JPH0767693A - 生物体の検出方法 - Google Patents

生物体の検出方法

Info

Publication number
JPH0767693A
JPH0767693A JP5352614A JP35261493A JPH0767693A JP H0767693 A JPH0767693 A JP H0767693A JP 5352614 A JP5352614 A JP 5352614A JP 35261493 A JP35261493 A JP 35261493A JP H0767693 A JPH0767693 A JP H0767693A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
colony
membrane
specific
organism
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP5352614A
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas L Benjamin
エル．ベンジャミン トーマス
Barbara Jackson
ジャクソン バーバラ
Joan Chen-Wu
チェン−ウ ジョアン
David Livingston
リビングストン デビッド
Thomas Hansen
ハンセン トーマス
Steven Tannenbaum
タンネンバウム スティーブン
Gerald Wogan
ウーガン ジェラルド
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Vicam LP
Original Assignee
Vicam LP
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vicam LP filed Critical Vicam LP
Publication of JPH0767693A publication Critical patent/JPH0767693A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria

Abstract

(57)【要約】 【目的】 細菌などの培養可能な生物体を容易かつ迅速
に検出する検出方法を提供する。 【構成】 特殊な磁化ビーズを使った目的とする生物体
の抗体による捕獲し、捕獲細胞をインキュベーションし
てコロニーを形成し、コロニー転写膜を使ってコロニー
からコロニー物質を転写し、および標識抗体、複製連鎖
反応または核酸プローブを使ってコロニー転写膜上でコ
ロニー物質を検出することを特徴とする検出方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、細菌、その他の培養
可能生物体を迅速かつ容易に検出するための検出方法に
関する。特に、食物、その他の夾雑が見込まれる試料中
の生存細菌株を検出するために、以下の点を特徴とする
検出方法を用いた免疫検出方法が利用されている。１）
磁化ビーズに固定化した特異的抗体で特異的細菌細胞を
捕獲する；２）捕獲された細胞をインキュベーションし
て細菌のコロニーを形成させる；３）そのコロニーをコ
ロニー転写膜に転写する；および４）そのコロニー転写
膜上でコロニーを確認、同定して定量する。
【０００２】
【従来の技術】細菌性病原体は重篤な疾病を引き起こす
周知の原因であるため、臨床検体（すなわち、血液、組
織、尿、その他の生体抽出物および体液）、農産物検体
（食品など）、ならびに環境検体（食品加工プラントの
表面など）中でこういった病原体を検出することが必要
である。
【０００３】しかし、食物中などで細菌性病原体を検出
するために現在行われている試験は、一般に、終了まで
多くの日数を必要とする。この期間、すなわち、試料の
採取から検定の終了までの間、生鮮食品および乳製品
は、食品の流通経路に乗って消費者の口に入ってしま
う。試験によって病原体の存在が示されると、経費のか
かる製品の回収を招いたり、悪くすると、試験結果がで
る前に、病気が発生することもある。
【０００４】上記のごとく、食品中の細菌性病原体を検
出する伝統的な方法は、基本的には増殖／培養期間を必
要とするため、所要時間が長くなってしまう。この増殖
／培養期間の目的は、損傷した細菌の回復、バックグラ
ウンドとなる拮抗微生物からこれら細菌の増殖、および
細菌細胞数の増加を起こさせて、同定をいっそう容易に
する点にある。多くの場合、標的細菌を同定するには、
２または３回別個のインキュベーションが一連して必要
である。しかし、現実にはそのような増殖工程で死滅す
る検出対象の細胞があって、検出感度の低下を招くこと
がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】食品中でリステリア属
の細菌を検出するための標準的な米国食品医薬品局の方
法（「細菌学的分析法（Bacteriological Analytical M
anual ）」、第７版、１９８４年；補遺、１９８７年９
月、２９章）では、２５g または２５mlの食品試料を２
２５mlの増殖肉汁と混合する。この肉汁混合物試料を２
日間インキュベーションする。第１日目および第２日目
の終わりに、この肉汁培養物の試料を、ペトリ皿に含ま
れる選択増殖用寒天上で画線培養し、これらペトリ皿を
さらに１〜２日間インキュベーションする。リステリア
菌コロニーの同定は、肉眼で行われる。しかし、このよ
うな同定は主観的であり、推定されたコロニーはさらに
試験を行って確認しなければならない。この試験はさら
に１〜２日を要する。増殖段階で細菌が増殖してしまう
ため、寒天プレート上のコロニー数はもとの試料中にあ
った細菌数を示すものではない。この試験では、細菌の
有無が調べられるだけであって、試料中にもとから存在
していた細菌数を知ることはできない。
【０００６】食品加工物中の細菌を検出するためのより
新しい方法では、増殖または同定に要する時間を短縮さ
せる工夫がなされている。これらの方法の多くには、抗
体が使用されている。Listera-Tek およびSalmonella-T
ek検出方法(Organon Technica Corp.)に代表される、典
型的な方法は２部位検出方法である。すなわち、１種類
の抗体がマイクロタイタープレートの穴に不動化され
て、標的細菌を捕獲する。これによって、試料から標的
細菌を分離することが可能となる。酵素で標識された第
２の抗体は、捕獲された細菌を検出するために使用され
る。理論的に、こういった検出方法は、食品試料中の細
菌を直接検出するために使用可能である。しかし、これ
らの検出方法には現実に感度限界があるので、食品試料
から得られた標的細菌を培養する必要がある。こうして
増殖させる必要があるため、確認段階でかかる時間が１
〜２時間と少なくなっても、この検出方法ではまだ２４
〜４８時間を要する。また、増殖によって定量が不可能
になる。
【０００７】リステリア菌検出のためのさらに別の方法
として、免疫磁化単離法がある。この方法では、目的の
細菌に対する抗体が磁化ビーズに不動化される。抗体を
結合しているビーズは、標的生物体と相互作用してか
ら、他の試料物質および磁場中の微生物から分離するこ
とができる。この方法の目的は、２４〜４８時間かかる
増殖期間を短かくしたり無くしたりする点にある。磁化
ビーズの作製および使用は、米国特許第3,970,518 号(G
iaever)、 第4,230,685 号(SenyiおよびWidder)、第4,67
7,055 号(Dodinら)、 および第4,695,393 号(Whitehead
ら) に記載されている。免疫磁化ビーズは、食品からサ
ルモネラ菌（Vermutら、 J. Appl. Bact. 72 巻、 112
頁、 1992年)、 黄色ぶどう球菌(John ら、 J. Clin. Mic
robiol. 27巻、 1631頁、 1987年)、 およびリステリア菌
(Skjerveら、 Appl. Env. Microbiol.56巻、 3478頁、 199
0年)、 ならびに糞便試料から大腸菌(Lund ら、 J. Cli
n. Microbiol. 29巻、 2259頁、 1991年) を分離するため
に使用されてきた。これらすべての例で、細菌数が少な
い場合、免疫磁化捕獲は非常に効率が悪い。食品微生物
学の分野で有意とされる低レベルの細菌数（１g あたり
１００個未満）では、これらの方法は増殖を行わずに使
用することはできない。非標的生物体による干渉がしば
しば起こるので、完全な検定法を実現するには、選択的
増殖もしくは確認工程またはその両者をさらに組み入れ
る必要がある。
【０００８】要約すると、食品試料中の細菌を検出する
ための、これらの「迅速」免疫検出方法のすべてでは、
増殖培地に試料を少なくとも１回希釈する必要があり、
その後、増殖期間を経て、最終培養物の１部を使用する
だけの検出方法が行われる。このように、実際の検定試
料は、もとの試料の一部に相当するにすぎない。したが
って、１回または数回の細菌培養工程は、その時の希釈
倍率を上回る必要があって、いっそうの培養時間を要す
る。また、増殖工程を入れることによって、細菌の定量
は不可能となる。さらに、この際の増殖工程によって、
同定されるべき細菌が死滅して、偽陰性の率が高まるこ
ともある。
【０００９】この発明の方法は、従来のすべての免疫磁
化法の特徴であった捕獲効率の低さを解消している。細
菌の免疫磁化捕獲は複雑な過程であり、捕獲を成功させ
るには幾つかのパラメータが重要である。食品試料から
細菌の高い回収率を得るには、その細菌と免疫磁化ビー
ズとの間の強い相互作用が必要である。本発明の検定法
の効率の高さは、磁化分離に使用される粒子のデザイン
と磁化分離方法の両者の改良による。
【００１０】ビーズの多孔度、ビーズのサイズ、結合方
