JP2008206516A - 口腔内連鎖球菌数を測定する方法及びそれに用いるpcrプライマー及びプローブセット - Google Patents
口腔内連鎖球菌数を測定する方法及びそれに用いるpcrプライマー及びプローブセット Download PDFInfo
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Abstract
【課題】口腔内に存在する「連鎖球菌の菌数」に対する「ミュータンス連鎖球菌の菌数」の比率を短時間で算出することができるリアルタイムPCR法を提供する。
【解決手段】それぞれ特定の塩基配列における連続する少なくとも15塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせ、及び特定の塩基配列における連続する少なくとも10塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むプローブからなる、口腔内連鎖球菌の菌数測定用プライマー及びプローブセットを使用する口腔内連鎖球菌数を測定する方法。
【選択図】なし
【解決手段】それぞれ特定の塩基配列における連続する少なくとも15塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせ、及び特定の塩基配列における連続する少なくとも10塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むプローブからなる、口腔内連鎖球菌の菌数測定用プライマー及びプローブセットを使用する口腔内連鎖球菌数を測定する方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、リアルタイムPCR法により口腔内に存在する口腔内連鎖球菌数を測定する方法及びそれに用いるPCRプライマー及びプローブセットに関する。
う蝕の発生は、ヒトの口腔内のミュータンス連鎖球菌の存在と密接な関連があることが知られている。ヒトの口腔内に存在するミュータンス連鎖球菌の中では、主にストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)及びストレプトコッカス・ソブリヌス(Streptococcus sobrinus)がう蝕における原因菌であると考えられている。
しかしながら、最近、う蝕発生のリスクは、口腔内のミュータンス連鎖球菌の存在だけでなく、口腔内に存在する「総連鎖球菌の菌数」に対する「ミュータンス連鎖球菌の菌数」の比率が重要であることがわかってきた。すなわち、「総連鎖球菌の菌数」に対する「ミュータンス連鎖球菌の菌数」の比率が高いと、う蝕になり易いことが報告されている(非特許文献1、非特許文献2、及び非特許文献3)。この比率を算出するためには、ミュータンス連鎖球菌を含む「総連鎖球菌の菌数」と、「ミュータンス連鎖球菌の菌数」とを正確に把握することが重要である。従来、この「ミュータンス連鎖球菌の菌数」及びミュータンス連鎖球菌を含む「総連鎖球菌の菌数」を測定するためには、口腔内の菌を培養することによって測定していた。しかしながら、連鎖球菌の培養及び測定には時間が掛かるため、数日間が必要であった。
「ミュータンス連鎖球菌の菌数」及び「総連鎖球菌の菌数」のうち、ミュータンス連鎖球菌であるストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)及びストレプトコッカス・ソブリヌス(Streptococcus sobrinus)の測定に関しては、それぞれの菌に特異的なプライマー及びプローブを設計し、リアルタイムPCR法により、唾液や歯垢から短時間に菌数を測定する方法が開発されている(非特許文献4)。
一方、う蝕発症に関連しない連鎖球菌であるストレプトコッカス・サリバリウス(Streptococcus salivarius)、ストレプトコッカス・サンギウス(Streptococcus sanguis)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、及びストレプトコッカス・ゴルドニス(Streptococcus gordonii)並びにミュータンス連鎖球菌を含む「総連鎖球菌の菌数」の測定に関しては、口腔内に存在するすべての連鎖球菌を測定することのできるリアルタイムPCR法は開発されていないため、時間の掛かる培養法が用いられている。そのため、口腔内に存在する「総連鎖球菌の菌数」に対する「ミュータンス連鎖球菌の菌数」の比率を算出するためには、数日間が必要であった。
従って、口腔内に存在する「総連鎖球菌の菌数」を培養法により測定し、これに対する「ミュータンス連鎖球菌の菌数」の比率を算出してう蝕リスクを検査する方法は、日数を要し効率が悪いため、臨床検査センター等で多数検体について、う蝕発生のリスクの検査を行う場合には適していなかった。
「初期う蝕のマネージメント」クインテッセンス出版株式会社、2004年8月10日、p.29−31、及びp.124−125
「アーカイブス・オブ・オーラル・バイオロジー(Archives of Oral Biology)」(英国)1996年、第41巻、p.167−73
