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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Detektieren von
Materialien, insbesondere ein Verfahren, bei welchem zwei oder mehr
Viruskomponenten an dem Material haften, welche dem Material eine detektierbare
Eigenschaft verleihen, durch die das Vorhandensein dieses Materials
detektiert und dessen Vorhandensein in einer Probe nachgewiesen
wird.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Es
existieren viele Techniken, um Proben zu analysieren um das Vorhandensein
eines Materials in dieser Probe zu detektieren. Beispielsweise können eine
chemische Analyse, chromatographische Techniken und spektroskopische
Techniken eingesetzt werden, um einzelne chemische Moleküle zu identifizieren.
Allerdings können
solche Techniken nicht ohne weiteres eingesetzt werden, um in einer
Probe vorhandene Organismen zu identifizieren.
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Nukleinsäureverfahren,
wie etwa eine Desoxyribonukleinsäure
(DNA)-Hybridisierung können
eingesetzt werden, um eine DNA oder eine Ribonukleinsäure (RNA)
zu detektieren. Allerdings haben diese Verfahren einen Mangel an
Empfindlichkeit. Vermehrungsverfahren, wie etwa die Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) können
eingesetzt werden, um Nukleinsäuretargets
zu vermehren, die dann detektiert werden können. Allerdings sind solche
Vorgehensweisen kompliziert und teuer, und sie sind spezifisch für das Detektieren
von Nukleinsäuren
vorgesehen.
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Immunverfahren,
wie etwa das Westernblotting (blotting = Auftupfen) oder ein Enzym-Immuntest
(EIA = enzyme immunoassay) oder ein enzymmarkierter immunabsorbierender
Test (ELISA) können
eingesetzt werden, um ein vorgegebenes Molekül, beispielsweise ein Protein
zu detektieren. Allerdings haben diese Verfahren Detektiergrenzen
in dem Bereich Picomol (pmol)/Liter bis Sub-Picomol/Liter, und sie
sind deshalb da nicht geeignet, wo ein sehr geringer Pegel des zu
detektierenden Materials vorliegt.
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Um
die Empfindlichkeit derartiger Detektierverfahren zu erhöhen, ist
vorgeschlagen worden, den detektierenden Antikörper mit radioaktiven Materialien,
Enzymen, Goldpartikeln oder Bakteriophagen zu markieren. Allerdings
sind diese Vorschläge
oft unspezifisch wegen der Nicht-Spezifität der Behaftung der Markierung an
dem Target oder anderen Materialien, die in der getesteten Probe
vorhanden sind.
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Es
wurde beispielsweise in der PCT-Anmeldung Nr. WO92/02633 vorgeschlagen,
Bakterien in einer Probe durch Behandeln der Probe in einem ersten
Kultivierungsschritt mit einem Virus oder Phagne zu identifizieren,
welcher für
das Bakterium, dessen Vorhandensein in der Probe man erwartet, spezifisch
ist und dieses infiziert. Die infizierte Probe wird sodann in einer
Weise behandelt, um jedwede exogene Phagenpartikel zu töten oder
zu entfernen, d.h. diejenigen, die die Bakterienzellen nicht infiziert
haben und so innerhalb der Zelle geschützt sind. Die verbleibenden
Bakterienzellen werden dann in einem zweiten Kultivierungsschritt
kultiviert, um die innerhalb der infizierten Bakterienzellen geschützten Phagenpartikel
zum Replizieren und Lysieren zu veranlassen. Das setzt eine neue
Generation von Phagenpartikeln in dem Kulturmedium frei. Diese können detektiert
werden, indem man den zweiten Kultivierungsschritt im Beisein von
weiteren der ers ten Bakterienzellen durchführt und die toten Bakterienzellen
detektiert, die mit jeder Replikation von Virenpartikeln innerhalb einer
infizierten Zelle gebildet werden. Alternativ dazu können die
durch das Lysieren der Viruspartikel freigesetzten Proteine durch
das Einfärben
von Proteinen oder durch andere Verfahren detektiert werden.
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Wenn
das erwartete Bakterium in der Anfangsprobe vorhanden ist, dann
werden in den infizierten Bakterienzellen Virenpartikel von der
ersten Kultivierung der Probe vorhanden sein, und sie werden in
dem zweiten Kultivierungsschritt detektiert werden. Wenn jedoch
die Probe das erwartete Bakterium nicht enthalten hat, dann würde in dem
ersten Kultivierungsschritt keine Infizierung der Probenzellen erfolgen,
so dass keine Virenpartikel zum Replizieren und Lysieren in dem
zweiten Kultivierungsschritt übertragen
würden.
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Diese
Technik ist als die Phagenvermehrungstechnik bekannt.
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In
einer Abwandlung der in der PCT-Anmeldung WO97/22713 vorgeschlagenen
Phagenvermehrungstechnik wird der zweite Kultivierungsschritt im
Beisein eines anfälligen
Bakteriums durchgeführt,
welches eine Replikationsrate hat, die größer als diejenige ist, die
in dem ersten Kultivierungsschritt eingesetzt wurde. Auf diese Weise
können
langsam wachsende Bakterien, beispielsweise das Mycobakterium Tuberkulosis
infolge des Beschleunigungseffektes des zweiten Kultivierungsschrittes
schnell detektiert werden.
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Allerdings
erfordern beide Varianten der Phagenvermehrungstechnik, dass ein
Virus, welches für
das erwartete Bakterium spezifisch ist und dieses infizieren kann,
verwendet wird, was den Bereich der Materialien ernsthaft begrenzt,
die identifiziert werden können,
und den Bereich von Virenpartikel, die verwendet werden können.
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Es
wäre nicht
nur erwünscht,
spezifische Organismen in einer Probe zu detektieren, sondern es
ist auch erwünscht,
einen weiten Bereich von anderen Materialien in Proben zu detektieren.
Beispielsweise wird oft gewünscht,
Schwermetalle und andere Schadstoffe im Wasser oder in Abfallprodukten
zu detektieren, um festzustellen, ob zwei oder mehr Materialien
miteinander in einer Weise in Wechselwirkung treten, die einen Benutzer
oder die Umwelt beeinträchtigen
könnte.
Insbesondere wäre
es erwünscht,
ein einfaches, jedoch effektives Mittel zu schaffen, um die Wirkung
eines Medikamentes oder eines pharmazeutischen Produktes auf einen
Organismus oder einen Gesundheitszustand festzustellen, die man
wünscht,
mit dem Medikament oder dem pharmazeutischen Produkt zu behandeln.
Homogene in-vitro-Immuntesttechniken, wie etwa Szintillationsannäherung und
Fluoreszenzpolarisation/Fluoreszenzquenching werden eingesetzt,
um über
molekulare Wechselwirkungen in Screeningtests zu berichten. Diese
Tests sind schnell und einfach auszuführen, haben jedoch im allgemeinen
eine geringe Empfindlichkeit. Das Hefe-Zwei-Hybridsystem wird als
ein in-vivo-Testsystem
eingesetzt, wobei in Wechselwirkung stehende Proteine als Beschleuniger
der Gen-Transkription wirkt, wodurch molekulare Wechselwirkungen
innerhalb der Zelle angezeigt werden. Allerdings kann diese Protein/Protein-Wechselwirkung durch
das dem Test unterzogene Medikament zerschlagen werden. Das Hefe-Zwei-Hybridsystem
verlangt auch, dass die Komponenten des Tests innerhalb der Hefezellen
synthetisiert werden. Das begrenzt den Bereich von molekularen Wechselwirkungen,
die beobachtet werden können.
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Ich
habe jetzt ein Verfahren gefunden, welches bei der Detektierung
eines weiten Bereiches von Materialien und den Pro dukten der Wechselwirkung
derartiger Materialien angewendet werden kann, um so eine Testtechnik
zu schaffen, die eine weit verbreitete Anwendung findet. Das Verfahren
gemäß der Erfindung
kann einen weiten Bereich von Markierungsmaterialien einsetzen,
um die zu detektierenden Materialien zu identifizieren, was dem
Benutzer eine Flexibilität
bei den eingesetzten Materialien gibt.
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Bei
dem Verfahren gemäß der Erfindung
werden zwei unterschiedliche Virenpartikel oder aktive Komponenten
eines Virus direkt oder indirekt als Markierungen an das zu detektierende
Material angelagert, das nachstehend als das Targetmaterial bezeichnet
wird. Diese Markierungen verleihen dem Targetmaterial charakteristische
Eigenschaften, welche das markierte Material von den Eigenschaften
eines jeden der Virenpartikel individuell unterscheiden. Das markierte
Material wird sodann auf das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein
dieser unterscheidenden Eigenschaften durch Kultivieren der markierten
Materialien im Beisein eines Bakteriums untersucht, welches durch
die beiden Viren infiziert werden kann.
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Der
Begriff Virus wird hier verwendet, um wahre Viren und Organismen
zu bezeichnen, welche Bakterien in einer Weise ähnlich einem wahren Virus infizieren.
