JP3034304B2 - タンパク質―核酸プローブおよびそれを用いたイムノアッセイ - Google Patents

タンパク質―核酸プローブおよびそれを用いたイムノアッセイ

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Description

【発明の詳細な説明】 説明 技術分野 本発明は一般に免疫学および核酸化学の分野に関す
る。さらに詳細には、本発明は、イムノアッセイにおけ
る、検出可能なシグナルを増幅する手段としての核酸ハ
イブリダイゼーションの利用に関する。
背景技術 核酸ハイブリダイゼーションは現在、DNA、RNA、およ
び／またはその他の物質の異質の混合物中に存在する特
定のヌクレオチド配列を検出および定量するために、遺
伝学的研究、生物医学的研究および臨床診断に普通に用
いられている。基本的な核酸ハイブリダイゼーションア
ッセイでは、一本鎖の分析物の核酸（DNAまたはRNAのい
ずれか）は、標識した核酸プローブに直接的または間接
的にハイブリダイズされ、そして標識を含有する二本鎖
が定量される。放射性および非放射性の標識の両方が用
いられている。
この基本的なアッセイには感度が不足している。分析
物が、少ないコピー数または薄い濃度で存在するとき、
そのシグナルはバックグラウンドノイズとの識別が不可
能である。この基本スキームの変法が、異質の物質から
の標的の二本鎖の分離を促進し、および／または検出を
促進する目的で分析物の配列を増幅するために開発され
ている。しかし、これらの変法は一般に複雑となるの
で、手順に時間がかかり、高いバックグラウンド、低感
度のため定量化が困難となる。これらの変法の一般的な
考察については、国際特許公開第89/03891号を参照のこ
と。
イムノアッセイもまた、血液サンプル、細胞抽出物お
よびその他の物質の異質混合物中に存在する特定の抗原
エピトープを検出および定量するために、遺伝学的研
究、生物医学的研究および臨床診断において普通に用い
られている。基本的なイムノアッセイは、モノクローナ
ル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかの抗体と標
的の抗原との特異的な結合、およびその反応を検出する
手段を含む。このような手段は直接イムノアッセイ、間
接イムノアッセイおよびサンドイッチイムノアッセイを
含む様々なアッセイに導入されている。しかしながら、
本質的な抗原／抗体相互作用の検出感度には、核酸ハイ
ブリダイゼーションのところで上述したのとほぼ同じ問
題が存在している。
現在、ラジオイムノアッセイ、イムノペルオキシダー
ゼ、およびELISAのような様々な技術が、イムノアッセ
イに用いられている。しかしながら、ラジオイムノアッ
セイは危険で環境に悪い試薬を必要とするという欠点を
有し、イムノペルオキシダーゼおよびELISAはシグナル
対ノイズ比が低くシグナル増幅に限界があるという欠点
がある。
本発明の第１の目的は、独特なポリヌクレオチド分子
を利用したシグナル増幅方法を提供することである。こ
の分子は、イムノアッセイに使用するための核酸ハイブ
リダイゼーションアッセイにおいて有用であることがわ
かっている。これらのアンプリファイアプローブは、高
度に再現性のあるシグナル増大、高度に再現性のあるシ
グナル対ノイズ比を提供し、そしてそれ自身定量できて
再現性がある。そして低濃度で存在する分析物抗原と特
異的に結合することが可能であり、さらに「ユニバーサ
ルな」核酸レポーター部分ともまた特異的に結合するこ
とができ、安定な複合体を形成する。
同一出願人による、1989年９月19日に特許された米国
特許第4,868,105号は、その開示がここで参考として採
用されている。この特許には、液相ハイブリダイゼーシ
ョのサンドイッチアッセイが記載されている。この中
で、分析物核酸は、「ラベリングプローブ」および「キ
ャプチャリングプローブ」にハイブリダイズされる。こ
のプローブ−分析物複合体は、ハイブリダイゼーション
により固体の支持体に結合される。このことにより、分
析物オリゴヌクレオチドが固相複合体として溶液から除
去され、それによって分析物が濃縮され、他の試薬から
のそれの分離が促進され、そしてそれの次の検出が増大
される。
同一出願人によるPCT出願、1990年11月15日に公開さ
れた公開第WO90/13667号では、２つのドメインを有する
直鎖および分枝状のマルチマーポリヌクレオチドプロー
ブ、およびこれらのプローブを、核酸ハイブリダイゼー
ションアッセイにおいてシグナルアンプリファイアとし
て利用する方法をクレームしている。このうち、第１の
ドメインは目的の一本鎖のオリゴヌクレオチド配列と相
補的であり、そして第２のドメインは、一本鎖の標識し
たオリゴヌクレオチドと相補的な多数の一本鎖のオリゴ
ヌクレオチドサブユニットを含有する。
同一出願人による同時係属中のPCT出願、PCT/US91/00
213号では、３つのドメインを有するポリヌクレオチド
プローブ、およびこれらのプローブを、核酸ハイブリダ
イゼーションアッセイにおいて、シグナルアンプリファ
イアとして利用する方法をクレームしている。このう
ち、第１のドメインは目的の一本鎖のオリゴヌクレオチ
ド配列と相補的であり、第２のドメインはバクテリアフ
ァージのDNA依存性RNAポリメラーゼの酵素活性のための
プロモーターとして作用することが可能であり、そしで
第３のドメインはポリメラーゼ活性の転写鋳型として作
用することが可能である。
タンパク質/DNAハイブリッド分子は、核酸ハイブリダ
イゼーションアッセイにおいてプローブとして用いら
れ、ここでそのタンパク質部分はラベリング成分として
作用する（Czichos,J.ら、Nucl.Acids Res.（1989）17:
1563;米国特許第4,873,187号；米国特許第4,737,454
号。
タンパク質/DNAハイブリッド分子はまた、イムノアッ
セイにおいてもプローブとして用いられている。米国特
許第4,692,509号には、タンパク質およびそれに共有結
合した放射性オリゴヌクレオチドを含有する放射性標識
されたハイブリッドプローブが記載されている。その放
射性部分は、生物学的なアッセイにおいてタンパンク質
部分の存在を示すために用いられる。E.P.A.第154884号
は、タンパク質/DNAハイブリッド分子を開示している。
この中でタンパク質部分は標的のタンパク質を特異的に
認識し、核酸部分はラベリング機能を提供する。
発明の要旨 本発明の１つの局面は、イムノアッセイにおいて検出
可能なシグナルのアンプリファイアとして使用するため
のポリペプチド／ポリヌクレオチドハイブリッド分子プ
ローブである。１つの実施態様において、「ポリメラー
ゼプローブ」は以下の３つのドメインを含有する： （ａ）ポリペプチドであり、既知の抗原に対して特異的
な抗体として機能する第１のドメイン（Ａ）； （ｂ）二本鎖のポリデオキシリボヌクレオチドであり、
DNA依存性RNAポリメラーゼの酵素活性のためのプロモー
ターとして機能し得る第２のドメイン（Ｂ）；および （ｃ）一本鎖または二本鎖のいずれかであり、該第２の
ドメインに隣接している第３のドメイン（Ｃ）であっ
て、該第２のドメインのプロモーター活性のための鋳型
として機能し得るようにされている、ドメイン。
第２の実施態様は、イムノアッセイにおいて検出可能
なシグナルのアンプリアンイアとして使用するためのポ
リペプチド／ポリヌクレオチドハイブリッド分子プロー
ブである。この「マルチマープローブ」は以下の２つの
ドメインを含有する： （ａ）ポリペプチドであり、既知の抗原と特異的に結合
する抗体として機能することが可能な第１のドメイン
（Ａ）； （ｂ）対象の一本鎖の核酸配列と特異的に結合し得る、
多数の一本鎖のオリゴヌクレオチドサブユニットを含有
する第２のドメイン（Ｍ）；および （ｃ）第１のドメインと第２のドメインを結合させる手
段。
本発明の別の局面は、上述のポリメラーゼプローブを
使用して、イムノアッセイにおける検出可能なシグナル
を増幅する方法である。この方法は以下の工程を包含す
る： （ａ）抗原分析物を、直接的または間接的に、固体の基
質上に固定する工程； （ｂ）以下のドメインを含有する第１の分子プローブと
分析物とを、直接的または間接的に結合する工程： （ｉ）結合ドメイン（Ａ）； （ii）DNA依存性RNAポリメラーゼの酵素活性のための
プロモーターとして機能し得る、二本鎖DNA配列であ
る、第２のドメイン（Ｂ）；および （iii）一本鎖または二本鎖のいずれかであり、ドメ
インＢに隣接している第３のドメイン（Ｃ）であって、
該第２のドメインのプロモーター活性のための鋳型とし
て機能し得るようにされている、ドメイン； （ｃ）結合していないプローブを除去する工程； （ｄ）DNA依存性RNAポリメラーゼの活性によって、プロ
ーブ構築物の第３のドメインＣの鋳型配列ｃ′に相補的
なRNAオリゴマーの多数のコピーを転写する工程；およ
び （ｅ）該転写物を定量する工程。
本発明の別の局面は、上述したようなマルチマープロ
ーブの使用により、イムノアッセイにおいて検出可能な
シグナルを増幅するもう１つの方法である。この方法は
以下の工程を包含する： （ａ）分析物を直接的または間接的に固体の基質上に固
定する工程； （ｂ）以下のドメインを含有するハイブリッド分子プロ
ーブに分析物を、直接的または間接的に結合させる工
程： （ｉ）対象の抗原と特異的に結合する抗体として機能
し得るポリペプチドである、結合ドメイン（Ａ）；およ
び （ii）一本鎖の標識されたオリゴヌクレオチドと特異
的に結合する工程が可能である、多数の一本鎖のDNAオ
リゴヌクレオチドサブユニットを含有する第２のドメイ
ン（Ｍ）；および （iii）第１のドメインと第２のドメインを結合させ
る手段； （ｃ）結合していないプローブを除去する工程； （ｄ）ドメインＭプローブのサブユニット配列と実質的
に相補的なヌクレオチド配列を含有する、一本鎖標識オ
リゴヌクレオチドを、第２のドメインのサブユニットに
ハイブリダイズさせる工程； （ｅ）結合していない標識オリゴヌクレオチドを除去す
る工程；そして （ｆ）該プローブと結合している標識オリゴヌクレオチ
ドの量を定量する工程。
さらにもう１つの実施態様は、競合イムノアッセイに
おいて、検出可能なシグナルを増幅する方法であり、こ
の方法は以下の工程を包含する： （ａ）ハイブリッド分子を構築する工程であって、この
分子中でドメインＡはハプテンとして機能することが可
能なポリペプチドであり、このドメインは、ポリメラー
ゼプローブのB/Cドメインまたはマルチマープローブの
Ｍドメインのいずれかと結合している、工程； （ｂ）競合する分析物の存在下において、ハイブリッド
分子を直接的または間接的に固体の基質上に固定化する