法、および長時間の捕獲を組み合わせれば、性能が改良
される。捕獲効率の改良とは、例えば、食品１g あたり
細菌数１０未満のレベルで増殖を行わずに食品試料から
細菌を直接分離し得るというものである。増殖工程を無
くすことができるので、この方法によって、実存する細
菌数の定量が可能となる。さらに、形成された細菌のコ
ロニーは、免疫化学的確認工程によって標的細菌として
個々に確認される。
【００１１】
【課題を解決するための手段】したがって、この発明の
一つの目的は、選択的培養工程を経ないですむ生存細菌
の検出方法を提供することである。
【００１２】この発明の別の目的は、培養可能ないかな
る生物体、特には病原性細菌などの細菌を迅速に確認お
よび定量するための方法を提供することである。
【００１３】この発明のさらに別の目的は、肉眼的観察
によって検出を容易になし得る細菌の検出方法を提供す
ることである。
【００１４】この発明の一連の目的は、以下からなる方
法を提供することによって成就される。 １）磁化ビーズに結合した抗体の使用によって、目的と
する細菌細胞を選択的に捕獲して、試料から除去する。 ２）捕獲された細菌細胞を培地上で増殖させて、コロニ
ーを形成させる。 ３）細菌コロニーをコロニー転写膜に接触させて、この
膜にコロニー物質を付着させる。および、 ４）目的とする細菌のコロニーからのコロニー物質を、
目的とする細菌の存在を示す証拠を与えるＤＮＡまたは
ＲＮＡプローブ、複製連鎖反応、および標識抗体を含む
さまざまな方法の１つを使用することによって検出す
る。
【００１５】上記のごとく、この発明の一つの目的は、
試料中で目的とする特定細菌の存在を迅速かつ容易に確
認するための検出方法を提供することである。この検出
方法は、細菌、カビおよび酵母などのいかなる培養可能
な生物の検出にも幅広く適用できる。有害性が見込まれ
る汚染物、特には肉眼で検出不能な汚染物を検出するこ
とが、特に重要である。汚染物を培養してコロニーの形
成が可能であってその汚染物に対する抗体の作製が可能
であるか、ＤＮＡもしくはＲＮＡプローブを使ってその
汚染物の検出が可能であるか、または複製連鎖反応を使
ってその汚染物からＤＮＡ物質の検出が可能であるかぎ
り、この検出方法によって広範な汚染物の検出が可能で
ある。
【００１６】特に好ましい態様では、この検出方法は、
様々な細菌を検出するために使用され、目的とするいか
なる特異的特定細菌の検出にも使用することができる。
その細菌は病原性であっても非病原性であってもよい
が、汚染が考えられる病原性細菌の検出が特に重要であ
る。この発明の検出方法によって検出可能な特異的細菌
の例として、リステリア(Listeria)属、カンピロバクタ
ー(Campylobactor) 属、大腸菌(E.coli)、サルモネラ(S
almonella)属、クロストリジウム(Clostridia)属［ボツ
リヌス菌(C.botulium)、ウエルシュ菌(C.perfingens)な
ど］、赤痢菌(Shegella)属、ブドウ球菌(Staphylococc
i) 属［黄色ブドウ球菌（S.aureus) など］、ビブリオ
(Vibrio)属［ビブリオ・ブルニフィクス(V.vulnificu
s)、コレラ菌(V.choreae) 、ビブリオ・パラヘモリティ
クス(V.parahaemolyticus)など］、エルジニア(Yersini
a)属［エルジニア・エンテロコリティカ(Y.enterocolyt
ica)、偽結核エルジニア菌(Y.psuedotuberculosis)な
ど］、プレシモナス・ストリゲロイデス(Plesimonas st
rigelloides)、バチルス(Bacilli) 属［バチルス・セレ
ウス(B. cereus) など］、およびアエロモナス(Aeromon
as) 属［アエロモナス・ヒドロフィリア(A.hydrophila)
など］が挙げられる。
【００１７】さらに、ビソクラミス(Byssochlamys)属、
フサリウム(Fusarium)属、 ゲオトリクム(Geotricum)
属、 ペニシリウム(Penicillium) 属、 スコプラリオプシ
ス(Scopulariopsis)属などの様々なカビ、ならびに、ク
ルイベロミセス(Kluyveromyces) 属、 ピキア(Pichia)
属、 サッカロミセス(Saccharomyces) 属、 カンジダ(Can
dida) 属、ロドトルラ(Rhodotorula) などの様々な酵母
を検出することができる。
【００１８】したがって、この発明の方法は、一般に以
下の工程を含む。 １）被検検体を、必要に応じて、液化またはこの検出方
法に適するように調製する。 ２）その存在を測定すべき、目的とする特定細菌に対す
るモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を表面
に固定化した磁化ビーズと液体試料を混ぜる。標的の特
定細菌細胞が試料中に存在していれば、その細胞は免疫
磁化ビーズ表面に不動化される。続いて、不動化細菌が
結合した免疫磁化ビーズを洗浄して、残りの試料をすべ
て除去する。 ３）次いで、不動化細菌を有する免疫磁化ビーズを培地
に播種して細菌を増殖させて、コロニーを形成させる。 ４）上記のコロニーが目的とする細菌に相当することを
確かめるため、コロニーをコロニー転写膜と接触させて
から、この膜を取り上げて、細菌コロニーからのコロニ
ー物質を転写膜に結合させる。 ５）目的とする細菌の存在を定性的または定量的に判定
し得る数種の検出／分析方法のうちの１つによって、コ
ロニー転写膜に結合したコロニー物質を検出／分析す
る。これらの検出工程には、（ａ）核酸プローブの使
用、（ｂ）複製連鎖反応の使用、および（ｃ）抗体の使
用が含まれる。以下にこれらを説明する。 （ａ）核酸プローブを使用する場合、コロニー転写膜
（ニトロセルロース）を溶解緩衝液に入れて、細菌コロ
ニーを溶解させ、細菌の核酸を放出させる。そこで、放
出された核酸はコロニー転写膜に結合することとなる。
次いで、この膜をブロックし、目的とする細菌に特異的
なＲＮＡまたはＤＮＡをブロッキング溶液に添加するこ
とによって、ブロッキング溶液中で直接ハイブリダイゼ
ーションを行う。プローブが、例えば、フルオレセイン
で標識されていれば、ハイブリダイズさせた膜を標識抗
フルオレセイン抗体とインキュベーションしてから、検
出することができる。 （ｂ）複製連鎖反応による検出を適用する場合、上記と
同様に、表面にコロニー物質が結合したコロニー転写膜
を溶解緩衝液に添加して、核酸を放出させる。次いで、
放出した核酸を沈澱させ、回収して複製連鎖反応のため
の鋳型を作製する。この鋳型の核酸を、ヌクレオシド三
リン酸、２価カチオンおよびプライマーと混合する。 （ｃ）抗体による検出を適用する場合、上記のコロニー
転写膜を固定剤で処理してコロニー物質を膜に固定し
て、この膜をブロックすることによって非特異的な反応
性を低下させる。細菌コロニーからの物質を膜上に固定
したのち、この膜を被検対象の細菌に特異的な標識また
は未標識第１抗体で処理し、洗浄して未結合の第１抗体
をすべて除去する。第１抗体が未標識であれば、第１抗
体に特異的な標識第２抗体で膜を処理して洗浄し、未結
合の標識第２抗体をすべて除去する。続いて、膜上での
標識第１または第２抗体の有無は、目的とする細菌コロ
ニーの存在を肉眼的に確認する手段によって特異的に検
出される。
【００１９】上記の一連の工程から分かることである
が、この発明の方法は、免疫磁化ビーズを使ってまず試
料から細菌を選別することを特徴とする。このビーズ
は、現実的なレベルで食品から細菌を効率的に捕獲でき
るものでなければならないが、大量に存在する可能性が
ある他の細菌を捕獲してはならない。この工程で使用さ
れる抗体は、目的とする細菌に対して完全に特異的であ
る必要はない。その後、選択的かつ特異的工程を組み合
わせることによって、目的とする唯一の特異的細菌に対
する検出方法に最終的特異性が付与されるからである。
この発明の特徴は、さらに、コロニー転写膜の使用とそ
れに続く確認工程にある。これらの特徴によって、この
発明の方法が、生存細菌株の迅速かつ特異的検出、特に
は肉眼による簡単な検出（ヒトの眼による検出）に適用
され得る。特に、この検出方法によって、２５mlの試料
に対して１コロニー形成単位（ＣＦＵ）を検出し得る、
非常に高感度の検出（すなわち、従来の免疫磁化方法よ
り１００倍以上高感度）が可能となる。
【００２０】この発明の高感度および有効性は、表面に
抗体が結合した磁化ビーズのデザインおよび使用法に関
連した因子の重要な組み合わせによって得られる。まず
第１に、抗体が磁化ビーズの表面に接触しなければなら
ないので、非孔質ビーズを必要とする。Giaever、 Seny
i、 およびDodin(上記) はみな、多孔質磁化ビーズの使
用を開示している。第２に、抗体は、その結合部位が外
に向いていなければならない。一実施態様では、プロテ
インＡ中間体を介して抗体が磁化粒子に結合される。す
なわち、プロテインＡをまず磁化粒子に結合させ、次い
で、選定された抗体をプロテインＡに結合させる。プロ
テインＡ中間体を使用することによって、結合抗体によ
る捕獲効率が極めて増大する（Forsgrenら、 J. Immuno
l. 99巻、 19頁、 1977年）。プロテインＡはＩg Ｇ抗体
のＦｃ領域に結合して、この抗体のＦａｂ領域を外側に
露呈させる。その結果、抗体が正しく配向し、粒子から
外側に向かって延びるので、結合抗体と標的との間で非
常に有効な相互作用が生じる。Senyi は、プロテインＡ
磁化ビーズについて記載しているが、その他の改良点は
記載されていないので、成功例とは言えない。第３に、
磁化粒子のサイズは、表面積を大きくするためにサブミ
クロンの範囲に入っていなければならない。Skjerve
は、直径２．８μm の固体ポリスチレンビーズを使用し
たが、これはずっと効果が低かった。第４に、ビーズと
細菌との間の接触時間は、強い相互作用を可能とする程
