JP2002517212A - ラベル化した複数のウイルスによる分析方法 - Google Patents

ラベル化した複数のウイルスによる分析方法

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Abstract

(57)【要約】 この発明はサンプル中のターゲット物質を検出する方法に関し、この方法は次のステップからなる：a）ターゲット物質が含まれていると予想されるサンプルを、ウイルス結合したターゲット物質を形成しかつ特異的特性を持つウイルス結合したターゲット物質を得るにためにターゲット物質と直接又は間接に結合することができる少なくとも２つのウイルスにさらし、b）ステージa からの生成物を、指示物質の存在下で、指示物質がウイルス結合したターゲット物質の特異的特性を受け入れることができるように、ウイルス結合したターゲット物質の付着により運ばれたウイルスに培養し、そして、c）ウイルスの付着した指示物質の存在又は不存在をモニターする。この発明はまたこの発明方法で使用するキットも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、物質を検出するための方法であり、特に、検証されるサンプル中で
検出され得る物質が存在することにより特異的特性を該物質に付与する２または
それ以上のウイルス成分を該物質に付着する方法に関する。
【０００２】 従来技術 サンプル中に存在する物質を検出するための多くのサンプル分析技術が既存す
る。例えば、個々の化学分子の識別には化学的分析、クロマトグラフィーの技術
、分光技術を用いることができる。しかし、このような技術ではサンプル中の生
体を容易に識別することはできない。 デオキシリボ核酸混成（ＤＮＡ）などの核酸方法がＤＮＡ及びリボ核酸（ＲＮ
Ａ）を検出するために用いられる。しかし、これらの方法は鋭敏度に欠ける。ポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの増幅方法を用いることで核酸ターゲットを
増幅し、検出することができる。しかし、この方法は複雑で費用がかかる上、核
酸の検出のみに特定される。 ウェスターンブロッティングやエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）や酵素識
別免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫法を用いることで、例えばタンパク
質などの特定の分子を検出することができる。しかし、これらの方法では１リッ
トルあたりのピカモル（pmol）からサブピカモルに検出限度があり、よって、検
出されるべき物質が微量しか存在しない場合は不適切である。 このような検出方法の鋭敏度を良くするために、検出する抗体を放射性物質、
酵素、金粒子或いはバクテリオファージでラベル付けすることが提案されている
。しかし、ターゲットに対するラベル付けされた付着物又は評価するサンプル中
の他の物質が不特定なため、これらの提案は不明確になりがちであった。
【０００３】 例えば、ＰＣＴ出願番号第ＷＯ９２／０２６３３号は、サンプル中に存在する
と思われるバクテリアに感染する特異的なウイルスまたはファージを用いて第一
培養ステージでサンプルを処理することでサンプル中のバクテリアを識別する方
法を提案している。感染したサンプルは、バクテリア細胞に感染していない、つ
まり、細胞内で保護されている外因性ファージ粒子を殺すか除去するように処理
される。その結果として生じたバクテリア細胞は、感染バクテリア細胞中で保護
されているファージ粒子を複製させ且つ溶菌させるために第二培養ステージで培
養される。これにより、ファージ粒子の新しい世代が培養基に放出される。この
ことは、第１バクテリア細胞のさらなる存在中での第二培養ステージをなすこと
によって、及び感染細胞中でのウイルス粒子の複製ともに形成される死んだバク
テリア細胞を検出することによって、検出することができる。この他、ウイルス
粒子の溶菌により放出されたタンパク質は、タンパク質着色或いは他の方法で検
出することができる。 もし、最初のサンプル中に予期されるバクテリアが存在すれば、サンプルの第
一培養からの感染バクテリア細胞中にウイルス粒子が存在して、第二の培養ステ
ージで見つけられることになる。しかし、サンプルに予期されるバクテリアが含
まれていなければ、第一培養ステージでサンプルの細胞は感染しないので、第二
培養ステージでウイルスは複製と溶菌はなされない。 この技術は、ファージ増幅法として知られている。
【０００４】 ＰＣＴ出願番号第ＷＯ９７／２２７１３号で開示されているファージ増幅法の
修正法では、第一培養ステージで使用されたものより複製率が高く感染しやすい
バクテリアの存在下で第二培養ステージが行われる。この方法では、ゆっくり成
長するバクテリア、例えば結核菌を第二培養ステージの促進効果によって迅速に
検出できる。 しかし、これらのファージ増幅法の両バリエーションは、特異的でかつ予期さ
れたバクテリアに感染することができるウイルスを必要とし、これは、識別でき
る物質の範囲及び使うことのできるウイルス粒子の範囲を厳格に制限する。 サンプル中の特定の生体を検出するだけでなく、サンプル中の他の様々な物質
を検出することが望ましい。例えば、使用者又は環境に影響しうるところで、２
つまたはそれ以上の物質が互いに作用しあうかを確定するために、水や廃棄物中
における重金属と他の汚染物質を検出することが望まれる。つまり、生体又は医
薬や薬剤で治療が必要な医療状態における医薬や薬剤の影響を知るためのシンプ
ルで且つ効果的な方法の提供が望まれている。ビトロ均質イムノアッセイ方法に
おいて、シンチレーション近接及び蛍光分極／蛍光急冷等がスクリーニング分析
における分子相互作用を報告するのに使用される。これらの検定を行うのは早く
てシンプルであるが、一般的に鋭敏度が悪い。ヴィボアッセイシステムとして、
相互作用するタンパク質が遺伝子転移のプロモーターとして働く、細胞内の分子
相互作用を示す酵母２ハイブリッドシステムが用いられる。しかし、このタンパ
ク質／タンパク質相互作用は、査定時に医薬によって分断される。酵母２ハイブ
リッドシステムはまた、検定成分の酵母菌細胞内での合成を必要とする。このた
め、検査可能な分子相互作用の範囲が制限されてしまう。
【０００５】 以下に考案する方法は、様々な物質及びその物質の相互作用による産生物を検
出するのに適用され、且つ適用範囲が広い検出方法である。本発明の方法では、
検出する物質を識別するために様々なマーカー物質を使用することができ、使用
する物質に使用者の融通性を付与している。 本発明の方法において２つの異なるウイルス粒子又はウイルスの活性成分は、
検出する物質に直接或いは間接的にタグとして付着され、 以下ターゲット物質
とする。これらのタグは、ウイルス粒子のいずれかの特性からタグ物質を個々に
