pe o perioadă de o oră. In continuare, adânciturile sunt citite cu un luminometru, și evaluate cantitativ față de o curbă standard care a fost efectuată cu cantități de antigen care au fost cunoscute.
Exemplul 4. Utilizarea probelor de polinucleotid polimerază la detectarea infectării cu HCV. La fiecare din exemplele 1 sau 2 care au fost descrise mai sus, probele de polinucleotid polimerază pot fi substituite cu probe de polimerază hibrid. Toate etapele sunt aceleași în fiecare exemplu până la adăugarea celui de al treilea anticorp care este o combinație de anticorpi de șoarece policlonali care recunosc fiecare din antigenii HCV. Aceasta este urmată de adăugarea a 50 pl de moleculă de legare hibridă la o concentrație de 20 pg/ml în 0,2 M bicarbonat de sodiu. Această incubare este condusă în conformitate cu același protocol care este cunoscut în toate incubările de anticorp, așa cum se cunoaște în domeniu de specialitate. Molecula de legare hibridă are un prim domeniu care funcționează ca un anticorp anti-șoarece și se leagă la toți anticorpii de șoarece, al treilea, legați în prealabil. Al doilea domeniu al hibridului de legare este o oligonucleotidă cu 1 5 reziduuri a cărui secvență este în principal complementară la domeniu A al probei de polinucleotid polimerază. După incubare și spălare, proba de polimerază este adăugată în 50 pl de tampon de hibridizare (0,3 M NaCI, 0,1 % NP-40) și incubată timp de 60 min, la temperatura de 4Q°C. După incubare, se îndepărtează excesul de probă, iar complexul este spălat de trei ori cu tampon de hibridizare. Domeniul B este transcris, după care transcrisul este evaluat cantitativ, așa cum s-a descris în cadrul exemplului 1.
Exemplul 5. Utilizarea probelor de multimer polinucleotidă la detectarea infectării cu HCV. Această determinare este identică cu cea descrisă în cadrul exemplului 4 de realizare de mai sus, până la adăugarea probei de polinucleotidă. Ulterior hibridizării marcajului la subunitățile domeniului M și evaluarea cantitativă a marcajului, este aceeași ca cele arătate în cadrul exemplului 3 de realizare.
Exemplul 6. Utilizarea probei de multimer polinucleotidă în detectarea IgG uman imobilizate. O polinucleotidă ramificată de tip pieptene având 1 5 lanțuri laterale dependente fiecare, și conținând trei situsuri (45 de situsuri în total) complementare la o probă marcată și o moleculă de biotină terminală atașată la o coloană a fost preparată așa cum s-a s-a descris mai sus.
Pe un suport solid, a fost imobilizată IgG umană în diverse concentrații.
RO 113496 Bl
IgG imobilizată a fost incubată cu IgG anti-uman de capră purificat, cu afinitate biotinilat (concentrația de biotină este de 40 ng) și excesul de aniser a fost spălat de pe suport. Suportul a fost apoi in- 5 cubat cu 200 ng de avidină-D, și apoi cu 100 fm sau 500 fm de polinucleotidă ramificată de tip pieptene, cu spălări adecvate. Suportul a fost apoi incubat cu probă de oligonucleotidă marcată cu pe- io roxidază obținută din hrean, complementară la proba marcată și legând situsurile pe polinucleotidă. Citirile de densitate optică (O.D.) s-au efectuat la
492/620 nm.
In scopul de a face comparație, deteminările au fost făcute așa cum s-a arătat mai sus, și utilizând o polinucleotidă cu un singur situs de legare al probei de marcare.
In tabelul de mai jos, sunt prezentate rezultatele acestor teste care au fost efectuate.
Citirea de densitate optică [O.D.J
| Conc.lgG uman (ng/ml) | 45 situsuri C100fm | 1 situs C100 fm | 45 situsuri C 500 fm | 1 situs C 500 fm |
| 100 | 1,116 | 0,005 | 2,505 | 0,002 |
| 50 | 1,089 | 0,002 | 1,565 | 0,001 |
| 25 | 0,432 | 0,001 | 1,295 | 0,001 |
| 12,5 | 0,303 | 0,001 | 0,451 | 0 |
Așa cum s-a raportat, polinucleo- 25 tida cu 45 de situsuri oferă un semnal cu mult mai înalt decât polinucleotidă cu un unic situs.
Alte variații și aplicații ale diferitelor probe de aplificare descrise în a- 3 o ceasta invenție, pentru metoda de imunodeterminare vor fi clare specialiștilor în domeniu, și se intenționează a fi cuprinse în cadrul invenției de față.
Pentru o mai bună înțelegere a 3 5 invenției, se mai arată și următoarele:
- în cadrul prezentei invenții s-au utilizat unele definiții, cum ar fi:
Un “semnal detectabil” este un indiciu transmisibil al apariției unui eveni- 4 o ment biochimic, cum ar fi o hibridizare de acid nucleic sau legarea unui antigen și anticorp. In prezenta invenție, sunt descrise metode de amplificare a semnalelor detectabile a determinărilor 45 imunologice.
Termenul de “ARN polimeraza dependent de ADN” este o enzimă care facilitează polimerizarea ARN-ului de secvență specifică dintr-un templat ADN 50 complementar.
Termenul “domeniu” este o re giune particulară a unei molecule biochimice caracterizată prin funcțiunea sa.
Un “epitop” este acea porțiune a unei molecule imunogenice care este recunoscută specific de, și completează cu, anticorpul său corespunzător într-o reacție imunologică.
O moleculă “hibrid” nucleotidă/ peptidă cuprinde atât reziduuri de acid nucleic, cât și reziduuri de aminoacid, fiecare într-un domeniu funcțional separat al moleculei.
Termenul de imunogen” este o substanță care poate reacționa într-un mod specific cu un anticorp.
O reacție imunologică” este recunoașterea și legarea specifică a unui antigen la epitopul unui imunogen.
□ “determinare imunologică” este o metodă pentru determinarea prezenței unui epitop, prin combinarea unei reacții imunologice cu un mijloc pentru detectarea și evaluarea cantitativă a reacției.
□ polidezoxiribonucleotidă” este o moleculă de ADN polimeric. O “polinucleotidă” este o moleculă polimerică de ADN sau ARN.
Un “promotor” este un loc pe o
RO 113496 Bl polidezoxiribonucleotidă la care enzimă
ARN polimerază se leagă preparatorii pentru a iniția transcrierea.
Termenul “ARN polimerază dependentă de ADN” este o enzimă care facilitează polimerizarea de secvență specifică dintr-un templat ARN complementar.
“Transcrierea” este un procedeu, mediat de o enzimă, prin care se formează ARN dintr-un templat polinucleotidic complementar. “Catenă superioară” este o moleculă de ADN dublu catenă, în a cărui catenă capătul 5' este în stânga când secvența este citită de la stânga la dreapta. Secvența acestei catene este prezentată totdeauna deasupra secvenței pentru care “catena sa inferioară” complementară care este citită de la 3-5', de la stânga la dreapta.
In ceea ce privește modurile de realizare a invenției, arătăm și următoarele:
I - Probe de amplificare.
A. Probe polimeraze.
Un aspect al acestei invenții este o probă de ADN amplificatoare (la care se face referire ca la proba de polimerază”), conținând trei domenii funcționale. Această probă este utilizată pentru a mări semnalul detectabil în determinări imunologice.
Primul domeniu (A-fig. 1 A) este o polipeptidă care funcționează ca un anticorp cu specificitate pentru un antigen ales. Regiunea funcțională a polipeptidei este urmată de o regiune cu reziduuri, fie de aminoacid fie de acid nucleic, adică o regiune de distanțare care nu interferează semnificativ cu activitatea anticorpului. Activitatea anticorpului poate fi specifică pentru un epitop înșuși al analitului; totuși, într-o întruchipare preferată, anticorpul este direcționat către un determinant antigenic al imunoglobulinei particulare folosită în determinarea descrisă mai sus (de exemplu IgG anti-iepure, sau anti-uman IgG; vezi fig.2A). După cum s-a procedat, analitul este contactat cu un anticorp specific, excesul de anticorp este îndepărtat și apoi proba de amplificare este lăsată să reacționeze cu anticorpul legat.
De preferință, analitul este mai întâi imobilizat pe un substrat solid pentru a facilita procedeele ulterioare de spălare. Această imobilizare poate fi directă (adică preparatele biologice conținând analitul pot fi legate la un filtru de nitroceluloză) sau indirect (adică - un anticorp specific poate fi imobilizat pe un substrat solid și apoi analitul legat la anticorpul legat).
Al doilea domeniu (B-fig. 1A), cu lungimea de 10 la 40 perechi de baze, este dublu catenat și funcționează ca un promotor ARN polimerază direcționat ADN. Acest promotor este de obicei derivat de la secvența de promotor al unui fag bacterial, oricare dintre fagii T3, T7 sau SP6, mai ales de la bacteriofagul T7. Această clasă de polimerizare ARN este un promotor cu înaltă specificitate. Promotorul T7 este probabil cel mai bine caracterizat (fig. 1B). Secvențele ADN din 17 promotori T7 sunt cunoscute, și a fost dedusă o secvență de consens: 5'TAATACGACTCACTATA-3', așa cum se cunoaște din literatura de specialitate în domeniu. Secvențele 3', către promotorul de pe catena complementară (segmentul c’, a cărui capăt 3' este adiacent la capătul 5' al segmentului b’) servesc ca templat pentru transcrierea, și poate fi adaptată transcrierea multor variații de secvențe de templați (fig. 1B). Numai însăși, regiunea de promotor trebuie să fie dublu-catenară, fapt cunoscut din literatura de specialitate.