工程； （ｃ）結合していないプローブを除去する工程；および （ｄ）DNA依存性RNAポリメラーゼ活性によって、RNAオ
リゴマーの多数のコピーを転写する工程、およびこの転
写物を定量する工程、（これは、ポリメラーゼプローブ
が使用される場合）；または （ｅ）一本鎖の標識オリゴヌクレオチドをＭドメインの
サブユニットにハイブリダイズさせる工程、結合してい
ない標識を除去する工程、および結合している標識を定
量する工程（これは、マルチマープローブが使用される
場合）。
図面の簡単な説明 図1Aは、モノマーポリメラーゼ型のアンプリファイア
プローブの図式である。大文字はドメインを表し、小文
字はドメイン内の鎖を表す。プライム文字は、下側の鎖
を表す（左から右へ３′から５′）。Ａドメインは標的
のエピトープを認識する抗体である（SEQ ID NO:
8）。ＢドメインはRNAポリメラーゼのプロモーターであ
る（SEQ ID NO:9）、（SEQ ID NO:10）、（SEQ ID
NO:11）および（SEQ ID NO:12）。ｃ′配列は、RNA
ポリメラーゼの鋳型である。プローブは一本鎖として合
成される。Ｃ領域の端のAAAAAAA（SEQ ID NO:1）は、
自己アニーリングさせるために添加したポリＡリンカー
を表す。ＡドメインとＢドメインとの間のA/T領域は、
十分な抗体活性を保持するために随意必要となる。
図1Bは、ポリメラーゼ型のアンプリファイアプローブ
の１つの実施態様のDNA配列である。プロモータードメ
インＢは、バクテリアファージのT7プロモーターのコン
センサス配列（５′−TAATACGACTCACTATA−３′）（SEQ
ID NO:2）と、このプロモーター配列の５′側の15個
の付加残基から成る。
図1Cは、マルチマーポリメラーゼ型のアンプリファイ
アプローブの図式である。このプローブ中で、Ａドメイ
ンは抗体として機能し、二本鎖のＢおよびＣドメインは
自己アニーリングする。
図1Dは、マルチマーアンプリファイアプローブの図式
である。このプローブ中で、Ａドメインは抗体として機
能し、Ｍドメインは多数のオリゴマーサブユニットを含
有する。二又分枝したマルチマーと櫛状（comb−like）
マルチマーの両方が示されている。
図2Aは、ポリメラーゼ型のアンプリファイアプローブ
を用いた、サンドイッチイムノアッセイ系の図式であ
る。分析物のタンパク質は、第１の抗体（例えば「ラブ
（rab）」（ラビット）−抗体）との複合体を形成する
ことにより、固体の基質上に間接的に固定され；そして
第２の抗体（例えばマウス抗体）と複合体を形成するこ
とによりアンプリファイアプローブと間接的に結合して
いる。
図2Bは、サンドイッチハイブリダイゼーション／イム
ノアッセイ系の図式である。分析物のタンパク質は上述
のように間接的に固定される。第２の抗体（マウス−抗
分析物）は、ハイブリッド抗体／ポリヌクレオチド分子
と複合体を形成している。ハイブリッド分子中では、タ
ンパク質部分は抗マウス抗体として機能し、ポリヌクレ
オチド部分はアンプリファイアプローブ（この場合、マ
ルチマープローブ）のａ′ヌクレオチド領域と相補的で
ある。
図３は、イムノアッセイにおけるレポーター分子とし
てのRNAポリメラーゼの転写物の利用を示す。ポリメラ
ーゼプローブを用いるサンドイッチ複合体を形成させた
後、RNAポリメラーゼを添加されると、鋳型配列
（ｃ′）と相補的な多数のRNA転写物（ｃ）が生成され
る。これらの配列は２つのサブドメインを有する:c1は
キャプチャープローブと相補的であり、固体の基質上に
固定されている；そしてc2はラベリングプローブと相補
的である。このことにより、標識が間接的に固定され
て、ハイブリダイゼーションアッセイシグナルが簡単に
定量できる。「＊」は放射性、化学発光性、蛍光性、ま
たは酵素的であり得る、取り込まれた標識を表す。
図４（パートＡからＦ）は、「櫛状」および／または
分枝状構造を有するマルチマーを作成する際に用いる手
順を例証している。
発明の詳細な説明 定義 「検出可能なシグナル」は、核酸ハイブリダイゼーシ
ョンまたは抗原と抗体の結合のような、生化学的な事象
の発生を示す伝達できる徴候である。本出願では、イム
ノアッセイの検出可能なシグナルをアセンプリファイア
する方法を記載する。
「DNA依存性RNAポリメラーゼ」は、相補的なDNA鋳型
から、特定の配列のRNAの重合を促進する酵素である。
「ドメイン」は、その機能によって特徴づけられた生
化学的な分子の特定の領域である。
「エピトープ」は、免疫原性のある分子のなかの部分
であって、免疫学的反応においてその対応する抗体によ
り特異的に認識され、そして、その抗体と複合体を形成
する部分である。
ヌクレオチド／ペプチドの「ハイブリッド」分子は、
核酸残基とアミノ酸残基の両方を含有し、それぞれの残
基が分子の別々の機能ドメインに存在する分子である。
「免疫原」は、特異的に抗体と反応し得る基質であ
る。
「免疫学的反応」は、抗体の、免疫原のエピトープへ
の特異的な認識と結合である。「イムノアッセイ」は、
免疫学的反応を、その反応を検出および定量する方法と
組み合わせることによって、エピトープの存在を決定す
る方法である。
「ポリデオキシリボヌクレオチド」は、ポリマーのDN
A分子である。「ポリヌクレオチド」は、ポリマーのDNA
またはRNA分子である。
「プロモーター」は、転写を開始するに先だって、RN
Aポリメラーゼ酵素が結合する、ポリデオキシリボヌク
レオチドの部位である。
「RNA依存性RNAポリメラーゼ」は、相補的なRNA鋳型
から、特定の配列のRNAの重合を容易にする酵素であ
る。
「転写」は、その働きによりRNAが相補的なポリヌク
レオチド鋳型から生成されるような酵素によって媒介さ
れるプロセスである。
二本鎖のDNA分子の「上側の鎖（upper strand）」
は、配列が左から右へ読まれる場合、５′末端が左側で
ある鎖のことである。この鎖の配列は、常にそれと相補
的な「下側の差（lower strand）」（これは左から右
へ、３′−から５′−へと読まれる）の上に存在する。
発明を実施するための形態 １−アンプリファイアプローブ Ａ−ポリメラーゼプローブ 本発明の１つの局面は、３つの機能的なドメインを含
有するDNAアンプリファイアプローブ（「ポリメラーゼ
プローブ」と呼ぶ）である。このプローブは、イムノア
ッセイにおいて検出可能なシグナルを増大させるために
用いられる。
第１のドメイン（図1AのＡ）は、選択された抗原に対
して特異性を有する抗体として機能するポリペプチドで
ある。そのポリペプチドの機能領域の次には、アミノ酸
または核酸残基のいずれかの領域が続く。この領域はす
なわち、スペーサー領域であり、これは実質的に抗体の
活性を妨害しない。その抗体活性は、分析物自身のエピ
トープに対して特異的であり得る；しかしながら、好適
な実施態様においては、抗体は、以下のアッセイにおい
て用いられる特定のイムノグロビンの抗原決定基に対応
している（例えば、抗ラビットIgG、または抗ヒトIgG−
図2A参照のこと）。実施されているように、分析物は特
異的な抗体と接触し、過剰の抗体は除去されて、次にア
ンプリファイアプローブが結合している抗体と反応す
る。
好ましくは、次の洗浄操作を容易にするために、最初
に分析物は固体の基質上に固定化される。この固定化は
直接（例えば、分析物を含有する生物の調製物はニトロ
セルロースフィルターに結合され得る）、または間接
（例えば、特異的な抗体が固体の基質上に固定され、次
にその分析物がその固定した抗体と結合され得る）であ
り得る。
第２のドメイン（図1AのＢ）は、通常長さが10個から
40個の塩基対であり、好ましくは20個から35個の塩基対
であり、さらに好ましくは30個から35個の塩基対であ
る。そして二本鎖であり、DNA配向のRNAポリメラーゼプ
ロモーターとして機能する。このプロモーターは、通常
バクテリアファージのプロモーター配列に由来し、好ま
しくはファージT3,T7、またはSP6のどれかに由来し、さ
らに好ましくはバクテリアファージT7に由来している。
このクラスのRNAポリメラーゼは、高いプロモーター特
異性がある。おそらくT7プロモーターは最もよく特徴が
明らかにされている（図1B）。17個のT7プロモーター由
来のDNA配列が既知であり、コンセンサス配列が推定さ
れている:5′−TAATACGACTCACTATA−３′（SEQ ID N
O:2）（Oakley and Coleman,Proc.Nat.Acad.Sci.（197
7）74:4266;Dunn and Studier,J.Molec.Biol.（1983）1
66:477）。相補鎖上のプロモーターの３′末端配列
（ｃ′セグメント；その３′末端がｂ′セグメントの
５′末端と隣接している）は、転写の鋳型として役立
ち、多くの鋳型配列変形の転写が適応され得る（図1
B）。プロモーター領域自身だけは二本鎖でなければな
らない（Milliganら、Nuc.Acids Res.（1987）15:878
3）。
プロモーターの５′側の伸長は、転写にはほとんど影
響がない。例えば、好適な実施態様においては、Ｂ領域
はT7プロモーターのコンセンサス配列に加えて、コンセ
ンサス配列の５′側への付加塩基から成る。これはpT7
プラスミド（US Biochemicalsから市販されている）の
Pvu II制限部位までの配列と同一である（図1B）。これ
らの配列は外来であってもなくてもよい。
第３のドメイン（図1AのＣ）は、第２のドメインの
３′側に直接つながっており、このドメインのｃ′鎖
は、ドメインＢプロモーターの鋳型として役立つ。ドメ
インＣは、通常長さが30個から80個のヌクレオチドであ
り、好ましくは35個から50個のヌクレオチドであり、最
も好ましくは40個から45個のヌクレオチドである。この
ドメインは一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。
ｃ′鋳型鎖の３′末端（直接プロモーターに隣接してい
る）は、通常シトシン残基であり、従って上側の鎖の
５′末端は通常グアノシン残基である。
ＣドメインのRNA転写生成物（ｃ）は、分析物の存在
および量のレポーター分子として機能する（図３）。シ
グナル増幅が起こるのは、それぞれの鋳型が101から104
の転写物を生成するからである。このドメインの配列は
ランダムな配列で設計されていて、その系の他のプロー
ブとの交差反応の可能性を最少にするためにコンピュー
ター分析で評価される。
Ｃドメインの配列は特定の検出スキームのために設計
され、そのようなスキームのいくつかは転写物を定量す
るために使用され得る、例えば、Ｃドメインの転写生成
物（ｃ）は、２つのサブドメイン、すなわちc1およびc2
にさらに分割され得る（図３）。サブドメインc1は、固
体の基質上に固定されている転写キャプチャープローブ
と相補的である。サブドメインc2はラベリングプローブ
