CN110408681A - 增强恒温扩增核酸灵敏度的方法及其试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种磁性钢珠用来增加RAA恒温扩增灵敏度的方法及其在核酸分析及检测、医学诊断中的应用，属于生物医学工程领域。其中包括(1)磁性珠的材料选择、(2)磁性钢珠的直径优化、(3)磁性钢珠的混合时间的优化、(4)磁性钢珠对RAA恒温检测灵敏度增加检测方式，其中磁性珠的材料选择为钢性，磁珠的直径选择为1.5mm，磁性钢珠的混合时间30s，恒温RAA结果的检查方式可以为琼脂糖凝胶、荧光检测，在此条件下磁性钢珠对RAA恒温扩增的灵敏度提高了10倍相对于未加钢珠，提高了100倍相对于其他类型的荧光检测仪。本发明磁性钢珠能够显著提高RAA恒温扩增的灵敏度，使得其在核酸快速检测、临床诊断上有较大的应用场景。

Description

增强恒温扩增核酸灵敏度的方法及其试剂
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域的重组酶介导的链置换(RAA)扩增反应，尤其是一种应用磁性钢珠增强RAA恒温扩增灵敏度的方法。
背景技术
重组酶介导扩增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在RAA反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。
重组酶介导的链置换(RAA)扩增反应发展到今天已有10多年的时间，随着科学技术不断的发展和进步，恒温RAA技术已经成为分子生物学中重要的技术之一，并广泛用于卫生防疫、遗传学、微生物学等。但是在临床医学和疾病潜伏期中的病毒诊断中往往没有达到理想的结果，甚至有时候导致漏检。因为在疾病的潜伏期的时间段里，病毒往往复制的特别少，没有足够的核酸量来满足检测限的需求，往往导致很多常规的检测方法无法捕捉到病毒基因。
发明内容
针对如何增强恒温RAA检测效率的方法研究，国内外很少有提及。大部分都是研究优化PCR扩增效率，通过添加甲酰胺、DMSO、甘油、BSA、非离子去污剂及氯化四甲基铵等，来增加PCR的特异性和产量。这些方法对于恒温RAA扩增体系来说，没有实质性的改变，甚至有抑制或者压根无法扩增。
本发明人小组惊讶的发现，通过改变反应RAA反应体系各分子之间的运动和结合效率来改变RAA检测的灵敏度被证实确实有效的。本发明人小组惊讶的发现，在该RAA反应体系中添加磁性钢珠，可以显著改变RAA检测的灵敏度研。有鉴于此，本发明的目的是提供磁性钢珠来增强RAA恒温检测的灵敏度的方法以及试剂。
为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：
一种磁性钢珠用来增加RAA恒温扩增灵敏度的方法及其在核酸分析及检测、医学诊断中的应用，属于生物医学工程领域。其中包括(1)磁性珠的材料选择、(2)磁性钢珠的直径优化、(3)磁性钢珠的混合时间的优化、(4)磁性钢珠对RAA恒温检测灵敏度增加检测方式，其中磁性珠的材料选择为钢性，磁珠的直径选择为1.5mm，磁性钢珠的混合时间30s，恒温RAA结果的检查方式可以为琼脂糖凝胶、荧光检测，在此条件下磁性钢珠对RAA恒温扩增的灵敏度提高了10倍相对于未加钢珠，提高了100倍相对于其他类型的荧光检测仪。
而且，所述的增强恒温RAA扩增灵敏度的方法，其特征在于：所述的磁性珠材质为特氟龙、聚乙烯、聚丙烯、铁珠、钢珠、钨钢珠、镍珠中的一种或者几种。在一些优选的方式中，最优的为磁性钢珠。
在一些实施方案中，所述的增强恒温RAA扩增灵敏度的方法，其特征在于：所述的磁性钢珠要经过漂洗、灭菌、超声、烘干等工艺处理。
在一些实施方案中，所述的增强恒温RAA扩增灵敏度的方法，其特征在于带磁性钢珠的直径可以为1mm、1.5mm、2mm、2.5mm等，最优的为1.5mm。
在一些实施方案中，所述的增强恒温RAA扩增灵敏度的方法，其特征在于带磁性的钢珠在反应管的混匀时间可以为5s、10s、15s、20s、25s、30s等，最优为20s的混匀时间。
在一些实施方案中，所述的增强恒温RAA扩增灵敏度的方法，其特征在于：所述的RAA扩增包括：常规RAA、低拷贝RAA扩增、长片段RAA扩增、复杂模板RAA扩增、不对称引物RAA扩增、荧光法RAA扩增、反转录RAA扩增、反复扩增的RAA。
在一些实施方案中，所述的试剂盒，所述增强恒温RAA扩增灵敏度的方法在公共卫生防疫、临床诊断、和疾病相关基因分析等生物医学领域中的应用。
在一些实施方案中，所述的用途，其中所述的临床疾病诊断为传染病诊断、性病诊断、癌症诊断等。
所以，一方面本发明提供一种恒温扩增核酸的方法，包括：在扩增试剂中增加磁性珠子，其中珠子的直径为0.5毫米-3毫米。
优选的，所述的磁珠珠子选自特氟龙、聚乙烯、聚丙烯、铁珠、钢珠、钨钢珠、镍珠中的一种。
优选的，所述的珠子为磁性钢珠。
优选的，所述的珠子的直径为1-1.5毫米。
优选的，所述的珠子的直径为1.5毫米。
优选的，在进行核酸扩增前，让磁珠与所述的扩增试剂为溶液状态，让核酸试剂溶液混合5-40秒时间。优选的，，混合的时间为20-30秒。
优选的，当磁珠为钢珠的时候，混合时间为20秒。
优选的，在让珠子与核酸扩增试剂接触前，对所述的磁性钢珠要经过漂洗、灭菌、超声、烘干等工艺处理。
优选的，所述的核酸扩增方法包括RAA和/或者RPA方法。
