CN116515961A - 一种基于化学发光免疫分析的rpa核酸检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法，涉及核酸检测技术领域。本发明的核酸检测方法如下：根据待检测核酸设计正向引物和反向引物，正向引物采用生物素进行修饰，反向引物采用FITC进行修饰；或者正向引物采用FITC进行修饰，反向引物采用生物素进行修饰；以待检测核酸为模板，利用正向引物和反向引物进行RPA扩增，得到扩增产物；将扩增产物和化学发光标记物修饰的FITC抗体加入至链霉亲和素修饰的固相中，孵育，清洗后加入化学发光底物，孵育后检测化学发光信号。本发明基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法，具有灵敏度高的优点，并且检测方法简单，容易实现自动化，解决了现有核酸检测方法灵敏度低和检测方法复杂的问题。

Description

一种基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，尤其涉及一种基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法。
背景技术
核酸检测是体外诊断技术中最为重要的检测手段之一，核酸检测可用于检测病原菌、病毒等微生物在体内的存在，如HPV、结核病等；在基因检测方面，核酸检测可用于检测特定的基因或基因突变，从而判断个体的易感性或携带者状态，为个体化医疗提供基础数据。当前进行核酸检测主要采用的方法是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），它可以从样品中复制目标DNA段，并通过荧光指示剂来检测是否存在目标DNA序列。虽然直至今日PCR一直是很多DNA检测领域的主要工具，但是它仍然存在需要专业设备、精准的温度控制以及试剂成本高昂等缺点有待改进。
相比于PCR技术，重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）作为一种新型的体外DNA扩增技术，可以弥补PCR存在的众多不足之处。RPA反应使用重组酶（Recombinase）、单链结合蛋白(Single-strand binding protein, SSB)和DNA聚合酶，其相对于PCR而言步骤更为简便，它利用重组酶催化两条单链DNA分子在同源区域结合，之后通过SSB保护单链DNA以维持其异质性，最后引发DNA聚合酶进行扩增反应。RPA技术结合了重组酶和聚合酶反应的优势，与PCR技术相比无需高温退火、庞大的PCR设备和复杂的实验室条件，只需简单的步骤即可快速获取核酸扩增结果，具有检测速度快、操作简单、成本低廉等优点。
使用RPA对核酸进行扩增后，可通过多种检测方法来判断目的基因的存在。Cordray等人将RPA与侧流向层析试纸条联用对疟原虫双链DNA进行检测，检出限可达到5拷贝/μL。Lau等人RPA与逆转录结合并使用荧光染料和侧流向层析试纸条检测扩增结果，实现了新冠病毒RNA的检测，检出限可达到7.659拷贝/μL。然而，侧流向层析试纸条、荧光等检测方法虽然可以简单快速的实现扩增产物检测，但是还是存在灵敏度低的缺点，难以满足实际检测种多种靶标的灵敏度需求。
化学发光作为一种灵敏度极高的信号检测方法，也有人把其应用于核酸检测。Kunze等人使用生物素标记引物进行RPA扩增，扩增产物与微阵列平表面的核酸探针杂交后，加入链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶和底物进行化学发光检测，但是该方法直接在固相上进行RPA扩增，效率低导致灵敏度仍然不够高，也难以用于全自动化学发光免疫分析仪实现自动化。Hu等人将RPA与CRISPR/Cas12a级联对HPV16的DNA靶标进行扩增和放大并通过化学发光法检测信号，可实现单拷贝级别的检测灵敏度，但是该体系会增加系统的复杂性并增加检测成本，同样也难以实现自动化。除此之外，上述基于化学发光的RPA技术需要把RPA引物先偶联到固相上，导致该固相无法通用，增加了研发成本和试剂成本。
发明内容
针对背景技术提出的问题，本发明的目的在于提出一种基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法，具有灵敏度高的优点，可实现单拷贝级别的检测灵敏度，并且检测方法简单，容易实现自动化，解决了现有核酸检测方法灵敏度低和检测方法复杂的问题。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法，包括以下步骤：
（1）根据待检测核酸设计正向引物和反向引物，正向引物采用生物素进行修饰，反向引物采用FITC（异硫氰酸荧光素）进行修饰；或者正向引物采用FITC进行修饰，反向引物采用生物素进行修饰；以待检测核酸为模板，利用正向引物和反向引物进行RPA扩增，得到扩增产物；
（2）将扩增产物和化学发光标记物修饰的FITC抗体加入至链霉亲和素修饰的固相中，孵育10~30 min，清洗后加入化学发光底物，孵育5~30 min后检测化学发光信号。