区別する特有の特性をターゲット物質に付与する。このタグ付された物質を、そ
の後、二つのウイルスに感染されうるバクテリアの存在下でタグ付された物質の
培養により、区別できる特性の存在又は不存在について調べる。 ここでいうウイルスとは、純種のウイルス及び純種のウイルスと同じようにバ
クテリアに感染する生体のことである。つまり、ウイルスという用語には次のも
のが含まれる。 ａ．ウイルス由来の特徴を有するウイルスの成分。 ｂ．プラスミドとウイルスの間の十字形で、バクテリア宿主の中でプラスミド
として成長することができるパッケージファージミド。これらは、ヘルパーウイ
ルスの存在によりウイルス粒子のように包んで隠されるが、独立してウイルスの
子孫を産出できない。 ｃ．バクテリアに対して溶菌性であり、成長し複製を続けることができるバク
テリアの溶菌無しにバクテリア内で成長・複製し、子孫を産出するウイルス。 感染するウイルスと感染できるバクテリア細胞との間の部分に達するのに必要
以上の量のバクテリアを用いてバクテリア細胞のウイルス感染が行われた場合、
そのバクテリア細胞は一つ以上のウイルス粒子によって感染することはない。こ
のような二重感染が充分におこり、且つ本発明の検定の結果を損なわない量は統
計的に計算することができ、以下これを統計量とする。この統計的な計算は、簡
単な試験とエラーテストにより得ることができる。
【０００６】 本発明の方法では、二つのウイルス粒子がターゲット物質を介して物理的に結
合されるので、それぞれのウイルス粒子がバクテリア細胞に感染し、その細胞に
は感染するウイルスの双方の特異的特性が付与される。双方のウイルスに感染し
、二つの特異的特性を合わせ持つバクテリア細胞は、これらの特性を一つしか持
たない細胞と容易に区別される。例えば、感染した細胞は、これらの特性のうち
一つだけ持つものは生き残らない状況、例えば、特定の抗生物質又は特定の温度
或いはｐＨの状況の下で培養することができる。これら両方の特性を持つ感染細
胞は生き残り、そして複製する。もし、溶菌性ウイルスがターゲット物質に付け
るタグとして使用された場合、ウイルスは感染したバクテリア細胞内で複製し、
更に感染と複製のサイクルを始めるために放出される子孫ウイルス粒子を産出す
る。つまり、タグ付けされたターゲット物質の存在中で、バクテリアの成長のカ
スケードはターゲット物質が最初のサンプル中に存在していることを示す。もし
、培養ステージでタグ付けされた物質が存在しなければ、バクテリアはほとんど
、或いは全く成長しない。
【０００７】 発明の開示 従って、本発明はサンプル中のターゲット物質を検出する方法を提供する。こ
の方法は以下のステージにより成る。 a）ターゲット物質が含まれていると予想されるサンプルを、ウイルス結合した
ターゲット物質を形成しかつ特異的特性を持つウイルス結合したターゲット物質
を得るにためにターゲット物質と直接又は間接に結合することができる２つまた
はそれ以上のウイルスにさらす、 b）ステージa からの産出物を、指示物質の存在下、好ましくは統計量より多く
の指示物質が存在する中で、指示物質がウイルス結合したターゲット物質の特異
的特性を受け入れることができるように、ウイルス結合したターゲット物質の付
着により運ばれたウイルスに培養する、そして、 c）ウイルスの付着した指示物質の存在又は不存在をモニターする。
【０００８】 本発明はターゲット物質が存在するサンプル又は、サンプル中の他の成分の相
互作用若しくはサンプルの成分とそこに添加される外部成分との相互作用により
産出されたサンプルに適用することができる。便宜上、ターゲット物質を含むサ
ンプルという語彙は、最初からターゲット物質を含む物質或いは何らかのメカニ
ズムによってターゲット物質が産出された物質を示すのに一般的に用いられる。 本発明の方法は、サンプル中のターゲット物質の存在及びその概ねの質量又は
濃度の効力検定に用いることができ、かつ、単にターゲット物質の存在又は不存
在を検出するだけでなく、ターゲット物質の量的な検出に用いてもよい。例えば
、色などのステージｂの産出物の二次的特徴の発達をモニターすることで、サン
プル中のターゲット物質の発生をモニターすることができる。便宜上、ここで用
いられる検出という語彙は、サンプル中のターゲット物質の性質及び質量両方の
検定を示し、この検出は、断続的若しくは連続的にある一定の期間行われるか、
又は、一回の観察として行われる。 好ましくは、ウイルスが付着した指示物質は生存するがウイルスが唯一付着し
ている又は全く付着していない指示物質は生存していない状態で、培養ステージ
ｂが行われる。
【０００９】 上記したように、少なくとも二つの異なるウイルスがターゲット物質に付着す
る必要があり、そうすると、両方のウイルスによって付与された特性を有する指
示物質だけが生存するようにステージｂの培養状態を選択することができる。一
般的に使用されるウイルスは異なる種類のものであり、それぞれのウイルスは異
なる特性をウイルス結合ターゲット物質に、つまり指示物質に付与している。し
かし、同種のウイルスを使用すること、及び周知の方法で普通はウイルス中に存
在しない望ましい成分を導入し、本発明の方法に使用されるウイルスにその特性
を付与するためにウイルスを変異させることも本出願の範囲にある。例えば、ウ
イルスは、特定の抗生物質に対する抵抗力を付与する因子型を導入する従来の方
法で処理できる。これは、ターゲット物質に結合される各ウイルスに対して行っ
てよい。このような変異によってウイルスに他の特性、例えば、熱または光感度
などを導入することができ、ステージｂでの培養が行われる状態は、指示物質の
様々な特性を生み出したり、反映したりすることができる。上記したように、ウ
イルスはターゲット物質に結合されて、少なくとも二つ以上の特性をターゲット
物質に付与する。もし望むなら、ウイルスが付着した指示物質の検出を可能にす
る或いは促進するウイルス又は追加ウイルスが持つ付加特性をターゲット物質に
付与してもよい。例えば、ウイルス結合したターゲット物質に光ルミネセンスの
特性を付与する第三のウイルスを、ターゲット物質に結合させることができる。
よって、ウイルスが結合したターゲット物質の存在は、ＵＶ、ＩＲ又は可視光で
ステージｂの産出物を照らして、第三のウイルスを持つ物質が蛍光させることに
より容易に検出することができる。代わりに、この特性は指示物質、例えば、β
−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、又はアルカリフォスファターゼが普通は
表さない酵素の表示でもよい。
【００１０】 便宜上、本発明は以下、抗生物質Ａに対する抵抗力を付与する一つの因子型を
持つように変異されたウイルスと抗生物質Ｂに対する抵抗力を付与する別の因子
型を持つように変異された別のウイルスを結合するという観点から説明する。 ターゲット物質は、ウイルス、バクテリア、原生動物、真核細胞、菌類或いは
他の生体の一部、又は生体の部分であってよい。しかし、このターゲット物質は
