JP2000513949A - 生物学的サンプル中における生物学的分子の検出のためのバクテリオファージの使用に基づく方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、生物学的サンプル中の関心分子を検出するために線状バクテリオファージの使用を可能にする方法に関する。本発明は、用いられるファージの特性によって立案され、定義される一連の複合操作から構成される。これらはカプシド表面に、少なくとも１個の分子が、一般にタンパク性物質に限定されず、上記生物学的サンプル中に存在する少なくとも１種の関心分子を結合できる。上記分子の存在の検出は、本発明の方法により、ファージの表面に暴露された分子とファージ自体のゲノムの間の会合を用いて行われる。カプシド上に暴露された分子に典型的な特異的複合体を形成する能力は、ファージＤＮＡ中の既知の配列の増幅によって検出可能な関心複合体のファージ−分子野形成を可能にする。本発明の方法はきわめて感度が高く、とくに診断および予知の目的に使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的サンプル中における生物学的分子の検出のための バクテリオファージの使用に基づく方法 本発明は、生物学的ソースにおける興味ある分子の存在の検出方法に関する。 これは、科学的研究の多くの領域に共通の要求に応えるものである。実際、生物 学的サンプル中における、たとえば臨床的病原に関与する分子の存在を同定する 能力は、とくに医学の分野における研究の重要な対象と常に考えられてきた。 バイオ医学の分野は、疑いもなく、この方法が適用される主要な（それのみで はないが）分野である。実際、この目的の方法に関連する本発明は、とくに診断 レベルでの検出における感度がますます高レベルに到達することを目標に提案さ れてきた。 細胞または組織抽出物中における特定の分子の存在を検出するために最も頻繁 に用いられるバイオ化学的ツールはそれらの著しい感度と高い結合特異性のため に抗体である。 興味ある分子との相互作用がこれらの方法で起こった場合、それは抗体自体に 連結されたマーカー、たとえば蛍光物質、酵素活性を有するタンパク質、または 放射性マーカーを用いて強調される。 これらのマーカーの検出能力は、いずれの場合も、いわゆるシグナル増幅方法 の使用によりかなり増強されることが見出されている。これらは、たとえば特異 的認識のために用いられる抗体（一次抗体）ではなく、第一の抗体に結合できる 第二の抗体（二次抗体）にマーカーを連結することによって、より強力な検出シ グナルを得ることを可能にする。マーカー分子たとえばフルオレスセインもしく はローダミンのような蛍光物質、アルカリホスファターゼもしくは西洋ワサビペ ルオキシダーゼのような酵素活性をもつプロテアーゼに共有結合で結合する二次 抗体を用いて多くの方法が開発されている。電子顕微鏡を用いる検出の場合には フェリンまたはコロイド状金スフェアも使用される。 別の増幅システムでは、分子の高い結合親和性、たとえば、ビオチン（小さな 水溶性ビタミン）およびストレプトアビジン（細菌性タンパク質）、またはレシ チン（特異的な糖残基を認識し結合できるタンパク質）と糖タンパク質、糖脂質 またはプロテオグリカンのような分子の間の高い結合親和性が使用される。 マーカーのネットワークの創成が検出シグナルをかなり増幅することを可能に することを含めて、このテーマに対しては、著しく広範囲の一連の変動が可能で ある。これらのすべての方法は、いずれの場合も、標的分子の特異的同定が可能 な分子としで抗体の使用に関連し、したがって、それらはまた、標的分子の濃度 により感度レベルが限定されることである。 後者の限定は，さらに最近ここで検出酵素の代わりにこの目的のためのＰＣＲ （ポリメラーゼチェーン反応）技術の適用に基づいて立案された方法により克服 された。これらの方法は、実際、この場合も、タンパク質ではなく、既知の配列 をもつポヌクレオチドに生理学的にカップリングする特異的なリガンドに対する モノクローナル抗体の使用に基づいている。 これは、既知のＤＮＡ配列の増幅によって以後の検出を実施することを可能に し、これは、ポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）の使用が効果的に達成される (V.Ruzickaら，1993;T.Sanoら，1992;H.Zhouら，1993)。 免疫ＰＣＲとして知られるこの方法は実際、標的分子に唯一の抗体が結合して いても検出することを可能にする。感度におけるかなりの改良にもかかわらず、 これらの方法には、とくにポリヌクレオチドと抗体の直接的な会合ならびに関心 分子への抗体の結合時におけるポリヌクレオチドよる避け難い干渉により生じる 高いバックグランドのような一連の問題を提供する。 