CN117377774A

CN117377774A - 用于敏感分析物检测测定的方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN117377774A
Application number: CN202280036358.2A
Authority: CN
Inventors: 克拉斯·卡兰德; 英瓦尔·彼得松; 英厄拉·弗里德堡
Original assignee: Kavidi Co ltd
Current assignee: Kavidi Co ltd
Priority date: 2021-05-25
Filing date: 2022-05-19
Publication date: 2024-01-09
Also published as: EP4347865A1; AU2022279886A1; WO2022250596A1

Abstract

本发明涉及用于检测样品中的目的分析物的方法，其包括使用能够与所述分析物特异性结合的配体、模板多核糖核苷酸、多种标记的脱氧核糖核苷酸三磷酸和具有逆转录酶活性的酶，其中所述配体包含长度为18至40个核苷酸的引物寡脱氧核糖核苷酸，所述模板多核糖核苷酸比所述引物寡脱氧核糖核苷酸长并且具有与所述引物寡脱氧核糖核苷酸至少部分互补的序列，其中所述分析物通过检测由所述酶合成的任何经标记DNA链来检测。本发明还涉及包含用于进行这样的方法之试剂的试剂盒。

Description

用于敏感分析物检测测定的方法及其试剂盒

技术领域

本发明一般性地涉及生物分子的检测领域。更具体地，本发明涉及用于放大可检测信号的核酸聚合在配体-分析物结合测定中的用途。

背景技术

配体结合测定代表了鉴定和定量宽范围化合物，例如药物、抗原和抗体的强有力工具。一类配体结合测定使用抗体作为配体结合组分。存在多种形式的酶免疫测定，例如ELISA(酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay))和CLIA(化学发光免疫测定(chemiluminescence immunoassay))。经典的酶免疫测定在最佳情况下达到1pg/ml的灵敏度。对于分子量(molecular weight，Mw)约等于20千道尔顿的典型蛋白质，1pg/ml等同于约3×10⁷个分子/ml或50阿摩尔(attomole)/ml。该灵敏度已被认为足以用于几乎所有生物医学任务。

然而，近年来生物医学诊断中的许多新的挑战表明，对于低丰度生物标志物的最佳检测需要将灵敏度提高数百倍。提高灵敏度的另一个明显优势是生物基质的干扰作用可通过简单的样品稀释来抵消，而不降低测定性能。

在经典的酶免疫测定中，由于信号生成系统的限制并由于系统背景(即系统中的物质与信号生成组分的非特异性结合)，低于一定数目的分子是不可能检测到的。

为了满足这些需求，已经出现了具有提高的灵敏度的数种技术，例如DNA增强的免疫测定(免疫聚合酶链式反应(immuno-Polymerase Chain Reaction，iPCR))(Cantor etal,Science,Vol.258,2Oct.1992,US 5665539)、电化学发光(Wei and Wang 2011)和单分子计数(Todd et al 2007)。下文将主要集中于免疫-PCR，其是与本发明最相关的现有技术。

国际专利公开no.WO 91/17442描述了用于增强免疫测定中的信号的蛋白质/核酸杂交探针。所述探针包含蛋白质部分、作为DNA依赖性RNA聚合酶的启动子发挥功能的双链多核苷酸和针对该启动子的单链或双链模板。所述蛋白质部分是能够作为与已知抗原特异性结合的抗体发挥功能的多肽。通过使用标记的互补多核苷酸探针在单独的步骤中对转录产物进行定量。

上文提到的Cantor et al,US 5665539,Science,Vol.258,2Oct.1992已经报道了将寡核苷酸与抗体连接以允许检测结合的抗原。对生物素和免疫球蛋白G二者均具有紧密且特异性的结合亲和力的链霉亲和素蛋白-A嵌合体用于将生物素化的DNA特异性地连接至已经固定在微滴定板孔上的抗原-单克隆抗体复合物。然后通过PCR(聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction))扩增连接的DNA的区段。PCR产物的分析允许检测低至9.6×10^-22摩尔)，其与常规ELISA相比是显著的改进。然而，在Cantor et al.中需要额外的步骤用于添加生物素化的试剂和结合蛋白。每次测定可包括多达20次洗涤步骤以去除过量的试剂并使测定不含非特异性结合试剂。这些试剂的添加和洗涤步骤增加了免疫-PCR操作的复杂性和时间。

Hendrickson et al.,Nucleic Acids Research,1995,Vol 23,No.3报道了对Cantor et al.测定的改进，降低了复杂性。通过DNA与抗体直接共价键联，通过用DNA标记抗体省去了数个反应和洗涤步骤。这些早期免疫PCR测定中的PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上分离并通过多种方法检测。此后，通过使用更高效的用于检测PCR产物的方法改进了用于检测/定量核酸和蛋白质二者的测定。现代的实时PCR测定利用荧光团标记的核苷酸，其在所需波长下激发之后可在每个扩增循环之后连续测量(对于综述，参见Kralik,&Ricchi2017)。

理论上，免疫PCR能够将配体结合测定的检测灵敏度提高数个数量级。然而，所述改进在实践中通常限于三至十倍(例如Simonova et al2018)。关键的限制因素通常是系统背景。提高阳性信号的标记系统通常也提高来自背景对照的信号。US2005/0233351A1解决了这些问题。将对抗原的不同决定簇具有特异性并与可交联寡核苷酸缀合的两种不同抗体与抗原结合。扩增寡核苷酸，从而将仅扩增已经相互交联的这样的寡核苷酸。以这种方式，避免了或者至少降低了非特异性背景信号。

影响所有PCR测试的基本问题也阻碍了免疫PCR。该系统对污染敏感，从而导致假阳性。另一个障碍是设计相关的扩增对照以允许定量检测。此外，存在对免疫PCR更为特殊的一系列问题，例如不利地影响抗体-抗原相互作用的反复的高温循环。如果抗体和抗原二者的结构是肽或蛋白质，则其可受到影响，导致较弱的抗体-抗原结合。因此，由于信号放大产生的灵敏度增益可被抗体-抗原结合强度的降低所抵消。

WO2006/053380公开了筛选样品中分析物的存在或不存在的方法，其包括使用例如对分析物具有特异性并与多核苷酸缀合的抗体，所述方法包括延伸多核苷酸或产生互补多核苷酸，并检测如此延伸或产生的多核苷酸。根据该方法实现显著的信号放大所需的长单链延伸多核苷酸将是脆弱的。洗涤操作期间的机械制动和源自样品和/或试剂的核酸酶的作用二者均将干扰、产生不规律现象(irregularity)、限制信号放大并阻碍该方法的有用性。WO2006/053380没有详细说明或实现与互补多核苷酸的产生相关的实施方案，并且没有提供基于该实施方案的实例。因此，尚不清楚与标准ELISA测试相比，该模型是否实际上有用和/或提供了提高的检测灵敏度。

为了避免疑问，以上关于现有技术的不足或缺点的任何讨论均基于本发明人从本发明的角度对技术的理解，并且不应被视为承认这样的不足或缺点是本领域中是公认的，或者对于本领域普通技术人员是已知的、理解的或以其他方式显而易见的。

发明内容

本发明旨在解决现有技术的至少一些缺点。因此，提供了用于检测生物或化学分析物的简单且灵敏的方法，该方法不需要温度循环或温度超过37℃，需要很少的步骤和试剂，并且仅需要标准设备。

在第一方面中，本发明涉及用于检测样品中的目的分析物的方法，其包括：

-使能够与所述分析物特异性结合的第一配体与所述样品在有助于所述配体与所述分析物特异性结合的条件下接触，其中所述第一配体包含能够与所述分析物特异性结合的结合部分和与所述结合部分结合的引物寡脱氧核糖核苷酸，其中所述引物寡脱氧核糖核苷酸的长度为18至40个核苷酸；