Der Begriff Virus umfasst demnach:
- a) Komponenten
eines Virus, welche die Eigenschaften des Virus besitzen, von dem
sie abgeleitet sind;
- b) gepackte Phagemide, die Kreuzungen zwischen Plasmiden und
Viren sind und als Plasmide auf bakteriellen Wirten wachsen können, die
jedoch im Beisein eines Helfervirus gepackt und abgesondert werden können, als
ob sie Virenpartikel wären,
auch wenn sie nicht unabhängig
eine Virennachkommenschaft erzeugen können;
- c) Viren, die für
Bakterien lysogen sind und die in den Bakterien Nachkommenschaft
wachsen lassen, sich replizieren und erzeugen können, und zwar ohne Auflösung der
Bakterien, die auch weiterhin gedeihen und sich replizieren können.
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Wenn
eine Vireninfektion bakterieller Zellen durchgeführt wird, unter Verwendung
eines Überschusses an
Bakterien über
das hinaus, was erforderlich ist, um eine Parität zwischen den infizierenden
Viren und den infizierbaren bakteriellen Zellen zu erreichen, dann
ist es unwahrscheinlich, dass eine bestimmte Bakterienzelle von
mehr als einem Virenpartikel infiziert wird. Die Menge, bei der
eine solche zweifache Infektion in ausreichendem Maße so unwahrscheinlich
wird, dass dies die Ergebnisse des Bestimmungsverfahrens gemäß der Erfindung
nicht stört,
kann statistisch berechnet werden, und sie wird hier als die statistische
Menge bezeichnet. Eine solche statistische Berechnung kann durch
einfache Versuch- und
Irrtum-Tests bestätigt
werden.
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Bei
dem Verfahren gemäß der Erfindung
sind zwei Virenpartikel physikalisch durch das Targetmaterial aneinander
gebunden, und jedes kann so die gleiche Bakterienzelle infizieren,
so dass diese Zelle mit den beiden charakteristischen Eigenschaften
der infizierenden Viren versehen wird. Eine Bakterienzelle, die
von beiden Viren infiziert ist und die Summe der beiden charakteristischen
Eigenschaften besitzt, kann ohne weiteres von Zellen unterschieden
werden, die nur eine dieser Eigenschaften haben. Beispielsweise
können
die infizierten Zellen unter Bedingungen kultiviert werden, unter
denen die nur eine dieser Eigenschaften besitzenden Zellen nicht überleben
können,
beispielsweise beim Vorliegen von spezifischen Antibiotika oder
spezifischen Temperatur oder pH-Bedingungen. Die infizierten Zellen
mit beiden charakteristischen Eigen schaften überleben und werden sich replizieren.
Wenn lysogene Viren als die Markierungen eingesetzt werden, die
an das Targetmaterial angelagert werden sollen, dann werden sich
die Viren innerhalb der infizierten Bakterienzellen replizieren
und eine Virenpartikelnachkommenschaft erzeugen, die freigesetzt
wird und neue Zyklen von Infektion und Replikation beginnt. Beim
Vorliegen von markiertem Targetmaterial zeigt demnach eine Kaskade des
Bakterienwachstums an, dass das Targetmaterial in der Anfangsprobe
vorlag. Wenn kein markiertes Material in dieser Kultivierungsstufe
vorliegt, dann findet nur ein geringes oder kein bakterielles Wachstum
statt.
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EP-A-O
139 354 beschreibt ein Verfahren und eine Ausrüstung (engl.: kit) zum Bestimmen
des Vorliegens bzw. der Menge an Targetmolekülen. Bei diesem Verfahren werden
ein Vektor, welcher beispielsweise die Gene für die Luziferase-Enzyme enthält, und
ein Detektorteststoff (engl.: probe) zum Binden des Vektors und
des Targets aneinander mit einer Probe in Kontakt gebracht. Der
Vektor kann ein Virus sein, beispielsweise ein Bakteriophage, und
er kann von einem Wirtbakterium aufgenommen und reproduziert werden.
Der Vektor-Detektorteststoff-Targetkomplex
kann von nicht-koordinativ gebundenen Komponenten getrennt werden. Der
Vektor kann sodann für
eine Replizierung und anschließende
Detektierung in den Wirt eingebracht werden.
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Wie
oben bemerkt wurde, wird eine Trennung des virusmarkierten Targets
von überschüssigen Viren nötig.
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Demgemäss sieht
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Detektieren eines Targetmaterials
in einer Probe vor, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
- a) Miteinander verbinden von mindestens zwei
Viren durch das Targetmaterial, um ein virusgebundenes Targetmaterial
zu bilden und in Verbindung damit das virusgebundene Targetmaterial
mit einer unterscheidenden Eigenschaft auszustatten, die dem Targetmaterial
durch eines der Viren allein nicht verliehen wird; und
- b) Kultivieren des Produktes aus Schritt a) in Gegenwart eines
Indikatormaterials, an dem sich die Viren anlagern, die von dem
virusgebundenen Targetmaterial getragen werden, um das Indikatormaterial
zu veranlassen, die unterscheidende Eigenschaft des virusgebundenen
Targetmaterials anzuzeigen; und
- c) Überwachen
des Vorliegens oder Nichtvorliegens von virusbehaftetem Indikatormaterial.
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Die
Erfindung kann bei Proben angewendet werden, in denen das Targetmaterial
vorhanden ist, oder in denen es durch die Wechselwirkung von anderen
Komponenten innerhalb der Probe oder durch das Zusammenwirken einer
Komponente der Probe mit einer externen, hinzugefügten Komponente
erzeugt werden soll. Vereinbarungsgemäß soll der Begriff der ein
Targetmaterial enthaltenden Probe deshalb allgemein dazu verwendet
werden, ein Material zu bezeichnen, in welchem das Targetmaterial
von Anfang an vorhanden ist, oder in welchem das Targetmaterial
durch irgendeinen Mechanismus erzeugt wird.
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Das
Verfahren gemäß der Erfindung
kann dazu eingesetzt werden, das Vorhandensein und die annähernde Menge
oder Konzentration des Targetmaterials in der Probe zu bestimmen,
und es kann durchgeführt werden,
um eine quantitative Bestimmung des Targetmaterials zu bieten.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG:
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Demnach
bietet die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Detektieren eines
Targetmaterials in einer Probe an, wobei das Verfahren die Schritte
umfasst:
- a) eine Probe, bei der man erwartet,
dass sie dieses Targetmaterial enthält, wird zwei oder mehr Viren
ausgesetzt, welche fähig
sind, sich direkt oder indirekt an das Targetmaterial zu binden,
um so ein virusgebundenes Targetmaterial zu bilden und dem virusgebundenen
Targetmaterial eine unterscheidende Eigenschaft zu verleihen; und
- b) Kultivieren des Produktes aus dem Schritt a) in Gegenwart
eines Indikatormaterials, vorzugsweise mit einem über der
statistischen Menge liegenden Überschuss,
an das sich die von dem virusgebundenen Targetmaterial getragenen
Viren anlagern, um das Indikatormaterial zu veranlassen, die unterscheidende
Eigenschaft des virusgebundenen Targetmaterials anzunehmen; und
- c) Überwachen
des Vorliegens oder Nichtvorliegens von virusbehaftetem Indikatormaterial.
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Die
Erfindung kann bei Proben angewendet werden, in denen das Targetmaterial
vorhanden ist, oder in welchem es durch die Wechselwirkung von anderen
Komponenten innerhalb der Probe oder durch die Wechselwirkung einer
Komponente der Probe mit einer hinzugefügten externen Komponente erzeugt
werden soll. Vereinbarungsgemäß wird deshalb
der Begriff der ein Targetmaterial enthaltenden Probe allgemein
dazu verwendet, ein Material zu bezeichnen, in welchem das Targetmaterial
von Anfang an vorhanden ist, oder in welchem das Targetmaterial
durch irgendeinen Mechanismus erzeugt wird.
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Das
Verfahren gemäß der Erfindung
kann eingesetzt werden, um das Vorhandensein und die annähernde Menge
oder Konzentration des Targetmaterials in der Probe zu bestimmen,
und es kann ausgeführt werden,
um eine quantitative Bestimmung des Targetmaterials zu liefern,
und ebenso, um einfach das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein
des Targetmaterials zu detektieren. In einigen Fällen kann es möglich sein, die
Erzeugung von Targetmaterial in einer Probe durch Überwachen
der Entwicklung irgendeines sekundären Merkmals, beispielsweise
der Farbe, in dem Produkt aus dem Schritt b) zu überwachen. Vereinbarungsgemäß wird der
Begriff des Detektierens hier verwendet, um sowohl eine qualitative
als auch eine quantitative Bestimmung des Targetmaterials in einer
Probe zu bezeichnen, und die Detektierung kann intermittierend oder
kontinuierlich über
eine Zeitspanne oder als eine Einzelbeobachtung ausgeführt werden.
