JP2006508667A - 磁性ベースの核酸増幅 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は一般に、核酸増幅の分野に関する。特に、本発明は、とりわけ、標的細胞、細胞小器官またはウイルスと磁性マイクロビーズとの間の結合を使用する、標的細胞またはウイルスの核酸を増幅するためのプロセスおよびキットを提供する。
診断分析および分子生物学研究のための基本技術として、種々の核酸増幅手順の発明(例えば、PCR)は、生命科学の発展を促す。しかし、複雑で時間のかかるPCRテンプレートの調製はしばしば、律速段階である。どのように迅速かつ単純なPCRテンプレートの調製を実現させるのか?それは自動的なミニバイオ−チップを作製することは、テンプレート調製のための有望な方法である。上記PCRチップの構築は、徐々に発展している。テンプレート調製とPCRプロセスとを統合することは、分析プロセスの自動化に適している。従って、ラボオンチップ(lab−on−a−chip)系が、生化学分析のために構築され得る。
一つの局面において、本発明は、標的細胞またはウイルスの核酸を増幅するためのプロセスに関し、このプロセスは以下を包含する:a)標的細胞もしくは標的ウイルスを含むか、または含むと疑われるサンプルを、磁性マイクロビーズに接触させる工程;b)上記サンプル中に存在する場合、上記標的細胞、または上記標的ウイルスを、上記磁性マイクロビーズに結合させて、上記標的細胞、または上記標的ウイルスと上記磁性マイクロビーズとの間で結合体を形成させる工程;ならびに、c)上記結合体を、磁力を介して他の望ましくない構成成分から分離して、上記サンプルから、上記標的細胞、上記標的細胞小器官または上記標的ウイルスを単離する工程;ならびにd)上記分離した結合体を、上記標的細胞または上記標的ウイルスに由来する核酸を増幅するために核酸増幅系に適用する工程。
開示を明確にするため本発明の詳細な説明を以下の小節に分けるが、これは限定のためではない。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学・技術用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を持つ。本明細書で引用されている全ての特許、特許出願、公開された出願、および他の刊行物は、その全体が、参考として援用される。この節で示されている定義が、本明細書中に参考のため援用される特許、特許出願、公開された出願、および他の刊行物に示される定義に反するかまたは矛盾する場合、この節で示されている定義は、本明細書中に参考のため援用される定義より優先する。
一局面において、本発明は、標的細胞または標的ウイルスの核酸を増幅するためのプロセスに関し、この方法は、以下を包含する:a)標的細胞または標的ウイルスを含むか、または含むと疑われるサンプルを、磁性マイクロビーズと接触させる工程;b)この標的細胞またはこの標的ウイルスを、このサンプル中に存在する場合、この磁性マイクロビーズに結合させて、この標的細胞、またはこの標的ウイルスとこの磁性マイクロビーズとの間で結合体を形成させる工程;ならびに、c)この結合体を、磁力を介して他の望ましくない構成成分から分離して、このサンプルから、この標的細胞、またはこの標的ウイルスを単離する工程;ならびに、d)この分離した結合体を、核酸増幅系に適用し、この標的細胞またはこの標的ウイルスから核酸を増幅する工程。
本明細書中に記載される実施形態は、一般に、PCRテンプレートの調製および磁性マイクロビーズを用いる核酸(例えば、遺伝子)増幅のためのプロセスに関する。細胞および核酸への非特異的吸着または低特異性吸着を介して、標的生物学的分子(例えば、核酸およびタンパク質)を含む細胞および生物学的物質(例えば、白血球、ウイルス、上皮細胞および培養細胞)は、全血、血漿、血清、骨髄、唾液、尿ならびに細胞および組織の培養溶液から分離され得、これらは、磁性マイクロビーズと一緒になって、マイクロビーズ−細胞結合体を形成する。溶出細胞の溶解後、放出された核酸は、磁性マイクロビーズによって吸着され、マイクロビーズ−核酸結合体を形成する。マイクロビーズ−細胞結合体およびマイクロビーズ−核酸結合体を、PCR反応のテンプレートとしてPCR系に添加する。不純物およびPCRインヒビターの除去、ならびに磁性マイクロビーズの重要な影響がないことに起因して、遺伝子増幅の感度および安定性は、影響を受けない。