Extensiile la capătul 5' al promotorului au un unic efect asupra transcrierii. De exemplu, într-o întruchipare preferată, regiunea B constă din secvența de consens a promotorului T7 plus baze suplimentare 5' la secvența plasmidelor pT7 (accesibile în domeniul de specialitate), până la situsul de restricție Pvu II (fig. 1B). Aceste secvențe pot fi sau să nu fie neesențiale.
Al treilea domeniu (C-fig. 1 A) este direcționată 3', către al treilea domeniu și catena c’ a acestui domeniu servește ca templat pentru promotorul domeniului B. Domeniul C este de obicei de lungime de 30 la 80 nucleotide, cel
RO 113496 Bl mai prefrabil 40 la 45 nucleotide. Acest domeniu poate fi, fie unicatenar fie dublu catenar. Capătul 3' al catenei c’ de templat (direcționată adiacent la promotor] este în mod uzual un reziduu de citosină și prin urmare, capătul T al catenei superioare este de obicei un reziduu de guanosina.
Produsul de transcriere al ARN (c) al domeniului C funcționează ca o moleculă raportor pentru prezența și cantitatea de analit (fig. 3). Amplificarea semnalului are loc datorită faptului că fiecare templat produce 101 până la 104 transcrieri. Secvența acestui domeniu este desemnată ca o secvență întâmplătoare, evaluată prin analiza computerizată pentru a minimaliza posibilitatea reacțiilor secundare cu alte probe din sistem.
Secvența domeniului C este destinată pentru o schemă de detecție specifică și pot fi folosite mai multe astfel de scheme pentru a evalua cantitativ transcripturile. De exemplu, produsul de transcriere (c) al domeniului C poate fi subdivizat în două subdomenii - c., și c2 (fig. 3). Subdomeniul c1 este complementar la o probă de captare a transcrierii care a fost imobilizată pe un substrat solid. Subdomeniul c2 este complementar la o probă de marcare. După hibridizare, cantitatea de marcat reținută este proporțional liniar cu cantitatea de analit prezent în proba originală.
Intr-o întruchipare alternativă, transcrisul domeniului C are numai un subdomeniu cr Domeniului C este transcris în prezență de trifosfați de ribonucleotide și transcrisul marcat ulterior, legat la o probă mobilizată de captare a transcrisului prin intermediul subdomeniului său complementar c3 și evaluat cantitativ.
Intr-o altă întruchipare, transcrisul domeniului C are numai un subdomeniu c2. Domeniului C este transcris în prezență de trifosfați de ribonucleotide biotinilați și transcrisurile sunt capturate pe paturi de avidină. Transcrisul este apoi legat la o probă de marcare prin subdomeniul său complementar c2 și evaluat cantitativ.
Sunt posibile și alte metode de marcare și detectare a transcrisului probei de amplificare, incluzând utilizarea simultană a ribonucleotidelor marcate și a cuplului avidină/biotină, și acestea vor fi evidente pentru specialiștii din domeniu.
Domeniul B și C al probelor de polimerază poate fi preparat prin donare, asamblare enzimatică, tehnici chimice de reticulare, sinteză chimică directă sau o combinație a acestora. Când sunt preparate prin donare, secvențele de acid nucleic care codifică întreg domeniu B/C sau fragmente ale acestora pot fi obținute sub formă mono-catenară sau dublu-catenară printr-un procedeu de donare convențional, care este cunoscut în domeniul de specialitate.
Domeniul B este dublu catenar și domeniul C poate fi, fie mono fie dublu catenar. Domeniile dublu catenare pot fi create în două moduri: catenele pot fi donate separat și ulterior catenele complementare hibridizate; sau într-o formă alternativă, proba poate fi donată ca o polinucleotidă mono-catenară, auto-consolidantă (de exemplu b’, c’ c b). In acest caz, se adaugă patru la zece, preferabil
5-7 nucleotide la secvență ca un distanțator între c și c’ pentru a permite conturarea la propriu a regiunii dublu catenare când ea este auto-consolidată. Distanțatorul este de obicei poli-A, dar poate fi modificat pentru a minimaliza reactivitatea de hibridizare secundară între diverse probe din experiment.
Domeniul A poate fi conjugat la domeniul B/C prin intermediul agenților de legare interpuși cum ar fi punți de acid nucleic, aminoacid, carbohidrat sau poliol, sau prin intermediul altor agenți de reticulare. Domeniul B/C poate fi sintetizat cu reziduuri 5' de acid nucleic care au fost derivatizate pentru a avea o grupare funcțională care oferă un situs de legare pentru domeniul A, sau reziduul poate fi derivatizat, după ce a fost sintetizată oligonucleotida, pentru a oferi un astfel de situs. Un procedeu preferat pentru reticularea chimică este de a încorpora o bază citozină,l\l4-modificată,
RO 113496 Bl la capătul 5' al polinucleotidei, așa cum este cunoscut din literatura de specialitate.
Intr-o întruchipare și mai preferată, conjugarea domeniului B/C al ADN la domeniul A al anticorpului poate fi condusă într-o manieră analoagă cu conjugarea enzimei. Domeniul B/C este sintetizat pentru a conține o porțiune de alchilamină. Alchilamina este reacționată cu un agent de reticulare heterobifuncțional cum ar fi succinimidil 4-maleimdometil-ciclohexan-1 -carboxilat (SMCC). După purificare pe coloană, ADN-ul poate fi reacționat specific cu funcționalitățile sulfhidril. Un anticorp poate conține un sulfohidril reactiv (cum ar fi în F(ab’)2 redus sau poate fi modificat cu Nsuccinimidil 3-(2-piridiltio)proprionat (SPDP) și apoi redus. Conjugarea directă ADN - amină la anticorp - amină este posibilă, de asemenea, cu reactivi homobifuncționali, dar în mod tipic este mai dificil de controlat.
B. Probe multimerice.
Altă întruchipare a invenției, este o probă de amplificare ADN (la care se face referire ca la o “probă multimer”) conținând două domenii funcționale, un prim domeniu A, care este același cu domeniul A al probei de polimerază descris mai sus, și un al doilea [M-fig. 1D), care cuprinde mai multe subunități repetative. Această probă, ca și proba de polimerază descrisă mai sus, este utilizată de asemenea pentru amplificare de semnal în determinările imunologice.
Polinucleotida domeniului M poate fi un polimer linear cu aceeași subunitate de oligonucleotidă monocatenară repetativă sau cu diferite subunități de oligonucleotide monocatenare. Aceste subunități sunt capabile de a se hibridiza în mod specific și stabil la o nucleotidă monocatenată de interes, în mod tipic o oligonucleotidă marcată sau alt multimer. Aceste unități vor fi de 15 la 50, preferabil 15 la 30 nucleotide în lungime și au un conținut de GC în intervalul de 40 la 60 %. Numărul total de unități de oligonucleotidă în multimer va fi de obicei de 3 la 50, mai obișnuit 10 la 20 unități de oligonucleotidă în multimer compuse din ARN, ADN, nucleotide modificate sau combinații ale acestora.
Subunitățile de oligonucleotide ale multimerului pot fi legate covalent direct fiecare de celălalt, prin intermediul legăturilor fosfodiester sau prin intermediul agenților de legare interpuși cum ar fi punți de acid nucleic, aminoacid, carbohidrat sau polioli, sau prin alți agenți de reticulare care sunt capabili de reticularea catenelor de acid nucleic sau de acid nucleic modificat. Situsul (situsurile) de legare pot fi la capetele subunității (fie în orientarea 3-5' normală fie la orientare întâmplătoare) și/sau la mai multe nucleotide interne în catenă.
La multimerii lineari, subunitățile individuale sunt legate cap la cap pentru a forma un polimer linear. Intr-un tip de multimer ramificat, trei sau mai multe unități de oligonucleotidă emană dintr-un punct de origine pentru a forma o structură ramificată.
Punctul de origine poate fi o altă subunitate de oligonucleotidă sau o moleculă multifuncțională la care pot fi legate covalent cel puțin trei unități. In alt tip, există o coloană subunitate de oligonucleotidă cu una sau mai multe subunități de oligonucleotide suspendate. Acest tip de multimer, din urmă, sunt de “tip furculiță”, de “tip pieptene” sau combinație “tip furculiță și tip pieptene” ca structură. Unitățile suspendate vor depinde în mod normal de o nucleotidă modificată sau de altă porțiune organică având grupări funcționale adecvate, la care pot fi conjugate oligonucleotidele, sau altfel spus atașate (vezi fig. 1D).
Multimerul poate fi total linear, total ramificat sau o combinație de porțiuni lineare și ramificat. Preferabil, vor exista cel puțin două puncte de ramificare în multimer, mai preferabil cel puțin 15, preferabil 15 la 50. Multimerul poate include unul sau mai multe segmente de secvențe dublu catenare.
Domeniul M poate fi preparat prin donare (dacă este linear), asamblare enzimatică, tehnici chimice de reticulare, sinteză chimică directă sau o combinație
RO 113496 Bl a acestora. Aceste metode de sinteză sunt dezvăluite în literatura de specialitate din domeniu. In cazul multimerilor lineari preparați prin donare, secvențele de acid nucleic care codifică întregul multimer sau fragmente ale acestuia poate fi adus în formă mono sau dublu catenară prin procedeu de donare convențional. Când sunt aduse în formă dublu catenară multimerii/fragmenți sunt în ultimă instanță denaturați pentru a oferi multimeri/fragmente monocatenari. Multimerii pot fi donați la forma monocatenară utilizând vectori fagi monocatenari cum ar fi M13. Fragmentele pot fi legate enzimatic sau chimic, pentru a forma multimerul din domeniul M. Când sunt asamblate enzimatic, unitățile individuale sunt legate cu o liză cum ar fi T4 ADN sau ARN ligază, după cum este cazul. Când sunt preparați prin reticulare chimică, unitățile individuale pot fi sintetizate cu unul sau mai mulți acizi nucleici care au fost derivatizați pentru a avea grupări funcționale care oferă situsuri de legare sau pot fi derivatizați, după ce oligonucleotidă a fost sintetizată, pentru a oferi astfel de situsuri. Un procedeu preferat pentru reticularea chimică este de a încorpora baze citosinice N4-modificat în nucleotida, așa cum este descris în literatura de specialitate care este cunoscută în domeniu.