度に長くなければならない。磁化ビーズを試料と３０分
から２時間（磁化ビーズを使った従来の試験で報告され
た時間より長い）混合する。
【００２１】工程１：液化 この発明の検出方法を使用すれば、食品、農産物、環境
試料および様々な臨床検体を含む広範な固体および液体
試料中の細菌の存在を検出することができる。試料が液
体の場合、これをそのままの状態でこの発明の方法にか
けることができる。または、最初に希釈もしくは遠心に
よる濃縮を行うとこも可能である。一方、試料が固体の
場合、最初にブレンダー／ストマッカー(stomacher、粉
砕機) の使用などによる標準的な既知の方法を用いて試
料を液化（例えば、水に）すべきである。液体または液
化試料は、必要に応じて、目の粗い紙、グラスまたは他
の支持フィルターを通して粒子を除くこともできる。被
検試料が環境試料の場合、被検表面または物質の拭い物
または掻きとり物を回収緩衝液中で混合してから、液化
食品試料として処理する。
【００２２】工程２：抗体による固定化 標的細菌細胞に対する抗体（ポリクローナル抗体または
モノクローナル抗体）は磁化ビーズに不動化され、試料
から細菌細胞を分離するために使用される。この工程で
は、１種類以上の抗体を使って、目的とする細菌属の標
的株すべてを認識することもできる。この工程で使われ
る抗体は細菌細胞の表面抗原を認識する。インキュベー
ション期間では液体試料または液化試料と抗体を結合さ
せた磁化粒子とが混合されるが、これを経て、抗体結合
粒子およびこれに結合された細菌を磁場によって試料か
ら分離（磁気的捕獲）し、洗浄して他の不純物を除去す
る。
【００２３】細菌の捕獲用抗体、および以降に記載する
ような細菌の検出用抗体としては、いかなる種類の抗体
（Ｉg Ｇ、Ｉg Ｍなど）も使用することができ、所望の
感度を含む様々な因子に応じて、ポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体を使用することができる。ポリ
クローナル抗体を使用する場合、この種の抗体をそれ自
体既知の方法に従って調製することができる。例えば、
B.A. Hurn ら［Meth.in Enzymology (1980), H. Van Va
nakis およびJ. Lagone 編、104-142 頁］が記載するよ
うな方法を使うことができる。モノクローナル抗体の調
製法は既知であって、モノクローナル抗体をこの発明に
使用するならば、この抗体はMilsteinおよびKohlerの原
著［Nature (1975), 256, 495-497 頁］にある方法を使
って調製される。
【００２４】磁化ビーズは、この検出方法で使用される
ためのいくつかの条件に合致していなければならない。
磁化ビーズは非孔質でなければならない。そのため、抗
体分子はビーズの表面に留まり、そこで抗体分子が細菌
と接触する。米国特許第3,970,518 号(Gieaver)、第4,23
0,685 号(SenyiおよびWidder) および第4,677,055 号(D
odinら) に記載された磁化ビーズはすべて多孔質であっ
て、抗体分子がビーズの中に侵入できる。細菌はビーズ
に侵入できないので、細菌と接触可能な抗体の量は減
る。さらに、ビーズは直径約１μm 未満でなければなら
ず、ビーズは細菌と同等またはそれ以下の小さなサイズ
である。Skjerve によって使用された磁化ビーズは、Dy
nal 社より市販されており、 ２．８μm であった。それ
らの捕獲効率が低い一因は、相対的に大きなビーズ直径
のためともいえる。
【００２５】したがって、この発明での使用に適したビ
ーズは、非孔質であって、直径が約５０nmから約１μm
（好ましくは、０．３〜１μm ）である。このビーズ
は、抗体が結合し得る化学的官能基も含んでいなければ
ならない。Whitehead ら( 米国特許第4,695,393 号) に
よって記載されたビーズが適している。しかし、Whiteh
ead は、細菌の捕獲については記載せず、かれらのビー
ズが従来の大型のビーズまたは多孔質のビーズ以上に改
善されたものであるという指摘もない。他の適切なビー
ズには、ウシ血清アルブミンでコートされたビーズなど
のタンパク質コート磁鉄鉱ビーズが含まれる。なお、ウ
シ血清アルブミンコートビーズは、プロテインＡのよう
な抗体結合化合物でさらにコートされることもある。有
用なビーズは、例えば、国際公開 WO 9102811 号(Immun
icon Corp)に記載されており、Immunicon Protein A Ma
gnetic Separation Media(カタログNo. G6100)として市
販されている。
【００２６】抗体は、抗体の結合部位がビーズの表面か
ら突き出して抗体の結合部位と細菌との接触を可能にす
るように磁化ビーズに結合されなければならない。その
ために、抗体は非結合部分のなんらかの部位で結合され
ている。直接共有結合にあずかる部位としては、炭水化
物部分および重鎖間のスルフヒドリル基を挙げることが
できる。他の抗体またはプロテインＡなど、非結合部分
に親和性をもつリガンドまたはタンパク質を使って、抗
体を間接的に結合させることもできる。プロテインＡを
介した結合は、この発明の好ましい方法である。プロテ
インＡを磁気粒子に結合させる方法は、学術論文から知
り得る方法のどれを用いてもよい。そういった１つの方
法では、直径約１μm の酸化鉄の磁化粒子を、アミノ基
で誘導体として、グルタルアルデヒドとの反応によって
化学的に活性化する。次いで、活性化磁化粒子をプロテ
インＡと混合すると、プロテインＡが共有結合した磁化
粒子が得られる。次いで、抗体をプロテインＡ磁化粒子
に添加して、短時間インキュベーションすると、プロテ
インＡ抗体複合体が形成される（Weetall, Meth inEnzy
mol. 44巻, 134 頁, 1976年）。プロテインＡ−結合抗
体が結合した誘導粒子は、直ちに細菌細胞の捕獲に使用
することができる。
【００２７】捕獲工程の間、強い相互作用が抗体と細菌
との間に働かなければならない。インキュベーション時
間が短い（例えば、５分間）と、弱い相互作用しか働か
ず、捕獲効率は低い。十分強い相互作用によって高い捕
獲効率を得るには、最低３０分間、好ましくは２時間必
要である。
【００２８】工程３：細菌コロニーの増殖 捕獲および不動化された細菌細胞を、細胞増殖用培地に
撒いて、インキュベーションする。インキュベーション
は、肉眼で観察し得る細菌コロニーが形成されるまで十
分な時間をかけて行われる。細胞を撒くことにより、個
々の細胞から別々のコロニーが形成され、定量が可能に
なる。
【００２９】インキュベーション用の培地は、当然、目
的とする被検細菌に応じて異なる。このような培地は、
固体のものが好ましく、例えば「Bacteriological Anal
itical Manual 」に記載されているように、 種々の細菌
について当業者に既知のものである。インキュベーショ
ン期間および条件も、目的とする特定細菌に応じて異な
り、それ自体既知である。一般に、増殖は、６ないし２
４時間以内に十分に達成される。
【００３０】あるいは、撒いた細菌を、液体培地中で増
殖させることも可能である。これによって定量は不可能
になるが、その後、特定細菌の存在は確認し得る。この
場合の確認は、典型的な生化学的試験によるか、免疫化
学的または核酸プローブ法によって行われる。
【００３１】工程４：膜上へのコロニー転写 細菌のインキュベーションが完了したのち、目的とする
特定細菌の確認がなお必要である。これはさまざまな方
法で行うことができる。例えば、コロニーの確認は、伝
統的な生化学的方法によってか新しく開発された免疫化
学的試験または核酸プローブ試験のいずれかによって行
うことができる。この発明の好ましい態様では、効果的
な磁化捕獲工程によって得られる定量能力を保持するた
めにコロニー転写膜上で免疫化学的な確認が行われる。
【００３２】コロニー転写膜を増殖培地と接触するよう
に置くことによって、膜にコロニーが付着して、コロニ
ー物質が膜に転写される。コロニー転写膜は、それ自体
既知であり、例えば、ニトロセルロースまたはナイロン
から成るものであってよい。膜は、増殖培地を含む容器
またはペトリ皿の大きさに合わせて切断されることが好
ましく、その結果、容器中で増殖するすべての細菌が１
枚のシートに転写される。この方法では、シートまたは
膜には、もとの増殖培地にあったコロニーのパターンと
同じパターンが写される。
【００３３】工程５：目的とする細菌の検出 ここで、コロニー物質が付着したコロニー転写膜を、目
的とする細菌の検出のためのいくつかの方法の一つにか
けることができる。
【００３４】（ａ）核酸プローブを使った検出 目的とする細菌の検出は、それ自体既知の方法に従った
核酸プローブを使用して行うことができる。リステリア
菌を検出するための適当な方法は、例えば、米国特許第
5,089,386 号、 国際公開 WO 90/08841号、 国際公開 WO
92/15883号、 および国際公開 WO 89/06699号に記載され
ている。
【００３５】適切な核酸プローブ検出方法は一般に、
（１）試料の処理および溶解、（２）特定プローブとの
ハイブリダイゼーション、（３）ハイブリッドの捕獲、
および（４）検出からなる。
【００３６】細菌の溶解は、プローブのための標的分子
を放出するために必要である。核酸の標的分子は、アル
カリ（ＮａＯＨなど）、グアニジン塩（グアニジンチオ
シアネート等）、酵素（リゾチーム、ムタノライシン、
およびプロテイナーゼＫ等）、ならびに界面活性剤を含
む多数の溶解剤のどれかを使った処理によって放出され
る。
【００３７】したがって、細菌の溶解によって、ＤＮＡ
とＲＮＡの両方、特にはリボソームＲＮＡおよび染色体
ＤＮＡが放出されるが、その両方は、適切なプローブを
適当に選択することによって標的分子として利用するこ
