JPH03257371A

JPH03257371A - 免疫学的測定方法

Info

Publication number: JPH03257371A
Application number: JP5506290A
Authority: JP
Inventors: Tadashi Hara; 正原; Kuniyo Inoue; 國世井上
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1990-03-08
Filing date: 1990-03-08
Publication date: 1991-11-15

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、核酸にタンパク質を結合し、タンパク質を特
異的に認識するモノクローナル抗体、相補的な核酸、二
本鎖核酸を特異的に認識するモノクローナル抗体を用い
る、核酸のサンドイツチ法による免疫測定方法に関する
ものである。

（従来の技術）核酸の塩基配列を同定することは、臨床的に現在非常に
注目されている診断方法である。この診断方法は、感染
症の診断、ヒト遺伝子疾患の診断、癌診断などで用いら
れることが期待されている。

例えば、感染症としてサルモネラ、赤痢などの細菌、肝
炎やエイズなどのウィルス、マイコプラズマ、寄生虫、
クラミヂアなどの微生物による感染症の診断に応用でき
る。また遺伝子診断では、遺伝子欠陥が病気の原因にな
っているもので、現在数千種類あるといわれているもの
についても応用できる。例えば染色体性遺伝病として、
ダウン症候群、ターナ−症候群等、メンデル型遺伝病と
して、フェニルケトン尿症、血友病等、多因子型遺伝病
としては、本態性高血圧、糖尿病等が臨床診断としてあ
げられる。更に癌においては、正常な核酸配列が変異し
たり、活性化された結果生じた癌遺伝子を同定して診断
する。このように適切な核酸プローブさえ用いれば、病
因と関連している遺伝子、あるいはその一部を特異的に
同定し臨床診断することが期待され、その応用範囲はか
なり広きにわたることが考えられる。

核酸の測定方法としては、核酸ハイブリダイゼション法
による四つのアッセイ法が一般的である。つまり、ドツ
トハイブリダイゼーション法（Ｐ、　　５ｔａｌｈａｎ
ｄｓｋｅ。

Ｕ、Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ　　　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ、　　１５、７４４−７４７（１９８２）
）　、コロニーハイブリダイゼーション法（Ｍ、Ｊ、Ｈ
ａａｓ、ｅｔ　　ａｌ。

Ｐｅｒｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、（１９８７））、ｉｎ　　
５ｕｔｅハイブリダイゼーシヨン法（Ｃ。

Ｊ、Ｂｕｒｒｅｌｌ、Ｅ、Ｊ、Ｇｏｗａｎｓ、Ａ。

Ｒ，Ｊｉｌｂｅｒｔ、Ｊ、Ｒ，Ｌａ１ｃｅ、Ｂ、Ｐ。

Ｍａｒｍｉｏｎ　　Ｈｅｐａｔｏｌ、、２，８５Ｓ９１
Ｓ　（１９ｇ２）　）である。さらにサンドイッチハイ
ブリダイゼーション法（Ｍ。

Ｖｉｒｔａｎｅｎ、Ｍ、Ｌａａｋｓｏｎｅｎ、Ｈ。

Ｓ　　ｄｅｒｌｕｎｄ、Ａ、Ｐａ１ｖａ、Ｐ。

Ｈａｌｏｎｅｎ、Ｍ、Ｒａｎｋｉ　：Ｌａｎｃｅｔ。

ｔ、３８１−３８９　（１９８３））が開発されている
。

ドツトハイブリダイゼーション法について説明すると、
まず試料中の核酸を抽出してアルカリ処理（０，５Ｎ　
　Ｎａ０Ｈ）Ｌ、、一重鎖核酸とする。

この−重鎮核酸をニトロセルロースフィルターの上に固
定し、それに放射性標識したハイブリダイゼーションプ
ローブを加えてハイブリダイズする。

遊離のハイブリダイゼーションプローブを除去し、放射
性標識物質を検出する方法である。非放射性ハイブリダ
イゼーションプローブを使用するものとしては、核酸を
ハプテンで標識し、それを免疫学的に検出する方法（Ｊ
、Ｅ。