-从所述样品中去除未结合的第一配体；

-使结合的第一配体与模板多核糖核苷酸、多种标记的脱氧核糖核苷酸三磷酸和具有逆转录酶活性的酶接触，所述模板多核糖核苷酸比所述引物寡脱氧核糖核苷酸长并且具有与所述引物寡脱氧核糖核苷酸至少部分互补的序列；

-在适于通过所述酶合成经标记DNA链的条件下孵育包含连接的引物寡脱氧核糖核苷酸的所述结合的第一配体、所述模板多核糖核苷酸、所述标记的脱氧核糖核苷酸三磷酸和所述酶；以及

-检测任何合成的经标记DNA链。

在一个实施方案中，所述引物寡脱氧核糖核苷酸选自包含所有四种碱基A、G、T和C或其子集的寡脱氧核糖核苷酸，或者选自包含单一碱基的寡脱氧核糖核苷酸，优选寡脱氧胸苷。

在一个实施方案中，所述标记的脱氧核糖核苷酸是标记的脱氧尿苷三磷酸(deoxyuridine triphosphate，dUTP)，例如溴-dUTP或碘-dUTP，优选溴-dUTP，并且所述模板多核糖核苷酸是多核糖腺苷酸。

在一个实施方案中，所述引物寡脱氧核糖核苷酸的长度为22至40个核苷酸。

在一个实施方案中，所述模板多核糖核苷酸的长度为10²至10³个核苷酸，优选2*10²至5*10²个核苷酸。

在一个实施方案中，所述具有逆转录酶活性的酶是真核生物聚合酶，例如DNA聚合酶γ；病毒聚合酶，例如逆转录病毒逆转录酶，优选HIV或M-MuLV逆转录酶；或者细菌聚合酶，例如来源于嗜温细菌的细菌聚合酶，优选大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I的Klenow片段，或者来源于嗜热细菌的细菌聚合酶，优选来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(BacillusStearothermophilu)的Bst 3.0。

在一个实施方案中，所述具有逆转录酶活性的酶选自DNA聚合酶γ、HIV或M-MuLV逆转录酶、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段和来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的Bst 3.0。

在一个实施方案中，孵育步骤在恒温下，优选在37℃下进行30分钟至4小时，优选进行1小时。

在一个实施方案中，所述检测通过包括以下步骤的检测方法进行：

-使能够与所述经标记DNA链特异性结合的第二配体与所述合成的经标记DNA链在有助于所述第二配体与所述DNA链特异性结合的条件下接触，其中所述第二配体包含能够与所述合成的经标记DNA特异性结合的结合部分以及共价连接的酶；

-从所述样品中去除未结合的第二配体；

-添加针对所连接的酶的底物，所述底物在被该连接的酶切割之后产生可检测信号；以及

-检测所述信号。

在一个实施方案中，所述第二配体是与所合成的经标记DNA特异性结合的抗体，其上共价连接了酶，例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

在一个实施方案中，所述共价连接的酶作用于底物以产生比色信号、荧光信号、化学发光信号或电化学信号。

在一个实施方案中，所述共价连接的酶是碱性磷酸酶，其作用于底物以产生作为可检测信号的化学发光信号。

在一个实施方案中，对所述目的分析物的检测是定量检测。

在第二方面中，本发明涉及试剂盒(kit of parts)，其包含第一配体、模板多核糖核苷酸、多种标记的脱氧核糖核苷酸三磷酸和具有逆转录酶活性的酶，所述第一配体包含能够与目的分析物特异性结合的结合部分和与所述结合部分结合的长度为18至40个核苷酸的引物寡脱氧核糖核苷酸，所述模板多核糖核苷酸比所述引物寡脱氧核糖核苷酸长并且具有与所述引物寡脱氧核糖核苷酸至少部分互补的序列。

在一个实施方案中，所述标记的脱氧核糖核苷酸三磷酸是标记的脱氧尿苷三磷酸(dUTP)，例如溴-dUTP或碘-dUTP，优选溴-dUTP，并且所述模板多核糖核苷酸是多核糖腺苷酸。

在一个实施方案中，所述具有逆转录酶活性的酶是真核生物聚合酶、病毒聚合酶或细菌聚合酶，例如DNA聚合酶γ、HIV或M-MuLV逆转录酶、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段或来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的Bst 3.0。

在一个实施方案中，所述试剂盒还包含：能够与所述标记的脱氧核糖核苷酸特异性结合的第二配体，所述第二配体还包含共价连接的酶；以及针对所述酶的底物。

在一个实施方案中，所述第二配体是单克隆抗体，其上共价连接了酶，例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

附图说明

图1示出了根据本发明的聚合酶增强的信号放大模型的示意性描述。

图2示出了在本发明的一个实施方案中产生的信号与引物标记的配体的量之间的关系，其示出了系统检测和定量用作分析物检测标记的引物的能力。

图3示出了具有不同长度的寡脱氧胸苷引物的配体与信号之间的关系。

图4示出了在引物延伸步骤中通过真核生物聚合酶、逆转录病毒聚合酶和细菌聚合酶进行逆转录的用途。

图5示出了不同量的标记的配体与信号之间的关系。

图6示出了使用的不同量的逆转录酶活性与信号之间的关系。

图7示出了两种逆转录病毒逆转录酶的逆转录反应时间与信号之间的关系。

图8示出了在引物延伸步骤中不同的标记的脱氧核糖核苷酸三磷酸的用途。

图9示出了本发明在抗原捕获ELISA中的实施。

定义和缩写

“odTX”是长度为X个脱氧胸苷核苷酸单位的寡脱氧胸苷的缩写，即“odT22”是由22个脱氧胸苷组成的寡核苷酸。

“prA”是单链多核糖腺苷酸的缩写。

ELISA＝酶联免疫吸附测定

PCR＝聚合酶链式反应

RT＝逆转录酶(Reverse transcriptase)

SARS＝严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome)

CoV＝冠状病毒(Corona Virus)

NIBSC＝国家生物标准与控制研究所(National Institute for BiologicalStandards and Control)(UK)

M-MuLV＝莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine leukemia virus)

HIV＝人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency virus)

HRP＝辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)

AP＝碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)

Bst＝嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus Stearothermophilus)

Pol-G＝人γ聚合酶

具体实施方式

本发明涉及用于检测，特别是定量检测样品中的目的分析物的方法，其包括使用能够与分析物特异性结合的配体、模板多核糖核苷酸、多种标记的脱氧核糖核苷酸三磷酸和具有逆转录酶活性的酶，其中所述配体包含长度为18至40个核苷酸的引物寡脱氧核糖核苷酸，所述模板多核糖核苷酸比引物寡脱氧核糖核苷酸长并且具有与引物寡脱氧核糖核苷酸至少部分互补的序列，其中所述分析物通过检测由所述酶合成的任何经标记DNA链来检测。本发明还涉及包含用于进行这样的方法之试剂的试剂盒。

本发明利用能够与目的分析物特异性结合的亲和配体，例如抗体。亲和配体是用在构成引物延伸步骤的逆转录反应中充当引物的短单链脱氧寡核苷酸标记的。不需要温度循环或升高温度，只需要在恒定的生理温度下进行一次孵育。在逆转录步骤中，形成这样的DNA-RNA螺旋，其中并入DNA链中的脱氧核糖核苷酸被标记，使得可在后续检测步骤中检测到。

在本发明中，对于与分析物分子结合的每种这样的亲和配体，在DNA-RNA杂交体中的新制成的DNA链中的标记的脱氧核糖核苷酸将是用于后续信号产生步骤的靶分子。这意味着与其中结合抗体是用于后续信号产生步骤的唯一靶分子(例如第二抗体-酶缀合物)的标准免疫测定相比，每个亲和配体/分析物复合物结合更多的信号产生缀合物，为信号放大提供了基础。