とができる。しかしｒＲＮＡは、細胞の重要な成分を構
成しており、標的分子が多数存在することとなるので、
標的分子としてｒＲＮＡを使用することが好ましい。ま
た、ｒＲＮＡプローブを使用すると、目的とする細菌の
特異性、すなわち、検出の正確さが増す。その際、偽陽
性または検出の誤りにつながることもある望ましくない
交叉反応を伴わない。
【００３８】ハイブリダイゼーションは、特異的な核酸
プローブの添加を含む。一般に、ハイブリダイゼーショ
ンとは、一定条件下で逆平行に２本の部分的または完全
な相補核酸が組み合わさって、特異的かつ安定な水素結
合が形成されることである。ハイブリダイゼーション／
反応条件の選択及び厳密さは、プローブ／標的２本鎖の
長さおよび塩基組成並びに２本の核酸鎖間のミスマッチ
のレベルおよび位置関係によって決まる。また、反応の
厳密性は、温度、ハイブリダイゼーション溶液中に存在
する変性剤のタイプおよび濃度ならびにイオン種のタイ
プおよび濃度といった反応パラメータによっても支配さ
れる。
【００３９】核酸プローブ検出方法のハイブリダイゼー
ション段階は、単一の特定プローブを使うか、２種類、
３種類もしくはそれ以上のプローブを組み合わせて行わ
れる。標的生物体のユニークなｒＲＮＡ配列に相同性の
ある配列をもつプローブが選ばれる。リステリア菌の検
出に使用するに適したプローブは、例えば、米国特許第
5,089,386 号、 国際公開 WO 90/08841号および国際公開
WO 89/06699号に記載されており、 例えば、Gene-Trak
Systems 社から市販されている。一般的に、第１の捕獲
プローブは、形成されたハイブリッド分子を捕獲するた
めに使用される。次いで、このハイブリッド分子は、抗
体反応を利用して検出されるか、放射性同位体（リン-3
2 など）、蛍光標識（フルオレセインなど）または化学
発光標識で標識可能な第２の検出プローブを利用して検
出される。
【００４０】（ｂ）複製連鎖反応の利用による検出 目的とする細菌の検出は、複製連鎖反応を利用して行う
こともできる。適当な複製連鎖反応は、例えば、国際公
開 WO 92/08805号に記載されている。こういった検出方
法は、コロニー転写膜に付着したコロニー物質に適用さ
れるか、磁化ビーズ上に捕獲された細菌に直接適用され
る。どちらの場合でも、細菌は溶解緩衝液と混合され、
回収された核酸の標的分子は複製連鎖反応の鋳型として
利用される。
【００４１】（ｃ）抗体を利用した検出 抗体を利用して特定細菌を検出するために、コロニー物
質がコロニー転写膜に付着した後、膜にコロニーを確実
に付着させるために適当な固定剤での処理によってコロ
ニー物質を転写膜に固定することが必要である。適切な
固定処理には、コロニー転写膜をメタノール溶液に浸す
処理、またはコロニー転写膜を界面活性剤のドデシル硫
酸ナトリウム溶液に浸して７０℃で短時間加熱する処理
が含まれる。
【００４２】固定したコロニーおよび膜をそれ自体既知
のブロッキング剤で処理して、その後に抗体を検出する
ときの非特異的な反応を防止することが望ましいことも
ある。適切なブロッキング剤の例として、カゼインおよ
びＢＳＡが挙げられる。
【００４３】次に、細菌コロニーからのコロニー物質が
表面に固定されたコロニー転写膜を、目的とする細菌に
特異的な抗体と接触させる。上記のように、ポリクロー
ナル抗体またはモノクローナル抗体を利用することがで
きるが、どちらの場合でも、特定の被検細菌に対する親
和性があるものを用いる。これらの抗体は、転写膜と接
触した場合、特異的標的細菌のコロニーからの物質に付
着または結合するが、その他のコロニーには結合しない
であろう。
【００４４】有効なポリクローナル抗体の例として、ウ
サギで作製したディフコ社の多血清(poly sera) からの
ポリクローナル抗体が挙げられる。これらの抗体は、特
定の複数の被験株にも特異的であり得る。単細胞のリス
テリア菌の例として、血清品種(serovars) １／２ａ、
１／２ｂ、１／２ｃ、３ａ、３ｂ、３ｃ、４ａ、４ａ／
ｂ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、７の各株を挙げることが
でき、これらのうち１／２ａ、１／２ｂおよび４ｂが最
も一般的な病原株である。したがって、リステリア菌株
血清品種１／２および４ｂに対するポリクローナル血清
を使用して、試料中での病原性リステリア菌の有無を検
出することが有用である。その他の有用な抗体（ポリク
ローナル抗体またはモノクローナル抗体）は、目的とす
る細菌の細胞表面に存在するタンパク質または炭水化物
に特異的な抗体である。血清品種１／２および４ｂのリ
ステリア菌のテイコ酸に対するモノクローナル抗体が特
に有用である。
【００４５】目的とする細菌細胞に特異的な第１抗体に
よる上記のような処理は、目的とする特定細菌の分離お
よび確認のための第１の工程である。続いて、その膜
は、第２抗体と接触される。さらに、この抗体は、ポリ
クローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであ
ってもよいが、重要なのは、ａ）第１抗体に結合し得る
こと、およびｂ）その後の検出を可能とする方法で標識
されることである。
【００４６】第１抗体が、例えば上記のディフコ社の多
血清であれば、第２抗体は、抗ウサギＩg Ｇ／標識複合
体である。第１抗体が、マウス由来のモノクローナル抗
体であれば、第２抗体は、抗マウスＩg Ｇ／標識複合体
である。
【００４７】あるいは、第１抗体（または上記の第１捕
獲核酸プローブ）自体を標識することもできる。次い
で、この検出方法では、第２抗体（または第２の検出プ
ローブ）を使用せずに、標識の検出を行うことができ
る。
【００４８】これらの抗体は、他の既知の免疫測定方法
に使用される標識で直接または間接に標識される。直接
の標識は、蛍光物質、化学発光物質、生物発光物質、放
射性物質、金属、ビオチンまたは酵素分子を包含する。
これらの標識を抗体または他の高分子に結合する方法
は、当業者にとって周知である。その例として、フルオ
レセインイソチオシアネートに関するW.Hijmans らの方
法［Clin. Exp. Immunol., 4, 457- (1969) ］；テトラ
メチルローダミンイソチオシアネートに関するJ.W. God
ing の方法［J. Immunol. Meth.,13, 215- (1976) ］；
および酵素に関するE. Ingrallの方法［Meth. in Enzym
ol., 70, 419-439 (1980) ］が挙げられる。
【００４９】これら検出抗体は、間接的に標識されても
よい。この場合、実際の検出分子は、第２抗体、または
抗細菌細胞表面抗体に対する結合親和性を有する他の分
子に結合される。第２抗体を使用する場合、これは、抗
細菌細胞表面抗体の作製に使用される動物種からのある
クラスの抗体（Ｉg ＧおよびＩg Ｍ）に対する一般的な
抗体であることが好ましい。
【００５０】例えば、第２抗体は、酵素のアルカリフォ
スファターゼまたはパーオキシダーゼとの複合体であっ
てもよい。標識を検出するには、前記の膜を第２抗体と
接触させて洗浄したのち、この膜を、アルカリフォスフ
ァターゼまたはパーオキシダーゼに対する色素産生基質
を含む溶液に浸す。色素産生基質は、酵素によって開裂
可能な化合物であって、この基質がもとの分子から開裂
された場合にだけ、ある種の検出可能なシグナルが生じ
る。色素産生基質は、これが酵素と反応するまで無色で
あって、反応した時点で強度の発色生成物が生じる。こ
のようにして、膜に付着した細菌コロニー由来の物質
は、濃い青／紫／黒色、または茶／赤色を呈するが、そ
の他のコロニー由来の物質は発色しない。検出分子の例
として、４−メチルウンベリフェリルフォスフェートな
どの蛍光物質、ならびに４−ニトロフェニルフォスフェ
ート、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジディン
および２，２’−アジノ−ジ−［３−エテルベンズ−チ
アゾリアンスルフォネート（６）］といった発色物質が
挙げられる。アルカリフォスファターゼおよびパーオキ
シダーゼの外に、他の有用な酵素には、β- ガラクトシ
ダーゼ、β- グルクロニダーゼ、α- グルコシダーゼ、
β- グルコシダーゼ、α- マンノシダーゼ、ガラクトー
スオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよびヘキソ
キナーゼが含まれる。
【００５１】
【実施例】
実施例１：抗体検出を利用したリステリア菌の検出 以下に特定の例を挙げて、リステリア菌を検出する際の
この発明の検出方法の実際について示す。
【００５２】１）プロテインＡを共有結合させたサイズ
約０．３μm の磁化粒子（Immunicon Protein A beads
など）に、リステリア菌に対する抗体（Lee Labs社、 リ
ステリア菌Ｏ抗血清Poly 1, 4 など）を添加する。
【００５３】２）１g あたり１０万個から１００万個の
細菌を含むことが従来の微生物学的方法によって知られ
るソーセージ試料を得る。なお、それには、米国食品医
薬品局のMost Probable Number Assay(MPN) によって測
定したところ、 １g あたり２３個のリステリア菌が含ま
れ、食品医薬品局のMPN 検出方法から外挿したところで
は１g あたり２．３個のリステリア菌が含まれる。MPN
検出方法は、１桁以内で正確である。免疫磁化捕獲法
は、ソーセージ型試料から３０％のリステリア菌を捕獲
する。
【００５４】３）上記の試料を以下のように液化する。
２５g のソーセージ試料を１５０mlのリン酸緩衝液（Ｐ
ＢＳ）＋０．０５％ツイーン２０に添加して、２分間通
常の速さで粉砕、撹拌する。
【００５５】４）得られた液を濾過して、４０mlの濾液
を回収する。
【００５６】５）４０mlの濾液を１１，０００×ｇで１