生体の残留物、例えば、生体により隠された又は発生したタンパク質、ホルモン
、核酸又は酸の配列、プリオン又は抗体などである。代わりに、上記したように
、このターゲット物質は薬品であってもよく、例えば、医薬或いは殺生物剤、例
えばぺプチシド、殺菌剤などの殺生物剤であり、これらの効力は特定の生体に対
しての検出のためのものである。若しくは、二つの他の物質、例えばホルモンや
タンパク質の相互作用によって産出された薬品であり、これらがサンプル中に存
在すると、ある物質のそのホルモンやタンパク質の発生を防いだり、促進に関す
る検出での物質の効力を測ることができる。また、不純物或いは汚染生体又は無
機薬品が、例えば水や産出物中に存在すれば、健康や他の有害要素を引き起こす
。ウイルスによってタグ付けできる成分は様々であるので、本発明は、ごく少量
の物質、一般的には１００万につき１００部より少ない物質を検出することが必
要とされる様々な場合に適用が可能である。
【００１１】 ターゲット物質は、ウイルスがターゲット物質に直接的に結合することができ
る二つの部位で理想的に提示される。このようなターゲット物質の結合は、例え
ば、ウイルス粒子の表面の適切な部位或いはターゲット物質に結合する周知の方
法で変異された部位に至る所でウイルスに直接的にできる。しかし、ウイルス粒
子のいずれか又は両方を、中間結合物質或いは配位子、例えば、ターゲット物質
の異なる領域を認識するタンパク質、アミノ酸、レクチン、ペプチド、抗体、単
クローン性抗体、核酸又は他の物質によってターゲット物質に結合することも本
発明の範囲にある。代わりに、配位子を暗号化する遺伝子配列をウイルスゲノム
に挿入して、ウイルス粒子の表面に表すことができる。もし望むなら、ウイルス
粒子が結合する部位は、例えば、ビオチンやジニトロフェノール（ＤＮＰ）など
の異なるハプテン、及び抗ビオチンと抗ＤＮＰ抗体に交差連結する異なるウイル
ス粒子に伝達して、ウイルス粒子がターゲット自体或いは配位子上の結合部位に
導かれる。 よって、ここでいうウイルスのターゲット物質への結合という語彙は、直接的
或いは非直接的にウイルスがあらゆる方法によってターゲット物質に付着し、タ
ーゲット物質に影響を及ぼして関係するウイルスの活動を維持する部位を提供す
ることを示す。
【００１２】 ターゲット物質の適切なペアリング、つまりウイルスと配位子は、周知の方法
と単純な試験とエラーテストを用いることで容易に確立できる。可能性のあるウ
イルスと配位子の組み合わせは、与えられたターゲット物質に結合できる様々な
物質を形成することができるので、さらに異なる種類のウイルスは、様々な変異
をすることができるので、本発明は、従来提案されたウイルス増幅アッセイ技術
のようにバクテリアだけに限定されず、様々なターゲット物質でウイルス結合の
ターゲットを形成することができる。よって、本発明は、様々なサンプル中の物
質の存在を検出することが望まれればどこでも、広範囲で使用できる。
【００１３】 ターゲット物質に対するウイルス又は変異ウイルスの結合は、ターゲット物質
の性質に依存した様々な方法及び物質を使ってなされる。一般的に、この結合は
、適切なウイルスの存在の下で、ウイルスの混合物を用いた一つのステージ、又
はウイルス粒子結合がウイルスの一つの型式にのみに認められる部位における２
つのステージのどちらかで、望まれるターゲット物質が含まれたサンプルの培養
によって行われる。培養は一般的に適当な液体の培養基、特に水溶性の培養基に
おいて０〜６０℃温度で実行される。ターゲット物質と結合していないウイルス
は溶液或いは液層における懸濁液中、又は固体のフォーム中にあり、また固体の
担体、例えば、ニトロセルロース或いはナイロン膜、セラミックフリット、固形
ビード等により運ばれる。本発明は便宜上、ターゲット物質のための水性の担体
の使用の点から以下に述べることとする。このようなターゲットの形成は、フリ
ーズドライ物或いは他のウイルスの固体物及び通常の技術によるターゲット物質
の溶解或いは懸濁によって作ることができる。
【００１４】 両方の形式のウイルスを持つ第三の物質を形成するために、相互に影響し合い
、各々が独立のウイルス形式を持つ二つの分離した成分を特に好適な実施例で使
用る。なぜなら、相互作用に影響する薬剤の急速なスクリーニングが可能だから
である。ステージａでの培養は、ウイルス性粒子の十分な割合がターゲット物質
に結合するまで行われる。ウイルス結合ステージの最適の条件は、ターゲット物
質の性質、ウイルス粒子及びステージｂにおけるウイルスが付着した指示物質を
検出する方法に依存する。一般的には、ウイルスの結合は、６０℃近くの温度に
おいて５〜１８０分かかり、最適な期間と条件は、その事例に応じた簡単な試験
とエラーテストによって容易に決定される。ターゲット物質へのウイルス性結合
の最適な範囲は、ステージｂからの産出物において検出される特性の性質及びサ
ンプルにおけるウイルス結合したターゲット物質の予想される濃度に依存するが
、一般的には、ウイルス結合はターゲット物質のうち少なくとも２５％、好まし
くは３０〜６０％或いはそれ以上に達する。
【００１５】 もし望むなら、ステージａで形成されるウイルス結合したターゲット物質を、
従来の単離技術や洗浄技術によって混合物から単離することができる。しかしな
がら、これは必要でないことが多く、そしてステージａからの産出物は、ステー
ジｂで行われる媒体として直接的に使用される。しかしながら、残留遊離ウイル
ス粒子からのウイルス結合したターゲット物質の半分の分離は、例えば、濾過、
常磁性のビードによる捕獲によって行われる。洗浄は、残留遊離ウイルス粒子を
殺す又は無能力にする物質によって行われる。代わりに、ターゲット物質に対す
るウイルス粒子の結合がビオチンのようなタグによるターゲット物質のラベリン
グをするところで、ウイルス結合したターゲット物質は、例えばストレプトアビ
ジン常磁性のビードのようなタグによって、非結合性ウイルス粒子から単離され
る。私は、このような残留非結合性ファージからのウイルス結合したターゲット
物質の半分の分離或いは単離が、ターゲット物質を検出或いは判定する本発明の
本方法の鋭敏度や特異性を高めることを発見した。
【００１６】 ステージＢにおいては、ウイルス結合したターゲット物質は、ターゲット物質
の付着によりウイルスの半分が運ばれるように指示物質の存在下において培養さ
れる。一つのターゲット分子又は粒子によって運ばれたこれらの効果によって、
ウイルスの半分は、同じ指示物質の分子又は粒子と付着し、ターゲット物質に付
与された二つの特有の性質の双方を備える分子又は粒子を与える。故に、双方の
特性を有する分子又は粒子を一方の性質を有する分子又は粒子から区別すること
ができる。
【００１７】 ウイルスの半分は、数多くの方法で指示物質と付着しうる。例えば、ウイルス
の半分はバクテリア指示物質に感染したり、又はそれに対して特異的特性を与え
るための指示物質と付着する培養の間に遺伝子型を表わすだろう。しかしながら