与现有技术的免疫-PCR相比，本发明还通过使用一种通用DNA引物序列和一种通用RNA模板用于引物延伸步骤，降低了分析物检测方法中所需核酸试剂的复杂性。两种寡核苷酸/多核苷酸由重复的单核苷酸(例如分别为脱氧胸苷和腺苷)构成。不需要温度循环或升高温度，只需要在生理温度下进行一次孵育。

用于引物延伸的酶促聚合过程是逆转录反应，由此聚合酶酶构建了新的互补DNA链。为此，其需要RNA链以进行复制(模板)、需要短的互补DNA链以开始延伸(引物)并且需要可用作生长链的构建单元(building block)的互补脱氧核苷酸三磷酸(deoxynucleotidetriphosphate，dNTP)。本发明中使用的dNTP是经标记的以用于促进新合成的DNA链的检测。

使用逆转录反应而不是(如免疫PCR中的)DNA依赖性DNA聚合酶反应的一个优点是与DNA聚合酶活性相比，逆转录酶活性在生物样品中不常见得多。来自内源性DNA聚合酶的污染可导致背景信号提高和阴性样品中的假阳性结果。特定的逆转录酶具有逆转录病毒或合成来源，并且哺乳动物细胞中逆转录酶活性的基线水平非常低。一些DNA聚合酶可被诱导以在体外系统中进行逆转录，但是逆转录酶活性比DNA聚合酶活性低得多。

因此，在一个方面中，本发明涉及用于检测样品中的目的分析物的方法，其包括：

-从所述样品中去除未结合的第一配体；

-检测任何合成的经标记DNA链。

在一些实施方案中，所述引物寡脱氧核糖核苷酸选自包含所有四种碱基A、G、T和C或其子集的寡脱氧核糖核苷酸，或者选自包含单一碱基的寡脱氧核糖核苷酸，优选寡脱氧胸苷。

在一些实施方案中，所述引物寡脱氧核糖核苷酸的长度为至少20个核苷酸，例如至少21或22个核苷酸。在一些实施方案中，所述引物寡脱氧核糖核苷酸的长度为不超过40个核苷酸，例如不超过39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、23或22个核苷酸。

在一些实施方案中，所述模板多核糖核苷酸的长度为10²至10³个核苷酸，例如约2*10²至5*10²个核苷酸。在一些实施方案中，本发明利用逆转录酶或具有逆转录酶活性的DNA聚合酶、寡脱氧胸苷(oligo-deoxythymidine，odT)标记的抗体和平均长度为约500个A-碱基的可溶性聚(rA)模板用于引物延伸。在逆转录步骤之后，每个经结合的寡脱氧胸苷(odT)标记的抗体将携带RNA-DNA杂合分子，其中新制成的DNA将由经化学标记的碱基构成。

在一些实施方案中，所述具有逆转录酶活性的酶是真核生物聚合酶、病毒聚合酶或细菌聚合酶，例如DNA聚合酶γ、逆转录病毒逆转录酶(例如HIV或M-MuLV逆转录酶)、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段或来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的Bst 3.0。不同聚合酶的体外持续合成能力根据反应条件而变化，但典型值是2至3分钟的酶引物模板复合物半衰期。

在一些实施方案中，孵育步骤在恒温下，优选在37℃下进行30分钟至4小时，优选进行1小时。通过逆转录病毒逆转录酶(RT)在prA模板上进行体外合成或多或少是渐进性的，其中在37℃下并入速率为10至15个核苷酸/秒(参见例如Hubert et al 1989)。从这些假设可计算出odT引物的酶促延伸将在30至50秒内到达prA₅₀₀模板的末端。仅利用一个模板的传统反应模型将既不为本发明提供足够的信号放大，也不提供与时间成线性的聚合反应。然而，某些聚合酶能够从单个引物开始使用多个模板，产生比模板长度更长的产物。这种类型的反应可通过逆转录病毒逆转录酶和某些其他更混杂的聚合酶进行，并且是体内酶催化反应的体外反映(例如Hubert et al 1989,Lennerstrand et al 1996)。

-从所述样品中去除未结合的第二配体；

-检测所述信号。

在一些实施方案中，其中所述第二配体是与所合成的经标记DNA特异性结合的抗体，其上共价连接了酶，例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。这样的共价连接的酶可作用于底物以产生比色信号、荧光信号、化学发光信号或电化学信号。在一些实施方案中，所述酶是碱性磷酸酶。在一些实施方案中，作用于底物的酶产生作为可检测信号的化学发光信号。许多合适的底物可商购获得，例如AMPPD(CAS no：122341-56-4)和在多种商品名下的即用型底物溶液，例如来自ThermoFisher Scientific的DynaLight^TM。

在一些实施方案中，对所述目的分析物的检测是定量检测。在这些实施方案中，基于检测到的合成的经标记DNA链的量和/或检测到的信号的强度对样品中目的分析物的量或浓度进行定量。如例如实施例4和图5中所示出的，在宽检测范围内，在分析物的量与产生的信号之间存在基本上线性的关系。信号水平还可受到其他因素的影响，例如酶活性的量和聚合反应时间。因此，通过在已知条件(分析物量范围、试剂浓度、反应体积、反应温度、反应时间等)下运行校准测定来在期望的分析物量/浓度范围内建立分析物量/浓度(一方面)与检测到的合成的经标记DNA链的量和/或检测到的信号的强度(另一方面)之间的相关性，可建立根据本发明的测定方法，以用于实际应用。然后，当对样品进行根据本发明的方法时，这样的相关性被用于对样品中的目的分析物的量或浓度进行定量。

图1中提供了根据本发明的方法的一个实施方案的步骤的概述。A)分析物与固相直接或间接地结合。用短引物标记的亲和配体(例如与odT22缀合的抗体)与固定的分析物结合。在孵育之后，通过洗涤来去除未结合的亲和配体。添加反应溶液，其含有与引物至少部分互补的模板、一种或数种经修饰核苷酸三磷酸，以及逆转录反应所需的除引物之外的其他缓冲组分。引物通过碱基配对与模板缔合。B)添加具有逆转录酶活性的酶，并且该酶与引物模板复合物中引物的3’末端结合。C)引发酶促聚合反应。随着引物的延伸，形成了含有经修饰碱基的新的DNA链。新的DNA链保持与RNA模板链碱基配对。D)并入新的DNA链中的经修饰脱氧核糖核苷酸碱基可通过数种任选的方法进行检测，例如使用针对用可检测标记(例如荧光团)标记的经修饰脱氧核苷酸的抗体，或者与切割底物以产生比色信号、荧光信号、化学发光信号或电化学信号的酶缀合的抗体。逆转录酶反应可通过模板转换机制产生跨越多个模板长度的DNA产物。

在一个方面中，本发明涉及试剂盒，其包含第一配体、模板多核糖核苷酸、多种标记的脱氧核糖核苷酸三磷酸和具有逆转录酶活性的酶，所述第一配体包含能够与目的分析物特异性结合的结合部分和与所述结合部分结合的长度为18至40个核苷酸的引物寡脱氧核糖核苷酸，所述模板多核糖核苷酸比引物寡脱氧核糖核苷酸长并且具有与引物寡脱氧核糖核苷酸至少部分互补的序列。这样的试剂盒可用于进行根据本发明的方法。

实施例

材料

DynaLight^TM化学发光AP底物，ThermoFisher

微板发光计，Awareness Technology,Inc

HydroFlex^TM微板洗涤器，Tecan。

Nunc^TM NucleoLink^TM条状物，白色用于发光。ThermoFisher

高结合白色半区域(half-area)微板，Bio-One Greiner

以1μmol-规模合成的具有NH2-C6间隔臂的odT18、odT22和odT30(寡脱氧胸苷)，Eurofins。

Ab201796生物素(B型)快速缀合试剂盒，批号GR3353844-1，Abcam。

SoluLink抗体-寡核苷酸多合一缀合试剂盒，Abcam。

链霉亲和素-碱性磷酸酶(AP)缀合物，ThermoFisher

SuperSignal ELISA Pico鲁米诺/增强剂溶液和SuperSignal ELISA Pico稳定过氧化物酶溶液购自ThermoFisher。

链霉亲和素-HRP N100，ThermoFisher。

SARS-CoV-2刺突蛋白根据Rosendal et al 2020制备。先前已经描述了编码2019-nCoV刺突蛋白的质粒(Wrapp,D.et al.2020)。使用293F系统(Thermo Fisher Scientific)产生重组刺突蛋白。