５分間遠心して、微生物を濃縮する。上清をデカントし
てから、ペレットを２mlのＰＢＳ＋ツイーンに再懸濁す
る。
【００５７】６）２mlの再懸濁液（もとのソーセージ試
料５．７g に相当する）と表面にリステリア菌に対する
抗体を固定化した磁化ビーズ溶液１００μl を混合す
る。
【００５８】７）試料の入ったチューブを１８０度反転
させながら２時間インキュベーションした後、混合物を
磁場にかけてリステリア菌細胞が表面に固定化された磁
化ビーズを回収する。そして、このビーズをＰＢＳで２
回洗浄して、望ましくない不純物並びに未結合物質及び
細胞を除去する。
【００５９】８）脳−心臓混和寒天（塩化リチウムおよ
びセフタジディム(ceftazidime) 添加）を含むプレート
の表面にばらばらになった磁化ビーズを撒く。
【００６０】９）３７℃で２０時間インキュベーション
した後、プレート上での細菌コロニーの増殖を調べる。
ソーセージ試料１g あたり２３ＣＦＵのリステリア菌を
含む試料から出発した一対のプレートは、数種の非リス
テリア菌様コロニーのほか、それぞれ２９個および２６
個のリステリア菌様コロニーを含んでいた。ソーセージ
試料１g あたり２．３ＣＦＵのリステリア菌を含む試料
から出発した一対のプレートは、それぞれ８個および２
個のリステリア菌様コロニーを含んでいた。
【００６１】１０）これらのコロニーをリステリア菌の
ものと確認するために、コロニー転写膜（例えば、Pall
Biodyne Transfer Membranes ）をプレートの固形増殖
培地上にのせて、膜上にコロニーの転写を行う。５分間
待ってから、この膜をプレートから剥がす。次いで、培
地の入ったプレートをさらにインキュベーションする
か、その後の試験に備えて４℃で保存する。
【００６２】１１）コロニーの付着している面を上にし
てコロニー転写膜を、１０mlのメタノールを含むトレイ
に５分間浸けて、細菌を殺し、抗原が流し落とされない
ように抗原を膜表面に固定する。
【００６３】１２）水道水を勢いよく流しながら膜を洗
って、過剰なコロニー物質を除去する。
【００６４】１３）ＰＢＳ＋ツイーンで膜を２〜５分間
洗う。洗浄液を除いて洗浄をもう２回（合計３回）繰り
返す。
【００６５】１４）膜を１０mlのＰＢＳ＋ツイーン＋２
％脱脂粉乳に浸することによって、膜をブロックして検
出抗体の非特異的反応性を防止する。往復運動する震盪
器上で３０分間震盪する。
【００６６】１５）３０分間のインキュベーションの
後、第１の抗体溶液を流し去り、膜をＰＢＳ＋ツイーン
で合計３回洗う。
【００６７】１６）３０分間震盪しながら、ＰＢＳ＋ツ
イーンに溶けた第１の抗体溶液１０ml中で膜をインキュ
ベーションする。この実施例で使用される抗体は、膜に
固定化したリステリア菌細胞表面のタンパク質抗原に結
合し得るマウスのモノクローナルＩg Ｍである。
【００６８】１７）３０分間のインキュベーションの
後、第１の抗体溶液を流し去り、膜をＰＢＳ＋ツイーン
で合計３回洗う。
【００６９】１８）３０分間震盪しながら、ＰＢＳ＋ツ
イーンで希釈した第２抗体（アルカリホスファターゼに
複合した抗マウスＩg Ｍヤギ抗体）１０ml中で膜をイン
キュベーションする。第２抗体は第１抗体（リステリア
菌に特異的）に結合し得る。その結果、リステリア菌コ
ロニーからの抗原が存在する場所の膜上で発色する。
【００７０】１９）第２の抗体溶液を流し去り、膜を１
０mlの水で合計３回洗う。
【００７１】２０）紫色の斑点が膜上に現れるまで、震
盪器の上でアルカリホスファターゼ基質溶液１０ml中で
膜をインキュベーションする。通常のインキュベーショ
ンは、約５分を要する。
【００７２】２１）基質を流し去り、１枚の膜あたり１
０mlの水で合計２回洗浄することによって反応を停止さ
せる。
【００７３】２２）各膜上の紫色のシグナルを数えるこ
とによってリステリア菌の数を測定する。この実施例で
は、２３ＣＦＵ/g試料の膜は２９および２６個の紫色シ
グナルを含み、２．３ＣＦＵ/g試料の膜は８および２個
の紫色シグナルを含んでいた。これらのシグナルは培地
上でのリステリア菌様コロニーに相当するので、それら
がリステリア菌であることが確認された。非リステリア
菌様コロニーに相当する部位では、紫色シグナルは認め
られなかった。
【００７４】２３）リステリア菌試験によって決定され
るもとの汚染レベルが計算される。２３ＣＦＵ/g（ＭＰ
Ｎで測定）を含むソーセージ試料は、この方法で測定し
た場合で１６ＣＦＵ/gを含んでいた。２．３ＣＦＵ/g
（ＭＰＮで測定）を含むソーセージ試料は、この方法で
測定した場合で２．９ＣＦＵ/gを含んでいた。
【００７５】実施例２：核酸プローブを利用したリステ
リア菌の検出 リステリア菌の捕獲は、コロニー転写膜を使用してコロ
ニーの転写膜を得る段階（工程１０）まで実施例１と同
様に行われる。この方法では、コロニー転写膜はニトロ
セルロース（ＮＣ）からなる。このＮＣ膜を、マスター
プレートのコロニーに５分間かぶせて、転写膜とする。
この転写膜を３７℃の溶解緩衝液（水に溶けた１ｗ／ｖ
％のドデシル硫酸ナトリウム）に３０分間入れ、細菌の
コロニーを溶解させて、細菌の核酸を放出させる。ここ
で、この核酸がＮＣ膜に結合するようになる。この工程
に続いて室温の緩衝液でゆっくりと洗浄してから、乾燥
膜を７０℃で２時間加熱することによってＮＣ膜上にＤ
ＮＡを固定する。次いで、ＮＣ膜を洗浄緩衝液に溶けた
０．１ｗ／ｖ％ウシ血清アルブミンでブロックする。ハ
イブリダイゼーションは、リステリア菌種またはリステ
リア菌モノサイトゲン(monocytogenes) に特異的であっ
てフルオレセインで標識されたＤＮＡプローブをブロッ
キング溶液に加えることによって、そのブロッキング溶
液中で直接行われる。ハイブリダイゼーションは、３７
℃で１時間行われる。
【００７６】次いで、ＮＣ膜は、洗浄緩衝液を使って、
３７℃で５分間、６５℃で５分間洗浄される。さらに、
ＮＣ膜を、アルカリホスファターゼで標識された抗フル
オレセイン抗体とインキュベーションする。あるいは、
このプローブがビオチニル化ＤＮＡプローブであって、
検出はアビジン標識酵素を使って行われる。ＮＣ膜は、
基質のブロモ−クロロ−インドイル−ホスフェートおよ
びニトロ−ブルー−テトラゾリウムとともにインキュベ
ーションされるが、インキュベーションは、コロニー物
質上に青色斑点が現れるか背景が薄い青色になるまで行
われる。リステリア菌が存在していれば、マスタープレ
ート上のリステリア菌コロニーに相当する膜の部分が発
色する。
【００７７】実施例３：複製連鎖反応を利用したリステ
リア菌の検出 複製連鎖反応による検出は、磁化ビーズに捕獲されたま
まの状態の細菌か、コロニー転写膜に付着した細菌のコ
ロニー物質に適用することができる。どちらの場合で
も、ビーズ上に存在する細菌またはコロニー由来の細菌
を溶解緩衝液と混合する。
【００７８】この溶解緩衝液は、酵素のリゾチームおよ
びムタノリシンを含む。これらの酵素は、細菌の細胞壁
を消化するので、核酸を放出させることができる。溶解
緩衝液中の試料は、３７℃で３０分間インキュベーショ
ンされる。続いて、プロテインキナーゼＫおよび界面活
性剤を含む溶解緩衝液が少量添加される。短時間のイン
キュベーションの後、酢酸ナトリウムおよび無水エタノ
ールが添加され、核酸が沈澱する。沈澱した核酸を遠心
して集め、乾燥する。この物質は、複製連鎖反応の鋳型
となる。
【００７９】複製連鎖反応は、核酸をヌクレオシド三リ
ン酸、２価カチオンおよびプライマーと混合することに
よって開始される。複製連鎖反応に使われるリステリア
菌プライマーの配列はたくさん報告されており、そのど
れもが適している。ＴＡＣポリメラーゼ（ＤＮＡポリメ
ラーゼの遺伝子工学的処理されたもの）をその混合物に
添加してから、この溶液を鉱油で覆って蒸発を防ぐ。こ
の混合物を複製連鎖反応に３０サイクルかけてから、電
気泳動にかける。ＤＮＡは、臭化エチジウムまたは他の
肉眼観察法によって眼で認められるようになる。これら
の条件下で検出可能なレベルまで増幅させるには、１ピ
コグラムの鋳型ＤＮＡがあれば十分である。
【００８０】この発明を上記のように説明してきたが、
これをさまざまな方法によって変形することができるの
は明らかであろう。こういった変形例は、この発明の精
神と範囲からの逸脱とみなされるべきではない。そし
て、当該分野の技術者には明らかとなるようなこういっ
たすべての変形例は、請求の範囲内に含まれるものされ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 バーバラ ジャクソン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02131ロスリンデイル キャサリン スト リート 50 (72)発明者 ジョアン チェン−ウ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02146ブルックリン セント ポール ス トリート 59 (72)発明者 デビッド リビングストン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02146ブルックリン パウエル ストリー ト 11 (72)発明者 トーマス ハンセン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02146ブルックリン フラー ストリート 197 (72)発明者 スティーブン タンネンバウム アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01701フラミンガム ヒッキー ドライブ 14 (72)発明者 ジェラルド ウーガン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02178ベルモント クラフリン ストリー ト 125