(1)このプロセスのサンプルおよび試薬の容量は、少ない。このプロセスは、5μlの全血または唾液を処理し得、そして使用される試薬の容量は、50μl未満である。
(2)沈殿プロセスは、室温で、遠心分離および温度制御なしで実施され得る。
(3)操作は、単純、迅速かつ簡便である。プロセス全体は、約0.5〜15分間しか要さない。
(4)プロセスにおける移動操作、およびサンプルへの夾雑の可能性は、除外され得るか、または減少され得る。
(5)分離方法は、普遍的であり、多くの種類のサンプルに対して好適である。
(6)プロセスの間の、作業者および環境に対する害はない。
(7)同時のテンプレート調製および増幅プロセスを有するために、このプロセスを自動化および小型化することは、容易である。
生物科学のサンプルから細胞を分離する工程は、中心的かつ基礎的な工程である。密度勾配遠心分離は、しばしば、細胞の大きさおよび密度の差異に基づいて使用される。しかし、遠心分離の必要性は、小型デバイスを構築することを困難にする。障壁デバイスは、細胞の大きさの差異に基づき、標的細胞を濾過するチップ上に構築される。このデバイスは、その困難な機械加工ゆえに、普遍的ではない。原則として、磁性マイクロビーズを使用して細胞を分離する2種類の方法が存在する。1つは、特異的抗体を用いて得られる磁性マイクロビーズを利用する、細胞の特異的分離である。もう1つは、選択的遠心分離または細胞の磁性マイクロビーズへの吸着の相違を利用して、細胞を分離することである。第1の方法は、多くの種類の細胞について好適であり、分離した細胞は、非常に特異的である。しかし、この磁性マイクロビーズは、高価であるだけでなく、厳密な輸送条件および保存条件を要し、かつその生物学的活性を失いやすい。第2の方法は、低い普遍性を有する。しかし、この磁性マイクロビーズは、安価であるだけでなく、厳密な輸送条件および保存条件を必要としない。この実験条件は、分離性能にほとんど影響を有さず、そしてその方法は、単純である。
被膜磁性マイクロビーズの調製は、CN 01/109870.8またはWO02/075309において見出され得る。
(1)小磁性マイクロビーズ(Tris−EDTA緩衝液(pH.6.0)中に懸濁される)を、液体生物学的サンプル中に添加する。混合物を、ボルテックスすることによって穏やかに撹拌し、室温で3分間インキュベートして、マイクロビーズ−細胞結合体を形成する。
(2)磁性マイクロビーズ−細胞結合体を、磁場によって分離し、そして上清を捨てる。磁性マイクロビーズ−細胞結合体を、70%エタノール溶液で1回洗浄する。洗浄したマイクロビーズ−細胞結合体を、遺伝子増幅のために、PCR系に直接添加し得る。
(3)少量の細胞溶解溶液を、混合物内に添加し、ボルテックスすることにより、懸濁液を均一に混合し、室温で1分間インキュベートして、細胞を溶解させる。混合物中にイソプロピルアルコールを添加し、そしてこの懸濁液を、ボルテックスすることにより均一に混合し、次いで、5分間放置して、結合体を形成させる。
(4)磁性マイクロビーズ−核酸結合体を、磁場によって分離し、上清を捨てる。磁性マイクロビーズ−核酸結合体を、70%エタノールで2回洗浄し、塩を溶出する。洗浄したマイクロビーズ−核酸結合体を、遺伝子増幅のために、PCR系に直接添加し得る。
(1)TE緩衝液(pH6.0):10mM EDTA/25mM Tris−HCl。Tris−EDTA(pH6.0):10mM EDTA/25mM Tris−HCl。
(2)溶解溶液:NaI 11.25g;尿素 12.0g;TritonX−100 0.65ml;TE(pH8.0)30ml:10mM EDTA/25mM Tris−HCl。
本方法は、以下の主な利点を有する:(1)単純かつ迅速な操作、1〜10分間しかかからない;(2)eppendorfチューブしか必要とせず、沈殿は必要としない;(3)得られた産物は、その後の生物学的操作に好適である;(4)自動化操作の実現が容易である;(5)有毒な薬剤を使用することなく、安全な操作;(6)室温での操作;(7)磁性マイクロビーズの容易な保存(分離効果に重要な影響を有さない)。
(2.1 操作プログラム)
(1)特定の細胞の表面上の抗原と反応する抗体で得られる少量の磁性マイクロビーズを、液体生物学的サンプル中に添加する。混合物を、ボルテックスすることによって穏やかに撹拌し、室温で3分間インキュベートして、マイクロビーズ−細胞結合体を形成する。