、ウイルス結合したターゲット物質から指示物質への特異的特性の転移は、指示
物質の細胞内へのウイルス粒子の進入を要求されることはない。このように、ウ
イルス粒子が指示物質の外側に付着することによってそれらの性質を転移する。
【００１８】 便宜上、本発明は、ステージｂにおけるターゲット物質により運ばれたウイル
スの半分がバクテリア細胞に感染され、且つ、感染された細胞に特異的特性を与
えるために感染された細胞内において保護される場合に関して、以下に述べるこ
ととする。
【００１９】 そこで、ステージｂは、適切なバクテリア培養物をステージaの産出物に加え
ること、及び生存する又は複製することができる特異的特性の双方を持つこれら
のバクテリアのみが存在する条件の下で培養とバクテリアの感染を行うことによ
ってなされる。そこで、好適な実施例では、大腸菌のようなバクテリアの培養は
、２つの抗バクテリア剤の存在下で、ウイルス結合したターゲットにより運ばれ
たウイルスの半分が抵抗を与えるためになされる。あるいは、ステージｂでの培
養は、抗生物質の存在しないところでなされ、容易に検出できるバクテリア集団
を与えるために培養がなされたの後に抗生物質が加えられる。便宜上、本発明を
ここからは、バクテリア細胞の成長の効果を実時間で検出することができるよう
に、抗生物質の存在中でのバクテリアの培養をなす見地から説明する。
【００２０】 大腸菌は、ウイルス結合した分子または粒子とバクテリア細胞との間の計算上
の同等を達成するために必要とされるものより多くの量が存在することが好まし
く、統計上必要とされる量を超える量が望ましい。大腸菌の超過量の使用は、ス
テージaからの産出物の中にとどまり得る両ウイルスの独立した粒子によって独
立のバクテリア細胞が感染される機会を減少させる。しかしながら、ステージｂ
中の又はその後の条件で、１つの種類のウイルスにのみ感染している細胞の生存
や成長を強く反対するところでは大腸菌の超過量の使用は必要ないであろう。一
般的には、統計上の量を１０〜３００％又はそれ以上の超過する大腸菌の量が、
１つの種類のウイルスにのみ感染しているバクテリア細胞の産出を最小限にする
ために使われ、従って、ウイルス結合物質により感染された細胞の検出を助ける
。また、上述したように、１つの種類のウイルスにのみ感染しているバクテリア
細胞の産出の危険をさらに減少するため、非結合ウイルス粒子をステージaの産
出物から取り除くことが望ましい。
【００２１】 ステージｂで使われる抗生物質剤の効果によれば、１つのウイルスにのみ感染
しているバクテリア細胞は、死滅するかもしれないし、又は、成長や複製しない
であろう。仮に溶菌遺伝子ウイルスが使われたら、二重感染細胞がウイルス複製
を主催することができる。従って、そのような細胞から複製されたウイルス粒子
は、感染のカスケード、複製及びウイルス粒子の放出ができるように、さらに細
胞に感染させ、かつ複製することができる。これは、二重感染細胞の成長の効果
を増幅する効果がある。
【００２２】 二重感染細胞の成長は、適切な技術を使ってモニターすることができる。例え
ば、バクテリアの培養は、二重感染細胞の重要な集団が裸眼で見えるようになる
まで続けることができる。あるいは、ターゲット物質を与られた特徴の１つがそ
れを許容するところ、又は第３ウイルスがターゲット物質に結合されたところで
二重感染細胞の成長は、比色、蛍光、または発色性の手段によってモニターする
ことができる。もし望むなら培養手段は、酵素または二重感染細胞により運ばれ
たウイルスの１つにより付与された特性を強調するために成長するバクテリアか
ら放出された化学薬品に反応する他の手段を一体化することができる。
【００２３】 二重感染バクテリア細胞に与えられた特異的特性は、ステージｂの培養混合物
内に存在するそのような細胞の数に従って強度を変化する。この強度は、テスト
された初期サンプル中にターゲット物質が存在したことを示したのと同じく、元
のサンプル中のターゲット物質の量の指示を与えるために使うことができる。 もし望むのなら、ターゲット物質に対する個々のファージ粒子のバックグラウ
ンド連結の効果およびステージｂ内のそれらの検出は、特に界面活性剤、例えば
商標Tweenの固体などの非イオン界面活性剤を使って、又はステージa及び／又は
ｂ内の培養媒体または洗浄流体中で０．１から０．５％ ｖ／ｖの量のカゼイン
又は５％ ｗ／ｖを超えるの量のアルブミンのようなタンパク質ブロック剤の使
用により減少させることが出来る。
【００２４】 上述のように本発明の方法は、使用できる物質の多数の組み合わせにより、様
々なターゲット物質に適用することが出来る。従って、本発明は、様々なところ
からのサンプルのテスト中で、様々なターゲット物質のために広範囲な適用が可
能である。ターゲット物質は、ファージ増幅技術で要求されるような生体である
必要はないが、化学薬品でも良い。例えば、ウイルスの溶菌から誘導されたタン
パク質、生体そのものの成分よりもむしろ生きている生体により産出されたＲＮ
Ａ、給水系統中の重金属または他の汚染物質、又は溶液中または固体支持物質例
えばポリアミド膜である。
【００２５】 本発明は、バクテリア若しくは他の生体の成長を抑制する又は促進する物質の
影響を測定することによって、物質の生体学的な活動を測定することを目的とす
る。従って、例えば、或る生体は、試験のために薬物にさらすことができるし、
隠されたタンパク質或いはｍＲＮＡの産出をモニターすることができる。もし、
薬物が有効であれば、薬物の効果が出た時点でタンパク質もしくはｍＲＮＡの産
出を中止するであろう。これは、適切な技術の使用によってモニターされる。代
わりに、その薬物は、菌類もしくは酵母菌等の生体の成長及びステージｂにおい
て評価された薬物の処理の後に生体の更なる成長を抑制するかもしれない。
【００２６】 本発明方法はまた、２つ又はそれ以上の物質が、互いに結合もしくは反応する
ことにおいて影響を及ぼし合うかどうかを研究することに利用される。本発明に
おいて研究された物質は各々、ファージ型式の一つのターゲット物質として機能
することができ、２つのターゲット物質が影響し合ったり又互いの結合が起こる
ことを示すのに使用されるファージの両型式を持つ産出物を産出をすることがで
きる。従って、一方の物質の分子は、特性Ａを持つファージでタグ付け可能であ
り、他方の物質の分子は、特性Ｂを持つファージでタグ付けされる。もしその物
質が相互作用の起こる状況にさらされ、そしてステージｂの如く結果合成物が培
養されるならば、特性Ａと特性Ｂを与えられた分子もしくは産出物の存在を、上
述のように検出することができる。この技術は、例えば薬物のスクリーニングに
おいて、２つの単分子及び／又は複合分子の相互作用の検出、例えば基質上の酵
素の結合、二つのタンパク質もしくは一つのタンパク質と核酸の相互作用、に応
用することができる。もし望むなら、第３の分子に、Ａ，Ｂ，Ｃの三特性すべて