Când sunt preparate prin sinteză chimică directă, oligonucleotidele conținând acizi nucleici derivatizați sau molecule multifuncționale a căror grupări funcționale sunt blocate sunt obținute prin tehnici convenționale de sinteză a oligonucleotidelor. Grupările funcționale sunt neblocate și unitățile de oligonucleotide sunt sintetizate din situsul sau situsurile neblocate.
O structură generică pentru molecule, utilizată pentru a genera puncte ramificate în multimeri, este după cum urmează:
r1 - o - r - x
I
I
Y în care R este un radical organic, preferabil un acid nucleic, R1 este o grupare protectoare a hidroxilului care poate fi îndepărtată în condiții în care nu se îndepărtează acidul nucleic sintetic de pe o fază solidă și nu îndepărtează azotul exociclic sau grupările protectoare ale fosfatului, X este o grupare conținând fosfor care ușurează sinteza acidului nucleic, cum ar fi o grupare fosforamidică, fosfonat sau fosfat protejată, Y este un radical derivat de la o grupare nucleofilică cum ar fi un amino, hidroxil, sulfhidril sau fosfat protejat, și R2 este R1 sau o grupare blocantă sau protejantă care poate fi îndepărtată sau înlocuită cu hidrogen fără să afecteze R1. In moleculele utilizate pentru a genera ramificări bifurcate sau de “tip furculiță” R1 și R2 sunt aceiași; pe când în moleculele utilizate pentru a genera o ramificare “de tip pieptene”, R2 este o grupare blocantă care este stabilă în prezența unui reactiv de blocare a R1. Fig. 4 ilustrează schematic precedeele utilizate pentru a sintetiza multimeri care au ramificări de “tip pieptene”, ramificații de “tip furculiță”, sau combinații ale acestora.
Partea A din fig. 4 reprezintă schema unei sinteze convenționale a unei oligonucleotide, cum ar fi o metodă automată cu fosforamidită (așa cum se cunoaște din literatura din domeniu). Cubul negru reprezintă un suport solid, N reprezintă o nucleotidă și p-NOR1 (R1 este echivalent cu R1 de mai sus), un derivat convențional de nucleotidă având grupări protectoare adecvate.
Partea B prezintă procedeul pentru obținerea unui multimer de “tip pieptene”. Compusul cu formula care urmează: p.n.or
I 1 t O
I R2 reprezintă o bază modificată cu formula (2) de mai jos. Este sintetizată o unitate de oligomer de mărime și secvență dorită și apoi este lăsată pe suport. Una sau mai multe baze citosinice ^-modificate sunt încorporate apoi în lanț, prin procedeu automat menționat. Preferabil,
RO 113496 Bl baza modificată are următoarea formulă:
z
(2) în care Z este un nucleofil cum ar fi -0-, -NH-, -S-, PCI/, și -0C-0-, R1 este o grupare blocantă sau protectivă cum ar fi dimetoxitritil (DMT) sau pixil care este în general stabilă la bază și sensibilă la acid, R2 este un hidrogen sau metil, R3 este o grupare blocantă sau protectoare care poate fi îndepărtată și înlocuită cu hidrogen fără a afecta R1, cum ar fi:
O O ii i
CH3-C—CH2CH2 — C—
H. >CH2-CH2-OC —
0—0
R5 este o fosforamidită sau alt derivat fosforos care ușurează adăugarea nucleotidelor la poziția 5' a unui lanț oligonucleotidic în timpul sintezei chimice (de exemplu, un fosfodiester, fosfotriester, etc), R6 este metil, hidrogen, I, Br, sau F, iar X este un întreg în intervalul 1 la 8, inclusiv. Când mai mult de o bază modificată este încorporată, aces tea sunt distanțate prin baze intermediare în lanț, cel mai preferabil printr-un dimer -TT. Pot fi încorporate unități oligonucleotidice adiționale în coloană, urmat de baze modificate adiționale și așa mai departe.
Gruparea nucleofilică N4 este apoi deprotejată (R3 este îndepărtat) și din aceasta sunt generate unități adiționale de oligonucleotidă, prin procedeul automat. Grupările R1 reziduale la terminațiile lanțului sunt îndepărtate, și multimerul ramificat “de tip pieptene” este scindat de pe suport.
Partea C a fig. 4 este o reprezentare a procedeului general pentru obținerea multimerilor “de tip furculiță”. Din nou, o unitate de oligomer de secvență și mărime dorită este sintetizată prin tehnici convenționale și lăsată pe suport. O grupare blocantă, bifuncțională conținând fosfor (reprezentată ca XP în partea C) cum ar fi o fosforamidită blocantă este încorporată apoi în lanț prin procedura automată. Grupările bifuncționale conținând fosfor, preferate sunt fosforamiditele blocate care au următoarea formulă:
R - O - CHj N(iPr)2
H - C - O - P
R - o - Jh2 OR1 în care R este respectiva grupare protectoare a hidroxilului, iPr este izopropil, și R1 este metil sau beta-cianoetil. Cel mai preferabil, R este DMT și R1 este beta-cianoetil.
Alternativ, se poate utiliza baza citosinică N4-modificată în care R1=Ra (de exemplu DMT).
Cele două grupări protectoare sunt apoi îndepărtate și sunt generate din aceste unități oligonucleotidice adiționale, prin procedura automată. Grupările R1 reziduale sunt îndepărtate și multimerul bifurcat este scindat de pe suport.
Părțile D și E reprezintă procedee în care doi sau mai mulți multimeri bifurcați, multimeri de “tip pieptene” sau combinații ale acestora sunt împreunați enzimatic sau chimic. In general, multi
RO 113496 Bl merii bifurcați și/sau cei de “tip pieptene” sunt preparați cum s-a arătat mai sus, și îndepărtați de pe suport. Ei sunt apoi combinați în soluție, utilizând proceduri de legare enzimatice sau chimice, 5 așa cum s-a descris mai sus.
Partea F prezintă procedeul pentru sintetizarea unei molecule multimer de “tip pieptene”. Acest procedeu este o variantă a procedeului prezentat în io partea B, și implică încorporarea bazelor modificate în catenele laterale dependente și generarea catenelor laterale de oligonucleotide secundare din acestea.
Pot fi încorporate în multimeri, 15 molecule de linkeri scindabili adecvate în situsuri predeterminante pentru scopul analizării structurii multimerului sau ca un mijloc pentru eliberarea de segmente predeterminate (cum ar fi porțiunea de 20 multimer care se leagă la oligonucleotida marcată). După sinteza multimerului și purificare, acești linkeri pot fi scindați în mod specific fără degradare suplimentară a structurii nucleotidelor a multi- 25 merului. Un tip preferat de moleculă de linker a fost desemnat să conțină o gru pare 1,2-diol (care poate fi scindată în mod selectiv de către periodați) ca și o grupare hidroxil protejată și o grupare de fosforamidită derivată de la hidroxil pentru a permite linkerului să fie încorporat în orice fragment ADN prin procedee standard cunoscute în chimia fosforamiditelor. O întruchipare preferată a unei astfel de linker este compusul care are următoarea formulă chimică:
în care DMT și iPr sunt așa cum au fost definiți mai înainte. După încorporare într-un fragment ADN și completa deprotecție, fragmentul care conține linkerul are următoarea structură:
H,C\ 8 r ^NCHjCHjO-P-O'5 (DNAz)3—CH ' 0 τ
OH coch—CHCO I OH în care ADN1 și ADN2 reprezintă subfragmente de ADN care pot fi aceleași sau diferite. Reacția acestui fragment cu periodat de sodiu scindează fragmentul următoarelor subfragmente:
no
In mod alternativ, gruparea 1,2diol poate fi înlocuită cu o grupare linker care conține o legătură sensibilă la hidroxilamină, o legătură sulfonică sensibilă la
CHjO \ 11V ^mch.ch2op-o-j (DNA»)*—OH
H /II ' xo #cco o
bază, sau o legătură disulfidică sensibilă la tiol. Astfel de grupări de linker pot fi derivate de la agenți de reticulare convenționali care sunt utilizați pentru a
RO 113496 Bl conjuga proteinele la alte unități. In mod asemănător, pot fi utilizate și alte grupări protectoare în afară de DMT.
Aspectele funcționale ale probei de polimerază pot fi combinate cu structura probei de multimer prin sintetizarea unei probe de multimer având un domeniu M cu subunități cuprinzând multipli ai domeniilor promotor/templat (B/ C) și probei de polimerază.
Ca și probele de multimer, subunitățile multimerice pot fi molecule ordonate linear sau ramificate.
Ca și probele de polimerază, domeniul A al probelor de multimer pot fi conjugate la un domeniu prin intermediul agenților de legare interpozați cum ar fi punți de acid nucleic, aminoacid, carbohidrat sau poliol, sau prin alți agenți de reticulare. Domeniul M poate fi sintetizat cu un reziduu 5' de acid nucleic care a fost derivat pentru a avea o grupare funcțională care oferă un situs de legare pentru domenii A, sau reziduul poate fi derivatizat, după ce oligonucleotida a fost sintetizată pentru a oferi un astfel de situs. Un procedeu preferat pentru reticulare chimică este de a încorpora o bază citosinică N4-modificată la capătul 5' al polinucleotidei, așa cum este descris în literatura de specialitate în domeniu.
II - Determinări imunologice.