と相補的である。ハイブリダイゼーション後、保持して
いる標識の量は、最初のサンプル中に存在する分析物の
量に直接的に比例する。
他の実施態様においては、Ｃドメインの転写物はc1サ
ブドメインのみを有する。Ｃドメインは標識された三リ
ン酸リボヌクレオチドの存在下で転写され、次にその標
識された転写物は、その相補的なc1サブドメインを介し
て、固定された転写キャプチャープローブと結合されて
定量される。
さらにもう１つの実施態様においては、Ｃドメインの
転写物はc2サブドメインのみを有する。Ｃドメインはビ
オチン化された三リン酸リボヌクレオチドの存在下で転
写され、その転写物はアピジンビーズで捕捉される。次
にその転写物は、その相補的なc2サブドメインを介し
て、ラベリングプローブとアニールされて定量される。
増幅するプローブの転写物を標識して検出する、いく
つかの他の方法が可能であり、標識リボヌクレオチドと
アビジン／ビオチン結合の併用が含まれ、それは当業者
には自明である。
ポリメラーゼプローブのＢおよびＣドメインは、クロ
ーニング、酵素的構築、化学的架橋技術、直接的化学合
成またはそれらの組み合わせによって調製され得る。ク
ローニングによって調製される場合、B/Cドメイン全体
またはそのフラグメントをコードする核酸配列は、従来
のクローニング操作によって一本鎖または二本鎖の形に
され得る。
Ｂドメインは二本鎖であり、Ｃドメインは一本鎖また
は二本鎖のいずれかであり得る。二本鎖のドメインは２
つの方法で生成され得る：鎖が別々にクローン化され、
次にその相補的な鎖がハイブリダイズされる；または代
わりに、そのプローブは一本鎖の自己アニーリングする
ポリヌクレオチド（例えば、ｂ′ｃ′ｃ ｂ）としてク
ローン化される。この場合は、４個から10個の付加ヌク
レオチド、好ましくは５個から７個のヌクレオチドをｃ
とｃ′の間にスペーサーとして配列に加えると、それが
自己アニールして二本鎖の適当な外形が現れる。スペー
サーは、通常ポリＡであるが、アッセイ中の様々なプロ
ーブ間のハイブリダイゼーション交差反応性を最少にす
るために、改変され得る。
核酸、アミノ酸、炭水化物またはポリオールブリッジ
のような間に入る結合物を介して、または他の架橋剤を
介して、ＡドメインはB/Cドメインと結合され得る。B/C
ドメインは、Ａドメインへ結合する部位を提供する官能
基を有するように誘導された５′−核酸残基とともに合
成され得る。あるいはそのような残基は、オリゴヌクレ
オチドが合成された後にそのような部位を提供するよう
に誘導され得る。化学的架橋の好ましい操作は、同一出
願人によるE.P.A.公開第0225807号に記載されているよ
うに、ポリヌクレオチドの５′末端にN4改変シトシンを
組み入れることである。
さらに好ましい実施態様においては、B/CドメインDNA
とＡドメイン抗体との結合は、酵素結合方法と同様の方
法で行われ得る。B/Cドメインは、アルキルアミン部分
を含有するように合成される。そのアルキルアミンは、
スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキ
サン−１−カルボキシレート（SMCC）のようなヘテロ二
官能性架橋剤と反応される。カラム精製後、DNAは特異
的にスルフヒドリル官能基と反応され得る。抗体は反応
性のあるスルフヒドリル（還元されたＦ（ab′）２中な
どに）を含有し、またはスルフヒドリル（Ｎ−スクシン
イミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート
（SPDP）で修飾されて還元されたときのような）を含有
するように修飾され得る。DNA−アミンと抗体−アミン
の直接の結合もまた、ホモ二官能性試薬によって可能で
あるが、典型的には、制御するのがより難しい。
Ｂ−マルチマープローブ 本発明のもう１つの実施態様は、２つの機能性ドメイ
ンを含有するDNAアンプリファイアプローブ（「マルチ
マープローブ」と呼ぶ）であり、第１のドメインＡは上
述のポリメラーゼプローブのドメインＡと同じであり、
第２のドメイン（図1DのＭ）はいくつかの繰り返しのサ
ブユニットを含有する。上述のポリメラーゼプローブの
ようにこのプローブもまた、イムノアッセイにおけるシ
グナル増幅に用いられる。
Ｍドメインのポリヌクレオチドは、同じ繰り返しの一
本鎖オリゴヌクレオチドサブユニット、または異なる一
本鎖オリゴヌクレオチドサブユニットの、直鎖または分
枝のポリマーであり得る。これらのサブユニットは、目
的の一本鎖のヌクレオチド、典型的には標識されたオリ
ゴヌクレオチド、またはほかのマルチマーに特異的また
は安定にハイブリダイズすることが可能である。これら
のユニットは、通常長さが15個から50個のヌクレオチド
であり、好ましくは15個から30個であり、そして40％か
ら60％の範囲のGC含量を有する。そのマルチマー中のオ
リゴヌクレオチドユニットの総数は、通常３個から50個
の範囲であり、さらに通常は10個から20個の範囲であ
る。そのマルチマーのオリゴヌクレオチドユニットは、
RNA、DNA、改変されたヌクレオチドまたはその組み合わ
せから構成され得る。
そのマルチマーのオリゴヌクレオチドサブユニット
は、リン酸ジエステル結合を介して、あるいは核酸、ア
ミノ酸、炭水化物またはポリオールブリッジのような間
にはさまれた結合物質を介して、あるいは核酸または修
飾された核酸鎖を架橋することが可能である他の架橋剤
を介して、互いに直接に共有結合され得る。結合の部位
（単数または複数）は、サブユニット（通常の３′−
５′の方向またはランダムな方向の）の末端、および／
または鎖の１つ以上の内部のヌクレオチドであり得る。
直鎖のマルチマーでは、個々のサブユニットは末端と
末端とが結合されて直鎖状のポリマーが生成される。１
つの型の分枝状のマルチマーでは、３つ以上のオリゴヌ
クレオチドがオリジンの点から発して分枝構造を生成す
る。そのオリジンの点は、別のオリゴヌクレオチドサブ
ユニット、または少なくとも３つのユニットが共有結合
され得る多官能性分子であり得る。別の型には、１つ以
上のペンダント（pendant）オリゴヌクレオチドサブユ
ニットを有するオリゴヌクレオチドサブユニットバック
ボーンがある。これらの後者の型のマルチマーには、構
造が「フォーク状（fork−like）」、「櫛状（comb−li
ke）」または「フォーク状」と「櫛状」との組み合わせ
のものがある。このペンダントユニットは通常、改変さ
れたヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドが結合さ
れ得るあるいは付着され得る、適当な官能基を有する他
の有機部分に依存する。図1Dを参照のこと。
そのマルチマーは全体が直鎖状か、全体が分枝状か、
または直鎖部分と分枝部分の組み合わせであり得る。好
ましくはマルチマー中に少なくとも２個の分枝点があ
り、さらに好ましく少なくとも15個あり、好ましくは15
個から50個ある。そのマルチマーは二本鎖の配列の１つ
以上のセグメントを含有し得る。
ドメインＭは、クローニング（もし直鎖状ならば）、
酵素的構築、化学的架橋技術、直接的化学合成またはそ
れらの組み合わせによって調製され得る。これらの合成
方法は、1989年５月５日に公開された、同一出願人によ
る国際特許出願、公開第89/03891号にすべて開示されて
いる。クローニングによって調製される直鎖状のマルチ
マーの場合、マルチマー全体またはそのフラグメントを
コードする核酸配列は、従来のクローニング操作によっ
て一本鎖または二本鎖の形にされ得る。二本鎖の形にさ
れる場合、最終的にはマルチマー／フラグメントは変性
されて一本鎖のマルチマー／フラグメントが提供され
る。マルチマーは、M13のような従来の一本鎖のファー
ジベクターを用いて、一本鎖の形でクローン化され得
る。フラグメントは酵素的または化学的に結合されてド
メインＭマルチマーが生成され得る。酵素的に構築され
る場合、個々のユニットは、場合により、T4 DNAリガ
ーゼまたはRNAリガーゼのようなリガーゼで連結され
る。化学的架橋によって調製される場合、個々のユニッ
トは、結合部位を提供する官能基を有するように誘導さ
れた１つ以上の核酸とともに合成され得る。あるいはオ
リゴヌクレオチドが合成された後にそのような部位を提
供するように誘導される。化学的架橋の好ましい操作
は、同一出願人によるE.P.A.第225807号に記載されてい
るように（この開示は参考としてここに採用されてい
る）、N4改変シトシン塩基をヌクレオチドに取り込むこ
とである。
直接化学合成によって調製される場合、誘導された核
酸、または、その官能基がブロックされている当価の多
官能性分子を含有するオリゴヌクレオチドは、従来のオ
リゴヌクレオチド合成技術によって生成される。その官
能基のブロックがはずされ、そしてオリゴヌクレオチド
ユニットはブロックされていない部位（単数または複
数）から合成される。
マルチマー中の分枝点を発生させるときに用いられる
分子の一般的構造は以下に示す通りである： ここで、Ｒは有機部分であり、好ましくは核酸であり、
R1は、固相から合成した核酸を除去せじかつ環外の窒素
またはリン酸保護基を除去しない条件下において、除去
され得るヒドロキシル保護基であり、Ｘは、保護された
ホスホルアミダイト、ホスホネートまたはリン酸基のよ
うな、核酸合成を容易にするリン含有基であり、Ｙは、
アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリルまたは保護され
たリン酸のような求核基から誘導されるラジカルであ
り、そしてR2は、R1、またはR1に影響することなく除去
されそして水素に置換される、ブロッキング基もしくは
保護基である。二叉の分枝または「フォーク状」の分枝
を発生させるのに用いられる分子において、R1とR2は同
じである；一方、「櫛状」の分枝を発生させるのに用い
られる分子においては、R2は、R1脱ブロッキング試薬の
存在下で安定なブロッキング基である。図４は、「櫛
状」の分枝、「フォーク状」の分枝、またはその組み合
わせを有するマルチマーを合成する際に用いられる操作
を図式的に説明している。
図４のパートＡは、自動化ホスホルアミダイト法（Wa
rnerら、DNA（1984）３:401）のような、直鎖状のオリ
ゴヌクレオチドを調製するための従来のオリゴヌクレオ
チド合成スキームを示している。黒いブロックは、固体
の支持体を示し、Ｎはヌクレオチドを表し、そしてｐ−
Ｎ−OR1（R1は下記のR1に対応する）は、適当な保護基
を有する従来のヌクレオチド誘導体を示している。
パートＢは、櫛状のマルチマーを製造する手順を示し
ている。
化合物； は、下記の構造式（２）の改変された塩基を示してい
る。所望のサイズおよび配列を有するオリゴマーユニッ
トは、支持体上で合成され、そこに残される。次に１個
