JPH05219994A - シグナル産生部分およびその使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】アッセイの標的が極度に低濃度であり、標的の
存在および／または濃度を検出するのに有用な増幅され
たシグナルが産生されるようなあらゆるアッセイで使用
するための、シグナル産成部分に関する。 【構成】自己増幅するシグナル産生部と、極少量の標的
分子を検出するアッセイ方法が開示されている。シグナ
ル産生部は活性バクテリオファージまたはウィルスと、
検出プローブを含む。標的と接触した後、シグナル産生
部は適当な宿主に導入され、複製と増幅されたシグナル
産生が行われる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はアッセイで使用するため
の、自己増幅するシグナル産成部分に関するものであ
る。より詳細には、本発明はアッセイの標的が極度に低
濃度であり、標的の存在および／または濃度を検出する
のに有用な増幅されたシグナルが産生されるようなあら
ゆるアッセイで使用するための、シグナル産成部分に関
するものである。本発明は、１０^-18モルまたはそれ以
下の量で存在する分子の検出および／または定量を可能
にするアッセイを与える。

【０００２】

【従来の技術】本分野では、検出可能なシグナルを産生
するための多様な手段を用いた多くのアッセイが既に知
られている。しかしながら、今日知られているアッセイ
は限られた強度のシグナルしか産生せず、したがって感
度には限りがある。既知のアッセイでより感度が高いも
のは、アッセイの標的と結合する検出プローブとシグナ
ル産成部分（標識）とを組み合わせるものである。シグ
ナル産成部分は典型的には蛍光部分または酵素である。
検出プローブは典型的には抗体、アビジン、または核酸
配列である。

【０００３】特異的なＤＮＡまたはＲＮＡ配列に関する
アッセイ（ＤＮＡプローブアッセイ）は、他の標的に関
するアッセイと比較すると、特に高度な選択性が可能で
ある。ＤＮＡプローブアッセイは病原菌やその他の微生
物学的物質、また遺伝病に由来するＤＮＡまたはＲＮＡ
配列の検出に特に有用である。しかしながら、現在のＤ
ＮＡプローブの適用はアッセイ技術の感度によって制限
されている。蛍光標識を用いたＤＮＡプローブアッセイ
は典型的には、約１０^-17モルの標的分子（アッセイ体
積あたり）まで測定可能な感度を持つ。酵素標識を用い
たアッセイは、約１０^-18モル（アッセイ体積あたり）
まで測定できるように改良された。

【０００４】バクテリオファージは適当な宿主細胞に導
入されると複製することができ、米国特許第４，１０
４，１２６号に開示されたヤング（Ｙｏｕｎｇ）による
競合結合アッセイで使用された。ヤングはさらに、標的
の存在量を決定するために、酵素などの特定の細胞内物
質の使用を開示している。しかしながら、このアッセイ
は、最も感度のよい酵素標識を用いたアッセイの１０
^-18モルの感度よりも、感度が悪い。さらに、このアッ
セイで用いるバクテリオファージはアッセイされる基質
に特異的に結合するタンパク質によって顕著に不活化さ
れる。

【０００５】モスコウィッツ（Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚ）は
米国特許第４，７４６，６０４号でさらに、幾つかのア
ッセイ形式で、シグナル産成部分として生きた細胞の使
用を開示している。細胞は複製され、それによって増幅
されたシグナルが生成される。米国特許第４，７４６，
６０４号はいかなるアッセイ形式でもバクテリオファー
ジやウイルスの使用を開示しておらず、１０^-18モルま
たはそれ以下の感度のアッセイを開示していない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】したがって、１０^-18
モルまたはそれ以下の量で存在する微量の標的分子の検
出または定量を可能にする非競合結合アッセイを与える
ことが、本発明の目的である。本発明の別の目的は、ア
ッセイで自己増幅するシグナル生成部分を用いて微量の
標識分子の検出のためのアッセイで与えることである。
本発明のさらに別の目的は、微量のＤＮＡまたはＲＮＡ
配列を検出するためのアッセイで自己増幅するシグナル
生成部分中に活性のあるウイルスまたはバクテリオファ
ージを用いることである。ファージまたはウイルスそれ
自体を存在するアッセイの標的量を決定するために使用
可能であり、あるいは酵素や他の触媒を産生するために
使用し、それをさらに存在する標的量の決定に用いるこ
とも可能である。本発明のこれらの目的および他の目的
およびそれらが達成される方法は、以下の発明の詳細な
説明から明らかになるであろう。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は３つの局面を持
つ。第１の局面は、微量の標的分子の存在あるいは濃度
を検出するためのアッセイで用いられる、自己増幅する
シグナル生成部分である。特に、シグナル産成部分は核
酸の材料および検出プローブとして働くベクターを含
む。ベクターは典型的にはバクテリオファージまたはウ
イルスであり、宿主への取り込みおよびその中での複製
に適したものである必要がある。宿主は典型的にはベク
ター適合性で選択された細胞である。ベクターによって
産生された核酸は、直接検出できるか、あるいは検出可
能なシグナルを産生するための連続反応に加わるような
ポリペプチドをコードするひとつ以上の核酸配列を含む
ことも可能である。ポリペプチドはタンパク質、酵素、
補酵素などである。核酸配列は宿主によって翻訳され、
ポリペプチドを産生する。このようにして、ベクターは
増幅されたシグナルを産生する。シグナル生成部分の検
出プローブはベクターと標的を結合させ、ベクター・検
出プローブ・標的を含むレポーター複合体を形成する。

【０００８】本発明の第２の局面は、本発明のシグナル
産成部分を用いて標的分子の存在および／または濃度を
検出するための方法である。レポーター複合体は通常の
方法によって、結合していないベクターおよび検出プロ
ーブから分離することができる。分離されたレポーター
複合体、より特異的には、そのベクター要素は宿主に導
入され、そこでベクターが複製され、検出可能なシグナ
ルを産生する。ベクターによって産生された核酸はポリ
ペプチドをコードすることもできる。この場合には、ベ
クターは、複製され、シグナル生成反応のためのポリペ
プチドをさらに産生するために、宿主に導入される。よ
り一般的には、本方法は： （ａ） シグナル産成部分を標的と接触させてレポータ
ー複合体を形成させること； （ｂ） レポーター複合体を、シグナル産成部分の結合
していない成分から分離すること； （ｃ） 分離したレポーター複合体由来のベクターを適
当な宿主に導入すること； （ｄ） ベクターにシグナルを産生させること；および （ｅ） シグナルを検出すること、 の過程を含む。レポーター複合体が結合していない成分
から分離されたら、それを宿主に導入することができ
る。あるいは、レポーター複合体を多様な成分に分離す
ることができる。重要なことは、ベクターが宿主に導入
されて増幅されたシグナルを産生することのみである。
ファージまたはウイルスをベクターとして用いた場合、
ファージまたはウイルスがそれ自身またはその核酸を宿
主に挿入可能であることは、本発明の利点である。

【０００９】本方法は標識分子の存在の有無を単に検出
するために使用することができる。また、これは存在す
る標的の濃度を定量するためにも使用可能である。宿主
に導入されると、存在する標的量と関係づけられる増幅
シグナルをシグナル産成部分が生成することは、シグナ
ル産成部分の利点である。本発明の方法で用いられれ
ば、本方法は慣習的な検出法の感度をはるかに越えて増
強された感度を与える。

【００１０】本発明の第３の局面は、特定の標識を検出
するための試験キットに、シグナル産成部分と本方法を
組み込むことである。本試験キットはシグナル産成部分
またはその成分、試験される系に適用するための手段を
含む。本キットはまた、標的に結合した核酸試料を、シ
グナル産成部分の結合していない成分から分離するため
の手段も含む可能性がある。本キットはさらに、適当な
宿主に、単離された核酸試料を導入する手段を与え、ま
たそれによって生成されたシグナルを検出するための手
段も含む可能性がある。

【００１１】本発明は、自己増幅するシグナル産成部分
と、標的分子の存在および／または濃度を検出するため
の方法を目的とするものである。シグナル産成部分と検
出方法は分子、イオン、および複合体の検出に使用可能
である。本発明は、タンパク質、ポリペプチド、核酸、
ホルモン、ハプテン、抗原、抗体、および生物学的過程
で使用または生成される類似のものなどの、生物分子の
検出で最も有利に使用される。より詳細には、本発明は
微生物薬剤のＲＮＡまたはＤＮＡ配列、または遺伝病に
よる配列の検出に使用される。