优选的，所述的核酸为非洲猪瘟的核酸。
优选的，让磁珠和扩增试剂溶液的体积比为1:1-1:3。
另一方面，本发明提供一种RAA扩增试剂，其中，该试剂包括核酸扩增必须的时间，其中，所述的试剂中还包括磁珠。
优选的，所述的磁珠珠子选自特氟龙、聚乙烯、聚丙烯、铁珠、钢珠、钨钢珠、镍珠中的一种。
优选的所述的珠子为磁性钢珠。
优选的所述的珠子的直径为1-1.5毫米。
优选的，所述的珠子的直径为1.5毫米。
优选的，当扩增试剂为溶液的时候，磁珠和扩增试剂溶液的体积比为1:1-1:3。
详细说明
检测和化验
检测表示化验或测试一种物质或材料是否存在，比如，但并不限于此，化学物质、有机化合物、无机化合物、新陈代谢产物、药物或者药物代谢物、有机组织或有机组织的代谢物、核酸、蛋白质或聚合物。另外，检测表示测试物质或材料的数量。
重组聚合酶扩增
重组酶介导扩增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在RAA反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。
在本发明中，RAA和RPA可以互换，磁珠的加入可以理解，对扩增的灵敏度提高的效果都类似。
RPA或RAA是一个核苷酸扩增方法(如等温扩增)。通常，在RPA的第一步，重组酶与第一和第二核苷酸引物接触，从而形成第一和第二核蛋白引物。通常第二步，第一和第二核蛋白引物与双链核苷酸模板接触，在模板核苷酸的第一链的第一部分形成第一个双链结构，在模板核苷酸的第二链的第二部分形成第二个双链结构，如在给定的DNA分子中，第一核苷酸引物和第二核苷酸引物的3’端相互相向而对。一般，在第3步，第一和第二核蛋白引物的3’端被DNA聚合酶扩展从而产生第一和第二双链核苷酸，第一和第二解置换核苷酸链。通常，第二步和第三步重可以被重复直到扩增达到预计的程度。
如这里所述，RPA或RAA使用的酶，已知是重组酶，能配对与双链DNA模板同源的寡核苷酸引物。在这种方式中，DNA在双链DNA模板中定点合成。存在核苷酸模板时，用2种或多种序列特异引物(如基因特异)即开始指数扩增反应。反应进展迅速，双链DNA模板序列的特异扩增的结果是几分钟内DNA模板从仅有几个拷贝扩增达到可检测的水平。RPA方法已经有所披露，例如在美国专利，号码US 7,270,981；US 7,399,590；US 7,666,598；US 7,435,561；美国专利公开US 2009/0029421；和国际申请WO 2010/141940中都有披露。所有这些文献的全部作文本发明的一部分并作为参考。
RPA或RAA反应包含各种蛋白和其他因子的协调，正如支持那些从寡核苷酸的3’端配对到互补底物的DNA合成一样，这些其它因子支持系统中重组元件的活性。在一些实施例中，RPA反应包含重组酶，单链结合蛋白，聚合酶，dNTPs,ATP,引物和核苷酸模板的混合物。在一些实施例中，RPA反应可以包括一种或多种下列物质(以任意组合的方式)：至少一种重组酶；至少一种单链结合蛋白；至少一种DNA聚合酶；dNTPs或dNTPs和ddNTPs的混合物；拥挤试剂；缓冲液；还原剂；ATP或ATP的类似物；至少一种重组加载蛋白；第一种引物和任意的第二种引物；探针；逆转录酶；和核苷酸模板分子，如单链(如RNA)或双链核苷酸。在一些实施例中，RPA反应可以包括如逆转录酶。其他的RPA反应混合物的实例不限于这里所描述的实例。
在一些实施例中，RPA或RAA反应可以包含UvsX蛋白，gp32蛋白，和UvsY蛋白。这里所述的组分、微粒或方法可以包括，或部分包括，如UvsX蛋白，gp32蛋白，和UvsY蛋白。例如这里所述的组分、微粒或任何的方法都可以包含，或部分包含，如T6H66S UvsX,Rb69gp32,和Rb69UvsY。
在一些实施例中，RPA或RAA反应可以包含UvsX蛋白和gp32蛋白。例如，这里所述的任何组分、任何微粒或任何方法都可以包含，或部分包含，如UvsX蛋白和gp32蛋白。
RPA或RAA反应的一种蛋白组分是重组酶，重组酶可以来自原核生物、病毒或真核生物。典型的重组酶包括RecA和UvsX(如从任何物种获得的RecA蛋白或UvsX蛋白)，和他们的片段或突变体，和它们之间的任意组合。RecA和UvsX蛋白可以从任何物种获得。RecA和UvsX片段或突变体蛋白也可以用合适的RecA和UvsX蛋白，核苷酸序列和分子生物学技术产生(见如在美国专利第8,071,308号中描述的UvsX突变体的形成)。典型的UvsX蛋白包括那些源自肌病毒科噬菌体蛋白(myoviridae phages)，例如T4,T2,T6,Rb69,Aeh1,KVP40,不动杆菌噬菌体(Acinetobacter phage)133，气单胞菌噬菌体(Aeromonas phage)65，噬蓝藻体(cyanophage)P-SSM2，噬蓝藻体(cyanophage)PSSM4，噬蓝藻体(cyanophage)S-PM2,Rb14,Rb32,气单胞菌噬菌体(Aeromonas phage)25，弧菌噬菌体nt-1，phi-1,Rb16,Rb43,噬菌体31,噬菌体44RR2.8t,Rb49,噬菌体Rb3,和噬菌体LZ2。其他典型的重组酶蛋白包括古细菌RADA和RADB蛋白和真核(如植物、哺乳动物和真菌)Rad51蛋白(如RAD51,RAD51B,RAD51C,RAD51D,DMC1,XRCC2,XRCC3,and recA)(见例Lin等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103:10328-10333,2006)。