使用填充有His-纯Ni-NTA树脂(Thermo Fisher Scientific)的柱纯化蛋白质。

人血浆样品

从国家生物标准与控制研究所(NIBSC),Hertfordshire,UK获得用于血清学测定的抗SARS-CoV-2验证小组。其是由23个已知为抗SARS-CoV-2阳性的样品和14个已知为抗SARS-CoV-2阴性的样品构成。

抗SARS-CoV-2免疫球蛋白(人)的WHO国际标准品，NIBSC代码：20/136，从同一来源获得。

聚合酶：

重组莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV)逆转录酶(RT)，New England BioLabs。

基于BH10序列的重组人免疫缺陷病毒(HIV)1RT根据Weber&Grosse(1989)制备。

Klenow DNA聚合酶，大片段，ThermoFisher

重组人γ聚合酶(gamma polymerase，Pol-G)催化亚基，BioSite。

BST 3.0DNA聚合酶，New England BioLabs。

IsoPol SD+，ArticZymes，Norway

抗体和抗体制备物

与碱性磷酸酶(AP)缀合的Bu 20小鼠单克隆小鼠抗BrdU抗体(代码09143)购自Aglient/dako AB。

与AP 805-055-180缀合的牛抗山羊IgG，Jackson Immuno Research

兔抗人IgG(H&L)A18905S，ThermoFisher

兔抗人IgG(H&L)AS10 1499，Agrisera

山羊抗人IgG A18813，ThermoFisher。

山羊抗人IgG Star 125，BioRad

来自人血清的IgG，试剂等级I-2511，Sigma-Aldrich

小鼠IgG，蛋白A纯化的，A66185M-LY，Meridian Life Science。

山羊IgG，纯化的，AS10 875，Agrisera

结合mab DH6/Ad10的配对小鼠抗SARS-CoV-2刺突蛋白购自Native Antigen公司，Oxford，UK

小鼠Bu20a-生物素(BioLegend 339810)

使用的缓冲液：

碳酸盐缓冲液0.05M，pH 9.6

PBS-吐温：PBS med 0.05％吐温20

HIV RT反应溶液：10mM Hepes pH 7.6、32μM BrdUTP、prA 100μg/ml、4mM MgCl₂、2mM精胺、Synperonic A11 0.5％(v/v)、0.2mM EGTA和BSA 0.5mg/ml。

具有IdUTP的HIV RT反应溶液：如上具有32μM BrdUTP而不是32μM BrdUTP的HIVRT反应溶液。

MMuLV RT反应溶液：10mM Hepes pH 7.6、32μM BrdUTP、prA 100μg/ml、6mMMnCl₂、24mM亚精胺、Triton X-100 0.5％(v/v)、0.2mM EDTA、4mM谷胱甘肽和BSA0.5mg/ml

Pol-G反应溶液：25mM Hepes pH 8.0、32μM BrdUTP、prA 100μg/m、0.5mM MnCl₂、100mM NaCl、1mM二硫赤藓糖醇l和BSA 0.66mg/ml。

BST 3.0DNA聚合酶反应溶液：25mM TrisHCl pH 8.8、32μM BrdUTP、prA 100μg/ml、8mM MgSO₄、150mM KCl、0.1％(v/v)吐温20。

板洗涤缓冲液：3mM硼酸、0.75％Triton X-100、0.005％(W/V)硫酸葡聚糖、0.2％ETOH和0.025％NaN₃。

封闭缓冲液：在具有0.05％吐温的PBS中的1％脱脂乳粉。

POLI反应溶液：25mM Hepes pH 8.0、0.67mg/ml BSA、0.5mM MnCl₂、50mM KCl、0.5mM亚精胺、28μg/ml PrA和50μM BrdUTP。

牛乳转移技术优化液主体(Blotto bulk)：脱脂乳粉25mg/ml、Bis-Tris25mM pH7.0、K₂SO₄ 10mM、亚精胺1.0mM、硫酸葡聚糖1.0 1mg/ml、吐温20 0.0.010％、二硫赤藓糖醇2.0mM

方法

从兔抗人IgG抗体中去除小鼠IgG交叉反应物质。

根据制造商的说明，将小鼠IgG与NHS-琼脂糖(GE Healthcare)结合，将凝胶装到2ml柱中，并用PBS洗涤。将PBS中的兔抗人IgG(H&L)Agrisera AS10 1499(75μg/ml)装载到柱上，并且收集流出物并储存在4℃下。

用生物素标记山羊和兔抗人IgG

使用Ab201796生物素(B型)快速缀合试剂盒(批号GR3353844-1)，根据制造商的说明用生物素标记抗人IgG。

用odT22或odT30标记山羊和兔抗人IgG。

使用SoluLink抗体-寡核苷酸多合一缀合试剂盒(目录号A-9202-001)，根据制造商的说明用odT22进行标记。0.5微摩尔(μmolel)的NH2-C6-odT22用于用甲酰苯甲酰胺进行标记。100μl(约55μg)亲和纯化的兔抗人IgG Agrisera AS10 1499用肼基烟酰胺进行标记。然后将两种经修饰生物分子在反应催化剂(苯胺)的存在下混合在一起以形成odT22-IgG缀合物，其最后使用磁性亲和固相进行纯化。odT22标记的IgG的实际产量为14μg(200μL，67μg/ml)。

用odT30进行标记是使用经修改的方案进行的。0.5微摩尔(μmole)的NH2-C6-odT30用于标记100μg亲和纯化的兔抗人IgG Agrisera AS101499。产量为22μg odT30标记的IgG(200μL，110μg/ml)。

用odT30标记Ad10小鼠抗SARS-CoV-2刺突蛋白mab。

用odT30标记Ad10是使用与兔抗人IgG相似的方案进行的。0.125微摩尔的NH2-C6-odT30用于标记100μg亲和纯化的Ad10小鼠抗SARS-CoV-2刺突蛋白mab。产量为60μg odT30标记的IgG(200μL，300μg/ml)。

用生物素标记odT18、odT22和odT30。

使用Ab201796生物素(B型)快速缀合试剂盒(批号GR3353844-1)，根据制造商的说明用生物素标记具有NH2-C6间隔臂的odT18、odT22和odT30(寡脱氧胸苷)。

实施例1：基本聚合酶增强的信号放大模型。

本实施例举例说明了根据本发明的方法检测和定量分析物的能力。与抗体或其他类型的亲和配体连接的寡核苷酸引物在以下实施例中用作分析物检测的标记。在与其靶标结合之后，与亲和配体连接的寡核苷酸可在具有可溶性互补模板并使用经标记核苷酸的一步聚合酶反应中充当引物。然后使用并入的标记检测如此合成的DNA链。

为了举例说明本发明的概念，链霉亲和素被用作模型分析物。能够与分析物特异性结合的第一配体由作为能够与分析物特异性结合的部分的生物素和作为引物寡脱氧核糖核苷酸的odT22组成。模板多核糖核苷酸是prA。标记的脱氧核糖核苷酸是溴脱氧尿苷三磷酸(Bromo-deoxy-Uridine-tri-phosphate，BrdUTP)。具有逆转录酶活性的酶是莫洛尼鼠白血病病毒(MMuLV)逆转录酶。能够与经标记DNA链特异性结合的第二配体是由抗体部分(具有抗BrdU特异性的单克隆小鼠抗体)和酶碱性磷酸酶(AP)组成的缀合物。

