CN114544966B - 一种多重信号放大系统及其在免疫吸附夹心法检测中的应用 - Google Patents

一种多重信号放大系统及其在免疫吸附夹心法检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种信号放大系统及其在免疫吸附夹心法检测中的应用。本发明提供了一种多重信号放大系统，所述多重信号放大系统包括连有待检测信号的DNA/RNA检测链、DNA/RNA放大链、DNA/RNA连接链、抗体或抗原分子、连接DNA/RNA连接链与抗体或抗原的连接中间体，其中，DNA/RNA检测链与DNA/RNA连接链部分的片段可互补配对后连接，或者，DNA/RNA检测链通过DNA/RNA放大链与DNA/RNA连接链连接，其中，各链之间通过部分片段的碱基可互补配对相互连接。本发明信号放大系统具有信号多重放大、检测限低、灵敏度更高、可同时检测多个目标物、可多轮检测等优点。

Description

一种多重信号放大系统及其在免疫吸附夹心法检测中的应用
技术领域
本发明属于免疫检测领域，具体涉及一种多重信号放大系统及其在免疫吸附夹心法检测中的应用。
背景技术
酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA)将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。传统ELISA测定方法中有3种必要的试剂：固定的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体、酶作用的底物。
传统的ELISA检测方法受限于酶和底物显色的种类，一次实验只能检测一种抗原或抗体。为了实现同时检测多种抗原或抗体信号并实现多轮检测，已有研究使用其他信号放大方法来代替酶促信号放大。
CN101988920A公开了一种抗原检测试剂盒和检测方法，采用DNA寡核苷酸缀合的抗体替换过氧化物酶融合的抗体，用于由酶实现的信号放大。RNA寡核苷酸分别互补于DNA寡核苷酸，能实现多种抗原在单个测定中的同时检测，但检测方法需要加入RNA酶，且存在检出限高、无法实现多轮检测、检测效率低、成本高、操作繁琐等缺陷。为此，需要研究新的检测灵敏度高、操作简便的信号放大系统。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多重信号放大系统，所述多重信号放大系统包括连有待检测信号的DNA/RNA检测链、DNA/RNA放大链、DNA/RNA连接链、抗体或抗原分子、连接DNA/RNA连接链与抗体或抗原的连接中间体，其中，DNA/RNA检测链与DNA/RNA连接链可互补配对后连接，或者，DNA/RNA检测链通过DNA/RNA放大链与DNA/RNA连接链连接，其中，各链之间通过碱基互补配对相互连接。
本发明优选的技术方案中，一个抗体或抗原的连接中间体可以连接一条或多条DNA/RNA连接链。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA检测链与DNA/RNA连接链互补配对为DNA/RNA检测链的碱基可直接与DNA/RNA连接链的碱基互补配对。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA检测链直接与DNA/RNA连接链互补配对时，互补配对部分碱基长度为5-180个碱基对，优选为7-140个，更优选为8-100个，再优选9-70个，还优选10-50个。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA检测链通过DNA/RNA放大链与DNA/RNA连接链连接时，DNA/RNA连接链与一条或多条DNA/RNA放大链的部分片段的碱基互补配对，同时DNA/RNA放大链的部分片段与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA检测链通过DNA/RNA放大链与DNA/RNA连接链连接时，DNA/RNA连接链与一条或多条DNA/RNA放大链部分片段碱基互补配对，然后，所述DNA/RNA放大链再与一条或多条DNA/RNA放大链部分片段的碱基互补配对，同时后者DNA/RNA放大链部分片段与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA检测链通过DNA/RNA放大链与DNA/RNA连接链连接时，DNA/RNA连接链与一级DNA/RNA放大链的部分片段的碱基互补配对，一级DNA/RNA放大链与一条或多条二级DNA/RNA放大链部分片段的碱基互补配对，同时二级DNA/RNA放大链与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
本发明优选的技术方案中，根据需要二级放大链可连接三级放大链，三级放大链连接四级放大链，依次连接，实现多级放大。
本发明优选的技术方案中，所述多条放大链为两条及以上放大链。
本发明优选的技术方案中，所述多级放大为两级及以上放大。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA连接链全部碱基或者部分片段的碱基可与DNA/RNA放大链或者DNA/RNA检测链通过碱基互补配对连接。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA检测链全部碱基或者部分片段的碱基可与DNA/RNA放大链或者DNA/RNA连接链通过碱基互补配对连接。本发明优选的技术方案中，DNA/RNA检测链与DNA/RNA放大链部分片段互补配对时，配对部分碱基长度为5-180个碱基对，优选为7-140个，更优选为8-100个，再优选9-70个，还优选10-50个。
本发明优选的技术方案中，一条DNA/RNA放大链与其他多条放大链的部分片段互补配对时，配对部分碱基长度为5-180个碱基对，优选为7-140个，更优选为8-100个，再优选9-70个，还优选10-50个。
本发明优选的技术方案中，不同级DNA/RNA放大链之间互补配对时(例如，一级连接二级时，二级连接三级时，以此类推)，配对部分碱基长度为5-180个碱基对，优选为7-140个，更优选为8-100个，再优选9-70个，还优选10-50个。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA放大链与DNA/RNA连接链互补配对时，配对部分碱基长度为5-180个碱基对，优选为7-140个，更优选为8-100个，再优选9-70个，还优选10-50个。
本发明的优选技术方案中，DNA/RNA连接链之间、同一级DNA/RNA放大链之间(例如，一级链之间的配对，二级链之间的配对)、DNA/RNA检测链之间的可配对部分碱基长度为0-5个碱基对。
本发明优选的技术方案中，所述多重信号放大系统的连接链与放大链、放大链与放大链、放大链与检测链、连接链与检测链之间可进行一轮或多轮检测。
本发明优选的技术方案中，每一轮检测后下一轮检测前采用洗脱液解离洗脱掉的位置可以为检测链与放大链互补配对的位置、放大链与放大链互补配对的位置、放大链与连接链互补配对的位置、检测链与连接链互补配对的位置。
本发明优选的技术方案中，通过调节洗脱液的浓度实现不同位置的解离。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、DNA/RNA检测链中可含有碱基重复单元。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA放大链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCT A-A(40≤n≤60)、
CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A(40≤n≤60)、
GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A(40≤n≤60)、
CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A(40≤n≤60)、
ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(40≤n≤60)、
GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A(40≤n≤60)、
GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A(40≤n≤60)、
TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(40≤n≤60)、
ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A(40≤n≤60)、
GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-TTT-TCCTTTTAT-A-(TCCTTTTAT-A)n-TCCTTTTAT-A(40≤n≤60)、
GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-TTT-CCTTCTATT-A-(CCTTCTATT-A)n-CCTTCTATT-A(40≤n≤60)、
GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-TTT-TTATTCACT-A-TTATTCACT-A-(TTATTCACT-A)n-TTATTCACT-A(40≤n≤60)、
TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T-TTTTGATTGTTT-TCATTACTT-A-TCATTACTT-A-(TCATTACTT-A)n-TCATTACTT-A(40≤n≤60)、
TATTATTGG-T-TATTATTGG-T-TATTATTGG-TTT-TTCTTACTC-A-TTCTTACTC-A-(TTCTTACTC-A)n-TTCTTACTC-A(40≤n≤60)。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA连接链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
AAAUUCCUCUACCACCUACA、
AAATTCCTCTACCACCTACATCAC、
TATTTAGTGTTCGAATAGTT、
TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG、
AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC、
GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG、
GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT、
CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC、
AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC、
AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA检测链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
待检测信号-TT-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T、
待检测信号-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T、
待检测信号-TT-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T、
待检测信号-TT-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T、
待检测信号-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
待检测信号-TT-TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T、
待检测信号-TT-TATTATTGG-T-TATTATTGG-T、
待检测信号-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
待检测信号-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T、
待检测信号-TT-ATAAAAGGA-T-ATAAAAGGA-T、
待检测信号-TT-AATGAAAGA-T-AATGAAAGA-T、
待检测信号-TT-AGTGAATAA-T-AGTGAATAA-T、
待检测信号-TT-AAGTAATGA-T-AAGTAATGA-T、
待检测信号-TT-GAGTAAGAA-T-GAGTAAGAA-T、
待检测信号-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U。
本发明优选的技术方案中，所述连接中间体两端或中间任意位置双功能化，一官能团连接抗体或抗原上对应的官能团，另一官能团连接DNA/RNA连接链上对应的官能团，连接中间体的双官能团中两种官能团的比例为一比一或一比多的任一种或多种。
本发明优选的技术方案中，所述抗体、抗原、DNA或RNA上用于与连接中间体反应或连接的官能团包括但不限于氨基、羧基、羟基、巯基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种。
本发明优选的技术方案中，所述连接中间体上的双官能团中的一种官能团与抗原或抗体上的包括但不限于氨基、羧基、羟基、巯基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种官能团反应连接。
本发明优选的技术方案中，所述连接中间体上的双官能团中的另一种官能团可以与DNA/RNA上的包括但不限于氨基、羧基、羟基、巯基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种官能团反应连接。
本发明优选的技术方案中，所述与连接中间体相连的抗体或抗原分子，一个抗体或抗原分子可连接一个或同时连接多个连接中间体。
本发明优选的技术方案中，所述与连接中间体相连的DNA连接链，一个一个连接中间体可连接一个或同时连接多个DNA连接链。
本发明优选的技术方案中，所述检测链连接有待检测信号。
本发明优选的技术方案中，所述待检测信号可以连接于DNA/RNA检测链的任何位置，可以为5’端、3’端、或者检测链中间的任何位置。
本发明优选的技术方案中，所述待检测信号选自但不限于荧光、磷光、化学发光、电磁信号、核磁信号、放射性信号中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述多重信号放大系统可应用于免疫吸附夹心法的检测中。
本发明的另一目的在于提供一种多重信号放大系统，所述的多重信号放大系统采用DNA/RNA放大链，其中，所述的DNA/RNA放大链可为一条或多条。
本发明的优选技术方案中，所述的DNA/RNA放大链可为一级放大或多级放大。
本发明的优选技术方案中，当DNA/RNA放大链为一条或多条时，DNA/RNA放大链部分片段与DNA/RNA连接链碱基互补配对，同时DNA/RNA放大链的部分片段与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
本发明的优选技术方案中，当DNA/RNA放大链为多条时，一条DNA/RNA放大链部分片段与DNA/RNA检测链互补配对，同时与其他多条DNA/RNA放大链互补配对。
本发明优选的技术方案中，当DNA/RNA放大链为多条时，DNA/RNA连接链与一条或多条DNA/RNA放大链部分片段碱基互补配对，然后，所述DNA/RNA放大链再与一条或多条DNA/RNA放大链部分片段的碱基互补配对，同时后者DNA/RNA放大链部分片段与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