が付与された複合体を持つ異なったファージを用いた第３の特性を付与すること
ができる。あるいは、本発明は、例えば相互作用分子の一つで優先的に結合する
ことによって薬物もしくは他の物質が相互作用を抑制することはないことを証明
することができ、従って、本発明は、ある物質の結合体の混合が安全であるかど
うか、或いは、薬物が予想された相互作用の効果を持つかどうかを示すことがで
きる。
【００２７】 これらの場合、二つのウイルスタグを持つ本発明のターゲット物質を結合形成
し、ウイルスによってタグ付けされた二つの別個の成分の相互作用によって形成
された結合化ターゲット物質の存在もしくは不存在を検出することに、本発明は
利用される。従って、ここにいうターゲット物質とは、両型式のウイルスでタグ
付けされた１つの物質と、１つの型式でタグ付けされたものと両型式のウイルス
を持つ物質を形成するために互いに結合または影響し合う物質を含むように構成
される。
【００２８】 好適な実施例では、ターゲット物質の検出は、二重感染した細胞の培養を含む
ことから、細胞の初期量が大きな倍率、例えば１０倍から１０8 倍に増加される
まで、この培養（ステージｂ）を続けることが可能である。この場合、初期サン
プルにおけるターゲット物質の非常に小さなレベルを、従来の技術によって検出
できなかったであろうターゲット物質のレベルである非常に大きな範囲に増幅す
ることができる。
【００２９】 本発明は、また、その方法において使用される分析キットを提供し、そのキッ
トは以下の構成からなる： ａ．ターゲット物質を形成するために結合する共通のターゲット物質またはタ
ーゲット物質を形成する個別の成分に適合し、特異的特性をターゲット物質に付
与する二つのファージ物質；及び ｂ．成長媒体中において培養のためにふさわしく、かつファージ物質によって
付与された特異的特性を採用することに適合した指示物質。 指示物質は、ファージ物質に感染され得るバクテリアであることが好ましい。
前記キットはまた、ウイルス結合したターゲット物質と指示物質の培養のための
成長媒体を含むことが更に望ましい。前記キットは、ファージ物質に感染された
指示薬物質の成長の表われを視覚的に検出可能にする追加成分を含むことが更に
好ましい。
【００３０】
【実施例】
概説： 本発明を以下、好適な実施例の観点から及び２つの異なったウイルス、ウイル
スＡとウイルスＢ、を使ったターゲット分子の検出の観点から、実例を用いなが
ら説明する。溶液中または支持に結合されているであろうターゲット分子は、お
そらくタンパク質である。ウイルスＡ及びウイルスＢは、一本鎖バクテリオファ
ージM13ウイルス又はアンピシリンとカナマイシン抵抗をそれぞれ暗号化した遺
伝子の挿入によって変異されたファージミドである。もし望むなら、該ウイルス
は、タンパク質の領域に結合しているIgGを暗号化した遺伝子の挿入によって変
異することもできる。これは、ウイルスがターゲット物質に対して特定できるい
ずれかのIgG抗体に結合することを可能とする。溶液中のターゲット分子のある
ところで、ウイルスAとBの両方または片方を、さらにペプチド又は自動ビオチン
化ペプチドに結合されたマルトースを含むように変異することや、ビオチンのよ
うなハプテンに共有結合させることができる。これはウイルス結合したターゲッ
ト物質を、非結合ウイルスを取り除くために、ストレプトアビジン又はメルロー
ス誘導性の常磁性体のビードで捕獲することによって洗浄されることを可能とす
る。これにより、本発明の方法の鋭敏度および特定性は増大される。
【００３１】 ウイルスＡ及び／又はウイルスＢは、ウイルスが付着した指示物質の比色、蛍
光、発光検出が可能である酵素、例えば、β−ガラクトシダーゼ又はルシフェラ
ーゼのような検出できるマーカーを暗号化する遺伝子を含むように変異すること
もできる。もし望むなら、ウイルスA及びウイルスBは、検出マーカーについて編
集されかつ指示物質の二重感染として機能するように異なった成分を各々含んで
も良い。これの明確な例は、TG1細胞のLacZ相補を伴うβーガラクトシダーゼの
表示がある。β−ガラクトシダーゼの表示は、TG1細胞の上でラックオペロンの
相補成分双方を持つウイルス結合ターゲット物質と共に生じるだけである。β−
ガラクトシダーゼは、エージャー媒体中の酵素誘導源イソプロピルーβーチオガ
ラクトピラノシド及び指示薬ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラク
トシドを使って検出することができる。媒体には、β−ガラクトシダーゼの存在
中で蛍光性または発色性の４−メチルウムベリフェリール−β−D−ガラクトー
ゼを含ませても良い。分光器、ELISAリーダー、ルミノメーター又は蛍光度計を
用いて、初期サンプル中に存在するターゲット物質の質的検出を得るために、断
続的に又は連続的に変化する色または色の度合いをモニターすることも本発明の
範囲に含まれる。
【００３２】 この技術のバリエーションには、第３成分が両方の相形式を持ちかつその後に
本発明の方法を使って検出され得るように、第３成分の形成のために相互に影響
する２つの成分を、各々個別に異なった相に結合することができる。このバリエ
ーションは、第３成分産出の抑制または効力を高める薬品の活動が、始めの二成
分、例えばタンパク質が存在し又は発生する状態の下で、有用な効果を持ちそう
かどうかについての迅速な検出を得るのに用いられるところで、薬品の迅速なス
クリーニングの特別の用途をもたらす。
【００３３】 本発明の方法の中では、ウイルス粒子は、ターゲット分子が検出されるサンプ
ルと共に１０〜１２０分間、４〜５０℃の間の温度で培養される。この培養の間
、ウイルスはサンプル中のターゲットタンパク質分子に結合される。この培養の
後、該サンプルを、培養ステージｂで使うか又は分離し、例えばビードの捕獲に
使用し、そして洗浄する。サンプルは、固体支持に結合するところで適切な洗浄
緩衝剤ですすぐことが出来る。
【００３４】 培養ステージｂ中では、統計上の必要量を超える大腸菌の量を、その後に適切
な成長媒体に加え、４〜５０℃の間の温度で３０〜７２０分間培養する。ウイル
スA及びB双方に感染されたものは、抗生物質に対して抵抗力があり又複製される
が、ウイルスの一つだけに感染したバクテリアを死滅させ又は複製させないため
に、成長媒体はアンピシリンとカナマイシンの両方を含む。これは観察者が、培
養基中のバクテリア細胞の成長をモニターすること、及び成長する細胞の存在及
び実時間でのその細胞の数を測定することを可能とする。しかしながら、適切な
培養期間の後に抗生物質を培養基に加えること、及び細胞群にある抗生物質の効
果を測定することも可能である。仮に抗生物質を初期培養ステージの後に加える
のならば、培養物質中の検出可能な変化を発生させるために、２〜６０分の間の
更なる培養が必要となるであろう。
【００３５】 溶液中にあったり又は固体支持に結合している核酸のような分子の検出のため