Ｌａｎｄｅｇｅｎｔ、ｅｔ　　ａｔ、、Ｅｘｐ。

Ｃｅ１１．Ｒｅｓ、、１５３．６ｌ−７２（１９８４）
、Ｐ、Ｔｃｈｅｎ、ｅｔ　　ａｌ。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。

８１．３４６６−３４７０　（１９ｇ４））　、ビオチ
ン標識した核酸プローブを試料中の核酸とハイブリダイ
ズさせ、次にストレプトアビジン、アルカリフォスファ
ターゼ、ＮＢＴ色素により発色させる方法（高橋豊三、
奥田研爾、ＢＩＯＩＮＤＵＳＴＲＹ、２，９２８−９３
５゜１０１３−１．０１５　（１９８５））　、オース
トラリアのＢＲＥＳＡ　（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　　ＥｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓＳｏｕ
ｔｈ　　　Ａｕ５ｔｒａｌｉａ　　　Ｐｔｙ。

Ｌｔｃｌ、）により開発されたＰｈｏｔｏｂｉｏｔｉｎ法、Ｏｒｇｅｎｉｃｓ社が開発
した抗体を利用するＣｈｅｍｉｐｒｏｂｅ法、和光純薬
工業（株）が開発したラベザイムベルオキシダーゼを標
的核酸に標識して検出する方法が市販されている。また
特開昭６０７２８２８号などがあげられる。

（発明が解決しようとする課題）従来知られた放射性標識したハイブリダイゼーションプ
ローブを用いる方法は、極めて簡便に、多検体を検出す
ることには優れている。しかしながら、放射性物質で標
識していることから経済的に高価になり、人体に対する
安全性あるいは廃棄処理の安全性の問題、適切な放射性
物質使用設備の設置、放射性物質の半減期の問題等を考
慮しなければならない。非放射性標識したハイブリダイ
ゼーションプローブを用いる方法においては、感度が低
いし、フィルターを用いるので洗浄方法に工夫が必要で
ある。

（課題を解決するための手段）本発明者らは従来技術の課題を解決した、操作が簡便で
かつ安全に低コストに、くわえて感度良く日常的に核酸
を免疫学的に診断する方法について鋭意検討したところ
、核酸に構造特異的なモノクローナル抗体を用いること
によってこれらの課題を解決できることを見出し本発明
を完成させた。

即ち本発明は、（１）　ａ、蛋白質を認識する固定化モノクローナル抗
体（１）ｂ、蛋白質に結合した一重鎖核酸プローブＣ６一重鎖の
短鎖に処理された試料中の核酸ｄ、二重鎖核酸を構造特
異的に認識するモノクローナル抗体（２〉を接触させ、遊離の核酸、モノクローナル抗体、核酸プ
ローブを除去した後、生成した免疫反応生成物を定量す
ることを特徴とする免疫学的測定方法、及び（２）　ａ、蛋白質を認識する固定化モノクローナル抗
体（１）ｂ、蛋白質に結合した、一重鎖の短鎖に処理された試料
中の核酸Ｃ０一重鎖核酸プローブｄ、二重鎖核酸を構造特異的に認識するモノクローナル
抗体（２〉を接触させ、遊離の核酸、モノクローナル抗体、核酸プ
ローブを除去した後、生成した免疫反応生成物を定量す
ることを特徴とする免疫学的測定方法である。以下、本発明の詳細な説明する。

本発明で使用するモノクローナル抗体は、Ｇ。

Ｋｏｈｌｅｒ、Ｃ，Ｍｉ　ｌ５ｔｅｉｎらの方法（Ｎａ
ｔｕｒｅ、２５６，４９５．１９７５）に従って調製し
、蛋白質を認識するモノクローナル抗体及び二重鎖核酸
を構造特異的に認識するモノクローナル抗体を得ればよ
い。