【００１２】自己増幅するシグナル産成部分は、標的へ
の結合とシグナルを産生できる物質を産生することによ
って、またはシグナルそのものを産生することによっ
て、標的の検出を可能にする。得られたシグナルの強度
は、標的の濃度に直接関係している。したがって、シグ
ナル強度の標準化により、標的濃度の決定が可能にな
る。本発明により適用されるシグナル増幅の程度は、こ
れまで検出不能だった標的の検出および濃度の定量が可
能になる程度である。例えば、本発明により１０⁴より
少ない標的分子の検出を可能にした。したがって、アッ
セイ体積あたり１０^-18モルの量の標的が検出可能とな
った訳である。本発明はいかなる形式でも使用可能であ
るが、存在する標的が約６×１０^-18モル（アッセイ体
積あたり）またはそれ以下の量であるようなアッセイで
用いることがより有利である。

【００１３】シグナル生成部分はベクターと検出プロー
ブを含む。ベクターは核酸の供給源として働き、天然に
存在するか、あるいは遺伝的に操作したバクテリオファ
ージ、ウイルス、プラスミドまたはそれを遺伝的に操作
したものを使用することができる。ベクターに産生され
た核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ほかのポリペプチドまたは
その断片であり、天然に存在するものまたは合成配列で
ある可能性がある。

【００１４】しかしながら、ベクターは宿主に導入さ
れ、宿主によって複製可能でなければならない。したが
って、ベクターと宿主は通常、適合性に関して選択され
る。バクテリオファージとウイルスは細胞に感染するこ
とができ、それによって細胞中にそれ自身またはその核
酸を導入するので、望ましいベクターである。典型的に
は、ベクターがバクテリオファージの場合には大腸菌な
どの最近細胞が使用され、ベクターがレトロウイルスの
場合には哺乳動物細胞が使用される。

【００１５】さらに、核酸は、検出されるシグナルを与
えるポリペプチドをコートするひとつ以上の核酸配列を
含むことができる。ポリペプチドは、シグナルそのもの
を産生できる物質、またはシグナルを産生する反応に関
与する物質である可能性がある。タンパク質、酵素、補
酵素などは本発明で使用される典型的なポリペプチドで
ある。通常は、核酸は適当なポリペプチドを生成するた
めの核酸配列を含むように遺伝的に修飾される。

【００１６】測定可能な産物の形成を触媒できる酵素が
望ましい。適当な酵素としては、酸性ホスファターゼ、
アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ガラクト
シダーゼ、ルシフェラーゼなどがある。これらの酵素は
光（光子）、発色原、沈澱などの産生を触媒することが
できる。これらの酵素は反応系から測定可能な物質の除
去を触媒することもできる。例えば、発色原を非発色原
に転換することが可能である。これらの酵素は不溶性粒
子を可溶性物質に転換することもでき、それによって懸
濁液から不溶性粒子を除去を行うことができる。

【００１７】ルシフェラーゼ酵素は光の放出を触媒し、
そのために望ましいものである。典型的なルシフェラー
ゼは細菌ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓ
ｃｈｅｒｉ）由来のもの、およびホタル フォティヌス
・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）由来
のものが含まれる。細菌ビブリオ・フィシェリ由来のル
シフェラーゼが特に望ましい。

【００１８】本発明の自己増幅できるシグナル生成部分
は検出プローブも含む。検出プローブは標的およびベク
ターの双方に結合し、それにより二つの連結する。この
連結により、標的分子の検出および／または定量が可能
となる。したがって、検出プローブはベクターと標的の
双方に結合可能なひとつ以上の成分を含む。３つが結合
してベクター−結合はプローブ−標識複合体（レポータ
ー複合体）を形成し、それが結合していない複合体から
分離できるならば、結合は十分である。検出プローブ
は、共有結合、イオン結合、水素結合、ハイブリダイゼ
ーション、電気的引力、ファン・デル・ワールス力など
を含むいずれかの形の結合によって標的とベクターに結
合するように選択される。検出プローブはベクターと結
合するのと同じ、または異なる機構によって標識と結合
することができる。

【００１９】典型的には、検出プローブの一つの成分
は、標的とハイブリダイズできるヌクレオチド配列を含
むポリヌクレオチド鎖である。ポリヌクレオチド鎖がベ
クターとハイブリダイズ可能な配列も含む可能性がある
が、より典型的にはベクターへの結合はモノクローナル
抗体およびポリクローナル抗体、その断片および対応す
る抗原とハプテンなどの結合の組みを使用するのが容易
である。これらは、抗原−Ｆａｂ、抗原−Ｆａｂ′、抗
原−Ｆ（ａｂ′）₂、ハプテン−Ｆａｂ、ハプテン−Ｆ
ａｂ′、ハプテン−Ｆ（ａｂ′）₂、抗原−抗体、およ
びハプテン−抗体の組を含む。そのほかの適当な結合の
組としては、ビオチンまたはビオチン化ＤＮＡポリヌク
レオチドと抗ビオチン、ジニトロフェニル化されたタン
パク質上のＤＮＰと抗ＤＮＰ、レクチン−糖タンパク
質、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジ
ン、相補的な核酸配列などがある。検出プローブはひと
つ以上の結合の組を含む可能性がある。

【００２０】結合組の一方はベクターに直接結合させら
れるが、その組の他方は検出プローブの別の成分（例え
ばポリヌクレオチド鎖）に結合させる。例えば、ベクタ
ーがバクテリオファージまたはウイルスである場合に
は、結合組の一方を、検出プローブ中の結合組の他方と
結合させる前に、ファージに結合させるのが有効であ
る。ファージまたはウイルスへの結合は、ファージまた
はウイルス表面を修飾して、結合組の１つに結合可能な
機能的反応基を導入することによって促進される。遊離
カルボキシル基がこのような結合に有利である；遊離ア
ミノ基は特に有用である。ここに述べる実施例１および
実施例２は修飾したＭ１３バクテリオファージをベクタ
ーとして使用している。どちらの例も、ファージの表面
にビオチンを結合させて、その結合パートナーであるス
トレプトアビジンを介してポリヌクレオチド鎖との結合
が促進される。ビオチン、ストレプトアビジン、及びポ
リヌクレオチド鎖は全て検出プローブの成分だと考えら
れる。同様に、実施例４では検出プローブのフルオレセ
インとの結合のために、修飾したＭ１３バクテリオファ
ージの表面に抗フルオレセイン抗体のＦ（ａｂ′）モノ
マーが結合している。フルオレセインとＦ（ａｂ′）抗
フルオレセインモノマーの双方が検出プローブの成分で
あると考えられる。

【００２１】結合組の一方または双方が多価である場合
には、多様な結合機構が可能である。例えば、実施例１
と実施例２では、ビオチンは独立にポリヌクレオチド鎖
とバクテリオファージに結合していた。ビオチンの多価
の結合パートナーであるストレプトアビジンは、ファー
ジとポリヌクレオチド鎖の双方の上のビオチンに結合す
ることにより、検出プローブ形成を完了した。本分野の
技術者には、他の結合機構も容易に明らかになるであろ
う。

【００２２】自己増幅するシグナル生成部分により、数
段階で検出可能なシグナルの促進された増幅が可能とな
る。第１段階は、ベクターが宿主に導入されてその後に
複製される時である。例えば、Ｍ１３およびφＸ１７４
などのバクテリオファージを宿主細胞に導入した後、そ
れらのゲノムは複製されて、宿主細胞中で数百コピーが
産生される。さらに、多くのゲノムは宿主細胞を取り囲
む培地中に放出され、さらに他の宿主細胞を感染し続け
る。各々の新しく感染した宿主は、もとのファージゲノ
ムをさらに数百コピー産生する過程を繰り返す。時間に
よるファージ数の増加は指数関数的である。例えば、実
施例１，２および４で用いた修飾Ｍ１３バクテリオファ
ージは、用いられた条件下で、標準的な大腸菌中２時間
で１０⁴倍以上の数に増加した。増幅の第２段階は、ベ
クターによって産生される核酸がポリペプチドをコード
している場合である。この増幅は、核酸の転写により、
数百から数千のｍＲＮＡ転写産物が産生されることによ
る。これらは次に複数回翻訳されてより多くのポリペプ
チドが産生される。ポリペプチド産物が、時間により蓄
積されるシグナルを産生する反応に関与する場合には、
さらに大きな増幅が可能である。

【００２３】本発明の別の局面では、自己増幅するシグ
ナル生成部分は、標的の存在または濃度を決定するため
の方法で用いられる。この方法は： （ａ） シグナル生成部分を標的と接触させて、シグナ
ル生成部分−標的複合体を形成させること； （ｂ） シグナル生成部分−標的複合体を、複合体を形
成していないシグナル生成部分成分から分離すること； （ｃ） 分離したシグナル生成部分−標的複合体由来の
ベクターを適当な宿主に導入すること； （ｄ） ベクターに増幅されたシグナルを産生させるこ
と； （ｅ） シグナルを検出すること； の過程からなる。得られたシグナルは、標的の存在の有
無を決定するための特異的な閾値に応じて検出される。
あるいは、シグナルは、標的の濃度を決定する既知の標
準シグナルに対応させて測定される。