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Vorzugsweise
wird der Kultivierungsschritt b unter Bedingungen ausgeführt, unter
denen das virusbehaftete Indikatormaterial überlebt, unter denen jedoch
das Indikatormaterial, an das kein oder nur einer der Viren angelagert
wurde, nicht überlebt.
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Wie
oben angegeben wurde, ist es erforderlich, dass wenigstens zwei
unterschiedliche Viren an das Targetmaterial angelagert werden,
so dass Kultivierungsbedingungen für den Schritt b) ausgewählt werden können, die
sicherstellen, dass nur das Indikatormaterial mit den Eigenschaften,
die durch beide Viren verliehen werden, überleben. Typischerweise sind
die verwendeten Viren unterschiedliche Arten, deren jede dem virusgebundenen
Targetmaterial und demzufolge dem Indikatormaterial eine unterschiedliche
Eigenschaft mitgibt. Allerdings liegt es im Umfang der vorliegenden
Anmeldung, auch die gleiche Virusart zu verwenden und den Virus
unter Verwendung bekannter Techniken zu modifizieren, um erwünschte,
normalerweise in dem Virus nicht vorhandene Komponenten einzuführen und
so den Viren, die in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden,
die gewünschten
Eigenschaften zu verleihen. Beispielsweise kann ein Virus in bekannter Weise
behandelt werden, um einen Genotyp einzuführen, welcher eine Resistenz
gegen bestimmte Antibiotika verleiht. Das kann mit jedem der Viren
gemacht werden, die an das Targetmaterial gebunden werden sollen. Eine
derartige Modifizierung kann dazu dienen, andere Eigenschaften in
den Virus einzuführen,
beispielsweise Hitze- oder Lichtempfindlichkeit, so dass die Bedingungen,
unter denen die Kultivierung im Schritt b) ausgeführt wird,
einen weiten Bereich von Eigenschaften in dem Indikatormaterial
hervorrufen oder widerspiegeln können.
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Wie
oben angegeben wurde, wird der Virus an das Targetmaterial gebunden,
um so dem Targetmaterial wenigstens zwei verschiedene Eigenschaften
zu verleihen. Falls erwünscht,
können
dem Targetmaterial zusätzliche
Eigenschaften verliehen werden, die von den Viren oder zusätzlichen
Viren getragen werden, die ein Detektieren des virusbehafteten Indikatormaterials
ermöglichen
oder erleichtern. Beispielsweise kann ein dritter Virus an das Targetmaterial
gebunden werden, welcher dem virusgebundenen Targetmaterial photolumineszente
Eigenschaften verleiht. Das Vorliegen des virusgebundenen Targetmaterials
kann so ohne weiteres detektiert werden, indem man das Produkt aus
dem Schritt b) mit UV-, IR- oder sichtbarem Licht beleuchtet, um
zu bewirken, dass das den dritten Virus tragende Material leuchtet.
Alternativ dazu könnte
die Eigenschaft die Darstellung eines Enzyms sein, welches normalerweise
nicht von dem Indikatormaterial dargestellt wird, beispielsweise
B-Galactosidase, Luziferase oder Alkali-Phosphatase.
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Vereinbarungsgemäß wird die
Erfindung nachstehend am Beispiel einer Anbindung eines Virus beschrieben,
welches so modifiziert wurde, dass es einen Genotyp trägt, welcher
eine Resistenz gegen ein Antibiotikum A verleiht, und eines anderen
Virus, welches so modifiziert wurde, dass es einen anderen Genotyp trägt, der
eine Resistenz gegen ein Antibiotikum B verleiht.
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Die
Targetmaterialien können
Teil eines Virus, von Bakterien, Protozoen, eukaryotischen Zellen,
Pilzen oder anderen Organismen bzw. Organismusteilen sein. Allerdings
kann das Targetmaterial auch ein Rückstand von einem Organismus
sein, beispielsweise ein von dem Organismus ausgeschiedenes oder
erzeugtes Protein, ein Hormon, eine Nukleinsäure oder eine Säurensequenz,
ein Prion oder ein Antikörper.
Alternativ dazu kann, wie oben angegeben wurde, das Targetmaterial
eine Chemikalie sein, beispielsweise ein Medikament oder Biozid,
beispielsweise ein Pestizid, ein Herbizid oder ein Fungizid, deren
Wirksamkeit gegen spezifische Organismen bestimmt werden soll, oder
eine Chemikalie, die durch die Wechselwirkung von zwei anderen Materialien,
beispielsweise einem Hormon oder Protein, erzeugt wird und dessen
Anwesenheit in der Probe ein Maß für die Wirksamkeit
eines im Test befindlichen Materials bei der Verhütung oder
Unterstützung der
Erzeugung dieses Hormons oder Proteins angibt; oder eine organische
oder anorganische Verunreinigungs- oder Schadstoffchemikalie, deren
Vorhandensein beispielsweise in Wasser oder einem Produkt Gesundheits-
oder andere Schäden
hervorrufen könnte.
Wegen der Vielzahl von Komponenten, mit denen die Viren markiert
werden können,
kann die Erfindung über
einen weiten Anwendungsbereich eingesetzt werden, wo es erforderlich
ist, sehr niedrige Materialpegel, typischerweise weniger als etwa
100 Teile pro Million, zu detektieren.
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Das
Targetmaterial bietet idealerweise zwei Stellen, an denen ein Virus
sich direkt an das Targetmaterial binden kann. Ein solches Anbinden
des Targetmaterials kann direkt an den Virus erfolgen, beispielsweise über geeignete
Stellen auf der Oberfläche
des Virenpartikels, oder über
eine Stelle, die in bekannter Weise modifiziert wurde, um sich an
das Targetmaterial zu binden. Allerdings liegt es im Umfang der
vorliegenden Erfindung, irgendeines oder beide Viruspartikel über ein
Zwischen-Anbindungsmaterial oder einen Zwischenliganden zu binden,
beispielsweise ein Protein, eine Aminosäure, ein Lektin, ein Peptid,
einen Antikörper,
einen monoklonalen Antikörper,
eine Nukleinsäure
oder ein anderes Material, welche unterschiedliche Regionen des Targetmaterials
erkennen. Alternativ dazu kann die genetische Sequenz, welche die
Liganden kodiert, in das Virusgenom eingesetzt und auf der Oberfläche des
Virenpartikels dargestellt werden. Falls erwünscht kann die Stelle, an die
ein Virenpartikel gebunden werden soll, mit unterschiedlichen Hapten,
beispielsweise Biotin und Dinitrophenol (DNP) markiert und die unterschiedlichen
Virenpartikel mit Anti-Biotin- und Anti-DNP-Antikörpern vernetzt
worden sein, so dass die Virenpartikel zu den Anbindungsstellen
an dem Target selbst oder dem Liganden geführt werden.
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Der
Begriff des Anbindens des Virus an das Targetmaterial wird deshalb
hier verwendet, um ein Anlagern des Virus mit irgendwelchen Mitteln
an das Targetmaterial, sei es direkt oder indirekt, zu bezeichnen,
um so Stellen vorzusehen, welche die Aktivität des Virus aufrechterhalten,
das mit dem Targetmaterial operativ verbunden ist.
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Geeignete
Paarungen des Targetmaterials, des Virus und der Liganden können ohne
weiteres unter Verwendung bekannter Techniken und der Auswahlverfahren
aufgestellt werden, die durch einfache Versuch- und Irrtum-Tests
bestätigt
werden. Da die möglichen
Kombinationen von Viren und Liganden die Bildung eines weiten Bereiches
von Materialien ermöglichen,
welche sich an ein gegebenes Targetmaterial binden können, und
da ein weiter Bereich von Modifikationen bei unterschiedlichen Virusarten
erreicht werden kann, kann die Erfindung dazu eingesetzt werden,
ein virusgebundenes Target mit einem weiten Bereich von Targetmaterialien
zu bilden, die nicht allein auf Bakterien beschränkt sind, wie bei den Virusvermehrungs-Bestimmungstechniken,
die bisher vorgeschlagen wurden. Die Erfindung findet demnach eine
weit verbreitete Anwendung, wo immer es erwünscht ist, das Vorhandensein
eines Materials in einem weiten Bereich von Proben zu detektieren.
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Die
Anbindung des Virus oder des modifizierten Virus an das Targetmaterial
kann unter Verwendung eines weiten Bereiches von Verfahren und Materialien
ausgeführt
werden, abhängig
von der Natur des Targetmaterials. Typischerweise wird die Anbindung
durch Inkubieren einer Probe durchgeführt, die das gewünschte Targetmaterial
in Gegenwart der geeigneten Viren enthält, entweder in einem einzigen
Schritt unter Verwendung einer Mischung von Viren, oder in zwei
Schritten, wobei die Stellen, an die sich die Viruspartikel binden, nur
einen Virustyp akzeptieren. Die Inkubation wird typischerweise bei
einer Temperatur von 0 bis 60°C
in einem geeigneten flüssigen
Medium, insbesondere einem wässrigen
Medium ausgeführt.