(2)磁性マイクロビーズ−細胞結合体を、磁場によって分離し、そして上清を捨てる。磁性マイクロビーズ−細胞結合体を、70%エタノール溶液で1回洗浄する。洗浄したマイクロビーズ−細胞結合体を、遺伝子増幅のために、PCR系に直接添加し得る。
(3)少量の細胞溶解溶液を、混合物内に添加し、ボルテックスすることにより、懸濁液を均一に混合し、室温で1分間インキュベートして、細胞を溶解させる。混合物中にイソプロピルアルコールを添加し、そしてこの懸濁液を、ボルテックスすることにより均一に混合し、次いで、5分間放置して、結合体を形成させる。
(4)磁性マイクロビーズ−核酸結合体を、磁場によって分離し、上清を捨てる。磁性マイクロビーズ−核酸結合体を、70%エタノールで1回洗浄し、塩を溶出する。洗浄したマイクロビーズ−核酸結合体を、遺伝子増幅のために、PCR系に直接添加し得る。
(1)TE緩衝液(pH6.0):10mM EDTA/25mM Tris−HCl;Tris−EDTA(pH6.0):10mM EDTA/25mM Tris−HCl。
(2)溶解溶液:NaI 11.25g;尿素 12.0g;TritonX−100 0.65ml;TE(pH8.0)30ml:10mM EDTA/25mM Tris−HCl。
本方法は、以下の主な利点を有する:(1)単純かつ迅速な操作、20〜30分間しかかからない;(2)エッペンドルフチューブしか必要とせず、沈殿は必要としない;(3)得られた産物は、その後の生物学的操作に好適である;(4)自動化操作の実現が容易である;(5)有毒な薬剤を使用することなく、安全な操作;(6)PCRインヒビターの容易な除去。
(実施例1.ヒト全血からのHLA−A遺伝子のテンプレート調製および増幅)
健康なドナー由来のヒト全血を、血液の1/6容量のACDで抗凝集した。白血球の単離の手順は、以下のようである。Tris−EDTA緩衝液(pH6.0)に懸濁した10μLの15μg/μL磁性マイクロビーズを含む1.5mLのEppendorfTMチューブに、50μL抗凝集血に加えた。混合物を、ボルテックスすることによって15秒間穏やかに懸濁し、室温で3分間インキュベートした。次いで、マイクロビーズ−白血球結合体を、磁気スタンド上で不動化し、上清を捨てた。磁性マイクロビーズ−白血球結合体を、100μLの70%エタノール溶液で2回洗浄した。上記の洗浄したマイクロビーズ−白血球結合体を、HLA−A遺伝子増幅のために、PCR系に直接添加した。産物を、アガロースゲル電気泳動により分析した。
使用した唾液は、健康なドナーから得られた。白血球の単離の手順は、以下のようである。Tris−EDTA緩衝液(pH6.0)中に懸濁した10μLの15μg/1μL磁性マイクロビーズを含む1.5mL EppendorfTMチューブに、50μLの唾液を加えた。混合物を、15秒間ボルテックスすることによって穏やかに撹拌し、室温で3分間インキュベートした。磁性マイクロビーズ−上皮細胞結合体を、磁気スタンド上で不動化し、上清を捨てた。磁性マイクロビーズ−上皮細胞結合体を、100μLの70%エタノール溶液で2回洗浄した。上記の洗浄した磁性マイクロビーズ−上皮細胞結合体を、HLA−A遺伝子増幅のためにPCR系に直接添加した。産物を、アガロースゲル電気泳動によって分析した。磁性マイクロビーズによって調製したテンプレートを使用した増幅産物の収率および純度を、溶出したDNAによって調製したテンプレートを使用した増幅産物の収率および純度と比較した。
健康なドナー由来のヒト全血を、血液の1/6容量のACDで抗凝集した。白血球の単離の手順は、以下のようである。Tris−EDTA緩衝液(pH6.0)に懸濁した10μLの15μg/μL磁性マイクロビーズを含む1.5mLのEppendorfTMチューブに、100μL細胞溶解溶液(0.5% Na2EDTA、0.1M Tris、0.1M NaCl、1% NP−40、30μlプロテイナーゼK(20mg/mL、pH7.8))と混合した50μL抗凝集血に加えた。懸濁液を、ボルテックスすることによって穏やかに懸濁し、室温で15分間インキュベートした。磁性マイクロビーズ−DNA−抗DNA結合体を、磁気スタンド上で不動化し、上清を捨てた。50μLのTris−EDTA(pH6.0)の溶液を結合体に加え、室温で10分間インキュベートして、DNAを溶出した。溶出したDNAを、PCR系に加え、HLA−A遺伝子を増幅した。産物を、アガロースゲル電気泳動およびUV分光法によって直接分析した。毒性の薬剤を使用しないこの方法は、すばらしい特異性および高い分離効率を有する。