优选地，在所述步骤（1）中，当待检测核酸为DNA时，根据目标DNA设计正向引物和反向引物，在进行RPA扩增时，以目标DNA为模板进行RPA扩增；当待检测核酸为RNA时，根据目标RNA逆转录产生的cDNA设计正向引物和反向引物，在进行RPA扩增时，以目标RNA逆转录产生的cDNA为模板，进行RPA扩增。
优选地，在所述步骤（2）中，链霉亲和素修饰的固相的制备方法如下：将链霉亲和素溶于柠檬酸盐缓冲液中，配制成浓度为520 μg/mL的链霉亲和素溶液，在固相使用链霉亲和素溶液于4~ 37℃下包被反应12~24小时，用封闭液于37℃下封闭0.5~2h，得到链霉亲和素包被固相。
优选地，所述步骤（1）的操作方法如下：将T4 UvsX 蛋白、T4 UvsY蛋白、T4 gp32、聚合酶、脱氧核苷酸三磷酸 、正向引物、反向引物、聚乙二醇-35K、二硫苏糖醇、磷酸肌酸、肌酸激酶、三磷酸腺苷 、三（羟甲基）氨基甲烷、醋酸钾和醋酸镁混合制成溶液，加入待检测核酸，RPA扩增反应10~30min，获得扩增产物。
优选地，所述步骤（2）的操作方法如下：使用Tris缓冲液将化学发光标记物修饰的FITC抗体母液稀释成0.5~2 μg/mL浓度的抗体工作液，取50μL稀释100~500倍的扩增产物和50 μL化学发光标记物修饰的FITC抗体加入至链霉亲和素包被固相中，于37℃下孵育10~30min后，检测化学发光信号。
优选地，在所述步骤（2）中，所述化学发光标记物修饰的FITC抗体为采用发光剂或酶进行修饰的FITC抗体。
优选地，所述化学发光标记物修饰的FITC抗体为吖啶脂标记抗FITC抗体、碱性磷酸酶标记抗FITC抗体和辣根过氧化物酶标记抗FITC抗体中的任意一种。
优选地，所述吖啶脂标记抗FITC抗体的制备方法如下：取0.1~0.5 mg FITC抗体加入100 μL PBS缓冲液中，再加入20μL吖啶酯溶液混合均匀，在37℃环境进反应，对反应后的混合物使用凝胶柱进行纯化；向纯化后的溶液中加入10%BSA，直至纯化后的溶液中牛血清白蛋白的终浓度为0.5%~2%，得到吖啶脂标记抗FITC抗体。
优选地，所述碱性磷酸酶标记抗FITC抗体的制备方法如下：取0.1 ~0.5 mg FITC抗体与0.1~ 0.5 mg碱性磷酸酶混匀后，加入0.125 mL浓度为0.01% ~2%的戊二醛溶液，室温避光反应2~6小时；再加入20μL浓度为0.5 ~2 mol/L的单乙醇胺溶液，室温避光封闭反应1~3小时；将反应后的混合物在4℃环境下使用PBS缓冲液搅拌透析过夜；向透析后的溶液中加入10%BSA，调节BSA终浓度至0.5% ~ 2%，再加入等体积甘油混匀后，得到碱性磷酸酶标记抗FITC抗体。
上述技术方案具有以下有益效果：
1、本技术方案的核酸检测方法中，RPA提供了第一级的信号放大；一个链霉亲和素可以结合四个包含生物素修饰端的核酸扩增产物，提供了第二级的信号放大；化学发光标记物修饰的FITC抗体与核酸扩增产物的FITC修饰端可以发生高效的免疫结合反应，由于抗原-抗体之间强大的亲和力提供第三级的信号放大作用；最后，加入的化学发光底物受到化学发光标记物修饰的FITC抗体催化产生强烈的化学发光信号，由于化学发光反应的低背景和高信噪比提供第四级的信号放大作用，本技术方案基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法通过该多级信号放大作用，结合RPA的高灵敏度、高选择性扩增，可以实现目标核酸（DNA或RNA）的超灵敏检测。
2、本技术方案基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法采用先RPA扩增，再通过CLIA进行扩增产物的检测，这样就无需在固相上偶联引物，而是偶联链霉亲和素，固相可以对不同项目都通用，此外，化学发光标记物标记抗FITC抗体也通用，使本技术方案的核酸检测方法操作简单且成本更低，更容易实现自动化检测。并且，RPA-CLIA提供了多级信号放大，检测灵敏度更高，无需引入其他酶系，检测时间更短。
附图说明
图1是本发明的一个实施例检测DNA的技术原理图；
图2是本发明另一个实施例检测RNA的技术原理图；
图3是本发明实施例1甲型流感核酸质粒的检测荧光信号图；
图4为实施例2中SARS-CoV-2病毒核酸质粒的检测荧光信号图；
图5为实施例3中HPV-16病毒DNA质粒的检测荧光信号图；
图6为实施例4中HPV-18病毒核酸质粒的检测荧光信号图。
具体实施方式
下面结合附图1-6及具体实施方式进一步说明本发明的技术方案。
一种基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法，包括以下步骤：
（1）根据待检测核酸设计正向引物和反向引物，正向引物采用生物素进行修饰，反向引物采用FITC进行修饰；或者正向引物采用FITC进行修饰，反向引物采用生物素进行修饰；以待检测核酸为模板，利用正向引物和反向引物进行RPA扩增，得到扩增产物；
（2）将扩增产物和化学发光标记物修饰的FITC抗体加入至链霉亲和素修饰的固相中，孵育10~30 min，清洗后加入化学发光底物，孵育5~30 min后检测化学发光信号。