Alt aspect al prezentei invenții, este acela care folosește probe amplificatoare în imunodeterminări pentru a determina și evalua cantitativ prezența și concentrația unui analit imunologic. Aceste probe amplificatoare sunt din două clase: probele hibride dezvăluite în secțiunea I, de mai sus (fie probe de polimeraze fie probe de multimer), sau probele de polinucleotide dezvăluite în literatura de specialitate în domeniu. Aceste probe sunt similare probelor hibride, dar cu domeniul A conținând secvență de polinucleotidă mai degrabă decât o polipeptidă.
Analitul poate fi orice imunogen de interes. Analitul poate fi prezent în concentrație scăzută într-o probă preparată, sau poate fi o specie minoritară într-un amestec heterogen de material biologic. Analitul poate fi prezent într-o diversitate de surse, de exemplu fluide biologice sau țesuturi, materiale alimentare, materiale din mediul înconjurător, etc, sau poate fi sintetizat in vitro.
Intr-o primă etapă, proba care conține analitul este preparat prin orice variantă a metodelor cunoscute de specialiștii din domeniu.
Se pot folosi probe amplificatoare pentru a detecta un analit în orice număr de protocoale de determinări imunologice, care sunt efectuate fie în soluție, fie imobilizat pe o fază solidă. Dacă imunodeterminarea este realizată în soluție, proba care conține analitul este fie legată direct la proba amplificatoare; indirect prin intermediul unuia sau mai multor anticorpi specifici pentru analit; fie, dacă se folosește o probă de polinucleotid, în conjucție cu o moleculă hibrid de linker (care a fost discutată în secțiunea II, infra). Probele amplificatoare pot fi utilizate în acest mod în cele mai multe protocoale de imunodeterminare așa cum rezultă și din literatura de specialitate din domeniu.
Intr-o imunodeterminare care utilizează o fază solidă, analitul (care poate fi sau un antigen sau un anticorp) este fie imobilizat direct pe o fază solidă, indirect prin legarea analitului la un prim anticorp care a fost mai întâi legat de o fază solidă; fie prin o determinare sandviș (fig.2A) în care un al doilea anticorp recunoaște analitul și în schimb este recunoscut de primul anticorp legat la faza solidă.
Dacă analitul este să fie legat direct de o fază solidă, proba care conține analitul este contactată cu un filtru de nitroceluloză sau cu un mijloc similar pentru legarea neselectivă a proteinei. Dacă analitul este să fie legat indirect și selectiv la o fază solidă un prim anticorp, direcționat către un epitop al analitului sau către un al doilea anticorp, este conjugat la faza solidă și ulterior este utilizat pentru a lega analitul sau un al doilea anticorp legat de analit.
A. Utilizarea probelor hibride.
RO 113496 Bl
Un anticorp suplimentar, direcționat către un al doilea epitop al analitului poate fi utilizat apoi în linker, între analit și proba amplificatoare. Proba amplificatoare, fie o probă de polimerază fie o probă de multimer, a cărui domeniu A este direcționat către un al doilea anticorp, poate fi conjugat apoi la anticorpul linker, formând un șirag care constă din primul anticorp legat la o fază solidă, un al doilea anticorp, analitul, in anticorp linker si o probă amplificatoare (fig.2A).
B. Utilizarea probelor polinucleotidice.
Intr-o alternativă a prezentei invenții, proba amplificatoare folosită este una dintre probele multimerului polinucleotidic, care sunt dezvăluite în literatura de specialitate. Aceste probe diferă de probele multimer hibrid - peptidă/ nucleotidă, din invenția de față prin aceea că domeniul A este o secvență de polinucleotidă mai degrabă decât o polipeptidă care funcționează ca un anticorp. Prin urmare, un linker hibrid anticorp/polinucleotidă poate fi folosit pentru a cupla indirect analitul la proba amplificatoare (fig.2B). Acest linker hibrid are un prim domeniu, care este o polipeptidă care funcționează ca un anticorp specific pentru un epitop al analitului sau un epitop al unui anticorp al anticorpului care recunoaște analitul; și un al doilea domeniu care este o secvență de nucleotidă în principal complementară la secvența de nucleotidă a domeniului A a probei amplificatoare.
In mod similar, într-o întruchipare alternativă, se poate folosi una din probele de polimerază polinucleotidică, așa cum este cunoscut în literatura de specialitate din domeniu. Aceste probe diferă de probele de polimerază hibrid din invenția de față prin aceea că domeniul A este mai degrabă o secvență de polinucleotidă decât o polipeptidă funcționând ca un anticorp. Aceste probe cer, de asemenea, utilizarea unui linker hibrid, așa cum s-a descris mai sus.
Utilizând o probă amplificatoare de polinucleotidă și un linker hibrid mai degrabă decât probe de hibrid amplificator care au fost descrise în secțiunea I de mai sus, proba amplificatoare poate fi un reactiv “universal” care este util atât pentru determinări de hibridizare a acidului nucleic, cât și pentru imunodeterminări.
C. Condiții de legare și hibridizare.
Intr-o întruchipare preferată, analitul este imobilizat indirect pe o fază solidă, de exemplu o plăcuță de policlorură de vinii (PVC) cu 96 de adâncituri. In determinarea sandviș care este descrisă în fig. 2A, se adaugă într-o adâncitură 50 ul din primul anticorp (antiiepure la o concentrație de 20 ug/ml în NaHC03 0,2M). Adâncitura este acoperită și incubată timp de două ore la temperatura camerei, într-o atmosferă umidificată. Soluția este apoi aspirată din adâncitură. Adâncitura se spală apoi de două ori cu un tampon blocant care conține 3 % albumină din ser de bovine în soluție salină de tampon blocant care conține 3 % albumină din ser de bovine în soluție salină de tampon fosfat blocant ce conține 0,02 % azidă de sodiu. In continuare, adâncitura se incubează cu tampon blocant, timp de 20 min la temperatura camerei, într-o atmosferă umidificată și apoi se spală de două ori cu un tampon blocant. In adâncitură, se adaugă 50 pg din al doilea anticorp (antianalit de iepure, tot în concentrație de 20 pg/ml) și se repetă procedeul care a fost descris mai sus. In adâncitură, se prepară noi serii de diluții, în tampon blocant. Se adaugă, în continuare câte 50 pl din fiecare diluție. Se acoperă placa și se incubează timp de două ore la temperatura camerei, în atmosferă umidificantă. După incubare, adânciturile se spală de patru ori cu tampon blocant. Se adaugă, în același mod, și al treilea anticorp (anti-analit de șoarece), după care se adaugă proba amplificatoare de hibrid. întrucât preparatele de țesut ocazionale pot conține anticorp ant-ADN, tamponul blocant utilizat pentru spălările care urmează, adăugarea probei care conține de asemenea 20 pg/ml ADN din spermă de somon.
RO 113496 Bl
Când sunt utilizate probele amplificatoare de polinucleotide sau probele de multimer hibrid, urmează o etapă de hibridizare a acidului nucleic după complexarea analitului și anticorpilor. In mod obișnuit, condițiile de hibridizare constau dintr-un mediu apos, în particular un mediu apos tamponat, care include diverși aditivi. Acești aditivi pot include polinucleotidele de hibridizare, săruri (de exemplu citrat de sodiu 0,017 M la 0,17 M și/sau clorură de sodiu 0,17 M la 1,7 M), detergenți neionici cum ar fi NP-40 sau Triton X-100 (0,1 la 1,0 %] care nu interferează cu complexul antigen/anticorp, și acizi nucleici purtători. Amestecul este incubat, timp de 15 la 75 min, la temperatura cuprinsă între 35 și 55°C.
Dacă condițiile folosite pentru hibridizarea oligonucleotidei marcate la subunități multimere produce instabilitate în complecși antigen/anticorp, etapa de hibridizare poate fi precedată de tratamentul complexului cu o proteină reticulantă cum ar fi aldehida glutarică, sau o metodă similară de stabilizare a complexului. Odată complexul proteinic stabilizat, condițiile de hibridizare a acidului nucleic pot fi schimbate pentru a include SDS (până la 1 %); solvenți neapoși cum ar fi dimetilformamidă, dimetilsulfoxid și formamidă, la temperaturi până la 70°C.
Este important să se ajusteze condițiile de hibridizare a acidului nucleic pentru a menține stabilitatea complecșilor antigen/anticorp. De exemplu, hibridizarea lanțurilor mai scurte de secvențe complementare poate fi realizată la temeperaturi mai joase. Intr-o întruchipare preferată, regiunile monocatenare complementare sunt de 12 la 20 baze. Intr-o întruchipare preferată, temperatura de hibridizare este de 35 la 45°C. Mai mult, întrucât numai oligonucleotidele monocatenare prezentate în această etapă sunt complementare, poate fi tolerată o strictețe mai mare și în consecință concentrații de săruri mai scăzute (0,3 % M Na).
1. Probă multimer.
Dacă se folosește o probă multimer, ulterior se adaugă oligonucleotidă marcată care este în cea mai mare parte compelmentară la polinucleotida repetativă din domeniul M, în condiții care îi permit să hibridizeze la unități de oligonucleotide complementare ale multimerului. Complexul de acid nucleic marcat, în faza solidă, și care a rezultat este apoi separat din excesul de oligonucleotidă marcată prin spălare, pentru a se îndepărta oligonucleotidă nelegată și apoi se citește valoarea.
Amplificarea poate fi multiplicată, prin utilizarea mai multor specii de multimer (așa cum este definit prin secvențe de subunitate) în determinare. In astfel de cazuri, un al doilea multimer este desemnat să se lege la secvența de repetare a primului multimer și complexul este apoi marcat cu o oligonucleotidă care este în bună parte complementară la secvența de reperate a celui de al doilea multimer. Orice număr de multimeri, poate fi legat în serii, în acest mod, pentru a realiza o amplificare chiar mai mare.