本发明优选的技术方案中，当DNA/RNA放大链为多级放大时，DNA/RNA连接链与一级DNA/RNA放大链的部分片段的碱基互补配对，一级DNA/RNA放大链与一条或多条二级DNA/RNA放大链部分片段的碱基互补配对，同时二级DNA/RNA放大链与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA连接链全部碱基或者部分片段的碱基可与DNA/RNA放大链或者DNA/RNA检测链通过碱基互补配对连接。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA检测链全部碱基或者部分片段的碱基可与DNA/RNA放大链或者DNA/RNA连接链通过碱基互补配对连接。
本发明优选的技术方案中，根据需要二级放大链可连接三级放大链，三级放大链连接四级放大链，依次连接，实现多级放大。
本发明优选的技术方案中，所述多条放大链为两条及以上放大链。
本发明优选的技术方案中，所述多级放大为两级及以上放大。
本发明的另一目的在于提供一种DNA/RNA放大链，该放大链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A(40≤n≤60)、
CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A(40≤n≤60)、
GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A(40≤n≤60)、
CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A(40≤n≤60)、
ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(40≤n≤60)、
GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A(40≤n≤60)、
GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A(40≤n≤60)、
TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(40≤n≤60)、
ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A(40≤n≤60)、
GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-TTT-TCCTTTTAT-A-(TCCTTTTAT-A)n-TCCTTTTAT-A(40≤n≤60)、
GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-TTT-CCTTCTATT-A-(CCTTCTATT-A)n-CCTTCTATT-A(40≤n≤60)、
GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-TTT-TTATTCACT-A-TTATTCACT-A-(TTATTCACT-A)n-TTATTCACT-A(40≤n≤60)、
TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T-TTTTGATTGTTT-TCATTACTT-A-TCATTACTT-A-(TCATTACTT-A)n-TCATTACTT-A(40≤n≤60)、
TATTATTGG-T-TATTATTGG-T-TATTATTGG-TTT-TTCTTACTC-A-TTCTTACTC-A-(TTCTTACTC-A)n-TTCTTACTC-A(40≤n≤60)。
本发明的另一目的在于提供一种DNA/RNA连接链，该连接链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
AAAUUCCUCUACCACCUACA、
AAATTCCTCTACCACCTACATCAC、
TATTTAGTGTTCGAATAGTT、
TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG、
AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC、
GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG、
GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT、
CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC、
AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC、
AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC。
本发明的另一目的在于提供一种DNA/RNA检测链，该检测链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
待检测信号-TT-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T、
待检测信号-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T、
待检测信号-TT-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T、
待检测信号-TT-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T、
待检测信号-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
待检测信号-TT-TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T、
待检测信号-TT-TATTATTGG-T-TATTATTGG-T、
待检测信号-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
待检测信号-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T、
待检测信号-TT-ATAAAAGGA-T-ATAAAAGGA-T、
待检测信号-TT-AATGAAAGA-T-AATGAAAGA-T、
待检测信号-TT-AGTGAATAA-T-AGTGAATAA-T、
待检测信号-TT-AAGTAATGA-T-AAGTAATGA-T、
待检测信号-TT-GAGTAAGAA-T-GAGTAAGAA-T、
待检测信号-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U。
本发明的另一目的在于提供一种多重信号放大系统的制备方法，包括抗原或抗体-DNA/RNA连接链的制备、DNA/RNA放大链的制备。
本发明优选的技术方案中，所述抗原或抗体-DNA/RNA连接链的制备为抗体或抗原通过连接中间体与DNA/RNA连接链相连，其中，所述连接中间体具有双官能团，一官能团与抗体或抗原相连，另一官能团与DNA/RNA连接链相连。
本发明优选的技术方案中，所述抗体或抗原或者DNA连接链上的用于与连接中间体连接的官能团包括但不限于腙基、氨基、羧基、羟基、巯基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种。
本发明优选的技术方案中，所述连接中间体的双官能团中一个官能团可与氨基反应连接，另一官能团可与羧基反应连接；或者一个官能团可以氨基反应连接，另一官能团可与羟基的反应连接；或者一个官能团可与氨基反应连接，另一官能团可与巯基反应连接；或者一个官能团可与羧基结合，另一官能团可与羟基结合；或者一个官能团可与羧基反应连接，另一官能团可与巯基反应连接；或者一个官能团可与羟基反应连接，另一官能团可与巯基反应连接；或任何其他可行的连接方案。
本发明优选的技术方案中，抗体或抗原上的氨基与连接中间体上的一个官能团反应连接，而DNA/RNA连接链上的巯基与连接中间体上的另一个官能团反应连接。
本发明优选的技术方案中，所述抗原或抗体-DNA/RNA连接链的制备包括下述步骤：
(1)将抗原或抗体、连接中间体，按摩尔比1:0.01-1:10000进行混合，0-50℃反应，形成抗原或抗体-连接中间体；
(2)将抗原或抗体-连接中间体、DNA/RNA连接链，按摩尔比1:0.01-1:10000进行混合，0-50℃反应，形成抗原或抗体-DNA/RNA连接链。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，抗体或抗原、连接中间体的摩尔比为1:0.05-1:1000，优选为1:0.1-1:100。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，反应温度为1-25℃，优选为2-8℃。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，抗原或抗体-连接中间体可通过脱盐离心柱或超滤进行纯化。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，抗原或抗体-连接中间体、DNA/RNA连接链的摩尔比为1:0.05-1:1000，优选为1:0.1-1:100。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，反应温度为1-25℃，优选为2-8℃。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，所述的抗原或抗体-DNA/RNA连接链可采用超滤离心纯化或透析纯化。
本发明优选的技术方案中，所述抗原或抗体-DNA/RNA连接链连接成功的验证方法，包括使用质谱进行验证。
本发明优选的技术方案中，所述质谱选自基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF)、电喷雾离子化质谱(ESI-MS)的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，DNA/RNA放大链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A(40≤n≤60)、
CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A(40≤n≤60)、
GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A(40≤n≤60)、
CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A(40≤n≤60)、
ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(40≤n≤60)、
GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A(40≤n≤60)、
GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A(40≤n≤60)、
TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(40≤n≤60)、
ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A(40≤n≤60)、
GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-TTT-TCCTTTTAT-A-(TCCTTTTAT-A)n-TCCTTTTAT-A(40≤n≤60)、
GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-TTT-CCTTCTATT-A-(CCTTCTATT-A)n-CCTTCTATT-A(40≤n≤60)、
GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-TTT-TTATTCACT-A-TTATTCACT-A-(TTATTCACT-A)n-TTATTCACT-A(40≤n≤60)、
TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T-TTTTGATTGTTT-TCATTACTT-A-TCATTACTT-A-(TCATTACTT-A)n-TCATTACTT-A(40≤n≤60)、
TATTATTGG-T-TATTATTGG-T-TATTATTGG-TTT-TTCTTACTC-A-TTCTTACTC-A-(TTCTTACTC-A)n-TTCTTACTC-A(40≤n≤60)。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA放大链的制备方法包括下述步骤：
(1)将聚合酶和相应的引物按一定比例混合并反应一定时间；
(2)反应完成后，灭活聚合酶，制得的DNA/RNA放大链反应产物；
(3)所得DNA/RNA放大链直接使用或进行纯化后使用。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA放大链合成后不纯化直接使用。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA放大链合成后纯化时所采用的纯化方法包括但不限于切胶回收、高效液相色谱法，凝胶渗透色谱法、离子交换色谱法、超滤离心、透析、沉淀法、结晶法等纯化方法中的一种或多种。
本发明的优选技术方案中，DNA/RNA连接链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
AAAUUCCUCUACCACCUACA、
AAATTCCTCTACCACCTACATCAC、
TATTTAGTGTTCGAATAGTT、
TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG、
AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC、
GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG、
GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT、
CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC、
AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC、
AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC。
本发明的另一目的在于提供一种利用多重信号放大系统进行免疫吸附夹心法检测的检测系统，所述检测系统包括可以与包被抗体或包被抗原结合的固相基质、可以与固相基质结合的包被抗体或包被抗原、待检测抗原或抗体、抗体/抗原-DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、连有待检测信号的DNA/RNA检测链，其中，多重信号放大系统包括抗体/抗原-DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、连有待检测信号的DNA/RNA检测链，用于将待检测抗原或抗体的信号放大后进行检测。
本发明优选的技术方案中，所述包被抗体或包被抗原、待检测抗原或抗体、抗体/抗原-DNA/RNA连接链三者可以形成双抗体夹心或者双抗原夹心的结构。
本发明的优选技术方案中，所述固相基质选自多孔板、PVDF膜、醛基化的固相基质等任何可吸附抗体/抗原或者通过化学键包被抗体/抗原的固相基质。
本发明的优选技术方案中，所述包被抗体或抗原选自任何可与相应抗原或抗体结合，并可被包被于固相基质的抗体或抗原。
本发明的优选技术方案中，所述抗体或抗原可通过化学键、吸附等作用包被于固相基质。
本发明优选的技术方案中，所述待检测抗原或者抗体可来自人、小鼠、细菌、病毒、其他任何来源的抗原的任一种或多种。