化学发光作为一种灵敏度极高的信号检测方法，当前已被广泛应用于免疫检测中，称为化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay, CLIA），除了灵敏度高外，CLIA具有特异性强、试剂价格低廉、试剂稳定、方法稳定快速、检测范围宽、操作简单、自动化程度高等优点。针对当前RPA技术存在的问题，本发明创造性地提出了基于CLIA的RPA技术（RPA-CLIA），并将其用于核酸的超敏检测。如附图1和附图2所示，为本技术方案检测核酸的技术原理图，本技术方案针对待检测核酸目设计了5’-生物素修饰的正向引物和5’-FITC修饰的反向引物，或者是5’-FITC修饰的正向引物和5’-生物素修饰的反向引物，基于这一对特殊设计的引物进行RPA等温扩增后，得到两端分别带有生物素标记和FITC标记的扩增产物。在步骤（2）中将该扩增产物作为样本进行化学发光免疫检测，先通过链霉亲和素修饰的固相，利用生物素与链霉亲和素之间超强的亲和力将RPA扩增产物捕获，同时加入的化学发光标记物（发光剂或酶）修饰的FITC抗体与RPA扩增产物另一端的FITC发生免疫结合反应，经过37℃孵育并多次清洗后，最终加入化学发光底物产生强烈的化学发光信号。本技术方案的核酸检测方法中，RPA提供了第一级的信号放大；一个链霉亲和素可以结合四个包含生物素修饰端的核酸扩增产物，提供了第二级的信号放大；而化学发光标记物修饰的FITC抗体与核酸扩增产物的FITC修饰端可以发生高效的免疫结合反应，由于抗原-抗体之间强大的亲和力提供第三级的信号放大作用；最后，加入的化学发光底物受到化学发光标记物修饰的FITC抗体催化产生强烈的化学发光信号，由于化学发光反应的低背景和高信噪比提供第四级的信号放大作用。本技术方案基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法的多级信号放大作用结合RPA的高灵敏度、高选择性扩增可以实现目标核酸（DNA或RNA）的超灵敏检测。
与现有基于化学发光的RPA技术相比，本技术方案RPA-CLIA采用先RPA扩增，再通过化学发光免疫分析（CLIA）进行扩增产物的检测，这样就无需在固相上偶联引物，而是在固相偶联链霉亲和素，使得固相可以对不同项目都通用，同时，本技术方案的化学发光标记物修饰的FITC抗体也能通用，使得本技术方案的核酸检测方法简单且成本更低，更容易实现自动化检测。并且，基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法提供了多级信号放大，检测灵敏度更高，无需引入其他酶系，检测时间更短，因此，本技术方案基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法经过在不同案例中的验证被证明具有很好的可拓展性，可用于各种核酸的超敏检测。
进一步的说明，在所述步骤（1）中，当待检测核酸为DNA时，根据目标DNA设计正向引物和反向引物，在进行RPA扩增时，以目标DNA为模板进行RPA扩增；当待检测核酸为RNA时，根据目标RNA逆转录产生的cDNA设计正向引物和反向引物，在进行RPA扩增时，以目标RNA逆转录产生的cDNA为模板，进行RPA扩增。
采用本技术方案基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法在进行RPA扩增时，对于目标DNA可以直接进行RPA扩增（图1），对于目标RNA可以进行逆转录后再进行RPA扩增（图2），同时本技术方案针对目标DNA或目标RNA反转录产生的cDNA设计了5’-生物素修饰的正向引物和5’-FITC修饰的反向引物，或者是5’-FITC修饰的正向引物和5’-生物素修饰的反向引物，基于这一对特殊设计的引物进行RPA等温扩增后，能够得到两端分别带有生物素标记和FITC标记的扩增产物，使得在步骤（2）进行化学发光免疫检测时能提供多级信号放大，从而有效提高核酸检测的灵敏度，可实现单拷贝级别的检测灵敏度。
值得说明的是，本技术方案中的正向引物和反向引物是通过外部的基因合成公司合成的，只需要提供目标核酸，以及提出采用生物素修饰或者FITC修饰，即可获得修饰过的正向引物和反向引物。
进一步的说明，在所述步骤（2）中，链霉亲和素修饰的固相的制备方法如下：将链霉亲和素溶于柠檬酸盐缓冲液中，配制成浓度为520 μg/mL的链霉亲和素溶液，在固相使用链霉亲和素溶液于4~ 37℃下包被反应12~24小时，用封闭液于37℃下封闭0.5~2h，得到链霉亲和素包被固相。
具体来说，本技术方案能够制备得到链霉亲和素修饰的固相，在步骤（2）将扩增产物作为样本进行化学发光免疫检测时，利用生物素与链霉亲和素之间超强的亲和力，通过链霉亲和素修饰的固相将RPA扩增产物捕获。
固相能够起到固定捕获抗体或抗原的作用，本技术方案中所使用的固相为酶标板或者磁珠，由于现在化学发光免疫分析主要有两种形式，一种是板式的，一种是基于磁珠的管式的，本技术方案的核酸检测方法可以使用这两种形式的化学发光免疫分析。