生物素化的odT22在白色Nunc^TMNucleoLink^TM条状物板上的固定

将封固在96孔框架中的白色NucleoLink^TM条状物用120μl/孔的在pH9.6的碳酸盐缓冲液中的200ng/ml链霉亲和素包被。使用Hydroflex板洗涤器和板洗涤缓冲液通过仔细的洗涤操作去除未结合的链霉亲和素。

在下一个步骤中，向板上的孔添加120μl生物素-odT22的5倍连续稀释液(范围为1.7×10^-16至1.0×10^-20mol/孔)，使其结合，然后将板再次洗涤。

结合的odT22的检测。

结合的odT可在聚合酶反应中充当引物。用于引物检测的酶促聚合过程是逆转录酶(RT)反应，由此该酶构建了新的DNA链。为此，其需要RNA模板以进行复制，需要短的互补DNA链以开始延伸(引物)并且需要可用作生长链的构建单元的互补脱氧核苷酸三磷酸。在本实施例中，反应在具有生物素-odT22的结合连续稀释液的96孔板(孔体积300μl)上进行，其中odT22在聚合过程中充当引物。

与odT引物互补的模板是prA，即仅由一个核苷酸碱基腺嘌呤构成的单链多核糖腺苷酸，其平均链长度为约500个核苷酸并且包含在RT反应溶液中。

RT反应所需的其他组分也是MMulv RT反应混合物的一部分，其包含BrdUTP(溴脱氧尿苷三磷酸)。BrdUTP提供通过重组M-Mulv RT(进行聚合的酶)添加至引物中的核苷酸碱基。

聚合酶反应

向板上的每个孔添加9.1U/孔的MMuLV RT来开始聚合酶反应，并且新产生的BrdU链的相对量将与孔中固定的odT22引物的量成比例。

聚合酶反应是温度依赖性的并且反应速度随着温度的升高而提高，直至酶功能因变性而受损。因此，在一小时的孵育期间将微滴定板放置在加热块上以提供37℃的恒温，并且还用盖盖上以防止蒸发。孵育温度和反应时间(孵育时间)二者均是待控制的因素。该系统中的检测灵敏度是添加至每个孔的聚合酶的量和反应时间二者的函数。

在一小时之后，通过去除RT-反应溶液终止聚合酶反应。这通过使用Hydroflex板洗涤器随后进行彻底的洗涤操作进行。所使用的“板洗涤缓冲液”包含某些提高洗涤效率的组分，例如洗涤剂(参见材料)。

缀合物结合

在洗去反应溶液之后，添加抗体-酶缀合物溶液。缀合物的抗体部分是具有抗BrdU特异性的单克隆小鼠抗体并且缀合物酶是碱性磷酸酶(AP)。缀合物结合反应也是温度依赖性的，并因此在37℃、30分钟孵育期间将微滴定板放回在加热块上。

缀合物结合步骤通过使用Hydroflex板洗涤器进行仔细的洗涤操作以去除缀合物溶液和非特异性结合的缀合物而结束，使得仅保留与BrdU结合的缀合物。提高的洗涤温度(30℃至35℃)有利于良好的洗涤结果。洗涤溶液与用于先前洗涤的溶液相同。

底物反应

在最终反应中，向孔添加含有DynaLight^TM化学发光碱性磷酸酶(AP)底物(ThermoFisher Scientific)的溶液。当缀合物的AP酶部分改变底物结构时，该底物产生光。在该过程的这一阶段中，化学反应可受可含有AP的空气中尘粒的影响。因此，在添加底物之后，将微滴定板直接移动到防止灰尘的Lumate微板发光计读数室。在10分钟的短“延滞期”以获得稳定的光信号之后，通过发光计测量光强度。

通过AP酶促过程产生的光的强度与通过抗BrdU抗体部分与合成的BrdU链结合而与孔结合的缀合酶的量成比例。并入的BrdU的量进而与孔中存在的odT引物的量成比例。

图2示出了用聚合酶增强的信号放大产生的信号与odT22引物/孔的量之间的关系。如可从该图中看出的，检测到低至1×10^-20mol/孔的odT量，并且odT/孔的量与在1×10^-20至2×10^-16mol odT/孔的范围内产生的信号之间存在线性关系。即约20 000倍的检测范围。

实施例2：聚合酶增强的信号放大模型中的引物长度与所产生的信号之间的关系。

寡核苷酸引物作为聚合酶引物发挥功能的能力根据引物特性和反应条件而变化。一个关键因素是引物长度。短引物最初与其模板弱缔合并且最初的聚合酶反应速度较低直至延伸的引物达到临界长度。增加引物长度将导致初始反应速度提高。超过一定长度，根据温度和条件，引物将与模板永久缔合。模板长度的进一步增加将不会影响反应速度。

这对聚合酶增强的信号放大中的引物-寡核苷酸引物的设计具有影响。本实施例举例说明了引物长度与产生的信号之间的关系。

生物素化的odT18、odT22和odT30在白色Nunc^TMNucleoLink^TM条状物板上的固定

将封固在96孔框架中的白色NucleoLink^TM条状物用120μl/孔的在pH9.6的碳酸盐缓冲液中的200ng/ml链霉亲和素包被。使用Hydroflex板洗涤器和板洗涤缓冲液通过仔细的洗涤操作去除未结合的链霉亲和素。在下一个步骤中，向板上的一组孔中的每个孔添加120μl生物素-odT18、生物素-odT22和生物素-odT30的指定连续稀释液，使其结合，然后将板再次洗涤。

聚合酶反应

结合的odT聚合物在聚合酶反应中充当引物。所使用的HIV反应溶液包含进行反应所必需的除引物之外的所有物质，并在上述的材料部分中进行了描述。向板上的每个孔添加80pg HIV RT来开始聚合酶反应，并允许在37℃下进行30分钟。新产生的BrdU链的相对量将反映引发并支持RT反应的实际引物类型和浓度的效率。

如在实施例1的缀合物结合和底物反应部分中所阐述的，新产生的BrdU链可利用AP缀合的小鼠Bu20 MAb来定量。

图3示出了产生的信号与每种指定引物/孔的量之间的关系。所有三种引物类型都能够引发RT反应。遇到的最高信号由odT30产生，紧随其后的是odT22，而odT18产生明显较低的信号。odT22与odT30引物之间的微小差异表明它们的长度接近于最佳。在目前的反应条件下，约8×10^-19mol的odT30足以产生1000RLU的信号，而产生相同信号需要约100倍多的odT18。

实施例3：在聚合酶增强的信号放大步骤中真核生物聚合酶、病毒聚合酶和细菌聚合酶的用途。

不同的聚合酶对引物-模板组合物具有不同的偏好。逆转录酶在体内使用RNA和DNA模板二者。一些DNA聚合酶严格依赖于DNA模板，而另一些还可显示出与RNA模板的聚合活性，或者换言之充当逆转录酶。尚不清楚逆转录酶活性是否在体内发挥作用，或者其是否只是体外现象。本发明使用聚合酶来增强可从分析物的检测中获得的信号。为此，能够在具有不同特性的聚合酶中进行选择是有利的，所述不同特性关于例如对来自样品的污染物的抗性、持续合成能力、反应速度、使转录物跨越数个模板(模板转换)的能力以及在一系列孵育时间内的稳定性。这将提供更大的自由度来使聚合酶增强的信号放大步骤的条件适应特定分析物的特定测定的要求。

