JP2024521001A - 高感度な分析物検出アッセイのための方法及びそのためのキット - Google Patents
高感度な分析物検出アッセイのための方法及びそのためのキット Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024521001A JP2024521001A JP2023564045A JP2023564045A JP2024521001A JP 2024521001 A JP2024521001 A JP 2024521001A JP 2023564045 A JP2023564045 A JP 2023564045A JP 2023564045 A JP2023564045 A JP 2023564045A JP 2024521001 A JP2024521001 A JP 2024521001A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- ligand
- polymerase
- labeled
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000012491 analyte Substances 0.000 title claims abstract description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 54
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 238000003556 assay Methods 0.000 title description 19
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims abstract description 93
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 93
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 81
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 81
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 70
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims abstract description 58
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 57
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 claims abstract description 46
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 34
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 33
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 32
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 claims abstract description 21
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims abstract description 17
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims abstract description 17
- -1 deoxyribonucleotide triphosphates Chemical class 0.000 claims abstract description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 50
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 33
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 27
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 27
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 22
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 claims description 17
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 claims description 17
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 17
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 15
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 12
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 claims description 11
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 8
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 claims description 8
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 8
- 102000016903 DNA Polymerase gamma Human genes 0.000 claims description 7
- 108010014080 DNA Polymerase gamma Proteins 0.000 claims description 7
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 3
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 12
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 115
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 85
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 43
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 36
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 36
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 31
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 23
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 22
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 22
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 20
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 19
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 17
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 17
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 16
- 101000629318 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 16
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 14
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 13
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 12
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 12
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 12
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 12
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 11
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 11
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 11
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 11
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 11
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 9
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 9
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 7
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000000670 ligand binding assay Methods 0.000 description 4
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical group O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000006872 enzymatic polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 3
- 230000007274 generation of a signal involved in cell-cell signaling Effects 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 3
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 2
- 102100035472 DNA polymerase iota Human genes 0.000 description 2
- 101001094672 Homo sapiens DNA polymerase iota Proteins 0.000 description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- XYIPYISRNJUPBA-UHFFFAOYSA-N [3-(3'-methoxyspiro[adamantane-2,4'-dioxetane]-3'-yl)phenyl] dihydrogen phosphate Chemical compound O1OC2(C3CC4CC(C3)CC2C4)C1(OC)C1=CC=CC(OP(O)(O)=O)=C1 XYIPYISRNJUPBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical class O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 2
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BIZCBYJEVMKIDD-UHFFFAOYSA-N 2-formylbenzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1C=O BIZCBYJEVMKIDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KOUZWQLNUJWNIA-UHFFFAOYSA-N 2-hydrazinylpyridine-3-carboxamide Chemical compound NNC1=NC=CC=C1C(N)=O KOUZWQLNUJWNIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 101000909256 Caldicellulosiruptor bescii (strain ATCC BAA-1888 / DSM 6725 / Z-1320) DNA polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108010078851 HIV Reverse Transcriptase Proteins 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 108010027090 biotin-streptavidin complex Proteins 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007809 chemical reaction catalyst Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000037048 polymerization activity Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000036632 reaction speed Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
【課題】温度循環又は３７℃を超える温度を必要とせず、いくつかのステップ及び試薬並びに標準機器のみを必要とする、生物学的又は化学的分析物の検出のための単純で高感度な方法の提供。【解決手段】分析物に特異的に結合する能力があるリガンドの使用を含む、サンプル中の目的の分析物の検出のための方法であって、リガンドは、１８～４０ヌクレオチドの長さを有するオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーより長く、及びオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーと少なくとも部分的に相補的である配列を有するポリリボヌクレオチド鋳型、複数の標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸及び逆転写酵素活性を有する酵素を含み、分析物は、酵素によって合成された任意の標識ＤＮＡ鎖を検出することによって検出される、方法に関する。本発明は、こうした方法を実施するための試薬を含むキットにも関する。【選択図】なし
Description
発明の分野
本発明は、概して、生体分子の検出の分野に関する。より具体的には、本発明は、リガンド－分析物結合アッセイにおいて検出可能なシグナルを増幅するための核酸重合の使用に関する。
本発明は、概して、生体分子の検出の分野に関する。より具体的には、本発明は、リガンド－分析物結合アッセイにおいて検出可能なシグナルを増幅するための核酸重合の使用に関する。
緒言
リガンド結合アッセイは、薬剤、抗原及び抗体などの広範囲な化合物を同定及び定量するための強力なツールを表す。リガンド結合アッセイのある１つのクラスでは、抗体がリガンド結合成分として使用される。酵素免疫測定法は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定）及びＣＬＩＡ（化学発光免疫測定法）などの種々のフォーマットで存在する。古典的な酵素免疫測定法では、最良の場合で１ｐｇ／ｍｌの感度が達成される。およそ２０キロダルトンに等しい分子量（Ｍｗ）を有する典型的なタンパク質の場合、１ｐｇ／ｍｌは、およそ３×１０７分子／ｍｌ又は５０アトモル／ｍｌに等しい。この感度は、ほぼ全ての生物医学的課題に対して十分であると考えられている。
リガンド結合アッセイは、薬剤、抗原及び抗体などの広範囲な化合物を同定及び定量するための強力なツールを表す。リガンド結合アッセイのある１つのクラスでは、抗体がリガンド結合成分として使用される。酵素免疫測定法は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定）及びＣＬＩＡ（化学発光免疫測定法）などの種々のフォーマットで存在する。古典的な酵素免疫測定法では、最良の場合で１ｐｇ／ｍｌの感度が達成される。およそ２０キロダルトンに等しい分子量（Ｍｗ）を有する典型的なタンパク質の場合、１ｐｇ／ｍｌは、およそ３×１０７分子／ｍｌ又は５０アトモル／ｍｌに等しい。この感度は、ほぼ全ての生物医学的課題に対して十分であると考えられている。
しかし、近年、生物医学的診断における多くの新たな課題として、低存在量バイオマーカーの最適な検出のために数百倍の感度増加が要求されることが示唆されている。感度増加の別の明らかな利点は、生物学的マトリックスの干渉効果がサンプルの単純希釈によって相殺可能であり、アッセイ性能の低下を伴わないことである。
古典的な酵素免疫測定法では、シグナル生成系における制限に起因して、また系のバックグラウンド、すなわちシグナル生成成分の系における材料との非特異的結合に起因して、特定の数を下回る分子を検出することができない。
感度が改善されたいくつかの技術、例えばＤＮＡ増強免疫測定法（イムノポリメラーゼ連鎖反応（ｉＰＣＲ））、（Cantor et al, Science, Vol. 258, 2 Oct. 1992、米国特許第５６６５５３９号）、電気化学発光（Wei and Wang 2011）及び単一分子計数（Todd et al 2007）が登場してこれらの要求を満たしている。以下の文章では、主にイムノＰＣＲ、すなわち本発明と最も関連性がある先行技術に焦点を当てる。
国際特許公開国際公開第９１／１７４４２号は、免疫測定法でシグナルを増強するために使用されるタンパク質／核酸ハイブリッドプローブを記載している。プローブは、タンパク質部分、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにおけるプロモーターとして機能する二本鎖ポリヌクレオチド及びプロモーターにおける一本鎖又は二本鎖鋳型を含む。タンパク質部分は、既知の抗原に特異的に結合する抗体として機能する能力があるポリペプチドである。転写産物は、標識された相補的ポリヌクレオチドプローブの使用により、別々のステップで定量される。