以上のN4改変シトシン塩基が上記自動化手順によって鎖
にとり込まれる。好ましくは、改変塩基は次のような構
造式を有する。
ここでＺは−Ｏ−、−NH−、−Ｓ−、PO4＝、および のような求核基、R1は一般に塩基に安定性で酸に感受性
の、ジメトキシトリチル（DMT）あるいはピキシルのよ
うな阻止あるいは保護基、R2は水素あるいはメチル、R3
は のような、R1に影響を及ぼすことなく取り除かれ水素に
置換される、阻止あるいは保護基、R5は、化学合成中に
オリゴヌクレオチド鎖の５′位置へのヌクレオチド付加
を可能にする、ホスホルアミダイトあるいはリン誘導体
（例えば、リン酸ジエステル、リン酸トリエステルな
ど）、R6は、メチル、水素、Ｉ、Br、あるいはＦ、そし
てＸは、１から８の範囲の（１と８とを含む）整数であ
る。１個より多い改変塩基が組み込まれるとき、好まし
くは鎖の介在塩基によって、最も好ましくは−TT−二量
体によって一定の間隔があけられる。付加的なヌクレオ
チドユニットは、付加的な改変塩基等に続いて、骨格に
組み込まれる。
次にN4求核基を脱保護し（R3を取り除く）、自動化手
順によってそこから付加的なオリゴヌクレオチドユニッ
トを生成する。鎖の末端の残基R1基を取り除き、分枝し
た「櫛状の」マルチマーを支持体から切り離す。
図４のパートＣは、「フォーク状の」マルチマーを製
造する一般的な手順を示している。再び、所望のサイズ
と配列のオリゴマーユニットを従来法で合成し、支持体
上に残す。次に、ブロッキングホスホルアミダイトのよ
うなブロッキングされた二官能性のリン含有基（パート
ＣでXPと表示）を自動化手順によって、鎖に組み込む。
好ましい二官能性リン含有基は、下記の構造式で示され
る、阻止されたホスホルアミダイト； ここでＲは該ヒドロキシル保護基、iPrはイソプロピ
ル、およびR1はメチルあるいはβ−シアノエチル；であ
る。最も好ましくは、ＲはDMTであり、そしてR1はβ−
シアノエチルである。
あるいは、R1＝R2であるN4改変シトシン塩基（例えば
DMT）を使用し得る。
次に２つの保護基を取り除き、自動化手順によりそこ
から付加的なオリゴヌクレオチドユニットを得る。残基
R1基を取り除き分枝状のマルチマーを支持体から切り離
す。
パートＤおよびＥは、２回以上二またに分かれたマル
チマー、「櫛状の」マルチマー、あるいはそれらの組み
合わせのマルチマーを酵素的にあるいは化学的につなぎ
合わせる手順を示している。一般的に、分枝状の、およ
び／あるいは「櫛状の」マルチマーは上述のように調製
され、そして支持体から取り除かれる。次に上述のよう
に酵素的なあるいは化学的な結合手順を用いて、溶液中
でつなぎ合わせる。
パートＦは、複数の「櫛状の」マルチマーを合成する
手順を示している。この手順はパートＢで示した手順の
変法であり、ぶら下がった側鎖での改変塩基の組み込み
に関与し、そこから第２のオリゴヌクレオチド側鎖を生
じる。
適切な切断可能なリンカー分子をマルチマーの構造を
分析する目的で、あるいは所定のセグメント（標準オリ
ゴヌクレオチドに結合するマルチマーの部分）を放出す
るための手段として、マルチマーの所定の部位に組み込
み得る。マルチマー合成と精製に続いて、これらのリン
カーはマルチマーのヌクレオチド構造の付随的な分解を
伴わずに特異的に切断され得る。好ましい型のリンカー
分子は、該リンカーが標準的なホスホルアミダイト化学
プロトコールによって、任意のDNAフラグメントに組み
込まれ得るために、保護されたヒドロキシル基およびホ
スホルアミダイトから誘導されたヒドロキシル基、なら
びに、1,2−ジオール基（過ヨウ化物によって選択的に
切断され得る）を含有するように設計する。このような
リンカーの好ましい実施態様は、下記の化合物である： ここでDMTおよびiPrは前述のように定義される。DNAフ
ラグメントに組み込まれ、完全に脱保護した後、リンカ
ー含有フラグメントは次のような構造を有する： ここでDNA1およびDNA2はDNAサブラグメントを表してお
り、同じでも異ってもよい。このフラグメントを過ヨウ
素酸ナトリウムと反応させると、次のようなサブフラグ
メントに切断される。
あるいは、1,2−ジオール基は、ヒドロキシルアミン
感受性結合、塩基感受性スルホン結合、あるいはチオー
ル感受性ジスルフィド結合を含むリンカーグループで置
換され得る。このようなリンカーグループは、タンパク
質を他の物質に結合させるために用いられる従来の架橋
剤から誘導され得る。同様にDMT以外の保護基が使用さ
れ得る。
ポリメラーゼプローブの機能的な局面は、ポリメラー
ゼプローブの多数のプロモーター／テンプレート（B/
C）ドメインを含むサブユニットを用いて、Ｍドメイン
を有するマルチマープローブを合成することによって、
マルチマープローブ構造と結合され得る。マレツマープ
ローブのように、多数のサブユニットは直鎖状でも分枝
した分子でもよい。
ポリメラーゼプローブのように、マルチマープローブ
のＡドメインは、核酸、アミノ酸、炭水化物、あるいは
ポリオール架橋のような介入される架橋剤、あるいは他
の架橋剤を介してＭドメインに結合され得る。Ｍドメイ
ンは、Ａドメインに対する結合部位を供する官能基を有
するように誘導体化された、５′核酸残基を用いて合成
し得るし、あるいはこのような部位を供するようにオリ
ゴヌクレオチドを合成した後で、該残基を誘導体化し得
る。化学的な架橋の好ましい手順は、同一出願人による
E.P.A公開番号0225807および前記セクションＩ（Ａ）に
記載のように、N4改変シトシン塩基をポリヌクレオチド
の５′末端に挿入する方法である。
II−イムノアッセイ 本発明の別の局面では、免疫学的な分析物の存在およ
び濃度を検出および定量するためのイムノアッセイに、
アンプリファイアプローブを使用する。このアンプリフ
ァイアプローブは２つのクラスからなる：前記セクショ
ンＩに記載のハイブリッドプローブ（ポリメラーゼプロ
ーブあるいはマルチマープローブ）、あるいは米国出願
番号463,022および米国出願番号340,031に記載のポリヌ
クレオチドプローブである。これらのプローブはハイブ
リッドプローブに類似しているが、ポリペプチドでなく
ポリヌクレオチド配列を含むＡドメインを有する。
分析物は、既知のあらゆる重要な免疫原であり得る。
分析物は調製した試料に低濃度で存在し得、あるいは生
物学的物質の不均一な混合物中の少数種であり得る。分
析物は、例えば生物学的流動体あるいは組織、食物、環
境物質等のさまざまな種に存在し得、あるいはインビト
ロで合成し得る。
最初の工程で、当業者に既知の種々の方法の何れかに
よって分析物を含む試料を調製する。
アンプリファイアプローブを、溶液中あるいは固相に
固定して行う多くのイムノアッセイプロトコールにおい
て、分析物を検出するために使用することができる。も
しイムノアッセイを溶液中で行うならば、分析物を含む
試料は、アンプリファイアプローブに直接的に結合され
るか、分析物に対して特異的な１個以上の抗原によって
間接的に結合されるかし、あるいは、もしポリヌクレオ
チドプローブを使用するならば、ハイブリッドリンカー
分子（後出のセクションII（Ｂ）で述べる）との結合に
おいて、結合される。アンプリファイアプローブは、こ
の方法でほとんどの可溶性のイムノアッセイプロトコー
ルに利用し得る。例えば米国特許番号4,778,751を参
照。
固相を利用するイムノアッセイにおいては、分析物
（抗原でも抗体でも有り得る）は固相に直接的に固定さ
れるか、最初に固相に結合された第１抗原に分析物が結
合することにより間接的に固定化されるか、あるいは第
２抗原が分析物を認識し、次に分析物が固相に結合され
た第１抗原によって認識されるサンドイッチアッセイ
（図2A）によって固定化される。
もし分析物が直接的に固相に結合されるのなら、分析
物を含む試料はニトロセルロースフィルターあるいは非
特異的に結合するタンパク質に対する類似の手段に接触
される。もし分析物が間接的にかつ選択的に固相に結合
されるのなら、分析物のエピドープあるいは第２抗原に
対する第１抗原は固相に結合され、続いて分析物あるい
は分析物に結合した第２抗原に結合するのに使用され
る。
Ａ−ハイブリッドプローブの使用 次に、分析物とアンプリファイアプローブとの間のリ
ンカーとして、分析物の第２のエピドープに特異的な他
の抗体を使用し得る。次に、ポリメラーゼプローブある
いはマルチマープローブの何れかであり、そのＡドメイ
ンが第２抗原に特異的であるアンプリファイアプローブ
をリンカー抗体に結合し得、固相に結合された第１抗
体、第２抗体、分析物、リンカー抗体、およびアンプリ
ファイアプローブからなる一連のもの（ストリング）を
形成する（図2A）。
Ｂ−ポリヌクレオチドプローブの使用 他の実施態様においては、使用するアンプリファイア
プローブは、国際公開番号89/03891に記載のポリヌクレ
オチドマルチマープローブの一種である。このプローブ
は、本出願のペプチド／ヌクレオチドハイブリッドマル
チマープローブとは、そのドメインＡが、抗体として機
能するポリペプチドでなくポリヌクレオチド配列である
点で異なっている。続いて、抗体／ポリヌクレオチドハ
イブリッドリンカーを、分析物のアンプリファイアプロ
ーブへの間接的な結合に使用する（図2B）。このハイブ
リッドリンカーは、分析物のエピドープあるいは分析物
を認識する抗体のエピドープに対する、特異的な抗体と
して機能するポリペプチドである第１のドメイン、およ
びアンプリファイアプローブのＡドメインのヌクレオチ
ド配列に対して実質的に相補的であるヌクレオチド配列
である第２のドメインを有する。
同様に他の実施態様においては、米国出願番号463,02
2に記載のポリヌクレオチドポリメラーゼプローブの１
つを使用し得る。これらのプローブは、本出願のプロー
ブとは、そのドメインＡが抗体として機能するポリペプ
チドでなくポリヌクレオチド配列である点で異なってい
る。これらのプローブも上述のハイブリッドリンカーを
使用することが必要である。
ポリヌクレオチドアンプリファイアプローブ、および
上述のセクションＩに記載のハイブリッドアンプリファ
イアプローブでなくハイブリッドリンカーを使用するこ
とによって、アンプリファイアプローブは、核酸ハイブ
リダイゼーションアッセイおよびイムノアッセイの両方
に有用な「普遍的な」試薬になり得る。
Ｃ−結合およびハイブリダイゼーションの条件 好ましい実施態様においては、分析物は、例えば96ウ
エルのポリビニルクロリド（PVC）プレートのような固
相に間接的に固定される。図2Aに示したサンドイッチア
ッセイにおいては、50μｌの第１抗体（0.2M NaHCO3中2
0μg/mlの濃度の抗ウサギ抗体）をウエルに加える。ウ
エルをおおい、加湿下室温で２時間インキュベートす
る。次に溶液をウエルから吸引する。次にウエルを、0.