本发明优选的技术方案中，所述待检测信号可以连接于DNA/RNA检测链的任何位置，可以为5’端、3’端、或者检测链中间的任何位置。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、DNA/RNA检测链中可含有碱基重复单元。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA放大链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A(40≤n≤60)、
CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A(40≤n≤60)、
GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A(40≤n≤60)、
CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A(40≤n≤60)、
ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(40≤n≤60)、
GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A(40≤n≤60)、
GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A(40≤n≤60)、
TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(40≤n≤60)、
ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A(40≤n≤60)、
GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-TTT-TCCTTTTAT-A-(TCCTTTTAT-A)n-TCCTTTTAT-A(40≤n≤60)、
GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-TTT-CCTTCTATT-A-(CCTTCTATT-A)n-CCTTCTATT-A(40≤n≤60)、
GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-TTT-TTATTCACT-A-TTATTCACT-A-(TTATTCACT-A)n-TTATTCACT-A(40≤n≤60)、
TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T-TTTTGATTGTTT-TCATTACTT-A-TCATTACTT-A-(TCATTACTT-A)n-TCATTACTT-A(40≤n≤60)、
TATTATTGG-T-TATTATTGG-T-TATTATTGG-TTT-TTCTTACTC-A-TTCTTACTC-A-(TTCTTACTC-A)n-TTCTTACTC-A(40≤n≤60)。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA连接链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
AAAUUCCUCUACCACCUACA、
AAATTCCTCTACCACCTACATCAC、TATTTAGTGTTCGAATAGTT、
TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG、
AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC、
GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG、
GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT、
CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC、
AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC、
AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA检测链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
待检测信号-TT-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T、
待检测信号-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T、
待检测信号-TT-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T、
待检测信号-TT-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T、
待检测信号-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
待检测信号-TT-TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T、
待检测信号-TT-TATTATTGG-T-TATTATTGG-T、
待检测信号-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
待检测信号-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T、
待检测信号-TT-ATAAAAGGA-T-ATAAAAGGA-T、
待检测信号-TT-AATGAAAGA-T-AATGAAAGA-T、
待检测信号-TT-AGTGAATAA-T-AGTGAATAA-T、
待检测信号-TT-AAGTAATGA-T-AAGTAATGA-T、
待检测信号-TT-GAGTAAGAA-T-GAGTAAGAA-T、
待检测信号-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U。
本发明的另一目的在于提供一种利用多重信号放大系统进行免疫吸附双抗体夹心法检测抗原的方法，包括下述步骤：
(1)固相基质上固定包被抗体；
(2)加入待检测抗原；
(3)加入抗体-DNA/RNA连接链，作用一定时间；
(4)加入DNA/RNA放大链，作用一定时间；
(5)加入DNA/RNA检测链，反应一定时间；
(6)进行洗涤，检测DNA/RNA检测链上的信号强度；
(7)通过不同浓度抗原标准品的检测信号强度绘制的标准曲线，根据待检测抗原样品的检测信号强度和标准曲线计算抗原的浓度。
本发明的优选技术方案中，步骤(1)中，在固相基质上包被抗体后，加入封闭液进行封闭。
本发明的优选技术方案中，所述固相基质选自多孔板、PVDF膜、醛基化的固相基质等任何可吸附包被抗体/抗原或者通过化学键包被抗体/抗原的固相基质。
本发明的优选技术方案中，所述包被抗体选自任何可与相应抗原结合，并可被包被于固相基质的抗体。
本发明的优选技术方案中，所述抗体可通过化学键、吸附等作用包被于固相基质。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，所述待检测抗原可来自人、小鼠、细菌、病毒、其他任何来源的抗原的任一种或多种。
本发明优选的技术方案中，步骤(3)中，所述抗体-DNA/RNA连接链中，每个抗体分子连接了一个或多个连接中间体。
本发明优选的技术方案中，所述抗体与连接中间体连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基或其他任何可行的连接基团中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，步骤(3)中，所述抗体-DNA/RNA连接链中，每个连接中间体连接1个或多个DNA/RNA连接链。
本发明优选的技术方案中，所述连接中间体与DNA/RNA连接链连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基或其他任何可行的连接基团中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，步骤(3)中，所述抗体通过连接中间体与DNA/RNA连接链连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基或其他任何可行的连接基团中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述用于连接抗体和DNA/RNA连接链的连接中间体中的两种官能团的比例为一比一、一比多中的任一种或多种。
本发明优选的技术方案中，所述两种官能团不同时为相同的官能团。
本发明的优选技术方案中，步骤(4)中，可先连接一级DNA/RNA放大链，连接后再加入二级DNA/RNA放大链，根据需要连接更多级别DNA/RNA放大链。
本发明的优选技术方案中，步骤(6)中，可先进行第一轮DNA/RNA检测链进行检测；然后进行解离，再加入第二轮DNA/RNA检测链进行检测；然后进行解离，再加入第三轮DNA/RNA检测链进行检测；根据需要进行多轮检测。
本发明优选的技术方案中，检测过程中不低于1轮的检测，优选为2轮到6轮；每轮检测中同时检测1种或1种以上的抗原。
本发明优选的技术方案中，所述多重信号放大系统的连接链与放大链、放大链与放大链、放大链与检测链、连接链与检测链之间可进行一轮或多轮检测。
本发明优选的技术方案中，每一轮检测后下一轮检测前解离洗脱的位置可以为检测链与放大链互补配对的位置、放大链与放大链互补配对的位置、放大链与连接链互补配对的位置、连接链与检测链互补配对的位置。
本发明优选的技术方案中，通过调节洗脱液的浓度实现不同位置的解离。
本发明优选的技术方案中，所述检测信号可以连接于DNA/RNA检测链的任何位置，可以为5’端、3’端、或者检测链中间的任何位置。
本发明优选的技术方案中，所述检测信号包括但不限于荧光、磷光、化学发光、电磁信号、核磁信号、放射性信号中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，加入各步骤物质反应后，去除多余物质，然后进行洗涤操作。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、DNA/RNA检测链中可含有碱基重复单元。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA放大链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A(40≤n≤60)、
CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A(40≤n≤60)、
GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A(40≤n≤60)、
CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A(40≤n≤60)、
ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(40≤n≤60)、
GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A(40≤n≤60)、
GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A(40≤n≤60)、
TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(40≤n≤60)、
ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A(40≤n≤60)、
GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-TTT-TCCTTTTAT-A-(TCCTTTTAT-A)n-TCCTTTTAT-A(40≤n≤60)、
GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-TTT-CCTTCTATT-A-(CCTTCTATT-A)n-CCTTCTATT-A(40≤n≤60)、
GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-TTT-TTATTCACT-A-TTATTCACT-A-(TTATTCACT-A)n-TTATTCACT-A(40≤n≤60)、
TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T-TTTTGATTGTTT-TCATTACTT-A-TCATTACTT-A-(TCATTACTT-A)n-TCATTACTT-A(40≤n≤60)、
TATTATTGG-T-TATTATTGG-T-TATTATTGG-TTT-TTCTTACTC-A-TTCTTACTC-A-(TTCTTACTC-A)n-TTCTTACTC-A(40≤n≤60)。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA连接链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
AAAUUCCUCUACCACCUACA、
AAATTCCTCTACCACCTACATCAC、TATTTAGTGTTCGAATAGTT、
TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG、
AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC、
GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG、
GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT、
CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC、
AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC、
AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA检测链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
待检测信号-TT-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T、
待检测信号-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T、
待检测信号-TT-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T、
待检测信号-TT-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T、
待检测信号-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
待检测信号-TT-TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T、
待检测信号-TT-TATTATTGG-T-TATTATTGG-T、
待检测信号-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
待检测信号-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T、
待检测信号-TT-ATAAAAGGA-T-ATAAAAGGA-T、
待检测信号-TT-AATGAAAGA-T-AATGAAAGA-T、
待检测信号-TT-AGTGAATAA-T-AGTGAATAA-T、
待检测信号-TT-AAGTAATGA-T-AAGTAATGA-T、
待检测信号-TT-GAGTAAGAA-T-GAGTAAGAA-T、
待检测信号-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U。