さらに、増幅反応の特異性および収率が反応試薬を混合するときの温度に依存 するとし、ＰＣＲ反応がプライマーのハイブリダイゼーションに至適と考えられ る温度以下の温度で起こるとすると、非特異的なハイブリダイゼーション産物を 得ることができる。 現在ではこの問題は、システムが「熱開始」プライマーの特異的ハイブリダイ ゼーションが可能になる温度に到達したのちにのみ、必須の試薬の増幅反応への 添加を行うことによって解決している。この操作は試薬を機械的に分離すること により(D.E.Birchら，1996)、またはＤＮＡポリメラーゼの酵素活性をブロッ クする抗体を用いることにより(J.Chengら，1996)達成される。 最近、増幅反応に続いてインシトゥハイブリダイゼーション反応を行うインシ トゥＰＣＲとして知られる細胞上で実施されるＰＣＲ法が開発されている(G.J.N uovo，1994)。この方法によれば、ＤＮＡ鋳型およびプライマーは、非特異的ハ イブリダイゼーション反応を回避する利点から、細胞分解の瞬間まで、生理学的 に分離したままに置かれる(ＥＰ524908；Hoffmann La Roche Inc.)。 さらに、最近の方法の多くの代表的な問題を克服すると考えられ、したがって 応答シグナルの増幅を改良する、新たな診断方法にすべて関連する一連の特許が ある。これらは、それらの主題として様々な方法を有し、たとえば特定のタンパ ク質の発見と関連するＰＣＲの使用(ＷＯ 9421676)；リガンドたとえばウイルス ＨＩＶ-１のエピトープに接合した遺伝子操作ハイブリッド酵素の使用(ＷＯ 942 636)；抗原に結合するタンパク質と複合させた核酸から発生させたウイルスエピ トープの使用(ＷＯ 9406934)；制御配列に連結したウイルスエピトープおよびそ のエピトープに向けられたモノクローナル抗体の発現のために、たとえばＨＣＶ から得られたウイルスｃＤＮＡの部分の使用がある。後者の場合、興味あるｃＤ ＮＡ領域は抗体応答とＤＮＡとのハイブリダイゼーション後に生じる応答の間の 交差制御の実施を可能にする(ＥＰ388232)。 一方、他の特許はその主題を、ＤＮＡアーゼ-Ｉによるウイルスゲノムたとえ ばＨＩＶ-１の消化により得られる抗原決定基のライブラリーの構築に有し、適 当なベクターを用いて得られたこれらのフラグメントの発現に続いて、上記発現 産物を抗体の使用によりついで選択するものである(ＥＰ373070)。 この関連で、本発明の価値はその主題として、広範に異なる状況および広範に 異なる目的に使用できるきわめて多目的の方法からなり、現在の技術水準で存在 する様々な問題の克服を可能にする点にある。 本発明の方法は、実際、特異的な抗体の産生ではなく、検査すべきサンプル中 の関心分子と相互作用できる任意の分子をカプシド上に表す組換え線状ファージ の使用を前提とするものである。 適当な分子を表すファージが利用可能である場合は、問題の分子が様々な起源 （ヒト生体または動物生体から採取したサンプルのみならず、他の種類のたとえ ば水、飲料または食品）の生物学的サンプル中に微量に存在しても、任意の種類 の関心分子（アミノ酸のみではなく）の存在を検出することを可能にする。本発 明の主題を形成する操作の組合せはまた、結果の明瞭性を危くするＤＮＡと試薬 の間の非特異的会合ならびにその結果としてのバックグランドの危険を消失させ るように統合される。 これらの利点は、ＰＣＲによる検出に使用されたＤＮＡが試薬に直接暴露され るのではなく、採用された組換えファージの内部に包含されているという事実の 結果である。 タンパク性カプシド封入への存在は実際に、以後の検出に用いられるＤＮＡを リガンド分子（一方はカプシドに暴露される）と受容体分子（サンプル中の関心 分子）の間の結合反応時の干渉から防止する。 これに続いて、リガンド分子と受容体分子の間の相互作用ののち、適当な洗浄 操作を行って、特異的な相互作用により受容体に結合しなかったファージを除去 する。最後に、ファージＤＮＡのヌクレオチド配列を、非特異的な反乱を回避す る方法に必要な試薬を添加することにより増幅させる。実際、増幅させるＤＮＡ は初期の段階にはファージカプシドのタンパク質により保護されたままで、タン パク質はポリメリゼーション反応が開始された瞬間にはじめて変性される。 その他の利点は、受容体ファージの構築に用いられた基本的組換えファージミ ドが一本鎖ＤＮＡを含有する粒子として大腸菌により本質的に分泌されるという 事実に由来する。実際一本鎖ＤＮＡ鋳型上ＰＣＲの使用が二本鎖ＤＮＡ上で実施 した場合よりも良好な結果を与えることは、現在の技術水準から既知である。 