Das Targetmaterial und das nicht gebundene Virus können in
Lösung
vorliegen, in Suspension in einer flüssigen Phase, oder sie können in
fester Form bzw. auf einem festen Träger gehalten vorliegen, beispielsweise
einer Nitrozellulose- oder Nylonmembran, einer Keramikfritte, festen
Kügelchen
(engl.: beads) oder dergleichen. Vereinbarungsgemäß wird die
Erfindung nachstehend in Verbindung mit der Verwendung eines wässrigen
Trägers
für das
Targetmaterial beschrieben. Eine solche Form des Targets kann durch
Auflösen
oder Suspendieren einer gefrier getrockneten oder anderen festen
Form des Virus- und Targetmaterials unter Verwendung bekannter Techniken
hergestellt werden.
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Die
Verwendung von zwei separaten Komponenten, deren jede ihren individuellen
Virustyp enthält,
die in eine Wechselwirkung treten und ein drittes Material bilden,
welches beide Virustypen enthält,
ist eine besonders bevorzugte Ausgestaltung, da diese ein schnelles
Screening (deutsch: Aussieben) von Drogen ermöglicht, die eine Wirkung auf
die Wechselwirkung haben.
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Die
Inkubation im Schritt a) wird durchgeführt, bis ein zufriedenstellendes
Verhältnis
der Virenpartikel an das Targetmaterial gebunden ist. Die optimalen
Bedingungen für
den Virusbindungsschritt hängt
von der Natur des Targetmaterials, der Virenpartikel und des Verfahrens
ab, welches verwendet wird, um das virusbehaftete Indikatormaterial
im Schritt b) zu detektieren. Typischerweise wird die Virusanbindung
von 5 bis 180 Minuten bei einer Temperatur von in der Nähe der Umgebungstemperatur
bis zu 60°C
dauern, und die optimale Zeitspanne sowie die optimalen Bedingungen
können
ohne weiteres für
jeden gegebenen Fall durch einfache Versuch- und Irrtumtests festgestellt
werden. Das optimale Ausmaß der
Virusanbindung an das Targetmaterial hängt von der Natur der in dem
Produkt aus dem Schritt b) zu detektierenden Eigenschaften und dem
erwarteten Pegel des virusgebundenen Targetmaterials in der Probe
ab, wird jedoch typischerweise eine Virusanbindung von wenigstens
25 %, vorzugsweise von 30 bis 60 % oder mehr des Targetmaterials
erreichen.
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Falls
erwünscht,
kann das virusgebundene Targetmaterial, welches im Schritt a) gebildet
wurde, aus der Mischung isoliert werden, in der es unter Verwendung
herkömmlicher
Isolations- und
Waschtechniken gebildet wurde. Allerdings wird das oft nicht nötig sein,
und das Produkt aus dem Schritt a) kann direkt als das Medium verwendet
werden, in welchem der Schritt b) ausgeführt wird. Allerdings kann eine
teilweise Trennung des virusgebundenen Targetmaterials von restlichen
freien Viruspartikeln durchgeführt
werden unter Verwendung beispielsweise der Filtration oder des Auffangens
mit paramagnetischen Kügelchen.
Der Waschvorgang kann mit Materialien durchgeführt werden, welche freie Virenpartikel
abtöten
oder unwirksam machen. Wo die Bindung der Virenpartikel an das Targetmaterial
ein Markieren des Targetmaterials mit einer Markierung, etwa Biotin,
einschließt,
kann alternativ dazu das virusgebundene Targetmaterial von den ungebundenen
Virenpartikeln unter Verwendung einer solchen Markierung, beispielsweise
mittels paramagnetischer Streptavidin-Kügelchen, isoliert werden. Ich
habe herausgefunden, dass eine derartige partielle Trennung oder
Isolierung des virusgebundenen Targetmaterials von restlichen, ungebundenen
Phagen die Empfindlichkeit und Besonderheit des Verfahrens gemäß der Erfindung
beim Detektieren oder Lokalisieren des Targetmaterials verbessert.
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Im
Schritt b) wird das virusgebundene Targetmaterial im Beisein eines
Indikatormaterials kultiviert, an welchem die von dem Targetmaterial
getragenen Virenanteile haften. Aufgrund der Tatsache, dass sie
von einem einzelnen Targetmolekül
oder -partikel getragen werden, haften die Virenanteile gleichzeitig
an dem gleichen Molekül
oder Partikel des Indikatormaterials, und sie verleihen diesem Molekül oder Partikel
beide unterscheidenden Eigenschaften, mit denen das Targetmaterial
ausgestattet ist. Es ist deshalb möglich, Moleküle oder
Partikel mit beiden Eigenschaften von Molekülen oder Partikeln zu unterscheiden,
die nur eine Eigenschaft haben.
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Die
Virenanteile können
an dem Indikatormaterial auf vielfache Weise haften. Beispielsweise
können die
Virenanteile bakterielle Indikatormaterialien infizieren; oder sie
können
während
der Kultivierung einen Genotyp darstellen, welcher an dem Indikatormaterial
haftet, um diesem die unterscheidenden Eigenschaften zu verleihen.
Allerdings muss der Transfer der charakteristischen Eigenschaften
von dem virusgebundenen Targetmaterial auf das Indikatormaterial
nicht den Eintritt der Virenpartikel in die Zelle des Indikatormaterials
erfordern. Die Viruspartikel können
demnach ihre Eigenschaften übertragen,
indem sie an der Außenseite
des Indikatormaterials angelagert werden.
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Vereinbarungsgemäß wird die
Erfindung nachstehend mit Bezug auf den Fall beschrieben, in welchem die
von dem Targetmaterial getragenen Virenanteile die bakteriellen
Zellen im Schritt b) infizieren und innerhalb der infizierten Zellen
geschützt
sind, um die unterscheidenden Eigenschaften auf die infizierten
Zellen zu übertragen.
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Der
Schritt b) kann demnach ausgeführt
werden, indem man eine geeignete bakterielle Kultur zu dem Produkt
aus dem Schritt a) hinzufügt
und die Kultivierung und Infizierung der Bakterien unter Bedingungen durchführt, bei
denen nur die Bakterien, denen beide unterscheidenden Eigenschaften
mitgegeben wurden, überleben
oder in der Lage sind, sich zu replizieren. In der bevorzugten Ausgestaltung
wird demnach die Kultivierung von Bakterien, wie etwa E.-Coli im
Beisein der beiden antibakteriellen Agenzien durchgeführt, denen die
von dem virusgebundenen Targetmaterial getragenen Virenanteile eine
Resistenz verleihen. Alternativ dazu wird die Kultivierung im Schritt
b) in Abwesenheit der Antibiotika durchgeführt, und die Antibiotika werden hinzugefügt, nachdem
die Kultivierung durchgeführt
wurde, um eine ohne weiteres zu detektierende Bakterienpopulation
zu erzeugen. Vereinbarungsgemäß wird die
Erfindung nachstehend mit Bezug auf eine Durchführung der Kultivierung der
Bakterien im Beisein der Antibiotika beschrieben, so dass deren
Effekt auf das Wachstum der Bakterienzellen in Realzeit detektiert
werden kann.
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Das
E.-Coli ist vorzugsweise in einer größeren Menge vorhanden, als
benötigt
würde,
um eine numerische Parität
zwischen den virengebundenen Targetmolekülen oder -partikeln und den
Bakterienzellen zu erzielen, und zwar vorzugsweise mit einem Überschuss über die
statistisch geforderte Menge. Die Verwendung eines Überschusses
des E.-Coli reduziert die Chance, dass eine einzelne Bakterienzelle
durch individuelle Partikel beider Viren infiziert wird, die in
dem Produkt aus dem Schritt a) verbleiben können. Wo die Bedingungen im
Schritt b) oder darauffolgend dem Überleben oder dem Wachstum
von lediglich einem der Virentypen stark entgegenstehen, mag es
allerdings nicht erforderlich sein, einen Überschuss des E.-Coli zu verwenden. Typischerweise
wird ein Überschuss
von 10 bis 300 % oder mehr des E.-Coli über die statistische Menge
verwendet, um die Produktion von Bakterienzellen zu minimieren,
die mit nur einem Virustyp infiziert werden, und um so eine Detektierung
der durch das virusgebundene Targetmaterial infizierten Zellen zu
unterstützen.
Darüber
hinaus wird, wie oben festgestellt wurde, bevorzugt, ungebundene
Virenpartikel aus dem Produkt des Schrittes a) zu entfernen, was
das Risiko einer Produktion von Bakterienzellen, die mit nur einem
Virustyp infiziert sind, weiter reduziert.