2. Proba de polimerază.
Dacă se folosește o probă de polimerază, ARN polimerază specifică pentru regiunea de promotor (domeniu B) al probei de amplificator, este apoi adăugată în condiții de transcriere adecvate și sunt produse copii ARN multiple (c) ale templatului [c’) domeniului C. Cantitatea de transcris este proporțională cantității de analitîn preparatul inițial.
Condițiile de transcriere constau dintr-un mediu apos, preferabil un mediu apos tamponat, cu săruri adecvate, în mod uzual, se folosesc săruri de magneziu, rATP, rUTP, rGTP, rCTP, o enzimă ARN polimerază, și mai include uzual și diverși agenți de denaturare, purtători de proteină și inhibitori RNA: Incubarea se face de obicei pe o perioadă de 15 la 90 min, iar temperatura care este considerată că este optimă este de exemplu, uzual aleasă a fi de 35 la 42°C, de obicei temperatura de 37°C.
Secvența domeniului C este destinată pentru o schemă de detecție spe
RO 113496 Bl cifică, și pot fi folosite mai multe de astfel de scheme pentru a evalua cantitativ transcrisurile. De exemplu, produsul de transcripție (c) al domeniului C poate fi subdivizat în două subdomenii - c, și c2 (fig. 2B). Subdomeniul cq este complementar la o probă de captare a transcrisului care a fost imobilizată pe un substrat solid. Subdomeniul c2 este complementar la o probă de marcare. După hibridizare, cantitatea de marcat reținut este proporțională în mod linear la o cantitate de analit prezentată în proba originală.
Intr-o întruchipare alternativă, transcrisul domeniului C are numai un subdomeniu cv Domeniul C este transcris în prezență de ribonucleotide trifosfați, și transcrisul marcat este ulterior legat la o probă de captare transcrisă imobilizată prin intermediul subdomeniul c1 și evaluat cantitativ.
Intr-o întruchipare alternativă, transcrisul domeniului C are numai un subdomeniu c2. Domeniul C este transcris în prezență de trifosfați de ribonucleotide biotiniliți și transcrisurile sunt captate pe paturi de avidină. Transcrisul este apoi legat la o probă marcată prin intermediul subdomeniul său c2 complementar, și evaluat cantitativ.
Sunt posibile mai multe probe de marcare și de detectare a transcrisului probei multiplicatoare, incluzând utilizarea simultană a ribonucleotidelor marcate și a cuplului avidină/biotină, și vor fi evidențiate specialiștilor în domeniu.
3. Considerații generale.
Faza solidă care este utilizată în determinare, poate fi sub formă de particule sau suprafață de perete solid, în oricare dintr-o varietate de containere, de exemplu tuburi centrifuge, coloane, plăcuțe de microtirare cu adâncituri, filtre, conducte, etc. Preferabil, particulele vor fi folosite la o dimensiune care este cuprinsă în intervalul de aproximativ 0,4 la 200 μ, mai uzual de la aproximativ 0,8 la 4,0 μ. Particulele pot fi oricare din materialele convenabile cum ar fi latex sau sticlă. Primul anticorp specific pentru analit, sau pentru un al doilea anticorp care este specific pentru analit, poate fi atașat în mod stabil la suprafața solidă prin intermediul grupelor funcționale prin procedee care sunt cunoscute în domeniul de specialitate.
Probele de marcare vor include, dacă sunt folosite probe de polimerizare, secvențe complementare la subdomeniul c2 a transcrisului probei amplificatoare; și dacă sunt folosite probe multimere, probele de marcare vor include secvențe complementare la unitățile repetative ale subdomeniului B. Proba de marcare va include una sau mai multe molecule (marcate) care duc direct sau indirect la obținerea unui semnal detectabil. Marcații pot fi legați la membri individual ai secvenței complementare sau pot fi prezenți ca un membru terminal sau coadă terminală care are o pluritate de măreați. In literatura de specialitate, au fost raportate diverse mijloace pentru obținerea de marcați legați la secvență. Este cunoscut, că marcații pot fi legați fie covalent, fie necovalent la secvența complementară. Marcații care pot fi folosiți includ radionuclide, fluoresceri, chemiluminisceri, coloranți, enzime, substraturi enzimatice, cofactori enzimatici, inhibitori de enzime, subunități de enzime, ioni metalici și alți asemenea acestora. Marcatorii specifici care sunt ilustrativi, includ fluoresceină, rodamină, roșu de Texas, ficoeritrină, luminol, NADPH, galactosidază, peroxidază din hrean, și altele asemenea, care sunt cunoscute din literatura de specialitate, pentru o comparație a metodelor de marcaj nerarioizotipic.
Probele de marcare pot fi preparate convenabil, prin sinteză chimică, așa cum este cunoscut din literatura de specialitate. Prin prevederea unei grupări terminale care are o funcționalitate, pot fi uniți diverși marcatori prin intermediul funcționalității.
Astfel, se poate prevedea un carboxil, tiol, amină, hidrazină sau altă funcționalitate la care pot fi legați diverși marcatori, fără afectare în detrimentul formării duplexului cu secvența. Așa cum s-a indicat deja, se poate realiza o mole
RO 113496 Bl culă cu o pluritate de marcaje reunite la secvența complementară la secvența de marcare. Alternativ, se poate realiza un ligand legat la secvența marcatoare și utiliza un receptor marcat pentru legarea la un ligand pentru a obține complexul de analit marcat.
Funcție de natura marcajului, se pot folosi diverse tehnici pentru detectarea prezenței marcajului. Pentru fluoresceri, sunt accesibile un număr de diferite fluorometre. Ca enzime, fie o determinare fluorometrică fie un produs colorant care se poate obține, care apoi se determină fluorometric prin metode care sunt cunoscute specialiștilor în domeniu, spectrofotometric sau vizual. Diversele marcaje care au fost folosite în imunodeterminări și tehnici aplicabile la imunodeterminări pot fi, de asemenea, folosite și în cazul detrminărilor din prezenta invenție.
Procedeele care sunt utilizate în etapele de separare a determinării vor varia în funcție de natura fazei folosite în stare solidă. Pentru particule, se va obține separarea particulelor prin centrifugare sau filtrarea supernatantului, sau izolarea acestuia printr-un alt mod cunoscut în domeniu. Acolo unde sunt determinate particulele, acestea vor fi spălate cu atenție, în mod uzual o dată până la cinci ori, cu un mediu tamponat adecvat care conține un detergent, de exemplu cu PBS cu SDS. Când mijlocul de separare este un perete sau suport, supernatantul poate fi izolat și îndepărtat, iar peretele spălat în același mod ca particulele.
D. Imunodeterminări competitive.
Probele amplificatoare de hibrid din prezenta invenție pot fi folosite de asemenea ca un mijloc pentru marcarea antigenului într-o determinare imunologic competitivă. Intr-o detrminare tipică, excesul de anticorp, policlonal sau monoclonal, preferabil monoclonal, și care se leagă specific de analit este imobilizat pe o fază solidă, în mod obișnuit pe o plăcuță cu multe adâncituri. 0 concentrație standard de antigen marcat este amestecată cu diluții în serie ale unei probe care este considerată a conține o cantitate necunoscută de analit. Diluțiile care sunt separate, sunt apoi expuse la anticorpul imobilizat, și este măsurată cantitatea de marcat legată. Capacitatea analitului nelegat de a reacționa cu analitul marcat, este utilizată pentru a calcula cantitatea de analit din probă.
Intr-o altă întruchipare a prezentei invenții, o porțiune de polinucleotidă a domeniului B/C a probei de polimerază este conjugată la un imunogen competitiv. Această moleculă hibrid este apoi utilizată ca antigenul marcat care s-a descris mai sus. După legarea competitivă, polimeraza (specifică pentru promotorul domeniului B) este adăugată, și produsul de transcriere este determinat așa cum s-a descris în secțiunea l(A] arătată.
Intr-o altă întruchipare a invenției de față, o porțiune de polinucleotidă a domeniului M a probei de multimer este conjugată la un imunogen competitiv. Această moleculă hibrid este utilizată ca antigenul marcat care s-a descris mai sus. După legarea competitivă, domeniul M este marcat și apoi evaluat, așa cum s-a descris în cele arătate mai sus.
Pentru cuplarea imunogenă la ADN, reactivii homobifuncționali cum ar fi disuccinimidil suberat (DSS], etilenglicol bis (DITC), sunt cei mai utili ca metode de cuplare, decât cei care au fost descriși în secțiunea l(A], de mai sus.
Trusa de realizare a determinărilor imunologice amplificatoare, în conformitate cu prezenta invenție, va cuprinde - în combinație în pachete - următorii reactivi: o fază solidă care este fie capabilă de legarea antigenului analit, fie alternativ are deja un prim anticorp de legare, legat la el, dacă forma determinării este una în care analitul este legat indirect la faza solidă prin intermediul unui anticorp de legare sau prin intermediul unui al doilea anticorp; opțional al doilea și al treilea anticorp de legare care sunt specifici pentru analit și o probă de linker hibrid, dacă forma determinării este una în care se utilizează o probă amplificatoare de polinucleotidă;
RO 113496 Bl proba amplificatoare; polimeraza ARN direcționată ADN adecvată și probe de captare a transcrisului imobilizat (dacă se utilizează o probă amplificatoare de polimerază); o probă de marcare adecvată. Acești reactivi vor fi, în mod obișnuit, așezați separat, în truse. Această trusă poate să înciuda, de asemenea, tampoane de hibridizare, soluții de spălare, controale negative ca standard, controale pozitive, precum și instrucțiuni pentru realizarea metodei de determinare.