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の工程、 ａ）特定生物体の有無が調べられる被検試料を、該特定
    生物体に対する抗体を表面に不動化した磁化固体支持体
    と混合して、該試料から該生物体の細胞を捕獲する工
    程、 ｂ）表面に第１の抗体および捕獲特定生物体を結合させ
    た該磁化固体支持体を磁場にさらして、該試料から該磁
    化固体支持体を分離する工程、 ｃ）捕獲された磁化固体支持体および捕獲された特定生
    物体を固体培地上で培養して、該特定生物体のコロニー
    を形成させる工程、 ｄ）該コロニーをコロニー転写膜と接触させることによ
    って、コロニー物質を該膜に付着させる工程、および ｅ）該膜を処理して、該膜上で該特定生物体の該コロニ
    ーからの物質を検出する工程を含む、培養可能な生物体
    の検出方法。
  2. 【請求項２】 表面にコロニー物質が付着した前記コロ
    ニー転写膜を前記特定生物体に特異的な第２の抗体と接
    触させることによって、該第２の抗体を該特定生物体の
    該コロニーからの該コロニー物質に結合させ、続いて該
    膜を該第２の抗体に特異的な標識抗体と接触させ、該膜
    上で該標識を検出することによって該試料中の該特定生
    物体を検出する、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 表面にコロニー物質が付着した前記コロ
    ニー転写膜を前記特定生物体の該コロニー物質に結合す
    る標識検出抗体と接触させて、該膜上での該検出抗体を
    検出し、該膜上で該特定生物体からのコロニー物質の存
    在を示す証拠を得る、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 表面にコロニー物質が付着した前記コロ
    ニー転写膜を前記標識抗体と接触させた後、標識検出抗
    体が結合したコロニーの数をカウントして、試料中の該
    特定生物体数を定量する、請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記標識が、蛍光物質、放射性物質、化
    学発光物質、生物発光物質および酵素基質分子から選ば
    れる、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】 表面にコロニー物質が付着した前記コロ
    ニー転写膜を溶解緩衝液と混合して生物体を溶解させ
    て、該特定生物体から核酸を放出させ、該放出核酸を該
    特定生物体に特異的な核酸プローブと混合しハイブリダ
    イズさせて、ハイブリッド分子を検出する、請求項１記
    載の方法。
  7. 【請求項７】 表面にコロニー物質が付着した前記コロ
    ニー転写膜を溶解緩衝液と混合して生物体を溶解させて
    該特定生物体から核酸を放出させ、該放出核酸を複製連
    鎖反応にかけて該特定生物体に特有の核酸を検出する、
    請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記特定生物体に対する前記抗体を抗体
    結合化合物を介して前記磁化固体支持体に結合させる、
    請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記抗体結合化合物がプロテインＡであ
    る、請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記特定生物体が、細菌、酵母または
    カビである、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の
    方法。
  11. 【請求項１１】 前記特定細菌が、リステリア属、カン
    ピロバクター属、エシェリキア属、サルモネラ属、クロ
    ストリジウム属、シゲラ属、スタフィロコッカス属、ビ
    ブリオ属、エルジニア属、プレシモナス属、バチルス属
    およびアエロモナス属からなる群より選ばれた一員；前
    記酵母が、クルイベロミセス属、 ピキア属、 サッカロミ
    セス属、 カンジダ属およびロドトルラ属から選ばれた一
    員；ならびに前記カビが、ビソクラミス属、 フサリウム
    属、 ゲオトリクム属、 ペニシリウム属およびスコプラリ
    オプシス属から選ばれた一員である、請求項１０記載の
    方法。
  12. 【請求項１２】 前記細菌がリステリア菌である、請求
    項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記細菌がリステリア菌の病原株であ
    る、請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記磁化固体支持体が直径５０nmない
    し１μm の非孔質磁化ビーズからなる請求項１ないし１
    ３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記コロニー転写膜が、ニトロセルロ
    ースまたはナイロンからなる、請求項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 試料２５mlあたり１コロニー形成単位
    を検出し得る、請求項１ないし１５のいずれか１項に記
    載の方法。
  17. 【請求項１７】 試料中の細菌を検出する方法であっ
    て、該方法は試料２５mlあたり１コロニー形成単位を検
    出し得るものであり、以下の工程、 ａ）特定細菌の有無を調べる被検試料を、表面に該特定
    細菌に対する第１抗体を固定化させた磁化固体支持体と
    混合し、該試料から該特定細菌の細胞を捕獲する工程で
    あって、該抗体は、該抗体のＦａｂ領域が該固体支持体
    表面から外に伸びるように抗体結合化合物を介して該固
    体支持体に結合している工程、 ｂ）表面に該第１抗体および捕獲された細菌細胞を結合
    させた該固体支持体を磁場にさらし、該試料から該磁化
    固体支持体を分離する工程、 ｃ）固体培地で該磁化固体支持体および捕獲された細菌
    細胞を培養し、該特定細菌のコロニーを形成させる工
    程、 ｄ）該コロニーをコロニー転写膜に接触させることによ
    って、該コロニーからのコロニー物質を該膜に付着させ
    る工程、 ｅ）該膜およびその表面に付着させた該コロニー物質を
    該特定細菌に特異的な第２抗体と接触させることによっ
    て、該第２抗体を該特定細菌の該コロニーからの該コロ
    ニー物質に結合させる工程、 ｆ）該膜を該第２抗体に特異的な標識抗体と接触させる
    ことによって、該特定細菌の該コロニーに結合した該第
    ２抗体に該標識抗体を結合させる工程、および ｇ）該膜を処理して、該膜上で該標識および該特定細菌
    のコロニーの存在を示す証拠を得る工程を含む細菌の検
    出方法。
  18. 【請求項１８】 前記標識が、蛍光物質、放射性物質、
    化学発光物質、生物発光物質および酵素基質分子から選
    ばれる、請求項１７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記特定細菌が、リステリア属、カン
    ピロバクター属、エシェリキア属、サルモネラ属、クロ
    ストリジウム属、シゲラ属、スタフィロコッカス属、ビ
    ブリオ属、エルジニア属、プレシモナス属、バチルス属
    およびアエロモナス属からなる群より選ばれた一員であ
    る、請求項１７または１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記特定細胞がリステリア菌である、
    請求項１９記載の方法。
JP5352614A 1992-12-31 1993-12-30 生物体の検出方法 Pending JPH0767693A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/999,363 US5491068A (en) 1991-02-14 1992-12-31 Assay method for detecting the presence of bacteria
US07/999,363 1992-12-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH0767693A true JPH0767693A (ja) 1995-03-14