「日本細菌学会誌」2001年、第56巻、p.334
「ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー(Journal of Clinical Microbiology)」(米国)2003年、第41巻、p.4438−41
本発明者等は、口腔内に存在する「総連鎖球菌の菌数」に対する「ミュータンス連鎖球菌の菌数」の比率を短時間で算出することができるように、口腔内連鎖球菌数を正確にリアルタイムPCR法で測定する方法について、鋭意研究した結果、原核生物リボソームの30Sサブユニットに含まれるRNAである16SリボソームRNA遺伝子の配列に着目し、連鎖球菌に共通して存在する配列を検討することにより、リアルタイムPCR法に使用可能なプライマー、並びにプライマー及びプローブを設計した。そのプライマー、並びにプライマー及びプローブを用いリアルタイムPCR法の検討を行い、培養法で測定した口腔内の連鎖球菌数を正確に反映することのできる特定のプライマー及びプローブを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、配列番号1で表される塩基配列における連続する少なくとも15塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含む少なくとも1種のフォワードプライマーと、配列番号2で表される塩基配列における連続する少なくとも15塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含む少なくとも1種のリバースプライマーとの組み合わせ、からなる口腔内連鎖球菌の菌数測定用プライマーセットに関する。
本発明によるプライマーセットの好ましい態様においては、前記フォワードプライマーが、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、若しくは配列番号14で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又はそれらの2種以上のオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、若しくは配列番号26で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又はそれらの2種以上のオリゴヌクレオチドである。
また本発明は、前記プライマーセットと、配列番号3又は配列番号4で表される塩基配列における連続する少なくとも10塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含む少なくとも1種のプローブとからなる口腔内連鎖球菌の菌数測定用プライマー及びプローブセットにも関する。
本発明によるプライマー及びプローブセットの好ましい態様においては、前記プローブが、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、若しくは配列番号45で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又はそれらの2種以上のオリゴヌクレオチドである。
また、本発明は、前記プライマーセットを用いたリアルタイムPCR法により、口腔内連鎖球菌の菌数を測定する方法、又は前記プライマー及びプローブセットを用いたリアルタイムPCR法により、口腔内連鎖球菌の菌数を測定する方法にも関する。
更に、本発明は、前記プライマーセットを含む、口腔内連鎖球菌の菌数測定用リアルタイムPCRキット、又は前記プライマー及びプローブセットを含む、口腔内連鎖球菌の菌数測定用リアルタイムPCRキットにも関する。
なお、本明細書において、「測定」は「定量」を意味するが、定量することにより検出を行っており、本発明のプライマー及びプローブセット、並びに口腔内連鎖球菌の菌数を測定する方法が、定性的な検出に使用することを排除するものではない。
本発明によるプライマーセットの好ましい態様においては、前記フォワードプライマーが、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、若しくは配列番号14で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又はそれらの2種以上のオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、若しくは配列番号26で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又はそれらの2種以上のオリゴヌクレオチドである。
また本発明は、前記プライマーセットと、配列番号3又は配列番号4で表される塩基配列における連続する少なくとも10塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含む少なくとも1種のプローブとからなる口腔内連鎖球菌の菌数測定用プライマー及びプローブセットにも関する。