蛋白質を認識するモノクローナル抗体を固相に固定化す
るには、通常知られた物理的あるいは化学的方法等を用
いれば良い。更に、例えば固相に蛋白質を認識するモノ
クローナル抗体（１）のＦｃ領域を特異的に認識する抗
体を物理的あるいは化学的に固定化し、その後、該抗体
を介して蛋白質を認識するモノクローナル抗体（１）を
固定化しても良い。固相としては、例えばポリスチレン
、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、
セファロース粒子、ラテックス、アガロース、セルロー
ス、ポリメタアクリレートなどが使用される。

また二重鎖核酸を構造特異的に認識するモノクローナル
抗体（２〉を標識化することにより、最終的に生成した
免疫反応生成物の検出を簡便に行うことができる。この
標識化の方法と検出方法もなんら限定されるものでなく
、公知の方法により標識化および検出することができる
。標識としては、例えば、３）（、１２５１，１３１■
等の放射性物質を用いることも出来るが、安全性、管理
の容易さ等の点から、例えばフルオレスカミン、フルオ
レラセンチオシアネート、テトラローダミンイソチオシ
アネート等が常法により用いられる。更に好ましくは、
通常のエンザイムイムノアツセイで使用される様な酵素
、例えばペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
、アルカリホスファターゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、
β−グルクロニダーゼなどが良い。

標識されていないモノクローナル抗体（２）を用いた場
合には、前記した様な標識物質で標識された、モノクロ
ーナル抗体（２）のＦｃ領域を特異的に認識する抗体を
使用して、固相上に標識物質を有する免疫反応複合体を
形成させる。この複合体は詳しくは、固相・・・モノクローナル抗体（１）−蛋白質の結合し
た核酸−核酸−モノクローナル抗体（２）・・・標識物
質と表される。ここで、・・・は前記した様にモノクロナ
ル抗体（１）又は（２）とは異なる、ポリクローナル抗
体又はモノクローナル抗体を介しても良い結合である。

ただし、本発明で同一のサブクラスに属するモノクロー
ナル抗体（１）及び（２）　０を使用する場合には制限が生じる。即ち、同一のサブク
ラスに属するモノクローナル抗体は、そのＦｃ領域が同
一であることから、例えばモノクロナル抗体（２）のＦ
ｃ領域を認識するように調整された、標識された抗体が
誤ってモノクローナル抗体（１）のＦｃ領域を認識し、
複合体固相・・・モノクローナル抗体（１）・・・標識
物質を形成する可能性があるからである。従って本発明
では、抗体の調製などの操作を簡便にするためにも固相
に物理的あるいは化学的に結合したモノクローナル抗体
（１）及び標識物質と化学的に結合したモノクローナル
抗体（２）の２種モノクローナル抗体を使用することが
好ましい。蛋白質を特異的に認識するモノクローナル抗
体（１）、二重鎖核酸を特異的に認識するモノクローナ
ル抗体（２）以外の標識された抗体を用いる場合には、
サブクラスの異なるモノクローナル抗体（１）、モノク
ローナル抗体（２）を使用したり、あるいは標識物質と
直接（他の抗体を介さず）結合したモノクローナル抗体
（２）を使用することが好ましい。

試料中の核酸は、天然に存在するウィルス、細菌などの
微生物、動植物などに由来する一重鎖もしくは二重鎖核
酸であるが、特に限定されるものではない。二重鎖核酸
の場合は、一重鎖に融解した後、短鎖になるよう処理を
行なう。短鎖にしないと、ハイブリダイゼーションの障
害となる恐れがあるからである。

核酸とタンパク質の結合方法は、Ｎ−スクシンイミジル
−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ−１−（ＳＰ
ＤＰ）などによるジスルフィド結合による方法、カルボ
ジイミド法などなんら限定されるものでない。蛋白質と
してはとくに限定はないが、例えば血清アルブミンなど
をあげることができる。