【００２４】シグナル生成部分は標識と接触し、結合す
る。しかしながら、標識と接触する前にシグナル生成部
分が完全に形成されることは必要とされていない。シグ
ナル生成部分−標的複合体は、完全な複合体が形成され
るいかなる形式で形成されてもよい。例えば、実施例１
および実施例２では検出プローブはポリヌクレオチド
鎖、ストレプトアビジン、および２分子のビオチンを含
んでいた。各実施例で、検出プローブのポリヌクレオチ
ド鎖は最初にビオチン化され、つぎに標的と接触し、続
いてストレプトアビジンと結合し、その後に既にビオチ
ン化されていたベクターに結合した。本分野の技術者
は、シグナル生成部分−標識複合体を形成させるための
別の方法も容易に認めるであろう。

【００２５】シグナル生成部分と標識は典型的には水相
中で接触させる。水相とは、約９０から１００％が水で
あり、残りが水と混合可能な１種以上の有機溶媒を含む
溶媒相を意味し、該有機溶媒はシグナル生成部分と標的
成分またはその成分間の結合を変性させないまたは逆に
影響しないものである。適当な溶媒は、１から４炭素原
子を持つ低分子量アルコールおよび、分子量が約１００
から１０，０００のポリオール（例えばポリエチレング
リコール）およびポリエーテル（例えばポリビニルピロ
リドン）などであるが、これに制限されるものではな
い。

【００２６】典型的には、標的分子は検出プローブに、
一方の成分に相補的なヌクレオチド配列のハイブリダイ
ゼーションによって結合する。シグナル生成部分−標的
複合体は次に、結合していない物質（例えば、結合して
いないシグナル生成部分や成分の一部）から分離する。
分離は、水相から複合体を沈澱させること、それを固相
支持体に結合させそれを水相から除去すること、あるい
はその他の適当な通常の方法で行われるが、これに制限
されるものではない。複合体は固相支持体（固相）に結
合させることが望ましい。

【００２７】固相とは、水相中に解けないあらゆる固相
支持体を意味する。通常の固相物質としては、金属、ガ
ラス、プラスチックがある。固相は、接触が場所を占め
る容器（例えば、試験管、遠心カップ、マイクロタイタ
ーカップなど）あるいは容器中に挿入される装置（例え
ばビーズや計量棒）などである。金属とプラスチックは
ビーズに望ましい物質である；ガラスとプラスチックは
容器に望ましい。

【００２８】より詳細には、結合組の成分が結合できる
ようなあらゆるプラスチックが固相としての使用に適し
ている。プラスチックは疎水性（例えば、ポリスチレ
ン、ポリエチレン、およびポリプロピレン）または親水
性（例えば、硫酸を含むプラスチック、スルフォン酸
塩、カルボン酸、１次アミン、芳香族アミン、アミド、
水酸基、トシル活性基、あるいはクロロメチル基）であ
る。ポリエチレン、ポリスチレン、、ポリプロピレン、
およびスチレン／ビニルカルボン酸、スチレン／芳香族
アミン、およびスチレン／１次アミンの共重合体が望ま
しい。このような物質は微小球または顆粒として、バン
・ラボラトリーズ社、カーメル、インディアナから入手
可能である。

【００２９】シグナル生成部分−標的複合体の固相への
結合は、しばしば捕獲プローブによって促進されるが、
これは検出プローブと同様の方法で機能するものであ
る。キャプチャープローブは標的と固相の双方に結合で
きる１種以上の成分を含む。それによりシグナル生成部
分−標的複合体が結合していない成分から分離されるな
らば、結合は十分である。捕獲プローブは標的に、共有
結合、イオン結合、水素結合、ハイブリダイゼーショ
ン、電気的引力、ファン・デル・ワールス力などで結合
できる。

【００３０】典型的には、捕獲プローブの１つの成分は
標識に結合するポリヌクレオチド鎖である。結合は、標
的中の相補的なヌクレオチド配列とポリヌクレオチド鎖
とのハイブリダイゼーションによって生じる。しかしな
がら、このプローブによる結合が阻害するのを避けるた
め、検出プローブによる結合配列とは離れた標的中の配
列に結合するように、鎖が選択される。

【００３１】捕獲プローブは固相に直接結合可能であ
る。しかしながら、このような結合も、検出プローブに
対するベクターの結合を促進するために用いられたもの
と同様な結合組を用いることによって促進される。この
ようなものとしては、モノクローナル抗体およびポリク
ローナル抗体およびその断片、および対応する抗原とハ
プテンがある。適当な結合組としては、抗原−Ｆａｂ、
抗原−Ｆａｂ′、抗原−Ｆ（ａｂ′）₂、および一般的
なハプテン−抗体、およびビオチンまたはビオチン化Ｄ
ＮＡプローブと抗ビオチン、ジニトロフェニル化タンパ
ク質上のＤＮＰと抗ＤＮＰ、レクチン−糖タンパク質、
ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、
相補的核酸配列などが特に含まれる。捕獲プローブは１
種以上の結合組を含むこともできる。

【００３２】シグナル生成部分と同様に、標識、捕獲プ
ローブ、および固相の間の結合は、特定の順序で行われ
ることは意図されていない。例えば実施例１および実施
例２では、検出プローブのポリヌクレオチド鎖、標識、
および捕獲プローブのポリヌクレオチド鎖の間の複合体
は、固相を導入することによって複合体が固定される前
に形成された。第２の捕獲プローブのポリヌクレオチド
鎖はあらかじめ固相に結合させておいた。その後に、結
合組成分を添加して検出プローブを完了させ、続いてベ
クターを導入して過程を完了した。本分野の技術者は、
シグナル生成部分を固相に結合させる別の方法があるこ
とを容易に理解するであろう。

【００３３】固定されたシグナル生成部分−標識複合体
はつぎに、残っている結合していない成分から分離す
る。分離はデカンテーション、吸引、プロッティング、
染み込ませるなどにより水相を除くこと、あるいは単に
固相を除去すること（例えばビーズや測量棒）ことによ
って行う。適当な洗浄溶液で行うことにより、分離が増
強される。シグナル生成部分複合体がつぎに導入され、
本分野の技術者には既知の技術を用いて宿主細胞に感染
させる。あるいは、ベクターを結合した複合体から分離
して、宿主に導入することもできる。

【００３４】そののちに、ベクターは上述のように増幅
されたシグナルを産生する。標的の存在のみが知りたい
場合には、閾値以上が産生されているかどうかを決める
ためにシグナルを測定する。閾値が得られれば、反応は
陽性である；もしそうでなければ標的は存在しないと結
論づけられる。既知の標準試料に対して測定した反応を
比較することにより、標的の濃度が決定できる。

【００３５】本発明および本発明の方法を実施するため
の試薬はキットに含めることができる。キットは、部分
的には、自己増幅するシグナル産成部分の成分、試験す
る系に適用するための手段、およびシグナル産成部分が
標的と結合したら結合していない成分からシグナル産成
部分のベクターを分離するための手段を含む。本キット
はさらに、適当な宿主に対して単離したベクターを導入
する手段も含む可能性もあり、それから得られるシグナ
ルの検出手段も含む可能性がある。

【００３６】

【実施例】以下の例は、当発明の様々な態様を表わして
いる。各例はリボソームＲＮＡを標的とするアッセイを
示す。各アッセイの感度はアッセイ当りの細胞当量と標
的のモル数で表わされる。実施例において用いられる細
菌は、典型として細胞あたり約５×１０⁴のリボソーム
を含み、この数字は各アッセイの標的ｒＲＮＡに対する
モル感度を決定するのに使われた。実施例はいかなる場
合においても当発明の範囲を限定することを意図するも
のではない。実施例において使われているバクテリオフ
ァージの量は、プラーク形成単位（ｐｌａｑｕｅ−ｆｏ
ｒｍｉｎｇｕｎｉｔ）（ｐｆｕ）で表わされており、広
く知られているプラークアッセイを用いて決定された。

【００３７】実施例１ この実施例は病原体リステリア・イノキュア（Ｌｉｔｅ
ｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）の検出における、シグナル産
生部とその使用を示す。実施例中、シグナル産生部はマ
グネティックビーズを固体相として用いる二重プローブ
アッセイ（即ち、検出と捕獲プローブを用いたアッセ
イ）に組み込まれる。大腸菌は宿主として用いられる。

