JP2002345476A - Ｄｎａライゲーション反応を用いる均一競合系高感度測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】測定対象物質に標識物質が近接したことを示す
情報を増幅してＳ／Ｎ比を高めることが可能であり、し
かも標識物質の結合が容易である、高感度かつ簡便な測
定方法を提供すること。 【解決手段】（ア）測定対象物質、（イ）及び（ウ）に
おける物質と特異的に結合する物質、（イ）該（ア）と
特異的に結合し得る物質であって標識核酸と結合したも
の（ウ）該（ア）と特異的に結合し得る物質であって標
識核酸と結合したもの、および（エ）試料を接触させ、
（イ）及び（ウ）の標識核酸を連結し、連結された核酸
の、少なくとも連結部分を含む部分を増幅し又は標識核
酸が連結されたことを示す核酸の合成を生起し、増幅さ
れた核酸を検出し、その結果を測定対象物質の存在又は
存在量と関連付けることからなる測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、例えば抗原等の、
抗体、ペプチド、核酸、アビジン、レセプター等と特異
的に結合し得る測定対象物質を均一系で高感度に測定す
る測定方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ベッドサイドやオンサイトで検体中の測
定対象物質（例えば抗原）の濃度を簡便に測定し得る測
定系の要望は強い。抗原等の測定系として免疫測定が一
般的であり、例えば抗体により抗原を挟みこみ検体中の
抗原量を定量するサンドイッチ法や、抗体と標識抗原の
結合を測定検体中の抗原がどの程度阻害するかで抗原を
定量する競合法が普及している。

【０００３】しかしながら上記測定系にはＢ／Ｆ分離が
必要で、操作性に関してより一層の簡便化が求められて
おり、Ｂ／Ｆ分離を伴わない測定方法がいくつか提案さ
れている。例えば抗原を認識する２種類の抗体を別々の
蛍光色素で標識し、両色素が抗原に結合して接近したこ
とを蛍光波長の高波長シフトで検出する方法が提案され
ている（ＦＲＥＴ）。しかしながら、抗原抗体反応は平
衡反応であるから、ある値以上にシグナルが増加するこ
とはなく、十分なＳ／Ｎ比が得られずに高感度分析とし
ては不向きであった。また他の方法としては、次のよう
な方法も提案されている。

【０００４】まず酵素の活性部位近傍を低分子抗原で標
識し、該抗原を認識する抗体を結合させて酵素活性を押
さえておく。そして該酵素を含む反応系内に該抗原が入
ってきたときには抗体が酵素からはずれ、酵素活性が発
現することを利用する方法である（Ｒｕｄｅｎｓｔｅｉ
ｎ、Ｋ．Ｅ．、Ｕｌｌｍａｎ、Ｅ．Ｆ．、１９７２、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、４７、
８４６−８５１）。また、抗体と、酵素阻害物質で標識
した抗原とを反応させる方法も提案されており、既に試
薬が市販されている（酵素阻害物質標識イムノアッセ
イ、Ａｂｂｏｔ社、商品名；ＴＥＴＲＡＺＹＭＥ）。こ
の方法は、抗原抗体反応で両者が結合すると、立体障害
のために酵素阻害作用は発揮されないが、遊離の抗原に
抗体が消費されると酵素阻害作用が発生することを利用
して遊離抗原を測定するものである。