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Abhängig von
der Effizienz des im Schritt b) verwendeten Antibiotikum-Agens können die
durch nur einen Virus infizierten Bakterienzellen absterben, oder
sie mögen
nicht wachsen und sich nicht replizieren. Wenn lysogene Viren verwendet
werden, dann können
doppelt infizierte Zellen eine Virusreplizierung bewirten. Die replizierten
Virenpartikel von solchen Zellen können deshalb weitere Zellen
infizieren und sich replizieren, so dass eine Kaskade von Infektion,
Replizierung und Freisetzung von Virenpartikeln verursacht werden
kann. Das hat die Wirkung, den Effekt des Wachstums der doppelt
infizierten Zellen zu verstärken.
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Das
Wachstum der doppelt infizierten Zellen kann unter Verwendung jeder
geeigneten Technik überwacht
werden. Beispielsweise kann eine Kultivierung der Bakterien fortgesetzt
werden, bis signifikante Populationen der doppelt infizierten Zellen
für das
nackte Auge sichtbar werden. Wo eine der dem Targetmaterial verliehenen
Eigenschaften es erlaubt oder wo ein dritter Virus an das Targetmaterial
gebunden wurde, kann alternativ dazu das Wachstum der doppelt infizierten
Zellen mit kolorimetrischen, fluoreszenten oder lumineszenten Mitteln überwacht
werden. Falls erwünscht,
können
die Kultivierungsmittel ein Enzym oder andere Mittel beinhalten,
welche auf eine Chemikalie reagieren, die von den wachsenden Bakterien
freigesetzt wird, um die Eigenschaft zu verstärken, die von einem der von
den doppelt infizierten Zellen getragenen Viren verliehen wird.
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Die
unterscheidende Eigenschaft, die den doppelt infizierten Bakterienzellen
mitgegeben wird, variiert in ihrer Intensität entsprechend der Anzahl derartiger,
in der Kultivierungsmischung im Schritt b) vorhandenen Zellen. Diese
Intensität
kann verwendet werden, um eine Anzeige der Menge des Targetmaterials
in der originalen Probe zu geben, sowie dazu, zu zeigen, dass das
Targetmaterial in der getesteten Anfangsprobe vorhanden war.
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Falls
erwünscht
kann der Effekt des Hintergrundkoppelns von individuellen Phagenpartikeln
an das Targetmaterial und deren Detektierung im Schritt b) reduziert
werden, indem man ein oberflächenaktives Agens
verwendet, insbesondere ein nichtionisches, oberflächenaktives
Agens, wie es etwa unter der Markenbezeichnung Tween verkauft wird,
oder durch die Verwendung eines Protein-blockierenden Agens, wie
etwa Kasein oder Albumin in Mengen von jeweils 0,1 bis 0,5 % v/v
bzw. bis zu 5 % w/v in dem Kultivierungsmedium oder in den Waschfluiden
in den Schritten a) und/oder b).
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Wie
oben festgestellt wurde, kann das Verfahren gemäß der Erfindung bei einem weiten
Bereich von Targetmaterialien angewendet werden, und zwar wegen
der großen
Anzahl von Materialkombinationen, die eingesetzt werden können. Die
Erfindung findet demnach eine weit verbreitete Anwendung beim Testen
von Proben aus einem weiten Bereich von Ausgangsstoffen und für einen
weiten Bereich von Targetmaterialien. Die Targetmaterialien müssen keine
Organismen sein, wie es bei der Phagenvermehrungstechnik erforderlich ist;
sie könnten
vielmehr Chemikalien sein, beispielsweise aus der Auflösung eines
Virus abgeleitete Proteine; von lebenden Organismen erzeugte RNA
besser als Komponenten des Organismus selbst; Schwermetalle oder
andere Schadstoffe in Wassersystemen; oder Proteine oder Nukleinsäuren in
Lösung
bzw. an feste Trägermaterialien
gebunden, wie beispielsweise Polyamid-Membranen.
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Die
Erfindung findet auch Verwendung beim Bestimmen einer biologischen
Aktivität
von Materialien, indem man den Effekt dieses Materials auf eine
Unterdrückung
oder eine Förderung
des Wachstums von Bakterien oder anderen Organismen bestimmt. Ein
Organismus kann demnach beispielsweise einer im Test befindlichen
Droge ausgesetzt werden, und die Produktion von sekretiertem Protein
oder Boten-RNA kann überwacht
werden. Wenn die Droge wirksam ist, dann wird die Produktion von
Protein oder Boten-RNA in dem Punkt enden, in dem die Droge wirksam
wird, und dieses kann unter Verwendung irgendeiner geeigneten Technik überwacht
werden. Alternativ dazu kann die Droge ein Wachstum eines Organismus,
beispielsweise eines Pilzes oder einer Hefe sowie das nachfolgende
Wachstum dieses Organismus nach einer Behandlung mit der im Schritt
b) bestimmten Droge unterdrücken.
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Das
Verfahren gemäß der Erfindung
kann auch eingesetzt werden, um zu untersuchen, ob zwei oder mehr
Materialien in Wechselwirkung stehen, um sich zu verbinden oder
miteinander zu reagieren. In dieser Anwendung der Erfindung können die
zu untersuchenden Materialien jeweils als ein Targetmaterial für einen der
Phagentypen und die Produktion eines Produktes dienen, welches beide
Phagentypen trägt,
die verwendet werden, um zu zeigen, dass eine Wechselwirkung oder
Bindung der beiden Targetmaterialien stattgefunden hat. Demnach
können
Moleküle
von einem Material mit Phagen markiert werden, welche die Eigenschaft
A verleihen, und die Moleküle
des anderen Materials können
mit Phagen markiert werden, welche die Eigenschaft B verleihen.
Wenn die Materialien unter den Bedingungen, unter denen die Wechselwirkung
stattfinden soll, einander und der sich ergebenden Mischung ausgesetzt
werden, die wie im Schritt b) inkubiert wird, dann kann das Vorhandensein
von Molekülen
oder eines Produktes, dem beide Eigenschaften A und B verliehen wurden,
detektiert werden, wie oben beschrieben wurde. Diese Technik kann
angewendet werden, um die Wechselwirkung von zwei einfachen und/oder
komplexen Molekülen
zu detektieren, beispielsweise die Bindung eines Enzyms auf einem
Substrat, die Wechselwirkung von zwei Proteinen oder eines Proteins
und einer Nukleinsäure
beispielsweise beim Screening von Drogen. Falls erwünscht, kann
einem dritten Molekül
eine dritte Eigenschaft verliehen werden, indem man einen unterschiedlichen
Phagen verwendet, um einen mit allen drei Eigenschaften A, B und
C versehenen Komplex zu erhalten.
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Alternativ
dazu kann die Erfindung eingesetzt werden, um zu bestätigen, dass
keine Wechselwirkung stattfindet, beispielsweise wo eine Droge oder
ein anderes Material die Wechselwirkung verhindert, indem es sich
bevorzugt an eines der wechselwirkenden Moleküle bindet und so anzeigt, ob
es sicher ist, bestimmte Kombinationen von Materialien zu mischen
oder ob eine Droge einen Effekt auf eine erwartete Wechselwirkung
hat.
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In
diesen Fällen
wird die Erfindung eingesetzt, um das Vorhandensein oder das Fehlen
eines kombinierten Targetmaterials zu detektieren, welches durch
die Wechselwirkung von zwei individuellen virenmarkierten Komponenten
gebildet wurde, die sich verbinden und das Targetmaterial gemäß der Erfindung
bilden, welches die beiden Virenmarkierungen trägt. Der Begriff des Targetmaterials,
wie er hier verwendet wird, ist deshalb so auszulegen, dass er ein
einzelnes Material umfasst, welches mit beiden Virustypen markiert
ist und Materialien, welche mit einem der Virentypen markiert sind,
und die sich verbinden oder miteinander in Wechselwirkung treten,
um das beide Virentypen tragende Material zu bilden.
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Da
in der bevorzugten Ausgestaltung das Detektieren des Targetmaterials
ein Kultivieren von doppelt infizierten Zellen verwendet, ist es
möglich,
diese Kultivierung (Schritt b) fortzusetzen, bis die anfängliche
Menge derartiger Zellen um einen großen Faktor vermehrt worden
ist, beispielsweise um das 10- bis 108-fache.
Auf diese Weise kann ein sehr geringer Pegel des Targetmaterials
in der Anfangsprobe auf ein sehr großes Ausmaß vermehrt werden, was es möglich macht,
Pegel des Targetmaterials zu detektieren, welche auf andere Weise
mit konventionellen Techniken nicht detektierbar ist.
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Die
Erfindung sieht auch ein Bestimmungs-Kit für den Einsatz in dem Verfahren
gemäß der Erfindung vor,
wobei dieses Kit umfasst:
- a) zwei Phagenmaterialien,
welche in der Lage sind, sich an ein gemeinsames Targetmaterial
oder an zwei individuelle Komponenten, die sich verbinden und das
Targetmaterial bilden, zu binden, wobei diese Phagenmaterialien
dem Targetmaterial eine unterscheidbare Eigenschaft verleihen; und
- b) ein Indikatormaterial, welches für eine Kultivierung in einem
Wachstumsmedium geeignet und dazu ausgelegt ist, die unterscheidbare
Eigenschaft anzunehmen, die durch die Phagenmaterialien verliehen
wird.