Claims (37)
- Revendicări1. Probă moleculară hibridă polipeptidă/ polinucleotidă, caracterizată prin aceea că, cuprinde un prim domeniu (A), care este o polipeptidă capabilă să funcționeze ca un anticorp care se leagă în mod specific la un antigen cunoscut și un al doilea domeniu (B) care poate fi o polideoxiribonucleotidă cu dublă catenă, capabilă să funcționeze ca promotor pentru activitatea unei enzime ARN polimerază dependentă de ADN și un al treilea domeniu (C) care este, fie cu o simplă, fie cu o dublă catenă și adiacent la domeniu al doilea, astfel încât al treilea domeniu să fie capabil să funcționeze ca un templat pentru activitatea de promotor al celui de al doilea domeniu, fie un doilea domeniu (M) cuprinzând o mulțime de subunități oligonucleotidice cu simplă catenă care sunt capabile să se lege în mod specific la o secvență de acid nucleic cu simplă catenă, de interes, și, în ambele situații, mijloace pentru conjugarea primului și celui de a! doilea domeniu.
- 2. Probă moleculară hibridă polipeptidă/polinucleotidă pentru utilizare ca amplificator în determinări imunologice, caracterizată prin aceea că, cuprinde:(a) un prim domeniu (A) care este o polipeptidă și funcționează ca un anticorp specific pentru un antigen cunoscut;(b) un al doilea domeniu (B) care este polinucleotidă cu dublă catenă, capabilă să funcționeze ca promotor pentru activitatea unei enzime polimerazăARN dependente-ADN cu activitate de enzimă; și (c) un al treilea domeniu (C) care este fie monocatenar fie cu dublucatenar și adiacent celui de al doilea domeniu, astfel încât al treilea domeniu este capabil să funcționeze ca un templat pentru activitatea de promotor al celui de al doilea domeniu.
- 3. Probă moleculară, conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că, ARN dependent ADN cu activitate de polimerază este derivat de la bacteriofagul T7.
- 4. Probă moleculară, conform revendicărilor 2 sau 3, caracterizată prin aceea că, al doilea domeniu B este de cel puțin 10 și nu mai mult de 40 nucleotide în lungime.
- 5. Probă moleculară, conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că, al treilea domeniu C este de cel puțin 30 și nu mai mult de 80 nucleotide în lungime.
- 6. Probă moleculară, conform revendicării 3, caracterizată prin aceea că, activitatea de polimerază este derivată de la bacteriofagul T7 și secvența pentru al doilea domeniu B cuprinde secvența:5' - TAA TAC GAC TCA CTA TA-3’ 3' - ATT ATG CTG AGT GAT AT-5'
- 7. Probă moleculară, conform revendicării 3, caracterizată prin aceea că, activitatea de polimerază este derivată de la bacteriofagul T7 în care secvența de nucleotidă al celui de al doilea domeniu este:5' - CTG GCT TAT CGA ATT TAA TAC GAC TCA CTA TA-3'3' - GAC CGA ATA GCT TTA ATT ATG CTG AGT GAT AT-5'.
- 8. Probă moleculară, conform revendicărilor 3, 4, 5, 6 sau 7, caracterizată prin aceea că, reziduul 5’ al catenei superioare a secvenței de nucleotidă pentru al treilea domeniu C, este adiacent celui de al doilea domeniu B și este un reziduu de guanozină.RO 113496 Bl
- 9. Probă moleculară, conform revendicărilor 2, 3, 4, 5, 6, 7 sau 8, caracterizată prin aceea că, secvența pentru al treilea domeniu C, este:5-GGG AGA TGT GGT TGT CGT ACT TAG CGA AAT ACT GTC CGA GTC G3'3'-CCC TCT ACA CCA ACA GCA TGA ATC GCT TTA TGA CAG GCT CAG C5'
- 10. Probă moleculară, conform revendicării 9, caracterizată prin aceea că, capătul catenei superioare al secvenței nucleotidice de ADN a celui de al doilea domeniu B este atașată la capătul 5' al catenei superioare al secvenței de nucleotidă din domeniul C.
- 11. Probă moleculară, conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că, transcrisul celui de al treilea domeniu C are două subdomenii:(a) un prim subdomeniu, c,, care este capabil să hibridizeze la un linker de captare oligonucleotidic, linkerul de captare fiind capabil să hibridizeze la o polinucleotidă imobilizată pe un suport solid; și (b) al doilea subdomeniu, c2, care este capabil de legare la un linker marcat oligonucleotidic, linkerul marcat fiind capabil să se lege la o probă evaluabilă cantitativ.
- 12. Probă moleculară, conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că, o unitate funcțională cuprinzând al doilea și al treilea domeniu B și C, este prezentă în unități repetitive multiple.
- 13. Probă moleculară pentru utilizare ca amplificator de semnal în determinări imune, caracterizată prin aceea că, conține:(a) un prim domeniu (A) cuprinzând o polipeptidă capabilă să funcționeze ca un anticorp care se leagă în mod specific la un analit cunoscut; și [b] un al doilea domeniu (M) cuprinzând o multiplicitate de subunități oligonucleotidice monocatenare care sunt capabile să se lege în mod specific la o secvență de acid nucleic monocatenară de interes.
- 14. Probă moleculară, conform revendicării 13, caracterizată prin aceea că, fiecare unitate oligonucleotidică al celui de al doilea domeniu M, cuprinde 15 la 50 baze și are un conținut în GC în intervalul de la circa 40 la circa 60 %.
- 15. Probă moleculară, conform revendicării 13, caracterizată prin aceea că, molecula are structură moleculară.
- 16. Probă moleculară, conform revendicării 13, caracterizată prin aceea că, molecula are structură ramificată.
- 17. Probă moleculară, conform revendicării 13, caracterizată prin aceea că, cel puțin o porțiune a subunităților oligonucleotidice ale celui de al doilea domeniu sunt legate prin intermediul unei porțiuni multifuncționale derivate de la un compus cu formula:r1 - o - R - xI l Y Â2 (1) în care R este un radical organic, preferabil un acid nucleic, R1 este o grupare protectoare a hidroxilului care poate fi îndepărtată în condiții în care nu se îndepărtează acidul nucleic sintetic de pe o fază solidă și nu îndepărtează grupările protectoare exociclice ale azotatului sau fosfatului, X este o grupare conținând fosfor care facilitează sinteza acidului nucleic, Y este un radical derivat de la o grupare nucleofilică, și R2 și R1 sau o grupare protectoare pot fi îndepărtate și înlocuite cu hidrogen fără a afecta R1.
- 18. Probă moleculară, conform revendicării 13, caracterizată prin aceea că, cel puțin o porțiune a subunităților oligonucleotidice sunt legate prin intermediul unei porțiuni multifuncționale derivate de la un compus cu formula:RO 113496 BlR3Z (2) în care Z este un nucleofil, R1 este o grupare blocantă sau protectoare care este în general stabilă la baze și sensibilă la acid, R2 este un hidrogen sau metil, R3 este o grupare protectoare sau poate fi îndepărtată și înlocuită cu hidrogen fără a afecta R1,R5 este un derivat fosforos care permite adiția nucleotidelor la poziția 5' a unui lanț oligonucleotidic pe timpul sintezei chimice, R6 este metil, hidrogen, I, Br, sau F, iar X este un întreg în intervalul 1 la 8, inclusiv.
- 19. Probă moleculară, conform revendicării 13, caracterizată prin aceea că, cel puțin o porțiune a subunităților oligonucleotidice sunt legate prin intermediul unei porțiuni multifuncționale derivate de la un compus cu formula:R - 0 - CH, N(iPr),I 2 / 2H - C - O - PI X 1 R - O - CHj 0Ra
- 20. Metodă de amplificare a unui semnal detectabil într-o determinare imunologică, caracterizată prin aceea că, cuprinde etapa de construire a unei molecule hibride în care primul domeniu este o polipeptidă capabilă să funcționeze ca o heptenă și acest domeniu este conjugat la domeniul al doilea/al treilea (B/C) al probei de polimerază sau, la un domeniu (M) al probei de multimer după care urmează etapele:(a) imobilizarea sau nu a analitului, analitului antigenic sau a moleculei hibride, direct sau indirect pe un substrat solid, respectiv în prezența sau absenta unui analit competitiv;(b) legarea directă sau indirectă de analit și de proba moleculară cuprinzând:i] un domeniu (A) de legătură;ii] un al doilea domeniu (B) care este o secvență ADN cu dublă catenă capabilă să funcționeze ca un promotor pentru activitatea enzimei ARN polimerază dependentă de ADN, și iii] un al treilea domeniu (C) care este fie cu simplă, fie cu dublă catenă și adiacent domeniului (B] astfel încât cel de al treilea domeniu este capabil să funcționeze ca un templat pentru activitatea promotorului celui de al doilea domeniu sau, o probă moleculară hibridă cuprinzând: (i) un domeniu (A) de legătură care este o polipeptidă capabilă să funcționeze ca un anticorp ce se leagă în mod specific la un antigen de interes; (ii) un al doilea domeniu (M) cuprinzând o mulțime de subunități oligonucleotidice de ADN cu simplă catenă, subunități oligonucleotidice care sunt capabile să se lege în mod specific la o oligonucleotidă marcată cu simplă catenă și (iii) mijloace pentru conjugarea primului și celui de al doilea domeniu;(c) îndepărtarea probei nelegate;(d) transcrierea de copii multiple de oligomeri ARN care sunt complementari față de secvența de templat c al celui de al treilea domeniu (C) a probei de construct prin intermediul activității ARN polimerazei dependentă de ADN sau, hibridizarea oligonucleotidelor marcate cu simplă catenă care cuprind o secvență nucleotidică care este în cea mai mare parte complementară la secvența de subunitate a probei celui de al doilea domeniu la subunitățile din cel de al doilea domeniu și respectiv, transcrierea de copii multiple de oligomeri ARN prin intermediul activității polimerazei ARN dependentă de ADN și evaluarea cantitativă a transcripțiilor - aRO 113496 Bl ceasta în cazul în care se utilizează o probă de polimerază; sau, hibridizarea oligonucleotidelor marcate, cu simplă catenă, la subunitățile domeniului și îndepărtarea marcatului nelegat și evaluarea cantitativă a marcatului legat - aceasta în cazul în care se utilizează o probă multimer.