HBVウイルスを保有するドナー由来のヒト全血を、血液の1/6容量のACDで抗凝集した。ウイルスの単離の手順は、以下のようである。200μLの血清を、500μLの全血から分離した。これを、抗HBVウイルス抗体を有する50μLの15μg/μL磁性マイクロビーズを含むTris−EDTA緩衝液(pH6.0)に添加した。懸濁液を、ボルテックスすることによって穏やかに懸濁し、室温で15分間インキュベートした。磁性マイクロビーズ−ウイルス−抗体結合体を、磁気スタンド上で不動化し、上清を捨てた。結合体を、PCR系に加え、HBA遺伝子を増幅した。産物を、アガロースゲル電気泳動およびUV分光法によって直接分析した。毒性の薬剤を使用しないこの方法は、すばらしい特異性および高い分離効率を有する。
Claims (36)
- 標的細胞または標的ウイルスの核酸を増幅するためのプロセスであって、該プロセスは、以下:
a)標的細胞もしくは標的ウイルスを含むか、または含むと疑われるサンプルを、磁性マイクロビーズに接触させる工程;
b)該サンプル中に存在する場合、該標的細胞または該標的ウイルスを、該磁性マイクロビーズに結合させて、該標的細胞または該標的ウイルスと該磁性マイクロビーズとの間で結合体を形成させる工程;ならびに
c)該結合体を、磁力を介して他の望ましくない構成成分から分離して、該サンプルから、該標的細胞または該標的ウイルスを単離する工程;ならびに
d)該分離した結合体を、核酸増幅系に適用し、該標的細胞または該標的ウイルス由来の核酸を増幅する工程、
を包含する、プロセス。 - 前記サンプルが、臨床サンプルである、請求項1に記載のプロセス。
- 前記サンプルが、血清、血漿、全血、痰、脳脊髄液、羊水、尿、胃腸管内容物、毛髪、唾液、汗、歯肉擦過標本、骨髄、組織、および細胞培養物からなる群より選択される、請求項1に記載のプロセス。
- 前記標的細胞が、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、組み換え細胞、および培養細胞からなる群より選択される、請求項1に記載のプロセス。
- 前記標的ウイルスが、真核生物細胞ウイルスまたはバクテリオファージである、請求項1に記載のプロセス。
- 前記磁性マイクロビーズが、常磁性物質、強磁性物質、およびフェリ磁性物質からなる群より選択される磁化可能な物質を含む、請求項1に記載のプロセス。
- 前記磁化可能な物質が、金属組成物を含む、請求項6に記載のプロセス。
- 前記金属組成物が、遷移金属組成物またはそれらの合金である、請求項7に記載のプロセス。
- 前記遷移金属が、鉄、ニッケル、銅、コバルト、マンガン、タンタル、ジルコニウム、およびコバルト−タンタル−ジルコニウム(CoTaZr)合金からなる群より選択される、請求項8に記載のプロセス。
- 前記金属組成物が、Fe3O4である、請求項7に記載のプロセス。
- 前記磁性マイクロビーズが、約5ナノメートル〜約50,000ナノメートルの範囲の直径を有する、請求項1に記載のプロセス。
- 前記磁性マイクロビーズが、未処理であるか、または有機分子で改変されている、請求項1に記載のプロセス。
- 前記磁性マイクロビーズが、改変されて、ヒドロキシル基、カルボキシル基またはエポキシ基を含む、請求項1に記載のプロセス。
- 前記磁性マイクロビーズが、改変されて、前記標的細胞または前記標的ウイルスに特異的に結合する部分を含む、請求項1に記載のプロセス。
- 前記部分が、抗体またはその機能的フラグメントである、請求項14に記載のプロセス。
- 前記サンプル中に存在する場合、前記標的細胞または前記標的ウイルスが、前記磁性マイクロビーズに非特異的に、または低い特異性で結合されて、前記結合体を形成する、請求項1に記載のプロセス。
- 前記サンプル中に存在する場合、前記標的細胞または前記標的ウイルスが、前記磁性マイクロビーズに高い特異性で結合されて、前記結合体を形成する、請求項1に記載のプロセス。
- 前記分離した結合体を核酸増幅系に適用する前に、該分離した結合体を洗浄して、前記望ましくない構成成分を除去する工程をさらに包含する、請求項1に記載のプロセス。
- 自動化されている、請求項1に記載のプロセス。
- 約0.5分〜約30分の範囲の時間内に完了する、請求項1に記載のプロセス。
- エッペンドルフチューブ内で行われる、請求項1に記載のプロセス。
- 沈殿手順も遠心分離手順もなしで行われる、請求項1に記載のプロセス。