【０００５】上記２つの方法は、原理的には活性化した
酵素によりシグナルが増幅される系ではあるが、前者は
抗体で酵素活性が押さえられるように酵素活性部位周辺
を抗原で標識しなければならず、後者も酵素阻害物質と
抗原とを結合しなければならないが、かかる結合は困難
である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記したように、ＦＲ
ＥＴでは抗体が近接したことを示す情報を増幅してＳ／
Ｎ比を高めることができず、また他の方法においては酵
素の特定の場所に抗原を導入するのが非常に困難である
という課題がある。そこで本願発明は、測定対象物質に
標識物質が近接したことを示す情報を増幅してＳ／Ｎ比
を高めることが可能であり、しかも標識物質の結合が容
易である、高感度かつ簡便な測定方法を提供するもので
ある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
になされた本願請求項１の発明は、 Ａ；以下（ア）から（エ）を接触させ、試料中に測定対
象物質が存在する場合には（ア）、（イ）及び（ウ）か
らなる結合体の生成が測定対象物質の存在量に依存して
競合的に阻害されるようにし、（ア）測定対象物質、下
記（イ）及び（ウ）における物質と特異的に結合し得る
物質、（イ）上記（ア）と特異的に結合し得る物質であ
って標識核酸と結合したもの（ウ）上記（ア）と特異的
に結合し得る物質であって標識核酸と結合したもの
（エ）試料（ここで前記（ア）の物質は少なくとも同時
に前記（イ）及び（ウ）と結合して結合体を生成可能で
あり、（イ）及び（ウ）の標識核酸は同一又は異なる配
列を有し、かつ、互いに連結され得る末端を有するもの
であり、そして（イ）及び（ウ）の物質は同一又は異な
る物質である） Ｂ；（イ）及び（ウ）の標識核酸を連結し、 Ｃ；このようにして連結された核酸の、少なくとも連結
部分を含む部分を増幅し又は標識核酸が連結されたこと
を示す核酸の合成を生起し、 Ｄ；増幅された核酸を検出し、その結果を測定対象物質
の存在又は存在量と関連付ける、 との工程からなる、測定対象物質の測定方法である。

【０００８】本願請求項２の発明は前記請求項１の発明
に係り、前記（イ）及び（ウ）の標識核酸が共に一本鎖
ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ又は二重鎖ＤＮＡであることを特
徴とする。本願請求項３の発明は前記請求項２の発明に
係り、前記標識核酸が共に二重鎖ＤＮＡであり、そして
その連結され得る末端は平滑末端であることを特徴とす
る。本願請求項４の発明は前記請求項１の発明に係り、
前記標識核酸の連結が酵素によって実施されることを特
徴とする。そして本願請求項５の発明は前記請求項１の
発明に係り、前記測定対象物質と特異的に結合する物質
が抗体、ペプチド、核酸、ストレプトアビジン又はレセ
プターから選ばれることを特徴とする。以下本発明を詳
細に説明する。

【０００９】抗原結合能をもった抗原認識分子を核酸で
標識しておき、抗原を介して抗原認識分子同士を近接さ
せ、結果的に標識核酸を近接させた状態で核酸のライゲ
ーション反応を起こさせると、抗原が存在する場合と存
在しない場合でライゲーション効率に差が出ることが見
出された。通常核酸のライゲーション反応は核酸濃度が
高いほど進行しやすいため、遺伝子組替え技術のなかで
は、核酸を連結させる場合に高濃度の核酸で反応を行な
ったり、ポリエチレングリコールを反応系に添加し、核
酸同士を会合させて連結反応を行っている。しかしなが
ら、上記知見では、抗原認識物質が抗原を介して近接す
ることで標識核酸も近接し、核酸が局所的に高濃度にな
った結果、核酸のライゲーション効率が高くなったもの
である。この結果、抗原が存在しない場合には核酸の局
所的な濃度上昇が起こらないため、ライゲーション効率
は低いままである。

【００１０】上記知見を利用すれば、ライゲーション反
応等によって標識核酸が連結されたか否かを検出するこ
とにより、試料中に抗原（測定対象物質）の存在又はそ
の存在量を測定することが可能となる。しかしながら、
連結された標識核酸は微量であるため、そのままでは検
出が困難である。そこで本願発明では、連結されていな
い標識核酸は増幅せず、連結された標識核酸のみを増幅
等することで、ライゲーション等による標識核酸の連結
という情報を増幅するものである。