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Vorzugsweise
ist das Indikatormaterial ein Bakterium, welches durch die Phagenmaterialien
infiziert werden kann. Es wird ferner bevorzugt, dass das Kit auch
ein Wachstumsmedium für
die Kultivierung des virusgebundenen Targetmaterials und des Indikatormaterials
umfasst. Es wird ferner bevorzugt, dass das Kit ein zusätzliches
Ingrediens umfasst, welches eine visuell detektierbare Anzeige des
Wachstums des durch die Phagenmaterialien infizierten Indikatormaterials
bietet.
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BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
AUSGESTALTUNGEN:
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Allgemeine Beschreibung:
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Die
Erfindung wird jetzt in einer Darstellung von bevorzugten Ausführungsbeispielen
derselben sowie in Bezug auf das Detektieren eines Targetmoleküls unter
Verwendung von zwei unterschiedlichen Viren, nämlich Virus A und Virus B,
beschrieben. Das Targetmolekül
kann ein Protein sein, welches sich in einer Lösung befindet oder an einen
festen Träger
gebunden ist.
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Die
Viren A und B sind Einzelstrang-Bakteriophagen-Ml3-Viren oder -Phagemide,
welche durch Einsetzen der Gene, welche jeweils eine Ampicillin-
und Kanamycinresistenz kodieren, modifiziert wurden. Falls erwünscht, können die
Viren durch Einsetzen der Gene modifiziert werden, welche den IgG-Bindungsbereich des
Proteins kodieren. Das ermöglicht
es, dass die Viren an jeden IgG-Antikörper gebunden werden, welcher für das Targetmaterial
spezifisch sein kann. Wenn das Targetmolekül sich in Lösung befindet, dann können jedes
Virus A und B oder beide weiter modifiziert werden, so dass sie
ein Maltose-Bindungspeptid oder ein Auto-Biotinylations-Peptid, oder kovalent
mit einem Hapten vernetzt, wie etwa Biotin, umfassen. Dies ermöglicht es,
dass das virusgebundene Targetmaterial durch Einfangen mit Streptavidin-
oder Maltose-derivatisierten paramagnetischen Kügelchen gewaschen wird, um
jedes ungebundene Virus zu entfernen. Dies erhöht die Empfindlichkeit und
Spezifität
des Verfahrens gemäß der vorliegenden
Erfindung.
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Das
Virus A und/oder B kann auch so modifiziert werden, dass es ein
Gen enthält,
welches eine detektierbare Marke kodiert, wie etwa ein Enzym beispielsweise
für eine β-Galactosidase
oder Luziferase, die eine kolorimetrische, fluoreszente oder lumineszente
Detektierung des virenbehafteten Indikatormaterials ermöglichen.
Falls erwünscht
können
das Virus A und das Virus B jeweils unterschiedliche Komponenten
der detektierbaren Marke enthalten, welche kompiliert werden und
bei einer Doppelinfizierung des Indikatormaterials in Funktion treten.
Ein spezifisches Beispiel davon ist die Darstellung einer β-Galactosidase infolge
einer LacZ-Ergänzung
von TG1-Zellen.
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Die
Darstellung der β-Galactosidase
erfolgt nur nach Infizierung der TG1-Zellen mit einem virusgebundenen
Targetmaterial, welches beide Ergänzungskomponenten des Lac-operon
trägt.
Die β-Galactosidase kann
detektiert werden unter Verwendung der Induktor-Isopropyl-β-Thiogalactopyranoside
und des Indikators Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-Galactosid in einem Agar-Medium.
Das Medium kann 4-Methylumbelliferyl-β-D-Galactose enthalten, welches
im Beisein von β-Galactosidase
fluoreszent oder lumineszent ist. Es liegt auch im Umfang der Erfindung,
die Änderungen
bei der Farbe oder der Farbintensität durch intermittierende oder
kontinuierliche Verwendung eines Spektrometers, eines ELISA-Lesers,
eines Luminometers oder Fluorimeters zu überwachen, um eine qualitative
Abschätzung
des in der Anfangsprobe enthaltenen Targetmaterials vorzusehen.
-
Bei
einer Abwandlung dieser Technik können zwei Komponenten, welche
in Wechselwirkung treten und eine dritte Komponente bilden, jeweils
individuell an einen unterschiedlichen Phagen gebunden werden, so
dass die dritte Komponente beide Phagentypen trägt und sodann unter Einsatz
des Verfahrens gemäß der Erfindung
detektiert werden kann. Diese Abwandlung findet eine spezielle Anwendung
beim schnellen Screening von Drogen, wo die Wirkung der Droge, die
Produktion der dritten Komponente zu verhindern oder zu vervielfachen,
dazu verwendet werden kann, eine schnelle Bestimmung dahingehend
durchzuführen,
ob die Droge wahrscheinlich einen nützlichen Effekt bei Bedingungen
hat, bei denen die ersten beiden Komponenten, beispielsweise Proteine,
vorhanden sind oder erzeugt werden.
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Bei
dem Verfahren gemäß der Erfindung
werden die Viruspartikel für
10 bis 120 Minuten bei einer Temperatur zwischen 4°C und 50°C mit der
Probe, in der das Targetmolekül
detektiert werden soll, inkubiert. Während dieser Inkubation werden
die Viren an die Targetproteinmoleküle in der Probe gebunden. Nach
dieser Inkubation kann die Probe entweder als die für den Kultivierungsschritt
b) vorgesehene verwendet oder, beispielsweise unter Verwendung eines
Perlauffangverfahrens, isoliert und gewaschen werden. Wenn die Probe an
einen festen Träger
gebunden ist, kann sie mit einer geeigneten Waschpufferlösung gespült werden.
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In
dem Kultivierungsschritt b) wird sodann ein Überschuss an Escherichia-Coli
(E.-Coli) über
der statistisch erforderlichen Menge in einem geeigneten Wachstumsmedium
hinzugefügt
und bei einer Temperatur zwischen 4°C und 50°C für 30 bis 720 Minuten inkubiert.
Das Wachstumsmedium enthält
sowohl Ampicillin als auch Kanamycin, so dass Bakterien, welche
nur durch eines der Viren infiziert worden sind, absterben oder sich
nicht replizieren, während
diejenigen, welche durch beide Viren A und B infiziert worden sind,
gegenüber diesen
Antibiotika resistent sind und sich replizieren. Das ermöglicht es
einem Beobachter, das Wachstum der Bakterienzellen in dem Kulturmedium
zu beobachten und sowohl das Vorhandensein von wachsenden Zellen als
auch die Anzahl derartiger Zellen in Realzeit zu bestimmen. Es ist
jedoch auch möglich,
die Antibiotika dem Kulturmedium nach einer geeigneten Inkubationsperiode
hinzuzufügen
und den Effekt des Antibiotikums auf die Zellenpopulation zu bestimmen.
Wenn das Antibiotikum nach dem anfänglichen Inkubationsschritt
hinzugefügt
wird, dann würde
eine weitere Inkubation von zwischen 2 bis 60 Minuten erforderlich,
um eine detektierbare Änderung
in dem inkubierten Material zu erzeugen.
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Bei
einer anderen bevorzugten Ausgestaltung für das Detektieren eines Moleküls, wie
etwa einer Nukleinsäure,
die sich in Lösung
befinden oder an einen festen Träger
gebunden sein kann, sind das Virus A und das Virus B Einzelstrang-Bakteriophage-M13-Viren
oder Phagemide, welche jeweils durch Einsetzen der Ampicillin- bzw.
Kanamycinresistenz kodierenden Gene modifiziert wurden. Die Viren
können
einer weiteren Abwandlung durch Anbindung an Nukleinsäure-Teststoffe
oder Peptid-Nukleinsäuresonden
unterworfen werden, wie unten beschrieben wird. Die Viren werden
für 30
bis 240 Minuten bei einer Temperatur zwischen 4°C und 60°C mit der Probe, in der das
Targetmolekül
detektiert werden soll, inkubiert. Während dieser Inkubation binden
sich die Viren an die Target-Nukleinsäuremoleküle in der
Probe.
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Nach
dieser Inkubation wird die virengebundene Nukleinsäure mit
einem Überschuss
an E.-Coli in einem geeigneten Wachstumsmedium bei einer Temperatur
zwischen 4°C
und 50°C
für 30
bis 480 Minuten inkubiert, und der Effekt der Antibiotika bestimmt,
wie oben beschrieben wurde.
-
Bei
der Detektierung von Nukleinsäuren
werden zwei oder mehr Nukleinsäure-Teststoffe
benötigt,
welche sich an die Target-Nukleinsäure binden.