进一步的说明，所述步骤（1）的操作方法如下：将T4 UvsX 蛋白、T4 UvsY蛋白、T4gp32、聚合酶、脱氧核苷酸三磷酸 、正向引物、反向引物、聚乙二醇-35K、二硫苏糖醇、磷酸肌酸、肌酸激酶、三磷酸腺苷 、三（羟甲基）氨基甲烷、醋酸钾和醋酸镁混合制成溶液，加入待检测核酸，RPA扩增反应10~30min，获得扩增产物。
具体来说，当待检测核酸为DNA时，步骤（1）的操作方法如下：将120 ng/μL 的T4UvsX 蛋白、60 ng/μL的T4 UvsY蛋白、600 ng/μL 的T4 gp32、30 ng/μL的枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I（Bsu）或8.6 or 12.8 μg的金黄色葡萄球菌聚合酶（Sau)、200 μM脱氧核苷酸三磷酸 （dNTP， N = A，T，C，G）、150 nM~600 nM正向引物、150 nM~600 nM反向引物、5%聚乙二醇-35K、2mM二硫苏糖醇、50mM磷酸肌酸、100 ng/μL的肌酸激酶、3 mM三磷酸腺苷（ATP）、50mM三（羟甲基）氨基甲烷（pH 7.9）、100 mM醋酸钾、14 mM醋酸镁混合制成溶液，加入待检测核酸，RPA扩增反应10~30min，获得扩增产物。
当待检测核酸为RNA时，步骤（1）的操作方法如下： 将100mmol/L Tris-HCl（pH8.4）、50mmol/L KCl、2.5mmol/L MgCl2、100mg/mL BSA、100pmol 随机六聚寡核苷酸或oligo dT引物、80～200U 逆转录酶（M-MLV或AMV）、120 ng/ μL 的T4 UvsX蛋白、60 ng/ μL的T4 UvsY蛋白、600 ng/ μL的T4 gp32、30 ng/ μL 的枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I（Bsu）或8.6 or 12.8 μg金黄色葡萄球菌聚合酶（Sau)、200 μM脱氧核苷酸三磷酸 （dNTP， N = A，T，C，G）、150 nM~600 nM正向引物、150 nM~600 nM反向引物、5% 聚乙二醇-35K、2 mM二硫苏糖醇、50 mM 磷酸肌酸、100 ng / μL肌酸激酶、3 mM三磷酸腺苷 （ATP）、50 mM 三（羟甲基）氨基甲烷(pH 7.9) 、100 mM醋酸钾、14 mM醋酸镁混合制成溶液，加入待检测核酸，反应10~30min，获得RPA扩增产物。
具体来说，T4 UvsX蛋白也叫T4 UvsX重组酶，英文名称为T4 UvsX Recombinase，T4 UvsX蛋白来源于T4噬菌体，是RecA/Rad51家族的同源体，在双链DNA断裂的修复和复制叉重新启动的过程中起到重要作用，T4 UvsX蛋白可与其他 DNA 结合蛋白或辅助因子一起与单链 DNA 形成核酸蛋白复合物，该复合物通过寻找与靶标 DNA 的互补区域进行杂交，以进一步完成链置换反应。
T4 UvsY蛋白是一种来源于噬菌体T4的重组调节蛋白。T4 gp32也称之为T4噬菌体基因32编码蛋白（T4 gene 32 protein），是一种单链DNA（ssDNA）结合蛋白。
进一步的说明，所述步骤（2）的操作方法如下：使用Tris缓冲液将化学发光标记物修饰的FITC抗体母液稀释成0.5~2 μg/mL浓度的抗体工作液，取50μL稀释100~500倍的扩增产物和50 μL化学发光标记物修饰的FITC抗体加入至链霉亲和素包被固相中，于37℃下孵育10~30 min后，检测化学发光信号。
具体来说，步骤（2）的操作方法如下：使用Tris缓冲液（0.05M，pH 7.0 ~ 7.5）将化学发光标记物修饰的FITC抗体母液稀释成0.5 ~2μg/mL浓度的抗体工作液，取50μL稀释100~500倍的核酸扩增产物和50μL化学发光标记物标记抗FITC抗体加入至链霉亲和素包被的固相中，混合后于37℃孵育10 ~ 30 min。用0.05M，pH7.5 的TBST洗涤5次后加入100 μL的化学发光底物，37℃孵育5 ~ 30 min后检测化学发光信号。
值得说明的是，在步骤（2）中，化学发光标记物修饰的FITC抗体稀释后的浓度对化学发光信号值和信噪比会产生影响。核酸扩增产物稀释倍数会对背景信号值有影响，调整核酸扩增产物稀释倍数可以降低背景信号值。孵育时间会对免疫反应有影响，从而影响化学发光免疫检测最终的信号值，本技术方案中，孵育时间10 ~ 30 min，此时检测得到的发光信号较强。
进一步的说明，在所述步骤（2）中，所述化学发光标记物修饰的FITC抗体为采用发光剂或酶进行修饰的FITC抗体。
化学发光免疫分析可以分为直接化学发光免疫分析和间接化学发光免疫分析，直接化学发光免疫分析是使用发光剂标记抗FITC抗体，如吖啶脂标记抗FITC抗体作为检测抗体；间接化学发光免疫分析也叫酶促化学发光免疫分析，是使用酶标记抗FITC抗体，如碱性磷酸酶标记抗FITC抗体、辣根过氧化物酶标记抗FITC抗体等作为检测抗体，本发明在进行化学发光免疫检测时，可以使用直接化学发光免疫分析或间接化学发光免疫分析。
进一步的说明，所述化学发光标记物修饰的FITC抗体为吖啶脂标记抗FITC抗体、碱性磷酸酶标记抗FITC抗体和辣根过氧化物酶标记抗FITC抗体中的任意一种。