本发明在聚合酶增强的信号放大步骤中使用用小寡核苷酸引物标记的抗体或亲和配体。互补模板在反应溶液中是游离的。使转录物跨越数个模板的能力是有益的。获得的信号随使用的酶量而变化。具有相似偏好的聚合酶是可互换的。较慢的反应速度可通过使用较大的酶量来补偿。本实施例举例说明了哺乳动物聚合酶γ(polymerase gamma，PolG)、HIV逆转录酶、大肠杆菌pol I DNA聚合酶的Klenow片段或另一种细菌聚合酶Bst 3.0可用于免疫测定中的聚合酶增强信号放大步骤，所述免疫测定使用人IgG作为分析物。

针对人IgG的免疫测定的设计

将封固在96孔框架中的白色NucleoLink^TM条状物用120μl/孔的在PBS中稀释至100ng/ml的人IgG包被。使用Hydroflex板洗涤器通过用板洗涤缓冲液仔细洗涤去除未结合的IgG。在下一个步骤中，添加120μl不同稀释度的生物素化的山羊抗人IgG，使其结合，然后将板再次洗涤。

然后添加30μl由10ng/ml链霉亲和素和相应摩尔量一半的生物素-odT22组成的混合物。在短暂孵育之后将板再次洗涤。

现在，板的每个孔包含三层：人IgG、分析物的第一层，具有配体、生物素化的山羊抗人IgG的连续稀释液的第二层，以及链霉亲和素与结合的odT22引物的第三层。结合的odT22引物的量与结合配体的量成比例，所述结合配体的量取决于分析物的量。通过应用聚合酶增强的信号放大步骤，现在可根据本发明检测孔中分析物的量。

聚合酶反应

旨在用于HIV RT和Klenow DNA聚合酶增强的信号放大的孔的组接收30μl的HIVRT反应溶液等分试样，而旨在用于pol G和Bst 3.0聚合酶增强的信号放大的相应组接收30μl的其各自反应溶液的等分试样。每种反应溶液均包含用于聚合酶反应所必需的除odT引物之外的所有组分。聚合酶反应开始于为每组孔添加100μl的酶等分试样。稀释HIV RT和Klenow DNA聚合酶酶以产生大致相同的酶促活性8U/ml Klenow片段具有对应于800pg/ml重组HIV RT的活性。pol G溶液包含2.4μg酶/ml，Bst 3.0聚合酶0.16U/ml。使聚合酶反应在37℃下进行30分钟。

通过使用Hydroflex板洗涤器随后进行彻底的洗涤操作去除RT-反应溶液来终止聚合酶反应。缀合物结合和底物添加如实施例1中所述进行。

图4示出了由四种聚合酶中的每一种产生的信号与添加至测定中的生物素化配体的量之间的关系。

所有四种酶均被证明可用于聚合酶增强的信号放大。稀释HIV和Klenow聚合酶以在所使用的条件下产生相似量的酶活性。如可从图中推断的，这两种酶产生了几乎相同的抗人IgG滴定谱。由于使用了较高的酶输入，针对所有IgG浓度的信号均高于使用pol G或Bst 3.0聚合酶的相应信号。要注意的是，由HIV RT、Klenow片段和Bst聚合酶在最高IgG浓度下产生的信号超过了板读取器的读数范围，并因此偏离了线性。另参见实施例5。

所使用的pol G聚合酶量产生了较低的信号，并且其在整个浓度范围内保持线性。

实施例4：由聚合酶增强的信号放大步骤产生的信号与测定中分析物和引物标记的配体的量之间的关系。

许多经典的免疫测定旨在对与所限定的抗原结合的免疫球蛋白的量进行定量。本发明的检测灵敏度是多个因素的函数，所述因素例如引物标记的抗体或亲和配体的量、引物长度、所使用聚合酶的量和类型、聚合酶反应条件和反应时间以及最后用于对反应期间产生的经标记DNA进行定量的系统。

针对人IgG的免疫测定的设计

将封固在96孔框架中的白色NucleoLink^TM条状物用120μl/孔的在PBS中稀释的人IgG的指定连续稀释液包被。使用Hydroflex板洗涤器通过用板洗涤缓冲液仔细洗涤去除未结合的IgG。在下一个步骤中，添加120μl含有25、6.25或1.56ng odT22缀合的兔抗人IgG，使其结合30分钟，然后将板再次洗涤。

现在，板的每个孔包含两层：连续稀释的人IgG、分析物的第一层，和具有配体、odT22缀合的兔抗人IgG的三种稀释液的第二层。结合的odT22引物的量与结合配体的量成比例，所述结合配体的量取决于分析物的量。通过应用聚合酶增强的信号放大步骤，现在可根据本发明检测孔中分析物的量并对其进行定量。

聚合酶反应

将30μl包含用于聚合酶反应的除odT引物之外的所有组分的HIV RT反应溶液添至板上的每个孔。然后添加120μl 800pg/ml的重组HIV 1RT开始聚合酶反应。使聚合酶反应在37℃下进行45分钟。

通过使用Hydroflex板洗涤器随后进行彻底的洗涤操作去除RT-反应溶液来终止聚合酶反应。

缀合物结合和底物添加如实施例1中所述进行。

图5示出了由聚合酶增强的信号放大步骤产生的信号与测定中存在的人IgG抗原和odT22缀合的抗人IgG的量之间的关系。

将在不同浓度的odT22标记的抗人IgG抗体下产生的发光信号相对于孔中固定的人IgG的量作图。在每种浓度的odT22标记的抗体下，板上人IgG的量与产生的信号之间存在线性关系。要注意的是，对于odT22标记的抗体，该系统远未达到饱和。odT22标记的抗体量的每次提高均产生成比例提高的信号，并且没有达到最大检测灵敏度。根据本发明检测到非常低水平的固定的人IgG。在本实验中，例如odT22标记的抗体的中值浓度的检测范围为5.3×10^-18至1.7×10^-14摩尔人IgG/孔，约3200倍范围。

实施例5：聚合酶增强的信号放大步骤中使用的聚合酶的量与抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗体免疫测定中的信号之间的关系。

如实施例4中所表明的，odT22标记的配体的量与产生的信号之间存在线性关系。存在影响信号水平的许多其他因素。最明显且最突出的是所使用的酶活性的量和聚合反应时间。本实施例旨在举例说明本发明在免疫测定中的用途，所述免疫测定测量在感染SARS-CoV-2病毒之后对SARS-CoV-2刺突蛋白作出应答的抗体。

抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗体免疫测定的设计

将封固在96孔框架中的白色NucleoLink^TM条状物用100μl/孔的在PBS中稀释至100ng/ml的SARS-CoV-2刺突蛋白包被。使用Hydroflex板洗涤器通过用PBS-吐温仔细洗涤去除未结合的刺突蛋白。将包被的板储存在-80℃下。在使用之前，将孔用PBS-吐温洗涤一次，并在室温下与封闭缓冲液(具有0.05％吐温的PBS中的1％脱脂乳粉)一起孵育1小时。

在下一个步骤中，在封闭缓冲液中稀释来自对针对SARS-Cov-2刺突蛋白之抗体呈阳性的热灭活(56℃持续1小时)人血清的三组连续稀释液的100μl样品，并将其添加至孔。将板孵育30分钟，并随后使用Hydroflex板洗涤器在PBS-吐温缓冲液中洗涤。

然后添加30μl在PBS-吐温中稀释至(50ng/ml)的odT30标记的兔抗人IgG。在短暂孵育之后将板再次洗涤。

现在，板的每个孔包含三层：SARS-COV-2刺突蛋白、分析物的第一层，具有含抗SARS-Cov-2刺突蛋白抗体的人血浆的连续稀释液的第二层，以及具有odT30缀合的兔抗人IgG的第三层。结合的odT22引物的量与结合的人抗刺突抗体的量成比例。通过应用聚合酶增强的信号放大步骤，现在可根据本发明检测血浆样品中抗刺突抗体的存在并对其进行定量。

聚合酶反应

将30μl包含用于聚合酶反应的除odT引物之外的所有组分的HIV RT反应溶液添加至板上的每个孔。然后通过添加100μl对应于80、660或3290pg HIV RT/孔的HIV 1RT开始聚合酶反应。使聚合酶反应在37℃下进行45分钟。