Einzelkopie-Gensequenzen können
detektiert werden unter Verwendung von zwei Teststoffen für die gleiche
genetische Region oder das gleiche Gen; die Empfindlichkeit für diagnostische
Anwendungen kann jedoch erhöht
werden, indem man wiederholte oder sich wiederholende Sequenzen
in dem Genom des zu detektierenden Organismus anpeilt. Solche Wiederholsequenzen
können durch
die Bindung von mehr als einer Kopie einer einzelnen Teststoff-Spezies
an die Wiederholsequenzen detektiert werden. Wenn zwei Teststoffe
verwendet werden, dann können
sie mit den gleichen oder unterschiedlichen Hapten markiert werden,
d.h. beide Teststoffe können
mit Biotin markiert werden, oder ein Teststoff mit Biotin und der
andere mit Digoxigenin (Boehringer Mannheim, Lewes, UK, 1 093 088)
markiert werden. Nach der Anbindung (Hybridisierung) der Teststoffe
an die Target-Nukleinsäure
können
die Teststoffmoleküle,
die jetzt mit einem Zwischenraum vernetzt sind, über die von diesen getragenen
Hap tengruppen detektiert werden. Beispielsweise können der
Phage A und der Phage K verwendet werden, die zu Fragmenten von
Anti-Digoxigenin-Antikörpern
(Boehringer Mannheim, Lewes, UK, 1 214 67) oder Streptavidin konjugiert
wurden. Wenn ein einzelner Hapten, beispielsweise Biotin, verwendet
wird, um die Sonden zu markieren, dann können die beiden Phagen mit
dem gleichen Hapten-bindenden Molekül markiert werden, beispielsweise
mit Streptavidin. Diese Vorgehensweise kann für eine Detektierung von sich
wiederholenden, tandemartig wiederholten Molekülen angemessen sein, z.B. der
Lmet2-Sequenz von Leishmania donovani oder der 21-Basis-Paarwiederholung
von Plasmodium falciparum. Die Target-DNA kann aus dem Organismus
unter Verwendung einer geeigneten herkömmlichen Technik oder in Rohextrakten
oder Lysaten von Patientenproben präpariert und auf einer Membran,
beispielsweise Hybond N., Hybond N+ (Amersham International plc,
Amersham Uk) immobilisiert werden sowie vor der Detektierung unter
Verwendung standardisierter Verfahren (Amersham International plc,
Veröffentlichungen
P1/384/91/6 und P1/387/92/4 und Short Protocols in Molecular Biology,
zweite Ausgabe, Ausubel, FM et al eds. Green Publishing Associates
and John Siley & Sons.
1992) denaturiert werden. Alternativ dazu kann ein homogenes Testformat
verwendet werden; oder es kann gereinigtes DNA präpariert werden,
durch Restriktionsenzyme beschnitten werden, durch Elektrophorese
nach Abmessungen getrennt werden und vor dem Detektieren auf Nylonmembrane
immobilisiert werden.
-
TESTERGEBNISSE:
-
Präparierung der log Phase TG1
E.-Coli:
-
Minimale
Mediumplatten wurden präpariert,
wie in "Short Protocols
in Molecular Biology",
2. Ausgabe, herausgegeben von F.M. Ausubel et al., Green Publishing
Associates und John Wi ley and Sons, 1992 beschrieben. E.-Coli TG1
(Pharmacia Biotechnology, Cambridge, UK: Expression Module 27-9401-01)
wurde auf die minimale Mediumplatte aufgestrichen und über Nacht
bei 37°C
inkubiert, um einzelne Kolonien zu erzeugen, und sodann bei 4°C aufbewahrt.
Eine einzelne Kolonie wurde in 10 ml eines 2xYT-Mediums geimpft,
welches 17 g Bactotrypton (Difco 0123-17-3), 10 g Bacto-Hefeextrakt
(Difco 0127-17-19) und 5 g NaCl pro Liter enthielt, das 15 Minuten
lang autoklav behandelt worden war. Das geimpfte Medium wurde unter
Schütteln
bei 37°C
inkubiert, bis ein logarithmisches Wachstum erreicht wurde, OD660
nm von etwa 0,5.
-
Präparierung des Phagen K:
-
10 μl des log
Phase TG1, das wie oben beschrieben präpariert war, wurde 1 ml 2xYT
in einem 20 ml-Universal-Plastikbehälter zugesetzt. 108 Phage
M13K02 (Pharmacia, Expression module 27-1524-02) PFUS wurden dem Behälter zugesetzt,
und die Mischung wurde bei 37°C
60 Minuten lang inkubiert. 10 ml 2xYT, 50 μg/ml Kanamycin wurden zugesetzt,
und die Mischung bei 37°C
inkubiert, bis ein stationäres
Phasenwachstum erreicht war, und zwar etwa 5 Stunden. Zellen und
Zellendebris wurde durch Zentrifugieren entfernt, und der Überstand
durch einen 0,22 Mikron-Filter gefiltert. 2 ml einer 20 % w/v-Lösung von
PEG 8000 (Sigma P5413) und 2,5 M NaCl wurde der Phagensuspension
zugesetzt, und der Phage durfte sich über Nacht absetzen. Der Phage
wurde dann wiederholt zentrifugiert und resuspendiert, sodann in
1 ml PBS (Sigma 1000-3), 1 mM MgCl2 (Sigma
M2670) und 25 μM
Trypsin (als 6 μl
eines 2,5 % w/v Trypsin-Ausgangsmaterials: Sigma T4674) 60 Minuten
lang inkubiert, und der Phage wurde mit 200 μl von 20 % PEG 8000 und 2,5
M NaCl 10 Minuten lang bei Raumtemperatur ausgefällt. Der Phage wurde zentrifugiert
und mit PBS, MgCl2, PEG 800 und NaCl gewaschen.
Fluide wurden entfernt, und der Phage re suspendiert, um den das
Kanamycingenom tragenden aktiven Phagen zu erhalten.
-
Präparation des Phagen A:
-
Dieser
Phage wurde präpariert
unter Verwendung der oben für
den Phagen K beschriebenen Technik, mit der Ausnahme, dass der Phage
A pCANTAB 5E von Pharmacia Biotechnology, Expression module 27-9401-01
verwendet wurde, und dieser wurde mit Ampicillin (Sigma A2804) und
dem Helferphage M13K07 von Pharmacia Biotechnology, Expression module
27-1524-01 und sodann mit sowohl Ampicillin als auch Kanamycin (Sigma
K0879) inkubiert, so dass sich ein Phagemid ergab, welches eine
Ampicillinresistenz kodiert.
-
Alternativ
dazu kann der Phage A und der Phage K durch Ultrazentrifugierung
auf Caesiumchloridgradienten unter Verwendung der Technik präpariert
werden, die in Short Protocols in Molecular Biology beschrieben
wurde.
-
Beispiel 1
-
Detektierung
eines immobilisierten, Liganden-bindenden Moleküls unter Verwendung eines mit
einem Liganden markierten Phagen.
-
In
diesem Beispiel ist der verwendete Ligand Biotin, welches sich an
das Protein Streptavidin bindet. Ein Molekül des Streptavidin kann vier
Moleküle
des Biotin binden.
-
Die
Biotinylation des Phagen wurde unter Verwendung eines Biotinamidocaproat-N-Hydroxylsulfosuccinimid-Ester
(Sigma B2643) durchgeführt,
wie in dem Handbuch des Lieferanten beschrieben ist. Das optimale
Verhältnis
von Phage zu Biotin kann für
jeden Phage experimentell bestimmt werden. Der biotinylierte Phage wurde
durch eine Standard-Polyethylen-Glycol-Ausfällung gereinigt.
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Die
biotinylierten Phage K und Phage A wurden verwendet, um paramagnetische
Streptavidin-Kügelchen
zu detektieren. Die Kügelchen
waren zuvor durch Lichtmikroskopierung zu 2 × 105-Partikel pro μl unter Verwendung
eines Haemocytometers quantifiziert worden. Die paramagnetischen
Streptavidin-Kügelchen (Promega
Z5481) wurden gewaschen und präpariert,
wie durch die Lieferanten empfohlen. Kontrollkügelchen wurden durch Waschen
in der gleichen Lösung,
die 0,1 mM Biotin (Sigma B4501) enthielt, inaktiviert.
-
Die
Streptavidin- und die inaktivierten Kontrollkügelchen wurden in Serie zehnfach
verdünnt
und mit einer Mischung eines jeden der biotinylierten Phagen inkubiert.
Nachdem man erlaubt hatte, dass sich die Phagen an die Kügelchen
binden, wurden die Kügelchen
gewaschen und mit log-Phase TG1-Zellen inkubiert, um eine Phageninfektion
zu erhalten.