本発明は、さらに添付の図面を参照すればより明瞭なものになろう。 図１は抗-ＨＣＶ抗体に結合できるペプチドをカプシドの表面に現すファージ Ｐ787のＤＮＡの増幅の結果を示す。エチジウムブロミド含有アガロースゲル上 ＵＶ蛍光により可視化する。ＭはプラスミドＤＮＡｐＵＣ19の制限酵素Hinf Ｉ による加水分解によって得られた分子量の標準である。 図２は、抗-ＨＣＶ抗体を含有する患者からのＣ17およびＣ22血清とインキュ ベーションしたのちの、ファージ混合物のＤＮＡの増幅の結果を示す。可視化は エチジウムブロミド含有アガロースゲル上ＵＶ蛍光による。ＰＣ89は非組換え ファージであり、それとファージライブラリーを構築して、ここで陰性対照とし て使用した。 図３は、図２において使用したのと同一のファージ混合物のＤＮＡを、２名の 志願者からの抗-ＨＣＶ抗体を含まない、したがって、陰性対照と考えられる血 清Ｎ57およびＮ60とインキュベーション後に増幅した結果である。可視化は、エ チジウムブロミド含有アガロースゲル上ＵＶ蛍光による。ＰＣ89は実施例１に上 述したように陰性対照ファージである。ＭはプラスミドＤＮＡｐＵＣ19の制限酵 素HinfＩによる加水分解によって得られた分子量の標準である。 本発明の主題は、ある種の関心分子、この関係では受容体分子としても指示さ れる分子の存在を、少なくともある種の分子、ここではリガンド分子として指示 され、ファージカプシド上に暴露された分子により特異的に認識されるそれらの 能力に基づいた定量および測定方法である。 この記載中、リガンド分子および受容体分子の概念はいかに厳密に相互に依存 し、特異的な作業概念に厳密に結合するかが強調される必要がある。この結果と してカプシドの表面に暴露される分子は、サンプル中における存在が考えられ、 その存在または濃度が測定される分子に特異的に結合し、したがって「受容体」 と定義される分子に特異的に結合するその能力に基づきもっぱら「リガンド」と 定義され、およびその逆である。 本発明においては、たとえば生物学的液体、細胞もしくは組織の表面のような ソースから得られる任意の分子は、上に定義したような特異的「リガンド」との 相互作用によってその存在が同定できれば、「受容体」と考えられる。たとえば 確認された抗原（ウイルス抗原、腫瘍抗原もしくは正常組織に存在する抗原）を 明瞭に認識できる抗体、またはその正確な分子的性質はまだ分かっていない抗原 が、単独ではこの範疇ではないが、「リガンド」の範疇に属する。この場合、こ れらの抗原は「受容体」と考えられる。これらの定義は、たとえば、検討される 生物学的液体中または細胞および組織の表面上におけるこれらの抗原の存在およ び/または濃度が診断的価値を有する指標である場合に関係する。しかしながら 、本発明の方法によれば、存在または濃度の測定が必要な関心受容体分子が抗体 を形成する場合には、抗原自体をリガンドとして使用することが可能である。 同様に、関心があれば、この場合それらと特異的に結合できる分子、すなわち 「リガンド」として作用することにより検出されることになる生物学的液体中に 存在する可溶性受容体とともに、単一細胞または組織中の細胞の膜上に存在する 特異的受容体も「受容体」と考えることが可能である。関心分子がもはや、膜受 容体を形成しない（この場合は「リガンド」として作用する）が、それらの特異 的リガンド（この場合は「受容体」と考えられる）と考えられる。 したがって、検討下にあるサンプル中における存在が診断的および/または予 知的価値（特異的病態の出現とのその関連が確認されたのち）を有することまた はいずれの目的であれ興味がもたれることが考えられる任意の分子は「受容体」 の範疇に包含できることを理解すべきである。 この方法には、とくに医学および獣医学のみでなく、他の分野たとえば食品お よび環境の分野にも、多くの適用が明らかである。 この方法は、「リガンド」およびサンプル中に存在する受容体分子の間の相互 作用を検出するため、組換えまたは非組換えいずれかの線状バクテリオファージ の使用が可能なことは、本発明者らにより、サンプル中に存在する受容体分子が 著しく低濃度であっても、ファージゲノム中に存在し、物理的または遺伝子的に 「リガンド」に関連する特異的ヌクレオチド配列の増幅により、次のように検証 された。 簡略に述べれば、本発明の方法は、常に適用が可能で、以下を同定することが できる。すなわち、 Ａ）生物学的液体中または細胞もしくは組織の表面上におけるその存在が、あ る病態に相関するか、または、たとえば診断的目的からかなりの興味がもたれる 場合の受容体分子または「受容体」群を形成する均一なクラス、および Ｂ）その構造がそれらをバクテリオファージのカプシド上に暴露することを可 能にし、受容体分子に特異的に結合する能力を保持する、たとえばポリペプチド 型の「リガンド」または「リガンド」群のクラスである。 