Family

ID=25546247

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP5352614A Pending JPH0767693A (ja) 1992-12-31 1993-12-30 生物体の検出方法

Country Status (4)

Country Link
US (2) US5491068A (ja)
EP (1) EP0605003A3 (ja)
JP (1) JPH0767693A (ja)
CA (1) CA2112603C (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001161396A (ja) * 1999-09-28 2001-06-19 Becton Dickinson & Co 試料中の微生物の識別方法
JP2006508667A (ja) * 2002-12-10 2006-03-16 ツィンファ ユニバーシティ 磁性ベースの核酸増幅
KR101028875B1 (ko) * 2010-02-12 2011-04-12 메디스커브 주식회사 세포 내에서 세포내 물질의 생리활성 기능을 조절하는 조절물질을 검출하는 방법

Families Citing this family (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6004766A (en) * 1987-07-28 1999-12-21 Biotechnology Australia Pty Limited Method for detecting low levels of microorganisms
WO1994007138A1 (en) 1992-09-14 1994-03-31 Fodstad Oystein Detection of specific target cells in specialized or mixed cell population and solutions containing mixed cell populations
NO180658C (no) * 1994-03-10 1997-05-21 Oeystein Fodstad Fremgangsmåte og anordning for deteksjon av spesifikke målceller i spesialiserte eller blandede cellepopulasjoner og opplösninger som inneholder blandede cellepopulasjoner
NO180167C (no) 1994-09-08 1997-02-26 Photocure As Fotokjemisk fremgangsmåte til å innföre molekyler i cellers cytosol
AU4535896A (en) * 1995-01-13 1996-07-31 Delft Diagnostic Laboratory B.V. Capturing of microorganisms using complement components
US5571481A (en) * 1995-02-17 1996-11-05 Vicam, L.P. Magnetic capture rack with slidable magnetic member
US6159689A (en) * 1995-11-10 2000-12-12 Genera Technologies Limited Methods of capture and assay procedures
NO961031D0 (no) 1996-03-13 1996-03-13 Det Norske Radiumshospital Tum Fremgangsmåte til å drepe uönskede målceller
US5888835A (en) * 1996-05-10 1999-03-30 Chiron Diagnostics Corporation Method and apparatus for wash, resuspension, recollection and localization of magnetizable particles in assays using magnetic separation technology
US6143578A (en) * 1996-05-10 2000-11-07 Bayer Corporation Method and apparatus for wash, resuspension, recollection and localization of magnetizable particles in assays using magnetic separation technology
GB9709728D0 (en) 1997-05-13 1997-07-02 Dynal As Single step method
US6337215B1 (en) 1997-12-01 2002-01-08 International Business Machines Corporation Magnetic particles having two antiparallel ferromagnetic layers and attached affinity recognition molecules
US6503747B2 (en) 1998-07-14 2003-01-07 University Of Hawaii Serotype-specific probes for Listeria monocytogenes
US7071005B1 (en) * 1998-08-24 2006-07-04 Centrus International, Inc. Method and device for concentrating selected groups of microorganisms
US5973138A (en) 1998-10-30 1999-10-26 Becton Dickinson And Company Method for purification and manipulation of nucleic acids using paramagnetic particles
AU758630B2 (en) * 1998-11-06 2003-03-27 Solexa Ltd. A method for reproducing molecular arrays
US6790661B1 (en) * 1999-07-16 2004-09-14 Verax Biomedical, Inc. System for detecting bacteria in blood, blood products, and fluids of tissues
WO2001027323A1 (en) * 1999-10-08 2001-04-19 Vanderbilt University Method of screening for susceptibility to drug-induced cardiac arrhythmia
US6503761B1 (en) 1999-10-19 2003-01-07 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Selective removal of contaminants from a surface using articles having magnets
US6841393B2 (en) 1999-10-19 2005-01-11 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Selective removal of contaminants from a surface using colored particles and articles having magnets
US6787302B2 (en) * 1999-10-25 2004-09-07 Genprime, Inc. Method and apparatus for prokaryotic and eukaryotic cell quantitation
US6673568B1 (en) 1999-10-25 2004-01-06 Genprime, Inc. Method and apparatus for prokaryotic and eukaryotic cell quantitation
GB0010910D0 (en) * 2000-05-05 2000-06-28 Jones Osborn Analytical method and apparatus
US20030022203A1 (en) * 2001-04-23 2003-01-30 Rajan Kumar Cellular Arrays
CA2451498A1 (en) 2001-06-22 2003-01-03 Marshfield Clinic Methods and oligonucleotides for the detection of salmonella sp., e. coli o157:h7, and listeria monocytogenes
DE10136472A1 (de) * 2001-07-23 2003-02-20 Inst Chemo Biosensorik Vorrichtung und Verfahren für den Nachweis lebender Mikroorganismen, eukaryotischer Zellen oder Organellen
JP3580801B2 (ja) * 2001-08-01 2004-10-27 富士写真フイルム株式会社 核酸の分離精製方法
GB0122790D0 (en) * 2001-09-21 2001-11-14 Secr Defence Method of determining the presence of target bacteria
US7118870B2 (en) * 2001-09-28 2006-10-10 The State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University Detection of fecal contamination using nucleic acid molecules that recognize bacterial 16S rDNA sequences
US6696254B2 (en) * 2001-11-21 2004-02-24 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Detection and identification of enteric bacteria
JP2005533239A (ja) * 2001-12-20 2005-11-04 セーフテスト インコーポレイテッド 複雑な基質中の特定の物質を単離および検出する装置および方法
GB0215878D0 (en) * 2002-07-09 2002-08-14 Smart Holograms Ltd Cell detection
JP4025135B2 (ja) * 2002-07-19 2007-12-19 富士フイルム株式会社 核酸の分離精製方法
JP3890360B2 (ja) * 2002-07-19 2007-03-07 富士フイルム株式会社 核酸の分離精製方法
US7018805B2 (en) * 2002-08-29 2006-03-28 Vicam L.P. α-Amylase assay and uses thereof
EP1565745A4 (en) * 2002-11-12 2007-06-27 Strategic Diagnostics Inc ISOLATION AND CONFIRMATION OF ANALYZES FROM TEST EQUIPMENT
CN1230531C (zh) * 2002-12-09 2005-12-07 清华大学 从样品中分离细胞粒子的方法
US7601491B2 (en) 2003-02-06 2009-10-13 Becton, Dickinson And Company Pretreatment method for extraction of nucleic acid from biological samples and kits therefor
US20040157219A1 (en) * 2003-02-06 2004-08-12 Jianrong Lou Chemical treatment of biological samples for nucleic acid extraction and kits therefor
JP3890044B2 (ja) * 2003-02-18 2007-03-07 シャープ株式会社 活性化ガスが抗原性物質を失活させる性能の評価方法、その評価方法の評価試料として用いる処理済抗原性物質の作成装置
US20040248291A1 (en) * 2003-04-10 2004-12-09 Pentax Corporation Method for culturing cells, cell culture carriers and cell culture apparatus
JP2007504835A (ja) * 2003-09-12 2007-03-08 バイオコントロール システムズ，インコーポレイティド 微生物の濃縮、および検出のための方法、組成物、ならびにキット
US20070254320A1 (en) * 2003-10-20 2007-11-01 Alan Olstein Method and Kit for Detecting Listeria Spp.
US7996825B2 (en) * 2003-10-31 2011-08-09 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Cross-file inlining by using summaries and global worklist
EP1574584B1 (en) * 2004-03-10 2006-11-15 Boehringer Mannheim Gmbh Methods for isolation of bacteria from biological samples
EP1574583A1 (en) * 2004-03-10 2005-09-14 Roche Diagnostics GmbH Methods for isolation of bacteria from biological samples
US20050239091A1 (en) * 2004-04-23 2005-10-27 Collis Matthew P Extraction of nucleic acids using small diameter magnetically-responsive particles
US20060024776A1 (en) * 2004-08-02 2006-02-02 Mcmillian Ray Magnetic particle capture of whole intact organisms from clinical samples
WO2006017427A1 (en) * 2004-08-03 2006-02-16 Becton, Dickinson And Company Use of magnetic material to fractionate samples
CA2575446C (en) * 2004-08-03 2014-03-25 Becton, Dickinson And Company Use of magnetic material to direct isolation of compounds and fractionation of multipart samples
FR2883296B1 (fr) * 2005-03-15 2007-05-18 Nicolas Bara Procede et dispositif permettant d'isoler les microorganismes
US20070269814A1 (en) * 2005-11-10 2007-11-22 Litmus, L.L.C. Method of pathogen or chemical detection
GB0606822D0 (en) * 2006-04-05 2006-05-17 Alaska Food Diagnostics Assay System
KR100829585B1 (ko) * 2006-04-07 2008-05-14 삼성전자주식회사 표적 세포 분리 및 신속한 핵산 분리 방법 및 장치
US7527765B2 (en) 2006-04-11 2009-05-05 Harrogate Holdings Consumer food testing device
US7947441B2 (en) * 2006-04-14 2011-05-24 University Of South Florida Molecular detection and quantification of Enterococci
US8273310B2 (en) 2006-09-05 2012-09-25 Samsung Electronics Co., Ltd. Centrifugal force-based microfluidic device for nucleic acid extraction and microfluidic system including the microfluidic device
WO2009006417A2 (en) * 2007-06-29 2009-01-08 Becton, Dickinson And Company Methods for extraction and purification of components of biological samples
EP2220500A4 (en) * 2007-11-20 2010-12-15 3M Innovative Properties Co METHOD FOR ANALYZING A BACTERIUM SAMPLE USING A POLYMER DETECTOR CONTAINING DIACETYLENE
WO2009088991A2 (en) * 2008-01-03 2009-07-16 Los Alamos National Security, Llc Flow cytometric gfp-based yeast two hybrid system
CA2719358C (en) * 2008-03-31 2017-10-24 Altan Co., Ltd. Antiviral agent and antiviral composition
US9201066B2 (en) 2008-09-26 2015-12-01 Biotica, Bioquimica Analitica, S.L. Rapid process for detection of microorganisms with magnetic particles
SI2336349T1 (sl) * 2008-09-26 2016-06-30 Biotica Bioquimica Analitica, S.L. Hiter postopek za detekcijo mikroorganizmov z magnetnimi delci
US8710836B2 (en) 2008-12-10 2014-04-29 Nanomr, Inc. NMR, instrumentation, and flow meter/controller continuously detecting MR signals, from continuously flowing sample material
US20110262989A1 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Nanomr, Inc. Isolating a target analyte from a body fluid
US8841104B2 (en) 2010-04-21 2014-09-23 Nanomr, Inc. Methods for isolating a target analyte from a heterogeneous sample
US9476812B2 (en) 2010-04-21 2016-10-25 Dna Electronics, Inc. Methods for isolating a target analyte from a heterogeneous sample
US9428547B2 (en) 2010-04-21 2016-08-30 Dna Electronics, Inc. Compositions for isolating a target analyte from a heterogeneous sample
EP2773946B1 (en) 2011-11-03 2021-08-25 Siemens Healthineers Nederland B.V. Detection of surface-bound magnetic particles
US8211715B1 (en) 2011-11-15 2012-07-03 Harrogate Holdings, Ltd. Co. Consumer food testing device providing remote monitoring
US9995742B2 (en) 2012-12-19 2018-06-12 Dnae Group Holdings Limited Sample entry
US10000557B2 (en) 2012-12-19 2018-06-19 Dnae Group Holdings Limited Methods for raising antibodies
US9804069B2 (en) 2012-12-19 2017-10-31 Dnae Group Holdings Limited Methods for degrading nucleic acid
US9434940B2 (en) 2012-12-19 2016-09-06 Dna Electronics, Inc. Methods for universal target capture
US9551704B2 (en) 2012-12-19 2017-01-24 Dna Electronics, Inc. Target detection
US9599610B2 (en) 2012-12-19 2017-03-21 Dnae Group Holdings Limited Target capture system
WO2017042819A1 (en) 2015-09-11 2017-03-16 Molecular Detection Israel Ltd. Methods for isolating microbial cells from a blood sample
US9834808B2 (en) 2016-01-21 2017-12-05 SeLux Diagnostics, Inc. Methods for rapid antibiotic susceptibility testing
BR112018014146A2 (pt) 2016-01-21 2018-12-11 Selux Diagnostics Inc métodos de teste rápido de suscetibilidade antimicrobiana
EP4022079A1 (en) 2019-08-27 2022-07-06 Selux Diagnostics, Inc. Systems and methods for performing antimicrobial susceptibility testing
CN112575054B (zh) * 2019-12-16 2022-12-16 中国计量科学研究院 单增李斯特菌和细菌总数快速同步多重检测方法及试剂盒
US11371073B2 (en) 2020-03-11 2022-06-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Listeria detection
GB202009143D0 (en) * 2020-06-16 2020-07-29 Molendotech Ltd Testing method and apparatus
CN112505117A (zh) * 2020-11-11 2021-03-16 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 一种二茂铁纳米花、电化学适配体生物传感器体系及其制备方法和应用
US20220251623A1 (en) * 2021-02-09 2022-08-11 Jonathan N. Roth Method and apparatus for avoiding false positive coliform testing
CN113281137A (zh) * 2021-02-26 2021-08-20 中国计量科学研究院 免疫磁珠富集后的细菌待检测样品的磁珠去除方法
CN115014025B (zh) * 2022-06-10 2023-06-30 珠海格力电器股份有限公司 一种深冻模式下的菌落监测方法、装置及冰箱