本発明によるプライマー及びプローブセットの好ましい態様においては、前記プローブが、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、若しくは配列番号45で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又はそれらの2種以上のオリゴヌクレオチドである。
また、本発明は、前記プライマーセットを用いたリアルタイムPCR法により、口腔内連鎖球菌の菌数を測定する方法、又は前記プライマー及びプローブセットを用いたリアルタイムPCR法により、口腔内連鎖球菌の菌数を測定する方法にも関する。
更に、本発明は、前記プライマーセットを含む、口腔内連鎖球菌の菌数測定用リアルタイムPCRキット、又は前記プライマー及びプローブセットを含む、口腔内連鎖球菌の菌数測定用リアルタイムPCRキットにも関する。
なお、本明細書において、「測定」は「定量」を意味するが、定量することにより検出を行っており、本発明のプライマー及びプローブセット、並びに口腔内連鎖球菌の菌数を測定する方法が、定性的な検出に使用することを排除するものではない。
本発明によれば、口腔内に存在する総連鎖球菌の菌数を正確に、且つ短時間に測定することが可能であり、本発明の方法により得られた口腔内連鎖球菌数から測定された総連鎖球菌の菌数からミュータンス連鎖球菌の菌数に対する比率を算出することにより、う蝕のリスクを効率良く検出することが可能である。また、本発明の方法により、培養法と比較して多数の検体を処理することができ、臨床検査センター等における効率的な測定が可能である。
本発明のプライマーセット並びにプライマー及びプローブセットは、口腔内連鎖球菌数を測定するために使用することができる。これらのプライマーセット並びにプライマー及びプローブセットの塩基配列は、連鎖球菌のリボソームの30Sサブユニットに含まれるRNAである16SリボソームRNA遺伝子の塩基配列に基づいたものである。
本明細書において、「口腔内連鎖球菌」とは、口腔内に存在するすべての種類の連鎖球菌を意味し、例えばストレプトコッカス・サリバリウス(Streptococcus salivarius)、ストレプトコッカス・サンギウス(Streptococcus sanguis)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、及びストレプトコッカス・ゴルドニス(Streptococcus gordonii)並びにミュータンス連鎖球菌であるストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)及びストレプトコッカス・ソブリヌス(Streptococcus sobrinus)を含む。また、本明細書において、口腔内に存在する「総連鎖球菌の菌数」は、口腔内に存在するであろうすべての種類の連鎖球菌の菌数を意味するものである。本発明の方法によって測定される「口腔内連鎖球菌数」は、口腔内から採取した検体中のすべての種類の連鎖球菌の数を意味するものであり、本発明の方法によって得られた検体中の口腔内連鎖球菌数から口腔内の総連鎖球菌の菌の総数を推定することも可能である。
本発明者等は、ストレプトコッカス・サリバリウス(Streptococcus salivarius)、ストレプトコッカス・サンギウス(Streptococcus sanguis)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、及びストレプトコッカス・ゴルドニス(Streptococcus gordonii)並びにミュータンス連鎖球菌であるストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)及びストレプトコッカス・ソブリヌス(Streptococcus sobrinus)の16SリボソームRNA遺伝子の塩基配列において、同一の塩基配列からなるヌクレオチドの領域を選択し、プライマー及びプローブを作成した。しかしながら、単純にすべての連鎖球菌において同一の塩基配列のプライマー及びプローブを選択するのみでは、培養法と正確に相関する結果は得られなかった。そのため、本発明者等は、特定の塩基配列からなるヌクレオチドの領域を選択し、プライマー並びにプライマー及びプローブを設計することによって、培養法で測定した口腔内の連鎖球菌数を正確に把握することのできる測定方法を確立した。
本明細書において、「口腔内連鎖球菌」とは、口腔内に存在するすべての種類の連鎖球菌を意味し、例えばストレプトコッカス・サリバリウス(Streptococcus salivarius)、ストレプトコッカス・サンギウス(Streptococcus sanguis)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、及びストレプトコッカス・ゴルドニス(Streptococcus gordonii)並びにミュータンス連鎖球菌であるストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)及びストレプトコッカス・ソブリヌス(Streptococcus sobrinus)を含む。また、本明細書において、口腔内に存在する「総連鎖球菌の菌数」は、口腔内に存在するであろうすべての種類の連鎖球菌の菌数を意味するものである。本発明の方法によって測定される「口腔内連鎖球菌数」は、口腔内から採取した検体中のすべての種類の連鎖球菌の数を意味するものであり、本発明の方法によって得られた検体中の口腔内連鎖球菌数から口腔内の総連鎖球菌の菌の総数を推定することも可能である。