本発明の主題は、したがって、本質的に以下の操作に基づく方法である。すな わち、 ａ）ファージの表面上に暴露された分子と相互作用する能力を破壊することな く、関心分子を固定化し、 ｂ）上述のように固定化された分子を、内部にその配列が少なくとも部分的に 既知の一本鎖ＤＮＡ分子を有し、生物学的サンプル中に存在する少なくとも１個 の関心分子に特異的に結合できる少なくとも１個の分子がカプシドの表面上に暴 露された少なくとも１個の組換え線状バクテリオファージと、特異的結合を生じ させ、 ｃ）この方法で得られた分子-バクテリオファージ複合体を、反応混合物から 分離し、 ｄ）分子とバクテリオファージの間の非特異的相互作用によって発生した複合 体を除去するために洗浄し、 ｅ）以下のｇ）に記載の操作を実施するための試薬を添加し、 ｆ）このように選択されたバクテリオファージタンパク質カプシドを形成する タンパク質を溶解させ、 ｇ）上述のようにして得られたＤＮＡをポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ） によって増幅し、 ｈ）上述のように増幅されたＤＮＡをたとえば慣用の方法により検出する。 増幅されたＤＮＡを検出する方法は、たとえば、エチジウムブロミドの存在下 におけるアガロースゲル上電気泳動、キャピラリー電気泳動、放射能で特異的に 標識したまたは発光プローブへのハイブリダイゼーションによることができる。 とくにｇ）に指示した操作、すなわち、ファージＤＮＡの増幅は、少なくとも １種はファージＤＮＡの既知配列と相補性である１対のオリゴヌクレオチドを用 い、ＰＣＲによって行われる。さらに、ファージカプシドタンパク質の溶解のプ ロトコールは、そのＤＮＡの変性が起こり、通常93〜96℃の範囲内に落ちる温度 を使用し、プライマーとＤＮＡ鋳型の接触は同じ温度で行うと、すなわちＰＣＲ に「熱開始」を行うと、結果として非特異的反応産物の事実上の消失が達成され ることを見出した。 この方法の重要な適用は関心分子が抗体の場合である。 さらに特異的な適用では、関心分子の固定化が固相に行われ、この場合それは 続いて受動吸着および/または分子自体に特異的な抗体を用いることにより達成 される。 いずれにしても、固定化はまた、細菌またはStaffilococcus Aureus、グルー プＣ strep tococciのプロテインＧ、および動物免疫グロブリンに結合できる任 意の他の細菌性タンパク質からなる群より選択される細菌性タンパク質少なくと も１種を使用することにより達成できる。 とくに興味があるこの方法のさらに他の適用は、使用されるバクテリオファー ジがカプシドの表面上にウイルス抗原、自己抗原（生物学的液体のソースである 動物に存在できる抗原）、アレルゲン、細胞膜受容体、上記分子の部分、または 検討下の生物学的液体中のその存在を模倣できるオリゴペプチド、ならびにそれ らに由来する特異的な細胞膜受容体もしくはペプチド、または試験される液体中 に受容体が存在するアミノ酸型のリガンドを表す場合である。 この方法の基本的な態様中には、まず第一に、検出のために用いられる手段は 常に一般に組換え型のＭ13、ｆ１またはｆｄの線状バクテリオファージであり、 それはカプシドの表面上に、好ましくはアミノ酸型の、試験すべき「受容体」と 特異的に相互作用できる「リガンド」として働く分子１種または２種以上を暴露 することを可能にする。これは、独創性の第一の要素を形成し、もはやリガンド 分子を直接使用する必要はなく、適当に選択された天然の「リガンド」、それらの 部分または模倣体を含有するファージが使用される。 本発明はそれ自体、過去に記載された他の検出方法、たとえば抗体をプローブ として使用される既知の配列を有するポリヌクレオチド分子と人工的に結合させ る免疫ＰＣＲとは、本発明ではファージの内部に含有された遺伝情報を関心分子 の存在の決定に使用するという事実によって正に識別される。 さらに、異なるファージを同時に使用する能力は、関心分子または多数の関心 分子さえ同時に検出することを可能にする。 しかしながら、主要な特徴はとくに、ファージの表面上に暴露された「リガン ド」とＰＣＲによる検出に用いられるファージＤＮＡとの会合である。これは、 「リガンド」をコードする遺伝情報のみでなく、また、さらに一般的にファージ ゲノム中の任意のヌクレオチド配列を構成することが可能である。 この結果として、本発明の方法はまた、検出に使用される「リガンド」と会合 するヌクレオチド配列を、特異性を増大させ増幅反応時間を短縮するように選択 することを可能にした。