缀合物结合和底物添加如实施例1中所述进行。

图6示出了针对SARS-Cov-2刺突蛋白的IgG抗体的这一免疫测定的检测灵敏度是如何随着聚合酶增强的信号放大步骤中使用的聚合酶的量而变化的。聚合酶反应开始于免疫测定的第三层中的odT30引物，并在添加至反应溶液中的可溶性模板上进行。在该系统中产生的信号与产生的BrdU链的量成比例，并且发现当添加的HIV RT的量从80pg RT/孔提高至660pg RT/孔时，产生的信号提高约8倍。进一步提高多至3290pg RT/孔时没有产生或仅产生较小的信号提高。当提高酶量时，系统最终达到饱和状态，这时所有odT30引物末端始终被聚合酶占据。如可从图中看出的，这在所有血清稀释液下均有效。

实施例6：聚合酶增强的信号放大步骤中的聚合酶反应时间与信号之间的关系。

只要所有反应组分以过量存在，正常酶反应与酶量和反应时间就呈线性。由于实际原因，在数小时内获得配体结合测定的结果被认为是有利的。因此，在实施例1至5中将聚合酶反应时间限制为30至60分钟。然而，本发明提供了通过提高聚合酶反应时间来获得提高的检测灵敏度的可行性。本发明中的引物延伸步骤是基于反应溶液中的游离模板和与固相结合的引物标记的配体的组合。在信号放大步骤中，依次利用数个模板跨模板边界进行聚合的能力有益于避免接近模板成为聚合酶反应的速率限制因素。

odT22在白色Nunc^TMNucleoLink^TM条状物板上的固定

将封固在96孔框架中的白色NucleoLink^TM条状物用120μl/孔的在pH9.6的碳酸盐缓冲液中的200ng/ml链霉亲和素包被。使用Hydroflex板洗涤器和板洗涤缓冲液通过仔细的洗涤操作去除未结合的链霉亲和素。在下一个步骤中，向板上的孔添加120μl的3.125pg生物素-odT22/ml，使其结合，然后将板再次洗涤。

聚合酶反应

将链霉亲和素-odT22包被的条状物转移至六个单独的框架，每个框架两个条状物。每个框架上的一个条状物接收130μl包含800pg HIV1 RT/ml的HIV RT反应溶液，另一个条状物接收包含0.2U MMuLV RT/ml的MMuLV RT反应溶液。两种反应溶液均包含用于聚合酶反应所必需的除引物之外的所有物质，并在材料中有所描述。将具有条状物的框架转移至37℃培养箱。在30分钟之后将一个框架从培养箱取出，并在-20℃下冷冻。在60分钟之后将另一个框架从培养箱取出，并如第一个框架进行处理。在120、240、355和1090分钟之后重复该过程。当最后的框架被冷冻时，将所有条状物组装成一个框架。在解冻之后，通过使用Hydroflex板洗涤器随后进行彻底的洗涤操作去除RT-反应溶液来终止聚合酶反应。

缀合物结合和底物添加如实施例1中所述进行。

图7示出了当使用HIV-1或MMuLV RT时，在聚合酶增强的信号放大步骤中与聚合酶反应时间相关的信号发展。两种酶在数小时内均产生不断增加的信号，但是在长孵育时间期间却表现地截然不同。MMuLV酶是“缓慢起始物(slow starter)”，但是在最初的“延滞期”之后的许多个小时内，维持与时间成线性关系的聚合酶反应。另一方面，HIV-1RT立即开始以产生标记的DNA，但是在数小时之后反应速度降低，并且甚至在约400分钟之后反应出现逆转。

数小时的线性聚合酶反应需要比约500个碱基的模板长得多的新的DNA链。产生的长RNA/DNA链在某些反应条件下对核酸酶明显敏感。时间与产生的信号之间的关系因酶与反应混合物的不同组合而变化。对于每种限定的应用，当设计包含根据本发明的聚合酶增强的信号放大步骤的免疫测定时，必须考虑这一点。

实施例7：在抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗体免疫测定中的信号放大步骤中使用两种不同的脱氧尿苷三磷酸类似物对信号的影响。

实施例1至6中的聚合酶增强的信号放大步骤是基于使用一种脱氧胸苷三磷酸类似物BrdUTP来标记新合成的DNA。显然可使用其他核苷酸类似物并用相似的方法检测它们。信号将取决于脱氧胸苷三磷酸类似物并入的反应速度和新合成的DNA中类似物的检测效率二者。在本实施例中，比较了通过将IdUTP和BrdUTP作为两种不同的经修饰脱氧尿苷三磷酸类似物用于抗SARS-Cov-2刺突蛋白抗体免疫测定中的聚合酶增强的信号放大步骤而产生的信号。

抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗体免疫测定的设计

如实施例5中所述，将来自Bio-One的高结合白色半区域微板用SARS-Cov-2刺突蛋白包被。

在下一个步骤中，产生两种热灭活(56℃持续1小时)人血清的连续稀释液，一种抗SARS-Cov-2刺突蛋白抗体阳性(UK 9)和一种抗体阴性(UK 32)，两者均在封闭缓冲液中稀释。将其添加至两个单独板上的孔。将板孵育30分钟，并随后使用Hydroflex板洗涤器在PBS-吐温缓冲液中洗涤。然后添加30μl在PBS-吐温中稀释至200ng/ml的odT30缀合的兔抗人IgG。在短暂孵育之后将板再次洗涤。

聚合酶反应

具有相同血清滴定的两个板中的一个接收30μl/孔HIV RT反应溶液，所述反应溶液包含BrdUTP和用于聚合酶反应的除odT引物之外的所有其他组分。剩余板接收30μl相同的HIV RT反应溶液，但是用IdUTP替代BrdUTP。然后向板上的每个孔添加HIV 1RT(240pg)开始聚合酶反应。使聚合酶反应在37℃下进行30分钟。通过使用Hydroflex板洗涤器随后进行彻底的洗涤操作去除RT-反应溶液来终止反应。

缀合物结合和底物添加如实施例1中所述进行。

图8示出了在用于检测针对SARS-Cov-2刺突蛋白的人IgG抗体的免疫测定的聚合酶增强的信号放大步骤中两种不同的经修饰脱氧尿苷三磷酸类似物的用途。对来自NIBSC的抗SARS-Cov-2验证小组的阳性血清UK9按照抗SARS-Cov-2免疫球蛋白(NIBSC代码20/136)的WHO国际标准进行校准，并将图中UK9的量表示为IgG结合抗体单位(bindingantibody unit，BAU)。包含来自同一小组的阴性血清UK 26，以用于与图中相同稀释度的阳性UK9血清进行比较。

与IdUTP相比，BrdUTP作为HIV RT的底物产生了稍微更高的信号。发现两种类似物的线性检测跨度相似，并且范围为0.4至1300μBAU。证明用聚合酶增强的信号放大步骤的免疫测定能够在低至0.4μBAU的稀释度下区分SARS-CoV-2阳性(UK9)血清和阴性血清(UK26)。

实施例8：针对SARS-CoV-2刺突蛋白的聚合酶增强的抗原捕获ELISA。

在实施例5和7中已经表明了本发明用于增强对与固定的抗原结合的抗体进行定量的测定的用途。本实施例旨在说明本发明用于增强抗原捕获测定的用途。ELISA中的信号和检测范围二者随着检测抗体上标记的量和类型而变化。在实施例1至7中，已出于此目的使用了AP缀合的单克隆抗体(monoclonal antibody，mab)。因此，本实施例还旨在表明其他酶标记(例如辣根过氧化物酶(HRP))在聚合酶增强的ELISA中的可用性。SARS-CoV-2刺突蛋白ELISA中第一层的设计