- 21. Metodă de amplificare a unui semnal detectabil într-o determinare imunologică, caracterizată prin aceea că, cuprinde:a) legarea directă sau indirectă la un analit a unei probe moleculare biochimice cuprinzând un domeniu de legare (A), un al doilea domeniu (B) care este o secvență de ADN cu catenă dublă capabilă să funcționeze ca un promotor pentru activitatea enzimei ARD polimerază dependentă de ADN; și un al treilea domeniu (C) care este fie cu unică catenă fie cu dublă catenă și adiacent la domeniul B, astfel încât al treilea domeniu este capabil să funcționeze ca un templat pentru activitatea promotorului celui de al doilea domeniu;b) îndepărtarea probei nelegate;c) transcrierea copiilor multiple de oligomeri, ARN care sunt complementari secvenței c’, a celui de al treilea domeniu, C, al probei construct prin intermediul activității polimerază ARN dependente ADN; șid) evaluarea cantitativă a transcrisurilor ARN.
- 22. Metodă de amplificare, conform revendicării 21, caracterizată prin aceea că, analitul este mai întâi imobilizat, direct sau indirect pe un substrat solid.
- 23. Metodă de amplificare, conform revendicăriilor 21 și 22, caracterizată prin aceea că, domeniul A este o polipeptidă capabilă să funcționeze ca un anticorp, și proba este legată direct sau indirect la analit prin intermediul domeniului A.
- 24. Metodă de amplificare, conform revendicăriilor 21 și 22, caracterizată prin aceea că, (a) domeniul A al probei este o polinucleotidă monocatenară;[b] analitul este legat indirect la proba moleculară prin intermediul unei molecule linker hibrid proteină/ polinucleotidă cu două domenii:(i) un prim domeniu care este o secvență polinucleotidică monocatenară în mare parte complementară la secvența domeniului A al probei; și (ii) un al doilea domeniu care funcționează ca un anticorp specific pentru analit, sau într-un epitop al unui anticorp care este specific pentru analit.
- 25. Metodă de amplificare, conform revendicăriilor 21, 22, 23 și 24 caracterizată prin aceea că, al doilea domeniu B este derivat de la polimerază ARN dependent-ADN a bacteriofagului T7.
- 26. Metodă de amplificare, conform revendicăriilor 21, 22, 23 și 24 caracterizată prin aceea că, (a) cel de al treilea domeniu, C, al probei este transcris în prezență de ribonucleotid trifosfați marcați;(b) transcrisurile celui de al treilea domeniu au un prim subdomeniu, cq, complementar la o probă de captură oligonucleotidică care este imobilizată pe un substrat solid; și (c) transcrisurile menționate sunt imobilizate și apoi evaluate cantitativ.
- 27. Metodă de amplificare, conform revendicăriilor 21, 22, 23, 24 sau 25 caracterizată prin aceea că, (a) cel de al treilea domeniu, C, al primei probei este transcris în prezență de trifosfați ribonucleotidici biotinilați;(b) transcrisul celui de al treilea domeniu are un prim subdomeniu, ca, care este complementar la o probă oligonucleotidică marcată;(c) transcrisurile sunt imobilizate pe un substrat solid avidinilat; și (d) transcrisurile sunt evaluate cantitativ.
- 28. Metodă de amplificare, conform revendicăriilor 21, 22, 23, 24 sau 25 caracterizată prin aceea că, (a) cel de al treilea domeniu, C, al probei este transcris în prezența trifosfaților ribonucleotidici, atât marcați cât și biotinilați;RO 113496 Bl (c) transcrisurile sunt imobilizate pe un substrat solid avidinilat; și (d) transcrisurile sunt evaluate cantitativ.
- 29. Metodă de amplificare, conform revendicăriilor 21, 22, 23, 24 sau 25 caracterizată prin aceea că, (a) transcrisul celui de al treilea domeniu, C, al probei are două subdomenii:(i) un prim domeniu, cv complementar la o probă de captare oligonucleotidică, proba de captare fiind imobilizată pe un substrat solid; și (ii) un al doilea domeniu, c2, care este complementar la o probă oligonucleotidică, marcată;(b) transcrisul este hibridizat la proba de captură;(c) proba marcată este hibridizată la transcrisul menționat; și (d) proba marcată este determinată cantitativ.
- 30. Metodă de amplificare, conform revendicării 21, caracterizată prin aceea că, unitatea cuprinzând al doilea și al treilea domeniu B și C, al primei probe este prezentă în unitățile B/C repetitive multiple.
- 31. Metodă de amplificare a unui semnal utilizată pentru a detecta și evalua cantitativ un antigen într-o determinare imunologică, caracterizată prin aceea că, cuprinde:(a) legarea directă sau indirectă la un analit a unei probe moleculare biochimice conținând un domeniu de legare (A), și un al doilea domeniu (M) care cuprinde o multitudine de subunități oligonucleotidice ADN monocatenare capabile să hibridizeze la o oligonucleotidă marcată monocatenară;(b) îndepărtarea probei nelegate;(c) hibridizarea oligonucleotidelor marcate monocatenare, care conține o secvență de nucleotidă care este în cea mai mare parte compelmentară la secvența subunitară a probei domeniului M la subunități ale celui de al doilea domeniu;(d) îndepărtarea oligonucleotidelor marcate; și (e) evaluarea cantitativă a cantității de legătură, oligonucleotidică marcată, la probă.
- 32. Metodă de amplificare, conform revendicării 31, caracterizată prin aceea că, analitul este mai întâi imobilizat direct sau indirect, pe un substrat solid.
- 33. Metodă de amplificare, conform revendicării 32, caracterizată prin aceea că, domeniul A este o polipeptidă capabilă să funcționeze ca un anticorp și proba este legată direct sau indirect la analit prin intermediul domeniului A.
- 34. Metodă de amplificare, conform revendicării 33, caracterizată prin aceea că, polipeptidă domeniului A se leagă specific la un epitop al unui anticorp și se leagă specific la analit.
- 35. Metodă de amplificare, conform revendicării 31, caracterizată prin aceea că, (a) domeniul A al probei este o polinucleotidă monocatenară; și (b) analitul este legat indirect la proba moleculară prin intermediul unei molecule linker hibride proteină/ polinucleotidă cu două domenii:(i) un prim domeniu care este o secvență polinucleotidică monocatenară complementară în principal la secvența domeniului A al probei; și (ii) un al doilea domeniu care funcționează ca un anticorp, specific pentru analit.
- 36. Metodă de amplificare a unui semnal detectabil într-o imunodeterminare competitivă, caracterizată prin aceea că, cuprinde:(a) construirea unei probe moleculare conținând:(i) un prim domeniu (A) care este capabil să funcționeze ca un imunogen;(ii) un al doilea domeniu (B) care este o polinucleotidă dublu catenară capabilă să funcționeze ca un promotor pentru activitatea enzimei polimerază ARN dependent- ADN; și (iii) un al treilea domeniu (C) care este fie mono- fie dublu catenar și adiaRO 113496 Bl cent la un al doilea domeniul B, astfel încât cel de-al treilea domeniu este capabil să funcționeze ca un templat pentru activitatea de promotor al celui de-al doilea domeniu;(b) imobilizarea probei, direct sau indirect, pe un substrat solid în prezența unui analit competitiv;(c) îndepărtarea probei nelegate;(d) transcrierea de copii multiple de oligomeri ARN care sunt complementari la secvența de templet, c’, a celui de al treilea domeniu, C, al probei construct prin intermediul activității polimerazei ARN dependent - ADN; și (e) evaluarea cantitativă a transcrisurilor ARN.