【００１１】本願発明で使用する（ア）の、測定対象物
質、（イ）及び（ウ）における物質と特異的に結合する
物質（以下「認識物質」とする）は、抗体、ペプチド、
核酸、ストレプトアビジン、レセプター等が具体例とし
てあげられるが、少なくとも前記（イ）及び（ウ）と同
時に結合して（ア）、（イ）及び（ウ）からなる結合体
を生成可能であれば特に制限はない。測定対象物質は、
前記認識物質に特異的に結合して前記結合体の生成を競
合的に阻害可能なものであれば良いが、代表的なものと
して例えばハプテン、低分子抗原、蛋白質、ウイルス粒
子、細胞、バクテリア、菌体等を例示することができ
る。むろん本願発明では核酸をも測定対象物質として測
定可能であるが、配列が既知の核酸に対しては、単に当
該核酸に後述するような増幅方法を適用することによっ
ても測定が可能である。

【００１２】上記（イ）及び（ウ）における物質（以下
「同等物質」とする）は、認識物質との特異的結合性に
おいて測定対象物質と同等であれば、認識物質との結合
力（親和力）は測定対象物質と異なっていても良い。即
ち、本願発明では測定対象物質が存在しない場合には
（ア）、（イ）及び（ウ）の結合体が生成されるが、測
定対象物質が存在する場合にはその生成が競合的に阻害
されるようなものであれば制限はない。ここで（イ）及
び（ウ）における同等物質の認識物質に対する結合力
（親和力）が測定対象物質のそれよりも弱い場合には、
比較的少量の測定対象物質の存在により前記結合体の生
成阻害が顕著となり、比較的低濃度の測定対象物質の測
定に有利である。逆に（イ）及び（ウ）における同等物
質の認識物質に対する結合力（親和力）が測定対象物質
のそれよりも強い場合には、前記結合体の生成阻害に比
較的多量の測定対象物質が必要となり、比較的高濃度の
測定対象物質の測定に有利となる。具体的に同等物質
は、例えば認識物質が抗体である場合には、少なくとも
認識物質との免疫反応特異性において測定対象物質と同
等であれば良い。同等物質としては、更に具体的には、
例えば測定対象物質そのもの、測定対象物質が蛋白質で
ある場合には例えばその部分的ペプチド、測定対象物質
がウイルス粒子、細胞、バクテリア又は菌体である場合
には例えばその断片等であることが好ましい。

【００１３】上記（イ）及び（ウ）において同等物質と
結合させる標識核酸は同一又は異なる配列を有し、か
つ、互いに連結され得る末端を有するものであれば一本
鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＲＮ
Ａの中から自由に選ぶことができ、その長さ等に特に制
限はない。これら標識核酸は最終的に後述するような方
法により増幅可能な核酸であれば制限はないため、例え
ばＤＮＡ−ＲＮＡキメラ遺伝子なども利用することがで
きる。なお標識核酸の安定性を考えると、特に二本鎖Ｄ
ＮＡが好ましい。また夾雑物として核酸を含有する試料
中の測定対象物質に対して本願発明を適用する場合に
は、連結された標識核酸を夾雑核酸から分離した後に後
述する増幅を行う場合を除き、前記標的核酸は、後述す
る増幅等により少なくともそれら夾雑核酸とは区別し得
るような核酸が増幅されるようにデザインする。

【００１４】同等物質と結合させる標識核酸の連結され
る末端は、互いに相互作用しないものであることが好ま
しい。例えばかかる末端が相補的である一本鎖ＤＮＡ等
を使用すると、測定対象物質が存在しない状態でも核酸
同士の相互作用により近接し、ライゲーション反応等が
進行する可能性があるからである。従って本願発明にお
ける好適な標識核酸の末端はかかる相互作用を低減し得
るものである。例えば好適な標識核酸として平滑末端を
有する二本鎖ＤＮＡを例示できる。また他にも、上記の
ような相互作用が生じてもライゲーション反応等が生じ
ないような立体構造を有する核酸を使用することが例示
できる。なお二本鎖ＤＮＡを標識核酸とする場合には、
ライゲーション等によりそれらを連結する際の効率を高
めるため、各５’末端をリン酸化しておくことが好まし
い。