以上のような反応物ａ、ｆｆｌ白質を認識する固定化モノクローナル抗体（
１）ｂ、蛋白質に結合した一重鎖核酸プローブｃ、一重鎖の
短鎖に処理された試料中の核酸コ１２ｄ、二重鎖核酸を構造特異的に認識するモノクローナル
抗体（２）またはａ、蛋白質を認識する固定化モノクローナル抗体（１）ｂ、蛋白質に結合した、一重鎖の短鎖に処理された試料
中の核酸ｃ、一重鎖核酸プローブｄ、二重鎖核酸を構造特異的に認識するモノクローナル
抗体（２）を接触させてハイブリダイゼーションおよび免疫反応を
おこなわせる。このとき、ａ、ｂ、ｃ、ｄの試料および
試薬の添加順序にはとくに限定はなく、任意の順序で添
加することができる。

標識されたモノクローナル抗体（２）のうち、遊離の（
間接的に固相に固定化されていない）標識されたモノク
ローナル抗体（２）や、核酸、核酸プローブの除去には
、例えば通常のイムノアッセイで使用されるＢ／Ｆ分離
法等の洗浄法を行えば良い。

（発明の効果）本発明によれば、簡便な操作により核酸の測定が可能で
ある。更に、本発明ではモノクローナル抗体の固定化お
よび標識物質のモノクローナル抗体への結合を前もって
行っておくことで、更に操作を簡便にし要する時間を短
縮することが可能である。このことは、短時間に多数の
検体（試料）を１ｌｌ１１定するという臨床的な要望を
解決するものである。また、試料または核酸プローブを
蛋白質に結合させるので、従来法に比べて感度が向上し
た。

さらに、モノクローナル抗体の結合が核酸ハイブリダイ
ゼーションの障害にならない、または、核酸ハイブリダ
イゼーションがモノクローナル抗体の粘合の障害になら
ないといった利点があげられる。

（実施例）以下本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示す
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１３〕　４［１］核酸とヒト血清アルブミンの結合方法（１）ヒト
血清アルブミン（以下Ｈ８Ａと省略する。）とＳＡＭＳ
Ａの結合精製した１ｍｇ／ｍｌのＩＳＡ溶液溶液１壱ｌ５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に対して透析した後、１ｍ
モル／ｍ　Ｉ（７）ＳＡＭＡＳ　（Ｓアセチルメルカプ
ト無水コハク酸）ジオキサン溶液７５μｌを加え、３０
℃で１時間インキュベートした。次にこれを１００ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）ｌ：対して透析しＳＡＭＳ
−ＨＳＡ溶液を得た。

（２）核酸と５ＰＤＰの結合末端をアミノ化した核酸（１５０μｇ）に５０ｍＭホウ
酸（ｐＨ９，５）を９５μｍを加えさらに２０　ｍ　ｇ
　／　ｍ　１の５ＰＤＰ５μｍを加え、３７℃で３０分
間インキュベートした。次にこれを逆相クロマトグラフ
ィー用カラム０ＤＳ−１２０Ｔ（東ソー社製）にかけ、
核酸−ＦＤＰ画分を分取した後凍結乾燥した。

（３）ｌ８Ａと核酸の結合（１）のＳＡＭＳ−Ｈ８Ａ４８μ１（５０μｇ）と（２
）の核酸−ＰＤＰＩ５μｇと２０ＸＳＳＣ５０μｌとＩ
　Ｍ　　Ｎ　Ｈ２０Ｈ２μｍを混ぜ合わせて４℃で、１
晩インキユベートした。次にＧ３０００ＳＷＸＬにかけ
Ｉ（ＳＡ−核酸画分を分取した。