在本发明的任意方法中，重组酶(如UvsX)可以是突变体或杂种重组酶。在一些实施例中，UvsX突变体是Rb69UvsX，它至少在其氨基酸序列上包含一个突变，其中，突变体可以选自于氨基酸突变组，氨基酸突变组可以由(a)为在64位点的氨基酸不是组氨酸而是丝氨酸，在C端附加一个或多个谷氨酸残基，在C端附加一个或多个天门冬氨酸，或它们之间的任意组合。在其他实施例中，UvsX突变体是T6UvsX具有至少一个T6UvsX氨基酸序列突变，其中突变体从氨基酸突变组中选择产生，氨基酸突变组由(a)在66位点的氨基酸不是组氨酸，(b)66位点是丝氨酸，(c)在C端附加一个或多个谷氨酸残基，(d)在C端附加一个或多个天门冬氨酸，和(e)它们之间的任意组合。杂种重组蛋白使用的地方，杂种蛋白可以，例如可以是至少一个区域的氨基酸序列来自不同物种的UvsX蛋白。这个区域可以是，例如UvsX的DNA-结合环-2结合域。
另外，在持续进行的各种交换反应过程中，一种或多种单链DNA结合蛋白可以用来稳定核苷酸。一种或多种单链DNA结合蛋白可以来源于或从各种物种中获得，如从原核生物，病毒或真核生物。典型的单链DNA结合蛋白包括但不限于大肠杆菌SSB和那些源自肌病毒噬菌体的单链DNA结合蛋白，例如T4,T2,T6,Rb69,Aeh1,KVP40,不动杆菌噬菌体133，气单胞菌噬菌体65，噬蓝藻体P-SSM2，噬蓝藻体PSSM4，噬蓝藻体S-PM2,Rb14,Rb32,气单胞菌噬菌体25，弧菌噬菌体nt-1，phi-1,Rb16,Rb43,噬菌体31,噬菌体44RR2.8t,Rb49,噬菌体Rb3,和噬菌体LZ2。额外的单链DNA结合蛋白的例子包括脱氮硫杆菌(A.denitrificans)Alide-2047,伯克氏菌(Burkholderia thailandensis)BthaB_33951,普式菌(Prevotellapallen)s HMPREF9144-0124，和复制蛋白A的真核单链DNA结合蛋白。
DNA聚合酶可以是真核的或原核生物的聚合酶。真核生物聚合酶的实施例中包括pol-alpha,pol-beta,pol-delta,pol-epsilon，和它们的突变体或片段，或它们的组合。原核生物聚合酶的实施例中包括大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I(如科莱诺(Klenow)片段)，噬菌体T4gp43DNA聚合酶，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)聚合酶I的大片段,Phi-29DNA聚合酶，T7DNA聚合酶，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Pol I，金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Pol I，大肠杆菌DNA聚合酶I，大肠杆菌DNA聚合酶II，大肠杆菌DNA聚合酶III,大肠杆菌DNA聚合酶IV,大肠杆菌DNA聚合酶V,和它们的突变体或片段，或它们的组合。在一些实施例中，DNA聚合酶缺失3'-5'核酸外切酶活性。在一些实施例中，DNA聚合酶具有链置换功能，如I类和PolV原核生物聚合酶的大片段。
本发明的任何方法中都可以在拥挤试剂的情况下进行。在一些实施例中，拥挤试剂可以包括一种或多种聚乙二醇/聚氧乙烯,聚环氧乙烷，聚乙烯醇，聚丙乙烯，聚蔗糖，葡萄聚糖，聚乙烯(乙烯吡咯烷酮)(PVP)，和白蛋白。在一些实施例中，拥挤试剂的分子量不超过200，000道尔顿。拥挤试剂存在的重量体积比(w/v)在大约0.5％至大约15％间。
假如使用重组加载蛋白，重组加载蛋白可以是源自原核生物、病毒或真核生物。典型的重组加载蛋白包括大肠杆菌RecO,大肠杆菌RecR,UvsY,和它们的突变体或片段，或它们的组合。典型的UvsY蛋白包括那些源自肌病毒噬菌体例如T4,T2,T6,Rb69,Aeh1,KVP40，不动杆菌噬菌体133，气单胞菌噬菌体65，噬蓝藻体P-SSM2，噬蓝藻体PSSM4，噬蓝藻体S-PM2,Rb14,Rb32,气单胞菌噬菌体25，弧菌噬菌体nt-1，phi-1,Rb16,Rb43,噬菌体31,噬菌体44RR2.8t,Rb49,噬菌体Rb3,和噬菌体LZ2。在本发明的任何方法中，重组加载试剂可以来自肌病毒噬菌体。肌病毒噬菌体可以是，例如T4,T2,T6,Rb69,Aeh1,KVP40,不动杆菌噬菌体133，气单胞菌噬菌体65，噬蓝藻体P-SSM2，噬蓝藻体PSSM4，噬蓝藻体S-PM2,Rb14,Rb32,气单胞菌噬菌体25，弧菌噬菌体nt-1，phi-1,Rb16,Rb43,噬菌体31,噬菌体44RR2.8t,Rb49,噬菌体Rb3,和噬菌体LZ2。
另外，本发明的任何方法中可以用中断引物执行。中断引物是一种引物可以不允许聚合酶延伸。利用中断引物时，解中断试剂可以用来开启引物并允许延伸。解中断试剂可以是从引物打通中断组的核酸内切酶或核酸外切酶。典型的解中断试剂包括大肠杆菌核酸外切酶III和大肠杆菌核酸内切酶IV。