上記で言及されたCantor et al、米国特許第５６６５５３９号、Science, Vol. 258, 2 Oct. 1992は、結合された抗原の検出を可能にするための、オリゴヌクレオチドの抗体への付着を報告している。ビオチン及び免疫グロブリンＧの両方に対する厳密な特異的結合親和性を有するストレプトアビジン－タンパク質Ａキメラを使用して、ビオチン化ＤＮＡを、マイクロタイタープレートウェル上に固定化された抗原－モノクローナル抗体複合体に特異的に付着させた。次に、付着されたＤＮＡのセグメントは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって増幅された。ＰＣＲ産物の分析により、従来のＥＬＩＳＡと比較して有意な改善である、９．６×１０－２２モルまで低く検出することができた）。しかし、Cantor et al.では、ビオチン化試薬及び結合タンパク質の添加のために余分なステップが要求される。各アッセイは、余分な試薬を除去し、非特異的に結合された試薬のアッセイを排除するため、２０もの数の洗浄ステップを含み得る。これらの試薬の添加及び洗浄ステップのため、イムノＰＣＲ法に複雑性及び時間が加わる。
Hendrickson et al., Nucleic Acids Research, 1995, Vol 23, No. 3は、複雑性を低減する、Cantor et al.のアッセイの改善を報告している。いくつかの反応及び洗浄ステップは、ＤＮＡの抗体への直接的共有結合による抗体のＤＮＡによる標識によって排除された。これら早期の免疫ＰＣＲアッセイにおけるＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動で分離され、様々な方法によって検出された。核酸及びタンパク質の両方の検出／定量のためのアッセイは、それ以来、ＰＣＲ産物の検出のためのより効率的な方法の使用によって改善されている。最新のリアルタイムＰＣＲアッセイでは、要求される波長での励起後、各増幅サイクル後に連続的に測定可能であるフルオロフォア標識ヌクレオチドが利用されている（レビューとして、Kralik, & Ricchi 2017を参照されたい）。
理論上、イムノＰＣＲは、リガンド結合アッセイの検出感度を数桁改善する能力を有する。しかし、改善は、実際には３～１０倍に制限されることが多い（例えば、Simonova et al 2018）。決定的な制限因子は、系のバックグラウンドであることが多い。陽性シグナルを増加させる標識システムは、一般に、バックグラウンドコントロールからのシグナルも確かに増加させる。米国特許出願公開第２００５／０２３３３５１Ａ１号は、これらの問題に対処している。抗原の異なる決定基に特異的であり、架橋可能なオリゴヌクレオチドとコンジュゲートされた２つの異なる抗体が抗原に結合される。オリゴヌクレオチドが増幅され、それにより互いに架橋されているこうしたオリゴヌクレオチドのみが増幅されることになる。このようにして、非特異的なバックグラウンドシグナルは、回避されるか又は少なくとも低減される。
全てのＰＣＲ検査に影響する基本的な問題は、イムノＰＣＲに対しても支障となる。そのシステムは、汚染に感受性があり、偽陽性を引き起こす。別の障壁は、定量検出を可能にするために関連する増幅コントロールを設計することである。さらに、抗体－抗原相互作用に悪影響を及ぼす反復される高温循環など、イムノＰＣＲにより特異的な一連の問題が存在する。抗体及び抗原の両方の構造は、それがペプチド又はタンパク質である場合に影響を受け、抗体－抗原結合の低下をもたらし得る。したがって、シグナル増幅からの感度の利得は、抗体－抗原結合の強度低下によって相殺され得る。
国際公開第２００６／０５３３８０号は、例えば、分析物に特異的であり、ポリヌクレオチドにコンジュゲートされた抗体の使用を含む、サンプル中の分析物の存在又は不在についてスクリーニングする方法であって、ポリヌクレオチドを伸長するか又は相補的ポリヌクレオチドを生成することと、そのように伸長又は生成されたポリヌクレオチドを検出することとを含む方法を開示している。この方法に従って有意なシグナル増幅を達成するために要求される長い一本鎖の伸長されたポリヌクレオチドは、脆弱なものになるであろう。洗浄手順中の機械的ブレーキ並びにサンプル及び／又は試薬に起因するヌクレアーゼの効果の両方は、干渉し、不規則性をもたらし、シグナル増幅を制限し、この方法の有用性を妨げることになる。国際公開第２００６／０５３３８０号は、相補的ポリヌクレオチドの生成に関する実施形態について詳述しないか又はそれを可能にせず、この実施形態に基づく実施例を提供していない。したがって、このモデルが実際に有用であり、及び／又は標準的なＥＬＩＳＡ検査と比較して検出感度の増加をもたらすか否かは、定かではない。
疑義を回避するために、先行技術の大まかな欠点又は短所に関する上記のあらゆる考察は、本発明の観点における技術に関する本発明者らの理解に基づき、こうした欠点及び短所は、当技術分野で認識若しくは公知されるか、理解されるか又は他に当業者にとって明白であったことの承認として解釈されるべきではない。
発明の概要
本発明は、先行技術の短所の少なくとも一部を解決することを目的とする。したがって、温度循環又は３７℃を超える温度を必要とせず、いくつかのステップ及び試薬並びに標準機器のみを必要とする、生物学的又は化学的分析物の検出のための単純で高感度な方法が提供される。
本発明は、先行技術の短所の少なくとも一部を解決することを目的とする。したがって、温度循環又は３７℃を超える温度を必要とせず、いくつかのステップ及び試薬並びに標準機器のみを必要とする、生物学的又は化学的分析物の検出のための単純で高感度な方法が提供される。
第１態様における本発明は、サンプル中の目的の分析物の検出のための方法であって、
－ 分析物に特異的に結合する能力がある第１リガンドを、リガンドの分析物への特異的結合を促進する条件下でサンプルと接触させることであって、第１リガンドは、分析物に特異的に結合する能力がある結合部分と、結合部分に結合されたオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーとを含み、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーは、１８～４０ヌクレオチドの長さを有する、接触させることと；
－ サンプルから非結合の第１リガンドを除去することと；
－ 結合された第１リガンドを、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーより長く、及びオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーと少なくとも部分的に相補的である配列を有するポリリボヌクレオチド鋳型；複数の標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸；及び逆転写酵素活性を有する酵素と接触させることと；
－ 結合されたオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーを含む結合された第１リガンド、ポリリボヌクレオチド鋳型、標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸及び酵素を、前記酵素による標識ＤＮＡ鎖の合成に適した条件下でインキュベートすることと；
－ 任意の合成された標識ＤＮＡ鎖を検出することと
を含む方法に関する。
－ 分析物に特異的に結合する能力がある第１リガンドを、リガンドの分析物への特異的結合を促進する条件下でサンプルと接触させることであって、第１リガンドは、分析物に特異的に結合する能力がある結合部分と、結合部分に結合されたオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーとを含み、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーは、１８～４０ヌクレオチドの長さを有する、接触させることと；
－ サンプルから非結合の第１リガンドを除去することと；
－ 結合された第１リガンドを、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーより長く、及びオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーと少なくとも部分的に相補的である配列を有するポリリボヌクレオチド鋳型；複数の標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸；及び逆転写酵素活性を有する酵素と接触させることと；
－ 結合されたオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーを含む結合された第１リガンド、ポリリボヌクレオチド鋳型、標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸及び酵素を、前記酵素による標識ＤＮＡ鎖の合成に適した条件下でインキュベートすることと；
－ 任意の合成された標識ＤＮＡ鎖を検出することと
を含む方法に関する。
一実施形態では、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーは、４つの塩基Ａ、Ｇ、Ｔ及びＣの全てを含有するオリゴデオキシリボヌクレオチド若しくはそのサブセット又は単一の塩基を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチド、好ましくはオリゴデオキシチミジンから選択される。
一実施形態では、標識デオキシリボヌクレオチドは、標識デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、例えばブロモ－ｄＵＴＰ又はヨード－ｄＵＴＰ、好ましくはブロモ－ｄＵＴＰであり、及びポリリボヌクレオチド鋳型は、ポリリボアデニル酸である。
一実施形態では、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーは、２２～４０ヌクレオチドの長さを有する。
一実施形態では、ポリリボヌクレオチド鋳型は、１０２～１０３ヌクレオチド、好ましくは２×１０２～５×１０２ヌクレオチドの長さを有する。
一実施形態では、逆転写酵素活性を有する酵素は、真核生物ポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼガンマ；ウイルスポリメラーゼ、例えばレトロウイルス逆転写酵素、好ましくはＨＩＶ若しくはＭ－ＭｕＬＶ逆転写酵素又は細菌ポリメラーゼ、例えば中温性細菌由来の細菌ポリメラーゼ、好ましくは大腸菌（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片若しくは好熱性細菌由来の細菌ポリメラーゼ、好ましくはバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）由来のＢｓｔ３．０である。
一実施形態では、逆転写酵素活性を有する酵素は、ＤＮＡポリメラーゼガンマ、ＨＩＶ又はＭ－ＭｕＬＶ逆転写酵素、大腸菌（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片及びバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus Stearothermophilus）由来のＢｓｔ３．０からなる群から選択される。
一実施形態では、インキュベーションステップは、一定の温度、好ましくは３７℃で３０分～４時間、好ましくは１時間にわたって実施される。
一実施形態では、検出は、
－ 標識ＤＮＡ鎖に特異的に結合する能力がある第２リガンドを、合成された標識ＤＮＡ鎖と、第２リガンドのＤＮＡ鎖への特異的結合を促進する条件下で接触させるステップであって、第２リガンドは、合成された標識ＤＮＡに特異的に結合する能力がある結合部分と、共有結合された酵素とを含む、ステップと；
－ サンプルから非結合の第２リガンドを除去するステップと；
－ 結合された酵素による切断時に検出可能なシグナルを生成する、結合された酵素のための基質を添加するステップと；
－ 前記シグナルを検出するステップと
を含む検出方法を通して実施される。
－ 標識ＤＮＡ鎖に特異的に結合する能力がある第２リガンドを、合成された標識ＤＮＡ鎖と、第２リガンドのＤＮＡ鎖への特異的結合を促進する条件下で接触させるステップであって、第２リガンドは、合成された標識ＤＮＡに特異的に結合する能力がある結合部分と、共有結合された酵素とを含む、ステップと；
－ サンプルから非結合の第２リガンドを除去するステップと；
－ 結合された酵素による切断時に検出可能なシグナルを生成する、結合された酵素のための基質を添加するステップと；
－ 前記シグナルを検出するステップと
を含む検出方法を通して実施される。
一実施形態では、第２リガンドは、合成された標識ＤＮＡに特異的に結合する抗体であって、それに共有結合された酵素、例えばアルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼを有する抗体である。
一実施形態では、共有結合された酵素は、基質に対して作用して、比色分析、蛍光、化学発光又は電気化学シグナルを生成する。
一実施形態では、共有結合された酵素は、基質に対して作用して、検出可能なシグナルとして化学発光シグナルを生成するアルカリホスファターゼである。
一実施形態では、目的の分析物の検出は、定量検出である。
第２態様では、本発明は、目的の分析物に特異的に結合する能力がある結合部分と、結合部分に結合された１８～４０ヌクレオチドの長さのオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーとを含む第１リガンド；オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーより長く、及びオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーと少なくとも部分的に相補的である配列を有するポリリボヌクレオチド鋳型、複数の標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸；及び逆転写酵素活性を有する酵素を含むパーツキットに関する。
一実施形態では、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーは、４つの塩基Ａ、Ｇ、Ｔ及びＣの全てを含有するオリゴデオキシリボヌクレオチド若しくはそのサブセット又は単一の塩基を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチド、好ましくはオリゴデオキシチミジンから選択される。
一実施形態では、標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸は、標識デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、例えばブロモ－ｄＵＴＰ又はヨード－ｄＵＴＰ、好ましくはブロモ－ｄＵＴＰであり、及びポリリボヌクレオチド鋳型は、ポリリボアデニル酸である。
一実施形態では、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーは、２２～４０ヌクレオチドの長さを有する。
一実施形態では、ポリリボヌクレオチド鋳型は、１０２～１０３ヌクレオチド、好ましくは２×１０２～５×１０２ヌクレオチドの長さを有する。
一実施形態では、逆転写酵素活性を有する酵素は、真核生物、ウイルス又は細菌ポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼガンマ、ＨＩＶ若しくはＭ－ＭｕＬＶ逆転写酵素、大腸菌（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片又はバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus Stearothermophilus）由来のＢｓｔ３．０である。
一実施形態では、パーツキットは、標識デオキシリボヌクレオチドに特異的に結合する能力がある第２リガンドであって、共有結合された酵素も含む第２リガンドと、前記酵素のための基質とをさらに含む。
一実施形態では、前記第２リガンドは、モノクローナル抗体であって、それに共有結合された酵素、例えばアルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼを有するモノクローナル抗体である。
一実施形態では、共有結合された酵素は、基質に対して作用して、検出可能なシグナルとして化学発光シグナルを生成するアルカリホスファターゼである。
図面の簡単な説明
本発明に従うポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅モデルの概略図を示す。
本発明の一実施形態における、生成されたシグナルとプライマー標識リガンドの量との間の関係を示し、分析物検出のための標識として使用されるプライマーを検出及び定量する系の能力を図示する。
異なる長さのオリゴデオキシチミジンプライマーを伴うリガンドとシグナルとの間の関係を図示する。
プライマー伸長ステップにおける真核生物、レトロウイルス及び細菌ポリメラーゼによる逆転写の使用を図示する。
標識リガンドの異なる量とシグナルとの間の関係を図示する。
使用される逆転写酵素活性の異なる量とシグナルとの間の関係を図示する。
２種のレトロウイルス逆転写酵素における逆転写反応時間とシグナルとの間の関係を図示する。
プライマー伸長ステップにおける異なる標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸の使用を図示する。
抗原捕捉ＥＬＩＳＡにおける本発明の実装を図示する。
定義及び略称
「ｏｄＴＸ」は、長さＸのデオキシチミジンヌクレオチド単位のオリゴデオキシチミジンの略称であり、すなわち、「ｏｄＴ２２」は、２２デオキシチミジンからなるオリゴヌクレオチドである。
「ｐｒＡ」は、一本鎖ポリリボアデニル酸の略称である。
ＥＬＩＳＡ＝酵素結合免疫吸着測定
ＰＣＲ＝ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＴ＝逆転写酵素
ＳＡＲＳ＝重症急性呼吸器症候群
ＣｏＶ＝コロナウイルス
ＮＩＢＳＣ＝国立生物学的製剤研究所（ＵＫ）
Ｍ－ＭｕＬＶ＝モロニーマウス白血病ウイルス（Moloney Murine leukemia virus）
ＨＩＶ＝ヒト免疫不全ウイルス
ＨＲＰ＝ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ＡＰ＝アルカリホスファターゼ
Ｂｓｔ＝バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus Stearothermophilus）
Ｐｏｌ－Ｇ＝ヒトガンマポリメラーゼ
「ｏｄＴＸ」は、長さＸのデオキシチミジンヌクレオチド単位のオリゴデオキシチミジンの略称であり、すなわち、「ｏｄＴ２２」は、２２デオキシチミジンからなるオリゴヌクレオチドである。
「ｐｒＡ」は、一本鎖ポリリボアデニル酸の略称である。
ＥＬＩＳＡ＝酵素結合免疫吸着測定
ＰＣＲ＝ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＴ＝逆転写酵素
ＳＡＲＳ＝重症急性呼吸器症候群
ＣｏＶ＝コロナウイルス
ＮＩＢＳＣ＝国立生物学的製剤研究所（ＵＫ）
Ｍ－ＭｕＬＶ＝モロニーマウス白血病ウイルス（Moloney Murine leukemia virus）
ＨＩＶ＝ヒト免疫不全ウイルス
ＨＲＰ＝ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ＡＰ＝アルカリホスファターゼ
Ｂｓｔ＝バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus Stearothermophilus）
Ｐｏｌ－Ｇ＝ヒトガンマポリメラーゼ
詳細な説明