具体来说，当在本技术方案中，当化学发光标记物修饰的FITC抗体为吖啶脂标记抗FITC抗体时，配合使用的化学发光底物为过氧化氢和氢氧化钠的混合物（0.05% H2O2+（0.01~0.1M）NaOH）；当化学发光标记物修饰的FITC抗体为碱性磷酸酶标记抗FITC抗体时，配合使用的化学发光底物为1，2-二氧环乙烷衍生物（AMPPD）；当化学发光标记物修饰的FITC抗体为辣根过氧化物酶标记抗FITC抗体时，配合使用的化学发光底物为鲁米诺。
优选地，本技术方案中化学发光标记物修饰的FITC抗体为碱性磷酸酶标记抗FITC抗体（也称之为碱性磷酸酶修饰的FITC抗体），此时配合使用的化学发光底物为1，2-二氧环乙烷衍生物（AMPPD）。碱性磷酸酶标记抗FITC抗体能够与扩增产物的FITC修饰端发生免疫结合反应，经过37℃孵育并多次清洗后，加入1，2-二氧环乙烷衍生物，1，2-二氧环乙烷衍生物受到碱性磷酸酶催化能够产生强烈的化学发光信号，由于酶促反应的高效性提供进一步的信号放大作用，从而能够提高灵敏度。
进一步的说明，所述吖啶脂标记抗FITC抗体的制备方法如下：取0.1~0.5 mg FITC抗体加入100 μL PBS缓冲液中，再加入20μL吖啶酯溶液混合均匀，在37℃环境进反应，对反应后的混合物使用凝胶柱进行纯化；向纯化后的溶液中加入10%BSA，直至纯化后的溶液中牛血清白蛋白的终浓度为0.5%~2%，得到吖啶脂标记抗FITC抗体。
具体来说，所述吖啶脂标记抗FITC抗体的制备方法如下：取0.1~0.5 mg FITC抗体加入100 μL PBS缓冲液（0.1M，pH 7.0 ~ 7.5）中，再加入20 μL浓度为0.5 ~ 2 mg/mL的吖啶酯溶液混合均匀，在37℃环境下反应震荡孵育3小时，对反应后的混合物使用SephadexG50凝胶柱进行纯化，凝胶柱的流动相为PBS缓冲液（0.01M，pH 7.0~7.5）；最后向纯化后的溶液中加入PBS缓冲液（0.01M，pH 7.0~7.5，含0.5% PC300）配制的10%BSA调节BSA终浓度至为0.5%~2%，得到吖啶脂标记抗FITC抗体，置于4℃避光保存。
进一步的说明，所述碱性磷酸酶标记抗FITC抗体的制备方法如下：取0.1 ~0.5 mgFITC抗体与0.1~ 0.5 mg碱性磷酸酶混匀后，加入0.125 mL浓度为0.01% ~2%的戊二醛溶液，室温避光反应2~6小时；再加入20μL浓度为0.5 ~2 mol/L的单乙醇胺溶液，室温避光封闭反应1~3小时；将反应后的混合物在4℃环境下使用PBS缓冲液搅拌透析过夜；向透析后的溶液中加入10%BSA，调节BSA终浓度至0.5% ~ 2%，再加入等体积甘油混匀后，得到碱性磷酸酶标记抗FITC抗体。
本技术方案使用戊二醛一步交联法对FITC抗体进行碱性磷酸酶标记。具体操作方法如下：取0.1 ~ 0.5 mg FITC抗体与0.1 ~ 0.5 mg碱性磷酸酶混匀后，加入0.125 mL 浓度为0.01% ~2%的戊二醛溶液，室温避光反应2 ~ 6小时。再加入20μL浓度为0.5~ 2 mol/L的单乙醇胺溶液，继续于旋转培养器上室温避光封闭1 ~ 3小时。将反应后的混合物在4℃环境下使用PBS缓冲液（0.01M，pH 7.0 ~ 7.5）搅拌透析过夜。最终向透析后的溶液中加入PBS缓冲液（0.01M，pH 7.0 ~ 7.5）配制的10%BSA，调节BSA终浓度至为0.5% ~ 2%，再加入等体积甘油混匀后，制得碱性磷酸酶标记抗FITC抗体，置于-20℃保存。
具体来说，辣根过氧化物酶标记抗FITC抗体的制备方法如下：取0.1 ~ 0.5 mg辣根过氧化物酶（HRP）加入20 μL体积0.01 M~0.2 M高碘酸钠溶液中，室温避光反应10~30分钟后加入1~10μL乙二醇，继续反应10~30分钟。再加入0.1~0.5 mg FITC抗体，室温避光反应2小时。使用50 KD超滤管对反应后的溶液纯化2~3遍后回收反应液。向反应液中加入1~10 μL体积4 mg/mL硼氢化钠混匀后，4℃避光反应2小时，再次经过50 KD超滤管纯化2~3遍。向超滤后的溶液中加入PBS缓冲液（0.01M，pH 7.0 ~ 7.5）配制的10%BSA调节BSA终浓度至为0.5% ~ 2%，再加入等体积甘油混匀后，即得辣根过氧化物酶标记抗FITC抗体，置于-20℃保存。
下面结合实施例进一步阐述本技术方案。
实施例1
本实施例基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法以甲型流感（influenza A）RNA作为待检测核酸，对其进行定性检测，包括以下步骤：
（1）将100mmol/L Tris-HCl（pH 8.4）、50mmol/L KCl、2.5mmol/L MgCl2、100mg/mLBSA、100pmol随机六聚寡核苷酸引物、100U逆转录酶(AMV)、120 ng/μL的T4 UvsX 蛋白、60ng/μL的T4 UvsY蛋白、600 ng/μL 的T4 gp32、30 ng/μL枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I（Bsu）、200 μM脱氧核苷酸三磷酸（dNTP， N = A，T，C，G）、200nM正向引物、200nM反向引物、5%聚乙二醇-35K、2mM二硫苏糖醇、50mM磷酸肌酸、100 ng/μL的肌酸激酶、3 mM三磷酸腺苷（ATP）、50 mM三（羟甲基）氨基甲烷（pH 7.9）、100 mM醋酸钾、14 mM醋酸镁混合制成溶液，分别加入0、1、10、100、1000copies的甲型流感RNA样品，RPA扩增反应30min，获得扩增产物；