在一些实施例中，本发明包括：重组酶与第一和第二核苷酸引物和第三延伸中断引物接触形成第一、第二核第三核酸蛋白引物，其中，中断引物含有一个或多个非互补或修饰内残基；第一和第二核酸蛋白引物与双链靶标核苷酸接触，在第一链的第一部分(形成D环)核酸蛋白引物和DNA第一链之间形成第一双链结构，在第二链的第二部分(形成D环)第二核酸蛋白引物和DNA第二链之间形成第二双链结构，这样，在位于第一和第二引物的5’端之间间的第三部分靶核苷酸的相同靶标核苷酸上，第一核酸蛋白引物和第二核酸蛋白引物彼此相向而对进行导向；和用一种或多种聚合酶和dNTPs延伸第一核酸引物和第二核酸引物3’端，从而形成靶标核苷酸的第一扩增；在核酸酶存在时，靶标核苷酸的第一扩增与第三核酸引物接触在靶标核苷酸初扩增内形成第三双链结构(形成D环)，只有在形成第三双链结果后，核酸酶特异拆开不互补的内部残基形成第三个5’引物和第三个3’延伸中断引物；和用一个或多个聚合酶和dNTP延伸第三个5’引物的3’端，产生第二双链扩增核苷酸。
在一些实施例中，这些方法包括：第一和第二引物扩增双链靶标核苷酸内的第一部分产生第一扩增产物，至少一种附加引物可以被用于扩增第一扩增产物内的部分连续序列(如，附加第三者引物被用来与如第一或第二引物结合，扩增在第一扩增产物内的部分连续序列)。在一些实施例中，方法包括：第一和第二引物扩增双链靶标核苷酸内的第一部分产生第一扩增产物，和，第三和第四中引物可被用于扩增第一扩增产物内的部分连续序列。
在一些实施例中，方法包括，如一个正向引物和一个反向引物。在一些实施例中，扩增方法包括至少一个中断引物，该中断引物包含一个或多个不互补或内修饰残基(如，一个或多个可以被核酸酶识别和清除的不互补或内修饰残基，核酸酶可以，例如为DNA糖基酶，脱嘌呤嘧啶(AP)内切核酸酶，fpg,Nth,MutY,MutS,MutM,大肠杆菌MUG，人类MUG,人类Ogg1,脊椎动物Nei-like(Neil)糖基酶,Nfo,核酸外切酶III,or尿嘌呤糖基酶)。其他的核苷酸实例(如引物和探针)不限于这里所述的方法。
在一些实施例中，扩增方法可以包括抵抗(resistant)核酸酶的引物或探针，如包含至少一种(如至少2、3、4、5、6、7或8)磷酸酯键(phosphorothioate linkages)。
本发明的任何过程可以有肝磷脂的情况下执行。肝磷脂作为减少非特异引物杂质的试剂，可以增加大肠杆菌核酸外切酶III或大肠杆菌核酸内切酶IV的功能来快速刨除3’中断基或来自重组中间体的末端残基。
根据反应的特殊类型，混合物可包含一种或多种缓冲剂、一种或多种盐和一种或多种核苷酸。反应混合物可以被持续在有利于反应的一个特定温度或温度范围内。在一些实施例中，温度被保持在或低于80℃，如保持在或低于70℃，保持在或低于60℃，保持在或低于50℃，保持在或低于40℃，保持在或低于37℃，保持在或低于30℃，保持在或低于室温。在一些实施例中，温度保持在或高于4℃，保持在或高于10℃，保持在或高于15℃，保持在或高于20℃，保持在或高于25℃，保持在或高于30℃，保持在或高于37℃，保持在或高于40℃，保持在或高于50℃，保持在或高于60℃，保持在或高于70℃。在一些实施例中，反应混合物被保持在室温或周围环境(ambient)温度。在一些实施中，整个反应时间内混合液的摄氏温度的变化小于25％(如少于20％，少于15％，少于10％，少于5％)和/或整个反应时间内混合液的温度变化小于15℃(如小于10℃，小于5℃，小于2℃，或小于1℃)。
可以用本领域熟知的方法进行扩增的检测，例如实时检测。在一些实施例中，用一种或多种可检测的标记物标记一种或多种引物或探针(如分子信标探针)。典型可检测的标记物包括酶、酶底物，辅酶，酶抑制剂，荧光标记，猝灭剂，发光团，磁粉或玻璃珠，氧化还原敏感的基团(电化学活性基团)，冷光标记，放射性同位素(包括放射性核苷酸)，和结合对成员。更多特异实例包括荧光，藻蛋白，四乙基罗丹明和β-半乳糖胺酶。结合对成员可以包括生物素/抗生物素蛋白，生物素/抗生蛋白链菌素，抗原/抗体，配体/受体，和这些结合对的衍生物和突变体。这里应该注明荧光猝灭剂被认为是可检测标记。例如荧光猝灭剂可以与荧光染料接触，猝灭的数量是可被检测到的。
磁性珠子以及使用方法
本发明所说的珠子是指具有一定直径的，具有一定体积的珠子。在一些方式中，这些珠子是金属珠子，例如铁、铜、钢、镍珠等金属离子。在另外一些方式中，珠子也可以非金属的珠子。在一些方式中，珠子可以是磁性的珠子，所谓磁性的珠子一般是指能够在磁场下可以对珠子产生运动影响，例如可以被磁化的珠子。在一些方式中，珠子本身带有磁性，在磁场下可以对该带有磁性的珠子产生影响。在一些方式中，所谓的影响就是在磁场的作用下对珠子能够运动。在一些方式中，所述的磁性珠子可以与核酸反应的试剂进行混合，所谓的核酸反应试剂为等温扩增的试剂。在一些方式中，等温扩增的试剂包括PRA或者RAA扩增所必须要的试剂。
在一些方式中，可以先让磁珠与等温扩增的试剂进行预先混合，然后进行扩增，也可以是让磁珠与试剂混合，在扩增的时候，让磁珠留在扩增溶液里。这里的试剂一般是溶液试剂。当然，在制备或者准备扩增试剂的时候，可以预先把磁珠与试剂混合，然后制备为干粉的试剂。当需要进行实际扩增的时候，再把需要扩增的试剂制备成液体从而进行扩增。
在一些方式中，这里的磁珠的直径为1.5mm左右，可以是0.1毫米，0.2毫米，0.5毫米，0.6毫米，0.7毫米，0.8毫米，0.9毫米，1毫米，1.2毫米，1.3毫米，1.4毫米，1.5毫米，1.6毫米，1.7毫米，1.8毫米。