事実上、ＰＣＲ反応を達成するには、オリゴヌクレオチ ドプライマーの配列、各インキュベーションが行われる時問および温度ならびに 各反応におけるサイクル数が、きわめて迅速なそして高度に特異的な増幅を得る ようにこの時点で予め選択できる。 事実上、その性質により、ファージの内部に存在し検出に使用される遺伝情報 は、反応管中に１個のＤＮＡ分子の存在でも強調することを可能にする現時点の ＰＣＲ法を用いるととくに増幅させる傾向がある。ポリメラーゼチェーン反応を 用いて得られる感度は現在使用されている他の検出方法を用いては容易に達成す ることはできない。 これから得られる他の利点は、増幅に使用されるオリゴヌクレオチドプローブ が、ファージ中に存在する特定のＤＮＡを、それを含まない他のファージからの ＤＮＡの存在下にも特異的な増幅を与えるように設計することができる。たとえ ば、特異的な挿入体を含有するファージのＤＮＡのみ（たとえば、カプシド上に 暴露された場合「リガンド」として作用する分子をコードするＤＮＡ）を、この 挿入体を含まないファージのＤＮＡの存在下でも、増幅するようにプローブを設 計することが可能である。これの最も直接的な結果は、検討下にある受容体分子 （単数または複数）を異なるファージの混合物と反応させて、他のファージの存 在下でも、各単一の種類のファージとの結合を同定することが可能である。 さらにＤＮＡがタンパク性のカプシドの内部に含まれるという事実は、ＰＣＲ 法に典型的な検出特異性の限界の一つの克服を可能にする。この限界は、２個の プライマーの配列により、ＤＮＡ鋳型を増幅プローブと比較的低温で接触させる 必要である。温度を最初の増幅サイクルを開始させるために上昇させるとＤＮＡ の一部はプローブに複合体化したままで、これはＤＮＡ鋳型上でプローブ自体の 非特異的延長を生じる。様々な方法がこの問題を除去するために提案されている (４，５)。本発明の方法は、上述のように、天然にカプシドの内部に封入された ＤＮＡを使用し、したがってそれはカプシドの溶解のときまで特異的プローブと の接触から保護されるという事実を使用することで問題を見事に解決することが できる。この点に関して、きわめて高い特異性が、単にその方法を、ＤＮＡと 特異的プローブの間の接触を高温でのみ可能にする熱溶解プロトコールを用いて 遂行することにより得ることができる。 この実施態様によりむしろ単純にまたきわめて実用的に達成される様式におい て、ＰＣＲの「熱開始(Hot Start)」という技術用語で知られた方法を達成する ことができる。 以上、本発明を一般的に記述してきた。以下の実施例を参照し、特異的実施態 様のさらに詳細な説明を、本発明の対象、特徴、利点および操作のより明瞭な理 解のために掲げる。これらの実施例は単に例示のためのものであり、請求の範囲 に定義された本発明の範囲をいかなる意味でも限定するものではない。 実施例１ ヒト肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の抗原に対する特異的な抗体の患者血清中におけ る検出方法 本発明に従い、以下の方法を使用した。 Ｆｃ部分に特異的なヒトのヤギ−抗-ＩｇＧ免疫グロブリンを、最近ＰＣＲ法 に用いられている96ウエルのポリカルボネートプレート［Coster製，Thermowell -II（登録商標）6509型］のウエルに吸着させた。インキュベーション後、プレ ートを食塩リン酸緩衝液で洗浄し、残った吸着部位を粉末スキムミルクを再懸濁 した緩衝液中でインキュベートしてブロックした(文献に記載されたように)。以 下を次の方法で調製してプレート上のウエルに分配した。１）各種レベルに希釈 した試験すべきヒト血清の量;この実施例では、ＨＶＣに感染し、抗-ＨＣＶ抗体 を含有する患者からのヒト血清Ｃ17およびＣ22型を使用した。Ｎ57およびＮ6Oは 見掛け上健康な抗-ＨＣＶ抗体は見出せない個体から得られた血清型である。こ れらの血清の量を非特異的担体として作用する非組換え型のファージと混合する 。ＰＣＲ反応で増幅できるが、カプシド上には特異的リガンドを示さない組換え ファージ２Ａ、本実施例ではヒト抗-ＨＣＶ抗体を結合できるペプチド、また２ ＢＨＣＶ-特異的ファージＰ787を添加した。 37℃で90分間インキュベートしたのちプレートを空にしてリン酸緩衝液で洗浄 し、特異的に結合しなかったすべての組換えファージを除去した。各ウエルにつ いで、ＰＣＲに適当な緩衝液中、増幅に特異的なＤＮＡプローブ、ポリメラー ゼＴaq、ジオキシヌクレオチド三リン酸塩を含む混合物を加えた。 プレートをＰＣＲのために熱インキュベーターに移し、５分間95℃に加熱して 開始する反応サイクルでプロセスを継続した。