本发明的另一目的在于提供一种利用多重信号放大系统进行免疫吸附法双抗原夹心法检测抗体的方法，包括下述步骤：
(1)在固相基质上包被抗原；
(2)加入待检测抗体；
(3)加入抗原-DNA/RNA连接链，作用一定时间；
(4)加入DNA/RNA放大链，作用一定时间。
(5)加入DNA/RNA检测链，反应一定时间；
(6)进行洗涤，检测DNA/RNA检测链上的信号强度；
(7)根据不同浓度抗体标准品的检测信号强度绘制标准曲线，并根据待检测抗体样品的检测信号强度和标准曲线计算抗原的浓度。
本发明的优选技术方案中，步骤(1)中，包被吸附抗原后，加入封闭液进行封闭。
本发明的优选技术方案中，所述固相基质选自多孔板、PVDF膜、醛基化的固相基质等任何可吸附包被抗体/抗原或者通过化学键包被抗体/抗原的固相基质。
本发明的优选技术方案中，所述包被抗原选自任何可与相应抗体结合，并可被包被于固相基质的抗原。
本发明的优选技术方案中，所述抗原可通过化学键、吸附等作用包被于固相基质。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，所述待检测抗体来自于人、小鼠、细菌、病毒、其他任何来源的抗体的任一种或多种。
本发明优选的技术方案中，步骤(3)中，所述抗原-DNA/RNA连接链中，每个抗原分子连接一个或多个连接中间体。
本发明优选的技术方案中，所述抗原与连接中间体连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基或其他任何可行的连接基团中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，步骤(3)中，所述抗原-DNA/RNA连接链中，每个连接中间体上连接上一个或多个DNA/RNA连接链。
本发明优选的技术方案中，所述连接中间体与DNA/RNA连接链连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基或其他任何可行的连接基团中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述用于连接抗原和DNA/RNA连接链的连接中间体中的两种双官能团的比例为一比一、一比多中的任一种或多种。
本发明优选的技术方案中，所述两种官能团不同时为相同的官能团。本发明的优选技术方案中，步骤(4)中，可先连接一级DNA/RNA放大链，连接后再加入二级DNA/RNA放大链，根据需要连接更多级别DNA/RNA放大链。
本发明的优选技术方案中，步骤(6)中，可先进行第一轮DNA/RNA检测链检测；然后进行解离，再加入第二轮DNA/RNA检测链进行检测；然后进行解离，再加入第三轮DNA/RNA检测链进行检测；根据需要进行多轮检测。
本发明优选的技术方案中，检测过程中不低于1轮的检测，优选为2轮到7轮；每轮检测中同时检测1种或1种以上的抗体。
本发明优选的技术方案中，所述多重信号放大系统的连接链与放大链、放大链与放大链、放大链与检测链、连接链与检测链之间可进行一轮或多轮检测。
本发明优选的技术方案中，每一轮检测后下一轮检测前解离洗脱的位置可以为检测链与放大链互补配对的位置、放大链与放大链互补配对的位置、放大链与连接链互补配对的位置、连接链与检测链互补配对的位置。
本发明优选的技术方案中，通过调节洗脱液的浓度实现不同位置的解离。
本发明优选的技术方案中，所述检测信号可以连接于DNA/RNA检测链的任何位置，可以为5’端、3’端、或者检测链中间的任何位置。
本发明优选的技术方案中，所述检测信号包括但不限于荧光、磷光、化学发光、电磁信号、核磁信号、放射性信号中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，加入各步骤物质反应后，去除多余物质，然后进行洗涤操作。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、DNA/RNA检测链中可含有碱基重复单元。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA放大链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A(40≤n≤60)、
CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A(40≤n≤60)、
GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A(40≤n≤60)、
CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A(40≤n≤60)、
ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(40≤n≤60)、
GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A(40≤n≤60)、
GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A(40≤n≤60)、
TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(40≤n≤60)、
ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A(40≤n≤60)、
GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-TTT-TCCTTTTAT-A-(TCCTTTTAT-A)n-TCCTTTTAT-A(40≤n≤60)、
GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-TTT-CCTTCTATT-A-(CCTTCTATT-A)n-CCTTCTATT-A(40≤n≤60)、
GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-TTT-TTATTCACT-A-TTATTCACT-A-(TTATTCACT-A)n-TTATTCACT-A(40≤n≤60)、
TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T-TTTTGATTGTTT-TCATTACTT-A-TCATTACTT-A-(TCATTACTT-A)n-TCATTACTT-A(40≤n≤60)、
TATTATTGG-T-TATTATTGG-T-TATTATTGG-TTT-TTCTTACTC-A-TTCTTACTC-A-(TTCTTACTC-A)n-TTCTTACTC-A(40≤n≤60)。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA连接链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
AAAUUCCUCUACCACCUACA、
AAATTCCTCTACCACCTACATCAC、TATTTAGTGTTCGAATAGTT、
TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG、
AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC、
GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG、
GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT、
CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC、
AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC、
AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA检测链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
待检测信号-TT-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T、
待检测信号-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T、
待检测信号-TT-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T、
待检测信号-TT-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T、
待检测信号-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
待检测信号-TT-TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T、
待检测信号-TT-TATTATTGG-T-TATTATTGG-T、
待检测信号-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
待检测信号-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T、
待检测信号-TT-ATAAAAGGA-T-ATAAAAGGA-T、
待检测信号-TT-AATGAAAGA-T-AATGAAAGA-T、
待检测信号-TT-AGTGAATAA-T-AGTGAATAA-T、
待检测信号-TT-AAGTAATGA-T-AAGTAATGA-T、
待检测信号-TT-GAGTAAGAA-T-GAGTAAGAA-T、
待检测信号-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U。
本发明的另一目的在于多重信号放大系统在免疫吸附夹心法检测中的应用。
本发明的另一目的在于多重信号放大检测系统在免疫吸附夹心法检测中的应用。
本发明中，“DNA/RNA”是指DNA或RNA。
本发明中，“抗体/抗原”是指抗体或抗原。
与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
1、本发明是一种基于DNA或RNA互补配对的信号放大系统，通过DNA/RNA连接链和一条DNA/RNA放大链连接，DNA/RNA放大链与多个DNA/RNA检测链连接，实现信号单级多重放大；另外，DNA/RNA放大链还可与多个放大链连接，实现二级多重放大，甚至三级以上放大。本发明不仅实现了待检测抗原或抗体的浓度检测，并且降低了检测限，灵敏度更高。
2、本发明每一轮可以同时检测多种抗原或抗体的浓度。
3、本发明可以实现抗体或抗原的多轮检测，且可实现检测链、放大链、连接链互补配对部分的选择洗脱，适用性更广，降低时间成本和材料成本。
4、本发明中可量化偶联到每个抗原或抗体上的DNA/RNA连接链的数量。
附图说明
图1抗体与DNA/RNA连接链的连接过程。(1)抗体与中间连接体反应连接；(2)制得的抗体-连接中间体偶联物与DNA/RNA连接链反应结合；(3)抗体与DNA/RNA连接链连接成为抗体-DNA/RNA连接链。
图2本发明所述检测系统信号放大的原理机制。其中图a表示一级多重信号放大系统示意图，图b表示二级多重信号放大系统示意图。(1)引物Z*-A和发夹在酶的催化下，引物不断循环生成长链复合物1:Z*-AAAA…AA；(2)长链复合物1与抗体上的DNA/RNA连接链Z结合；(3)检测链A*A*与已经连接到抗体上的长链复合物1结合并发光，实现单次多重信号放大；(4)与步骤1同理，引物在A*A*-B和发夹在酶的催化下，引物不断循环生成长链复合物2:A*A*-BBBB…BB；(5)长链复合物2与已经连接到抗体上的长链复合物1结合；(6)检测链B*B*与已经连接到抗体上的长链复合物2结合并发光，实现2次多重信号放大。
Figure GDA0004146308110000291
代表抗体。
Figure GDA0004146308110000292
代表互补链。例如单链DNA或RNA：A链表示某一DNA或RNA的序列，那么A*表示A链的互补链的序列。
Figure GDA0004146308110000293
代表荧光基团
图3一级放大系统的免疫吸附双抗体夹心法检测流程。(1)准备一块多孔板，并包被抗体a；(2)孵育抗原，使其与抗体a结合；(3)孵育抗体b-DNA/RNA连接链，使其与抗体a和抗原形成抗体-抗原-抗体的夹心结构；(4)孵育长链复合物Z*-AAAA…AA，使其与抗体b上的DNA/RNA连接链Z结合；(5)孵育两条检测链，使其与抗体b上的长链复合物结合并发光，并随之进行检测；(6)将上一步骤中的两条检测链洗掉，并孵育另外两条检测链后进行检测。
Figure GDA0004146308110000294
代表抗体
Figure GDA0004146308110000295
代表互补链。例如单链DNA或RNA：A链表示某一DNA或RNA片段序列，那么A*表示A链互补链的序列。
Figure GDA0004146308110000296
代表抗原1
Δ代表抗原2
Figure GDA0004146308110000297
代表抗原3
□代表抗原4
Figure GDA0004146308110000298
图4实施例1中制备所得放大链采用凝胶电泳跑胶结果示意图。
图5实施例1采用一级放大系统进行双重双轮检测四种抗原浓度时四种不同抗原的标准曲线。a,IL-10的标准曲线；b,TGF-β的标准曲线；c,IFN-γ的标准曲线；d,TNF-α的标准曲线。
图6二级放大系统免疫吸附双抗体夹心法的检测流程。(1)准备一块多孔板，并包被抗体a；(2)孵育抗原，使其与抗体a结合；(3)孵育抗体b-DNA连接链结合，使其与抗体a和抗原形成抗体-抗原-抗体的夹心结构；(4)孵育长链复合物Z*-AAAA…AA，使其与抗体b上的DNA连接链Z结合；(5)二次信号放大；(6)孵育两条检测链，使其与抗体b上的长链复合物结合并发光，并随之进行检测；(7)将上一步骤中的两条检测链洗掉，并孵育另外两条检测链后进行检测。
Figure GDA0004146308110000301
代表抗体
Figure GDA0004146308110000302
代表互补链。单链DNA或RNA：A链表示某一DNA或RNA片段序列，则A*表示A链互补链的序列。
○代表抗原1
△代表抗原2
Figure GDA0004146308110000303
代表抗原3
Figure GDA0004146308110000304
Figure GDA0004146308110000305
代表红色荧光基团b
图7实施例2采用二级放大系统进行双轮检测四种抗原浓度时四种不同抗原的标准曲线。a,IL-10的标准曲线；b,TGF-β的标准曲线；c,IFN-γ的标准曲线；d,TNF-α的标准曲线。
图8双重放大系统双抗原夹心法的免疫吸附法检测流程。(1)准备一块多孔板，并包被抗原a(2)并孵育抗体，使抗体与抗原a结合(3)后孵育抗原b，使其与抗原a和抗体形成抗原-抗体-抗原的夹心结构(4)孵育长链复合物Z*-AAAA…AA，使其与抗原b上的DNA/RNA连接链Z结合(5)二次信号放大；(6)孵育2条检测链，使其与抗原b上的长链复合物结合并发光，并随之进行检测；(7)将上一步骤中的2条检测链洗掉，并孵育另外两条检测链后进行检测。
Figure GDA0004146308110000311
代表抗体
Figure GDA0004146308110000312
代表互补链。例如单链DNA或RNA：A链表示某一DNA或RNA片段序列，则A*表示A链互补链的序列。
○代表抗原1
△代表抗原2
Figure GDA0004146308110000313
代表抗原3
Figure GDA0004146308110000314
Figure GDA0004146308110000315
代表红色荧光基团b
图9实施例5中六轮检测6种抗原时的标准曲线和检测限示图。其中a-f为六种抗原的标准曲线图；g-l为六种抗原的检测限示意图。
图10实施例6中与传统酶-底物显色法ELISA对比时的标准曲线和检测限示图。其中a和c分别为DNA放大系统免疫吸附法和传统ELISA法检测时的标准曲线；b和d分别为DNA放大系统免疫吸附法和传统ELISA法检测时的检测限示意图。
具体实施方式
下面列举一部分具体实施例对本发明进行说明，有必要在此指出的是以下具体实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