【００１５】上記（ア）、（イ）、（ウ）及び（エ）を
接触させることにより、試料中に存在する測定対象物質
の量（濃度）に存在した量（濃度）の結合体が生成す
る。すなわち測定対象物が多量に存在している場合には
測定対象物質と結合する（ア）の量が増えるため、結合
体の生成量は減少する。（ア）、（イ）、（ウ）及び
（エ）の接触は、同時、順次、或いは２つ以上を同時に
接触させた後、残りを順次又は同時に接触させる等すれ
ば良い。

【００１６】前記結合体が生成すると、前記（イ）及び
（ウ）の標識核酸が近接する。そこでこれら標識核酸を
連結する。連結方法としては酵素を用いる方法、ハイブ
リダイズさせる方法、化学的に結合させる方法等が例示
できるが、操作の容易性等の観点から酵素を用いて核酸
をライゲーションする方法が好ましい。かかる酵素とし
ては、例えばＴ４−ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ、Ｅ．Ｃｏｌ
ｉ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ等の公知酵素を例示できる。
標識核酸の連結を完了した後は、（ア）と（イ）又は
（ウ）は遊離した状態となっていても支障はない。従っ
て、例えば標識核酸として二本鎖核酸を用い、後述する
増幅において該核酸をいったん一本鎖状態とするために
加温処理するような場合であっても、該処理によって
（イ）又は（ウ）が遊離することに留意する必要がな
い。

【００１７】連結した標識核酸（以下「連結核酸」とす
る）の増幅方法は、連結核酸中の少なくとも連結部分を
含む部分を増幅するか、または、連結核酸が生成された
ことを示す核酸（以下「レポーター核酸」とする）の合
成を生起し得るものであれば特に制限されない。例えば
ＰＣＲ法やＮＡＳＢＡ法等の核酸増幅方法を用いて該部
分（及び／又は該部分の相補的な核酸）を実施しても良
いし、また例えば標識核酸としてともに二本鎖ＤＮＡで
あって、一方にはＲＮＡ合成を生起し得るプロモーター
遺伝子の一部が含まれ、他方には該プロモーター遺伝子
の残りの部分とその下流側に接続されたレポーター核酸
が含まれるような標識核酸を用いたり、或いは一方には
ＲＮＡ合成を生起し得るプロモーター遺伝子が含まれ、
他方にはレポーター核酸が含まれるような標識核酸を用
い、生成される連結核酸においては該レポーター核酸
（ＲＮＡ）が生成されるようにしておき、連結核酸の生
成後にＲＮＡポリメラーゼを作用させる等しても良い。
より具体的には、例えば連結核酸としてＭＲＳＡのｍｅ
ｃＡ遺伝子が生成するような標識核酸を用いた場合で
は、例えば本願出願人が特願平１２−１７９３９４号に
開示したような増幅方法を使用することができる。また
前記プロモーター遺伝子としては例えばＴ３、Ｔ７、Ｓ
Ｐ６プロモーター等を例示でき、レポーター遺伝子とし
ては例えばルシフェラーゼ遺伝子等を例示することがで
きるが、これら以外であっても適宜使用することができ
る。

【００１８】以上のようにして連結核酸中の少なくとも
連結部分を含む部分を増幅するか、または、連結核酸が
生成されたことを示すレポーター核酸の合成を生起した
後に、増幅された核酸又は合成されたレポーター核酸を
検出し、その結果から試料中に測定対象物質が存在した
か否か、更にはその存在量を測定する。前記検出方法と
しては、例えば、電気泳動による検出方法、カラムクロ
マトグラフィーで分離した後に検出する方法等、通常行
われている方法であれば特に制限なく使用することがで
きるが、検出に当たって増幅された核酸等の分離を必要
としない検出方法を使用することが特に好ましい。この
特に好ましい検出方法として、増幅等された核酸の検出
をリアルタイムで行うことのできるリアルタイムモニタ
リング方法がある。かかる方法では前記増幅等をリアル
タイムで検出できるため、検出時間の短縮と定量が可能
になる。例えば本出願人らが特開平８−２１１０５０号
に開示した方法を例示できる。