この経過は、ファージタンパク質 の溶解が起こり、ついで増幅すべきＤＮＡが特異的プローブと接触するのはこの 温度でのみであることから、とくに重要である。ＰＣＲ反応はこの高温で開始し （熱開始）、94℃で10秒間および72℃で10秒間の25サイクルを続ける。反応は72 ℃で２分間インキュベートして終結する。 この方法で増幅されたファージＰ787のＤＮＡはエチジウムブロミドを含むア ガロースゲル上電気泳動により特異的実施例１に示すように強調する。 実施例２ 患者血清中における抗-ＨＣＶ抗体の存在を診断するファージの組成物の使用 それぞれヒトＣ型肝炎ウイルスの異なるタンパク性領域を模倣する特異的に選 択された多数のファージの組成物を、血清中の抗-ＨＣＶ抗体存在を診断するた めに使用した。それらがもつ配列によってファージは識別できるが、より単純に 挿入体の長さにより、ファージＤＮＡ挿入体のディメンションに従いアガロース ゲル上で異なる長さのＤＮＡフラグメントの増幅を観察することが可能である。 本実施例では、ファージの混合物を使用して、いかに実施例１に記載のように アガロースゲル上の応答を得ることが可能であるかを示す。 血清中で異なる抗原の抗体を同定できること、および増幅応答が特異的である ことは驚くべきである。図２および図３に示す結果は、しかしながら、実施例１ に上述した電気泳動により分析することができる応答から構成される。 実施例３ ヒト抗-ＩＬ-６抗体のインビトロでの検出方法 ＩＬ-６に対する受容体がプレート上に固定化され、ＩＬ-６を発現するファー ジが細胞外培養培地中のその存在を検出するために使用される方法を記載する。 ｈＩＬ-６をコードするヒトｃＤＮＡを、Ｍ13から文献記載のようにして得ら れたファージミドの遺伝子IIIのアミノ末端に融合させた。組換えｈＩＬ-６/Ｍ1 3-ｐIIIファージはヒトインターロイキン６受容体の存在の検出に使用できる。 本技術分野では、文献記載のようにｈＩＬ-６/Ｒおよび抗-ｈＩＬ-６抗体の両者 をインビトロで結合できるｈＩＬ-６を発現するファージをいかに選択するかは 既に記載されている。本発明者らは、本発明に記載の方法を使用すれば、認識が さらに効果的に可能であることを証明した。 固体支持体、たとえば、プラスチックビーズに、１μｇのモノクローナル抗- ｈＩＬ-６抗体を10ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ9.2中４℃で一夜インキュベートし て固定した。１ mlのＴＢＳ/６％ＢＳＡ中、４℃で４時間インキュベートしてブ ロックしたのちビーズをｈＩＬ-６と４℃で一夜インキュベートした。ビーズを ２mlのＴＢＳＴによる洗浄に２回付し、ついで１ mlのＴＢＳＴ/0.1％ＢＳＡ中 で１時間インキュベートした。ついでフアージを500μlの100ｍＭグリシン塩酸 塩、ｐＨ2.2で溶出し、溶出液を３ＭのＴris-ＨＣl，ｐＨ8.9で中和した。抗体 に結合したファージは本発明に記載したようにＰＣＲにより検出できる。 実施例４ ヒトＩＬ-６受容体の可溶化型の検出方法 遺伝子操作した卵胞癌細胞に発現させたヒトＩＬ-６受容体を、本発明に記載 の方法に従い検出し、可能であれば、ＩＬ-６またはＩＬ-６のスーパーアンタゴ ニストを発現できるファージを用いて定量する方法を記載する。 ＣＨＯ細胞系（CsRh14）はインターロイキン６受容体（ref）の可溶化型を分 泌できる。100μｌのトシル活性化したDynabeads M450（unipath）を用いて濃縮 型を調製し、磁性粒子コンセントレーターを用いて50ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐ Ｈ9.5で洗浄し、ついで15μｇのモノクロナール抗-ｈＩＬ-６Ｒα抗体を含有す る同一緩衝液400μｌ中25℃で24時間インキュベートした。ＴＢＳ/0.1％ＢＳＡ 中４℃で12時間飽和継代後、ビーズを、CsRh14系から得られた血清を含まない、 shＩＬ-６Ｒα250ngを含有する条件培地400μｌと25℃で４時間インキュベート した。shＩＬ-６Ｒαが結合したビーズを数回洗浄したのちに、ｈＩＬ-６を発現 できるファージとともに（１：４の比）、４℃で16時間インキュベートした。反 応容量をＴＢＳ/0.1％ＢＳＡの適当量を加えることにより、１mlとした。ビーズ を１mlのＴＢＳＴで３回洗浄したのち、ファージを 400mlの100ｍＭのクエン酸塩緩衝液、ｐＨ3.2で溶出した。３Ｍ TrisＣＨｌ、ｐ Ｈ8.9で中和したのち、結合したファージを本発明の本質に従いＰＣＲで検出し た。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年１２月１８日（１９９８．