在一些方式中，扩增试剂是溶液的时候，磁珠可以是一个或者几个，磁珠的体积与溶液的体积比例可以是1:2.5；1:1；1:2.8；1：3.0，1:3.2；1:0.8；1:4.0等等任何比例都可以的。
在一些方式中，对于磁性珠子进行预先的处理，去掉珠子表面的杂质或者油污等，这些物质可能会对核酸的扩增造成干扰。在一些方式中，所述的磁珠为钢珠，直径为1.5mm。
在一些方式中，在进行核酸扩增前或者扩增中，让磁珠与核酸扩增的溶液试剂预先混合然后再进行扩增，预先混合的时间可以是5秒，10秒，15秒，20秒，25秒，30秒，35秒。在一些方式中，在混合的同时可以让磁珠在溶液里进行运动，运动的目的就是让溶液混合更加均匀。这可能是由于核酸扩增试剂里含有影扩增反应的干扰物质。处理的方法可以包括清洗、去污、烘干、消毒、灭菌等等方法。
在一些方式中，磁珠的运动或者让磁珠与扩增试剂的预先处理是在等温扩增检测仪中完成，该设备或者仪器具有加温保持稳定恒定，同时具有荧光读取的功能。当然可以理解，磁场的产生、温度的控制和荧光读取的功能可以是独立存在的，也可以结合在一起的，例如同时具有磁场的产生、温度的控制和荧光读取的功能。例如，实时荧光等温扩增检测仪能够针对等温扩增试剂，实现快速核酸扩增；同时，实现扩增反应过程中，实时荧光信号采集与处理，并给出阴/阳性检测结果的判读。同时对多个反应试管进行高精度控温加热，并通过优化设计来确保各个孔位间的温度均匀性。也可以借助特定波长的高亮度LED对反应试管内部的荧光染料进行荧光激发，同时，采用高灵敏度光电二极管(PD)来接收发射的荧光信号；尤其是，可以通过优化的空间光路设计获取了最佳的荧光检测性能，确保了仪器的检测灵敏度。另外，可以通过运动磁铁提供的周期性变化强磁场来操控反应试管内部的磁珠，借助磁珠在反应试剂内的周期性上下运动，达到强化反应试剂内部混合，提高反应效率的目的。
采用磁珠提高了检测的灵敏度的机理目前还不知道，但是可能是反应试剂比较粘稠,而且我们发现在反应结束后还会出现微小的气泡。增加磁性珠子或者颗粒，可以有效改善这些现象，从而最终增加了等温扩增的灵敏度。
样品或者样本
用本发明的检测装置可以检测的样品包括生物液体(例如病例液体或者临床样品)。液体样品或者流体样品可以来源于固态或者半固态的样品，包括排泄物，生物组织和食品样品。利用任何适当的方法可以将固态或半固态的样品转化成液体样品，例如混合、捣碎、浸软、孵育、溶解或在合适的溶液中(例如水，磷酸盐溶液或其他缓冲溶液)利用酶解作用消化固体样品。“生物样品”包括来源于动物，植物和食品样品，例如包括来源于人或动物的尿液，唾液，血及其成分，脊髓液、阴道分泌物，精子，粪便，汗液，分泌物，组织，器官，瘤，组织和器官的培养物，细胞培养物和介质。优选生物样品是尿。食品样品包括食品加工的物质，最终产品，肉，干酪，酒，牛奶和引用水。植物样品包括源于任何植物，植物组织，植物细胞培养物和介质。“环境样品”来源于环境(例如，来自于湖或者其他水体的液体样品，污水样品，土质样品，地下水，海水和废液样品)。环境样品还可包括污水或者其他废水。
被分析物质
这里所说的被分析物质是指样品中的核酸物质。这里的核酸可以是病毒、细菌、组织等任何生命物质中的核酸物质。这里的核酸可以是DNA、RNA等物质。
基因组由DNA组成并且可用于本发明的扩增分析的微生物的实例是(但不限于)曲霉属，黄曲霉，烟曲霉，构巢曲霉，念珠菌，念珠菌，新型隐球菌，格鲁氏隐球菌，隐球菌，疱疹病毒，乙型肝炎病毒，单纯疱疹病毒1-2，人巨细胞病毒，人巨细胞病毒，人巨细胞病毒，人巨细胞病毒，肺炎支原体，人疱疹病毒，JC病毒，乳头瘤病毒1-82，细小病毒B，假痘病毒，SV40病毒，牛痘病毒，水痘带状疱疹病毒和天花病毒。一些微生物可能经历了基因组进化，其导致对一些治疗处理产生抗性，这些处理对其野生型对应物有效。在这种情况下，通常需要多种测定来检测传染性微生物，那些微生物的亚型和特定的抗性菌株，为治疗导向提供诊断信息。能够同时检测传染性微生物、亚型和抗性菌株的方法将改进诊断所需的时间和成本。
基因组由RNA组成且在PCR之前需要逆转录酶将其RNA转化为cDNA的病毒包括但不限于星状病毒，布尼亚瓦病毒，加利福尼亚脑炎病毒，路易斯脑炎病毒，西尼罗病毒，日本脑炎病毒，东方马脑炎病毒，西部马脑炎病毒，委内瑞拉马脑炎病毒，墨累谷脑炎病毒，基孔肯雅病毒，蜱热病毒，出血热病毒，柯萨奇病毒A1-24，柯萨基病毒B1-6，登革热病毒1-4，杜文海格(Duvenhage)病毒，东部马脑炎病毒，埃博拉病毒，回声病毒1-24，肠道病毒1-71，肠道冠状病毒，汉坦病毒，甲型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，E病毒，人免疫缺陷病毒(HIV)1和2，呼吸道冠状病毒，轮状病毒，T-淋巴细胞病毒，流感病毒A，流感病毒B，胡宁(Junin)病毒，拉沙热病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，诺沃克病毒，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒，副流感病毒1-4，脊髓灰质炎病毒1-3，狂犬病病毒，呼吸道合胞病毒，鼻病毒1-113，罗西欧(Rocio)病毒，风疹病毒，水疱性口炎病毒，黄热病毒，寨卡病毒。