［２］　　　［１１で作製したｌ５Ａ−核酸を用いた核
酸の酵素免疫測定（１）抗Ｈ８Ａモノクローナル抗体の固定化未処理マイ
クロタイタープレート（９６ウエル・タンクプレート、
インターメッド社製）の各ウェルに０．１Ｍ炭酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ９，５）に溶解した１０μｇ／ｍｌのマウス由来
の抗Ｈ９Ａ抗体の溶液１００μｍを加えて、室温で２時
間放置した。次に、各ウェルの溶液を除去し、リン酸緩
衝化生理食塩水（０，８５％ＮａＣ１含有０．０１％リ
ン酸緩衝液、ｐＨ７゜２二以下ＰＢＳ）に０．０４％ツ
イーン（ｔ　ｗ　ｅｅｎ）　−２０を含んだ溶液（以下
ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後、０．２％ゼラチンを溶
解したＰ　５６ＢＳ−Ｔ溶液３００μｌを各ウェルに加えて、４℃でブ
ロッキング処理しそのまま保存した。

（２）次に［１コで作製したｌ３Ａ−核酸をＰＢＳ−Ｔ
溶液に核酸濃度１μｇ／ｍｌで溶解した溶液を１００μ
ｌずつ各ウェルに加えて、３７℃で１．５時間インキュ
ベートした。次に、溶液を除去しＰＢＳ溶液３回洗浄し
た。

（３）２重鎖核酸の融解既知量の２重鎖核酸を含む０．１８ＭＮａＣ１溶液を５分間沸騰させた。この後すぐに氷冷し
、１本鎖核酸溶液を得た。

（４）ハイブリダイゼーション（３）で得られた１重鎖核酸溶液をハイブリダイゼーシ
ョン溶液（終濃度５ＸＳＳＣ，ｌｘデンハルト溶液、５
％デキストラン硫酸、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，
５））に溶解し各ウェルに１００μｍずつ加え、６５℃
で一晩インキユベートした。次にＰＢＳ−Ｔで３回洗浄
した。

（５）試料中の１重鎖核酸の測定次にマウス抗２時鎖核酸モノクローナル抗体をＰＢＳ−
Ｔ溶液で希釈し、各ウェルに１００μずつ添加した。３
７℃で１．５時間インキュベートした後、溶液を除去し
ＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。次にＰＢＳ−Ｔ溶液で
希釈したペルオキシダーゼ標識抗免疫グロブリン抗体（
タボ社製）を１００μｌずっ各ウェルに加え、３７℃で
１．５時間インキュベートした後、溶液を除去しＰＢＳ
−Ｔ溶液で３回洗浄した。各ウェルに０．０３％２．２
−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾリン硫酸）−ジ
アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び０．０１％過酸化水素
（Ｈ２Ｏ２）を含有する０、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ
４，１）から成る基質溶液を各ウェルに２００μｌ添加
し、室温で１０分間酵素反応させた後、２００ｍＭシュ
ウ酸溶液を１００μｌ加えて酵素反応を停止させた。

上記マイクロタイタープレートを各ウェルについて、波
長４１５ｎｍ、対照波長４９２ｎｍの吸光強度を自動マ
イクロタイタープレートリーダ（東ソー株式会社製、Ｍ
ＰＲ−Ａ４、商品名）で測定した。結果を表１に示す。

表１から明らかな　７８ように、試料中の核酸は０゜１〜１０００ｎ　　ｇ／の範囲で定量できることが確認された。

表１

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ａ、蛋白質を認識する固定化モノクローナル抗体
（１）ｂ、蛋白質に結合した一重鎖核酸プローブｃ、一重鎖の短鎖に処理された試料中の核酸ｄ、二重鎖
核酸を構造特異的に認識するモノクローナル抗体（２）を接触させ、遊離の核酸、モノクローナル抗体、核酸プ
ローブを除去した後、生成した免疫反応生成物を定量す
ることを特徴とする免疫学的測定方法。
（２）ａ、蛋白質を認識する固定化モノクローナル抗体
（１）ｂ、蛋白質に結合した、一重鎖の短鎖に処理された試料
中の核酸ｃ、一重鎖核酸プローブｄ、二重鎖核酸を構造特異的に認識するモノクローナル
抗体（２）を接触させ、遊離の核酸、モノクローナル抗体、核酸プ
ローブを除去した後、生成した免疫反応生成物を定量す
ることを特徴とする免疫学的測定方法。