本発明は、分析物に特異的に結合する能力があるリガンドの使用を含む、サンプル中の目的の分析物の検出、特に定量検出のための方法に関し、リガンドは、１８～４０ヌクレオチドの長さを有するオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーより長く、及びオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーと少なくとも部分的に相補的である配列を有するポリリボヌクレオチド鋳型、複数の標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸及び逆転写酵素活性を有する酵素を含み、分析物は、酵素によって合成された任意の標識ＤＮＡ鎖を検出することによって検出される。本発明は、こうした方法を実施するための試薬を含むキットにも関する。
本発明は、分析物に特異的に結合する能力があるリガンドの使用を含む、サンプル中の目的の分析物の検出、特に定量検出のための方法に関し、リガンドは、１８～４０ヌクレオチドの長さを有するオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーより長く、及びオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーと少なくとも部分的に相補的である配列を有するポリリボヌクレオチド鋳型、複数の標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸及び逆転写酵素活性を有する酵素を含み、分析物は、酵素によって合成された任意の標識ＤＮＡ鎖を検出することによって検出される。本発明は、こうした方法を実施するための試薬を含むキットにも関する。
本発明では、目的の分析物に特異的に結合することができる抗体などの親和性リガンドが使用される。親和性リガンドは、プライマー伸長ステップを構成する逆転写反応におけるプライマーとして役立つ短い一本鎖デオキシオリゴヌクレオチドで標識される。温度循環又は温度上昇は、必要ではなく、一定の生理学的温度での１回のインキュベーションのみが必要とされる。逆転写ステップでは、ＤＮＡ－ＲＮＡヘリックスが形成され、ＤＮＡ鎖に組み込まれるデオキシリボヌクレオチドは、その後の検出ステップで検出できるように標識される。
本発明では、分析物分子に結合されたこうした各親和性リガンドの場合、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドにおける新規に作成されたＤＮＡ鎖内の標識デオキシリボヌクレオチドは、その後のシグナル生成ステップにおける標的分子となる。これは、結合された抗体がその後のシグナル生成ステップにおける唯一の標的分子である（例えば、二次抗体－酵素コンジュゲート）標準の免疫測定法と比較して、親和性リガンド／分析物複合体あたりにより多くのシグナルを生成するコンジュゲートが結合してシグナル増幅における基盤を提供することを意味する。
本発明は、プライマー伸長ステップのための１つのユニバーサルＤＮＡプライマー配列及び１つのユニバーサルＲＮＡ鋳型を使用することにより、分析物検出方法で必要とされる核酸試薬の複雑性も先行技術のイムノＰＣＲと比較して低減する。オリゴ／ポリヌクレオチドの両方は、それぞれ反復された単一ヌクレオチド、例えばデオキシチミジン及びアデノシンからなる。温度循環又は温度上昇は、必要ではなく、生理学的温度での１回のインキュベーションのみが必要とされる。
プライマー伸長のために使用される酵素重合プロセスは、逆転写反応であり、それにより、ポリメラーゼ酵素は、新たな相補的ＤＮＡ鎖を構築する。これを行うため、それには、複製するためのＲＮＡ鎖（鋳型）、伸長を開始する起点の短い相補的ＤＮＡ鎖（プライマー）及び成長鎖のための構成要素として使用可能である相補的デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）が必要である。本発明で使用されるｄＮＴＰを標識することで、新規に合成されたＤＮＡ鎖の検出が促進される。
イムノＰＣＲの場合のように、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ反応の代わりに逆転写反応を用いることの１つの利点は、逆転写酵素活性が、ＤＮＡポリメラーゼ活性と比較して、生体サンプル中で広範性がはるかに低いことである。内因性ＤＮＡポリメラーゼからの汚染は、バックグラウンドシグナルの増加及び陰性サンプル中での偽陽性結果を引き起こし得る。特定の逆転写酵素は、レトロウイルス又は合成起源であり、哺乳動物細胞内の逆転写酵素活性のベースラインレベルは、非常に低い。一部のＤＮＡポリメラーゼは、インビトロ系で逆転写を実施するように促されるが、逆転写酵素活性は、ＤＮＡポリメラーゼ活性よりはるかに低い。
したがって、一態様では、本発明は、サンプル中の目的の分析物の検出のための方法であって、
－ 分析物に特異的に結合する能力がある第１リガンドを、リガンドの分析物への特異的結合を促進する条件下でサンプルと接触させることであって、第１リガンドは、分析物に特異的に結合する能力がある結合部分と、結合部分に結合されたオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーとを含み、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーは、１８～４０ヌクレオチドの長さを有する、接触させることと；
－ サンプルから非結合の第１リガンドを除去することと；
－ 結合された第１リガンドを、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーより長く、及びオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーと少なくとも部分的に相補的である配列を有するポリリボヌクレオチド鋳型；複数の標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸；及び逆転写酵素活性を有する酵素と接触させることと；
－ 結合されたオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーを含む結合された第１リガンド、ポリリボヌクレオチド鋳型、標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸及び酵素を、前記酵素による標識ＤＮＡ鎖の合成に適した条件下でインキュベートすることと；
－ 任意の合成された標識ＤＮＡ鎖を検出することと
を含む方法に関する。
－ 分析物に特異的に結合する能力がある第１リガンドを、リガンドの分析物への特異的結合を促進する条件下でサンプルと接触させることであって、第１リガンドは、分析物に特異的に結合する能力がある結合部分と、結合部分に結合されたオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーとを含み、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーは、１８～４０ヌクレオチドの長さを有する、接触させることと；
－ サンプルから非結合の第１リガンドを除去することと；
－ 結合された第１リガンドを、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーより長く、及びオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーと少なくとも部分的に相補的である配列を有するポリリボヌクレオチド鋳型；複数の標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸；及び逆転写酵素活性を有する酵素と接触させることと；
－ 結合されたオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーを含む結合された第１リガンド、ポリリボヌクレオチド鋳型、標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸及び酵素を、前記酵素による標識ＤＮＡ鎖の合成に適した条件下でインキュベートすることと；
－ 任意の合成された標識ＤＮＡ鎖を検出することと
を含む方法に関する。
いくつかの実施形態では、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーは、４つの塩基Ａ、Ｇ、Ｔ及びＣの全てを含有するオリゴデオキシリボヌクレオチド若しくはそのサブセット又は単一の塩基を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチド、好ましくはオリゴデオキシチミジンから選択される。
いくつかの実施形態では、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーは、少なくとも２０ヌクレオチド、例えば少なくとも２１又は２２ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーは、４０以下のヌクレオチド、例えば３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２３又は２２以下のヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチド鋳型は、１０２～１０３ヌクレオチド、例えば約２×１０２～５×１０２ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、本発明では、逆転写酵素又は逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、オリゴデオキシチミジン（ｏｄＴ）標識抗体及びプライマー伸長のための、平均長さが約５００のＡ塩基である可溶性ポリ（ｒＡ）鋳型が使用される。逆転写ステップ後、結合された各オリゴデオキシチミジン（ｏｄＴ）標識抗体は、新規に作成されたＤＮＡが化学標識された塩基からなる場合、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド分子を運ぶことになる。
いくつかの実施形態では、逆転写酵素活性を有する酵素は、真核生物、ウイルス又は細菌ポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼガンマ、ＨＩＶ若しくはＭ－ＭｕＬＶ逆転写酵素などのレトロウイルス逆転写酵素、大腸菌（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片又はバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus Stearothermophilus）由来のＢｓｔ３．０である。インビトロでの異なるポリメラーゼの処理能力は、反応条件に依存して変動するが、典型的な値は、２～３分の酵素プライマー鋳型複合体の半減期である。
いくつかの実施形態では、インキュベーションステップは、一定の温度、好ましくは３７℃で３０分～４時間、好ましくは１時間にわたって実施される。レトロウイルス逆転写酵素（ＲＴ）によるｐｒＡ鋳型上でのインビトロ合成は、３７℃において１０～１５ヌクレオチド／秒の取り込み速度でおよそ進行する（例えば、Hubert et al 1989を参照されたい）。これらの仮定から、ｏｄＴプライマーの酵素的伸長が３０～５０秒以内にｐｒＡ５００鋳型の末端に達することが算出され得る。１つの鋳型のみを使用する従来の反応モデルは、本発明における十分なシグナル増幅も、時間と線形な重合反応も提供しないことになる。しかし、特定のポリメラーゼは、単一プライマーから開始し、鋳型長さより長い産物をもたらす、複数の鋳型を使用する能力を有する。このタイプの反応は、レトロウイルス逆転写酵素及び特定の他のより乱雑なポリメラーゼによって実施することができ、酵素がインビボで触媒する反応のインビトロな影響である（例えば、Hubert et al 1989, Lennerstrand et al 1996）。
一実施形態では、検出は、
－ 標識ＤＮＡ鎖に特異的に結合する能力がある第２リガンドを、合成された標識ＤＮＡ鎖と、第２リガンドのＤＮＡ鎖への特異的結合を促進する条件下で接触させるステップであって、第２リガンドは、合成された標識ＤＮＡに特異的に結合する能力がある結合部分と、共有結合された酵素とを含む、ステップと；
－ サンプルから非結合の第２リガンドを除去するステップと；
－ 結合された酵素による切断時に検出可能なシグナルを生成する、結合された酵素のための基質を添加するステップと；
－ 前記シグナルを検出するステップと
を含む検出方法を通して実施される。
－ 標識ＤＮＡ鎖に特異的に結合する能力がある第２リガンドを、合成された標識ＤＮＡ鎖と、第２リガンドのＤＮＡ鎖への特異的結合を促進する条件下で接触させるステップであって、第２リガンドは、合成された標識ＤＮＡに特異的に結合する能力がある結合部分と、共有結合された酵素とを含む、ステップと；
－ サンプルから非結合の第２リガンドを除去するステップと；
－ 結合された酵素による切断時に検出可能なシグナルを生成する、結合された酵素のための基質を添加するステップと；
－ 前記シグナルを検出するステップと
を含む検出方法を通して実施される。
いくつかの実施形態では、前記第２リガンドは、合成された標識ＤＮＡに特異的に結合する抗体であって、それに共有結合された酵素、例えばアルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼを有する抗体である。こうした共有結合された酵素は、基質に対して作用して、比色分析、蛍光、化学発光又は電気化学シグナルを生成し得る。いくつかの実施形態では、酵素は、アルカリホスファターゼである。いくつかの実施形態では、基質に対して作用する酵素は、検出可能なシグナルとして化学発光シグナルを生成する。いくつかの好適な基質は、市販されており、例えばＡＭＰＰＤ（ＣＡＳ番号：１２２３４１－５６－４）及びThermoFisher Scientific製のDynaLight（商標）などの様々な商品名での既製の基質溶液が挙げられる。
いくつかの実施形態では、目的の分析物の検出は、定量検出である。これらの実施形態では、サンプル中の目的の分析物の量又は濃度は、検出された合成された標識ＤＮＡ鎖の量及び／又は検出されたシグナルの強度に基づいて定量される。例えば、実施例４及び図５に例示される通り、分析物の量と、生成されたシグナルとの間には、実質的に線形の関係が広い検出範囲にわたって認められる。シグナルレベルは、酵素活性の量及び重合反応時間などの他の要素によっても影響され得る。そのため、本発明に従うアッセイ方法は、実用上、既知の条件（分析物量の範囲、試薬濃度、反応体積、反応温度、反応時間など）下で較正アッセイを実行することによってセットアップし、一方での分析物の量／濃度と、他方での検出された合成された標識ＤＮＡ鎖の量及び／又は検出されたシグナルの強度との間の相関を所望の分析物の量／濃度の範囲内で確立することができる。次に、サンプルに本発明に従う方法を施すとき、こうした相関を用いて、サンプル中の目的の分析物の量又は濃度が定量される。
本発明に従う方法の一実施形態のステップの概要が図１に提示される。Ａ）分析物は、直接的又は間接的に固相に結合される。短いプライマーで標識された親和性リガンド、例えばｏｄＴ２２とコンジュゲートされた抗体は、固定化された分析物に結合される。インキュベーション後、非結合の親和性リガンドは、洗浄によって除去される。逆転写反応に必要とされる、プライマーと少なくとも部分的に相補的である鋳型、１つ又はいくつかの修飾ヌクレオチド三リン酸及びプライマーを除く他の緩衝液成分を含有する反応溶液が添加される。プライマーは、塩基対合によって鋳型と会合する。Ｂ）逆転写酵素活性を有する酵素は、プライマー鋳型複合体におけるプライマーの３’末端に付加され、結合する。Ｃ）酵素重合反応が開始される。プライマーが伸長されると、修飾塩基を含む新たなＤＮＡ鎖が形成される。新たなＤＮＡ鎖は、ＲＮＡ鋳型鎖との塩基対合状態を維持する。Ｄ）新たなＤＮＡ鎖に組み込まれた修飾デオキシリボヌクレオチド塩基は、例えば、フルオロフォアなどの検出可能な標識で標識されたか、又は比色分析、蛍光、化学発光若しくは電気化学シグナルを生成するための、基質を切断する酵素とコンジュゲートされた、修飾デオキシヌクレオチドに特異的な抗体を用いるいくつかの任意選択的な方法によって検出することができる。逆転写酵素反応により、鋳型スイッチング機構による複数の鋳型長さに及ぶＤＮＡ産物が生成され得る。
一態様では、本発明は、目的の分析物に特異的に結合する能力がある結合部分と、結合部分に結合された１８～４０ヌクレオチドの長さのオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーとを含む第１リガンド；オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーより長く、及びオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーと少なくとも部分的に相補的である配列を有するポリリボヌクレオチド鋳型、複数の標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸；及び逆転写酵素活性を有する酵素を含むパーツキットに関する。こうしたキットは、本発明に従う方法の実施で有用である。
実施例
材料
DynaLight（商標）化学発光ＡＰ基質、ThermoFisher
LuMate（登録商標）マイクロプレートルミノメーター、Awareness Technology, Inc
HydroFlex（商標）マイクロプレートウォッシャー、Tecan。
Nunc（商標）NucleoLink（商標）ストリップ、発光用に白色。ThermoFisher
高結合白色半面積マイクロプレートBio-One Greiner
１μｍｏｌスケールで合成されたＮＨ２－Ｃ６スペーサーアームを有するｏｄＴ１８、ｏｄＴ２２及びｏｄＴ３０（オリゴデオキシチミジン）、Eurofins。
Ａｂ２０１７９６ビオチン（タイプＢ）高速コンジュゲーションキット、ロットＧＲ３３５３８４４－１、Abcam。
SoluLink抗体－オリゴヌクレオチドのオールインワンコンジュゲーションキット、Abcam。
ストレプトアビジン－アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲート ThermoFisher
SuperSignal ELISA Picoルミノール／エンハンサー溶液及びSuperSignal ELISA Pico安定ペルオキシダーゼ溶液は、ThermoFisherから購入した
ストレプトアビジン－HRP N100 ThermoFisher。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質は、Rosendal et al 2020に従って調製した。２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質をコードするプラスミドは、以前に記載がなされている、Wrapp,D. et al.2020）。組換えスパイクタンパク質は、293Fシステム、Thermo Fisher Scientificを用いて生成された
タンパク質は、Ｈｉｓ－純粋なＮｉ－ＮＴＡ樹脂、Thermo Fisher Scientificが充填されたカラムを用いて精製された。
材料
DynaLight（商標）化学発光ＡＰ基質、ThermoFisher
LuMate（登録商標）マイクロプレートルミノメーター、Awareness Technology, Inc
HydroFlex（商標）マイクロプレートウォッシャー、Tecan。
Nunc（商標）NucleoLink（商標）ストリップ、発光用に白色。ThermoFisher
高結合白色半面積マイクロプレートBio-One Greiner
１μｍｏｌスケールで合成されたＮＨ２－Ｃ６スペーサーアームを有するｏｄＴ１８、ｏｄＴ２２及びｏｄＴ３０（オリゴデオキシチミジン）、Eurofins。
Ａｂ２０１７９６ビオチン（タイプＢ）高速コンジュゲーションキット、ロットＧＲ３３５３８４４－１、Abcam。