【００３８】改良されたＭ１３バクテリアファージがベ
クターとして使われた。特に細菌のビブリオ・ハルベビ
（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｖｉ）由来のルミフェラー
ゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）酵素のｌｕｘＡとｌｕｘＢ
遺伝子がバクテリオファージＭ１３ｍｐ１９に導入され
た。ｌｕｘＡとｌｕｘＢの核酸配列はコーン（Ｃｏｈ
ｎ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．，
２６０； ６１３９−６１４６（１９８５）とジョンス
トン（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｃｈｅｍ．， ２６１； ４８０５−４８１１
（１９８６）によってそれぞれ示されている。これらの
遺伝子は１９２９塩基対のＳａｌＩからＢｇｌIIまでの
制限断片としてプラスミドｐＴＢ７から得られた。この
プラスミドはイリノイ州ピオリア（Ｐｅｏｒｉａ）のＵ
ＳＤＡ ＮＲＲＬよりＮＲＲＬＢ−１５２３１株として
入手できる。この制限断片はバクテリオファージＭ１３
ｍｐ１９のＳａｌＩとＢａｍＨＩ制限部位の間に挿入さ
れた。Ｍ１３ｍｐ１９はメリーランド州ガイザーバーグ
（Ｇａｉｔｈｅｒｂｅｒｇ）のベテスダ・リサーチ・ラ
ボ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）
から入手できる。クローニング手法のすべては標準法に
よって行われ、当業者にとっては簡単に再現可能であ
る。結果として得られたバクテリオファージＭ１３ＳＯ
Ｃ５１２はＭ１３ｍｐ１９にあるｌａｃプロモーターの
転写制御下にあるｌｕｘＡとｌｕｘＢをコードする配列
を含んでいた。

【００３９】その後ファージをＮ−ヒドロキシサクシン
イミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）
ビオチン（ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン）を含むリン酸緩衝
液（０．１Ｍ ＮａＨ₂ＰＯ₄、０．１Ｍ ＮａＣｌ，Ｐ
Ｈ７．５）に２５℃で６０分間懸濁させてＭ１３ＳＯＣ
５１２ファージ表面にビオチンを結合させた。最適な反
応液は約５ｍｌ（ｐＨ７．５）中に約１×１０¹³から約
５×１０¹³ｐｆｕのＭ１３ＳＯＣ５１２と約２１０μｇ
のＮＨＳ−ビオチンを含む。ビオチン化（ｂｉｏｔｉｎ
ｙｌａｔｉｏｎ）の前と後ろにプレートアッセイを用い
て生存バクテリオファージの数が決定された。このアッ
セイではファージの生存性がビオチン化の後も変化しな
いことを示唆した。ビオチン化されたファージはセファ
デックスＧ−２５クロマトグラフィーによって未反応の
ＮＨＳ−ビオチンから分離され、更に２％ポリエチレン
グリコール（０．５Ｍ ＮａＣｌ）中での沈澱によって
濃縮され、リン酸緩衝液１ｍｌに再懸濁された。９９％
以上のバクテリオファージがＮＨＳ−ビオチンと反応し
た。

【００４０】検出プローブは合成ＲＮＡポリヌクレオチ
ド鎖、ビオチン、ストレプトアビジンから成る。このＲ
ＮＡ鎖は大腸菌１６ＳｒＲＮＡの８０から６４８の塩基
に相補な５７５核酸配列を含む。ビオチンは通常の手法
を用いてＲＮＡ鎖に結合された。ストレプトアビジンは
検出プローブとＭ１３ＳＯＣ５１２バクテリオファージ
のビオチンに結合され検出プローブが完成された。

【００４１】捕獲プローブはＤＮＡおよびｄＴのオリゴ
ヌクレオチドから成る。このＤＮＡオリゴヌクレオチド
はリステリアモノサイトジエン（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍ
ｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）１６ＳｒＲＮＡの領域に正
確に相補的な３５塩基の合成オリゴヌクレオチドを含
む。この核酸配列はＴＧＴ ＣＣＣ ＣＧＡ ＡＧＧＧ
ＡＡ ＡＧＣ ＴＣＴ ＧＴＣ ＴＣＣ ＡＧＡ ＧＴ
Ｇ ＧＴである。約１２５残基のｄＡティルがターミナ
ル デオキシリボヌクレオチジル トランスフェレース
（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）によって３′末
端に付加された。この３５塩基相補領域はビオチン化さ
れた検出プローブに対する相補領域と重なっていない。
オリゴ（ｄＴ）はまたアッセイの固体相として使用する
マグネティックビーズにも結合した。

【００４２】水溶性のカルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉ
ｉｍｉｄｅ）活性剤である１−エチル−３（３−ジメチ
ルアミノ−プロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）の存
在下で５′アミン末端オリゴ（ｄＴ）ヌクレオチドを、
カルボキシル酸ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ末端の
粒子と反応させて、オリゴ（ｄＴ）をマグネティックビ
ーズに接着させた。ＥＤＡＣはシグマケミカル社（Ｓｉ
ｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）から入手できる。
粒子は０．７から１．７μの平均直径を持ち、マサチュ
ーセッツ州ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）のアド
バンスト・マグネティックス社より入手できる。オリゴ
（ｄＴ）粒子はマサチューセッツ州フラミンガム（Ｆｒ
ａｍｉｎｇｈａｍ）のジーン−トラックシステム社（Ｇ
ｅｎｅ−Ｔｒａｋ Ｓｙｓｔｅｍｓ）から出ているキッ
トの一部として手に入れることができる。このビーズは
０．１Ｍ炭酸二水素ナトリウムで数回、そして滅菌水で
数回洗浄された。このビーズは使用するまで１０ｍＭ
ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０），０．０５％と０．０２％アジ
化ナトリウム中で４℃にて保存可能である。

【００４３】細胞内物質や標識されたプローブの非特異
的吸着を減らすため、ビーズはあらかじめ以下のように
２回前処理をされた。ビーズをビーズ・プレハイブリダ
イゼーション緩衝液（０．１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．
５）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）、４％（Ｗ／
Ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，ファクターＶ，ミズ
ーリ州セントルイス Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ シグマ・ケ
ミカル社）、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０）で０．１％固体
まで希釈し、パイレックス（Ｐｙｒｅｘ）びん内で６８
℃、３−４時間、時々激しく撹拌しながらインキュベー
トした。Ｔｗｅｅｎ２０はシグマ・ケミカル社からでて
いるポリオキシエチレン・ソルビタン・モノラウレイト
（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｓｏｒｂｉｔａｎ
ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ）の商品名である。ビーズは
極わずかか、あるいは全く撹拌せずに１晩冷却のため放
置された。その後滅菌水で３回すすぎ、ビーズ・プレハ
イブリダイゼーション緩衝液に０．０２％アジ化ナトリ
ウムを加えた中に０．１％固体として室温にて再懸濁さ
れた。このビーズは使用されるまで室温で試験管回転機
（ｔｕｂｅ ｒｏｔａｔｏｒ）で回転された。（ビーズ
は使用前プレハイブリダイゼーション緩衝液とアジド中
で２カ月に至るまでｄＡ₁₂結合能力の低下なしで保存さ
れた。）使用当日ビーズはプレハイブリダイゼーション
緩衝液で１回洗われ、標的捕獲のため０．０１６％固体
の割で緩衝液中に再懸濁された。

【００４４】リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉ
ａ ｉｎｎｏｃｕａ）のビーズアッセイの感度は以下の
ように評価された。リステリア・イノキュアの細胞抽出
液を０．１ｍｌの２．５Ｍグアニジン・イソチオシアン
酸（ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔ
ｅ Ｇｕ ＳＣＮ）緩衝液（０．１Ｍトリス−塩酸（ｐ
Ｈ７．５）、０．４Ｍ ＥＤＴＡ）中で濃度１０⁷，１
０⁶，１０⁵，１０⁴細胞／ｍｌと段階的に希釈した。各
希釈液２０μｌに１２．５μｌの１０^-8ＭＤＮＡオリゴ
ヌクレオチド（捕獲プローブの）と１２．５μｌの２×
１０^-9Ｍのビオチン化ＲＮＡ（検出プローブの）が加え
られた。各溶液はｐＨ７に調製され、３７℃で１５分間
インキュベートしてＤＮＡ−ｒＲＮＡ−ＲＮＡ複合体を
形成させた。このｒＲＮＡは細胞抽出液の１６Ｓ ｒＲ
ＮＡであった。

【００４５】各希釈液の複合体は２００μｌのオリゴ
（ｄＴ）マグネティックビーズ（０．１％固体）を加
え、更にこの系は３７℃で５分間インキュベート固定化
された。このビーズをその後溶液からとり出し、洗浄緩
衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍトリス、０．５％
ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５）で２回
洗浄を行った。このビーズを０．１μｇストレプトアビ
ジン（カルフォルニア州、サンディエゴ Ｓａｎ Ｄｉ
ｅｇｏ、キャル−バイオケム Ｃａｌ−Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ）を含む洗浄緩衝液１１０μｌに再懸濁し、１０分間
室温でインキュベートした。ビーズはその後洗浄緩衝液
でもう２回洗われ、１０¹⁰ｐｆｕのビオチン化Ｍ１３Ｓ
ＯＣ５１２バクテリオファージを含む洗浄緩衝液１１０
μｌに再懸濁された。この懸濁液は室温で１０分間イン
キュベートされた。その後洗浄緩衝液で５回ビーズを洗
い、前もって６０℃に温めておいた熱溶出緩衝液（ｔｈ
ｅｒｍａｌ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（０．５
Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍトリス、ｐＨ８．０）１００μ
ｌに再懸濁した。６０℃で１分間ビーズをインキュベー
トした後この系を水槽につけ室温まで冷却した。磁石を
使って溶液からビーズがとり除かれた。その後各上澄５
０μｌをバクテリオファージに関して以下のようにアッ
セイした。