本发明的实施例可用于检测或筛查多种疾病或病理状况，例如癌症。可以通过本发明的方法和组分评估的癌症包括癌细胞，其包括来自膀胱，血液，骨，骨髓，脑，乳腺，结肠，食管，胃肠，牙龈，头，肾，肺，鼻咽，颈，卵巢，胰腺，前列腺，皮肤，胃，睾丸，舌或子宫的细胞和癌细胞。
此外，已明确癌症具有以下组织学类型，尽管它不限于这些：肿瘤，恶性；癌；癌，未分化；巨细胞和纺锤体细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤胆管癌；肝细胞癌；联合肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤息肉腺癌；腺癌，家族性结肠息肉；实体癌；类癌；恶性肿瘤；分支-肺泡腺癌；乳头状腺癌；色素癌；嗜酸性细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡腺癌；乳头状和滤泡腺癌；非包膜性硬化癌；肾上腺皮质癌子宫内膜癌；皮肤附属癌；顶分泌腺癌；皮脂腺癌；宫颈腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特病，乳腺；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌/鳞状上皮化生；胸腺瘤卵巢基质瘤，恶性；恶性肿瘤；颗粒细胞瘤，恶性；成胶质细胞瘤；塞尔托利氏(sertoli)细胞癌；淋巴细胞肿瘤脂质细胞肿瘤，恶性；副神经节瘤乳腺外神经胶质瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；肾小球系膜恶性黑素瘤；无色性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨型黑色素瘤上皮样细胞黑素瘤；蓝痣肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤横纹肌肉瘤；胚胎横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤混合性肿瘤；宫颈内膜(mullerian)混合肿瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤间质瘤布伦纳肿瘤叶状肿瘤滑膜肉瘤间皮瘤无性系胚胎性癌；畸胎瘤卵巢癌绒毛膜癌；中肾型血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西氏肉瘤；血管外皮细胞瘤淋巴管肉瘤骨肉瘤；近端骨肉瘤；软骨肉瘤软骨母细胞瘤间质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞性耳科肉瘤；成神经管细胞瘤成釉细胞纤维肉瘤；松果体脊索瘤神经胶质瘤室管膜瘤星形细胞瘤原发性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；成星细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；少突胶质细胞瘤；原始神经外胚层小脑肉瘤神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤神经纤维肉瘤；神经鞘瘤颗粒细胞肿瘤，恶性；恶性淋巴瘤霍奇金病；霍奇金淋巴瘤；副神经管恶性淋巴瘤，小淋巴细胞；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡；蕈样真菌病；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增多；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴样白血病；浆细胞白血病；红白血病淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓性白血病；嗜碱性白血病；嗜酸性白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；骨髓肉瘤；和毛细胞白血病。此外，RNA水平的基因突变和改变被评估为癌前潜伏期，例如转化，异常结构和增生。
有益效果：1、本发明应用于磁性钢珠来增加RAA恒温扩增的灵敏度，相比于目前RAA检测常用的方案来说，能够提高RAA恒温扩增灵敏度为10-100倍；2、本发明所涉及到的磁性钢珠增强RAA恒温扩增灵敏度的方法，该方法所用的磁性钢珠，价格便宜，可获性强，易于长期室温保存，使用方便；3、本发明对RAA恒温扩增的灵敏度提高显著，使得针对RAA恒温扩增的应用更具有效率和目的性，对公共卫生防疫、临床诊断、疾病相关基因分析等有重大理论意义和应用价值。
附图说明
图1为带磁性的珠子的筛选实验图。
图2为磁性钢珠直径对比实验图。
图3和图4为磁性钢珠预混时间的实验图。
图5和图6为加磁性钢珠和不加磁性钢珠灵敏度对比图，其中图5为含有钢珠，图6为不含有钢珠的实验结果图。
具体实施方法
以下通过具体实施例对本发明进一步说明，但并不局限于此。本发明的保护范围以权利要求的范围为准。
实施例子1：试剂和样品的准备和反应条件的设置
1.模板、引物及探针
模板的制备：采用非洲猪瘟VP72基因克隆的质粒(通过购买获得)。所提取的模板DNA浓度经Nanodrop测定并换算为2.54x1010copies/μl。用无菌去离子水稀释到1000拷贝(copies)/μl，100拷贝(copies)/μl、10拷贝(copies)/μl、1拷贝(copy)/μl，用作本实验的反应模板。应用下述的引物来扩增非洲猪瘟VP72基因。