【００１９】以上のようにして検出を行った結果の関連
付けは、該結果を既知濃度の測定対象物質含有試料につ
いて同様の操作を行った結果と比較等することにより行
う。かかる関連付けは、例えば核酸測定や免疫測定の分
野において公知の工程である。

【００２０】

【発明の実施の形態】以下本願発明をさらに詳細に説明
するために実施例を示すが、本願発明はこれら実施例に
限定されるものではない。

【００２１】実施例１ ビオチン化核酸の調製 ビオチン標識した２種類の核酸を次のように調製した。
まずｐＵＣ１１８を鋳型に、ＰＣＲ法でビオチン標識核
酸を調製した。プライマーとして使用した核酸の配列は
５’末端をビオチン化した配列番号１と配列番号２を用
い、ＰＣＲ反応で増幅後、高速液体クロマトグラフィー
で精製した（カラム：Ｇ３０００ＳＷＸＬ（商品名、東
ソー（株）製）、溶離液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ
ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、流速：１ｍｌ／
ｍｉｎ、検出：２６０ｎｍの吸収）。その後、制限酵素
（ＰｖｕＩＩ）でビオチン化されていない側の末端を切
断することで、５’末端がリン酸化されている、平滑末
端二本鎖ＤＮＡ（全長１７３ｂｐ）を得た。

【００２２】次にアセテートキナーゼ遺伝子を鋳型にも
う一つのビオチン化核酸をＰＣＲ法で調製した。プライ
マーとして５’末端をビオチン化した配列番号３及び
５’末端をリン酸化した配列番号４の核酸を用いてＰＣ
Ｒ反応で増幅後に、高速液体クロマトグラフィーで精製
した（１７９ｂｐ）。なお２種類の核酸は、エタノール
沈殿を行った後に、２６０ｎｍの吸収から濃度を検定し
た。

【００２３】実施例２ ライゲーション反応の初期条件
の決定 上記で調製したDNAを用いてライゲーション反応の条件
設定を行った。まず１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ Ｄ
ＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ緩衝液に、ビオチン化ＤＮＡフラグメントを９００ｎ
Ｍから７．２ｎＭになるように加え、更にＴ４ ＤＮＡ
Ｌｉｇａｓｅ（商品名、宝酒造（株）製）をそれぞれ
１００から３．７Ｕ／ａｓｓａｙになるように添加し、
１６℃で４５分間反応させた（反応液量３０マイクロリ
ットル）。その後、電気泳動することで核酸を分離し、
ライゲーション効率を測定した。

【００２４】結果を図１に示した。その結果、（１）高
DNA濃度（９００、１８０ｎＭ）ではＤＮＡを近接させ
なくてもライゲーション反応は進行していること、
（２）３．７Ｕの酵素量では少なすぎること、が分かっ
た（９００ｎＭと１８０ｎＭを比較してもバンドの濃さ
は変化していないため）。

【００２５】そこで初期条件として、アッセイあたりの
酵素量は３３．３Ｕとし、反応温度および時間は１６
℃、４５分とした． 実施例３ ストレプトアビジンダイナビーズを用いたラ
イゲーション効率の向上 実施例２で求めた条件を基本にして、核酸濃度を７２ｐ
Ｍ、７．２ｐＭの２種類に変化させ、さらにストレプト
アビジン固定化ダイナビーズ（商品名、ＤＹＮＡＬ社
製）を１０、１、０．１、０．０１マイクログラム添加
し、ライゲーション反応を起こさせた。終濃度が１ｍＭ
になるようにビオチンを添加した後、９５℃で５分間加
熱し、ストレプトアビジンに結合している核酸を溶液中
に遊離させた。その後、ライゲーション産物を1マイク
ロリットルとり、2種類のＰＣＲプライマー（配列番号
１及び配列番号３）を用いてライゲーション産物を２５
サイクルのＰＣＲ反応で増幅した。その後、ＰＣＲ産物
を電気泳動することで増幅バンドの強度比を比較した。