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3970518A (en) * 1975-07-01 1976-07-20 General Electric Company Magnetic separation of biological particles
US4230685A (en) * 1979-02-28 1980-10-28 Northwestern University Method of magnetic separation of cells and the like, and microspheres for use therein
FR2537725B1 (fr) * 1982-12-09 1985-07-12 Pasteur Institut Procede de detection immunobacteriologique de germes pathogenes dans des milieux biologiques contamines
US4695393A (en) * 1983-05-12 1987-09-22 Advanced Magnetics Inc. Magnetic particles for use in separations
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5597531A (en) * 1985-10-04 1997-01-28 Immunivest Corporation Resuspendable coated magnetic particles and stable magnetic particle suspensions
US5089386A (en) * 1987-09-11 1992-02-18 Gene-Trak Systems Test for listeria
EP0355147B1 (en) * 1988-01-13 1995-04-19 Institut Pasteur Dna probe specific for pathogenic listeria
EP0418346A1 (en) * 1989-02-06 1991-03-27 Gene-Trak Systems Probes and methods for the detection of listeria
NL9002696A (nl) * 1990-11-15 1992-06-01 U Gene Research Bv Werkwijze en kit voor het aantonen van microoerganismen.
DE69131939D1 (de) * 1991-02-14 2000-03-02 Vicam Lp Testverfahren zum Nachweis der Anwesenheit von Bakterien
WO1992015883A1 (en) * 1991-03-08 1992-09-17 Amoco Corporation Improved assays including colored organic compounds
GB9107124D0 (en) * 1991-04-05 1991-05-22 Dynal As Chemical process

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001161396A (ja) * 1999-09-28 2001-06-19 Becton Dickinson & Co 試料中の微生物の識別方法
JP2006508667A (ja) * 2002-12-10 2006-03-16 ツィンファ ユニバーシティ 磁性ベースの核酸増幅
KR101028875B1 (ko) * 2010-02-12 2011-04-12 메디스커브 주식회사 세포 내에서 세포내 물질의 생리활성 기능을 조절하는 조절물질을 검출하는 방법
WO2011099730A3 (ko) * 2010-02-12 2012-01-12 메디스커브 주식회사 세포 내에서 세포내 물질의 생리활성 기능을 조절하는 조절물질을 검출하는 방법

Also Published As

Publication number Publication date
CA2112603A1 (en) 1994-07-01
EP0605003A2 (en) 1994-07-06
US5491068A (en) 1996-02-13
CA2112603C (en) 1998-10-27
US5695946A (en) 1997-12-09
EP0605003A3 (en) 1995-06-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5695946A (en) Assay method for detecting presence of bacteria
US5821066A (en) Simple, rapid method for the detection, identification and enumeration of specific viable microorganisms
EP0498920B1 (en) Assay method for detecting the presence of bacteria
Olsvik et al. Magnetic separation techniques in diagnostic microbiology
JP5670207B2 (ja) 凝集反応による液体培地中の微生物のリアルタイム検出のための方法
AU681845B2 (en) Method of detecting microorganisms
WO1999053320A9 (en) Real time detection of antigens
JPS60188847A (ja) 連鎖球菌ａの検出用試験セット及び検出方法
EP2007903A2 (en) Nucleic acid detection using lateral flow methods
JPH10503655A (ja) ミコバクテリアの検出
US7241626B2 (en) Isolation and confirmation of analytes from test devices
US20150079597A1 (en) Method for capturing and concentrating a microorganism in a biological sample
US6531278B1 (en) Ligand-DNA composition for capture and detection of contaminants on a solid surface
JPH0326965A (ja) 表面水酸基を有する膜を用いるクラミジア抗原の測定のための診断用試験キット及び方法
McCarthy Immunological techniques: ELISA
JP2001004631A (ja) 磁気ビーズ固定化抗体を用いた微生物の迅速検定法
JP2002181823A (ja) 微生物の検出方法
JPH0994098A (ja) 微生物の選択的濃縮方法およびこれを用いた微生物検査法
Pięta et al. Application of an aptamer and a reagent based on gold nanoparticles for detection of Escherichia coli
Dhanze et al. RECENT ADVANCES IN DIAGNOSIS OF FOODBORNE LIPATHOGENS FROM FOODS OF ANIMAL ORIGIN
de Warrenne Blackburn The separation and detection of Salmonella from foods using immunomagnetic particles
JP2001095567A (ja) 遺伝子検出用遺伝子担体及び遺伝子検出方法
JP2003004747A (ja) 免疫微粒子法と生物発光法の利用による微生物検出法
WO1998013692A1 (en) Microorganism separation system
JPH03257371A (ja) 免疫学的測定方法

Legal Events

Date Code Title Description
A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20040127