１２．１８） 【補正内容】 【図３】 【手続補正書】 【提出日】平成１２年３月２９日（２０００．３．２９） 【補正内容】 請求の範囲 １．生物学的サンプル中の興味ある分子の存在を検出するための方法であって 、 ａ）ファージの表面に暴露された分子と相互作用する能力を破壊することなく 興味ある分子を固定化し、 ｂ）上述のように固定化された興味ある分子を、その配列が少なくとも部分的 に既知の一本鎖ＤＮＡ分子を内部に有し、生物学的サンプル中に存在する少なく とも１個の興味ある分子に特異的に結合できる少なくとも１個の分子をカプシド 表面上に露出する少なくとも１個の組換え線状バクテリオファージと、特異的に 結合させ、 ｃ）この方法で得られた分子-バクテリオファージ複合体を、反応混合物から 分離し、 ｄ）分子とバクテリオファージの間の非特異的相互作用によって発生した複合 体を除去するために洗浄し、 ｅ）以下のｇ）に記載の操作を実施するための試薬を添加し、 ｆ）このように選択されたバクテリオファージタンパク質カプシドを形成する タンパク質を溶解させ、 ｇ）上述のようにして得られたＤＮＡをポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ） によって増幅し、 ｈ）上述のように増幅されたＤＮＡを検出する操作からなる上記方法。 ２．ｆ）で示された操作はＤＮＡの変性が起こる温度で実施して、ｇ）で示さ れた以後の操作工程を形成し、これはカプシドタンパク質の溶解後直ちに同じ温 度で行い、すなわちＰＣＲの「熱開始」を達成することからなる、生物学的サン プル中の興味ある分子を検出するための請求項１記載の方法。 ３．興味ある分子は抗体である、生物学的サンプル中の興味ある分子を検出す るための請求項１または２記載の方法。 ４．興味ある分子は固相に固定化される、生物学的サンプル中の興味ある分子 を検出するための請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。 ５．興味ある分子の固相上への固定化は受動吸着によって行われる、生物学的 サンプル中の興味ある分子を検出するための請求項４記載の方法。 ６．興味ある分子の固相上への固定化はその分子自体に特異的な抗体の使用に より行われる、生物学的サンプル中の興味ある分子を検出するための請求項４記 載の方法。 ７．分子の固相上への固定化は、細菌またはスタフィロコッカス・アウレウス (Staffilococcus Aureus)のプロテインＡ、グループＣストレプトコッカス(Stre ptococci)のプロテインＧ、および動物免疫グロブリンに結合できる任意の他の 細菌性タンパク質からなる群より選択される少なくとも１個の細菌性タンパク質 の使用により行われる、生物学的サンプル中の興味ある分子を検出するための請 求項３記載の方法。 ８．バクテリオファージはカプシド表面上にウイルス抗原、その部分または検 討下にある生物学的液体中のそれらの存在の効果を模倣できるオリゴペプチドを 示す、生物学的サンプル中の興味ある分子を検出するための請求項１〜７のいず れか一項に記載の方法。 ９．バク・テリオファージはカプシド表面上に自己抗原、その部分または検討 下にある生物学的液体中のそれらの存在の効果を模倣できるオリゴペプチドを示 す、生物学的サンプル中の興味ある分子を検出するための請求項１〜７のいずれ か一項に記載の方法。 10．バクテリオファージはカプシド表面上にアレルゲン、その部分または検討 下にある生物学的液体中のそれらの存在の効果を模倣できるオリゴペプチドを示 す、生物学的サンプル中の興味ある分子を検出するための請求項１〜７のいずれ か一項に記載の方法。 11．バクテリオファージはカプシド表面上に細胞膜受容体、それらの受容体の 部分またはそれらの生物活性を模倣できるオリゴペプチドを示す、生物学的サン プル中の興味ある分子を検出するための請求項１〜７のいずれか一項に記載の方 法。 12．バクテリオファージはカプシド表面上に特異的細胞膜受容体、またはそれ らから誘導されるぺプチドを示す、生物学的サンプル中の興味ある分子を検出す るための請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。 13．バクテリオファージはカプシド表面上に、試験される液体中にその受容体 が存在すると思われるアミノ酸の性質のリガンドを示す、生物学的サンプル中の 興味ある分子を検出するための請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。 14．