（2）使用Tris缓冲液（0.05M，pH 7.0~ 7.5）将碱性磷酸酶标记抗FITC抗体母液稀释成1μg/mL浓度的抗体工作液，取50μL稀释200倍的核酸扩增产物和50μL碱性磷酸酶标记抗FITC抗体抗体工作液，加入至链霉亲和素包被的固相中，混合后于37℃孵育10min。用0.05M，pH7.5 的TBST洗涤5次后加入100 μL的化学发光底物（1，2-二氧环乙烷衍生物），37℃孵育5min后检测化学发光信号。
其中，在步骤（2）中链霉亲和素包被的固相的制备方法如下：将链霉亲和素溶于柠檬酸盐缓冲液（0.05 M，pH 4.0）中，配制成浓度为5 μg/mL的链霉亲和素溶液，在固相使用链霉亲和素溶液于37℃下包被反应12小时，随后用封闭液（含1% BSA和1 %蔗糖），37℃封闭反应0.5h得到链霉亲和素包被的固相；
步骤（2）中碱性磷酸酶标记抗FITC抗体的制备方法如下：取0.1mg FITC抗体与0.1mg碱性磷酸酶混匀后，加入0.125 mL 浓度为0.01%的戊二醛溶液，室温避光反应6小时；再加入20μL浓度为0.5 mol/L的单乙醇胺溶液，继续于旋转培养器上室温避光封闭1小时。将反应后的混合物在4℃环境下使用PBS缓冲液（0.01M，pH 7.0）搅拌透析过夜；最终向透析后的溶液中加入PBS缓冲液（0.01M，pH7.0）配制的10%BSA，调节BSA终浓度至为0.5%，再加入等体积甘油混匀后，制得碱性磷酸酶标记抗FITC抗体。
实验结果：图3为本实施例中甲型流感核酸质粒的检测荧光信号图，由图3可知，检测体系的信号随着甲型流感RNA分析物的增加而增强，最低检出限为1 copies/μL，由此可见，采用本实施例的核酸检测方法可以实现目标核酸的超灵敏检测。
实施例2
本实施例基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法以SARS-CoV-2 RNA作为待测物，对其进行定性检测，包括以下步骤：
（1）将100mmol/L Tris-HCl（pH 8.4）、50mmol/L KCl、2.5mmol/L MgCl2、100mg/mLBSA、100pmol的oligo dT引物、100U逆转录酶（AMV）、120 ng/μL 的T4 UvsX 蛋白、60 ng/μL的T4 UvsY蛋白、600 ng/μL 的T4 gp32、30 ng/μL枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I（Bsu）、200 μM脱氧核苷酸三磷酸（dNTP， N = A，T，C，G）、200nM正向引物、200nM反向引物、5%聚乙二醇-35K、2mM二硫苏糖醇、50mM磷酸肌酸、100 ng/μL的肌酸激酶、3 mM三磷酸腺苷（ATP）、50 mM三（羟甲基）氨基甲烷（pH 7.9）、100 mM醋酸钾、14 mM醋酸镁混合制成溶液，分别加入0、1、10、100、1000copies的SARS-CoV-2病毒RNA样品，进行RPA扩增反应30min，获得扩增产物；
（2）使用Tris缓冲液（0.05M，pH 7.0~ 7.5）将碱性磷酸酶标记抗FITC抗体母液稀释成1μg/mL浓度的抗体工作液，取50μL稀释200倍的核酸扩增产物和50μL碱性磷酸酶标记抗FITC抗体抗体工作液，加入至链霉亲和素包被的固相中，混合后于37℃孵育10min。用0.05M，pH7.5 的TBST洗涤5次后加入100 μL的化学发光底物（1，2-二氧环乙烷衍生物），37℃孵育5min后检测化学发光信号。
其中，在步骤（2）中链霉亲和素包被的固相的制备方法如下：将链霉亲和素溶于柠檬酸盐缓冲液（0.05 M，pH 4.0）中，配制成浓度为5 μg/mL的链霉亲和素溶液，在固相使用链霉亲和素溶液于37℃下包被反应12小时，随后用封闭液（含1% BSA和1 %蔗糖），37℃封闭反应0.5h得到链霉亲和素包被的固相；
步骤（2）中碱性磷酸酶标记抗FITC抗体的制备方法如下：取0.1mg FITC抗体与0.1mg碱性磷酸酶混匀后，加入0.125 mL 浓度为0.01%的戊二醛溶液，室温避光反应6小时；再加入20μL浓度为0.5 mol/L的单乙醇胺溶液，继续于旋转培养器上室温避光封闭1小时。将反应后的混合物在4℃环境下使用PBS缓冲液（0.01M，pH 7.0）搅拌透析过夜；最终向透析后的溶液中加入PBS缓冲液（0.01M，pH7.0）配制的10%BSA，调节BSA终浓度至为0.5%，再加入等体积甘油混匀后，制得碱性磷酸酶标记抗FITC抗体。