SoluLink抗体－オリゴヌクレオチドのオールインワンコンジュゲーションキット、Abcam。
ストレプトアビジン－アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲート ThermoFisher
SuperSignal ELISA Picoルミノール／エンハンサー溶液及びSuperSignal ELISA Pico安定ペルオキシダーゼ溶液は、ThermoFisherから購入した
ストレプトアビジン－HRP N100 ThermoFisher。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質は、Rosendal et al 2020に従って調製した。２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質をコードするプラスミドは、以前に記載がなされている、Wrapp,D. et al.2020）。組換えスパイクタンパク質は、293Fシステム、Thermo Fisher Scientificを用いて生成された
タンパク質は、Ｈｉｓ－純粋なＮｉ－ＮＴＡ樹脂、Thermo Fisher Scientificが充填されたカラムを用いて精製された。
ヒト血漿サンプル
血清学的アッセイのための抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検証パネルは、国立生物学的製剤研究所（ＮＩＢＳＣ）（Hertfordshire, UK）から得た。それは、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性であることが知られた２３のサンプル及び抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陰性であることが知られた１４のサンプルからなる。
血清学的アッセイのための抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検証パネルは、国立生物学的製剤研究所（ＮＩＢＳＣ）（Hertfordshire, UK）から得た。それは、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性であることが知られた２３のサンプル及び抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陰性であることが知られた１４のサンプルからなる。
抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫グロブリン（ヒト）のＷＨＯ国際標準品、ＮＩＢＳＣコード：２０／１３６は、同じソースから得た。
ポリメラーゼ：
組換えモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭｕＬＶ）逆転写酵素（ＲＴ）、New England BioLabs。
Weber&Grosse (1989)に従って調製されたＢＨ１０配列に基づく組換えヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１ ＲＴ。
クレノウＤＮＡポリメラーゼ、大断片、ThermoFisher
組換えヒトガンマポリメラーゼ（Ｐｏｌ－Ｇ）触媒サブユニット、BioSite。
ＢＳＴ３．０ ＤＮＡポリメラーゼ、New England BioLabs。
IsoPol SD+, ArticZymes, Tromsoe, Norway
組換えモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭｕＬＶ）逆転写酵素（ＲＴ）、New England BioLabs。
Weber&Grosse (1989)に従って調製されたＢＨ１０配列に基づく組換えヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１ ＲＴ。
クレノウＤＮＡポリメラーゼ、大断片、ThermoFisher
組換えヒトガンマポリメラーゼ（Ｐｏｌ－Ｇ）触媒サブユニット、BioSite。
ＢＳＴ３．０ ＤＮＡポリメラーゼ、New England BioLabs。
IsoPol SD+, ArticZymes, Tromsoe, Norway
抗体及び抗体製剤
アルカリホスファターゼ（ＡＰ）にコンジュゲートされたＢｕ２０マウスモノクローナルマウス抗ＢｒｄＵ抗体（コード０９１４３）は、Aglient/dako ABから購入した
AP805-055-180，Jackson Immuno Researchとコンジュゲートされたウシ抗ヤギＩｇＧ
ウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）A18905S, ThermoFisher
ウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）AS10 1499,Agrisera
ヤギ抗ヒトＩｇＧ A18813, ThermoFisher。
ヤギ抗ヒトＩｇＧ Star125, BioRad
ヒト血清からのＩｇＧ、試薬グレードＩ－２５１１、Sigma-Aldrich
マウスＩｇＧ、プロテインＡ精製A66185M-LY, Meridian Life Science。
ヤギＩｇＧ、精製AS10 875, Agrisera
一致ペアマウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質結合ｍａｂのDH6/Ad10は、Native Antigen Company,Oxford, UKから購入した
マウスＢｕ２０ａ－ビオチン（BioLegend 339810）
アルカリホスファターゼ（ＡＰ）にコンジュゲートされたＢｕ２０マウスモノクローナルマウス抗ＢｒｄＵ抗体（コード０９１４３）は、Aglient/dako ABから購入した
AP805-055-180，Jackson Immuno Researchとコンジュゲートされたウシ抗ヤギＩｇＧ
ウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）A18905S, ThermoFisher
ウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）AS10 1499,Agrisera
ヤギ抗ヒトＩｇＧ A18813, ThermoFisher。
ヤギ抗ヒトＩｇＧ Star125, BioRad
ヒト血清からのＩｇＧ、試薬グレードＩ－２５１１、Sigma-Aldrich
マウスＩｇＧ、プロテインＡ精製A66185M-LY, Meridian Life Science。
ヤギＩｇＧ、精製AS10 875, Agrisera
一致ペアマウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質結合ｍａｂのDH6/Ad10は、Native Antigen Company,Oxford, UKから購入した
マウスＢｕ２０ａ－ビオチン（BioLegend 339810）
使用された緩衝液：
炭酸塩緩衝液 ０．０５Ｍ、ｐＨ９．６
PBS-Tween：ＰＢＳ ｍｅｄ ０．０５％Tween20
ＨＩＶ ＲＴ反応溶液：１０ｍＭヘペス ｐＨ７．６、３２μＭ ＢｒｄＵＴＰ、ｐｒＡ １００μｇ／ｍｌ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭスペルミン、Synperonic A11、０．５％（ｖ／ｖ）、０．２ｍＭ ＥＧＴＡ及びＢＳＡ ０．５ｍｇ／ｍｌ。
ＩｄＵＴＰを有するＨＩＶ ＲＴ反応溶液：前記ＨＩＶ ＲＴ反応溶液として、３２μＭ ＢｒｄＵＴＰの代わりに３２μＭ ＢｒｄＵＴＰを有する。
ＭＭｕＬＶ ＲＴ反応溶液：１０ｍＭヘペス ｐＨ７．６、３２μＭ ＢｒｄＵＴＰ、ｐｒＡ １００μｇ／ｍｌ、６ｍＭ ＭｎＣｌ２、２４ｍＭスペルミジン、トリトンX100 ０．５％（ｖ／ｖ）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、４ｍＭグルタチオン及びＢＳＡ ０．５ｍｇ／ｍｌ
Ｐｏｌ－Ｇ反応溶液：ｐＨ８．０の２５ｍＭヘペス、３２μＭ ＢｒｄＵＴＰ、ｐｒＡ １００μｇ／ｍｌ、０．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭジチオエリトリトールｌ及びＢＳＡ ０．６６ｍｇ／ｍｌ。
ＢＳＴ３．０ ＤＮＡポリメラーゼ反応溶液：２５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．８、３２μＭ ＢｒｄＵＴＰ、ｐｒＡ １００μｇ／ｍｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）Tween20。
プレート洗浄緩衝液：３ｍＭホウ酸、０．７５％トリトンX100、０．００５％（Ｗ／Ｖ）デキストラン硫酸塩、０．２％ＥＴＯＨ及び０．０２５％ＮａＮ３。
ブロッキング緩衝液：０．０５％Tweenを有するＰＢＳ中、１％脱脂粉乳
ＰＯＬＩ反応溶液：ｐＨ８．０の２５ｍＭヘペス、０．６７ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭスペルミジン、２８μｇ／ｍｌ ＰｒＡ及び５０μＭ ＢｒｄＵＴＰ。
Blotto bulk：脱脂粉乳２５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．０のビストリス２５ｍＭ、Ｋ２ＳＯ４ １０ｍＭ、スペルミジン１．０ｍＭ、デキストラン硫酸塩１．０１ｍｇ／ｍｌ、Tween20 ０．０．０１０％、ジチオエリトリトール２．０ｍＭ
炭酸塩緩衝液 ０．０５Ｍ、ｐＨ９．６
PBS-Tween：ＰＢＳ ｍｅｄ ０．０５％Tween20
ＨＩＶ ＲＴ反応溶液：１０ｍＭヘペス ｐＨ７．６、３２μＭ ＢｒｄＵＴＰ、ｐｒＡ １００μｇ／ｍｌ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭスペルミン、Synperonic A11、０．５％（ｖ／ｖ）、０．２ｍＭ ＥＧＴＡ及びＢＳＡ ０．５ｍｇ／ｍｌ。
ＩｄＵＴＰを有するＨＩＶ ＲＴ反応溶液：前記ＨＩＶ ＲＴ反応溶液として、３２μＭ ＢｒｄＵＴＰの代わりに３２μＭ ＢｒｄＵＴＰを有する。
ＭＭｕＬＶ ＲＴ反応溶液：１０ｍＭヘペス ｐＨ７．６、３２μＭ ＢｒｄＵＴＰ、ｐｒＡ １００μｇ／ｍｌ、６ｍＭ ＭｎＣｌ２、２４ｍＭスペルミジン、トリトンX100 ０．５％（ｖ／ｖ）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、４ｍＭグルタチオン及びＢＳＡ ０．５ｍｇ／ｍｌ
Ｐｏｌ－Ｇ反応溶液：ｐＨ８．０の２５ｍＭヘペス、３２μＭ ＢｒｄＵＴＰ、ｐｒＡ １００μｇ／ｍｌ、０．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭジチオエリトリトールｌ及びＢＳＡ ０．６６ｍｇ／ｍｌ。
ＢＳＴ３．０ ＤＮＡポリメラーゼ反応溶液：２５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．８、３２μＭ ＢｒｄＵＴＰ、ｐｒＡ １００μｇ／ｍｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）Tween20。
プレート洗浄緩衝液：３ｍＭホウ酸、０．７５％トリトンX100、０．００５％（Ｗ／Ｖ）デキストラン硫酸塩、０．２％ＥＴＯＨ及び０．０２５％ＮａＮ３。
ブロッキング緩衝液：０．０５％Tweenを有するＰＢＳ中、１％脱脂粉乳
ＰＯＬＩ反応溶液：ｐＨ８．０の２５ｍＭヘペス、０．６７ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭスペルミジン、２８μｇ／ｍｌ ＰｒＡ及び５０μＭ ＢｒｄＵＴＰ。
Blotto bulk：脱脂粉乳２５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．０のビストリス２５ｍＭ、Ｋ２ＳＯ４ １０ｍＭ、スペルミジン１．０ｍＭ、デキストラン硫酸塩１．０１ｍｇ／ｍｌ、Tween20 ０．０．０１０％、ジチオエリトリトール２．０ｍＭ
方法
ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体からのマウスＩｇＧ交差反応物質の除去
マウスＩｇＧをＮＨＳ－アガロース（GE Healthcare）と製造業者の説明書に従って結合させ、ゲルを２ｍｌのカラムに充填し、ＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳ中のウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）Agrisera AS10 1499（７５μｇ／ｍｌ）をカラムに充填し、フロースルーを収集し、４℃で貯蔵した。
ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体からのマウスＩｇＧ交差反応物質の除去
マウスＩｇＧをＮＨＳ－アガロース（GE Healthcare）と製造業者の説明書に従って結合させ、ゲルを２ｍｌのカラムに充填し、ＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳ中のウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）Agrisera AS10 1499（７５μｇ／ｍｌ）をカラムに充填し、フロースルーを収集し、４℃で貯蔵した。
ヤギ及びウサギ抗ヒトＩｇＧのビオチンによる標識
抗ヒトＩｇＧを、Ab201796ビオチン（タイプＢ）高速コンジュゲーションキット、ロットGR3353844-1を製造業者の説明書に従って使用してビオチンで標識した。
抗ヒトＩｇＧを、Ab201796ビオチン（タイプＢ）高速コンジュゲーションキット、ロットGR3353844-1を製造業者の説明書に従って使用してビオチンで標識した。
ヤギ及びウサギ抗ヒトＩｇＧのｏｄＴ２２又はｏｄＴ３０による標識。
ｏｄＴ２２による標識を、SoluLink抗体－オリゴヌクレオチドのオールインワンコンジュゲーションキット、Cat.No.A-9202-001を製造業者の説明書に従って使用して実施した。０．５μモルのＮＨ２－Ｃ６－ｏｄＴ２２をホルミルベンズアミドによる標識のために使用した。１００μｌ（約５５μｇ）の親和性精製ウサギ抗ヒトＩｇＧのAgrisera ＡＳ１０ １４９９をヒドラジノニコチンアミドで標識した。次に、２種の修飾生体分子を、反応触媒（アニリン）の存在下で一緒に混合し、ｏｄＴ２２－ＩｇＧコンジュゲートを形成し、最終的に磁気親和性固相を用いて精製した。ｏｄＴ２２標識ＩｇＧの実際の収量は、１４μｇ（６７μｇ／ｍｌで２００μＬ）であった。
ｏｄＴ２２による標識を、SoluLink抗体－オリゴヌクレオチドのオールインワンコンジュゲーションキット、Cat.No.A-9202-001を製造業者の説明書に従って使用して実施した。０．５μモルのＮＨ２－Ｃ６－ｏｄＴ２２をホルミルベンズアミドによる標識のために使用した。１００μｌ（約５５μｇ）の親和性精製ウサギ抗ヒトＩｇＧのAgrisera ＡＳ１０ １４９９をヒドラジノニコチンアミドで標識した。次に、２種の修飾生体分子を、反応触媒（アニリン）の存在下で一緒に混合し、ｏｄＴ２２－ＩｇＧコンジュゲートを形成し、最終的に磁気親和性固相を用いて精製した。ｏｄＴ２２標識ＩｇＧの実際の収量は、１４μｇ（６７μｇ／ｍｌで２００μＬ）であった。
ｏｄＴ３０による標識を、改良プロトコルを用いて行った。０．５μモルのＮＨ２－Ｃ６－ｏｄＴ３０を、１００μｇの親和性精製ウサギ抗ヒトＩｇＧのAgrisera AS10 1499を標識するために使用した。収量は、ｏｄＴ３０標識ＩｇＧの２２μｇ（１１０μｇ／ｍｌで２００μＬ）であった。
Ad10マウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ｍａｂのｏｄＴ３０での標識。
Ad10のｏｄＴ３０による標識を、ウサギ抗ヒトＩｇＧの場合と類似するプロトコルを用いて行った。０．１２５μモルのＮＨ２－Ｃ６－ｏｄＴ３０を、１００μｇの親和性精製Ad10マウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ｍａｂを標識するために使用した。収量は、ｏｄＴ３０標識ＩｇＧの６０μｇ（３００μｇ／ｍｌで２００μＬ）であった。
Ad10のｏｄＴ３０による標識を、ウサギ抗ヒトＩｇＧの場合と類似するプロトコルを用いて行った。０．１２５μモルのＮＨ２－Ｃ６－ｏｄＴ３０を、１００μｇの親和性精製Ad10マウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ｍａｂを標識するために使用した。収量は、ｏｄＴ３０標識ＩｇＧの６０μｇ（３００μｇ／ｍｌで２００μＬ）であった。
ｏｄＴ１８、ｏｄＴ２２及びｏｄＴ３０のビオチンによる標識。
ＮＨ２－Ｃ６スペーサーアームを有するｏｄＴ１８、ｏｄＴ２２及びｏｄＴ３０（オリゴデオキシチミジン）を、Ab201796ビオチン（タイプＢ）高速コンジュゲーションキット、ロットGR3353844-1を製造業者の説明書に従って使用してビオチンで標識した。
ＮＨ２－Ｃ６スペーサーアームを有するｏｄＴ１８、ｏｄＴ２２及びｏｄＴ３０（オリゴデオキシチミジン）を、Ab201796ビオチン（タイプＢ）高速コンジュゲーションキット、ロットGR3353844-1を製造業者の説明書に従って使用してビオチンで標識した。
実施例１ 基本的なポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅モデル。
本実施例は、本発明に従う方法の、分析物を検出及び定量する能力について例示する。抗体又は他のタイプの親和性リガンドに結合されたオリゴヌクレオチドプライマーは、以下の実施例において、分析物検出のための標識として使用する。それら標的への結合後、親和性リガンドに結合されたオリゴヌクレオチドは、可溶性の相補的鋳型を伴い、標識ヌクレオチドを用いる１ステップポリメラーゼ反応におけるプライマーとして役立ち得る。次に、そのように合成されたＤＮＡ鎖を、組み込まれた標識を用いて検出する。
本実施例は、本発明に従う方法の、分析物を検出及び定量する能力について例示する。抗体又は他のタイプの親和性リガンドに結合されたオリゴヌクレオチドプライマーは、以下の実施例において、分析物検出のための標識として使用する。それら標的への結合後、親和性リガンドに結合されたオリゴヌクレオチドは、可溶性の相補的鋳型を伴い、標識ヌクレオチドを用いる１ステップポリメラーゼ反応におけるプライマーとして役立ち得る。次に、そのように合成されたＤＮＡ鎖を、組み込まれた標識を用いて検出する。
本発明の概念を例示するため、ストレプトアビジンをモデル分析物として使用する。分析物に特異的に結合する能力がある第１リガンドは、分析物に特異的に結合する能力がある部分としてのビオチン及びオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーとしてのｏｄＴ２２からなる。ポリリボヌクレオチド鋳型は、ｐｒＡである。標識デオキシリボヌクレオチドは、ブロモ－デオキシ－ウリジン－トリ－リン酸（ＢｒｄＵＴＰ）である。逆転写酵素活性を有する酵素は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭｕＬＶ）逆転写酵素である。標識ＤＮＡ鎖に特異的に結合する能力がある第２リガンドは、抗体部分（抗ＢｒｄＵ特異性を有するモノクローナルマウス抗体）及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ）酵素からなるコンジュゲートである。
ビオチン化ｏｄＴ２２の白色Nunc（商標）NucleoLink（商標）ストリッププレートへの固定化