02％のアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝化生理食塩水
中に３％のウシ血清アルブミンを含有するブロッキング
バッファーで２回洗浄する。次に、ウエルを加湿下室温
で20分間ブロッキングバッファーとともにインキュベー
トし、そしてブロッキングバッファーでもう２回洗浄す
る。
50μｌの第２抗体（これも20μg/mlの濃度のウサギ抗
分析物）をウエルに加え、上述の処置を繰り返す。分析
物中のブロッキングバッファー中の次の希釈系列を調製
する。各希釈液の50μｌをウエルに加える。プレートを
おおい、加湿下室温で２時間インキュベートする。イン
キュイベーションに続いて、ウエルをブロッキングバッ
ファーで４回洗浄する。次に第３抗体（マウス抗分析
物）を同様の様式で加え、続いてハイブリッドアンプリ
ファイアプローブを加える。時々、組織調製物が抗DNA
抗体を含んでいることがあるので、プローブの添加に続
いて行われる洗浄に使用するブロッキングバッファーに
も、20μg/mlのサケ精子DNAを含ませる。
ポリヌクレオチドアンプリファイアプローブあるいは
ハイブリッドマルチマープローブを使用する際は、分析
物と抗体との複合化に続いて、核酸ハイブリダイゼーシ
ョン工程を行う。通常ハイブリダイゼーションン条件
は、種々の添加物を含む水性媒体、特に緩衝化水性媒体
でなる。これらの添加物には、ハイブリダイズさせるポ
リヌクレオチド、塩（例えば、0.017Mから0.17Mのクエ
ン酸ナトリウムおよび／または0.17Mから1.7Mの塩化ナ
トリウム）、NP−40あるいはトリトンＸ−100（0.1から
1.0％）のような抗原／抗体の複合を妨げない非イオン
性界面活性剤、およびキャリア核酸が含まれる。混合物
を35℃から55℃で15から75分間インキュベートする。
もし標識オリゴヌクレオイドの多量体サブユニットに
対するハイブリダイゼーションの条件が、抗原／抗体複
合体の不安定化を誘引するのなら、複合体をグルタルア
ルディドのようなタンパク質架橋剤で処理するか、ある
いは複合体を安定化させる類似の方法をハイブリダイゼ
ーション工程に先だって行う。一旦タンパク質複合体を
安定化すると、核酸ハイブリダイゼーション条件を、SD
S（１％まで）、ジメチルホルムアミド、ジメチルスル
フォキシド、およびホルムアミドのような非水性溶媒を
含むように変更し得、温度を70℃まで上げられる。
抗原／抗体複合体の安定性を維持するように核酸ハイ
ブリダイゼーションの条件を調節することが重要であ
る。例えば、相補配列のより短い一区切りのハイブリダ
イゼーションは、より低い温度で行われる。好ましい実
施態様においては、相補的な一本鎖の領域は12から20塩
基である。好ましい実施態様においては、ハイブリダイ
ゼーション温度は、35から45℃である。さらに、この工
程で存在する唯一の一本鎖オリゴヌクレオチドは相補鎖
であるから、より高い緊縮性とその結果としての低い塩
濃度（0.3M Na）が許容される。
１−マルチマープローブ もしマルチマープローブを使用するのなら、続いて、
Ｍドメインの繰り返しポリヌクレオチドに実質的に相補
的な標識オリゴヌクレオチドを、相補的な多量体のオリ
ゴヌクレオチドユニットとのハイブリダイズを可能にす
る条件下で加える。次に得られる固相標識核酸複合体
を、結合していない標識オリゴヌクレオチドを取り除く
ための洗浄によって、余剰の標識オリゴヌクレオチドか
ら分離して測定する。
増幅は、アッセイにおいて１種より多い多量体（サブ
ユニット配列で定義される）を用いることにより増やし
得る。このような列では、第２の多量体は第１の多量体
の繰り返し配列に結合するよう設計され、次にその複合
体は、第２の多量体の繰り返し配列に実質的に相補的な
オリゴヌクレオチドで標識される。多数の多量体がこの
方式によって、この列に結合し得、より多く増幅でき
る。
２−ポリメラーゼプローブ もしポリメラーゼプローブを使用するのなら、続い
て、アンプリファイアプローブのプロモーター領域（ド
メインＢ）に特異的なRNAポリメラーゼを適切な転写条
件下で加え、Ｃドメインテンプレート（ｃ′）の多数の
RNAコピー（ｃ）を生産する。転写物の量は、開始の調
製での分析物の量に比例する。
転写条件は、水性媒体、好ましくは通常はマグネシウ
ム塩を含む適当な塩、rATP、rUTP、rGTP、rCTP、RNAポ
リメラーゼ酵素を含む緩衝化水性媒体で、通常は種々の
変性剤、タンパク質キャリア、およびRNアーゼ阻害剤か
らなる。インキュベーションは通常は15から90分、通常
は60分であり、選択した酵素に最適の温度で、通常は35
℃から42℃、通常は37℃で行う。
Ｃドメインの配列を特異的な検出スキームのために設
計し、それらのスキームの数種を転写物の定量に使用す
る。例えばＣドメインの転写産物（ｃ）は、２つのサブ
ドメイン−C1およびC2（図2B）に再分割し得る。サブド
メインC1は、固相に固定化された転写キャプチャープロ
ーブに相補的である。サブドメインC2はラベリングプロ
ーブに相補的である。ハイブリダイゼーションの後に残
存する標識の量は、元の試料に存在する分析物の量に直
接的に比例する。
他の実施態様においては、Ｃドメインの転写物はC1サ
ブドメインのみを有する。Ｃドメインを標識リボヌクレ
オチド三リン酸の存在化で転写し、標識転写物を固定化
キャプチャープローブに、相補的なC1サブドメインを介
して結合させて定量する。
しかしながら他の実施態様においては、Ｃドメインの
転写物はC2サブドメインのみを有する。Ｃドメインをビ
オチン化リボヌクレオシド三リン酸の存在下で転写し、
次に転写物をアビジンビーズ上に捕獲する。次に転写物
を、その相補的なC2サブドメインを介してラベリングプ
ローブにアニールして定量する。
アンプリファイングプローブの転写物を標識し検出す
るいくつかの他の方法が使用し得、この方法には、標識
リボヌクレオチドとアビジン／ビオチンカップリングを
同時に使用する方法が含まれ、これらは当業者に公知で
ある。
３−一般的な考察 アッセイに使用する固相は粒子でもあり得るし、例え
ば遠心分離用のチューブ、カラム、マイクロタイタープ
レートウエル、フィルター、チューブなどのような種々
の容器の固体壁表面でもあり得る。好ましくは約0.4か
ら200ミクロンの範囲の大きさの粒子が使用され、さら
に通常は約0.8から4.0ミクロンである。粒子は、ラテッ
クス、ガラスのような従来のあらゆる物質であり得る。
分析物、あるいは分析物に特異的な第２抗体に特異的な
第１抗体は、既知の方法で官能基を介して固相に安定に
結合され得る。
もしポリメラーゼプローブを使用するのなら、ラベリ
ングプローブ、アンプリファイアプローブの転写物のC2
サブドメインに相補的な配列を含む。マルチマープロー
ブを使用するのなら、ラベリングプローブは、Ｂドメイ
ンの繰り返しユニットに相補的な配列を含む。ラベリン
グプローブは、直接的にあるいは間接的に検出可能なシ
グナルを提供する１個以上の分子（「標識」）を含む。
標識は相補的配列の個々のメンバーに結合し得、あるい
は複数の標識を有する末端メンバーあるいは末端テール
として存在する。配列に結合される標識を供給する種々
の方法が文献に報告されている。例えば、Urdeaら、Nuc
l.Acids Res.（1988）16:4937、Learyら、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA（1983）80:4045、RenzおよびKurz、Nucl.Ac
ids Res.（1984）12:3435、RichardsonおよびGumport、
Nucl.Acids Res.（1983）11:6167、Smithら、Nucl.Acid
s Res.（1985）13:2399、MeinkothおよびWahl、Anal.Bi
ochem.（1984）138:267を参照のこと。標識は相補配列
に共有結合で、あるいは非共有結合により結合され得
る。使用し得る標識には、放射性核種、蛍光物質、化学
発光物質、色素、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻
害剤、酵素サブユニット、金属イオンなどが含まれる。
特異的な標識の例として、フルオレッセイン、ローダミ
ン、テキサスレッド、フィコエリスリン、ウンベリフェ
ロン、ルミノール、NADPH、ガラクトシダーゼ、ホース
ラディッシュパーオキシダーゼなどが挙げられる。非放
射性同位体標識方法との比較のためにUrdeaらの文献を
参照のこと。
ラベリングプローブは、同一出願人によるE.P.A公開
番号225807に記載の化学合成法等により簡便に調製でき
る。便利な官能性を有する末端基を提供することによっ
て、種々の標識がその官能性によって結合され得る。従
って、種々の標識が配列の二重構造に有害な影響を及ぼ
す事なく結合し得る、カルボキシ、チオール、アミン、
ヒドラジン、あるいは他の官能性を供給し得る。既に示
したように、ラベリング配列に相補的な配列に結合し得
る複数の標識を有する分子を得ることができる。あるい
は、ラベリング配列に結合されるリガンドを有し得、標
識分析物複合体を供給するリガンドへの結合のための標
識レセプターを使用し得る。
標識の存在を検出するために、標識の性質によって種
々の技法を使用し得る。蛍光物質に対しては、種々の蛍
光計を利用することができる。酵素とともに蛍光あるい
は着色生成物を供給し得、蛍光比色、分光光度あるいは
視覚により測定し得る。イムノアッセイに使用する種々
の標識およびイムノアッセイに適用可能な技法を、本ア
ッセイに使用し得る。
アッセイの分離工程に用いられる方法は、固相の性質
によって変化する。粒子の場合、遠心あるいは濾過によ
り粒子を分離し、上澄みが排除されあるいは上澄みが単
離される。粒子をアッセイする段階では、例えばSDSを
含むPBSのような洗浄剤を含む適切な緩衝化媒体で完全
に、通常１から５回、粒子を洗浄する。分離物質が壁あ
るいは支持体である場合、上澄みを単離し、あるいは排
除し、壁を粒子の場合に示したのと同様の方法で洗浄す
る。
D.競合イムノアッセイ 本発明のハイブリッドアンプリファイアプローブは、
競合イムノアッセイにおいて、抗原を標識するための方
法に使用し得る。典型的なアッセイにおいて、過剰のモ
ノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、好ましくは分
析物に特異的に結合するモノクローナル抗体を固相、通
常は複数ウエルのプレートに固定する。標準的な濃度の
標識抗原を、未知量の分析物を含むと考えられる試料の
一連の希釈液と混合する。次に、各希釈液を固定した抗
原にさらし、結合された標識の量を測定する。非標識分
析物が標識分析物と競合する能力は、試料中の分析物濃
度を計算するために用いられる。
一つの実施態様において、ポリメラーゼプローブのB/
Cドメインのポリヌクレオチド部分を、競合免疫原に結