-
Nach
der Phageninfektion wurden die TG1-Zellen auf feste, Ampicillin
und Kanamycin enthaltende Medien abgeschieden, um so diese E.-Coli-Zellen,
welche doppelt infizierte Zellen gewesen waren, sowohl durch Phagen
A und Phagen K zu kultivieren, und die Anzahl der Kolonien wurde
gezählt
(siehe Tabelle 1). Der Test und die inaktivierte Kontrolle wurden
doppelt ausgeführt
(A und B), und die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 dargestellt. Tabelle
1
- ++ = zu viele um gezählt zu werden
-
Schlüsse:
-
Zwei
Phagen, welche unterschiedliche wählbare Eigenschaften innerhalb
ihres E.-Coli-Wirtes kodieren, können
in einer Probe verwendet werden, um ein Molekül zu detektieren, an das sie
sich mittels Liganden an der Phagenoberfläche binden. Die Ergebnisse
zeigen, dass dieses Testverfahren eine Empfindlichkeit von einer
so geringen Zahl wie 20 Streptavidin-Kügelchen
hat.
-
Beispiel 2
-
Detektierung
eines Liganden bindenden Moleküls
(Streptavidin) in einer homogenen Probe (ohne Waschen).
-
Reihenverdünnungen
von Streptavidin (Sigma 54762) wurden einer Mischung von biotinylierten
Phagen A und Phagen K zugesetzt, die wie im Beispiel präpariert
waren. Nach einer Inkubation, um es den Phagen zu ermöglichen,
sich an das Strepta vidin zu binden, wurden log-Phase TG1-Zellen
zugesetzt, um die E.-Coli-Zellen mit den Phagen zu infizieren.
-
Nach
der Infektion wurden die Zellen auf feste, Ampicillin und Kanamycin
enthaltende Zellen ausgefällt,
um nach doppelt infizierten Zellen zu selektieren, und die Anzahl
von Kolonien auf jeder Platte wurde gezählt, und die Ergebnisse sind
in der Tabelle 2 dargelegt: Tabelle
2
-
Schluss:
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass das Verfahren gemäß der Erfindung eine so geringe
Zahl wie 105 Moleküle oder 0,1 attomole Streptavidin
ohne Einfangen oder Waschen des Komplexes detektieren könnte. Eine Verhinderung
der Detektierung wurde bei höheren
Konzentrationen (1 femtomole) oder Streptavidin offensichtlich,
was eine allgemeine Beobachtung bei anderen Immuntesttechniken ist.
-
Beispiel 3:
-
Detektierung
eines Antigens mit Antikörper-markierten
Phagen.
-
Phage
A und Phage K wurden jeweils zu einem Anti-Kartoffel-Virus X-Antikörper (Agdia
Incorporated, Elkhart, Indiana 46514, USA) unter Verwendung von
Glutaraldehyd als Biokonjugat mittels des Verfahrens konjugiert,
welches in Bioconjugation, Mohammed Aslam und Alastair Dent, Eds.
1998, Macmillian Reference Ltd., London, UK ISBN 0-3330583752 beschrieben
ist. Die Konjugate wurden verdünnt
und in TBS, 1 mM MgCL2 bei 4°C aufbewahrt.
-
ELISA-Kits
zum Detektieren von Kartoffel-Virus X (Agdia, PathoScreen Kit PSP
10000/0288), positive Kontrollphiolen aus gefriergetrockneten, infizierten
Blattmaterialien (Agdia, LPC 10000) und negative Kontrollphiolen
aus gefriergetrocknetem Blattmaterial (Agdia, LNC 10000) wurden
von Agdia Incorporated bezogen.
-
Verdünnungen
von infiziertem Blattmaterial wurden zu Anti-Kartoffel X-Virus-Antikörper-beschichteten Mikrotiter-Plattenbehältern (engl.:
wells)(Agdia, PathoScreen Kit PSP 10000/0288) zugesetzt, um ein
Einfangen des Virenmaterials zu ermöglichen. Nach dem Einfangen
und Waschen wurden konjugierte Phagen A und Phagen K einem jedem
Behälter
zugesetzt und inkubiert, um ein Einfangen der Phagenpartikel zu
ermöglichen.
Die Behälter
wurden sodann gewaschen, und log-Phase TG1-Zellen wurden zugesetzt,
um eine Infektion der Zellen mit den konjugierten Phagen zu ermöglichen.
Nach der Infektion wurden die Inhalte eines jeden Behälters auf
feste, Ampicillin und Kanamycin enthaltende Medien ausgefällt, um
nach doppelt infizierten Zellen zu selektieren, und die Anzahl der Kolonien
auf jeder Platte wurde gezählt.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 dargestellt: Tabelle
3
- ++ zu viele Kolonien, um sie zu zählen, z.B. > 1000
-
Schlüsse:
-
Das
Verfahren gemäß der Erfindung
detektierte das Vorhandensein von Blattviren bei einer 10–3-Verdünnung des
positiven Kontrollblattmaterials.
-
Vergleichsbeispiel:
-
Vergleich
einer Ein-Phagen-, einer Zwei-Phagen- und einer ELISA-Vorgehensweise
zum Detektieren eines Virus.
-
Es
wurde dem gleichen Protokoll gefolgt, wie es im Beispiel 3 beschrieben
ist, mit der Ausnahme, dass eine Verwendung eines einzelnen konjugierten
Phagen (Phage K) mit einem Mix aus konjugierten Phagen A und Phagen
K zum Detektieren der verdünnten
Pflanzenextrakte verglichen wurde. Der Einzelphage K wurde zuletzt
auf Kanamycin enthaltende Agar-Platten ausgefällt, während der Phagenmix zuletzt
auf Kanamycin und Ampicillin enthaltende Agar-Platten in der üblichen
Weise ausgefällt
wurde. Nach der Inkubation, um eine Selektierung infizierter Zellen
zu ermöglichen,
wurde die Anzahl der Kolonien gezählt, und die Ergebnisse sind in
der Tabelle 4 dargestellt:
Den Anweisungen des Herstellers
folgend wurde eine Patho-Screen
Kartoffel-Virus-X-ELISA-Bestimmung parallel an den gleichen Verdünnungen
eines positiven Kontrollblattextraktes durchgeführt, und die Ergebnisse dieses
Tests sind auch in der Tabelle 4 dargestellt: Tabelle
4
-
Schluss:
-
Dieses
Experiment zeigt den Vorteil einer Verwendung der Zwei-Phagen-Vorgehensweise
im Vergleich zu einer Einzel-Phagen-Vorgehensweise.
Wenn der Phage K alleine verwendet wurde, gab es eine signifikante
Anzahl von Kolonien in der negativen Kontrolle. Die Zwei-Phagen-Vorgehensweise
reduziert das Hintergrundsignal, so dass die positiven Proben ohne
weiteres identifiziert werden, auch bei einer Verdünnung von
10–3.
Das Hintergrundsignal kann weiter durch die Verwendung eines oberflächenaktiven
Agens, beispielsweise des unter der Handelsmarke Tween 20 verkauften
Agens in einer Konzentration von 0,1 bis 0,5 % v/v und/oder eines
Rinderserumalbumins bei Konzentrationen von bis zu 5 % w/v in dem
Inkubations- oder Waschmedium reduziert werden.
-
Das
PathoScreen ELISA, wie es von den Herstellern geliefert wird, war
nicht so empfindlich wie das Verfahren gemäß der Erfindung.
-
Beispiel 4:
-
Eine
alternative Zwei-Phagen-Strategie zur Detektierung eines Virus.
-
Ein
Anti-Kartoffel-X-Virus-konjugierter Phage A oder Phage K (präpariert
wie im Beispiel 3) wurde verwendet, um Mikrotiter-Plattenbehälter (Greiner
Labortechnik Ltd., Cambridge, UK, 756061) zu beschichten. Verdünnungen
eines Pflanzenextraktes wurden in Phage-beschichteten Behältern eingefangen.
Nach dem Waschen wurde ein Phage/Antikörper-Konjugat (Phage A oder
Phage K) zu jedem Behälter
zugesetzt, derart, dass Phage A den Behältern zugesetzt wurde, welche
mit Phage K beschichtet waren, und umgekehrt. Nach einer Inkubation,
um ein Einfangen des Phagen zu ermöglichen, wurden die Behälter gewaschen,
und es wurde log-Phase TG1 zugegeben, um eine Infektion zu erreichen.
Nach der Infektion wurden die Inhalte eines jeden Behälters auf
feste, Ampicillin und Kanamycin enthaltende Medien ausgefällt, um
nach doppelt infizierten Zellen zu selektieren. Nach dem Selektieren
wurde die Anzahl der Kolonien auf jeder Platte gezählt, und
die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 dargestellt: Tabelle
5
-
Schluss:
-
Dieser
Test zeigt, dass eine Bindung des Virus an das Targetmaterial in
zwei Stufen eine erfolgreiche Alternative zur Bindung der Phagenpartikel
in einem einzigen Schritt bietet und es erlaubt, eine 10–4-Verdünnung eines
positiven Kontrollblattextraktes zu detektieren.