VP72-RAA-F:GCCGAAGGGAATGGATACTGAGGGAATAGCAA(SEQ ID No：1)
VP72-RAA-R:TCCCGAGAACTCTCACAATATCCAAACAGCAG(SEQ ID No：2)
VP72-RAA-P:GAACATTACGTCTTATGTCCAGATACGT[FAM-dT]G[THF]G[BHQ-dT]CCGTGATAGGAGTGA(SEQ ID No：3)。
阴性独照为：无菌去离子水。以上引物和阳性样本以及阴性对照都在PCR荧光反应条件下进行过验证，表示都能正常检测出，说明引物是可以使用的。具体验证过程略。
2.试剂
PEG和MgAC购买于Sigma公司并自己配置。
1)试剂配方如下:
RAA反应体系组分 体积(μL)
RAA试剂干粉 提前配置并冻干粉末于反应试管中
ABuffer 12.5μL
B Buffer 2.5μL
引物混合液 4μL
特异性荧光探针 0.6μL
DNA模板 2μL
ddH<sub>2</sub>O 28.4μL
总体积 50μL
A Buffer为20％PEG，用无菌超纯水配制，pH自然，没有刻意调节；
B Buffer为280mM MgAc用无菌超纯水配制，pH自然；
RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)，30ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶，100mmol/LTricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。
3.RAA反应体系的配置：每个检测样品包括阴性对照对应一个RAA反应干粉管，每个RAA反应干粉管中各反应组分和所加入的体积如表1所示。
4.反应条件
恒温荧光检测仪：Genchek-2(杭州众测生物科技有限公司)
反应条件为：37℃，
反应时间：20min；
实施例2：磁性珠子的预处理方法
刚购买回来的钢珠、铁珠、镍珠或者塑料珠等生产过程都会有油脂或者其他的杂质出现，需要进行预处理，具体流程如下：
1)珠子放入塑料瓶内，圆珠子和塑料瓶体积比1:3；
2)加入清水，盖上瓶盖，震荡塑料瓶5分钟，反复清洗3次；
3)加入去离子水重复2步骤1-2次，直至洗完后的废水无漂浮物。
4)加上去离子水，放入超声波仪器内清洗1h，超声波功率设置为高档，温度设为50℃-60℃之间；
5)取出圆珠放入塑料瓶内，高压灭菌，121℃，25min；
6)灭菌后的钢珠放入烘箱进行烘干，备用；
实施例3：不同磁性珠子的筛选比较
以非洲猪瘟病毒100拷贝(copies)/μl为阳性样本，去离子水为阴性对照，来考察不同性质的磁性珠子对检测灵敏度的影响。
具体RAA试剂和反应条件相同，按照上面所介绍的试剂配置(实施方式1)，如表1所述的成分配置，仅仅在阳性的样本里磁珠不同而已，磁珠如下几个分类：磁性铁珠、磁性钢珠、磁性镍珠，塑料磁珠，分别购买自：明亮钢珠厂、明亮钢珠厂、南宫市铸宇合金材料有限公司和Thermo fisher，颗粒直径为1.5mm。
首先按照实施例子2处理这些磁珠，然后向RAA干粉的8联排管分别加入1颗珠子，然后采用表1的试剂配置成反应溶液进行反应，在反应前让磁珠在溶液中来回运动或者震动20秒，然后进行正式的扩增反应。
由图1结果可见，带磁性的钢珠的扩增曲线最为典型，有明显的指数期和平台期，有较高荧光强度(纵坐标值)，且CT值较小(曲线与阈值线的交叉点所对应的横坐标)。磁性钢珠与钨钢珠相比，出峰时间没有差异，但是荧光值出现一定的差距,荧光强度相对较弱。其它带磁性的珠子，例如铁珠和塑料磁珠曲线上升高度较低，CT值较大，平台期不明显。在我们初期的试验中，有些珠子没有出现扩增，出现漏检，例如：钴珠等。
说明带磁性的钢珠使RAA恒温扩增产物的复制速度更快、数量更多，扩增反应效率更高，具有更好的利用价值。
不同磁性珠子的CT值如下表:
磁性珠子 CT值 荧光值
磁性铁珠 7.45 1200
磁性钢珠 3.61 5900
磁性镍珠 3.62 4500
塑料磁珠 5.68 4200
实时例4：磁性钢珠直径大小的筛选
以非洲猪瘟病毒100拷贝(copies)/μl为阳性样本，去离子水为阴性对照。具体反应试剂和反应条件与实施例子1和2描述的相同，仅仅不一样的是磁性钢珠的大小直径为1mm、1.5mm、2mm。
从图2结果可见，同样模板浓度的情况下，磁性钢珠直径为1.5mm的情况下，RAA的扩增曲线最为典型，有明显的指数期和平台期，有较高荧光强度(纵坐标值)，且CT值较小，为3.12(曲线与阈值线的交叉点所对应的横坐标)。磁性钢珠为1mm和2mm的情况下，出峰时间没有差异，但相比于1.5mm的钢珠来说，出峰时间较晚，所以选择1.5mm直径的磁性钢珠作为后续的研究。有可也说明，直径的大小有影响。
实例5：磁性钢珠的预混时间优化
本发明所述的磁性钢珠混合的时间可以为10s、20s、30s，最优的混合时间20s(混合时间是指：配置好样品后，加入磁性珠子进行混合的时间，混合的时间一旦满足，就开始启动真正的RAA扩增反应)。这里的磁性钢珠的直径为1.5mm。，其它条件与实施例子4相同，仅仅是混合接触的时间长短不同。