【００４６】試験溶液を１．５ｍｌエッペンドルフチュ
ーブに加えた。ここに宿主として働く中間ログ（ｍｉｄ
−ｌｏｇ）相のＪＭ１０１細胞２００μｌを以下のよう
に調製し加えた。大腸菌ＪＭ１０１（Ｆ＋）細胞の培養
液を３７℃で１晩空気を送りながら培養した。この培養
液をルリア（Ｌｕｒｉａ）培地で１：１００に希釈し、
約２時間で中間ログ相まで生育させた。ＤＮＡｓｅＩを
最終濃度１０³Ｋｕｎｉｔｚ／ｍｌ、ＲＮＡｓｅＡを最
終濃度１μｇ／ｍｌとなるよう加えた。

【００４７】試験溶液と宿主細胞の混合液を室温で１５
分間振とうを行わずにインキュベートした。それぞれの
内容物をその後イソプロピル−β−ガラクトサイド（ｉ
ｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を最
終濃度０．５ｍＭで含むルリア培地２．０ｍｌに加え、
３７℃で２時間空気を送りながら（＝振とうしながら）
インキュベートした。

【００４８】そらから後各培養液２００μｌを採取し、
１２×７５ｍｍのホウ珪酸塩（ｂｏｒｏｓｉｌｉｃａｔ
ｅ）培養試験管に移した。ルリア培養液中にデカナール
の０．１％溶液３００μｌを注入して発光が誘発され
た。この発光はデカナールを注入した後１０秒おいた後
ルミノメーター（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）で５秒間測
定して検出した。（ルシフェラーゼ ｌｕｃｉｆｅｒａ
ｓｅ 酵素は系内に存在するフラビンヌクレオチドと共
に、加えられたデカナールの酸化を触媒し、光を発す
る。ルミノメーターニューハンプシャー州、ナシュ Ｎ
ａｓｈｕａのバートホールド・アナリティカル・インス
トルメント Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製である。）系のバックグ
ランドノイズをバクテリオファージにさらされていない
ＪＭ１０１培養液をアッセイして決定した。発光出力は
５秒当りのカウント数として測定され、各希釈液に混和
されたリステリア・イノキュアの数に対してプロットし
た。 リステリア 発光出力 細胞当量 発光カウント数／秒 シグナル：ノイズ ５×１０⁵ ３．３９×１０⁶ １９．２：１ ５×１０⁴ １．５９×１０⁶ ９．０：１ ５×１０³ １．６６×１０⁵ − ５×１０² １．２２×１０⁵ − ０ １．７７×１０⁵ − このアッセイはリステリア・イノキュア約５×１０⁴細
胞当量またはｒＲＮＡ約４×１０^-15モルの感度であっ
た。

【００４９】実施例２ 実施例２はディップスティックｄｉｐｓｔｉｃｋアッセ
イにおける発明を説明する。実施例１のように、標的は
リステリア・イノキュア由来の１６ＳｒＲＮＡであっ
た。更にまた検出プローブとして、実施例１と同じ，ビ
オチン化したＲＮＡとストレプトアビジン、捕獲プロー
ブとして実施例１と同じ、ＤＮＡとオリゴ（ｄＴ）ヌク
レオチドが使用された。ベクターは実施例１で用いられ
た、同じ改良型Ｍ１３ＳＯＣ５１２バクテリオファージ
であった。ディップスティックは固体相としてマグネテ
ィックビーズの代わりに用いられた。ディップスティッ
クは試験用キットとしてジーン−トラック Ｇｅｎｅ−
Ｔｒａｋ社から販売されているジーン−トラックシステ
ム（Ｇｅｎｅ−Ｔｒａｋ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によってオ
リゴ（ｄＴ）被覆された。

【００５０】ディップスティックアッセイの感度は以下
のように決定された。リステリア・イノキュアの細胞抽
出液を０．１ｍｌの２．５ＭＧｕＳＣＮ緩衝液中で１０
⁸，１０⁷，１０⁶，１０⁵，１０⁴，１０³，１０²細胞／
ｍｌと、段階的に希釈した。０．３ｍｌの２．５ＭＧｕ
ＳＣＮ緩衝液に各希釈液７０μｌ、１０^-8ＭＤＮＡオリ
ゴヌクレオチド１２．５μｌおよび２×１０^-9Ｍビオチ
ン化ＲＮＡ１２．５μｌを加えた。各溶液をｐＨ７に調
製し、３７℃で１５分間インキュベートした。

【００５１】生成したＤＮＡ−ｒＲＮＡ−ＲＮＡ複合体
は、オリゴ（ｄＴ）で被覆したディップスティックを各
溶液に３７℃で１５分間挿入して固定化された。各ディ
ップスティックを取り出し、そのスティックを０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７）中で３回洗い、その後１０μｇ
／ｍｌのストレプトアビジン（リン酸緩衝液中）と室温
で１０分間インキュベートした。このディップスティッ
クを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で再び３回洗
浄し、１０¹⁰ｐｆｕビオチン化Ｍ１３ＳＯＣ５１２バク
テリオファージ（リン酸緩衝液中）と室温で１０分間イ
ンキュベートした。このディップスティックを０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７）で３回洗い、１μｇのリボヌク
レアーゼＡで３７℃にて１時間分解した。ディップステ
ィックを引き出し、各希釈液の上澄を実施例１で述べら
れているようにアッセイした。 リステリア 発光出力 細胞当量 発光カウント／秒 シグナル：ノイズ ４×１０⁶ ２．２３×１０⁶ ２８４．０：１ ４×１０⁵ ８．６９×１０⁶ １１１．０：１ ４×１０⁴ ７．５２×１０⁴ ９．６：１ ４×１０³ ７．４６×１０³ − ４×１０² ３．１５×１０³ − ４０ ５．２７×１０³ − ４ ４．４３×１０³ − ０ ７．８５×１０³ − このアッセイは約４×１０⁴細胞当量またはｒＲＮＡ約
３×１０^-15モルまで感度があった。

【００５２】実施例３ この実施例はマグネティック・ビーズ・アッセイの形式
で大腸菌細胞を検出するための発明を説明する。ベクタ
ーは遺伝的に改良されたφＸ１７４バクテリオファージ
であった。このファージはφＸ１７４Ｊ−Ｆ−ｉｎｓ６
と名づけられており、ミュラー（Ｍｕｌｌｅｒ）ら、
Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｒｏｌ．， １４１：１−２４（１
９８０）によって記述された様に以前に改良された。実
施例１で用いたビオチン化Ｍ１３ＳＯＣ５１２バクテリ
オファージ調製のプロトコールに従いφＸ１７４Ｊ−Ｆ
−ｉｎｓ６の表面にビオチンが結合された。

【００５３】検出プローブは合成ＤＮＡ鎖、ビオチン、
ストレプトアビジンから成る。このＤＮＡは大腸菌の１
６ＳｒＲＮＡに結合能を持つ３５核酸配列を持ち、その
５′末端に６単位のテトラエチレン・グリコール（ｔｅ
ｔｒａｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）が加えられ
た。この核酸配列はＴＧＮ ＡＡＧ ＴＡＣ ＴＴＴＡ
ＣＡ ＡＣＣ ＣＧＡ ＡＧＧ ＣＣＴ ＴＣＴ ＴＣ
Ａ ＴＡＣである。最後のテトラエチレン・グリコール
・モノマーにビオチンが結合された。検出プローブはテ
トラエチレン・グリコール（６．２５ｇ）を無水ピリジ
ン（７０ｍｌ）中で４，４′−ジメトオキシトリチルク
ロライド（４，４′−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ
ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（５．４６ｇ）と１晩室温にて撹
拌しながら反応させて調製された。溶媒をその後真空ポ
ンプで除き、残渣をトルエンで２回共蒸発（ｃｏｅｖａ
ｐｏｒａｔｅ）して酢酸エチルに溶解し、飽和炭酸水素
ナトリウム溶液で２度抽出し、乾燥させ（ＭｇＳ
Ｏ₄）、真空中で蒸留乾固させた。残渣を２％トリエチ
ルアミンを含むヘキサン中の酢酸エチル濃度勾配（１：
４，ｖ／ｖから１：１，ｖ／ｖ）を用いたシリカゲルで
のフラッシュ クロマトグラフィーによって更に精製し
た。