【００２６】結果を図２に示した。その結果、ダイナビ
ーズの添加によりライゲーション効率が向上しているこ
とが示された。

【００２７】実施例４ ストレプトアビジンを用いたラ
イゲーション効率の向上 担体に固定化されていないストレプトアビジンでのライ
ゲーション効率を評価した。まず、核酸濃度を７２ｐＭ
から７．２ａＭまで変化させた条件でライゲーション反
応を行い、ストレプトアビジンが無い条件でのライゲー
ション効率を観察した。

【００２８】結果を図３に示した。この結果より、核酸
濃度７．２ｐＭでライゲーション反応を行い、３０サイ
クルのＰＣＲ反応を行った後に電気泳動でバンドを検出
する測定系を基本条件にして、ストレプトアビジンの添
加でライゲーション効率が向上するかを調べた。

【００２９】ストレプトアビジンの添加量を３０ｐｍｏ
ｌから３×１０^-7ａｍｏｌまで変化させ、ライゲーショ
ン効率がどのように変化するかを調べた。その結果を図
４に示した。この図からも明らかなように、３ｆｍｏｌ
から３ａｍｏｌの間でライゲーション効率が向上してい
ることが示された。ストレプトアビジンの濃度が高いと
ころでライゲーション効率が低下するのは、ビオチン化
抗体よりストレプトアビジンの比率が高すぎるために、
近接効果が出ていないためである。

【００３０】実施例５ 抗ビオチン抗体測定系の構築 前項の反応条件で抗ビオチン抗体の濃度を種々変化させ
た時の、ライゲーション効率の変化を観察した。その結
果を図５に示した。図５から明らかな様に、抗ビオチン
抗体を１８ａｍｏｌから１．８ｐｍｏｌの範囲で添加す
ることで、ライゲーション効率が向上している事が明ら
かになった。

【００３１】実施例６ ビオチン測定系の構築 ビオチン化核酸濃度７２ｐＭ、抗ビオチン抗体の濃度６
０ｐＭの条件、ビオチン化核酸濃度７．２ｐＭ、抗ビオ
チン抗体の濃度６ｐＭの条件に種々の濃度のビオチンを
添加してライゲーション効率の変化をみた。その結果を
図６に示した。図６から明らかなように、ライゲーショ
ン効率は添加するビオチンの量に従い濃度依存的に低下
することが明らかとなった。また、ビオチン化核酸濃度
が低濃度の方がビオチンを高感度に測定することが出来
た。

【００３２】実施例７ ビオチンＡＣ５測定系の構築 ビオチン化核酸濃度７２ｐＭ、抗ビオチン抗体の濃度６
０ｐＭの条件、ビオチン化核酸濃度７．２ｐＭ、抗ビオ
チン抗体の濃度６ｐＭの条件に種々の濃度のビオチンＡ
Ｃ５を添加してライゲーション効率の変化をみた。その
結果を図７に示した。図７から明らかなように、ライゲ
ーション効率は添加するビオチンの量に従い濃度依存的
に低下することが明らかとなった。またビオチン化核酸
濃度が低濃度の方がビオチンＡＣ５を高感度に測定する
ことが出来た。

【００３３】

【発明の効果】上記説明した本願発明の測定方法では、
測定対象物質の存在に起因して（ア）、（イ）及び
（ウ）の結合体生成が競合的に阻害され、標識核酸が近
接できなくなり、標識核酸の連結率が低下して連結核酸
の生成数が減少し、最終的には測定対象物質に反比例し
て連結核酸等の増幅や連結核酸が生成されたことを示す
核酸の合成が促進される。従って、ＦＲＥＴでは抗体が
近接したことを示す情報を増幅してＳ／Ｎ比を高めるこ
とができないという課題は本願発明では解決されてお
り、また他の方法に存在していた酵素の特定の場所に抗
原を導入するのが非常に困難であるという課題も解決さ
れている。