９６ウェルフレーム内に載せた白色NucleoLink（商標）ストリップをｐＨ９．６の炭酸塩緩衝液中の１２０μｌ／ウェルの２００ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジンでコーティングした。非結合のストレプトアビジンを、Hydroflexプレートウォッシャー及びプレート洗浄緩衝液を使用する入念な洗浄手順によって除去した。
９６ウェルフレーム内に載せた白色NucleoLink（商標）ストリップをｐＨ９．６の炭酸塩緩衝液中の１２０μｌ／ウェルの２００ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジンでコーティングした。非結合のストレプトアビジンを、Hydroflexプレートウォッシャー及びプレート洗浄緩衝液を使用する入念な洗浄手順によって除去した。
次のステップでは、プレート上のウェルに１２０μｌの５倍系列のビオチン－ｏｄＴ２２希釈物を１．７×１０－１６～１．０×１０－２０モル／ウェルの範囲で添加し、結合させておき、その後、プレートを再び洗浄した。
結合されたｏｄＴ２２の検出。
結合されたｏｄＴは、ポリメラーゼ反応におけるプライマーとして作用し得る。プライマー検出のために用いられる酵素的重合プロセスは、逆転写酵素（ＲＴ）反応であり、それにより、酵素は、新たなＤＮＡ鎖を構築する。これを行うため、それには、複製するためのＲＮＡ鋳型、伸長を開始する起点の短い相補的ＤＮＡ鎖（プライマー）及び成長鎖のための構成要素として使用可能である相補的デオキシヌクレオチド三リン酸が必要である。反応は、本実施例において、結合されたビオチン－ｏｄＴ２２の段階希釈物を伴う９６ウェルプレート（ウェル体積３００μｌ）内で実施され、ｏｄＴ２２は、重合プロセスにおけるプライマーとして役立つ。
結合されたｏｄＴは、ポリメラーゼ反応におけるプライマーとして作用し得る。プライマー検出のために用いられる酵素的重合プロセスは、逆転写酵素（ＲＴ）反応であり、それにより、酵素は、新たなＤＮＡ鎖を構築する。これを行うため、それには、複製するためのＲＮＡ鋳型、伸長を開始する起点の短い相補的ＤＮＡ鎖（プライマー）及び成長鎖のための構成要素として使用可能である相補的デオキシヌクレオチド三リン酸が必要である。反応は、本実施例において、結合されたビオチン－ｏｄＴ２２の段階希釈物を伴う９６ウェルプレート（ウェル体積３００μｌ）内で実施され、ｏｄＴ２２は、重合プロセスにおけるプライマーとして役立つ。
ｏｄＴプライマーに相補的な鋳型は、ｐｒＡ、すなわち約５００ヌクレオチドの平均鎖長を有し、及びＲＴ反応溶液中に含まれる、１つのヌクレオチド塩基アデニンのみからなる一本鎖ポリリボアデニル酸である。
ＲＴ反応に必要な他の成分は、ＢｒｄＵＴＰ（ブロモ－デオキシ－ウリジン－トリ－リン酸）を含有するＭＭｕｌｖ ＲＴ反応混合物の一部でもある。ＢｒｄＵＴＰは、重合を実行する酵素の組換えＭ－Ｍｕｌｖ ＲＴによってプライマーに付加されるヌクレオチド塩基を提供する。
ポリメラーゼ反応
ポリメラーゼ反応は、９．１Ｕ／ウェルのＭＭｕＬＶ ＲＴのプレート上の各ウェルへの添加によって開始され、新規に生成されたＢｒｄＵ鎖の相対量は、ウェル内に固定化されたｏｄＴ２２プライマーの量に比例することになる。
ポリメラーゼ反応は、９．１Ｕ／ウェルのＭＭｕＬＶ ＲＴのプレート上の各ウェルへの添加によって開始され、新規に生成されたＢｒｄＵ鎖の相対量は、ウェル内に固定化されたｏｄＴ２２プライマーの量に比例することになる。
ポリメラーゼ反応は、温度依存性であり、反応速度は、酵素機能が変性によって損なわれるまで温度上昇とともに増加する。そのため、マイクロタイタープレートは、１時間のインキュベーション中に３７℃の一定の温度を提供するための加熱ブロック上に置き、さらに蓋によってカバーし、蒸発を防止する。インキュベーション温度及び反応における時間（インキュベーション時間）の両方は、制御される要素である。この系における検出感度は、各ウェルに添加されるポリメラーゼの量及び反応時間の両方の関数である。
ポリメラーゼ反応は、１時間後、ＲＴ反応溶液を除去することによって停止する。これは、Hydroflexプレートウォッシャー、それに続く徹底洗浄手順を用いることによって実施する。使用する「プレート洗浄緩衝液」は、特定の成分、例えば洗浄の効率を高めるための洗剤（材料を参照されたい）を含有する。
コンジュゲート結合
反応溶液を洗い流した後、抗体－酵素コンジュゲート溶液を添加する。コンジュゲートの抗体部分は、抗ＢｒｄＵ特異性を有するモノクローナルマウス抗体であり、コンジュゲート酵素は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）である。コンジュゲート結合反応は、温度依存性でもあり、そのため、マイクロタイタープレートは、３７℃で３０分のインキュベーション中、加熱ブロック上に再び配置する。
反応溶液を洗い流した後、抗体－酵素コンジュゲート溶液を添加する。コンジュゲートの抗体部分は、抗ＢｒｄＵ特異性を有するモノクローナルマウス抗体であり、コンジュゲート酵素は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）である。コンジュゲート結合反応は、温度依存性でもあり、そのため、マイクロタイタープレートは、３７℃で３０分のインキュベーション中、加熱ブロック上に再び配置する。
コンジュゲート結合ステップを、Hydroflexプレートウォッシャーを使用して入念な洗浄手順によって終了させ、コンジュゲート溶液及び非特異的に結合されたコンジュゲートを除去することで、ＢｒｄＵに結合されたコンジュゲートのみが残る。洗浄温度の増加（３０～３５℃）は、良好な洗浄結果にとって有利である。洗浄溶液は、以前の洗浄の場合と同じである。
基質反応
最終反応では、DynaLight（商標）化学発光アルカリホスファターゼ（ＡＰ）基質（ThermoFisher Scientific）を含有する溶液をウェルに添加する。この基質は、コンジュゲートのＡＰ酵素部分が基質構造を修飾すると光を生成する。プロセスのこの段階では、化学反応は、ＡＰを含有し得る大気粉塵粒子によって影響され得る。したがって、基質の添加後、マイクロタイタープレートを粉塵からそれが保護されるLumateマイクロプレートルミノメーターの読み取りチャンバー内に直接的に移す。安定な光シグナルを得るための１０分の短い「遅滞期」後、光強度をルミノメーターによって測定する。
最終反応では、DynaLight（商標）化学発光アルカリホスファターゼ（ＡＰ）基質（ThermoFisher Scientific）を含有する溶液をウェルに添加する。この基質は、コンジュゲートのＡＰ酵素部分が基質構造を修飾すると光を生成する。プロセスのこの段階では、化学反応は、ＡＰを含有し得る大気粉塵粒子によって影響され得る。したがって、基質の添加後、マイクロタイタープレートを粉塵からそれが保護されるLumateマイクロプレートルミノメーターの読み取りチャンバー内に直接的に移す。安定な光シグナルを得るための１０分の短い「遅滞期」後、光強度をルミノメーターによって測定する。
ＡＰ酵素プロセスによって生成される光の強度は、抗ＢｒｄＵ抗体部分の合成されたＢｒｄＵ鎖への結合を介してウェルに結合された複合酵素の量に比例する。次いで、組み込まれたＢｒｄＵの量は、ウェル内に存在したｏｄＴプライマーの量に比例する。
図２は、ポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅で生成されたシグナルと、１ウェルあたりのｏｄＴ２２プライマーの量との間の関係を示す。図から抽出できるように、１ウェルあたり１×１０－２０モルに減少したｏｄＴ量を検出し、１ウェルあたりのｏｄＴの量と、１ウェルあたり１×１０－２０～２×１０－１６モルのｏｄＴの範囲で生成されたシグナルとの間に線形関係が認められた。すなわち、約２００００倍の検出範囲である。
実施例２ プライマー長と、ポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅モデルで生成されたシグナルとの間の関係。
オリゴヌクレオチドプライマーがポリメラーゼにおけるプライマーとして機能する能力は、プライマー特性及び反応条件に依存して変動する。１つの決定的因子は、プライマー長である。短いプライマーは、初期にはそれらの鋳型と弱く会合され、初期ポリメラーゼ反応速度は、伸長されたプライマーが決定的長さに達するまで低い。プライマー長の増加は、初期反応速度の増加を引き起こすことになる。特定の長さを超えると、温度及び条件に応じて、プライマーは、鋳型と常に会合されることになる。鋳型長さのさらなる増加は、反応速度に影響することはない。
オリゴヌクレオチドプライマーがポリメラーゼにおけるプライマーとして機能する能力は、プライマー特性及び反応条件に依存して変動する。１つの決定的因子は、プライマー長である。短いプライマーは、初期にはそれらの鋳型と弱く会合され、初期ポリメラーゼ反応速度は、伸長されたプライマーが決定的長さに達するまで低い。プライマー長の増加は、初期反応速度の増加を引き起こすことになる。特定の長さを超えると、温度及び条件に応じて、プライマーは、鋳型と常に会合されることになる。鋳型長さのさらなる増加は、反応速度に影響することはない。
これは、ポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅におけるプライマーにおけるオリゴヌクレオチドプライマーの設計に対する影響を有する。本実施例は、プライマー長と、生成されたシグナルとの間の関係を例示する。
白色Nunc（商標）NucleoLink（商標）ストリッププレートでのビオチン化ｏｄＴ１８、ｏｄＴ２２及びｏｄＴ３０の固定化
９６ウェルフレーム内に載せた白色NucleoLink（商標）ストリップをｐＨ９．６の炭酸塩緩衝液中の１２０μｌ／ウェルの２００ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジンでコーティングした。非結合のストレプトアビジンを、Hydroflexプレートウォッシャー及びプレート洗浄緩衝液を使用する入念な洗浄手順によって除去した。次のステップでは、ビオチン－ｏｄＴ１８、－ｏｄＴ２２及び－ｏｄＴ３０の指定の段階希釈物１２０μｌをプレート上のそれらの個別のウェルセットにそれぞれ添加し、結合させておき、その後、プレートを再び洗浄した。
９６ウェルフレーム内に載せた白色NucleoLink（商標）ストリップをｐＨ９．６の炭酸塩緩衝液中の１２０μｌ／ウェルの２００ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジンでコーティングした。非結合のストレプトアビジンを、Hydroflexプレートウォッシャー及びプレート洗浄緩衝液を使用する入念な洗浄手順によって除去した。次のステップでは、ビオチン－ｏｄＴ１８、－ｏｄＴ２２及び－ｏｄＴ３０の指定の段階希釈物１２０μｌをプレート上のそれらの個別のウェルセットにそれぞれ添加し、結合させておき、その後、プレートを再び洗浄した。
ポリメラーゼ反応
結合されたｏｄＴポリマーは、ポリメラーゼ反応におけるプライマーとして作用する。使用したＨＩＶ反応溶液は、反応に必須であるプライマーを除く全てを含有し、上記の材料セクションに記載する。ポリメラーゼ反応は、８０ｐｇのＨＩＶ ＲＴのプレート上の各ウェルへの添加によって開始され、３７℃で３０分間進行させておく。新規に生成されたＢｒｄＵ鎖の相対量は、ＲＴ反応を開始及び支持するための実際のプライマータイプの効率及び濃度を反映することになる。
結合されたｏｄＴポリマーは、ポリメラーゼ反応におけるプライマーとして作用する。使用したＨＩＶ反応溶液は、反応に必須であるプライマーを除く全てを含有し、上記の材料セクションに記載する。ポリメラーゼ反応は、８０ｐｇのＨＩＶ ＲＴのプレート上の各ウェルへの添加によって開始され、３７℃で３０分間進行させておく。新規に生成されたＢｒｄＵ鎖の相対量は、ＲＴ反応を開始及び支持するための実際のプライマータイプの効率及び濃度を反映することになる。
新規に生成されたＢｒｄＵ鎖は、実施例１のコンジュゲート結合及び基質反応セクションで概説した通り、ＡＰコンジュゲートマウスＢｕ２０のＭＡｂを用いて定量することができる。
図３は、生成されたシグナルと、１ウェルあたりの指定の各プライマーの量との間の関係を示す。３つ全てのプライマータイプがＲＴ反応を開始することができた。生じた最高のシグナルは、ｏｄＴ３０、その直後のｏｄＴ２２によって生成された一方、ｏｄＴ１８は、有意により低いシグナルを生成した。ｏｄＴ２２及びｏｄＴ３０プライマー間の小さい差異は、それらの長さが最適に近いことを示す。現在の反応条件下において、ほぼ８×１０－１９モルのｏｄＴ３０は、１０００ＲＬＵのシグナルを生成するのに十分であった一方、ｏｄＴ１８は、同一シグナルを生成するのに約１００倍より多く必要であった。
実施例３．ポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅ステップにおける真核生物、ウイルス及び細菌ポリメラーゼの使用。
異なるポリメラーゼは、プライマー－鋳型組成物に対して異なる優先度を有する。逆転写酵素では、インビボでＲＮＡ及びＤＮＡ鋳型の両方が使用される。一部のＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型に厳密に依存する一方、それ以外は、ＲＮＡ鋳型との重合活性を過剰に示し得るか又は換言すれば逆転写酵素として作用し得る。逆転写酵素活性がインビボでの役割を果たすか又はそれが単なるインビトロでの現象であるかは、明確ではない。本発明では、ポリメラーゼを使用して、分析物の検出から得ることができるシグナルを増強する。このため、例えば、サンプルからの汚染物質に対する抵抗性、処理能力、反応速度、いくつかの鋳型に及んで転写物を作成する能力（鋳型スイッチング）及び種々のインキュベーション時間にわたる安定性に関連した異なる特性を有するポリメラーゼの中で選択できることは、有利である。これは、特定の分析物に対する特定のアッセイの要件に対する、ポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅ステップについての条件を採用するためのより多くの自由度を提供することになる。
異なるポリメラーゼは、プライマー－鋳型組成物に対して異なる優先度を有する。逆転写酵素では、インビボでＲＮＡ及びＤＮＡ鋳型の両方が使用される。一部のＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型に厳密に依存する一方、それ以外は、ＲＮＡ鋳型との重合活性を過剰に示し得るか又は換言すれば逆転写酵素として作用し得る。逆転写酵素活性がインビボでの役割を果たすか又はそれが単なるインビトロでの現象であるかは、明確ではない。本発明では、ポリメラーゼを使用して、分析物の検出から得ることができるシグナルを増強する。このため、例えば、サンプルからの汚染物質に対する抵抗性、処理能力、反応速度、いくつかの鋳型に及んで転写物を作成する能力（鋳型スイッチング）及び種々のインキュベーション時間にわたる安定性に関連した異なる特性を有するポリメラーゼの中で選択できることは、有利である。これは、特定の分析物に対する特定のアッセイの要件に対する、ポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅ステップについての条件を採用するためのより多くの自由度を提供することになる。
本発明では、ポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅ステップでは、小さいオリゴヌクレオチドプライマー標識抗体又は親和性リガンドを使用する。相補的鋳型は、反応溶液中に遊離する。いくつかの鋳型に及ぶ転写物を作成する能力は、有利である。得られるシグナルは、使用される酵素の量とともに変化する。類似の優先度を有するポリメラーゼは、互換可能である。より遅い反応速度は、より大量の酵素量の使用によって補償することができる。本実施例は、哺乳類ポリメラーゼガンマ（ＰｏｌＧ）、ＨＩＶ逆転写酵素、大腸菌（E. coli）ｐｏｌ Ｉ ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片又は別の細菌ポリメラーゼＢｓｔ３．０のいずれかが、分析物としてヒトＩｇＧを用いる免疫測定法におけるポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅ステップで使用できることを例示する。
ヒトＩｇＧのための免疫測定法の設計
９６ウェルフレーム内に載せた白色NucleoLink（商標）ストリップを、ＰＢＳで１００ｎｇ／ｍｌに希釈された１２０μｌ／ウェルのヒトＩｇＧでコーティングした。非結合のＩｇＧを、Hydroflexプレートウォッシャーを使用するプレート洗浄緩衝液による入念な洗浄によって除去した。次のステップでは、１２０μｌのビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧを様々な希釈物で添加し、結合させておき、その後、プレートを再び洗浄した。
９６ウェルフレーム内に載せた白色NucleoLink（商標）ストリップを、ＰＢＳで１００ｎｇ／ｍｌに希釈された１２０μｌ／ウェルのヒトＩｇＧでコーティングした。非結合のＩｇＧを、Hydroflexプレートウォッシャーを使用するプレート洗浄緩衝液による入念な洗浄によって除去した。次のステップでは、１２０μｌのビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧを様々な希釈物で添加し、結合させておき、その後、プレートを再び洗浄した。
次に、１０ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジンからなる混合物３０μｌ及び対応するモル量の半分のビオチン－ｏｄＴ２２を添加した。短期間のインキュベーション後、プレートを再び洗浄した。
ここで、プレートの各ウェルは、３つの層を含有する：最初に分析物であるヒトＩｇＧの層、ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧであるリガンドの段階希釈物を有する第２層及びｏｄＴ２２プライマーが結合されたストレプトアビジンの第３層。結合されたｏｄＴ２２プライマーの量は、分析物の量に依存する結合されたリガンドの量に比例する。ポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅ステップを適用することにより、ウェル内の分析物の量は、ここで、本発明に従って検出することができる。
ポリメラーゼ反応
ＨＩＶ ＲＴ及びクレノウＤＮＡポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅を意図したウェルのセットは、一定分量３０μｌのＨＩＶ ＲＴ反応溶液を受けた一方、ｐｏｌ Ｇ及びＢｓｔ３．０ポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅を意図した対応するセットは、一定分量３０μｌのそれらの各反応溶液を受けた。各反応溶液は、ポリメラーゼ反応に必要とされる、ｏｄＴプライマーを除く全ての成分を含有した。ポリメラーゼ反応は、各ウェルセットへの一定分量１００μｌの酵素の添加によって開始させた。ＨＩＶ ＲＴ及びクレノウＤＮＡポリメラーゼ酵素を希釈することでほぼ同じ酵素活性を得ていた。８Ｕ／ｍｌのクレノウ断片は、８００ｐｇ／ｍｌの組換えＨＩＶ ＲＴの場合に対応する活性を有した。ｐｏｌ Ｇ溶液は、１ｍｌあたり２．４μｇの酵素、０．１６Ｕ／ｍｌのＢｓｔ３．０ポリメラーゼを含有した。ポリメラーゼ反応は、３７℃で３０分間進行させておいた。