- 37. Metodă de amplificare a unui semnal detectabil într-o imunodeterminare competitivă, caracterizată prin aceea că, cuprinde:(a) construirea unei probe moleculare conținând:(i) un prim domeniu (A) care este capabil să funcționeze ca un imunogen;și (ii) un al doilea domeniu (M) conținând o multiplicitate de subunități oligonucleotidice monocatenare care sunt capabile să se lege în mod specific la o secvență de acid nucleic monocatenar de interes;(b) imobilizarea probei, direct sau indirect, pe un substrat solid în prezența unui analit competitiv;(c) îndepărtarea probei nelegate;(d) hibridizarea oligonucleotidelor marcate monocatenare care conțin o secvență nucleotidică care este în principal complementară la secvența subunitară a probei domeniului M, la subunitățile din cel de al doilea domeniu;(e) îndepărtarea oligonucleotidelor marcate nelegate; și (f) evaluarea cantitativă a cantității de oligonucleotidă marcată legată la probă.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US51921290A | 1990-05-04 | 1990-05-04 | |
| PCT/US1991/002925 WO1991017442A1 (en) | 1990-05-04 | 1991-05-06 | Protein-nucleic acid probes and immunoassays using same |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RO113496B1 true RO113496B1 (ro) | 1998-07-30 |
Family
ID=24067357
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RO92-01380A RO113496B1 (ro) | 1990-05-04 | 1991-05-06 | Proba moleculara hibrida polipeptida/polinucleotida si metoda de amplificare a unui semnal detectabil intr-o determinare imunologica |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0528870B1 (ro) |
| JP (1) | JP3034304B2 (ro) |
| KR (1) | KR0171617B1 (ro) |
| AT (1) | ATE174121T1 (ro) |
| AU (1) | AU659798B2 (ro) |
| BG (1) | BG61315B1 (ro) |
| CA (1) | CA2081455A1 (ro) |
| DE (1) | DE69130564T2 (ro) |
| HU (1) | HUT64623A (ro) |
| IE (1) | IE911534A1 (ro) |
| PT (1) | PT97580B (ro) |
| RO (1) | RO113496B1 (ro) |
| RU (1) | RU2107730C1 (ro) |
| WO (1) | WO1991017442A1 (ro) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5629153A (en) * | 1990-01-10 | 1997-05-13 | Chiron Corporation | Use of DNA-dependent RNA polymerase transcripts as reporter molecules for signal amplification in nucleic acid hybridization assays |
| DE69131596T2 (de) * | 1990-01-10 | 1999-12-23 | Chiron Diagnostics Corp | Dns-abhängige rns-polymerase-transkripte als reportermoleküle zur signalverstärkung in nukleinsäure-hybridisierungsuntersuchungen |
| EP0648281A4 (en) * | 1991-09-10 | 1997-06-04 | Jack D Love | TARGETED AMPLIFICATION OF DNA AND RNA AND SIGNAL AMPLIFICATION. |
| JPH05149949A (ja) * | 1991-11-26 | 1993-06-15 | Nisshin Flour Milling Co Ltd | 新規な微量物質測定法 |
| CA2129444A1 (en) * | 1992-02-04 | 1993-08-05 | Richard C. Ebersole | Amplification of assay reporters by nucleic acid replication |
| AU4596893A (en) * | 1992-05-29 | 1993-12-30 | Gen Trak, Inc. | Signal amplification probe and methods of use |
| ES2044784B1 (es) * | 1992-06-12 | 1994-09-01 | Inia | Procedimiento para la deteccion e identificacion de patogenos virales y subvirales. |
| US5985548A (en) * | 1993-02-04 | 1999-11-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Amplification of assay reporters by nucleic acid replication |
| WO1994026932A1 (en) * | 1993-05-13 | 1994-11-24 | United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Nucleic acid tagged immunoassay |
| JPH10507344A (ja) * | 1994-08-22 | 1998-07-21 | ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア | エピトープ整列化とタンパク質制限地図作製によるタンパク質の配列決定方法 |
| US5753787A (en) * | 1995-04-10 | 1998-05-19 | Yale University | Nucleic acids encoding ancylostoma secreted protein |
| SE504798C2 (sv) | 1995-06-16 | 1997-04-28 | Ulf Landegren | Immunanalys och testkit med två reagens som kan tvärbindas om de adsorberats till analyten |
| AU2980397A (en) | 1996-06-10 | 1998-01-07 | Laboratory Of Molecular Biophotonics | Highly sensitive fluorescent immunoassay |
| US5922553A (en) * | 1996-11-21 | 1999-07-13 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method of detecting protein by immuno RNA |
| GB9718921D0 (en) * | 1997-09-05 | 1997-11-12 | Brax Genomics Ltd | Catalytically generated mass labels |
| DE69834208T2 (de) * | 1998-12-10 | 2007-01-25 | Daniel P. El Dorado Hills Cashman | Blockierte polymerase polynukleotid-immunoassay und kit |
| US7582420B2 (en) | 2001-07-12 | 2009-09-01 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
| WO2002101358A2 (en) * | 2001-06-11 | 2002-12-19 | Illumina, Inc. | Multiplexed detection methods |
| WO2003048388A2 (en) * | 2001-12-07 | 2003-06-12 | The University Of Liverpool | Immuno polymerase chain reaction assay |
| US10114015B2 (en) | 2013-03-13 | 2018-10-30 | Meso Scale Technologies, Llc. | Assay methods |
| KR102257912B1 (ko) * | 2013-03-13 | 2021-05-27 | 메소 스케일 테크놀러지즈, 엘엘시 | 개선된 분석 방법 |
| EP3143401A4 (en) | 2014-05-15 | 2017-10-11 | Meso Scale Technologies, LLC | Improved assay methods |
| CN114544937B (zh) * | 2020-11-11 | 2023-04-07 | 艾克发(北京)生物技术有限公司 | 一种多重信号放大系统及其在免疫吸附间接法检测中的应用 |
| JP2024521001A (ja) | 2021-05-25 | 2024-05-28 | カビディ エービー | 高感度な分析物検出アッセイのための方法及びそのためのキット |
| CN114277090A (zh) * | 2021-12-17 | 2022-04-05 | 宁波熙宁检测技术有限公司 | Aav8中和抗体检测方法和检测试剂盒 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4299916A (en) * | 1979-12-26 | 1981-11-10 | Syva Company | Preferential signal production on a surface in immunoassays |
| FI63596C (fi) * | 1981-10-16 | 1983-07-11 | Orion Yhtymae Oy | Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser |
| US4556643A (en) * | 1982-07-26 | 1985-12-03 | Agracetus | Assay method and probe for polynucleotide sequences |
| US4748111A (en) * | 1984-03-12 | 1988-05-31 | Molecular Diagnostics, Inc. | Nucleic acid-protein conjugate used in immunoassay |
| US4957858A (en) * | 1986-04-16 | 1990-09-18 | The Salk Instute For Biological Studies | Replicative RNA reporter systems |
| US4749647A (en) * | 1984-06-22 | 1988-06-07 | Genetic Systems Corporation | Polymerization-induced separation assay using recognition pairs |
| US4828979A (en) * | 1984-11-08 | 1989-05-09 | Life Technologies, Inc. | Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection |
| US4910300A (en) * | 1985-12-11 | 1990-03-20 | Chiron Corporation | Method for making nucleic acid probes |
| US4868105A (en) * | 1985-12-11 | 1989-09-19 | Chiron Corporation | Solution phase nucleic acid sandwich assay |
| US4882269A (en) * | 1985-12-13 | 1989-11-21 | Princeton University | Amplified hybridization assay |
| CA1339351C (en) * | 1987-10-15 | 1997-08-26 | Michael S. Urdea | Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same |
| WO1990002819A1 (en) * | 1988-09-08 | 1990-03-22 | The Salk Institute For Biological Studies | Replicative rna-based amplification detection systems |
-
1991
- 1991-05-06 RO RO92-01380A patent/RO113496B1/ro unknown
- 1991-05-06 AU AU77912/91A patent/AU659798B2/en not_active Ceased
- 1991-05-06 PT PT97580A patent/PT97580B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-05-06 JP JP3508881A patent/JP3034304B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-05-06 KR KR1019920702987A patent/KR0171617B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-05-06 RU RU92016387A patent/RU2107730C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1991-05-06 EP EP91908991A patent/EP0528870B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-06 DE DE69130564T patent/DE69130564T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-05-06 AT AT91908991T patent/ATE174121T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-05-06 IE IE153491A patent/IE911534A1/en unknown
- 1991-05-06 HU HU9203445A patent/HUT64623A/hu unknown
- 1991-05-06 WO PCT/US1991/002925 patent/WO1991017442A1/en active IP Right Grant
- 1991-05-06 CA CA002081455A patent/CA2081455A1/en not_active Abandoned
-
1992
- 1992-11-03 BG BG97041A patent/BG61315B1/bg unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IE911534A1 (en) | 1991-11-06 |
| AU7791291A (en) | 1991-11-27 |
| JP3034304B2 (ja) | 2000-04-17 |
| EP0528870A1 (en) | 1993-03-03 |
| CA2081455A1 (en) | 1991-11-05 |
| EP0528870B1 (en) | 1998-12-02 |
| RU2107730C1 (ru) | 1998-03-27 |
| HU9203445D0 (en) | 1993-01-28 |
| WO1991017442A1 (en) | 1991-11-14 |
| PT97580B (pt) | 1998-08-31 |
| DE69130564D1 (de) | 1999-01-14 |
| HUT64623A (en) | 1994-01-28 |
| DE69130564T2 (de) | 1999-07-29 |
| BG97041A (bg) | 1993-12-24 |
| AU659798B2 (en) | 1995-06-01 |
| ATE174121T1 (de) | 1998-12-15 |
| PT97580A (pt) | 1992-03-31 |
| KR0171617B1 (ko) | 1999-05-01 |
| JPH06506768A (ja) | 1994-07-28 |
| EP0528870A4 (en) | 1993-06-09 |
| BG61315B1 (en) | 1997-05-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5656731A (en) | Nucleic acid-amplified immunoassay probes | |
| RO113496B1 (ro) | Proba moleculara hibrida polipeptida/polinucleotida si metoda de amplificare a unui semnal detectabil intr-o determinare imunologica | |
| US5902724A (en) | Signal amplification method | |
| EP0779934B1 (en) | Compositions and methods for use in detection of analytes | |
| US5985548A (en) | Amplification of assay reporters by nucleic acid replication | |
| CA1314810C (en) | Heterologous system for the detection of chemically-labeled dna and other biological materials providing a receptor or target moiety thereon | |
| EP0469066B1 (en) | Improved nucleic acid hybridization assays for hbv employing amplification | |
| US4748111A (en) | Nucleic acid-protein conjugate used in immunoassay | |
| EP0625211B1 (en) | Amplification of assay reporters by nucleic acid replication | |
| US20100273145A1 (en) | Assay method utilizing polynucleotide sequences | |
| EP0819249A1 (en) | Sensitive immunoassays utilizing antibody conjugates with replicable dna templates | |
| EP1813948A1 (en) | Method of detecting target substances | |
| US20040018495A1 (en) | Microparticle based signal amplification for the detection of analytes | |
| JP2000502887A (ja) | 生体分子の電子的固相アッセイ | |
| EP0146039A2 (en) | Hybridization assay with immobilization of hybrids by antihybrid binding | |
| JPH08205897A (ja) | 特異結合検査法およびそれに用いる検査用試薬 | |
| JP2004533257A (ja) | 増幅可能なプローブ |