の別の好適な実施例中では、ウイルスＡ及びウイルスＢは、一本鎖バクテリオフ
ァージM13ウイルス又はアンピシリンとカナマイシン抵抗をそれぞれ暗号化した
遺伝子の挿入によって変異されたファージミドである。該ウイルスは、核酸への
結合又は以下に詳述するが如くペプチド核酸プローブによって、更なる変異を受
けやすい。ウイルスは、ターゲット分子が検出されるサンプルと共に３０〜２４
０分間、４〜６０℃の間の温度で培養される。この培養の間、ウイルスはサンプ
ル中のターゲット核酸分子に結合する。 この培養の後、ウイルス結合した核酸は、適切な成長媒体の中で４〜５０℃の
間の温度で、３０〜４８０分間、大腸菌の超過量で培養され、かつ上述のように
抗生物質の効果を検出する。
【００３６】 核酸の検出の中では、ターゲット核酸に結合できる２つ又はそれ以上の核酸プ
ローブが必要とされる。単独コピーの遺伝子配列は、同じ遺伝子領域または遺伝
子に対して２つのプローブを使うことによって検出することが出来るが、診断上
の適用の鋭敏度は、検出される生体のゲノム中で、ターゲッティングの反復又は
繰り返される配列によって増加される。このような繰り返される配列は、繰り返
される配列に対するプローブの単独の種類の２つ以上のコピーの結合によって検
出される。仮に2つのプローブが使われるのなら、それらには同じ又は異なるハ
プテンでラベル付けすることができる。例えば、両プローブともビオチンでラベ
ル付けするか、または１つのプローブをビオチンで他をジゴキシゲニンでラベル
付けする（Boehringer Mannheim. Lewes, UK, 1 093 088）。ターゲット核酸に
プローブを結合（雑種を作成）させた後、空間的に結合したプローブ分子は、ハ
プテン基がそれらによって運ばれることによって検出される。例えば、抗ジゴキ
シゲニン抗体の断片（Boehringer Mannheim. Lewes, UK, 1 214 667）又はスト
レプトアビジンに接合したファージA及びファージKを使うことが出来る。仮に単
独ハプテン、例えばビオチンが、プローブのラベル付けに使われたら、その後２
つのファージは、同じハプテン結合分子、例えばストレプトアビジンでラベル付
けすることが出来る。このアプローチは、繰返し前後に繰り返される分子、例え
ば、Leishmania donovaniの配列Lmet2、又はPlasmodium falciparum.の２１base
pair repeatの検出に適している。ターゲットDNAは生体から適切な通常の技術
を用いて、又は天然抽出から又は犠牲サンプルの溶解質により準備され、そして
膜、例えばハイボンド N、ハイボンドN+（Amersham International plc, Amers
ham UK）の上に固定され、そして検出に先立ち、性質を規格化された方法（Amer
sham International plc出版P1/384/91/6とP1/387/92/4及びShort Protocols in
Molecular Biology,第２版 Ausubel,FM et al eds. Green Publishing Associ
ates and John Wiley & Sons. 1992）を用いて変えられる。あるいは、同種の効
力検定フォーマットを使うことが出来る。または、精製されたDNAを準備し、制
限酵素で切り、電気泳動で大きさを分離しかつ検出の前にナイロン膜の上に固定
することも出来る。
【００３７】 テスト結果： ログフェイズＴＧ１大腸菌の準備： 最小媒体プレートを、 F M Ausubelら、Green Publishing Associates 及びJo
hn Wiley & Sons によって１９９２年に編集された”Short Protocols in Molec
ular Biology”の第２版に記載されたように準備した。ＴＧ１大腸菌（Pharmaci
a Biotechnology, UK-Expression Module 27-9401-01）に、最小媒体プレート上
ですじを付け、単一コロニーを発生させるために３７℃で一晩中培養し、それか
ら４℃で放置した。単一コロニーを、１５分間滅菌した１リットル当たり１７ｇ
のBactotryptone（Difco 0123-17-3 ）, １０ｇのBacto yeast extract（Difco
0123-17-19）及び５ｇのＮａＣｌを含んだ２ｘＹＴ媒体１０ｍｌ中にて接種した
。接種媒体は、約0.5 のOD660nm のログ成長が達成されるまで３７℃で振動培養
した。
【００３８】 ファージＫの準備： 上記したように準備しログフェイズＴＧ１大腸菌１０μｌを、２０ｍｌのプラ
スチック製ユニバーサル容器内の２ｘＹＴ１ｍｌに添加した。１０8 のファージ
M13K02（Pharmacia, Expression module 27-1524-01 ）pfusを容器に添加し、混
合物を３７℃で６０分間培養した。２ｘＹＴ１０ｍｌ、カナマイシン 50 μｇ／
ｍｌを添加し、定常フェイズ成長が達成されるまで３７℃で約５時間混合培養し
た。細胞と細胞片を遠心力によって除去し、0.22ミクロンフィルターを通して上
澄み液を濾過した。PEG 8000（Sigma P5413)の２０％ｗ／ｖの溶液２ｍｌｓと２
．５ＭのＮａＣｌを、ファージ懸濁液に添加し、このファージを一晩中沈殿させ
た。このファージはそれから繰り返し遠心分離して再沈殿させ、次いでＰＢＳ(S
igma 1000-3)１ｍｌ，ＭｇＣｌ2 (Sigma M2670) １ｍＭ及びトリプシン２５μＭ
（2.5%w.v Trypsin stock-Sigma T2670,６μｌとして) 中で６０分間培養し、こ
のファージは室温で１０分間、 200μｌの20％PEG8000 と2.5 ＭのＮａＣｌに沈
殿させた。このファージを遠心分離させ、ＰＢＳ，ＭｇＣｌ2 ，PEG8000 及びＮ
ａＣｌで洗浄した。液体を除去し、ファージをカナマイシンゲノムを持つ活性フ
ァージを得るために再沈殿した。
【００３９】 ファージＡの準備： このファージは、Pharmacia Biotechnology, Expression module 27-9401-01
からのファージＡ pCANTAB 5E を使用し、これをアンピシリン(Sigma A2804) と
Pharmacia Biotechnology，Expression module 27-1524-01からのヘルパーファ
ージM13K07と共に培養させ、その後アンピシリン抵抗体を暗号化するファージミ
ドを得るために アンピシリンとカナマイシン(Sigma K0879) の両方と共に培養
したことを除いてはファージＫについて上記した技術を使用して準備した。 あるいは、Molecular Biology のShort Protocolsに記載された技術を使用し
た塩化セシウム勾配上で超遠心力によってファージＡとファージＫを準備し、精
製することもできる。