ＨＩＶ ＲＴ及びクレノウＤＮＡポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅を意図したウェルのセットは、一定分量３０μｌのＨＩＶ ＲＴ反応溶液を受けた一方、ｐｏｌ Ｇ及びＢｓｔ３．０ポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅を意図した対応するセットは、一定分量３０μｌのそれらの各反応溶液を受けた。各反応溶液は、ポリメラーゼ反応に必要とされる、ｏｄＴプライマーを除く全ての成分を含有した。ポリメラーゼ反応は、各ウェルセットへの一定分量１００μｌの酵素の添加によって開始させた。ＨＩＶ ＲＴ及びクレノウＤＮＡポリメラーゼ酵素を希釈することでほぼ同じ酵素活性を得ていた。８Ｕ／ｍｌのクレノウ断片は、８００ｐｇ／ｍｌの組換えＨＩＶ ＲＴの場合に対応する活性を有した。ｐｏｌ Ｇ溶液は、１ｍｌあたり２．４μｇの酵素、０．１６Ｕ／ｍｌのＢｓｔ３．０ポリメラーゼを含有した。ポリメラーゼ反応は、３７℃で３０分間進行させておいた。
ポリメラーゼ反応は、Hydroflexプレートウォッシャー、それに続く徹底洗浄手順を用いてＲＴ反応溶液を除去することによって停止させた。コンジュゲート結合及び基質添加は、実施例１に記載のように実施した。
図４は、４種のポリメラーゼのそれぞれにより生成されたシグナルと、アッセイに添加されたビオチン化リガンドの量との間の関係を示す。
４種全ての酵素は、ポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅に有用であることが判明した。ＨＩＶ及びクレノウポリメラーゼを希釈することで、使用された条件中に類似量の酵素活性を得ていた。図から推定できるように、２種の酵素は、実際上、同一の抗ヒトＩｇＧ滴定特性をもたらした。シグナルは、全てのＩｇＧ濃度において、より高い酵素入力の使用に起因して、ｐｏｌ Ｇ又はＢｓｔ３．０ポリメラーゼでの対応するシグナルより高かった。最高ＩｇＧ濃度でのＨＩＶ ＲＴ、クレノウ断片及びＢｓｔポリメラーゼによって生成されたシグナルは、プレートリーダーの読み取り範囲を上回り、したがって線形性から逸脱したことに注目されたい。実施例５も参照されたい。
使用したｐｏｌ Ｇポリメラーゼ量では、より低いシグナルが得られ、全濃度範囲にわたって線形性が維持された。
実施例４ ポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅ステップによって生成されたシグナルと、アッセイにおける分析物及びプライマー標識リガンドの量との間の関係
多くの古典的な免疫測定法は、規定の抗原に結合された免疫グロブリンの量を定量するように設計される。本発明の検出感度は、プライマー標識抗体又は親和性リガンドの量、プライマー長、使用されるポリメラーゼの量及びタイプ、ポリメラーゼ反応条件及び反応時間などのいくつかの要素及び最後に反応中に生成された標識ＤＮＡの定量化のために使用されるシステムの関数である。
多くの古典的な免疫測定法は、規定の抗原に結合された免疫グロブリンの量を定量するように設計される。本発明の検出感度は、プライマー標識抗体又は親和性リガンドの量、プライマー長、使用されるポリメラーゼの量及びタイプ、ポリメラーゼ反応条件及び反応時間などのいくつかの要素及び最後に反応中に生成された標識ＤＮＡの定量化のために使用されるシステムの関数である。
ヒトＩｇＧについての免疫測定法の設計
９６ウェルフレーム内に載せた白色NucleoLink（商標）ストリップを、ＰＢＳで希釈された１２０μｌ／ウェルのヒトＩｇＧの指定の段階希釈物でコーティングした。非結合のＩｇＧを、Hydroflexプレートウォッシャーを使用するプレート洗浄緩衝液による入念な洗浄によって除去した。次のステップでは、２５、６．２５又は１．５６ｎｇのいずれかのｏｄＴ２２コンジュゲートウサギ抗ヒトＩｇＧを含有する１２０μｌを添加し、３０分間結合させておき、その後、プレートを再び洗浄した。
９６ウェルフレーム内に載せた白色NucleoLink（商標）ストリップを、ＰＢＳで希釈された１２０μｌ／ウェルのヒトＩｇＧの指定の段階希釈物でコーティングした。非結合のＩｇＧを、Hydroflexプレートウォッシャーを使用するプレート洗浄緩衝液による入念な洗浄によって除去した。次のステップでは、２５、６．２５又は１．５６ｎｇのいずれかのｏｄＴ２２コンジュゲートウサギ抗ヒトＩｇＧを含有する１２０μｌを添加し、３０分間結合させておき、その後、プレートを再び洗浄した。
ここで、プレートの各ウェルは、２つの層を含有する：最初に分析物である段階希釈されたヒトＩｇＧの層及びｏｄＴ２２コンジュゲートウサギ抗ヒトＩｇＧであるリガンドの３つの希釈物を有する第２層。結合されたｏｄＴ２２プライマーの量は、分析物の量に依存する結合されたリガンドの量に比例する。ポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅ステップを適用することにより、ウェル内の分析物の量は、ここで、本発明に従って検出及び定量することができる。
ポリメラーゼ反応
ポリメラーゼ反応におけるｏｄＴプライマーを除く全ての成分を含有する３０μｌのＨＩＶ ＲＴ反応溶液をプレート上の各ウェルに添加した。次に、ポリメラーゼ反応を８００ｐｇ／ｍｌの１２０μｌの組換えＨＩＶ １ ＲＴの添加によって開始させた。ポリメラーゼ反応は、３７℃で４５分間進行させておいた。
ポリメラーゼ反応におけるｏｄＴプライマーを除く全ての成分を含有する３０μｌのＨＩＶ ＲＴ反応溶液をプレート上の各ウェルに添加した。次に、ポリメラーゼ反応を８００ｐｇ／ｍｌの１２０μｌの組換えＨＩＶ １ ＲＴの添加によって開始させた。ポリメラーゼ反応は、３７℃で４５分間進行させておいた。
ポリメラーゼ反応は、Hydroflexプレートウォッシャー、それに続く徹底洗浄手順を用いてＲＴ反応溶液を除去することによって停止させた。
コンジュゲート結合及び基質添加は、実施例１に記載のように実施した。
図５は、ポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅ステップによって生成されたシグナルと、アッセイ中に存在するヒトＩｇＧ抗原及びｏｄＴ２２コンジュゲート抗ヒトＩｇＧの量との間の関係を例示する。
異なる濃度のｏｄＴ２２標識抗ヒトＩｇＧ抗体で生成された発光シグナルを、ウェル内に固定化されたヒトＩｇＧの量に対してプロットした。ｏｄＴ２２標識抗体の各濃度において、プレート上のヒトＩｇＧの量と生成されたシグナルとの間に線形関係が認められた。系がｏｄＴ２２標識抗体に関して決して飽和状態ではないことに注目されたい。ｏｄＴ２２標識抗体の量における各増加は、比例的に増加されるシグナルを生成し、最大検出感度に達しなかった。固定化されたヒトＩｇＧは、本発明に従い、非常に低いレベルで検出される。例えば、この実験におけるｏｄＴ２２標識抗体の中央値濃度における検出範囲は、１ウェルあたり５．３×１０－１８～１．７×１０－１４モルのヒトＩｇＧ（約３２００倍の範囲）に及んだ。
実施例５．ポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅ステップにおいて使用されたポリメラーゼの量と、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗体の免疫測定法におけるシグナルとの間の関係
実施例４で実証した通り、ｏｄＴ２２標識リガンドの量と生成されたシグナルとの間に線形関係が認められる。シグナルレベルに影響する他の要素が多く存在する。最も明確で最も顕著であるのは、使用した酵素活性の量及び重合反応時間である。本実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの感染後にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する抗体応答を測定する免疫測定法における本発明の使用について例示することを意図する。
実施例４で実証した通り、ｏｄＴ２２標識リガンドの量と生成されたシグナルとの間に線形関係が認められる。シグナルレベルに影響する他の要素が多く存在する。最も明確で最も顕著であるのは、使用した酵素活性の量及び重合反応時間である。本実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの感染後にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する抗体応答を測定する免疫測定法における本発明の使用について例示することを意図する。
抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗体免疫測定法の設計
９６ウェルフレーム内に載せた白色NucleoLink（商標）ストリップを、ＰＢＳで１００ｎｇ／ｍｌに希釈した１００μｌ／ウェルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質でコーティングした。非結合のスパイクタンパク質を、Hydroflexプレートウォッシャーを使用するPBS-Tweenによる入念な洗浄によって除去した。コーティングプレートを－８０℃で貯蔵した。使用前に、ウェルをPBS-Tweenで１回洗浄し、ブロッキング緩衝液である０．０５％Tweenを有するＰＢＳ中の１％脱脂粉乳とともに室温で１時間インキュベートした。
９６ウェルフレーム内に載せた白色NucleoLink（商標）ストリップを、ＰＢＳで１００ｎｇ／ｍｌに希釈した１００μｌ／ウェルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質でコーティングした。非結合のスパイクタンパク質を、Hydroflexプレートウォッシャーを使用するPBS-Tweenによる入念な洗浄によって除去した。コーティングプレートを－８０℃で貯蔵した。使用前に、ウェルをPBS-Tweenで１回洗浄し、ブロッキング緩衝液である０．０５％Tweenを有するＰＢＳ中の１％脱脂粉乳とともに室温で１時間インキュベートした。
次のステップでは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する抗体について陽性である熱不活化（５６℃で１時間）ヒト血清の段階希釈物の３つのセットからのサンプル１００μｌをブロッキング緩衝液で希釈し、ウェルに添加した。プレートを３０分間インキュベートし、次にHydroflexプレートウォッシャーを使用してPBS-Tween緩衝液で洗浄した。
次に、PBS-Tweenで（５０ｎｇ／ｍｌ）に希釈した３０μｌのｏｄＴ３０標識ウサギ抗ヒトＩｇＧを添加した。短期間のインキュベーション後、プレートを再び洗浄した。
ここで、プレートの各ウェルは、３つの層を含有する：最初に分析物であるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質の層、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗体を含有するヒト血漿の段階希釈物を有する第２層及びｏｄＴ３０コンジュゲートウサギ抗ヒトＩｇＧを有する第３層。結合されたｏｄＴ２２プライマーの量は、結合されたヒト抗スパイク抗体の量に比例する。ポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅ステップを適用することにより、血漿サンプル中の抗スパイク抗体の存在は、ここで、本発明に従って検出及び定量することができる。
ポリメラーゼ反応
ポリメラーゼ反応におけるｏｄＴプライマーを除く全ての成分を含有する３０μｌのＨＩＶ ＲＴ反応溶液をプレート上の各ウェルに添加した。次に、ポリメラーゼ反応は、１ウェルあたり８０、６６０又は３２９０ｐｇのいずれかのＨＩＶ ＲＴに対応する１００μｌのＨＩＶ １ ＲＴの添加によって開始させた。ポリメラーゼ反応は、３７℃で４５分間進行させておいた。
ポリメラーゼ反応におけるｏｄＴプライマーを除く全ての成分を含有する３０μｌのＨＩＶ ＲＴ反応溶液をプレート上の各ウェルに添加した。次に、ポリメラーゼ反応は、１ウェルあたり８０、６６０又は３２９０ｐｇのいずれかのＨＩＶ ＲＴに対応する１００μｌのＨＩＶ １ ＲＴの添加によって開始させた。ポリメラーゼ反応は、３７℃で４５分間進行させておいた。
ポリメラーゼ反応は、Hydroflexプレートウォッシャー、それに続く徹底洗浄手順を用いてＲＴ反応溶液を除去することによって停止させた。
コンジュゲート結合及び基質添加は、実施例１に記載のように実施した。
図６は、この免疫測定法における、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質に対するＩｇＧ抗体についての検出感度が、ポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅ステップにおいて使用されたポリメラーゼの量とともにどのように変化したかを例示する。ポリメラーゼ反応は、免疫測定法の第３層内のｏｄＴ３０プライマーから開始し、反応溶液に添加された可溶性鋳型上で進行する。この系において生成されたシグナルは、生成されたＢｒｄＵ鎖の量に比例し、添加されたＨＩＶ ＲＴ量が１ウェルあたり８０ｐｇから６６０ｐｇのＲＴに増加すると、約８倍増加することが見出された。ＲＴが１ウェルあたり最大３２９０ｐｇにさらに増加すると、シグナル増加が全く得られなかったか又は得られてもごくわずかであった。酵素量が増加すると、全てのｏｄＴ３０プライマー末端が全ての時点でポリメラーゼによって占有されるとき、系は、最終的に飽和段階に達する。図から抽出できるように、これは、全ての血清希釈物で有効であった。
実施例６．ポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅ステップにおけるポリメラーゼ反応時間とシグナルとの間の関係
正常な酵素反応は、全ての反応成分が過剰に存在する限り、酵素量及び反応時間とともに線形である。実際的理由から、数時間以内にリガンド結合アッセイから結果を得ることは、好ましいと考えられる。そのため、ポリメラーゼ反応時間は、実施例１～５において３０～６０分に制限している。しかし、本発明は、ポリメラーゼ反応時間を増加させることによって検出感度の増加を得る可能性を提供する。本発明におけるプライマー伸長ステップは、反応溶液中の固相及び遊離鋳型に結合されたプライマー標識リガンドの組み合わせに基づく。鋳型境界を通して重合を実行するため、いくつかの鋳型を連続的に利用する能力は、鋳型へのアクセスがシグナル増幅ステップにおけるポリメラーゼ反応において律速になることを回避するために有利である。
正常な酵素反応は、全ての反応成分が過剰に存在する限り、酵素量及び反応時間とともに線形である。実際的理由から、数時間以内にリガンド結合アッセイから結果を得ることは、好ましいと考えられる。そのため、ポリメラーゼ反応時間は、実施例１～５において３０～６０分に制限している。しかし、本発明は、ポリメラーゼ反応時間を増加させることによって検出感度の増加を得る可能性を提供する。本発明におけるプライマー伸長ステップは、反応溶液中の固相及び遊離鋳型に結合されたプライマー標識リガンドの組み合わせに基づく。鋳型境界を通して重合を実行するため、いくつかの鋳型を連続的に利用する能力は、鋳型へのアクセスがシグナル増幅ステップにおけるポリメラーゼ反応において律速になることを回避するために有利である。
白色Nunc（商標）NucleoLink（商標）ストリッププレートへのｏｄＴ２２の固定化
９６ウェルフレーム内に載せた白色NucleoLink（商標）ストリップをｐＨ９．６の炭酸塩緩衝液中の１２０μｌ／ウェルの２００ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジンでコーティングした。非結合のストレプトアビジンを、Hydroflexプレートウォッシャー及びプレート洗浄緩衝液を使用する入念な洗浄手順によって除去した。次のステップでは、１２０μｌの３．１２５ｐｇのビオチン－ｏｄＴ２２／ｍｌをプレート上のウェルに添加し、結合させておき、その後、プレートを再び洗浄した。
９６ウェルフレーム内に載せた白色NucleoLink（商標）ストリップをｐＨ９．６の炭酸塩緩衝液中の１２０μｌ／ウェルの２００ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジンでコーティングした。非結合のストレプトアビジンを、Hydroflexプレートウォッシャー及びプレート洗浄緩衝液を使用する入念な洗浄手順によって除去した。次のステップでは、１２０μｌの３．１２５ｐｇのビオチン－ｏｄＴ２２／ｍｌをプレート上のウェルに添加し、結合させておき、その後、プレートを再び洗浄した。
ポリメラーゼ反応
ストレプトアビジン－ｏｄＴ２２コーティングストリップを６つの別々のフレーム（それぞれ２つのストリップ）に移した。各フレーム上の一方のストリップは、８００ｐｇのＨＩＶ １ ＲＴ／ｍｌを含有するＨＩＶ ＲＴ反応溶液１３０μｌを、他方は、０．２ＵのＭＭｕＬＶ ＲＴ／ｍｌを含有するＭＭｕＬＶ ＲＴ反応溶液を受けた。両方の反応溶液は、ポリメラーゼ反応に必須である、プライマーを除く全てを含有したが、それを材料において説明する。ストリップを有するフレームを３７℃のインキュベーターに移した。３０分後、１つのフレームをインキュベーターから取り出し、－２０℃で凍結させた。６０分後、別のフレームをインキュベーターから取り出し、１番目として処理した。このプロセスは、１２０分後、２４０分後、３５５分後及び１０９０分後に反復させた。最後のフレームを凍結させると、全てのストリップを１つのフレーム内に構築した。解凍後、ポリメラーゼ反応を、Hydroflexプレートウォッシャー、それに続く徹底洗浄手順を用いてＲＴ反応溶液を除去することによって停止させた。
ストレプトアビジン－ｏｄＴ２２コーティングストリップを６つの別々のフレーム（それぞれ２つのストリップ）に移した。各フレーム上の一方のストリップは、８００ｐｇのＨＩＶ １ ＲＴ／ｍｌを含有するＨＩＶ ＲＴ反応溶液１３０μｌを、他方は、０．２ＵのＭＭｕＬＶ ＲＴ／ｍｌを含有するＭＭｕＬＶ ＲＴ反応溶液を受けた。両方の反応溶液は、ポリメラーゼ反応に必須である、プライマーを除く全てを含有したが、それを材料において説明する。ストリップを有するフレームを３７℃のインキュベーターに移した。３０分後、１つのフレームをインキュベーターから取り出し、－２０℃で凍結させた。６０分後、別のフレームをインキュベーターから取り出し、１番目として処理した。このプロセスは、１２０分後、２４０分後、３５５分後及び１０９０分後に反復させた。最後のフレームを凍結させると、全てのストリップを１つのフレーム内に構築した。解凍後、ポリメラーゼ反応を、Hydroflexプレートウォッシャー、それに続く徹底洗浄手順を用いてＲＴ反応溶液を除去することによって停止させた。
コンジュゲート結合及び基質添加は、実施例１に記載したように実施した。
図７は、ＨＩＶ－１又はＭＭｕＬＶ ＲＴのいずれかを使用するときの、ポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅ステップにおけるポリメラーゼ反応時間に関連するシグナル発生を示す。両方の酵素は、数時間にわたりシグナル増加をもたらしたが、長いインキュベーション時間中、著しく異なる挙動を示した。ＭＭｕＬＶ酵素は、「スロースターター」であったが、最初の「遅滞期」後の長い時間にわたり時間と線形であるポリメラーゼ反応を持続させた。他方で、ＨＩＶ－１ ＲＴは、直ちに開始させ、標識ＤＮＡを生成したが、反応速度は、数時間後に減少し、反応は、約４００分後に反転するようにさえ見えた。
数時間にわたる線形ポリメラーゼ反応は、新たなＤＮＡ鎖が約５００塩基の鋳型よりはるかに長いことを必要とする。生成された長いＲＮＡ／ＤＮＡ鎖は、特定の反応条件においてヌクレアーゼに対して明らかに高感度である。時間と生成されたシグナルとの間の関係は、酵素及び反応混合物の異なる組み合わせ間で変動する。規定された各適用において、本発明に従うポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅ステップを含む免疫測定法を設計する場合、これを考慮する必要がある。
実施例７．抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗体免疫測定法におけるシグナル増幅ステップにおいて２つの異なるデオキシウリジン三リン酸類似体を用いるシグナルに対する効果