合させる。次に、このハイブリッド分子を前述の標識抗
原として使用する。競合結合の後、ポリメラーゼ（Ｂド
メインプロモーターに対して特異的）を加え、転写産物
を前出のセクションＩ（Ａ）に記載の方法でアッセイす
る。
他の実施態様において、マルチマープローブのＭドメ
インポリヌクレオチド部分を競合免疫原に結合する。次
に、このハイブリッド分子を前述の標識抗原として使用
する。競合結合の後、Ｍドメインを標識し、前述の方法
で定量する。
免疫原をDNAと結合させるために、ジスクシニミジル
スベラート（DSS）、エチレングリコールビス（スクシ
ニミジルスクシネート）（EGS）、あるいはｐ−フェニ
レンジイソチオシアネート（DITC）のような同一二官能
性の試薬は、前出のセクションＩ（Ａ）に記載のカップ
リング方法よりも、おそらくはより有用である。
本発明の増幅されたイムノアッセイを行うためのキッ
トは、詰め合わせの組み合わせとして以下の試薬を含
む：抗原分析物を結合し得るか、あるいは、もし分析物
が結合された第１抗体あるいは第２抗体を介して固相に
間接的に結合されるようなアッセイ形式では、代替的に
既に固相に結合されている結合用の第１抗体を有する固
相；必要に応じて、分析物に特異的なリンカーである第
２あるいは第３抗体、そしてもしポリヌクレオチドアン
プリファイアプローブを使用するアッセイ形式であれ
ば、ハイブリダイッドリンカープローブ；アンプリファ
イアプローブ；適当なDNAに対するRNAポリメラーゼおよ
び固定化された転写キャプチャープローブ（ポリメラー
ゼアンプリファイアプローブを使用する場合）；および
適当なラベリングプローブ。これらの試薬は典型的に
は、キット中の別々の容器に入れられる。キットには、
ハイブリダイゼーションバッファー、洗浄溶液、陰性お
よび陽性のコントロールおよびアッセイを実施するため
の説明書が含まれる。
以下の実施例は、例として示すものであって本発明を
限定するものではない。本発明の意図する範囲内の他の
実施態様が当業者には明らかである。
実施例１−ヒト血清におけるHCV抗原の存在についての
イムノアッセイ このアッセイは、Ｃ型肝炎ウィルスのＣ−100抗原の
存在を直接に検査するために設計される。このイムノア
ッセイのための一般的なプロトコールは、前述されたと
おりである。第１抗体としてヤギ抗マウス抗体を使用す
るマイクロタイタープレートを用意する。この抗体を96
ウェルのマイクロタイタープレートのウェル中に固定化
する。第２抗体は、HCV C−100のエピトープに特異的な
マウスモノクローナル抗体である。HCVについてスクリ
ーニングしようとする個体からの血清の同一の２つの希
釈物をブロッキングバッファー中で調製し、適切な非感
染コントロールと並列してマイクロタイターのウェル中
でインキュベートする。第３抗体は、各HCV抗原を確認
するポリクローナルウサギ抗体の組み合わせである。最
後の抗体は、ハイブリッドT7ポリメラーゼアンプリファ
イアプローブである。ドメインＡのポリペプチド部分
は、ヤギ抗ウサギ抗体として機能し、「サンドイッチ」
イムノアッセイを完成させる。
T7ポリメラーゼプローブを添加した後、ドメインＣの
転写は、この複合体を、40mM Tris HC1（pH8）、20mM M
gCl2、10mM NaCl、1mMスペルミジン、10mMジチオスレイ
トール、0.15mg/mlウシ血清アルブミン、rATP、rCTP、r
GTP、rUTPがそれぞれ1.25mM、1600単位/ml RNアシン、
および2000単位/ml T7 RNAポリメラーゼからなる溶液20
μｌ中でインキュベートすることにより実施する。この
混合物を37℃で１時間インキュベートする。8 x SSCお
よび0.2％SDSを含有する溶液20μｌを添加して転写を停
止させ、混合物全体を、C1′配列を有する固定化キャプ
チャープローブを含む新しいウェルに移し変える。ドメ
インＣの転写物の捕捉（図３）は、55℃で１時間インキ
ュベートし、その後0.1 x SSC、0.1％SDSで２回洗浄す
ることによって実行される。
次に、ドメインＣの転写物を、40μｌの4 x SSC、100
μg/mlのポリＡ中の酵素標識プローブ（c2′）50fmolを
55℃で15分間添加することにより標識する。最後に、こ
の複合体を0.1 x SSC、0.1％SDSで洗浄し、続いて0.1 x
SSCで２回洗浄する。
AP検出のために、Lumigen Inc.から得られる、酵素が
引き金となって起こるジオキセタン反応（Schapp（198
7）ら、Tet.Lett.28:1159−1162および米国特許第4,85
7,652号）を行う。検出方法は、以下のように行う。標
識工程では、APプローブを有するHMブッファー20μｌを
各ウェルに添加し、それらのウェルを55℃で15分間イン
キュベートする。上清を除去して、各ウェルを380μｌ
の0.1 x SSCおよび0.1％SDSで２回洗浄する。次に、そ
れらのウェルを380μｌの0.1 x SSCで２回洗浄して、残
存する全てのSDSを取り除く。CTABバッファー中の3.3 x
10-4Mジオキセタン20μｌを各ウェルに添加する。これ
らのウェルを軽くたたいて試薬が底に沈むようにし、こ
の試薬が底全体に均一に分布するようゆっくりと回す。
ウェルをマイクロタイタープレートのシールで覆い、37
℃のオーブンで１時間インキュベートする。次にウェル
をルミノメーターで読み、既知量の抗原について作成さ
れた標準曲線と比較して定量する。
実施例２−ヒト血清におけるHCVに対する抗体の存在に
ついてのイムノアッセイ マイクロタイタープレートをまず、Ｃ型肝炎ウィルス
からのHCV C−100抗原でコートする。コーティングバッ
ファー（50mMホウ酸ナトリウム、pH9.0）、21ml/プレー
ト、BSA（25μg/ml）、HCV C−100（2.50μg/ml）を含
む溶液を添加の直前に調製する。この溶液を0.2ml/ウェ
ルでプレートに添加し、５分間混合した後、されらを覆
って37℃で２時間インキュベートし、その後この溶液を
吸引によって取り除く。これらのウェルを0.4mlの洗浄
バッファー（100mMリン酸ナトリウム、pH7.4、140mM Na
Cl、0.1％カゼイン、１％（w/v）Triton X−100、0.01
％（w/v）ヒビテン）で１回洗浄する。洗浄溶液を除去
した後、200μl/ウェルのコート後溶液（10mMリン酸ナ
トリウム、pH7.2、150mM NaCl、0.1％（w/v）カゼイ
ン、３％ショ糖、および2mMフェニルメチルスルホニル
フルオライド（PMSF））を添加し、プレートをゆったり
と覆って気化するのを防ぎ、そして室温に30分間放置す
る。次にこれらのウェルを吸引して溶液を取り除き、棚
の加温なしに、１晩凍結乾燥する。
イムノアッセイを遂行するために、血清サンプルまた
はコントロールの同一の２つの希釈液20μｌをサンプル
希釈物（100mMリン酸ナトリウム、pH7.4、500mM NaCl、
1mM EDTA、0.1％（w/v）カゼイン、0.01％（w/v）Hibri
tance、１％Triton X−100、100μg/ml酵母抽出液）200
μｌを含むウェルに添加する。これらのプレートをシー
ルし、37℃で２時間インキュベートし、その後この容液
を吸引により除去して、そしてこれらのウェルを400μ
ｌの洗浄バッファー（0.05％Tween20を含むPBS）で３回
洗浄する。
血清サンプルの添加に引き続いて、これらのウェル
を、ウサギ抗ヒト血清を第３抗体（ウサギ抗分析物抗
体）で置き換えたこと以外、上記実施例１と同様にして
処理する。
実施例３−HCV感染の検出におけるマルチマープローブ
の使用 上記２つの実施例のいずれかにおいて、マルチマープ
ローブがポリメラーゼプローブと置き換えることができ
る。各実施例において全ての工程が、マルチマープロー
ブがポリメラーゼプローブよりも使用されるということ
を除いて、アンプリファイアプローブを添加するところ
まで同じである。アンプリファイアプローブと結合させ
た後、ドメインＭの多量体サブユニットと実質的な相同
性を有する標識オリゴヌクレオチド配列50fmolを含む溶
液を添加する。この酵素標識プローブを、40μｌの4 x
SSC、100μg/mlポリＡ中に15分間55℃で添加する。最後
に、この複合体を、0.1 x SSC、0.1％SDSで２回洗浄
し、さらに0.1 x SSCで２回洗浄した。
AP検出のために、Lumigen Inc.から得られる、酵素が
引き金となって起こるジオキセタン反応（Schapp（198
7）ら、Tet.Lett.28:1159−1162および米国特許第4,85
7,652号）を行う。検出方法は、以下のように行う。標
識工程では、APプローブを有するHMバッファー20μｌを
各ウェルに添加し、それらのウェルを55℃で15分間イン
キュベートする。上清を除去して、各ウェルを380μｌ
の0.1 x SSCおよび0.1％SDSで２回洗浄する。次に、そ
れらのウェルを380μｌの0.1 x SSCで２回洗浄して、残
存する全てのSDSを取り除く。CTABバッファー中の3.3 x
10-4Mジオキセタン20μｌを各ウェルに添加する。これ
らのウェルを軽くたたいて試薬が底に沈むようにし、こ
の試薬が底全体に均一に分布するようゆっくりと回す。
ウェルをマイクロタイタープレートのシールで覆い、37
℃のオーブンで１時間インキュベートする。次にウェル
をルミノメーターで読み、既知量の抗原について作成さ
れた標準曲線と比較して定量する。
実施例４−HCV感染の検出におけるポリヌクレオチドポ
リメラーゼプローブの使用 上記実施例１または２のいずれかにおいて、ポリヌク
レオチドポリメラーゼプローブを、ハイブリッドポリメ
ラーゼプローブで置き換えることができる。各実施例に
おいて全ての工程が、HCV抗原のそれぞれを認識するポ
リクローナルウサギ抗体の組み合わせである第３抗体を
添加するところまで同じである。続いて、50μｌのハイ
ブリッドリンカー分子を、0.2M NaHCO3中20μg/mlの濃
度で添加する。このインキュベーションを、全ての前記
抗体インキュベーションと同様のプロトコールに従って
実施する。このハイブリッドリンカー分子は抗ウサギ抗
体として機能し、あらかじめウサギの第３抗体に結合さ
れた全てのものに結合する第１のドメインを有する。ハ
イブリッドリンカーの第２ドメインは15残基を有するオ
リゴヌクレオチドであり、その配列はポリヌクレオチド
ポリメラーゼプローブのドメインＡと実質的に相補的で
ある。インキュベーションと洗浄の後、ポリメラーゼプ
ローブをハイブリダイゼーションバッファー（0.3M NaC
l、0.1％NP−40）50μｌに添加し、40℃で60分間インキ
ュベートする。インキュベーションの後、過剰なプロー
ブを除去して、複合体をハイブリダイゼーションバッフ
ァーで３回洗浄する。ドメインＢを転写させて、転写物
を実施例１のように定量する。
実施例５−HCV感染の検出におけるポリヌクレオチドマ