- 有毒な薬剤なしで行われる、請求項1に記載のプロセス。
- 温度制御なしに、約0℃〜約35℃の範囲の周囲温度で行われる、請求項1に記載のプロセス。
- 前記サンプルの体積が、約5μl〜約50μlの範囲に及ぶ、請求項1に記載のプロセス。
- 前記標的細胞が、全血、骨髄またはリンパから単離された白血球である、請求項1に記載のプロセス。
- 前記標的細胞が、唾液、尿および組織培養物から単離された上皮の脱落細胞または細菌細胞である、請求項1に記載のプロセス。
- 前記核酸増幅系が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、核酸配列ベース増幅(NASBA)、鎖置換増幅(SDA)、および転写媒介性増幅(TMA)からなる群より選択される、請求項1に記載のプロセス。
- 標的ウイルスまたは標的バクテリオファージを含むか、または含むと疑われるサンプルを磁性マイクロビーズに接触させる工程の前に、該サンプルから細胞を除去する工程をさらに包含する、請求項1に記載のプロセス。
- 標的細胞または標的ウイルスの核酸を増幅するためのキットであって、該キットは、同じもしくは異なる容器内に、以下:
a)標的細胞もしくは標的ウイルスを含むか、または含むと疑われるサンプルと接触するための磁性マイクロビーズ;
b)該サンプル中に存在する場合、該標的細胞または該標的ウイルスを、該磁性マイクロビーズに結合させて、該標的細胞または該標的ウイルスと該磁性マイクロビーズとの間で結合体を形成させるための手段;
c)該結合体を、該サンプルからの磁力を介して、他の望ましくない構成成分から分離するための手段;ならびに
d)該標的細胞または該標的ウイルス由来の核酸を増幅するための核酸増幅系、
を含む、キット。 - サンプル由来の標的細胞または標的ウイルスの核酸を増幅するために前記キットを使用するための使用説明書をさらに含む、請求項30に記載のキット。
- 標的細胞または標的ウイルスの核酸を増幅するためのプロセスであって、該プロセスは、以下:
a)標的細胞もしくは標的ウイルスを含むか、または含むと疑われるサンプルを、磁性マイクロビーズに接触させる工程;
b)該サンプル中に存在する場合、該標的細胞または該標的ウイルスを、該磁性マイクロビーズに結合させて、該標的細胞または該標的ウイルスと該磁性マイクロビーズとの間で結合体を形成させる工程;ならびに
c)該結合体を、磁力を介して他の望ましくない構成成分から分離して、該サンプルから、該標的細胞または該標的ウイルスを単離する工程;
d)該細胞−マイクロビーズ結合体または該ウイルス−マイクロビーズ結合体から核酸を放出させて、核酸−マイクロビーズ結合体を形成する工程、ならびに
e)該核酸−マイクロビーズ結合体を、核酸増幅系に適用し、該標的細胞または該標的ウイルス由来の核酸を増幅する工程、
を包含する、プロセス。 - 前記核酸−マイクロビーズ結合体を核酸増幅系に適用する前に、該核酸−マイクロビーズ結合体を洗浄して、前記望ましくない構成成分を除去する工程をさらに包含する、請求項32に記載のプロセス。
- 前記核酸−マイクロビーズ結合体を核酸増幅系に適用する前に、磁力を介して、他の望ましくない構成成分から該核酸−マイクロビーズ結合体を分離する工程をさらに包含する、請求項32に記載のプロセス。
- 標的細胞または標的ウイルスの核酸を増幅するためのキットであって、該キットは、同じもしくは異なる容器内に、以下:
a)標的細胞もしくは標的ウイルスを含むか、または含むと疑われるサンプルと接触するための磁性マイクロビーズ;
b)該サンプル中に存在する場合、該標的細胞または該標的ウイルスを、該磁性マイクロビーズに結合させて、該標的細胞または該標的ウイルスと該磁性マイクロビーズとの間で結合体を形成させるための手段;
c)該結合体を、該サンプルからの磁力を介して、他の望ましくない構成成分から分離するための手段;
d)該細胞−マイクロビーズ結合体または該ウイルス−マイクロビーズ結合体から核酸を放出させて、核酸−マイクロビーズ結合体を形成するための手段;ならびに
e)該標的細胞または該標的ウイルス由来の核酸を増幅するための核酸増幅系、
を含む、キット。 - サンプル由来の標的細胞または標的ウイルスの核酸を増幅するためにキットを使用するための使用説明書をさらに含む、請求項35に記載のキット。
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