実施例１～６におけるポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅ステップは、新規に合成されたＤＮＡを標識するための、１つのデオキシチミジン三リン酸塩類似体であるＢｒｄＵＴＰの使用に基づく。他のヌクレオチド類似体を使用して同様の方法によってそれらを検出することは、明らかに可能である。シグナルは、デオキシチミジン三リン酸塩類似体を組み込むための反応速度及び新規に合成されたＤＮＡにおける類似体の検出の効率の両方に依存することになる。本実施例では、本発明者らは、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗体免疫測定法におけるポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅ステップにおいて使用される、２つの異なる修飾デオキシウリジン三リン酸類似体としてのＩｄＵＴＰ及びＢｒｄＵＴＰによって生成されたシグナルを比較する。
実施例１～６におけるポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅ステップは、新規に合成されたＤＮＡを標識するための、１つのデオキシチミジン三リン酸塩類似体であるＢｒｄＵＴＰの使用に基づく。他のヌクレオチド類似体を使用して同様の方法によってそれらを検出することは、明らかに可能である。シグナルは、デオキシチミジン三リン酸塩類似体を組み込むための反応速度及び新規に合成されたＤＮＡにおける類似体の検出の効率の両方に依存することになる。本実施例では、本発明者らは、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗体免疫測定法におけるポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅ステップにおいて使用される、２つの異なる修飾デオキシウリジン三リン酸類似体としてのＩｄＵＴＰ及びＢｒｄＵＴＰによって生成されたシグナルを比較する。
抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗体免疫測定法の設計
Bio-One製の高結合性の白色半面積マイクロプレートを、実施例５に記載したようにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質でコーティングした。
Bio-One製の高結合性の白色半面積マイクロプレートを、実施例５に記載したようにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質でコーティングした。
次のステップでは、２つの熱不活化（５６℃で１時間）ヒト血清の段階希釈物が生成されたが、１つは、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗体陽性（ＵＫ９）、１つは、抗体陰性（ＵＫ３２）であり、いずれもブロッキング緩衝液で希釈した。それらを２つの別々のプレート上のウェルに添加した。プレートを３０分間インキュベートし、次にHydroflexプレートウォッシャーを使用してPBS-Tween緩衝液で洗浄した。次に、PBS-Tweenで２００ｎｇ／ｍｌに希釈した３０μｌのｏｄＴ３０コンジュゲートウサギ抗ヒトＩｇＧを添加した。短時間のインキュベーション後、プレートを再び洗浄した。
ポリメラーゼ反応
同一の血清滴定の場合の２つのプレートの一方は、ＢｒｄＵＴＰ及びポリメラーゼ反応におけるｏｄＴプライマーを除く他の全ての成分を含有する１ウェルあたり３０μｌのＨＩＶ ＲＴ反応溶液を受けた。残りのプレートは、同一であるが、ＢｒｄＵＴＰの代わりにＩｄＵＴＰを有するＨＩＶ ＲＴ反応溶液３０μｌを受けた。次に、ポリメラーゼ反応をＨＩＶ １ ＲＴ（２４０ｐｇ）のプレート上の各ウェルへの添加によって開始させた。ポリメラーゼ反応は、３７℃で３０分間進行させておいた。反応は、Hydroflexプレートウォッシャー、それに続く徹底洗浄手順を用いて、ＲＴ反応溶液を除去することによって停止させた。
同一の血清滴定の場合の２つのプレートの一方は、ＢｒｄＵＴＰ及びポリメラーゼ反応におけるｏｄＴプライマーを除く他の全ての成分を含有する１ウェルあたり３０μｌのＨＩＶ ＲＴ反応溶液を受けた。残りのプレートは、同一であるが、ＢｒｄＵＴＰの代わりにＩｄＵＴＰを有するＨＩＶ ＲＴ反応溶液３０μｌを受けた。次に、ポリメラーゼ反応をＨＩＶ １ ＲＴ（２４０ｐｇ）のプレート上の各ウェルへの添加によって開始させた。ポリメラーゼ反応は、３７℃で３０分間進行させておいた。反応は、Hydroflexプレートウォッシャー、それに続く徹底洗浄手順を用いて、ＲＴ反応溶液を除去することによって停止させた。
コンジュゲート結合及び基質添加は、実施例１に記載したように実施した。
図８は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対するヒトＩｇＧ抗体の検出のための免疫測定法におけるポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅ステップにおける２つの異なる修飾デオキシウリジン三リン酸類似体の使用について図示する。ＮＩＢＳＣからの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検証パネルからの陽性血清ＵＫ９を、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫グロブリンについてのＷＨＯ国際基準（ＮＩＢＳＣコード２０／１３６）に較正し、図中のＵＫ９の量をＩｇＧ抗体結合単位（ＢＡＵ）として表す。同じパネルからの陰性血清ＵＫ２６を、陽性ＵＫ９血清と同じ希釈物において比較のために図に含めた。
ＨＩＶ ＲＴに対する基質としてのＢｒｄＵＴＰは、ＩｄＵＴＰと比較してややより高いシグナルを生成した。線形検出のためのスパンは、両方の類似体と類似することが見出され、０．４～１３００μＢＡＵの範囲であった。ポリメラーゼでブーストされたシグナル増幅ステップを伴う免疫測定法では、０．４μＢＡＵまで低下した希釈物でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性（ＵＫ９）血清と陰性血清（ＵＫ２６）とを区別できることが判明した。
実施例８．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対するポリメラーゼでブーストされた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ。
固定化抗原に結合する抗体を定量するブースターアッセイへの本発明の利用は、実施例５及び７において示している。本実施例は、抗原捕捉アッセイをブーストするための本発明の使用について例示することを意図する。ＥＬＩＳＡにおける両方のシグナル及び検出範囲は、検出抗体上の標識の量及びタイプとともに変動する。実施例１～７では、本発明者らは、この目的のため、ＡＰコンジュゲートモノクローナル抗体（ｍａｂ）を使用している。したがって、本実施例は、ポリメラーゼでブーストされたＥＬＩＳＡにおけるホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの他の酵素標識の有用性について実証することも意図する。
固定化抗原に結合する抗体を定量するブースターアッセイへの本発明の利用は、実施例５及び７において示している。本実施例は、抗原捕捉アッセイをブーストするための本発明の使用について例示することを意図する。ＥＬＩＳＡにおける両方のシグナル及び検出範囲は、検出抗体上の標識の量及びタイプとともに変動する。実施例１～７では、本発明者らは、この目的のため、ＡＰコンジュゲートモノクローナル抗体（ｍａｂ）を使用している。したがって、本実施例は、ポリメラーゼでブーストされたＥＬＩＳＡにおけるホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの他の酵素標識の有用性について実証することも意図する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ＥＬＩＳＡにおける第１層の設計
白色Nunc NucleolinkストリップからなるマイクロタイタープレートをＰＢＳ中の１ウェルあたり１００μｌのＤＨ６マウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ｍａｂ（５００ｎｇ／ｍｌ）でコーティングした。プレートをシーリングテープでカバーし、冷蔵庫内で一晩インキュベートした。非結合のｍａｂを、Hydroflexプレートウォッシャー及びPBS Tweenを使用して除去した。コーティングプレートをブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中、１％脱脂粉乳）とともに３７℃で１時間インキュベートした。次に、プレートを再び洗浄した。
白色Nunc NucleolinkストリップからなるマイクロタイタープレートをＰＢＳ中の１ウェルあたり１００μｌのＤＨ６マウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ｍａｂ（５００ｎｇ／ｍｌ）でコーティングした。プレートをシーリングテープでカバーし、冷蔵庫内で一晩インキュベートした。非結合のｍａｂを、Hydroflexプレートウォッシャー及びPBS Tweenを使用して除去した。コーティングプレートをブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中、１％脱脂粉乳）とともに３７℃で１時間インキュベートした。次に、プレートを再び洗浄した。
第２層及び第３層の添加
次のステップでは、０．５％トリトンX100を有するブロッキング緩衝液中のｏｄＴ３０で標識した２０μｌのAd10マウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ｍａｂ（１０００ｎｇ／ｍｌ）をプレート上の各ウェルに添加した。次に、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質の段階希釈物のセットからの８０μｌのサンプル及びブランクを添加した（１２．５ｎｇ／ｍｌで開始し、０．５％トリトンX100を有するブロッキング緩衝液で６．１ｐｇ／ｍｌに達するまで２ステップで段階希釈した）。６０分のインキュベーション後、プレートを再び洗浄した。
次のステップでは、０．５％トリトンX100を有するブロッキング緩衝液中のｏｄＴ３０で標識した２０μｌのAd10マウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ｍａｂ（１０００ｎｇ／ｍｌ）をプレート上の各ウェルに添加した。次に、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質の段階希釈物のセットからの８０μｌのサンプル及びブランクを添加した（１２．５ｎｇ／ｍｌで開始し、０．５％トリトンX100を有するブロッキング緩衝液で６．１ｐｇ／ｍｌに達するまで２ステップで段階希釈した）。６０分のインキュベーション後、プレートを再び洗浄した。
ここで、プレートの各ウェルは、ｏｄＴ３０標識マウス抗ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質を有する第３層を含有する。結合されたｏｄＴ３０プライマーの量は、第２層内のＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質の量に比例し、本発明に従って定量することができる。
ポリメラーゼ反応
ポリメラーゼ反応におけるｏｄＴプライマーを除く全ての成分を含有する３０μｌのＰＯＬＩ反応溶液をプレート上の各ウェルに添加した。次に、ポリメラーゼ反応を、０．６７ｍｇのＢＳＡ／ｍｌを有するｐＨ８．０の２５ｍＭヘペス１００μｌ中の１２．５μＵのIsoPol SD+の添加によって開始させた。ポリメラーゼ反応を室温で６０分間進行させておいた。
ポリメラーゼ反応におけるｏｄＴプライマーを除く全ての成分を含有する３０μｌのＰＯＬＩ反応溶液をプレート上の各ウェルに添加した。次に、ポリメラーゼ反応を、０．６７ｍｇのＢＳＡ／ｍｌを有するｐＨ８．０の２５ｍＭヘペス１００μｌ中の１２．５μＵのIsoPol SD+の添加によって開始させた。ポリメラーゼ反応を室温で６０分間進行させておいた。
ポリメラーゼ反応は、Hydroflexプレートウォッシャーを使用してＲＴ反応溶液を除去することによって停止させた。
新規に生成されたＢｒｄＵ鎖の定量
本実施例では、本発明者らは、２ステップのコンジュゲート結合手順を利用する。１００μｌのビオチンコンジュゲートマウスBu20のｍａｂ（blotto bulk中、０．６μｇ／ｍｌ）をまず各ウェルに添加した。短時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、１００μｌのＨＲＰ標識ストレプトアビジン（０．１％カゼインを有するPBS Tween中、０．４２μｇ／ｍｌ）を添加した。プレート上の各ウェルは、ここで、新規に合成されたＢｒｄＵ鎖に結合されたＨＲＰ標識ビオチン－ストレプトアビジン複合体を含有することになる。
本実施例では、本発明者らは、２ステップのコンジュゲート結合手順を利用する。１００μｌのビオチンコンジュゲートマウスBu20のｍａｂ（blotto bulk中、０．６μｇ／ｍｌ）をまず各ウェルに添加した。短時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、１００μｌのＨＲＰ標識ストレプトアビジン（０．１％カゼインを有するPBS Tween中、０．４２μｇ／ｍｌ）を添加した。プレート上の各ウェルは、ここで、新規に合成されたＢｒｄＵ鎖に結合されたＨＲＰ標識ビオチン－ストレプトアビジン複合体を含有することになる。
基質反応
６．１ｍｌのSuperSignal ELISA Picoルミノール／エンハンサー溶液を６．１ｍｌのSuperSignal ELISA Pico安定ペルオキシダーゼ溶液と混合し、ＨＲＰ基質の使用液を得た。最終反応では、この溶液１２０μｌを各ウェルに添加する。この基質は、コンジュゲートのＨＲＰ酵素部分が基質構造を修飾するとき、光を生成する。ＲＴ反応プレートをLumateマイクロプレートルミノメーターの読み取りチャンバー内に移し、光強度を測定した。
６．１ｍｌのSuperSignal ELISA Picoルミノール／エンハンサー溶液を６．１ｍｌのSuperSignal ELISA Pico安定ペルオキシダーゼ溶液と混合し、ＨＲＰ基質の使用液を得た。最終反応では、この溶液１２０μｌを各ウェルに添加する。この基質は、コンジュゲートのＨＲＰ酵素部分が基質構造を修飾するとき、光を生成する。ＲＴ反応プレートをLumateマイクロプレートルミノメーターの読み取りチャンバー内に移し、光強度を測定した。
ＨＲＰ酵素プロセスによって生成された光の強度は、抗ＢｒｄＵ抗体の合成されたＢｒｄＵ鎖への結合を介してウェルに結合された複合酵素の量に比例する。次いで、組み込まれたＢｒｄＵの量は、ウェル内に捕捉されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に結合されたAd10のｍａｂに対するｏｄＴプライマーの量に比例する。
参照ＥＬＩＳＡ
ポリメラーゼでブーストされたアッセイなどの場合、同一成分を同一濃度で使用した。参照ＥＬＩＳＡにおけるAD10検出抗体を、ｏｄＴではなく、ビオチンで標識した。その後、この抗体のこれの存在について、シグナル増幅ステップを全く伴わずにＨＲＰ標識ストレプトアビジンで直接的に検出した。
ポリメラーゼでブーストされたアッセイなどの場合、同一成分を同一濃度で使用した。参照ＥＬＩＳＡにおけるAD10検出抗体を、ｏｄＴではなく、ビオチンで標識した。その後、この抗体のこれの存在について、シグナル増幅ステップを全く伴わずにＨＲＰ標識ストレプトアビジンで直接的に検出した。
図９は、ポリメラーゼでブーストされた抗原捕捉アッセイ又は参照ＥＬＩＳＡのいずれかによって生成されたシグナルとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の存在量との間の関係を図示する。
図から抽出できるように、ポリメラーゼでブーストされた捕捉アッセイでは、生成されたシグナルと約７×１０－１９～１×１０－１５モルの範囲で存在するスパイクタンパク質の量との間に線形関係がもたらされた。検出上限に近い線形性からの偏差は、ルミノメーターの検出範囲内の限界に起因した。
参照ＥＬＩＳＡでは、５×１０－１７モル未満のスパイクタンパク質レベルを検出できなかった。
参考文献
Collins E, Rothacker JA. Methods of detecting an analyte in a sample. WO2006/053380.
Hendrickson ER, Haffield Truby TM, Joerger RD, et al. High sensitivity multianalyte immunoassay using covalent DNA-labeled antibodies and polymerase chain reaction., Nucleic Acids Research, 1995, Vol 23, No.3, 522-529.
Huber HE, McCoy JM, Seehra JS, Richardson CC. Human immunodeficiency virus 1 reverse transcriptase. Template binding, processivity, strand displacement synthesis, and template switching. J Biol Chem, 1989, 264(8): 4669-78. PMID: 2466838.
Kralik P & Ricchi M. A Basic Guide to Real Time PCR in Microbial Diagnostics: Definitions, Parameters, and Everything. Frontiers in Microbiology, 2017, 8, 108- DOI={10.3389/fmicb.2017.00108}
Lannergren U. Methods and compositions for universal size specific PCR. US 2005/0233351A
Lennerstrand J, Rytting AS, Oervell C et al. A method for combined immunoaffinity purification and assay of HIV-1 reverse transcriptase activity useful for crude samples. Anal Biochem, 1996 Mar 15; 235(2): 141-52. doi: 10.1006/abio.1996.0106. PMID: 8833322.
Petterson I, Shao X, Gronowitz S, Kallander C. (2001) A method for measuring DNA polymerisation and applications of the method. PCT/SE02/01155 (WO 02/103039 A1)
Rosendal E, Wigren Bystroem J, Groening R et al. Detection of asymptomatic SARS-CoV-2 exposed individuals by a sensitive S-based ELISA. BMJ medRxiv preprint doi: doi.org/10.1101/2020.06.02.20120477.this version posted June 4, 2020.