表1-表8为本发明实施例中DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、DNA/RNA
DNA/RNA连接链序列编号 DNA连接链序列
DNA连接链1 AAATTCCTCTACCACCTACATCAC
DNA连接链2 TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG
DNA连接链3 AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC
DNA连接链4 GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG
DNA连接链5 GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT
DNA连接链6 CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC
DNA连接链7 AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC
RNA连接链8 AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC
检测链的序列信息。
表1.用于连接抗体的DNA连接链序列(从5’端到3’端)
表2.用于放大链制备的引物和发夹序列(从5’端到3’端)
Figure GDA0004146308110000321
Figure GDA0004146308110000331
表3.DNA放大链序列(从5’端到3’端)
Figure GDA0004146308110000332
表4.用于荧光检测的DNA检测链序列信息(从5’端到3’端)
Figure GDA0004146308110000333
Figure GDA0004146308110000341
表5.实施例1中用于一级多重信号放大免疫吸附检测的连接链、放大链和检测链
被检测抗原 DNA连接链 DNA一级放大链 DNA检测链
IL-10抗原 DNA连接链1 C.1 i.1*
TGF-β抗原 DNA连接链2 C.2 i.2*
INF-γ抗原 DNA连接链3 C.3 i.3*
TNF-α抗原 DNA连接链4 C.4 i.4*
表6.实施例2中用于二级多重信号放大免疫吸附检测的连接链、放大链和检测链
Figure GDA0004146308110000342
表7.实施例3中用于二级多重信号放大免疫吸附检测的连接链、放大链和检测链
Figure GDA0004146308110000343
Figure GDA0004146308110000351
表8.实施例4和5中用于六重抗原检测的抗体以及DNA检测链、放大链和检测链
Figure GDA0004146308110000352
实施例1采用一级多重放大系统和双抗体夹心法免疫吸附法检测多种抗原
如图3所示，本实施例采用双抗体夹心法同时检测4种抗原的浓度，四种抗原分别为IL-10，TGF-β，IFN-γ和TNF-α。
一、抗体-DNA连接链的制备(以anti-human IL-10detection antibody和DNA连接链1的连接为例)
(1)将抗体(anti-human IL-10detection antibody)通过超滤离心(100kDaMWCO)浓缩至2mg/mL，去除叠氮化物和其他防腐剂。
(2)抗体与连接中间体聚乙二醇化的长链SMCC(SM(PEG)2)(摩尔比1:20)在4℃反应3小时，SM(PEG)2具有双官能团，一个官能团与抗体上氨基反应连接，另一个官能团与巯基反应连接。
(3)通过脱盐离心柱(7000Da MWCO)去除多余的SM(PEG)2。
(4)加入巯基化修饰的DNA连接链(AAATTCCTCTACC ACCTACATCAC)，与连接中间体相连接的抗体混合(摩尔比15:1)，4℃反应12小时。
(5)通过超滤离心管(100kDa MWCO)纯化抗体-DNA连接链。
(6)抗体与DNA连接成功的验证：使用基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF)验证是否成功地将DNA连接链偶联到抗体上，并量化偶联到每个抗体上的DNA数量。结果显示，每个抗体上连接上了1个DNA连接链。
二、DNA放大链的制备(以C.1放大链的制备为例)
(1)在100μL PBS反应液中分别加入10mM MgSO4，80units/mL的聚合酶，600μM的dATP/dCTP/dTTP，10μM发卡结构h.1.1和10μM相应的引物p.1，将反应液置于37℃反应9小时。
(2)反应完成后将反应液置于80℃作用20分钟以灭活酶。
(3)将反应产物与蛋白上样缓冲液(含30mM乙二胺四乙酸，50％甘油，0.25％二甲苯青，0.25％溴酚蓝)按照9:1的体积比混合后在95℃反应5分钟。
(4)制备1％琼脂糖凝胶，采用Gelred为染料。
(5)凝胶放入电泳液中，将电压调至75V，运行30分钟，在泳道中分别加入样品和DL1000DNA marker，将电压调至200V，运行25分钟，结果如图4所示。
(6)将目的DNA条带从凝胶中切下，通过DNA回收试剂盒进行纯化回收，冻干回收的DNA，-20℃保存。
三、采用双抗体夹心法检测多种抗原
(1)将4种不同的包被抗体a(Anti-human IL-10capture antibody/anti-humanIFN-γcapture antibody/anti-human TNF-αcapture antibody/anti-human TGF-βcapture antibody)混合，用包被液(50mM Na2CO3/NaHCO3)将每种包被抗体的浓度稀释至10μg/mL，将混合液包被至96孔板，在4℃下过夜。
(2)去除未与96孔板结合的4种包被抗体a并用洗涤缓冲液洗涤3遍，加入封闭液(1％BSA in PBS)，37℃封闭2小时。
(3)去除封闭液并用洗涤缓冲液(0.1％tween-20)洗涤3遍，将4种抗原混合并加入相应的孔中于室温孵育4小时。
(4)去除抗原并用洗涤缓冲液洗涤3遍，加入4种检测抗体b-DNA连接链(anti-human IL-10detection antibody/anti-human IFN-γdetection antibody/anti-humanTNF-αdetection antibody/anti-human TGF-βdetection antibody)(IL-10抗体连接DNA连接链1，TGF-β抗体连接DNA连接链2，IFN-γ抗体连接DNA连接链3，TNF-α抗体连接DNA连接链4)，用封闭液将各个检测抗体稀释至2μg/mL，并加入相应的孔中后于室温孵育2小时。
(5)去除各个检测抗体并用洗涤缓冲液洗涤3遍，再用杂交洗涤缓冲液(15％甲酰胺,1mM EDTA)洗涤1遍并加入4种一级DNA放大链C.1、C.2、C.3和C.4(60nM-150nM)，37℃过夜孵育。
(6)去除DNA放大链并用杂交洗涤缓冲液洗涤3遍，再用检测缓冲液(500mM NaClin 1mM Tris-HCl)洗涤1遍，加入第一轮的两种DNA检测链i.1*和i.2*(1μM)，室温反应1小时，i.1*上连有绿色荧光信号(激发波长485nm，发射波长528nm)，i.2*上连接有红色荧光信号(激发波长579nm，发射波长620nm)。
(7)去除未结合的游离DNA检测链后同时检测两种DNA检测链i.1*和i.2*上的不同荧光信号强度。
(8)去除检测缓冲液，加入解离缓冲液(45％甲酰胺)，反应30分钟。
(9)去除解离缓冲液，用PBS缓冲液洗涤2遍，再用检测缓冲液洗涤2遍，加入第二轮检测的两种检测链i.3*和i.4*(1μM)并室温反应1小时，i.3*DNA上连有绿色荧光信号(激发波长485nm，发射波长528nm)，i.4*上连接有红色荧光信号(激发波长579nm，发射波长620nm)。
(10)去除未结合的游离检测链后同时检测两种DNA检测链i.3*和i.4*上的不同荧光信号强度。
(11)将每种抗原的标准品分别稀释成不同浓度，制备标准曲线用于定量计算待检测抗原的浓度。根据不同浓度抗原标准品绘制标准曲线，并根据待检测抗原样品中不同的信号强度，计算每种抗原的浓度。
四、实验结果
四种抗原的浓度检测结果与四种抗原已知浓度一致。IL-10浓度为30.0ng/mL，检测信号强度(荧光值)带入标准曲线方程的计算浓度为30.5ng/mL；TGF-β1浓度为65.0ng/mL，检测荧光值带入标准曲线方程的计算浓度为60.1ng/mL；INF-γ浓度为40.0ng/mL，检测荧光值带入标准曲线方程的计算浓度为38ng/mL；TNF-α浓度为5.0ng/mL，检测荧光值带入标准曲线方程的计算浓度为5.8ng/mL。
实施例2采用二级多重信号放大系统和双抗体夹心法检测多种抗原的含量
一、抗体和DNA连接链的制备
抗体-DNA连接链的制备同实施例1。
本实施例采用以抗体上的氨基与连接中间体聚乙二醇化的长链SMCC(SM(PEG)2)反应，再利用SM(PEG)2与DNA连接链上的巯基相连的方式来将抗体与DNA连接链相连，所使用的连接中间体具有双官能团，一端可与抗体上的氨基反应连接，另一端可与DNA上的巯基反应相连。
二、DNA放大链的制备
以可以部分互补配对的一级放大链C.1和二级放大链C.8为例。
C.1一级放大链的制备同实施例1，C.8二级放大链的制备过程如下：
(1)在100μLPBS反应液中分别加入10mM MgSO4,80units/ml的聚合酶，600μM的dATP/dCTP/dTTP，10μM h.8.8和10μM相应的引物p.8，将反应液置于37℃作用9小时。
(2)反应完成后将反应液置于80℃作用20分钟以灭活酶。
(3)将反应产物与蛋白上样缓冲液(含30mM乙二胺四乙酸，50％甘油，0.25％二甲苯青，0.25％溴酚蓝)按照体积比9:1混合后在95℃反应5分钟。
(4)制备1％琼脂糖凝胶，采用Gelred为染料。
(5)凝胶放入电泳液中，将电压调至75V，运行30分钟，之后在泳道中分别加入样品和DL 1000DNA marker，将电压调至200V，运行25分钟。
(6)将目的DNA条带从凝胶中切下，通过DNA回收试剂盒进行纯化回收，回收后的DNA进行冻干，之后放入-20℃进行保存。
同理制得可制得其他需要的放大链，如C.2-C.4，C,9-C.11放大链。
三、采用双抗体夹心法检测多种抗原
(1)将4种不同的包被抗体a(Anti-human IL-10capture antibody/anti-humanIFN-γcapture antibody/anti-human TNF-αcapture antibody/anti-human TGF-βcapture antibody)混合，用包被液将每种包被抗体的浓度稀释至10μg/mL，将混合液包被至96孔板，4℃过夜。
(2)去除未与96孔板结合的4种包被抗体a并用洗涤缓冲液洗涤3遍，加入封闭液，37℃封闭2小时。
(3)去除封闭液并用洗涤缓冲液洗涤3遍，将4种抗原IL-10、IFN-γ、TNF-α和TGF-β混合并加入相应的孔中，室温孵育4小时；
(4)去除抗原并用洗涤缓冲液洗涤3遍，加入4种检测抗体b(anti-human IL-10detection antibody/anti-human IFN-γdetection antibody/anti-human TNF-αdetection antibody/anti-human TGF-βdetection antibody)-连接链(IL-10抗体连接DNA连接链1，TGF-β抗体连接DNA连接链2，IFN-γ抗体连接DNA连接链3，TNF-α抗体连接DNA连接链4)，用封闭液将各个检测抗体稀释至2μg/mL并加入相应的孔中后于室温孵育2小时。
(5)去除未结合的检测抗体用洗涤缓冲液洗涤3遍，再用杂交洗涤缓冲液(15％甲酰胺)洗涤1遍并加入4种DNA一级放大链C.1、C.2、C.3和C.4(60nM-150nM)，37℃过夜孵育。
(6)去除一级DNA放大链，用杂交洗涤液洗涤3遍，然后加入与一级DNA放大链部分互补的4种二级DNA放大链C.8、C.9、C.10和C.11(60nM-150nM)，37℃孵育5个小时。
(7)去除DNA放大链并用杂交洗涤缓冲液洗涤3遍，再用检测缓冲液洗涤1遍，加入第一轮的两种DNA检测链i.8*和i.9*(1μM)，室温反应1小时，i.8*DNA检测链上连有绿色荧光信号(激发波长485nm，发射波长528nm)，i.9*DNA检测链连接有红色荧光信号(激发波长579nm，发射波长620nm)。
(8)去除未结合的游离DNA检测链，然后同时检测两种DNA检测链的荧光信号强度。
(9)去除检测缓冲液，加入解离缓冲液，室温反应20分钟。
(10)去除解离缓冲液，用PBS缓冲液洗涤2遍，再用检测缓冲液洗涤2遍，加入第二轮检测的两种检测链i.10*和i.11*(1μM)并于室温反应1小时，i.10*DNA检测链上连有绿色荧光信号(激发波长485nm，发射波长528nm)，i.11*DNA检测链连接有红色荧光信号(激发波长579nm，发射波长620nm)。
(11)去除未结合的游离DNA检测链然后同时检测两种DNA检测链的荧光信号强度。
(12)将每种抗原的标准品分别稀释成不同浓度，制备标准曲线用于定量计算待检测抗原的浓度。根据不同浓度抗原标准品绘制标准曲线，并根据待检测抗原样品中不同的信号强度，计算每种抗原的浓度。
四、实验结果
在本实验中，四种抗原的浓度已知，检测结果与四种抗原已知浓度一致。
已知IL-10浓度为0.50ng/mL，检测荧光值带入标准曲线方程后计算浓度为0.50ng/mL；已知TGF-β1浓度为0.20ng/mL，检测荧光值带入标准曲线方程后计算浓度为0.20ng/mL；已知INF-γ浓度为0.40ng/mL，检测荧光值带入标准曲线方程后计算浓度为0.39ng/mL；已知TNF-α浓度为0.25ng/mL，检测荧光值带入标准曲线方程后计算浓度为0.25ng/mL。
实施例3二级多重放大系统和双抗原夹心法检测多种抗体的含量
在本实施例中，采用双抗原夹心法同时检测4种抗体的浓度。
一.抗原和DNA/RNA连接链的制备
制备方法同实施例1中抗体-DNA连接链的制备，本实施例中抗原通过连接中间体SMPH(琥珀酰亚胺基-6-[(β-马来酰亚胺丙酰胺基)]己酯)与DNA或RNA连接链连接，制得抗原-DNA连接链(胰岛细胞瘤相关蛋白2(IA-2)抗原-DNA连接链2、胰岛素抗原-DNA连接链3、锌转运体8抗原-DNA连接链4)，抗原-RNA连接链(谷氨酸脱羧酶(GAD65))抗原-RNA连接链8)。
二、信号放大系统中DNA放大链的制备
同实施例2中DNA放大链的制备，制得C.1-C.4、C.8-C.11放大链。
三、采用双抗原夹心法检测多种抗体
(1)将4种不同的包被抗原a(人谷氨酸脱羧酶(GAD65)/人胰岛细胞瘤相关蛋白2(IA-2)/人胰岛素/人锌转运体8(ZnT8))混合，用包被液(50mM Na2CO3/NaHCO3 in PBS)将每种包被抗原的浓度稀释至10μg/mL，将混合液包被至96孔板，在4℃下过夜。
(2)去除未与96孔板结合的4种包被抗原a并用洗涤缓冲液洗涤3遍，加入封闭液，37℃封闭2小时。
(3)去除封闭液并用洗涤缓冲液洗涤3遍，将GAD65抗体，IA-2抗体，胰岛素抗体和ZnT8抗体4种抗体混合并加入相应的孔中于室温孵育4小时
(4)用洗涤缓冲液洗涤3遍，加入连接上了不同DNA或RNA连接链的4种检测抗原b(谷氨酸脱羧酶(GAD65)/胰岛细胞瘤相关蛋白2(IA-2)/胰岛素/锌转运体8)，用封闭液将各个检测抗原稀释至2μg/mL并加入相应的孔中后于室温孵育2小时。
(5)去除未结合的检测抗原并用洗涤缓冲液洗涤3遍，再用杂交洗涤缓冲液洗涤1遍并加入4种DNA放大链C.1、C.2、C.3和C.4(60nM-150nM)后37℃过夜孵育。
(6)去除一级DNA放大链，用杂交洗涤液洗涤3遍，然后加入与一级DNA放大链部分互补的4种二级DNA放大链C.8、C.9、C.10和C.11(60nM-150nM)，37℃孵育5个小时。
(7)去除DNA放大链并用杂交洗涤缓冲液洗涤3遍，再用检测缓冲液洗涤1遍，加入第一轮的两种DNA检测链i.15*和i.9*(1μM)于室温反应1小时，i.15*DNA检测链上连有黄色荧光信号(激发波长526nm，发射波长551nm)，i.6*DNA检测链连接有红色荧光信号(激发波长579nm，发射波长620nm)。
(8)去除未结合的DNA检测链，用检测缓冲液洗涤2遍后检测荧光信号。
(9)去除检测缓冲液，加入解离缓冲液，室温反应20分钟。