ルチマープローブの使用 このアッセイは、ポリヌクレオチドプローブを添加す
るところまで実施例４と同一である。それに続く標識の
ドメインＭサブユニットへのハイブリダイゼーションと
標識の定量は、実施例３と同様である。
実施例６−固定化したヒトIgGの検出におけるポリヌク
レオチドマルチマープローブの使用 15の従属側鎖のそれぞれが標識プローブに相補的な３
つの部位（全部で45部位）と、骨格に結合する末端ビオ
チン分子を有している、櫛状の分枝ポリヌクレオチドを
上記のように調製する。
ヒトIgGを様々な濃度で個体支持体に固定化させた。
固定化したIgGをビオチン化されたアフィニティー精製
のヤギ抗ヒトIgG（ビオチン濃度40ng）とインキュベー
トし、過剰の抗血清を支持体から洗い流した。次にこの
支持体を、200ngのアピジンＤと、さらに500fmの櫛状ポ
リヌクレオチドとインキュベートし、そして適切な洗浄
を行った。次にこの支持体を、ポリヌクレオチド上の標
識プローブ結合部位に相補的なホースラディッシュペル
オキシダーゼで標識したオリゴヌクレオチドプローブと
インキュベートした。吸光度（O.D.）の読みは、492/62
0nmで行った。
比較を目的とするアッセイを、１つのみの標識プロー
ブ結合部位を有するポリヌクレオチドを使用して、上記
のように行った。
下記の表は、これらのテスト結果を示す。
記録されたところによると、45部位のポリヌクレオチ
ドは、単一部位ポリヌクレオチドよりもよりも高いシグ
ナルを発していた。
イムノアッセイ法に対するこの適用において記述され
た様々なアンプリファイアプローブの他の改変および適
用は、当業者に自明であり、本発明の範囲内であること
が意図されるものである。
配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人：アーデア、マイケル エス． （ii）発明の名称：タンパク質−核酸プローブおよび
それを用いたイムノアッセイ （iii）配列数:12 （iv）関連住所： （Ａ）住所人：アイレル アンド マネラ （Ｂ）番地：ミドルフィールドロード545、スィー
ト200 （Ｃ）市：メンロ パーク （Ｄ）州：カリフォルニア （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号:94025 （ｖ）コンピューター読み出し形態： （Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC互換用 （Ｃ）操作システム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース＃1.
0、バージョン＃1.25 （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号:PCT/US91/02925 （Ｂ）出願日:1991年５月６日 （Ｃ）分類： （vii）代理人／事務所情報： （Ａ）氏名：シオッティ、トーマス イー． （Ｂ）登録番号:21,013 （Ｃ）照会／記録番号:2300−0046.51 （ix）電話回線情報： （Ａ）電話:415−327−7250 （Ｂ）テレファックス:415−327−2951 （Ｃ）テレックス:706141 （２）SEQ ID NO:1の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:7塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列:SEQ ID NO:1: （２）SEQ ID NO:2の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:17塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列:SEQ ID NO:2: （２）SEQ ID NO:3の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:17塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列:SEQ ID NO:3: （２）SEQ ID NO:4の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:32塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー；直鎖状 （xi）配列:SEQ ID NO:4: （２）SEQ ID NO:5の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:32塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列:SEQ ID NO:5: （２）SEQ ID NO:6の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:43塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列:SEQ ID NO:6: （２）SEQ ID NO:7の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:43塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列:SEQ ID NO:7: （２）SEQ ID NO:8の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:10塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列:SEQ ID NO:8: （２）SEQ ID NO:9の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:41塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列:SEQ ID NO:9: （２）SEQ ID NO:10の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:41塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列:SEQ ID NO:10: （２）SEQ ID NO:11の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:43塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列:SEQ ID NO:11: （２）SEQ ID NO:12の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:43塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列:SEQ ID NO:12:
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/532 C12Q 1/68

Claims (35)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】イムノアッセイにおいてシグナルアンプリ
    ファイアとして使用する分子プローブであって、該プロ
    ーブが、 （ａ）ポリペプチドであり、既知の抗原に特異的な抗体
    として機能する第１ドメイン（Ａ）、 （ｂ）DNA依存性RNAポリメラーゼ酵素活性に対するプロ
    モーターとして機能し得る二本鎖ポリヌクレオチドであ
    る第２ドメイン（Ｂ）、および （ｃ）該第２ドメインに隣接する一本鎖または二本鎖で
    あり、その結果該第２ドメインの該プロモーター活性に
    対する鋳型として機能し得る第３ドメイン（Ｃ）、 を含む、分子プローブ。
  2. 【請求項２】前記DNA依存性RNAポリメラーゼ活性がバク
    テリオファージT7に由来する、請求項１に記載のプロー
    ブ。
  3. 【請求項３】前記第２ドメインＢの長さが少なくとも10
    個でありおよび40個未満のヌクレオチドである、請求項
    １または２に記載のプローブ。
  4. 【請求項４】前記第３ドメインＣの長さが少なくとも30
    個でありおよび80個未満のヌクレオチドである、請求項
    ３に記載のプローブ。
  5. 【請求項５】前記ポリメラーゼ活性が前記バクテリオフ
    ァージT7に由来し、前記第２ドメインＢの配列が、 を含有する、請求項２に記載のプローブ。
  6. 【請求項６】前記ポリメラーゼ活性がバクテリオファー
    ジT7由来である、請求項２に記載のプローブであって、
    前記第２ドメインＢのヌクレオチド配列が である、プローブ。
  7. 【請求項７】前記第３ドメインＣのヌクレオチド配列の
    上側ストランドの５′残基が前記第２ドメインＢに隣接
    しており、かつグアノシン残基である、請求項１、２、
    ３、４、５または６に記載のプローブ。
  8. 【請求項８】前記第３ドメインＣの配列が である、請求項１、２、３、４、５、６または７に記載
    のプローブ。
  9. 【請求項９】前記第２ドメインＢのDNAヌクレオチド配
    列の上側ストランドの３′末端が、前記ドメインＣのヌ
    クレオチド配列の上側ストランドの５′末端に結合して
    いる、請求項８に記載のプローブ。
  10. 【請求項１０】前記第３ドメインＣの転写物が２つのサ
    ブドメインを有し、該２つのサブドメインが、 （ａ）オリゴヌクレオチドキャプチャーリンカーとハイ
    ブリダイズし得、該キャプチャーリンカーが固体基質上
    に固定化されたポリヌクレオチドにハイブリダイズし得
    る第１サブドメインc1、および （ｂ）オリゴヌクレオチド標識リンカーに結合し得、該
    標識リンカーが定量可能なプローブと結合し得る第２サ
    ブドメインc2、 である、請求項１に記載のプローブ。
  11. 【請求項１１】前記第２および第３ドメインであるＢお
    よびＣを含有する機能性ユニットが複数の反復ユニット
    の中に存在する、請求項１に記載のプローブ。
  12. 【請求項１２】イムノアッセイにおいて検出可能なシグ
    ナルを増幅する方法であって、該方法が、 （ａ）結合ドメイン（Ａ）、DNA依存性RNAポリメラーゼ
    酵素活性に対するプロモーターとして機能し得る二本鎖
    DNA配列である第２ドメイン（Ｂ）、およびドメインＢ
    に隣接する一本鎖または二本鎖であり、その結果該第２
    ドメインの該プロモーター活性に対する鋳型として機能
    し得る第３ドメイン（Ｃ）、を含む生化学的分子プロー