实验结果：图4为本实施例中SARS-CoV-2病毒核酸质粒的检测荧光信号图，由图4可知，检测体系的信号随着SARS-CoV-2病毒的RNA分析物的增加而增强，最低检出限为1copies/μL，由此可见，采用本实施例的核酸检测方法可以实现目标核酸的超灵敏检测。
实施例3
本实施例基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法以HPV-16病毒DNA质粒作为待测物，对其进行定性检测，包括以下步骤：
（1）将120 ng/μL 的T4 UvsX 蛋白、60 ng/μL的T4 UvsY蛋白、600 ng/μL的T4gp32、30 ng/μL枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I（Bsu）、200 μM脱氧核苷酸三磷酸（dNTP， N = A，T，C，G）、200nM正向引物、200nM反向引物、5%聚乙二醇-35K、2mM二硫苏糖醇、50mM磷酸肌酸、100 ng/μL的肌酸激酶、3 mM三磷酸腺苷（ATP）、50 mM三（羟甲基）氨基甲烷（pH 7.9）、100mM醋酸钾、14 mM醋酸镁混合制成溶液，分别加入0、1、10、100、1000copies的HPV-16病毒核酸质粒样品，进行RPA扩增反应30min，获得扩增产物；
（2）使用Tris缓冲液（0.05M，pH 7.5）将碱性磷酸酶标记抗FITC抗体母液稀释成1μg/mL浓度的抗体工作液，取50μL稀释200倍的核酸扩增产物和50μL碱性磷酸酶标记抗FITC抗体抗体工作液，加入至链霉亲和素包被的固相中，混合后于37℃孵育10min。用0.05M，pH7.5 的TBST洗涤5次后加入100 μL的化学发光底物（1，2-二氧环乙烷衍生物），37℃孵育5min后检测化学发光信号。
其中，在步骤（2）中链霉亲和素包被的固相的制备方法如下：将链霉亲和素溶于柠檬酸盐缓冲液（0.05 M，pH 4.0）中，配制成浓度为5 μg/mL的链霉亲和素溶液，在固相使用链霉亲和素溶液于37℃下包被反应12小时，随后用封闭液（含1% BSA和1 %蔗糖），37℃封闭反应0.5h得到链霉亲和素包被的固相；
步骤（2）中碱性磷酸酶标记抗FITC抗体的制备方法如下：取0.1mg FITC抗体与0.1mg碱性磷酸酶混匀后，加入0.125 mL 浓度为0.01%的戊二醛溶液，室温避光反应6小时；再加入20μL浓度为0.5 mol/L的单乙醇胺溶液，继续于旋转培养器上室温避光封闭1小时。将反应后的混合物在4℃环境下使用PBS缓冲液（0.01M，pH 7.0）搅拌透析过夜；最终向透析后的溶液中加入PBS缓冲液（0.01M，pH7.0）配制的10%BSA，调节BSA终浓度至为0.5%，再加入等体积甘油混匀后，制得碱性磷酸酶标记抗FITC抗体。
实验结果：图5为本实施例中HPV-16病毒DNA质粒的检测荧光信号图，由5可知，检测体系的信号随着HPV-16病毒DNA质粒分析物的增加而增强，最低检出限为1 copies/μL。
实施例4
本实施例基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法以HPV-18病毒DNA质粒为待测物，对其进行定性检测，包括以下步骤：
（1）将120 ng/μL 的T4 UvsX 蛋白、60 ng/μL的T4 UvsY蛋白、600 ng/μL 的T4gp32、30 ng/μL枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I（Bsu）、200 μM脱氧核苷酸三磷酸（dNTP， N = A，T，C，G）、200nM正向引物、200nM反向引物、5%聚乙二醇-35K、2mM二硫苏糖醇、50mM磷酸肌酸、100 ng/μL的肌酸激酶、3 mM三磷酸腺苷（ATP）、50 mM三（羟甲基）氨基甲烷（pH 7.9）、100mM醋酸钾、14 mM醋酸镁混合制成溶液，分别加入0、1、10、100、1000copies的HPV-18病毒DNA质粒样品，RPA扩增反应30min，获得扩增产物；
（2）使用Tris缓冲液（0.05M，pH 7.0~ 7.5）将碱性磷酸酶标记抗FITC抗体母液稀释成1μg/mL浓度的抗体工作液，取50μL稀释200倍的核酸扩增产物和50μL碱性磷酸酶标记抗FITC抗体抗体工作液，加入至链霉亲和素包被的固相中，混合后于37℃孵育10min。用0.05M，pH7.5 的TBST洗涤5次后加入100 μL的化学发光底物（1，2-二氧环乙烷衍生物），37℃孵育5min后检测化学发光信号。
其中，在步骤（2）中链霉亲和素包被的固相的制备方法如下：将链霉亲和素溶于柠檬酸盐缓冲液（0.05 M，pH 4.0）中，配制成浓度为5 μg/mL的链霉亲和素溶液，在固相使用链霉亲和素溶液于37℃下包被反应12小时，随后用封闭液（含1% BSA和1 %蔗糖），37℃封闭反应0.5h得到链霉亲和素包被的固相；
步骤（2）中碱性磷酸酶标记抗FITC抗体的制备方法如下：取0.1mg FITC抗体与0.1mg碱性磷酸酶混匀后，加入0.125 mL 浓度为0.01%的戊二醛溶液，室温避光反应6小时；再加入20μL浓度为0.5 mol/L的单乙醇胺溶液，继续于旋转培养器上室温避光封闭1小时。将反应后的混合物在4℃环境下使用PBS缓冲液（0.01M，pH 7.0）搅拌透析过夜；最终向透析后的溶液中加入PBS缓冲液（0.01M，pH7.0）配制的10%BSA，调节BSA终浓度至为0.5%，再加入等体积甘油混匀后，制得碱性磷酸酶标记抗FITC抗体。