从图3和图4可见，在模板浓度为100copies/μl、10copies/μl、1copy/μl的情况下，在100和10拷贝的情况下，混匀时间20s和30s对RAA的扩增的稳定性影响并无显著性差异。但是在1拷贝的情况下，混匀30s的RAA扩增的出峰时间明显晚于20s混匀时间，而且荧光值偏低，影响检出灵敏度，对于1拷贝的样品来讲，混合30s开始反应，不能有效检测出1拷贝的样品，虽然可以检测出10和100拷贝的样品(图3)，实际上1拷贝的检测结果和阴性结果相当，造成低浓度的样品的漏检。所以选择预先混合的时间为20s时间最好，可以检测出1拷贝的样品，提高了灵敏度(见图4)，能够有效区分阴性样品和低浓度为1拷贝的样品，显著提高了检测的灵敏度。
实施例6：加磁珠和未加磁珠RAA检测灵敏度的对比
选用直径为1.5mm的磁性钢珠，每个RAA干粉反应管加入量为1颗，具体RAA试剂和反应条件与上述相同，按照上面所列列举的试剂配置，如表1所述的成分配置。
从图5和图6可见，在模板浓度为100copies/μl、10copies/μl、1copy/μl的情况下，加钢珠的情况下，RAA恒温荧光扩增的灵敏度能够达到单拷贝(1copy/μl)，且有正常的“S”型曲线和较高的荧光值。
相反，没有添加磁性钢珠的RAA恒温扩增灵敏度为10copies/μl且出峰时间较晚相比于加了磁性钢珠的扩增，不能检测出单拷贝的样品。所以，加磁性钢珠能够使RAA恒温扩增的灵敏度提高10倍。
在缺少本文中所具体公开的任何元件、限制的情况下，可以实现本文所示和所述的发明。所采用的术语和表达法被用作说明的术语而非限制，并且不希望在这些术语和表达法的使用中排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物，而且应该认识到各种改型在本发明的范围内都是可行的。因此应该理解，尽管通过各种实施例和可选的特征具体公开了本发明，但是本文所述的概念的修改和变型可以被本领域普通技术人员所采用，并且认为这些修改和变型落入所附权利要求书限定的本发明的范围之内。
本文中所述或记载的文章、专利、专利申请以及所有其他文献和以电子方式可得的信息的内容在某种程度上全文包括在此以作参考，就如同每个单独的出版物被具体和单独指出以作参考一样。申请人保留把来自任何这种文章、专利、专利申请或其他文献的任何及所有材料和信息结合入本申请中的权利。
序列表
<110> 杭州众测生物科技有限公司
<120> 增强恒温扩增核酸灵敏度的方法及其试剂
<130> 19-100070-00012729
<140> 2019104146147
<141> 2019-05-17
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccgaaggga atggatactg agggaatagc aa 32
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcccgagaac tctcacaata tccaaacagc ag 32
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaacattacg tcttatgtcc agatacgtgg ccgtgatagg agtga 45

Claims (20)

1.一种恒温扩增样本中核酸的方法，包括：让核酸扩增的必须的试剂，其中，在扩增试剂中添加磁性珠子，其中，珠子的直径为0.5毫米-3毫米。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的磁珠珠子选自特氟龙、聚乙烯、聚丙烯、铁珠、钢珠、钨钢珠、镍珠中的一种。
3.根据权利要求1所述的方法，所述的珠子为磁性钢珠。
4.根据权利要求1所述的方法，所述的珠子的直径为1-1.5毫米。
5.根据权利要求3所述的方法，所述的珠子的直径为1.5毫米。
6.根据权利要求1所述的方法，在进行核酸扩增前，让磁珠与所述的扩增试剂为溶液状态，让核酸试剂溶液混合5-40秒时间。
7.根据权利要求1所述的方法，混合的时间为20-30秒。
8.根据权利要求1所述的方法，当磁珠为钢珠的时候，混合时间为20秒。
9.根据权利要求8所述的方法，所述的核酸为猪瘟病毒核酸。
10.根据权利要求1所述的方法，在让珠子与核酸扩增试剂接触前，对所述的磁性钢珠要经过漂洗、灭菌、超声、烘干等工艺处理。
11.根据权利要求1所述的方法，所述的核酸扩增方法包括RAA和/或者RPA方法。
12.根据权利要求1所述的方法，所述的核酸为非洲猪瘟的核酸。
13.根据权利要求6所述的方法，让磁珠和扩增试剂溶液的体积比为1:1-1:3。
14.一种RAA扩增样品中核酸的试剂，其中，该试剂包括核酸扩增必须的试剂，其中，所述的试剂中还包括磁珠。
15.根据权利要求14所述的试剂，所述的磁珠珠子选自特氟龙、聚乙烯、聚丙烯、铁珠、钢珠、钨钢珠、镍珠中的一种。
16.根据权利要求14所述的试剂，所述的珠子为磁性钢珠。
17.根据权利要求14所述的试剂，所述的珠子的直径为1-1.5毫米。
18.根据权利要求17所述的试剂，所述的珠子的直径为1.5毫米。
19.根据权利要求14所述的试剂，当扩增试剂为溶液的时候，磁珠和扩增试剂溶液的体积比为1:1-1:3。
20.根据权利要求14所述的试剂，所述的核酸扩增必须的试剂包括重组酶，单链结合蛋白，聚合酶。
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