    ブを分析物と直接的または間接的に結合させ、 （ｂ）結合していないプローブを除去し、 （ｃ）前記プローブ構築物の第３ドメインＣの鋳型配列
    であるｃ′に相補的なRNAオリゴマーの複数のコピー
    を、DNA依存性RNAポリメラーゼ活性により転写し、そし
    て （ｄ）該RNA転写物を定量すること、 を包含する、方法。
  13. 【請求項１３】前記分析物を直接的または間接的に固体
    基質に最初に固定化する、請求項12に記載の方法。
  14. 【請求項１４】ドメインＡが抗体として機能し得るポリ
    ペプチドであり、および前記プローブをドメインＡを介
    して直接的または間接的に前記分析物に結合する、請求
    項12または13に記載の方法。
  15. 【請求項１５】（ａ）前記プローブのドメインＡが一本
    鎖のポリヌクレオチドであり、および （ｂ）前記分析物を、下記の２つのドメインを有するタ
    ンパク質／ポリヌクレオチドハイブリッドリンカー分子
    を介して前記分子プローブに間接的に結合する、方法で
    あって、ここで （ｉ）第１ドメインが、該プローブのドメインＡの配列
    に実質的に相補的な一本鎖のポリヌクレオチドであり、
    および （ii）第２ドメインが、該分析物に対して特異的である
    か、あるいは前記分析物に特異的な抗体のエピトープに
    対して特異的な抗体として機能する、請求項12または13
    に記載の方法。
  16. 【請求項１６】前記第２ドメインＢがバクテリオファー
    ジT7のDNA依存性RNAポリメラーゼに由来する、請求項1
    2、13、14または15に記載の方法。
  17. 【請求項１７】（ａ）前記プローブの第３ドメインＣを
    標識リボヌクレオチド三リン酸の存在下で転写し、 （ｂ）該第３ドメインの転写物が、固体基質上に固定化
    されたオリゴヌクレオチドキャプチャープローブに相補
    的な第１サブドメインc1を有し、そして （ｃ）該転写物を固定化し、そして定量する、 請求項12、13、14、15または16に記載の方法。
  18. 【請求項１８】（ａ）前記第１プローブの第３ドメイン
    Ｃをビオチン化リボヌクレオチド三リン酸の存在下で転
    写し、 （ｂ）該第３ドメインの転写物が、標識オリゴヌクレオ
    チドプローブに相補的な第１サブドメインc2を有し、 （ｃ）該転写物をアビジン化固体基質上に固定化し、そ
    して （ｄ）該転写物を定量する、 請求項12、13、14、15または16に記載の方法。
  19. 【請求項１９】（ａ）前記プローブの第３ドメインＣを
    標識リボヌクレオチド三リン酸およびビオチン化リボヌ
    クレオチド三リン酸の両方の存在下で転写し、 （ｂ）該転写物をアビジン化固体基質上に固定化し、そ
    して （ｃ）該転写物を定量する、 請求項12、13、14、15または16に記載の方法。
  20. 【請求項２０】（ａ）前記プローブの第３ドメインＣの
    転写物が、 （ｉ）オリゴヌクレオチドキャプチャープローブに相補
    的であり、該キャプチャープローブが固体基質上に固定
    化されている、第１サブドメインc1、および （ii）標識オリゴヌクレオチドプローブに相補的な第２
    ドメインc2である、２つのサブドメインを有し、 （ｂ）該転写物を該キャプチャープローブにハイブリダ
    イズさせ、 （ｃ）該標識プローブを該転写物にハイブリダイズさ
    せ、そして （ｄ）該標識プローブを定量する、 請求項12、13、14、15または16に記載の方法。
  21. 【請求項２１】前記第１のプローブの第２および第３ド
    メインであるＢおよびＣを含むユニットが複数の反復B/
    Cユニット中に存在する、請求項12に記載の方法。
  22. 【請求項２２】イムノアッセイにおいてシグナルアンプ
    リファイアとして使用する分子プローブであって、該プ
    ローブが、 （ａ）既知の分析物に特異的に結合する抗体として機能
    し得るポリペプチドを含む第１ドメイン（Ａ）、および （ｂ）対象の一本鎖核酸配列に特異的に結合し得る一本
    鎖オリゴヌクレオチドサブユニットを多数含む第２ドメ
    イン（Ｍ）、 を含有する、分子プローブ。
  23. 【請求項２３】前記第２ドメインＭの各オリゴヌクレオ
    チドユニットが15個から50個の塩基対を有し、および40
    ％から80％の範囲のGC含有量を有する、請求項22に記載
    のプローブ。
  24. 【請求項２４】前記分子が直鎖構造を有する、請求項22
    に記載のプローブ。
  25. 【請求項２５】前記分子が分枝構造を有する、請求項22
    に記載のプローブ。
  26. 【請求項２６】前記第２ドメインのオリゴヌクレオチド
    サブユニットの少なくとも一部分を、下記の構造式を有
    する化合物に由来する多官能性部分を介して連結する、
    請求項22に記載のプローブ： ここで、Ｒは有機部分、好ましくは核酸であり、R1は合
    成核酸を固相から除去せず環構造外の窒素またはリン酸
    を保護する基を除去しない条件下で除去し得るヒドロキ
    シル保護基であり、Ｘは核酸合成を促進するリン含有基
    であり、Ｙは求核基由来のラジカルであり、そしてR2は
    R1であるかまたはR1に影響を与えることなしに除去され
    て水素で置き換え得るブロック基または保護基である。
  27. 【請求項２７】前記オリゴヌクレオチドサブユニットの
    少なくとも一部分が下記構造式で示される化合物に由来
    する多官能性部分を介して連結される、請求項22に記載
    のプローブ： ここで、Ｚは求核基であり、R1は一般に塩基に安定であ
    り、および酸に感受性の保護基であり、R2は水素または
    メチルであり、R3はR1に影響を与えることなく除去され
    て水素で置き換えられ得る保護基であり、R5は化学合成
    の間オリゴヌクレオチド鎖の５′位にヌクレオチドを添
    加し得るリン誘導体であり、R6はメチル、水素、Ｉ、B
    r、またはＦであり、およびＸは１から８の整数であ
    る。
  28. 【請求項２８】前記オリゴヌクレオチドサブユニットの
    少なくとも一部分が下記構造式で示される化合物に由来
    する多官能性部分を介して連結されるプローブであっ
    て、 ここで、Ｒがヒドロキシル保護基であり、iPrがイソプ
    ロピルであり、そしてR1がメチルまたはβ−シアノエチ
    ルである、請求項22に記載のプローブ。
  29. 【請求項２９】イムノアッセイにおいて抗原を検出し定
    量するために使用される検出可能なシグナルを増幅する
    方法であって、該方法が、 （ａ）結合ドメイン（Ａ）と、一本鎖標識オリゴヌクレ
    オチドにハイブリダイズし得る一本鎖DNAオリゴマーサ
    ブユニットを多数含む第２ドメイン（Ｍ）とを含有する
    生化学的な分子プローブを直接的または間接的に分析物
    に結合させ、 （ｂ）結合していないプローブを除去し、 （ｃ）ドメインＭプローブのサブユニット配列に実質的
    に相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖標識オリゴヌ
    クレオチドを第２ドメインのサブユニットにハイブリダ
    イズさせ、 （ｄ）結合していない標識オリゴヌクレオチドを除去
    し、そして （ｅ）該プローブに結合した標識オリゴヌクレオチドの
    量を定量すること、 を包含する、方法。
  30. 【請求項３０】前記分析物を固体基質上に直接的または
    間接的に固定化する、請求項29に記載の方法。
  31. 【請求項３１】ドメインＡが抗体として機能し得るポリ
    ペプチドであり、および前記プローブをドメインＡを介
    して前記分析物に直接的または間接的に結合する、請求
    項30に記載の方法。
  32. 【請求項３２】前記ドメインＡのポリペプチドが、前記
    分析物に特異的に結合する抗体のエピトープに対して特
    異的に結合する、請求項31に記載の方法。
  33. 【請求項３３】（ａ）前記プローブのドメインＡが一本
    鎖ポリヌクレオチドであり、および （ｂ）前記分析物が、下記２つのドメインを有するタン
    パク質／ポリヌクレオチドハイブリットリンカー分子を
    介して該分子プローブに間接的に結合する方法であっ
    て、該２つのドメインが、 （ｉ）該プローブのドメインＡの配列に実質的に相補的
    な一本鎖オリゴヌクレオチド配列である第１ドメイン、
    および （ii）該分析物に特異的な抗体として機能する第２ドメ
    インである、請求項29に記載の方法。
  34. 【請求項３４】該競合イムノアッセイにおいて検出可能
    なシグナルを増幅する方法であって、該方法が、 （ａ）（ｉ）免疫原として機能し得る第１ドメイン
    （Ａ）、 （ii）DNA依存性RNAポリメラーゼ酵素活性のためのプロ
    モーターとして機能し得る二本鎖ポリヌクレオチドであ
    る第２ドメイン（Ｂ）、および （iii）第２ドメインに隣接する一本鎖または二本鎖で
    あり、その結果該第２ドメインの該プロモーター活性に
    対する鋳型として機能し得る第３ドメイン（Ｃ）、を含
    む分子プローブを構築し、 （ｂ）競合する分析物の存在下で固体基質上で直接的ま
    たは間接的に該プローブを固定化し、 （ｃ）結合していないプローブを除去し、 （ｄ）該プローブ構築物の第３ドメインＣの鋳型配列
    ｃ′に相補的なRNAオリゴマーの複数コピーを、DNA依存
    性RNAポリメラーゼ活性により転写し、そして （ｅ）該RNA転写物を定量すること、 を包含する、方法。
  35. 【請求項３５】競合イムノアッセイにおいて検出可能な
    シグナルを増幅する方法であって、該方法が、 （ａ）（ｉ）免疫原として機能し得る第１ドメイン
    （Ａ）、および （ii）対象の一本鎖核酸配列に特異的に結合可能な一本
    鎖オリゴヌクレオチドサブユニットを多数含む第２ドメ
    イン（Ｍ）を含む分子プローブを構築し、 （ｂ）該プローブを競合性分析物の存在下で固体基質上
    に直接的または間接的に固定化させ、 （ｃ）結合していないプローブを除去し、 （ｄ）該ドメインＭプローブのサブユニット配列に実質
    的に相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖標識オリゴ
    ヌクレオチドを第２ドメインのサブユニットにハイブリ
    ダイズさせ、 （ｅ）結合していない標識オリゴヌクレオチドを除去
    し、そして （ｆ）該プローブに結合した標識オリゴヌクレオチドの
    量を定量すること、 を包含する、方法。
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