【００４０】 （例１） 配位子によりラベル付けられたファージを使用した固定配位子結合分子の検出 この例において使用される配位子は、タンパク質ストレプトアビジンに結合さ
れるビオチンである。ストレプトアビジンの一分子は４つのビオチン分子に結合
することができる。 ファージのビオチン化は、業者ハンドブックに記載されたように、ビオチンア
ミドカプロエイト−N−ヒドロキシスルフォサクシニミドエステル（Sigma B2643
)を使用して行った。ビオチンに対するファージの最適比は、各ファージについ
て実験的に決定することができる。ビオチン化ファージは、標準ポリエチレング
リコール沈殿によって精製した。
【００４１】 ビオチン化ファージＫ及びファージＡを、ストレプトアビジン常磁性体ビード
を検出するために使用した。このビードは、ヘモサイトメーターを使用してμl
当たり２×105 粒子にて光学顕微鏡検査により前もって計量した。 ストレプトアビジン常磁性体ビード(Promega Z5481) は、業者により推奨され
るように洗浄し準備した。コントロールビードは、0.1mM ビオチン(Sigma B4501
) を含む同じ溶液中で洗浄することによってブロックした。 ストレプトアビジン及びブロックしたコントロールビードは、連続的に１０倍
に希釈し、ビオチン化ファージの各混合物と共に培養した。ファージをビードに
結合させた後、ビードを洗浄し、ファージ感染を達成するためにログフェイズＴ
Ｇ１細胞と共に培養した。
【００４２】 ファージ感染の後、これらファージＡとファージＫの両方によって二重に感染
された細胞となった大腸菌細胞を選択的に培養するために、ＴＧ１細胞はアンピ
シリンとカナマイシンを含む固体媒体に張り付け、コロニーの数をカウントした
（表１参照）。テストとブロックしたコントロールが二重に行われ（ＡとＢ）、
結果を表１に示した。
【表１】
【００４３】 結論： それらの大腸菌宿主の内で異なる選択可能な特性を暗号付ける２つのファージ
は、ファージ表面上の配位子の効力によって結合される分子を検出するための検
定に使用することができる。この結果は、このテスト方法が20のストレプトアビ
ジンビードと同程度に低い感度をもつことを証明している。
【００４４】 （例２） 均質アッセイにおける固定配位子結合分子（ストレプトアビジン）の検出（無洗
浄） ストレプトアビジン(Sigma S4762) の連続希釈物を、例１のように準備したビ
オチン化ファージＡとファージＫの混合物に添加した。ファージをストレプトア
ビジンに結合させた後、ログフェイズＴＧ１細胞をファージと共に大腸菌細胞に
感染させるために添加した。
【００４５】 感染の後、該細胞を二重感染した細胞について選択するためにアンピシリンとカ
ナマイシンを含む固体媒体に張り付け、各プレート上のコロニーの数をカウント
し、結果は表２に示した。
【表２】
【００４６】 結論： これらの結果は、本発明の方法は、複合体の捕獲や洗浄なしに、105 分子又は
0.1 attomolesのストレプトアビジンと同程度に少量の検出が可能であることを
証明している。検出の抑制は、他の免疫検定技術による普通の観察であるストレ
プトアビジン濃度(1 femtomole) よりも高いところで明白である。
【００４７】 （例３） 抗体ラベル付けファージによる抗原の検出 ファージＡとファージＫを、Bioconjugation, Mohammed Aslam及び Alastair
Dent, Eds. 1998. Macmillan Reference Ltd. London, UK ISBN 0-333-583752に
記載された方法による生物的接合として、グルタルアルデヒドの使用により、ア
ンチポテトウイルスＸ抗体（Agdia Incorporated, Elkhart, Indiana 46514, US
A)にそれぞれ接合した。その接合物を希釈し、１mMのＭｇＣｌ2 のTBS 内に４℃
で貯蔵した。 ポテトウイルスＸ抗体（Agdia PathoScreen Kit PSP 10000/0288) の検出のた
めの ELISAキット、フリーズドライされた感染された葉物質のポジティブコント
ロール小びん(Agdia, LPC 10000)及び、フリーズドライされた葉物質のネガティ
ブコントロール小びん(Agdia, LNC 10000)を、Agdia 社より得た。
【００４８】 感染された葉物質の希釈物を、ウイルス物質を捕獲するためにマイクロプレー
トウェル(Agdia, PathoScreen Kit PSP 10000/0288)に被覆されたアンチポテト
Ｘウイルス抗体に添加した。捕獲と洗浄の後、接合したファージＡとファージＫ
を各ウェルに添加させ、ファージ粒子を捕獲するために培養した。ウェルはその
後洗浄し、ログフェイズTG1 細胞を細胞の感染を可能とするために接合したファ
ージと共に添加した。感染の後、各ウェルの内容物は二重に感染した細胞につい
て選択するためにアンピシリンとカナマイシンを含む固体媒体に張り付け、各プ
レート上のコロニーの数をカウントした。結果を表3 に示した。
【表３】
【００４９】 結論： 本発明の方法により、ポジティブコントロール葉物質の10-3希釈物において葉
ウイルスの存在を検出した。
【００５０】 （比較例） １ファージ、２ファージの比較、及びウイルスの検出のためのELISAアプローチ 希釈した植物抽出物の検出のために、単一の接合したファージ（ファージＫ）
の使用を、接合ファージＡとファージＫの混合物と比較したことを除いて、例３
に記載したのと同じプロトコルを続いて行った。ファージ混合物が最終的に通常
の方法でカナマイシンと アンピシリン を含んだ寒天培養基プレート上に張り付
けたのに反して、単一のファージＫは最終的にカナマイシンを含んだ寒天プレー
ト上に張り付けた。感染した細胞の選択をするための培養の後、コロニーの数を
カウントし、その結果を表４に示した。
【００５１】 製造者の指示に従って、Pathoscreen ポテトウイルスＸ ELISA検定を、ポジテ
ィブコントロール葉抽出物の同じ希釈物と並行して行い、このテストの結果もま
た表４に示した。
【表４】
【００５２】 結論： この実験は、単一のファージのアプローチと比較して２ファージのアプローチ
を使用する方が有利であることを証明している。ファージＫ単独で使用したとき
、ネガティブコントロール内には大量数のコロニーが存在していた。２ファージ
のアプローチは、１０-3の希釈物でさえもポジティブサンプルが容易に識別され
るようにバックグラウンド信号を減少させる。バックグラウンド信号を、界面活
性剤、例えば0.1 〜0.5% v/v の濃度の商標Tween 20の固体、及び／又は培養で
の5% w/v までの濃度の牛血清アルブミン或いは洗浄媒体の使用により更に減少
させることができる。 製造者によって供給された PathoScreen ELISAは、本発明の方法と同程度の鋭
敏度ではなかった。