【００５４】反応生成物（２．４２ｇ）をＮ，Ｎ−ジイ
ソプロピルエチルアミン（１．１０９ｇ）を含むジクロ
ロメタン（３０ｍｌ）に溶解した。メトキシ−Ｎ，Ｎ−
ジイソプロピル−クロロフォスホアミダイト（Ｍｅｔｈ
ｏｘｙ−Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｃｈｌｏｒ
ｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）（１．１０７ｇ）
を撹拌中のこの溶液に滴下した。溶液を室温で１時間撹
拌した。この混合液を酢酸エチル（飽和炭酸水素ナトリ
ウム溶液で前洗浄されたもの）で希釈し、飽和炭酸水素
ナトリウム溶液で２回抽出を行った。酢酸エチル相を真
空中で蒸発させ乾燥させた。生成物はエチル酢酸：ヘキ
サン：トリエチルアミン（２０：８０：５，ｖ／ｖ／
ｖ）と共につめられたシリカゲルでのフラッシュ・クロ
マトグラフィーによって同じ溶媒で溶出を行い、更に精
製された。この生成物をアセトニトリル０．１Ｍ溶液中
に溶かし、カルフォルニア州、フォスターのアプライド
・バイオシステム Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ社に記述されている手順を用いて、自動ＤＮＡ合成
機に供した。

【００５５】ヌクレオチド鎖は標準法で市販のアデノミ
ン、シトシン、グアノミン、チミジン アミダイトを使
って生成された。

【００５６】３％トリクロロ酢酸を含むジクロロメタン
溶液を用いて末端の５′−水酸基からジメトキシトリチ
ル保護基をとり除き、６回の連続した、カップリング、
キャッピング、酸化、そして脱トリチル化サイクルをテ
トラエチレン・グリコール・フォスホアミダイトと共に
行った。

【００５７】フォスホアミダイトは上記と類似の方法で
３−（Ｎ−トリフルオロアセチルアミノ）プロパノール
とメトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル・クロロフォスホ
アミダイトを用いて調製した。フォスホアミダイトを加
え、つづいてキャッピングと酸化が行われた。生成オリ
ゴヌクレオチドを調節された多孔ガラス支持体からとり
出し、標準法で脱保護を行った。ビオチン長鎖、（ＮＨ
Ｓ−ＬＣ−ビオチン、イリノイ州ロックフォード Ｒｏ
ｃｋｆｏｒｄのピアス・ケミカル Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ社）が標準法によって付加された。

【００５８】捕獲プローブは大腸菌１６ＳｒＲＮＡの４
４８から４８２残基および約１５０ｄＡ残基のポリ（ｄ
Ａ）ティルにおいて相補な核酸配列を持つ、第１のポリ
ヌクレオチドを含む。捕獲プローブはまた、捕獲プロー
ブの最初のポリヌクレオチドのポリ（ｄＡ）ティルに結
合するためのポリ（ｄＴ）配列を持つ第２のポリヌクレ
オチドを含む。マグネティックビーズは実施例１と同様
固体相として用いられた。第２のポリヌクレオチドは実
施例１で記述されているようにマグネティックビーズに
結合された。

【００５９】大腸菌のためのアッセイ様式の感度は以下
のように決定された。大腸菌の細胞抽出液を２．５ＭＧ
ｕＳＣＮ中で、アッセイ当り１０⁸，１０⁷，１０⁶，１
０⁵，１０⁴，１０³ １６ＳｒＲＮＡの細胞当量に段階
的に希釈した。捕獲プローブの第１ポリヌクレオチドを
２．５ＭＧｕＳＣＮ緩衝液にアッセイ当り約２×１０¹²
分子の濃度になるように加えた。検出プローブのビオチ
ン化された合成ＤＮＡ片を２．５ＭＧｕＳＣＮ緩衝液に
アッセイ当り約１０¹²分子の濃度になるように加えた。
各希釈液の全量はこれで約１００μｌとなった。各希釈
液を３７℃で６０分間インキュベートし、ＤＮＡ−ｒＲ
ＮＡ−ポリヌクレオチド複合体を形成させた。

【００６０】次にこの希釈液の５０μｌサンプルを１２
ｍｍ×７５ｍｍのポリプロピレン試験管に移した。ポリ
（ｄＴ）で被覆された１００μｌのビーズ（０．１％固
体、実施例１のように前処理されたもの）を各試験管に
加えた。この試験管を３７℃で１５分間振とうしながら
インキュベートした。その後ビーズを溶液から分離して
洗浄緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ，０．１Ｍトリス（ｐ
Ｈ７．５）、０．５％ＢＳＡ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２
０）で３回洗浄した。各セットのビーズを洗浄緩衝液中
で１μｇ／ｍｌのストレプトアビジン２００μｌと混合
し室温で１０分間インキュベートした。

【００６１】このビーズは再び溶液から分離され、洗浄
緩衝液で３回洗浄を行った。洗浄緩衝液２００μｌ中に
いる１０⁹ｐｆｕのビオチン化φｘ１７４Ｊ−Ｆ−ｉｎ
ｓ６を１００μｌのビーズアリコートに加えた。この溶
液を３７℃で３０分間振とうしながらインキュベート
し、ビーズを分離して、０．５ｍｌの洗浄緩衝液で５回
洗浄した。

【００６２】プロメガ・バイオテク（Ｐｒｏｍｅｇａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ）社（ウィスコンシン州マジソン Ｍａ
ｄｉｓｏｎ）のＲＱＩ２０単位のＤＮＡｓｅ，２００μ
ｌ緩衝液（０．０１Ｍ ＮａＣｌ、０．０４Ｍトリス、
０．００６Ｍ ＭｇＣｌ₂）中をビーズと合わせて３７
℃で２０分間インキュベートした。ビーズをとり除き、
上澄を細菌層上のプラーク形成によって力価を測定し
た。各希釈液から得られた結果は以下の通りである： 大腸菌 細胞当量／アッセイ φＸ１７４力価／アッセイ シグナル：ノイズ ５×１０⁷ ４．０×１０⁵ １８１：１ ５×１０⁶ １．２×１０⁴ ５：１ ５×１０⁵ ５．２×１０⁵ ２３６：１ ５×１０⁴ ３．５×１０⁵ １５９：１ ５×１０³ ２．４×１０⁴ １１：１ ５×１０² ８．０×１０⁴ ３６：１ ０ ３．２×１０³ − このアッセイは約５００大腸菌細胞当量または標的約４
×１０^-17モルまで感度があった。

【００６３】実施例４ 実施例４はマイクロタイター・ウェル・アッセイの形式
でリステリア・イノキュアを検出するための発明を説明
する。この形式では少なくとも病原菌１０細胞を検出す
ることが可能である。

【００６４】ベクターは実施例１および２で用いられ
た、遺伝的に改良されたＭ１３ＳＯＣ５１２バクテリオ
ファージである。実施例１および２におけるビオチンの
代わりに、抗蛍光抗体のＦ（ａｂ′）モノマーがファー
ジの表面に結合された。１０¹⁴ｐｆｕのファージを３．
４ｍｇのスルホ−Ｎ（４−カルボキシシクロ−ヘキシル
メチル）マレイミドと５ｍｌのリン酸緩衝液中でインキ
ュベートして、まずファージをマレイミドでラベルし
た。生成物はセファデックスＧ２５クロマトグラフィー
で精製された。抗蛍光抗体のＦ（ａｂ′）₂は標準的な
ペプシン分解のプロトコールによって調製された。２量
体断片は、おだやかな酸性（０．１Ｍ酢酸ナトリウム、
０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）条件下で０．０１５
Ｍジチオスレイトールとインキュベートしてモノマーに
した。０．１ｍｇのＦ（ａｂ）′モノマーを１０¹²ｐｆ
ｕの改良ファージと２５℃で１晩、８ｍｌのリン酸緩衝
液中でインキュベートした。生成物はセシウム・クロラ
イド密度勾配遠心（１０ｍｌ、０．４４ｇ、ＣｓＣｌ／
ｍｌ、１５０，０００×ｇで２０時間）によって精製さ
れた。ファージ画分をリン酸緩衝液に充分透析した。

【００６５】検出プローブを市販のＴ７ＲＮＡポリメラ
ーゼ転写キット（プロメガ Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィス
コンシン州マジソンＭａｄｉｓｏｎ）を用いて製造元の
指示に従って調製した。アリルアミン（Ａｌｌｙｌａｍ
ｉｎｅ）−ＵＴＰ（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー
（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）社）を反応液内でＵＴＰに置換させた。
ＲＮＡ転写物２．５μｇを０．４ｍｇのフルオレセイン
・イソチオシアン酸（モレキュラー・プローブＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州ユージーン
Ｅｕｇｅｎｅ）と２００μｌのホウ酸緩衝液（０．１Ｍ
ホウ酸、ｐＨ８．５）中で３７℃、２．５時間インキュ
ベートしてＲＮＡ転写物の蛍光ラベルを行った。