(10)去除解离缓冲液，用PBS缓冲液洗涤2遍，再用检测缓冲液洗涤2遍，加入第二轮检测的两种检测链i.10*和i.11*(1μM)并于室温反应1小时，i.7*DNA检测链上连有黄色荧光信号(激发波长526nm，发射波长551nm)，i.8*DNA检测链连接有红色荧光信号(激发波长579nm，发射波长620nm)。
(11)去除未结合的检测链，用检测缓冲液洗涤2遍后检测荧光信号。
(12)将每种抗体的标准品分别稀释成不同浓度，制备标准曲线用于定量计算待检测抗体的浓度。根据不同浓度抗体标准品绘制标准曲线，并根据待检测抗体样品中不同的信号强度，计算每种抗体的浓度。
四、实验结果
在本实验中，四种抗体的浓度已知，检测结果与四种抗体已知理论浓度一致。已知GAD65抗体浓度为0.60ng/mL，检测结果带入标准曲线方程后计算浓度为0.59ng/mL；已知IA-2抗体浓度为0.50ng/mL，检测结果带入标准曲线方程后计算浓度为0.50ng/mL；已知胰岛素抗体浓度为0.70ng/mL，检测结果带入标准曲线方程后计算浓度为0.69ng/mL；已知ZnT8抗体浓度为0.95ng/mL，检测结果带入标准曲线方程后计算浓度为0.94ng/mL。
实施例4采用二级多重信号放大系统双抗体夹心法检测三轮检测6种抗原的含量
一.抗体和DNA连接链的制备
抗体-DNA连接链的制备方法同实施例1的制备方法，制得IL-2抗体-DNA连接链7、TGF-β抗体-DNA连接链2、IFN-γ抗体-DNA连接链3、IL-10抗体-DNA连接链5、TNF-α抗体-DNA连接链4、IL-6抗体-DNA连接链6。
二、DNA放大链的制备
DNA放大链的制备方法同实施例1的制备方法，制得放大链C.2-C.7、C.9-C.14。
三、采用双抗体夹心法检测多种抗原
(1)将6种不同的包被抗体a(Anti-human IL-2capture antibody/anti-humanTGF-βcapture antibody/anti-human IFN-γcapture antibody/Anti-human IL-10capture antibody/anti-human TNF-αcapture antibody/Anti-human IL-6captureantibody)混合，用包被液将每种包被抗体的浓度稀释至10μg/mL，将混合液包被至96孔板，4℃过夜。
(2)去除未与96孔板结合的6种包被抗体a并用洗涤缓冲液洗涤3遍，加入封闭液，37℃封闭2小时。
(3)去除封闭液并用洗涤缓冲液洗涤3遍，将6种抗原IL-2、TGF-β、IFN-γ、IL-10、TNF-α和IL-6混合并加入相应的孔中，室温孵育4小时；
(4)去除抗原并用洗涤缓冲液洗涤3遍，加入6种检测抗体b(Anti-human IL-2detection antibody/anti-human TGF-βdetection antibody/anti-human IFN-γdetection antibody/Anti-human IL-10detection antibody/anti-human TNF-αdetection antibody/anti-human IL-6detection antibody)(如表8所示每种抗体b上都连接上了各自的不同DNA连接链)，用封闭液将各个检测抗体稀释至2μg/mL并加入相应的孔中后于室温孵育2小时。
(5)去除未结合的检测抗体用洗涤缓冲液洗涤3遍，再用杂交洗涤缓冲液(15％甲酰胺)洗涤1遍并加入6种DNA一级放大链C.7、C.2、C.3、C.4、C.5和C.6(60nM-150nM)，37℃过夜孵育。
(6)去除一级DNA放大链，用杂交洗涤液洗涤3遍，然后加入与一级DNA放大链部分互补的6种二级DNA放大链C.14、C.9、C.10、C.11、C.12和C.13(60nM-150nM)，37℃孵育5个小时。
(7)去除DNA放大链并用杂交洗涤缓冲液洗涤3遍，再用检测缓冲液洗涤1遍，加入第一轮的两种DNA检测链i.14*和i.9*(1μM)，室温反应1小时，i.14*DNA检测链上连有绿色荧光信号(激发波长485nm，发射波长528nm)，i.9*DNA检测链连接有红色荧光信号(激发波长579nm，发射波长620nm)。
(8)去除未结合的游离DNA检测链，然后同时检测两种DNA检测链的荧光信号强度。
(9)去除检测缓冲液，加入解离缓冲液，室温反应20分钟。
(10)去除解离缓冲液，用PBS缓冲液洗涤2遍，再用检测缓冲液洗涤2遍，加入第二轮检测的两种检测链i.10*和i.11*(1μM)并于室温反应1小时，i.10*DNA检测链上连有绿色荧光信号(激发波长485nm，发射波长528nm)，i.11*DNA检测链连接有红色荧光信号(激发波长579nm，发射波长620nm)。
(11)去除未结合的游离DNA检测链然后同时检测两种DNA检测链的荧光信号强度。
(12)去除检测缓冲液，加入解离缓冲液，室温反应20分钟。
(13)去除解离缓冲液，用PBS缓冲液洗涤2遍，再用检测缓冲液洗涤2遍，加入第三轮检测的两种检测链i.12*和i.13*(1μM)并于室温反应1小时，i.12*DNA检测链上连有绿色荧光信号(激发波长485nm，发射波长528nm)，i.13*DNA检测链连接有红色荧光信号(激发波长579nm，发射波长620nm)。
(14)去除未结合的游离DNA检测链然后同时检测两种DNA检测链的荧光信号强度。
(15)将每种抗原的标准品分别稀释成不同浓度，制备标准曲线用于定量计算待检测抗原的浓度。根据不同浓度抗原标准品绘制标准曲线，并根据待检测抗原样品中不同的信号强度，计算每种抗原的浓度。
四、实验结果
在本实验中，6种抗原的浓度已知，检测结果与6种抗原已知浓度一致。已知IL-2浓度为46.9pg/mL，检测浓度为46.1pg/mL；已知TGF-β浓度为7.8pg/mL，检测浓度为7.7pg/mL；已知INF-γ浓度为125.0pg/mL，检测浓度为126.6pg/mL；已知IL-10浓度为500.0pg/mL，检测浓度为492.0pg/mL；已知TNF-α浓度为23.4pg/mL，检测浓度为23.5pg/mL；已知6浓度为5.9pg/mL，检测荧光值带入标准曲线方程后计算浓度为6.4pg/mL。
实施例5采用二级多重信号放大系统双抗体夹心法检测六轮检测6种抗原的含量
一、抗体和DNA连接链的制备
抗体-DNA连接链的制备方法同实施例1的制备方法，制得IL-2抗体-DNA连接链7、TGF-β抗体-DNA连接链2、IFN-γ抗体-DNA连接链3、IL-10抗体-DNA连接链5、TNF-α抗体-DNA连接链4、IL-6抗体-DNA连接链6。
二、DNA放大链的制备
DNA放大链的制备方法同实施例1的制备方法，制得放大链C.2-C.7、C.9-C.14。
三、采用双抗体夹心法检测多种抗原
(1)将6种不同的包被抗体a(Anti-human IL-2capture antibody/anti-humanTGF-βcapture antibody/anti-human IFN-γcapture antibody/Anti-human IL-10capture antibody/anti-human TNF-αcapture antibody/Anti-human IL-6captureantibody)混合，用包被液将每种包被抗体的浓度稀释至10μg/mL，将混合液包被至96孔板，4℃过夜。
(2)去除未与96孔板结合的6种包被抗体a并用洗涤缓冲液洗涤3遍，加入封闭液，37℃封闭2小时。
(3)去除封闭液并用洗涤缓冲液洗涤3遍，将6种抗原IL-2、TGF-β、IFN-γ、IL-10、TNF-α和IL-6混合并加入相应的孔中，室温孵育4小时；
(4)去除抗原并用洗涤缓冲液洗涤3遍，加入6种检测抗体b(Anti-human IL-2detection antibody/anti-human TGF-βdetection antibody/anti-human IFN-γdetection antibody/Anti-human IL-10detection antibody/anti-human TNF-αdetection antibody/anti-human IL-6detection antibody))(如表8所示每种抗体b上都连接上了各自的不同DNA连接链)，用封闭液将各个检测抗体稀释至2μg/mL并加入相应的孔中后于室温孵育2小时。
(5)去除未结合的检测抗体用洗涤缓冲液洗涤3遍，再用杂交洗涤缓冲液(15％甲酰胺)洗涤1遍并加入6种DNA一级放大链C.7、C.2、C.3、C.4、C.5和C.6(60nM-150nM)，37℃过夜孵育。
(6)去除一级DNA放大链，用杂交洗涤液洗涤3遍，然后加入与一级DNA放大链部分互补的6种二级DNA放大链C.14、C.9、C.10、C.11、C.12和C.13(60nM-150nM)，37℃孵育5个小时。
(7)去除DNA放大链并用杂交洗涤缓冲液洗涤3遍，再用检测缓冲液洗涤1遍，加入第一轮的DNA检测链i.14*(1μM)，室温反应1小时，i.14*DNA检测链上连有红色荧光信号(激发波长579nm，发射波长620nm)。
(8)去除未结合的游离DNA检测链，然后检测DNA检测链荧光信号强度。
(9)去除检测缓冲液，加入解离缓冲液，室温反应20分钟。
(10)去除解离缓冲液，用PBS缓冲液洗涤2遍，再用检测缓冲液洗涤2遍，加入第二轮的DNA检测链i.9*(1μM)，室温反应1小时i.9*DNA检测链连接有红色荧光信号(激发波长579nm，发射波长620nm)。
(11)去除未结合的游离DNA检测链，然后检测检测链的荧光信号强度。
(12)去除检测缓冲液，加入解离缓冲液，室温反应20分钟。
(13)去除解离缓冲液，用PBS缓冲液洗涤2遍，再用检测缓冲液洗涤2遍，加入第三轮检测的检测链i.10*(1μM)并于室温反应1小时，i.10*DNA检测链上连有红色荧光信号(激发波长579nm，发射波长620nm)。
(14)去除未结合的游离DNA检测链然后检测DNA检测链的荧光信号强度。
(15)去除检测缓冲液，加入解离缓冲液，室温反应20分钟。
(16)去除解离缓冲液，用PBS缓冲液洗涤2遍，再用检测缓冲液洗涤2遍，加入第四轮检测的检测链i.11*(1μM)并于室温反应1小时，i.11*DNA检测链连接有红色荧光信号(激发波长579nm，发射波长620nm)。
(17)去除未结合的游离DNA检测链然后检测DNA检测链的荧光信号强度。
(18)去除检测缓冲液，加入解离缓冲液，室温反应20分钟。
(19)去除解离缓冲液，用PBS缓冲液洗涤2遍，再用检测缓冲液洗涤2遍，加入第五轮检测的检测链i.12*(1μM)并于室温反应1小时，i.12*DNA检测链上连有红色荧光信号(激发波长579nm，发射波长620nm)。
(20)去除未结合的游离DNA检测链然后检测DNA检测链的荧光信号强度。
(21)去除检测缓冲液，加入解离缓冲液，室温反应20分钟。
(22)去除解离缓冲液，用PBS缓冲液洗涤2遍，再用检测缓冲液洗涤2遍，加入第六轮检测的检测链i.13*(1μM)并于室温反应1小时，i.13*DNA检测链连接有红色荧光信号(激发波长579nm，发射波长620nm)。
(23)去除未结合的游离DNA检测链然后检测DNA检测链的荧光信号强度。
(24)将每种抗原的标准品分别稀释成不同浓度，制备标准曲线用于定量计算待检测抗原的浓度。根据不同浓度抗原标准品绘制标准曲线，并根据待检测抗原样品中不同的信号强度，计算每种抗原的浓度。
四、实验结果
在本实验中，6种抗原的浓度已知，检测结果与6种抗原已知浓度一致。已知IL-2浓度为39.1pg/mL，检测浓度为40.0pg/mL；已知TGF-β浓度为2.0pg/mL，检测浓度为2.6pg/mL；已知INF-γ浓度为93.7pg/mL，检测浓度为92.8pg/mL；已知IL-10浓度为125.0pg/mL，检测浓度为124.4pg/mL；已知TNF-α浓度为31.3pg/mL，检测浓度为32.2pg/mL；已知IL-6浓度为7.8pg/mL，检测浓度为8.0pg/mL。
IL-2的检测限为0.015pg/mL；TGF-β的检测限小于0.004pg/mL；INF-γ的检测限为0.060pg/mL；IL-10的检测限为0.060pg/mL；TNF-α的检测限为0.015pg/mL；IL-6的检测限为0.015pg/mL。
实施例6采用二级多重放大系统的双抗体夹心法与传统ELISA法检测抗原的对比
一、抗体和DNA连接链的制备
本实施例具体实验步骤与实施例1相同。
二、DNA放大链的制备
DNA放大链的制备与实施例2相同。
三、采用DNA放大系统的双抗体夹心法检测抗原
(1)将包被抗体a(Anti-human IL-10capture antibody)用包被液稀释至10μg/mL，将混合液包被至96孔板，4℃过夜。
(2)去除未与96孔板结合的包被抗体a并用洗涤缓冲液洗涤3遍，加入封闭液，37℃封闭2小时。
(3)去除封闭液并用洗涤缓冲液洗涤3遍，将抗原IL-10加入相应的孔中，室温孵育4小时；
(4)去除抗原并用洗涤缓冲液洗涤3遍，加入检测抗体b-DNA连接链，(IL-10抗体连接DNA连接链5)，用封闭液将各个检测抗体稀释至2μg/mL并加入相应的孔中后于室温孵育2小时。
(5)去除未结合的检测抗体用洗涤缓冲液洗涤3遍，再用杂交洗涤缓冲液(15％甲酰胺)洗涤1遍并加入DNA一级放大链C.5(60nM-150nM)，37℃过夜孵育。
(6)去除一级DNA放大链，用杂交洗涤液洗涤3遍，然后加入与一级DNA放大链部分互补的二级DNA放大链C.12(60nM-150nM)，37℃孵育5个小时。
(7)去除DNA放大链并用杂交洗涤缓冲液洗涤3遍，再用检测缓冲液洗涤1遍，加入DNA检测链i.12*(1μM)，室温反应1小时，i.12*DNA检测链连接有红色荧光信号(激发波长579nm，发射波长620nm)。
(8)去除未结合的游离DNA检测链，然后检测荧光信号强度。
(9)将每种抗原的标准品分别稀释成不同浓度，制备标准曲线用于定量计算待检测抗原的浓度。根据不同浓度抗原标准品绘制标准曲线，并根据待检测抗原样品中不同的信号强度，计算每种抗原的浓度。
四、采用传统ELISA法检测抗原浓度
(1)将人IL-10包被抗体a用包被液稀释至10μg/mL，包被至96孔板，4℃过夜。
(2)去除抗体未被包被的剩余溶液并用洗涤缓冲液(0.05％Tween-20in PBS)洗涤4遍，加入封闭液，室温封闭1小时。
(3)去除封闭液并用洗涤缓冲液洗涤4遍，在相应的孔中加入标准品，在室温孵育2小时。在实验中，将人IL-10的标准品提前稀释成不同浓度。
(4)用洗涤缓冲液洗涤4遍，用封闭液将Biotin修饰的人IL-10检测抗体稀释至2μg/mL并加入相应的孔中后于室温孵2小时。
(5)去除检测抗体并用洗涤缓冲液洗涤4遍，在相应的孔中加入亲和素修饰的辣根过氧化物酶，在室温孵育半个小时。
(6)去除辣根过氧化物酶并用洗涤缓冲液洗涤5遍，在相应的孔中加入TMB底物进行显色，在室温暗黑条件下孵育半个小时。
(7)在相应的孔中加入终止液，在450nm处进行吸光度值的检测。
五、实验结果
在本实验中，使用放大系统的双抗体夹心法检测IL-10的检测限是0.06pg/mL；使用传统双抗体夹心法ELISA检测IL-10的检测限为2.0pg/mL。
在本实验中，已知IL-10浓度为10.0pg/mL，使用放大系统的双抗体夹心法检测所得浓度为10.3pg/mL；使用传统双抗体夹心法ELISA检测时已知IL-10浓度为93.75pg/mL，传统ELISA检测所得浓度为78.1pg/mL。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。
序列表
<110> 艾克发（北京）生物技术有限公司
<120> 一种信号放大系统及其用于免疫吸附夹心法检测
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<211> 43
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> 3'端，反向dT修饰
<400> 21
atcattactt gggccttttg gcccaagtaa tgataagtaa tga 43
<210> 22
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> 3'端，反向dT修饰
<400> 22
attcttactc gggccttttg gcccgagtaa gaatgagtaa gaa 43
<210> 23
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(46)
<223> 重复单元，重复次数40-60次
<400> 23