Sano T, Smith CL and. Cantor CR,“Immuno-PCR: Very Sen-sitive Antigen Detection by Means of Specific Anti-body-DNA Conjugates.”Science, 1992, 258,120-122.
Sano T; Cantor CR; Smith CL. Immuno-polymerase chain reaction system for antigen detection. US 5,665,539, 1993
Simonova MA, Pivovarov VP, Ryazantsev DY et al. Comparative diagnostics of allergy using quantitative immuno-PCR and ELISA. Bioanalysis, 2018; 10(10): 757-767. doi: 10.4155/bio-2017-0194. Epub 2018 May 17.
Todd J, Freese B, Lu A, Held D, Morey J, Livingston R, Goix P. Ultrasensitive flow-based immunoassays using single-molecule counting. Clin Chem. 2007 Nov;53(11):1990-5. doi: 10.1373/clinchem.2007.091181. Epub 2007 Sep 21. PMID: 17890441.
Urdea M. Protein-nucleic acid probes and immunoassays using same. 1991 WO 91/17442.
Weber J, Grosse F. Fidelity of human immunodeficiency virus type I reverse transcriptase in copying natural DNA. Nucleic Acids Res. 1989 Feb 25;17(4):1379-93. doi: 10.1093/nar/17.4.1379. PMID: 2466238; PMCID: PMC331810.
Wei H, Wang E. Electrochemiluminescence of tris(2,2’-bipyridyl)ruthenium and its applications in bioanalysis: a review. Luminescence. 2011 Mar-Apr;26(2):77-85. doi: 10.1002/bio.1279. Epub 2011 Mar 14. PMID: 21400654.
Wrapp D. et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation.
Science 367, 1260-1263, doi:10.1126/science.abb2507 (2020).
Collins E, Rothacker JA. Methods of detecting an analyte in a sample. WO2006/053380.
Hendrickson ER, Haffield Truby TM, Joerger RD, et al. High sensitivity multianalyte immunoassay using covalent DNA-labeled antibodies and polymerase chain reaction., Nucleic Acids Research, 1995, Vol 23, No.3, 522-529.
Huber HE, McCoy JM, Seehra JS, Richardson CC. Human immunodeficiency virus 1 reverse transcriptase. Template binding, processivity, strand displacement synthesis, and template switching. J Biol Chem, 1989, 264(8): 4669-78. PMID: 2466838.
Kralik P & Ricchi M. A Basic Guide to Real Time PCR in Microbial Diagnostics: Definitions, Parameters, and Everything. Frontiers in Microbiology, 2017, 8, 108- DOI={10.3389/fmicb.2017.00108}
Lannergren U. Methods and compositions for universal size specific PCR. US 2005/0233351A
Lennerstrand J, Rytting AS, Oervell C et al. A method for combined immunoaffinity purification and assay of HIV-1 reverse transcriptase activity useful for crude samples. Anal Biochem, 1996 Mar 15; 235(2): 141-52. doi: 10.1006/abio.1996.0106. PMID: 8833322.
Petterson I, Shao X, Gronowitz S, Kallander C. (2001) A method for measuring DNA polymerisation and applications of the method. PCT/SE02/01155 (WO 02/103039 A1)
Rosendal E, Wigren Bystroem J, Groening R et al. Detection of asymptomatic SARS-CoV-2 exposed individuals by a sensitive S-based ELISA. BMJ medRxiv preprint doi: doi.org/10.1101/2020.06.02.20120477.this version posted June 4, 2020.
Sano T, Smith CL and. Cantor CR,“Immuno-PCR: Very Sen-sitive Antigen Detection by Means of Specific Anti-body-DNA Conjugates.”Science, 1992, 258,120-122.
Sano T; Cantor CR; Smith CL. Immuno-polymerase chain reaction system for antigen detection. US 5,665,539, 1993
Simonova MA, Pivovarov VP, Ryazantsev DY et al. Comparative diagnostics of allergy using quantitative immuno-PCR and ELISA. Bioanalysis, 2018; 10(10): 757-767. doi: 10.4155/bio-2017-0194. Epub 2018 May 17.
Todd J, Freese B, Lu A, Held D, Morey J, Livingston R, Goix P. Ultrasensitive flow-based immunoassays using single-molecule counting. Clin Chem. 2007 Nov;53(11):1990-5. doi: 10.1373/clinchem.2007.091181. Epub 2007 Sep 21. PMID: 17890441.
Urdea M. Protein-nucleic acid probes and immunoassays using same. 1991 WO 91/17442.
Weber J, Grosse F. Fidelity of human immunodeficiency virus type I reverse transcriptase in copying natural DNA. Nucleic Acids Res. 1989 Feb 25;17(4):1379-93. doi: 10.1093/nar/17.4.1379. PMID: 2466238; PMCID: PMC331810.
Wei H, Wang E. Electrochemiluminescence of tris(2,2’-bipyridyl)ruthenium and its applications in bioanalysis: a review. Luminescence. 2011 Mar-Apr;26(2):77-85. doi: 10.1002/bio.1279. Epub 2011 Mar 14. PMID: 21400654.
Wrapp D. et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation.
Science 367, 1260-1263, doi:10.1126/science.abb2507 (2020).
Claims (22)
- サンプル中の目的の分析物の検出のための方法であって、
－ 前記分析物に特異的に結合する能力がある第１リガンドを、前記リガンドの前記分析物への特異的結合を促進する条件下で前記サンプルと接触させることであって、前記第１リガンドは、前記分析物に特異的に結合する能力がある結合部分と、前記結合部分に結合されたオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーとを含み、前記オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーは、１８～４０ヌクレオチドの長さを有する、接触させることと；
－ 前記サンプルから非結合の第１リガンドを除去することと；
－ 前記結合された第１リガンドを、前記オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーより長く、かつ前記オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーと少なくとも部分的に相補的である配列を有するポリリボヌクレオチド鋳型；複数の標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸；及び逆転写酵素活性を有する酵素と接触させることと；
－ 前記結合されたオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーを含む前記結合された第１リガンド、前記ポリリボヌクレオチド鋳型、前記標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸及び前記酵素を、前記酵素による標識ＤＮＡ鎖の合成に適した条件下でインキュベートすることと；
－ 任意の合成された標識ＤＮＡ鎖を検出することと
を含む方法。 - 前記オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーは、４つの塩基Ａ、Ｇ、Ｔ及びＣの全てを含有するオリゴデオキシリボヌクレオチド若しくはそのサブセット又は単一の塩基を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチド、好ましくはオリゴデオキシチミジンから選択される、請求項１に記載の方法。
- 前記標識デオキシリボヌクレオチドは、標識デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、例えばブロモ－ｄＵＴＰ又はヨード－ｄＵＴＰ、好ましくはブロモ－ｄＵＴＰであり、及び前記ポリリボヌクレオチド鋳型は、ポリリボアデニル酸である、請求項２に記載の方法。
- 前記オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーは、２２～４０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリリボヌクレオチド鋳型は、１０２～１０３ヌクレオチド、好ましくは２×１０２～５×１０２ヌクレオチドの長さを有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 逆転写酵素活性を有する前記酵素は、真核生物ポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼガンマ；ウイルスポリメラーゼ、例えばレトロウイルス逆転写酵素、好ましくはＨＩＶ若しくはＭ－ＭｕＬＶ逆転写酵素又は細菌ポリメラーゼ、例えば中温性細菌由来の細菌ポリメラーゼ、好ましくは大腸菌（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片若しくは好熱性細菌由来の細菌ポリメラーゼ、好ましくはバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus Stearothermophilus）由来のＢｓｔ３．０である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 逆転写酵素活性を有する前記酵素は、ＤＮＡポリメラーゼガンマ、ＨＩＶ又はＭ－ＭｕＬＶ逆転写酵素、大腸菌（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片及びバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus Stearothermophilus）由来のＢｓｔ３．０からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
- 前記インキュベーションステップは、一定の温度、好ましくは３７℃で３０分～４時間、好ましくは１時間にわたって実施される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出は、
－ 前記標識ＤＮＡ鎖に特異的に結合する能力がある第２リガンドを、前記合成された標識ＤＮＡ鎖と、前記第２リガンドの前記ＤＮＡ鎖への特異的結合を促進する条件下で接触させるステップであって、前記第２リガンドは、前記合成された標識ＤＮＡに特異的に結合する能力がある結合部分と、共有結合された酵素とを含む、ステップと；
－ 前記サンプルから前記非結合の第２リガンドを除去するステップと；
－ 前記結合された酵素による切断時に検出可能なシグナルを生成する、前記結合された酵素のための基質を添加するステップと；
－ 前記シグナルを検出するステップと
を含む検出方法を通して実施される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第２リガンドは、前記合成された標識ＤＮＡに特異的に結合する抗体であって、それに共有結合された酵素、例えばアルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼを有する抗体である、請求項９に記載の方法。
- 前記共有結合された酵素は、基質に対して作用して、比色分析、蛍光、化学発光又は電気化学シグナルを生成する、請求項１０に記載の方法。
- 前記共有結合された酵素は、基質に対して作用して、前記検出可能なシグナルとして化学発光シグナルを生成するアルカリホスファターゼである、請求項１０又は１１に記載の方法。
- 前記目的の分析物の前記検出は、定量検出である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
- 目的の分析物に特異的に結合する能力がある結合部分と、前記結合部分に結合された１８～４０ヌクレオチドの長さのオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーとを含む第１リガンド；前記オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーより長く、かつ前記オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーと少なくとも部分的に相補的である配列を有するポリリボヌクレオチド鋳型；複数の標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸；及び逆転写酵素活性を有する酵素を含むパーツキット。
- 前記オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーは、４つの塩基Ａ、Ｇ、Ｔ及びＣの全てを含有するオリゴデオキシリボヌクレオチド若しくはそのサブセット又は単一の塩基を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチド、好ましくはオリゴデオキシチミジンから選択される、請求項１４に記載のパーツキット。
- 前記標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸は、標識デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、例えばブロモ－ｄＵＴＰ又はヨード－ｄＵＴＰ、好ましくはブロモ－ｄＵＴＰであり、及び前記ポリリボヌクレオチド鋳型は、ポリリボアデニル酸である、請求項１４又は１５に記載のパーツキット。
- 前記オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーは、２２～４０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１４～１６のいずれか一項に記載のパーツキット。
- 前記ポリリボヌクレオチド鋳型は、１０２～１０３ヌクレオチド、好ましくは２×１０２～５×１０２ヌクレオチドの長さを有する、請求項１４～１７のいずれか一項に記載のパーツキット。
- 逆転写酵素活性を有する前記酵素は、真核生物、ウイルス又は細菌ポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼガンマ、ＨＩＶ若しくはＭ－ＭｕＬＶ逆転写酵素、大腸菌（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片又はバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus Stearothermophilus）由来のＢｓｔ３．０である、請求項１４～１８のいずれか一項に記載のパーツキット。
- 前記標識デオキシリボヌクレオチドに特異的に結合する能力がある第２リガンドであって、共有結合された酵素も含む第２リガンドと、前記酵素のための基質とをさらに含む、請求項１４～１９のいずれか一項に記載のパーツキット。
- 前記第２リガンドは、モノクローナル抗体であって、それに共有結合された酵素、例えばアルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼを有するモノクローナル抗体である、請求項２０に記載のパーツキット。
- 前記共有結合された酵素は、基質に対して作用して、検出可能なシグナルとして化学発光シグナルを生成するアルカリホスファターゼである、請求項２０又は２１に記載のパーツキット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE2150659-7 | 2021-05-25 | ||
| SE2150659 | 2021-05-25 | ||
| PCT/SE2022/050491 WO2022250596A1 (en) | 2021-05-25 | 2022-05-19 | Method for sensitive analyte detection assays and kits therefor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2024521001A true JP2024521001A (ja) | 2024-05-28 |
Family
ID=82016503
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023564045A Pending JP2024521001A (ja) | 2021-05-25 | 2022-05-19 | 高感度な分析物検出アッセイのための方法及びそのためのキット |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4347865A1 (ja) |
| JP (1) | JP2024521001A (ja) |
| CN (1) | CN117377774A (ja) |
| AU (1) | AU2022279886A1 (ja) |
| WO (1) | WO2022250596A1 (ja) |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE174121T1 (de) | 1990-05-04 | 1998-12-15 | Chiron Corp | Protein-nukleinsäuresonden und selbige verwendende immunoassays |
| US5665539A (en) | 1991-07-12 | 1997-09-09 | The Regents Of The University Of California | Immuno-polymerase chain reaction system for antigen detection |
| SE504798C2 (sv) | 1995-06-16 | 1997-04-28 | Ulf Landegren | Immunanalys och testkit med två reagens som kan tvärbindas om de adsorberats till analyten |
| BRPI0210359B8 (pt) | 2001-06-14 | 2021-07-27 | Cavidi Tech Ab | método para medir a polimerização de dna dependente do dna em uma amostra biológica, e, embalagem comercial |
| AU2005216136A1 (en) * | 2004-02-20 | 2005-09-09 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Reagents, kits and methods for immunodetection of epitopes on molecules |
| EP1828405A4 (en) | 2004-11-16 | 2009-04-15 | Sienna Cancer Diagnostics Ltd | METHOD FOR DETECTING AN ANALYTE IN A SAMPLE |
-
2022
- 2022-05-19 JP JP2023564045A patent/JP2024521001A/ja active Pending
- 2022-05-19 AU AU2022279886A patent/AU2022279886A1/en active Pending
- 2022-05-19 CN CN202280036358.2A patent/CN117377774A/zh active Pending
- 2022-05-19 WO PCT/SE2022/050491 patent/WO2022250596A1/en active Application Filing
- 2022-05-19 EP EP22729314.9A patent/EP4347865A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4347865A1 (en) | 2024-04-10 |
| CN117377774A (zh) | 2024-01-09 |
| WO2022250596A1 (en) | 2022-12-01 |
| AU2022279886A1 (en) | 2023-11-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU783644B2 (en) | Methods and kits for proximity probing | |
| US7306904B2 (en) | Methods and kits for proximity probing | |
| Adler et al. | A real-time immuno-PCR assay for routine ultrasensitive quantification of proteins | |
| US6511809B2 (en) | Method for the detection of an analyte by means of a nucleic acid reporter | |
| US20080293051A1 (en) | proximity ligation assay | |
| Lind et al. | Development and evaluation of three real-time immuno-PCR assemblages for quantification of PSA | |
| JP2511221B2 (ja) | ポリメラ―ゼ活性測定方法 | |
| EP2494064A1 (en) | A proximity ligation assay involving generation of catalytic activity | |
| US20230323424A1 (en) | Controls for proximity detection assays | |
| JPH10179197A (ja) | 隣接してアニーリングしたプローブの三重らせん形成を用いる核酸の同定方法 | |
| JPH05149949A (ja) | 新規な微量物質測定法 | |
| US20240209413A1 (en) | Method for sensitive analyte detection assays and kits therefor | |
| JP2024521001A (ja) | 高感度な分析物検出アッセイのための方法及びそのためのキット | |
| US20220162589A1 (en) | Analyte Detection Method Employing Concatemers | |
| US20230159983A1 (en) | Method for detecting analytes of varying abundance | |
| JP2005257641A (ja) | Ｒｎａポリメラーゼを用いて複数の蛋白質を同時に検出する方法 | |
| CN116515961B (zh) | 一种基于化学发光免疫分析的rpa核酸检测方法 | |
| WO2024059773A2 (en) | Ultra-sensitive analyte detection and quantification using catch and release with proximity detection | |
| US20040259131A1 (en) | Methods for detection of target molecules and molecular interactions | |
| JP2002116207A (ja) | 高感度測定法およびそれに使用するキット | |
| JP2002345476A (ja) | Ｄｎａライゲーション反応を用いる均一競合系高感度測定方法 |