【００６６】捕獲プローブは７１３ヌクレオチドのビオ
チン化ＲＮＡおよびリステリア・イノキュアのリボソー
ムＲＮＡの６７４から１３８７塩基に相補な塩基を含
む。このプローブはプロメガ社のＴ７ＲＮＡポリメラー
ゼ転写キットを用いて調製された。ビオチン−１１−Ｕ
ＴＰ（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー社）が反応液
中でＵＴＰと置換した。

【００６７】マイクロタイター・ウェルの壁がアッセイ
に用の固体相として使用された。マイクロメンブレン
（Ｍｉｃｒｏｍｅｍｂｒａｎｅ）社（ニュージャージー
州、ニューアーク Ｎｅｗａｒａｋ）のコバインド（Ｃ
ｏ Ｂｉｎｄ）マイクロタイター・ウェルが使用され
た。ストレプトアビジンを以下のようにマイクロタイタ
ー・ウェルに共有結合させた。ストレプトアビジンのリ
ン酸緩衝液溶液が各ウェルに加えられた（０．１ｍｌ、
５ｍｇ／ｍｌ）。この緩衝液は０．１Ｍリン酸／０．１
Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５に作られたものである。ウェ
ルを室温で３時間インキュベートし、その後リン酸緩衝
液０．１５ｍｌずつ３回洗浄した。各ウェルに０．２ｍ
ｌのトリス−塩酸／ＮａＣｌ（０．１Ｍ／０．１Ｍ、ｐ
Ｈ８．０）を加えてウェルを過剰のアミノ基でブロック
し、２５℃で１晩インキュベートした。このウェルをそ
れからリン酸緩衝液０．１５ｍｌずつ、３容量で洗浄
し、使用まで４℃にて湿らせたまま保存した。

【００６８】リステリア・イノキュアのためのアッセイ
の感度は以下のように決定された。リステリア・イノキ
ュアの細胞抽出液をファクター１０で１０細胞／ｍｌま
で減少させた濃度に段階的に希釈した。ＲＮＡ−ｒＲＮ
Ａ−オリゴヌクレオチド複合体を実施例１の手順に従っ
て各希釈液で調製した。

【００６９】複合体の０．１ｍｌアリコートを個別のマ
イクロタイター・ウェルに加え２５℃で１時間インキュ
ベートした。洗浄緩衝液（０．１Ｍトリス、０．５Ｍ
ＮａＣｌ、０．５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、
ｐＨ７．５）で３回ウェルを洗浄した。１００μｌ洗浄
緩衝液中の抗蛍光Ｆ（ａｂ′）抗体が付着しているＭ１
３ＳＯＣ５１２バクテリオファージ１０¹⁶ｐｆｕを各ウ
ェルに加え、２５℃で６０分間インキュベートした。ウ
ェルは上記の通り洗浄された。リボヌクレアーゼＡ（１
μｇ）を加え、６０分間インキュベートした。

【００７０】各テスト溶液のアリコート（５０μｌ）を
宿主大腸菌（５０μｌ）に加えた。この培養菌を３７℃
で２時間発育させた。次に２ＹＴ培養液溶液の０．０４
％Ｍデカナール２００μｌを加えた。マイクロタイター
・ウェルを暗室で５分間ポラロイドフィルムにさらして
発光を記録した。発光はバックグランド・ノイズ以上
で、即ちアッセイ当り１０細胞当量濃度または約８×１
０^-19モルのｒＲＮＡまで認識できた。

【００７１】実施例５ この実施例はまたマイクロタイター・ウェル・アッセイ
の形式でリステリアモノサイトジェン（Ｌｉｓｔｅｒｉ
ａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を検出するための発
明を説明する。標的はこの病原体の１６ＳｒＲＮＡであ
る。ベクターはこれまでの例で用いられたものと同じＭ
１３ＳＯＣ５１２である。

【００７２】検出プローブはビオチン、ストレプトアビ
ジン、そして大腸菌１６ＳＲＮＡの６７４から１３８７
塩基に相補な合成ポリヌクレオチド鎖を含む。このポリ
ヌクレオチド鎖は標準的な技法を用いて調製された。ビ
オチンは標準的技法を用いてこの鎖に結合された。スト
レプトアビジンを以下のようにしてまずファージに結合
した。ファージを最初に０．２ＭのＭＯＰＳ緩衝液（３
−［Ｎ−モリフォリノ］プロパン スルホン酸ｐＨ７．
４）中のスルホサクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミ
ドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレース（Ｓ
ｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ； イリノイ州ロックフォード Ｒ
ｏｃｋｆｏｒｄ ピアス ケミカル Ｐｉｅｒｃｅ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ社）と室温で１時間反応させた。ＳＭＣ
Ｃ：ファージのモル比は５００：１であった。このＳＭ
ＣＣ−ファージ結合体をセファデックスＧ−２５クロマ
トグラフィーにかけ未反応のＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣと分
離した。Ｎ−サクシンイミド３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ；ピアス・ケミカル Ｐｉ
ｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を０．２Ｍ ＭＯＰＳ
中のストレプトアビジン（キャルバイオケム Ｃａｌｂ
ｉｏｃｈｅｍ社、カルフォルニア州、ラホヤ Ｌａ Ｊ
ｏｌｌａ）と室温で１時間混和した。ＳＰＤＰのストレ
プトアビジンに対するモル比は１００：１であった。こ
の反応混合液はセファデックスＧ−２５クロマトグラフ
ィーで精製された。ジチオスレイトール（シグマケミカ
ル Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を溶出したタン
パクに最終濃度５０ｍＭで加えた。この還元されたスト
レプトアビジン−ＳＰＤＰ結合体をセファデックスＧ−
２５カラムを通過させて精製を行った。ＳＭＣＣ−ファ
ージをストレプトアビジン−ＳＰＤＰ（モル比１：５
０）と４℃で１６時間反応させた。ストレプトアビジン
化したファージをそれからセシウム・クロライド密度勾
配（０．４４ｇ／ｍｌ；２０時間、１５０，０００×
ｇ，４℃）で精製し、０．２ＭのＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ
７．５に対して透析し、使用まで４℃にて保存された。

【００７３】捕獲プローブは実施例１で用いられたもの
と同じ、ｄＡティルを持つ３５塩基核酸と、４０００塩
基のｄＴホモポリマー（ｄＴ４０００；メリーランド州
ベセスダ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、スーパーテクス Ｓｕｐ
ｅｒｔｅｃｈｓ社）から成る。バージニア州チャンテリ
ー Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ダイナテク Ｄｙｎａｔｅｃ
ｈ社のイミュロン２（ｉｍｍｕｌｏｎ２）マイクロタイ
ター・ウェルにｄＴ４０００（１００μｇ／ｍｌ、１．
５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ ＭｇＣｌ₂、０．２５Ｍト
リス−塩酸、ｐＨ７．５中）２５０μｌを加え、３７℃
で１晩インキュベートしてｄＴ４０００を付着した。残
存するｄＴ４０００溶液を除いた後、ウェルを３７℃で
１５から３０分間乾燥させ、ＵＶ光を４分間あてて洗浄
緩衝液（１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍトリス−塩酸、ｐＨ
９．３、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．１％Ｔｗｅｅｎ２
０）で３回洗浄した。

【００７４】このウェルは３７℃で１時間、１．０Ｍ
ＮａＣｌ、０．２Ｍトリス−塩酸、ｐＨ７．５、０．０
４Ｍ ＥＤＴＡ、２．５％ウシ血清アルブミン（ファク
ターＶ ＢＳＡ）、０．５％サルコシル（Ｓａｒｋｏｓ
ｙｌ）（シグマ ケミカルＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ社）、１０μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡ（ベセスダ・リ
サーチ・ラボ社）で処理された。

【００７５】このアッセイの感度は以下のように決定さ
れた。個別の１．５ｍｌポリプロピレン試験管にリステ
リア・モノサイトジェン１０００，１０，１，０．１細
胞当量からの抽出液と、捕獲プローブのｄＡ−ティルを
持つオリゴヌクレオチド１００ｎｇ、検出プローブのビ
オチン化ポリヌクレオチド鎖５０ｎｇを加えた。試験管
内容物の容量を０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍトリス−
塩酸（ｐＨ７．５）溶液を加えて２００μｌとした。試
験管を６５℃で３０分間温めハイブリダイゼーションを
行わせた。

【００７６】ハイブリダイゼーションに続いて、各試験
管に１０⁹ｐｆｕのストレプトアビジン化バクテリオフ
ァージを加えた。それから試験管を３７℃で６０分間、
振とうしながらインキュベートした。各試験管の内容物
を個別のｄＴ４０００で被覆されたマイクロタイター・
ウェルに移し、３７℃で６０分間おだやかに振とうしな
がらインキュベートした。ウェルの内容物はその後洗浄
緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ ０．１Ｍトリス−塩酸、
ｐＨ７．５）で洗浄された。内容物をそれからマイクロ
タイター・ウェルからファージを分離するためＲＰ１Ｄ
Ｎａｓｅ（プロメガ Ｐｒｏｍｅｇａ社）２０単位を含
む２００μｌの０．０１Ｍトリス−塩酸、０．０４Ｍ
ＮａＣｌ、０．００６Ｍ ＭｇＣｌ₂、ｐＨ７．５とイ
ンキュベートした。インキュベーションは３７℃で３０
分間行われた。