【００５３】 （例４） ウイルスの検出のための代わりの２ファージ戦略 （例３のように準備した）ファージＡ又はファージＫが接合したアンチポテト
Ｘウイルスを、マイクロプレートウェル(Greiner Labortechnik Ltd., Cambridg
e, UK, 756061) を被覆するために使用した。植物抽出液の希釈物をファージ被
覆ウェル内に捕獲した。洗浄後、ファージ／抗体の接合体（ファージＡ又はファ
ージＫ）を、ファージＡをファージＫで被覆されていたウェルに添加させるよう
に逆にファージＫがファージＡで被覆されていたウェルに添加するように、各ウ
ェルに添加した。ファージを捕獲するための培養の後、ウェルを洗浄し、ログフ
ェイズＴＧ１を感染させるために添加した。感染の後、各ウェルの内容物を二重
感染した細胞について選択するためにアンピシリンとカナマイシンを含む固体媒
体に張り付けた。選択の後、各プレート上のコロニーの数をカウントし、その結
果を表５に示した。
【表５】
【００５４】 結論： このテストは、２つのステージでのターゲット物質へのウイルス結合が、１ス
テージでのファージ粒子の結合に有効に代わり得るものであること、及びポジテ
ィブコントロール葉抽出物の１０-4希釈物での検出を可能とすることを証明して
いる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 BB14 BB20 BB29 CB21 FA16 FA18 FB01 FB03 GC22 4B063 QA01 QA20 QQ05 QQ06 QQ07 QQ08 QQ10 QQ21 QQ41 QQ61 QQ70 QQ79 QQ89 QQ91 QQ94 QQ96 QQ98 QR15 QR54 QR75 QR79 QR83 QS24 QX01

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】サンプル中のターゲット物質を特定する方法に関し、この方法は
    次のステップからなる a）ターゲット物質が含まれていると予想されるまたはターゲット物質が集中し
    ているサンプルを、ウイルス結合したターゲット物質を形成しかつ特異的特性を
    持つウイルス結合したターゲット物質を得るにためにターゲット物質と直接又は
    間接に結合することができる２つまたはそれ以上のウイルスにさらす、 b）ステージa からの産出物を、指示物質の存在下で、指示物質がウイルス結合
    したターゲット物質の特異的特性を受け入れることができるように、ウイルス結
    合したターゲット物質の付着により運ばれたウイルスに培養する、そして、 c）ウイルスの付着した指示物質の存在又は不存在をモニターする。
  2. 【請求項２】ウイルスが付着した指示物質は生存するがウイルスが唯一付着し
    ている又は全く付着していない指示物質は生存していない状態で、培養ステージ
    ｂをおこなうことからなることを特徴とする請求項１に記載された方法。
  3. 【請求項３】ウイルスの半分が中間配位体を介してターゲット物質と結合して
    いることを特徴とする請求項１に記載された方法。
  4. 【請求項４】ウイルスの半分が、ウイルス結合したターゲット物質に抗生物質
    の二つの異なった形態を付与することを特徴とする請求項１乃至３に記載された
    方法。
  5. 【請求項５】指示バクテリア培養の存在下でステージｂの培養が行われること
    を特徴とする請求項１乃至４に記載された方法。
  6. 【請求項６】少なくとも統計上要求された量のバクテリア細胞の存在下でステ
    ージｂの培養が行われることを特徴とする請求項５に記載された方法。
  7. 【請求項７】ウイルス感染指示物質に、目視的に発見できる特徴が付与された
    ウイルスが使用されることを特徴とする請求項１に記載された方法。
  8. 【請求項８】ターゲット物質が無機或いは有機物質或いは生体、これらの一部
    又は表徴、或いは生体の産出物であることを特徴とする請求項１乃至７に記載さ
    れた方法。
  9. 【請求項９】ターゲット物質が、プロティン、酵素、プリオン、脂質、核酸、
    ホルモン、菌類、ウイルス、バクテリア、或いは原生動物であることを特徴とす
    る請求項８に記載された方法。
  10. 【請求項１０】ターゲット物質が、２又はそれ以上の物質の相互作用結果物で
    あり、この方法はこの様な相互作用の抑制或いは限度を決定するのに用いられる
    ことを特徴とする請求項１乃至９に記載された方法。
  11. 【請求項１１】相互作用が第三の成分の作用に依って抑制され、第三の成分の
    効果は相互作用の産出物の抑制程度に依って検定されることを特徴とする請求項
    １０に記載された方法。
  12. 【請求項１２】ターゲット物質が、他の物質に存在する汚染物質又は不純物で
    あり、この方法はそのような汚染物質又は不純物の存在を検出するのに用いられ
    ることを特徴とする請求項１に記載された方法。
  13. 【請求項１３】ターゲット物質が、医薬若しくは殺生物剤、または生体の殺生
    物剤若しくは医薬の相互作用結果物であり、この方法は医薬又は殺生物剤の効果
    を検出するのに用いられることを特徴とする請求項１乃至１２に記載された方法
    。
  14. 【請求項１４】指示物質中の特異的特性の検出が、サンプル中に存在するター
    ゲット物質の量的指示を与えるために、時間的期間以上モニターされることを特
    徴とする請求項１乃至１３に記載された方法。
  15. 【請求項１５】この請求項以前に好ましい実施例の何れの観点で記載された実
    質的に請求項１に記載された方法。
  16. 【請求項１６】次の構成からなる： ａ）普通のターゲット物質、或いはターゲット物質と相互作用し特異的特性をタ
    ーゲット物質に付与する成分、に結合するのに適した少なくとも２種のファージ
    物質；及び ｂ）ファージ物質によって付与された特異的特性を受け入れるのに適し、成長媒
    体の培地として適当な指示物質、 請求項１の方法に使用される成分のキット。
  17. 【請求項１７】指示物質がファージ物質に依って感染させることができるバク
    テリアであることを特徴とする請求項１６記載のキット。
  18. 【請求項１８】ファージ物質とバクテリアがフリーズドドライ固形特有形態で
    あることを特徴とする請求項１５記載のキット。
  19. 【請求項１９】ウイルス結合したターゲット物質と指示物質の培養のための成
    長媒体培養が含まれていることを特徴とする請求項１６乃至１８記載のキット。
  20. 【請求項２０】ファージ物質に依って感染された指示物質の成長の目視による
    検出が可能な指示物質を提供する追加成分が含まれてなることを特徴とする請求
    項１６乃至１９記載のキット。
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