バクテリオファージはカプシド表面上に請求項11〜13のいずれか一項に記 載の分子をともに示す、生物学的サンプル中の興味ある分子を検出するための請 求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＵ ，ＣＡ，ＣＮ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＵＳ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．生物学的サンプル中の関心分子の存在を検出する方法において、 ａ）ファージの表面に暴露された分子と相互作用する能力を破壊することなく 関心分子を固定化し、 ｂ）上述のように固定化された関心分子を、内部にその配列が少なくとも部分 的に既知の一本鎖ＤＮＡ分子を有し、生物学的サンプル中に存在する少なくとも １個の関心分子に特異的に結合できる少なくとも１種の分子がカプシドの表面上 に暴露された少なくとも１個の組換え線状バクテリオファージと、特異的結合を 生じさせ、 ｃ）この方法で得られた分子-バクテリオファージ複合体を、反応混合物から 分離し、 ｄ）分子とバクテリオファージの間の非特異的相互作用によって発生した複合 体を除去するために洗浄し、 ｅ）以下のｇ）に記載の操作を実施するための試薬を添加し、 ｆ）このように選択されたバクテリオファージタンパク質カプシドを形成する タンパク質を溶解させ、 ｇ）上述のようにして得られたＤＮＡをポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ） によって増幅し、 ｈ）上述のように増幅されたＤＮＡを検出することからなる方法。 ２．ｆ）で示された操作はＤＮＡの変性が起こる温度で実施して、ｇ）で示さ れた以後の操作工程を形成し、これはカプシドタンパク質の溶解後直ちに同じ温 度で行い、すなわちＰＣＲの「熱開始」を達成することからなる「請求項１」記 栽の方法。 ３．関心分子は抗体である生物学的サンプル中の関心分子を検出する「請求項 １および２」のいずれに記載の方法。 ４．関心分子は固相に固定化される生物学的サンプル中の関心分子を検出する 「請求項１〜３」のいずれに記載の方法。 ５．関心分子の固相上への固定化は受動吸着によって行われる生物学的サンプ ル中の関心分子を検出する「請求項４」記載の方法。 ６．関心分子の固相上への固定化はその分子自体に特異的な抗体の使用により 行われる生物学的サンプル中の関心分子を検出する「請求項４」記載の方法。 ７．分子の固相上への固定化は、細菌またはStaffi1ococcus Aureusのプロテ インＡ、グループＣ StreptococciのプロテインＧ、および動物免疫グロブリン に結合できる任意の他の細菌性タンパク質からなる群より選択される細菌性タン パク質少なくとも１種の使用により行われる生物学的サンプル中の関心分子を検 出する「請求項３」記載の方法。 ８．バクテリオファージはカプシドの表面上にウイルス抗原、その部分または 検討下にある生物学的液体中のそれらの存在の効果を模倣できるオリゴペプチド を示す、生物学的サンプル中の関心分子を検出する「請求項１〜７」のいずれか に記載の方法。 ９．バクテリオファージはカプシドの表面上に自己抗原、その部分または検討 下にある生物学的液体中のそれらの存在の効果を模倣できるオリゴペプチドを示 す、生物学的サンプル中の関心分子を検出する「請求項１〜７」のいずれかに記 載の方法。 10．バクテリオファージはカプシドの表面上にアレルゲン、その部分または検 討下にある生物学的液体中のそれらの存在の効果を模倣できるオリゴペプチドを 示す、生物学的サンプル中の関心分子を検出する「請求項１〜７」のいずれかに 記載の方法。 11．バクテリオファージはカプシドの表面上に細胞膜受容体、それらの受容体 の部分またはそれらの生物活性を模倣できるオリゴペプチドを示す、生物学的サ ンプル中の関心分子を検出する「請求項１〜７」のいずれかに記載の方法。 12．バクテリオファージはカプシドの表面上に特異的細胞膜受容体、またはそ れらから誘導されるペプチドを示す、生物学的サンプル中の関心分子を検出する 「請求項１〜７」のいずれかに記載の方法。 13．バクテリオファージはカプシドの表面上に、試験される液体中にその受容 体が存在すると思われるアミノ酸の性質のリガンドを示す、生物学的サンプル中 の関心分子を検出する「請求項１〜７」のいずれかに記載の方法。 14．バクテリオファージはカプシドの表面上に「請求項11〜16」のいずれかに 記載の分子をともに示す、生物学的サンプル中の関心分子を検出する「請求項１ 〜７」のいずれかに記載の方法。 15．上に記載、例示および請求された、生物学的サンプル中の関心分子を検出 する方法。