【００７７】各混合液のアリコート（１００μｌ）を、
０．５ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトサイ
ド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃ
ｔｏｓｉｄｅ ＩＰＴＧ）を含むＴＹＥ培養液中で発育
した中間ログ相にある大腸菌ＪＭ１０１培養液の２００
μｌ容量に加えた。この混合液を室温で１０分間インキ
ュベートした。それから混合液を同じＴＹＥ培養液２ｍ
ｌで更に希釈し、３７℃で２．５時間、激しく振とうし
ながらインキュベートした。デカナール（１０μｌ，
０．２％）を各混合液の１００μｌサンプルに加え、結
果として出る蛍光を測定した。各希釈における結果は次
の通りである。 リステリア 発光出力 細胞当量 （発光カウント／秒） シグナル：ノイズ １０００．０ ９．６６×１０⁴ ６．０：１ １０．０ ６．６２×１０⁴ ４．１：１ １．０ ４．０２×１０⁴ ２．５：１ ０．１ ３．２０×１０⁴ ２．０：１ ０．０ １．６１×１０⁴ − このアッセイは約０．１細胞当量または標的約８×１０
^-21モル以下に対して感度を示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウヴェ・リヒャルト・ミュラー アメリカ合衆国イリノイ州60545，プラノ, リバー・ロード 11714 (72)発明者 ダクラス・ジェームズ・タロン アメリカ合衆国イリノイ州60120，エルギ ン，リバー・ブラフ・ロード 469

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 標的の存在の有無またはその濃度決定の
   アッセイにおいて使用する、自己増幅シグナル産生部で
   あって、該自己増幅シグナル産生部は （ａ） 宿主に受け入れられ、かつそこで再産生可能な
   ベクターで、該ベクターは活性のあるバクテリオファー
   ジ、ウィルス、プラスミド、またはそれらの断片であ
   り；そして （ｂ） 該ベクターと、上記アッセイの標的に結合能を
   もつ検出プローブを含む。
2. 【請求項２】 上記検出プローブが、抗体、ストレプト
   アビジン、アビジン、ビオチン、オリゴヌクレオチド、
   Ｆａｂ断片、Ｆａｂ′断片、Ｆ（ａｂ′）₂断片から成
   るグループから選ばれた１またはそれ以上の成分から成
   る請求項１記載の自己増幅シグナル産生部。
3. 【請求項３】 上記ベクターがポリペプチドをコードす
   る請求項１記載の自己増幅シグナル産生部。
4. 【請求項４】 上記ベクターが活性のあるＭ１３または
   φＸ１７４バクテリオファージである請求項３記載の自
   己増幅シグナル産生部。
5. 【請求項５】 上記検出プローブが、抗体、ストレプト
   アビジン、、アビジン、ビオチン、オリゴヌクレオチ
   ド、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ′断片およびＦ（ａｂ′）₂断
   片から成るグループから選ばれた１またはそれ以上の成
   分から成る請求項３記載の自己増幅シグナル産生部。
6. 【請求項６】 上記ポリペプチドがルシフェラーゼ（ｌ
   ｕｃｉｆｅｒａｓｅ）酵素である請求項３記載の自己増
   幅シグナル産生部。
7. 【請求項７】 標的分子の存在の有無またはその濃度を
   決定する方法であって、 （ａ） ベクターは活性のあるバクテリオファージ、ウ
   ィルス、プラスミド、またはそれらの断片から成るグル
   ープのうちの１つであり、宿主に受け入れられ、かつそ
   こで再産生可能であり、また検出プローブは該ベクター
   と該標的分子に結合能を有する、ベクターおよび検出プ
   ローブを、上記標的分子を試験するためのサンプルと接
   触させ； （ｂ） ベクター−検出プローブ−標的複合体を形成さ
   せる； （ｃ） 上記ベクター−検出プローブ−標的複合体を複
   合体未形成のベクター、検出プローブ、標的から分離
   し； （ｄ） 上記分離されたベクター−検出プローブ−標的
   複合体からのベクターを、該ベクターが複製能を持つよ
   うな宿主に導入し； （ｅ） 上記複製性のベクターにシグナルを産生させ；
   そして （ｆ） 上記シグナルを検出すること； の各工程を含む方法。
8. 【請求項８】 上記検出プローブが、抗体、ストレプト
   アビジン、アビジン、ビオチン、オリゴヌクレオチド、
   Ｆａｂ断片、Ｆａｂ′断片およびＦ（ａｂ′）₂断片か
   ら成るグループから選ばれた１またはそれ以上の成分か
   ら成る請求項７記載の標的分子の存在の有無またはその
   濃度を決定する方法。
9. 【請求項９】 上記ベクター−検出プローブ−標的複合
   体が、上記複合体未形成のベクター、検出プローブ、標
   的から分離する前に固体相支持体に結合される請求項７
   記載の標的分子の存在の有無またはその濃度を決定する
   方法。
10. 【請求項１０】 上記ベクター−検出プローブ−標的複
    合体を上記固体相支持体に結合させるのに捕獲プローブ
    を使用する請求項９記載の標的分子の存在の有無または
    その濃度を決定する方法。
11. 【請求項１１】 上記捕獲プローブが、抗体、ストレプ
    トアビジン、アビジン、ビオチン、オリゴヌクレオチ
    ド、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ′断片、Ｆ（ａｂ′）₂断片か
    ら成るグループから選ばれた１またはそれ以上の成分か
    ら成り、上記固体支持相がマイクロタイター・ウェル、
    カップ、またはディップスティックである請求項１０記
    載の標的分子の存在の有無またはその濃度を決定する方
    法。
12. 【請求項１２】 上記ベクターがポリペプチドをコード
    する請求項７記載の標的分子の存在の有無またはその濃
    度を決定する方法。
13. 【請求項１３】 上記検出プローブが、抗体、ストレプ
    トアビジン、アビジン、ビオチン、オリゴヌクレオチ
    ド、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ′断片およびＦ（ａｂ′）₂断
    片から成るグループから選ばれた１またはそれ以上の成
    分から成る請求項１２記載の標的分子の存在の有無また
    はその濃度を決定する方法。
14. 【請求項１４】 上記ベクター−検出プローブ−標的複
    合体を、上記複合体未形成のベクター、検出プローブ、
    標的から分離する前に固体相支持体に結合させる請求項
    １２記載の標的分子の存在の有無またはその濃度を決定
    する方法。
15. 【請求項１５】 上記ベクター−検出プローブ−標的複
    合体を上記固体相支持体に結合させるのに捕獲プローブ
    を使用する請求項１４記載の標的分子の存在の有無また
    はその濃度を決定する方法。
16. 【請求項１６】 上記捕獲プローブが、抗体、ストレプ
    トアビジン、アビジン、ビオチン、オリゴヌクレオチ
    ド、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ′断片、Ｆ（ａｂ′）₂断片か
    ら成るグループから選ばれた１またはそれ以上の成分か
    ら成り、上記固体相支持体がマイクロタイター・ウェ
    ル、カップ、またはディップスティックである請求項１
    ５記載の標的分子の存在の有無またはその濃度を決定す
    る方法。
17. 【請求項１７】 上記ポリペプチドがルシフェラーゼ酵
    素である請求項１６記載の標的分子の存在の有無または
    その濃度を決定する方法。
18. 【請求項１８】 サンプル中の標的の存在の有無または
    その濃度を決定するためのアッセイキットであって； （ａ） 活性を持つバクテリオファージ、ウィルス、プ
    ラスミド、またはそれらの断片から成るグループのうち
    の１つで、シグナル産生能を持ち、宿主に受け入れられ
    てそこで再産生できるベクター； （ｂ） 該ベクターと該アッセイの標的に結合能を持つ
    検出プローブ; （ｃ） 該サンプルを該ベクターと該検出プローブに接
    近させる手段； （ｄ） 該標的に結合したベクターと検出プローブを該
    標的に結合していないベクターとプローブから分離する
    手段； （ｅ） 該分離された結合ベクターを受け入れ、そこで
    の再産生を許容できる宿主に導入する手段；から成るア
    ッセイキット。
19. 【請求項１９】 上記キットが上記ベクターを受け入
    れ、そこでの再産生を許容できる宿主を更に含む請求項
    １８記載のアッセイキット。
20. 【請求項２０】 上記ベクターがポリペプチドをコード
    する請求項１８記載のアッセイキット。