将由白色Nunc Nucleolink条状物组成的微滴定板用100μl/孔的在PBS(500ng/ml)中的DH6小鼠抗SARS-Cov-2刺突蛋白mab包被。将板用密封带覆盖，并在冰箱中孵育过夜。使用Hydroflex板洗涤器和PBS吐温去除未结合的mab。将包被的板在37℃下与封闭缓冲液(PBS中的1％脱脂乳粉)一起孵育1小时。然后将板再次洗涤。

添加第二层和第三层。

在下一个步骤中，向板上的每个孔添加20μl在具有0.5％triton X-100(1000ng/ml)的封闭缓冲液中的用odT30标记的Ad10小鼠抗SARS-Cov-2刺突蛋白mab。然后添加来自一组SARS-Cov-2刺突蛋白的连续稀释液的80μl样品和空白(以12.5ng/ml开始，并在具有0.5％triton X-100的封闭缓冲液中分两步进行连续稀释，直至达到6.1pg/ml)。在孵育60分钟之后，将板再次洗涤。

现在板的每个孔包含具有odT30标记的小鼠抗SARS-Cov-2刺突蛋白的第三层。结合的odT30引物的量与第二层中SARS-Cov-2刺突蛋白的量成比例，并且可根据本发明进行定量。

聚合酶反应

向板上的每个孔添加30μl包含用于聚合酶反应的除odT引物之外的所有组分的POLI反应溶液。然后通过添加在100μl 25mM hepes,pH 8.0,具有0.67mg BSA/ml中的12.5μU IsoPol SD+来开始聚合酶反应。使聚合酶反应在室温下进行60分钟。

通过使用Hydroflex板洗涤器去除RT-反应溶液来终止聚合酶反应。

新产生的BrdU链的定量

在本实施例中，利用了两步缀合物结合操作。首先向每个孔添加100μl生物素缀合的小鼠Bu20 mab(牛乳转移技术优化液主体中，0.6μg/ml)。在短暂孵育之后，将板洗涤并添加100μl HRP标记的链霉亲和素(在具有0.1％酪蛋白的PBS吐温中，0.42μg/ml)。现在板上的每个孔将包含与新合成的BrdU链结合的HRP标记的生物素-链霉亲和素复合物。

底物反应

将6.1ml SuperSignal ELISA Pico鲁米诺/增强剂溶液与6.1ml SuperSignalELISA Pico稳定过氧化物酶溶液混合以得到HRP底物工作溶液。在最终的反应中，将120μl该溶液添加至每个孔。当缀合物的HRP酶部分修饰底物结构时，该底物产生光。将RT反应板移入到Lumate微板发光计读数室中并测量光强度。

由HRP酶促过程产生的光强度与通过抗BrdU抗体与合成的BrdU链结合而与孔结合的缀合酶的量成比例。并入的BrdU的量进而与孔中捕获的与SARS-CoV-2刺突蛋白结合的Ad10 mab上的odT引物的量成比例。

参考ELISA

使用与聚合酶增强的测定中相同浓度的相同组分。参考ELISA中的AD10检测抗体用生物素而不是odT标记。随后在没有任何信号放大步骤的情况下用HRP标记的链霉亲和素直接检测该抗体的这种存在。

图9示出了由聚合酶增强的抗原捕获测定或参考ELISA产生的信号与存在的SARS-CoV-2刺突蛋白的量之间的关系。

如可从图中看出的，聚合酶增强的捕获测定在产生的信号与存在的刺突蛋白的量(约7×10^-19至1×10^-15摩尔)之间产生了线性关系。接近检测上限的线性偏差是由于发光计检测范围的限制。

参考ELISA不能检测低于5×10^-17摩尔的刺突蛋白水平。

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Claims

1.用于检测样品中的目的分析物的方法，其包括：

-从所述样品中去除未结合的第一配体；

-检测任何合成的经标记DNA链。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述引物寡脱氧核糖核苷酸选自包含所有四种碱基A、G、T和C或其子集的寡脱氧核糖核苷酸，或者选自包含单一碱基的寡脱氧核糖核苷酸，优选寡脱氧胸苷。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述标记的脱氧核糖核苷酸是标记的脱氧尿苷三磷酸(dUTP)，例如溴-dUTP或碘-dUTP，优选溴-dUTP，并且所述模板多核糖核苷酸是多核糖腺苷酸。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述引物寡脱氧核糖核苷酸的长度为22至40个核苷酸。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述模板多核糖核苷酸的长度为10²至10³个核苷酸，优选2*10²至5*10²个核苷酸。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述具有逆转录酶活性的酶是真核生物聚合酶，例如DNA聚合酶γ；病毒聚合酶，例如逆转录病毒逆转录酶，优选HIV或M-MuLV逆转录酶；或者细菌聚合酶，例如来源于嗜温细菌的细菌聚合酶，优选大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I的Klenow片段，或者来源于嗜热细菌的细菌聚合酶，优选来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus Stearothermophilu)的Bst 3.0。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述具有逆转录酶活性的酶选自DNA聚合酶γ、HIV或M-MuLV逆转录酶、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段和来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的Bst3.0。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中孵育步骤在恒温下，优选在37℃下进行30分钟至4小时，优选进行1小时。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述检测通过包括以下步骤的检测方法进行：

-从所述样品中去除未结合的第二配体；

-检测所述信号。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述第二配体是与所合成的经标记DNA特异性结合的抗体，其上共价连接了酶，例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述共价连接的酶作用于底物以产生比色信号、荧光信号、化学发光信号或电化学信号。

12.根据权利要求10至11中任一项所述的方法，其中所述共价连接的酶是碱性磷酸酶，其作用于底物以产生作为所述可检测信号的化学发光信号。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对所述目的分析物的检测是定量检测。

14.试剂盒，其包含第一配体、模板多核糖核苷酸、多种标记的脱氧核糖核苷酸三磷酸和具有逆转录酶活性的酶，所述第一配体包含能够与目的分析物特异性结合的结合部分和与所述结合部分结合的长度为18至40个核苷酸的引物寡脱氧核糖核苷酸，所述模板多核糖核苷酸比所述引物寡脱氧核糖核苷酸长并且具有与所述引物寡脱氧核糖核苷酸至少部分互补的序列。

15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述引物寡脱氧核糖核苷酸选自包含所有四种碱基A、G、T和C或其子集的寡脱氧核糖核苷酸，或者选自包含单一碱基的寡脱氧核糖核苷酸，优选寡脱氧胸苷。

16.根据权利要求14至15中任一项所述的试剂盒，其中所述标记的脱氧核糖核苷酸三磷酸是标记的脱氧尿苷三磷酸(dUTP)，例如溴-dUTP或碘-dUTP，优选溴-dUTP，并且所述模板多核糖核苷酸是多核糖腺苷酸。

17.根据权利要求14至16中任一项所述的试剂盒，其中所述引物寡脱氧核糖核苷酸的长度为22至40个核苷酸。

18.根据权利要求14至17中任一项所述的试剂盒，其中所述模板多核糖核苷酸的长度为10²至10³个核苷酸，优选2*10²至5*10²个核苷酸。

19.根据权利要求14至18中任一项所述的试剂盒，其中所述具有逆转录酶活性的酶是真核生物聚合酶、病毒聚合酶或细菌聚合酶，例如DNA聚合酶γ、HIV或M-MuLV逆转录酶、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段或来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的Bst 3.0。

20.根据权利要求14至19中任一项所述的试剂盒，其还包含：能够与所述标记的脱氧核糖核苷酸特异性结合的第二配体，所述第二配体还包含共价连接的酶；以及针对所述酶的底物。

21.根据权利要求20所述的试剂盒，其中所述第二配体是单克隆抗体，其上共价连接了酶，例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

22.根据权利要求20至21中任一项所述的试剂盒，其中所述共价连接的酶是碱性磷酸酶，其作用于底物以产生作为可检测信号的化学发光信号。