【００３４】以上のように本願発明は、同等物質が近接
したことを示す情報を増幅してＳ／Ｎ比を高めることが
可能であり、しかも標識核酸の結合が容易であるという
優れた特徴を有した、高感度かつ簡便な測定方法であ
る。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TOSOH Corporation <120>ＤＮＡライゲーション反応を用いる均一競合系高感度測定方法 <130> 211-0470 <160> 10 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ５’末端をビオチン化したプライマー <400> 1 caggaaacag ctatgac 17 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ５’末端をビオチン化したプライマー <400> 2 gctatagcct cttcgctatt acgccagctg 30 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ５’末端をビオチン化したプライマー <400> 3 gccctgcctt acaacctg 18 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ５’末端をリン酸化したプライマー <400> 4 gcatttaccg ttgcggatag c 21

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２の結果を示す図であり、ＤＮＡ濃度と
酵素量を変化させてライゲーション効率を比較した図で
ある。

【図２】実施例３の結果を示す図であり、ＤＮＡの濃度
とＤｙｎａｂｅａｄｓの量を変化させて、ＰＣＲサイク
ルを変えて、ライゲーション産物の量を比較したもので
ある。

【図３】実施例４の結果を示したもので、核酸濃度とＰ
ＣＲサイクル数の最適値を調べたものである。

【図４】実施例４の結果を示したもので、反応系のスト
レプトアビジンの濃度を変化させて、ライゲーション効
率の変化を見たものである。

【図５】実施例５の結果を示したもので、反応系のＤＮ
Ａの濃度と抗ビオチン抗体の濃度を変化させて、ＰＣＲ
で増幅したときの結果を示したものである。

【図６】実施例６の結果を示したもので、白丸は核酸の
濃度が７２ｐＭの場合、黒丸は核酸濃度が７．２ｐＭの
場合の結果をそれぞれ示す。縦軸には電気泳動後に得ら
れたバンドの強度比を、横軸には添加したビオチンの量
を示した。

【図７】実施例７の結果を示したもので、白丸は核酸の
濃度が７２ｐＭの場合、黒丸は核酸濃度が７．２ｐＭの
場合の結果をそれぞれ示す。縦軸には電気泳動後に得ら
れたバンドの強度比を、横軸には添加したビオチンＡＣ
５の量を示した。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の工程からなる、測定対象物質の測定
   方法； Ａ；以下（ア）から（エ）を接触させ、試料中に測定対
   象物質が存在する場合には（ア）、（イ）及び（ウ）か
   らなる結合体の生成が測定対象物質の存在量に依存して
   競合的に阻害されるようにし、 （ア）測定対象物質、下記（イ）及び（ウ）における物
   質と特異的に結合し得る物質、 （イ）上記（ア）と特異的に結合し得る物質であって標
   識核酸と結合したもの （ウ）上記（ア）と特異的に結合し得る物質であって標
   識核酸と結合したもの（エ）試料 （ここで前記（ア）の物質は少なくとも同時に前記
   （イ）及び（ウ）と結合して結合体を生成可能であり、
   （イ）及び（ウ）の標識核酸は同一又は異なる配列を有
   し、かつ、互いに連結され得る末端を有するものであ
   り、そして（イ）及び（ウ）の物質は同一又は異なる物
   質である） Ｂ；（イ）及び（ウ）の標識核酸を連結し、 Ｃ；このようにして連結された核酸の、少なくとも連結
   部分を含む部分を増幅し又は標識核酸が連結されたこと
   を示す核酸の合成を生起し、 Ｄ；増幅された核酸を検出し、その結果を測定対象物質
   の存在又は存在量と関連付ける。
2. 【請求項２】（イ）及び（ウ）の標識核酸は共に一本鎖
   ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＲＮＡ
   であることを特徴とする、請求項１の測定方法。
3. 【請求項３】前記標識核酸は共に二重鎖ＤＮＡであり、
   そしてその連結され得る末端は平滑末端であることを特
   徴とする、請求項２の測定方法。
4. 【請求項４】前記標識核酸の連結は酵素によって実施さ
   れることを特徴とする、請求項１の測定方法。
5. 【請求項５】前記測定対象物質と特異的に結合する物質
   は抗体、ペプチド、核酸、ストレプトアビジン又はレセ
   プターから選ばれることを特徴とする、請求項１の測定
   方法。