gtgatgtagg tggtagagga atttttataa acctaaataa acctaaataa acctaa 56
<210> 24
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(50)
<223> 重复单元，重复次数40-60次
<400> 24
ctagatcgaa ctattcgaac actaaatatt catcatcata catcatcata catcatcata 60
<210> 25
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)..(64)
<223> 重复单元，重复次数40-60次
<400> 25
gggttattgc gaggatatag ggcgtggcgg tgtcatagaa ttttaatact ctcaaatact 60
ctcaaatact ctca 74
<210> 26
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(65)
<223> 重复单元，重复次数40-60次
<400> 26
ctgttgcgcg ggagaacgac acggacgcta aatataggaa acttacaact taacacaact 60
taacacaact taaca 75
<210> 27
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)..(64)
<223> 重复单元，重复次数40-60次
<400> 27
attgagacgg tacggttcac tgctaacgga cgatttggat tcttttcatt tacattcatt 60
tacattcatt taca 74
<210> 28
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)..(64)
<223> 重复单元，重复次数40-60次
<400> 28
gagtatgcgt cggagacctt gacggacctt ggactagact tgttcaatca aaaacaatca 60
aaaacaatca aaaa 74
<210> 29
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)..(64)
<223> 重复单元，重复次数40-60次
<400> 29
gacggtgaat gtacgactat gcgacgggat actacaggaa ctttccaata ataaccaata 60
ataaccaata ataa 74
<210> 30
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(52)
<223> 重复单元，重复次数40-60次
<400> 30
taggtttatt taggtttatt taggtttatt ttttcattta cattcattta cattcattta 60
ca 62
<210> 31
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(52)
<223> 重复单元，重复次数40-60次
<400> 31
atgatgatgt atgatgatgt atgatgatgt ttttttctac cattttctac cattttctac 60
ca 62
<210> 32
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(52)
<223> 重复单元，重复次数40-60次
<400> 32
gagagtattt gagagtattt gagagtattt tttcctttta tatcctttta tatcctttta 60
ta 62
<210> 33
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(52)
<223> 重复单元，重复次数40-60次
<400> 33
gttaagttgt gttaagttgt gttaagttgt ttccttctat taccttctat taccttctat 60
ta 62
<210> 34
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(62)
<223> 重复单元，重复次数40-60次
<400> 34
gtaaatgaat gtaaatgaat gtaaatgaat ttttattcac tattattcac tattattcac 60
tattattcac ta 72
<210> 35
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(62)
<223> 重复单元，重复次数40-60次
<400> 35
ttttgattgt ttttgattgt ttttgattgt tttcattact tatcattact tatcattact 60
tatcattact ta 72
<210> 36
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(62)
<223> 重复单元，重复次数40-60次
<400> 36
tattattggt tattattggt tattattggt ttttcttact cattcttact cattcttact 60
cattcttact ca 72
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> Fluorophore
<400> 37
tttaggttta tttaggttta tt 22
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> Fluorophore
<400> 38
ttatgatgat gtatgatgat gt 22
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> Fluorophore
<400> 39
ttgagagtat ttgagagtat tt 22
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> Fluorophore
<400> 40
ttgttaagtt gtgttaagtt gt 22
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> Fluorophore
<400> 41
ttgtaaatga atgtaaatga at 22
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> Fluorophore
<400> 42
ttttttgatt gtttttgatt gt 22
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> Fluorophore
<400> 43
tttattattg gttattattg gt 22
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> Fluorophore
<400> 44
ttgtaaatga atgtaaatga at 22
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> Fluorophore
<400> 45
ttggtagaaa atggtagaaa at 22
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> Fluorophore
<400> 46
ttataaaagg atataaaagg at 22
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> Fluorophore
<400> 47
ttaatgaaag ataatgaaag at 22
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> Fluorophore
<400> 48
ttagtgaata atagtgaata at 22
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> Fluorophore
<400> 49
ttaagtaatg ataagtaatg at 22
<210> 50
<211> 22
<212> DNA
<213> Fluorophore
<400> 50
ttgagtaaga atgagtaaga at 22
<210> 51
<211> 22
<212> RNA
<213> Fluorophore
<400> 51
uuguaaauga auguaaauga au 22

Claims (35)

1.一种利用多重信号放大系统进行免疫吸附双抗体夹心法检测抗原的方法，所述方法能够同时检测1种以上的抗原，其特征在于，包括下述步骤：
（1）固相基质上固定1种以上的包被抗体；
（2）加入待检测抗原；
（3）加入1种以上的抗体-DNA/RNA连接链，作用一定时间；
（4）加入1种以上的DNA/RNA放大链，作用一定时间；
（5）加入1种以上的DNA/RNA检测链，反应一定时间；
（6）进行洗涤，检测1种以上的DNA/RNA检测链上的信号强度；
（7）通过不同浓度抗原标准品的检测信号强度绘制的标准曲线，根据待检测抗原样品的检测信号强度和标准曲线计算抗原的浓度，
所述DNA/RNA放大链、DNA/RNA连接链、DNA/RNA检测链为第一组、第二组、第三组、第四组、第五组、第六组、第七组中的一组以上；或者所述DNA/RNA放大链、DNA/RNA连接链、DNA/RNA检测链为第八组、第九组、第十组、第十一组、第十二组、第十三组、第十四组中的一组以上；
第一组：
连接链：TATTTAGTGTTCGAATAGTT，对应放大链：CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A；对应检测链：待检测信号-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T；
第二组：
连接链：AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC； 对应放大链：GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A；对应检测链：待检测信号-TT-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T；
第三组：
连接链：GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG ；对应放大链： CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A；对应检测链：待检测信号-TT-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T；
第四组：
连接链：GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT； 对应放大链：ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：待检测信号-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T；
第五组：
连接链：CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC；对应放大链：GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A；对应检测链：待检测信号-TT-TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T；
第六组：
连接链：AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC；对应放大链：GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A；对应检测链：待检测信号-TT-TATTATTGG-T-TATTATTGG-T；
第七组：
RNA连接链：AAAUUCCUCUACCACCUACA，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应检测链：待检测信号-TT-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T；
第八组：
RNA连接链：AAAUUCCUCUACCACCUACA，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应二级放大链：TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A- (TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：待检测信号-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U；
第九组：
连接链：TATTTAGTGTTCGAATAGTT，对应一级放大链：CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A；对应二级放大链：ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A；对应检测链：待检测信号-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T；
第十组：
连接链：AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC；对应一级放大链：GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A；对应二级放大链：GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-TTT-TCCTTTTAT-A-(TCCTTTTAT-A)n-TCCTTTTAT-A；对应检测链：待检测信号-TT-ATAAAAGGA-T-ATAAAAGGA-T；
第十一组：
连接链：GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG ；对应一级放大链： CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A；对应二级放大链：GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-TTT-CCTTCTATT-A-(CCTTCTATT-A)n-CCTTCTATT-A；对应检测链：待检测信号-TT-AATGAAAGA-T-AATGAAAGA-T；
第十二组：
连接链：GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT； 对应一级放大链：ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应二级放大链：GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-TTT-TTATTCACT-A-TTATTCACT-A-(TTATTCACT-A)n-TTATTCACT-A；对应检测链：待检测信号-TT-AGTGAATAA-T-AGTGAATAA-T；
第十三组：
连接链：CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC；对应放大链：GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A；对应二级放大链：TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T-TTTTGATTGTTT-TCATTACTT-A-TCATTACTT-A-(TCATTACTT-A)n-TCATTACTT-A；对应检测链：待检测信号-TT-AAGTAATGA-T-AAGTAATGA-T；