实验结果：图6为本实施例中HPV-18病毒核酸质粒的检测荧光信号图，由图6可知，检测体系的信号随着HPV-18病毒核酸质粒分析物的增加而增强，最低检出限为1 copies/μL，由此可见，采用本技术方案的核酸检测方法可实现单拷贝级别的检测灵敏度，并且检测方法简单，容易实现自动化。
以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）根据待检测核酸设计正向引物和反向引物，正向引物采用生物素进行修饰，反向引物采用FITC进行修饰；或者正向引物采用FITC进行修饰，反向引物采用生物素进行修饰；以待检测核酸为模板，利用正向引物和反向引物进行RPA扩增，得到扩增产物；
（2）将扩增产物和化学发光标记物修饰的FITC抗体加入至链霉亲和素修饰的固相中，孵育10~30 min，清洗后加入化学发光底物，孵育5~30 min后检测化学发光信号。
2.根据权利要求1所述基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，当待检测核酸为DNA时，根据目标DNA设计正向引物和反向引物，在进行RPA扩增时，以目标DNA为模板进行RPA扩增；当待检测核酸为RNA时，根据目标RNA逆转录产生的cDNA设计正向引物和反向引物，在进行RPA扩增时，以目标RNA逆转录产生的cDNA为模板，进行RPA扩增。
3.根据权利要求1所述基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，链霉亲和素修饰的固相的制备方法如下：将链霉亲和素溶于柠檬酸盐缓冲液中，配制成浓度为520 μg/mL的链霉亲和素溶液，在固相使用链霉亲和素溶液于4~ 37℃下包被反应12~24小时，用封闭液于37℃下封闭0.5~2h，得到链霉亲和素包被固相。
4.根据权利要求1所述基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法，其特征在于，所述步骤（1）的操作方法如下：将T4 UvsX 蛋白、T4 UvsY蛋白、T4 gp32、聚合酶、脱氧核苷酸三磷酸 、正向引物、反向引物、聚乙二醇-35K、二硫苏糖醇、磷酸肌酸、肌酸激酶、三磷酸腺苷、三（羟甲基）氨基甲烷、醋酸钾和醋酸镁混合制成溶液，加入待检测核酸，RPA扩增反应10~30min，获得扩增产物。
5.根据权利要求1所述基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法，其特征在于，所述步骤（2）的操作方法如下：使用Tris缓冲液将化学发光标记物修饰的FITC抗体母液稀释成0.5~2 μg/mL浓度的抗体工作液，取50μL稀释100~500倍的扩增产物和50 μL化学发光标记物修饰的FITC抗体加入至链霉亲和素包被固相中，于37℃下孵育10~30 min后，检测化学发光信号。
6.根据权利要求1所述基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，所述化学发光标记物修饰的FITC抗体为采用发光剂或酶进行修饰的FITC抗体。
7.根据权利要求6所述基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法，其特征在于，所述化学发光标记物修饰的FITC抗体为吖啶脂标记抗FITC抗体、碱性磷酸酶标记抗FITC抗体和辣根过氧化物酶标记抗FITC抗体中的任意一种。
8.根据权利要求7所述基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法，其特征在于，所述吖啶脂标记抗FITC抗体的制备方法如下：取0.1~0.5 mg FITC抗体加入100 μL PBS缓冲液中，再加入20μL吖啶酯溶液混合均匀，在37℃环境进反应，对反应后的混合物使用凝胶柱进行纯化；向纯化后的溶液中加入10%BSA，直至纯化后的溶液中牛血清白蛋白的终浓度为0.5%~2%，得到吖啶脂标记抗FITC抗体。
9.根据权利要求7所述基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记抗FITC抗体的制备方法如下：取0.1 ~0.5 mg FITC抗体与0.1~ 0.5 mg碱性磷酸酶混匀后，加入0.125 mL浓度为0.01% ~2%的戊二醛溶液，室温避光反应2~6小时；再加入20μL浓度为0.5 ~2 mol/L的单乙醇胺溶液，室温避光封闭反应1~3小时；将反应后的混合物在4℃环境下使用PBS缓冲液搅拌透析过夜；向透析后的溶液中加入10%BSA，调节BSA终浓度至0.5% ~ 2%，再加入等体积甘油混匀后，得到碱性磷酸酶标记抗FITC抗体。
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