第十四组：
连接链：AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC；对应一级放大链：GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A；对应二级放大链：TATTATTGG-T-TATTATTGG-T-TATTATTGG-TTT-TTCTTACTC-A-TTCTTACTC-A-(TTCTTACTC-A)n-TTCTTACTC-A；对应检测链：待检测信号-TT-GAGTAAGAA-T-GAGTAAGAA-T；
所述n的范围为40≤n≤60；
序列从左到右为序列的5’端到3’端。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，在固相基质上包被抗体后，加入封闭液进行封闭。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相基质选自多孔板、PVDF膜、醛基化的固相基质。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述待检测抗原来自人和/或小鼠的1种以上的抗原。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述抗体-DNA/RNA连接链中，每个抗体分子连接了一个或多个连接中间体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述抗体与连接中间体连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基的任一种或其组合。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述抗体-DNA/RNA连接链中，每个连接中间体连接1个或多个DNA/RNA连接链。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述连接中间体与DNA/RNA连接链连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或其组合。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述抗体通过连接中间体与DNA/RNA连接链连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基的任一种或其组合。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，用于连接抗体和DNA/RNA连接链的连接中间体中的两种官能团的比例为一比一或一比多。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述两种官能团不同时为相同的官能团。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，先连接一级DNA/RNA放大链，连接后再加入二级DNA/RNA放大链。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（6）中，先进行第一轮DNA/RNA检测链进行检测；然后进行解离，再加入第二轮DNA/RNA检测链进行检测；然后进行解离，再加入第三轮DNA/RNA检测链进行检测。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测过程中不低于1轮的检测；每轮检测中同时检测1种以上的抗原。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，检测2轮到6轮；每轮检测中同时检测1种以上的抗原。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测信号连接于DNA/RNA检测链的5’端、3’端、或者检测链中间的任何位置。
17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测信号包括荧光、磷光、化学发光、电磁信号、核磁信号、放射性信号中的任一种或其组合。
18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加入各步骤物质反应后，去除多余物质，然后进行洗涤操作。
19.一种利用多重信号放大系统进行免疫吸附法双抗原夹心法检测抗体的方法，所述方法能够同时检测1种以上的抗体，其特征在于，包括下述步骤：
（1）在固相基质上包被1种以上的抗原；
（2）加入待检测抗体；
（3）加入1种以上的抗原-DNA/RNA连接链，作用一定时间；
（4）加入1种以上的DNA/RNA放大链，作用一定时间；
（5）加入1种以上的DNA/RNA检测链，反应一定时间；
（6）进行洗涤，检测1种以上的DNA/RNA检测链上的信号强度；
（7）根据不同浓度抗体标准品的检测信号强度绘制标准曲线，并根据待检测抗体样品的检测信号强度和标准曲线计算抗原的浓度；
所述DNA/RNA放大链、DNA/RNA连接链、DNA/RNA检测链为第一组、第二组、第三组、第四组、第五组、第六组、第七组中的一组以上；或者所述DNA/RNA放大链、DNA/RNA连接链、DNA/RNA检测链为第八组、第九组、第十组、第十一组、第十二组、第十三组、第十四组中的一组以上；
第一组：
连接链：TATTTAGTGTTCGAATAGTT，对应放大链：CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A；对应检测链：待检测信号-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T；
第二组：
连接链：AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC； 对应放大链：GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A；对应检测链：待检测信号-TT-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T；
第三组：
连接链：GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG ；对应放大链： CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A；对应检测链：待检测信号-TT-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T；
第四组：
连接链：GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT； 对应放大链：ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：待检测信号-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T；
第五组：
连接链：CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC；对应放大链：GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A；对应检测链：待检测信号-TT-TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T；
第六组：
连接链：AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC；对应放大链：GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A；对应检测链：待检测信号-TT-TATTATTGG-T-TATTATTGG-T；
第七组：
RNA连接链：AAAUUCCUCUACCACCUACA，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应检测链：待检测信号-TT-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T；
第八组：
RNA连接链：AAAUUCCUCUACCACCUACA，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应二级放大链：TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A- (TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：待检测信号-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U；
第九组：
连接链：TATTTAGTGTTCGAATAGTT，对应一级放大链：CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A；对应二级放大链：ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A；对应检测链：待检测信号-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T；
第十组：
连接链：AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC；对应一级放大链：GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A；对应二级放大链：GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-TTT-TCCTTTTAT-A-(TCCTTTTAT-A)n-TCCTTTTAT-A；对应检测链：待检测信号-TT-ATAAAAGGA-T-ATAAAAGGA-T；
第十一组：
连接链：GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG ；对应一级放大链： CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A；对应二级放大链：GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-TTT-CCTTCTATT-A-(CCTTCTATT-A)n-CCTTCTATT-A；对应检测链：待检测信号-TT-AATGAAAGA-T-AATGAAAGA-T；
第十二组：
连接链：GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT； 对应一级放大链：ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应二级放大链：GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-TTT-TTATTCACT-A-TTATTCACT-A-(TTATTCACT-A)n-TTATTCACT-A；对应检测链：待检测信号-TT-AGTGAATAA-T-AGTGAATAA-T；
第十三组：
连接链：CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC；对应放大链：GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A；对应二级放大链：TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T-TTTTGATTGTTT-TCATTACTT-A-TCATTACTT-A-(TCATTACTT-A)n-TCATTACTT-A；对应检测链：待检测信号-TT-AAGTAATGA-T-AAGTAATGA-T；
第十四组：
连接链：AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC；对应一级放大链：GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A；对应二级放大链：TATTATTGG-T-TATTATTGG-T-TATTATTGG-TTT-TTCTTACTC-A-TTCTTACTC-A-(TTCTTACTC-A)n-TTCTTACTC-A；对应检测链：待检测信号-TT-GAGTAAGAA-T-GAGTAAGAA-T；
所述n的范围为40≤n≤60；
序列从左到右为序列的5’端到3’端。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，包被吸附抗原后，加入封闭液进行封闭。
21.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述所述固相基质选自多孔板、PVDF膜、醛基化的固相基质。
22.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述待检测抗体来自于人或小鼠的1种以上的抗体。
23.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述抗原-DNA/RNA连接链中，每个抗原分子连接一个或多个连接中间体。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，抗原与连接中间体连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基的任一种或其组合。
25.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述抗原-DNA/RNA连接链中，每个连接中间体上连接上一个或多个DNA/RNA连接链。
26.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述连接中间体与DNA/RNA连接链连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基的任一种或其组合。
27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，用于连接抗原和DNA/RNA连接链的连接中间体中的两种双官能团的比例为一比一或一比多。
28.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述两种官能团不同时为相同的官能团。
29.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，先连接一级DNA/RNA放大链，连接后再加入二级DNA/RNA放大链。
30.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，步骤（6）中，先进行第一轮DNA/RNA检测链检测；然后进行解离，再加入第二轮DNA/RNA检测链进行检测；然后进行解离，再加入第三轮DNA/RNA检测链进行检测。
31.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，检测过程中不低于1轮的检测；每轮检测中同时检测1种以上的抗体。
32.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，检测过程为2轮到7轮。
33.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述检测信号连接于DNA/RNA检测链的5’端、3’端、或者检测链中间的任何位置。
34.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述检测信号包括荧光、磷光、化学发光、电磁信号、核磁信号、放射性信号中的任一种或其组合。
35.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，加入各步骤物质反应后，去除多余物质，然后进行洗涤操作。
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