本発明者等は、ストレプトコッカス・サリバリウス(Streptococcus salivarius)、ストレプトコッカス・サンギウス(Streptococcus sanguis)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、及びストレプトコッカス・ゴルドニス(Streptococcus gordonii)並びにミュータンス連鎖球菌であるストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)及びストレプトコッカス・ソブリヌス(Streptococcus sobrinus)の16SリボソームRNA遺伝子の塩基配列において、同一の塩基配列からなるヌクレオチドの領域を選択し、プライマー及びプローブを作成した。しかしながら、単純にすべての連鎖球菌において同一の塩基配列のプライマー及びプローブを選択するのみでは、培養法と正確に相関する結果は得られなかった。そのため、本発明者等は、特定の塩基配列からなるヌクレオチドの領域を選択し、プライマー並びにプライマー及びプローブを設計することによって、培養法で測定した口腔内の連鎖球菌数を正確に把握することのできる測定方法を確立した。
本発明のプライマーセットにおけるプライマーは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、及び配列番号4の塩基配列における連続する少なくとも15塩基の塩基配列からなるプライマーオリゴヌクレオチド部分(以下、それぞれ、プライマーオリゴヌクレオチド部分1、プライマーオリゴヌクレオチド部分2、プライマーオリゴヌクレオチド部分3、及びプライマーオリゴヌクレオチド部分4と称する)を含むプライマーである。それぞれのプライマーオリゴヌクレオチド部分を含むプライマーを、領域1プライマー、領域2プライマー、領域3プライマー、及び領域4プライマーと称する。それぞれのプライマーオリゴヌクレオチド部分の長さは、好ましくは15mer以上、より好ましくは16mer以上、最も好ましくは18mer以上である。また、本発明のプライマー及びプローブセットにおけるプローブは、配列番号3、及び配列番号4の塩基配列における連続する少なくとも10塩基の塩基配列からなるプローブオリゴヌクレオチド部分(以下、それぞれ、プローブオリゴヌクレオチド部分3、及びプローブオリゴヌクレオチド部分4と称する)を含むプローブである。それぞれのプローブオリゴヌクレオチド部分を含むプローブを領域3プローブ及び領域4プローブと称する。それぞれのプライマーオリゴヌクレオチド部分の長さは、好ましくは10mer以上、より好ましくは12mer以上、最も好ましくは14mer以上である。以下に、配列番号1、配列番号2、配列番号3、及び配列番号4の塩基配列を示す。
領域1(配列番号1):5‘−GGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTAAG−3’
領域2(配列番号2):5‘−AATCCGGACAACGCTCGGGACCTACGTA−3’
領域3(配列番号3):5‘−TACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCA−3’
領域4(配列番号4):5‘−TGGCACGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTGGTA−3’
領域1(配列番号1):5‘−GGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTAAG−3’
領域2(配列番号2):5‘−AATCCGGACAACGCTCGGGACCTACGTA−3’
領域3(配列番号3):5‘−TACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCA−3’
領域4(配列番号4):5‘−TGGCACGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTGGTA−3’
配列番号46は、口腔内の存在する連鎖球菌の1つであるストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)の16SリボソームRNA遺伝子の二本鎖DNAのうち、一本鎖のDNAの塩基配列(GeneBank Accession No.AF077836)を示している。配列番号1で表される塩基配列は、配列番号46で表される塩基配列の412〜440番領域に相当し、配列番号2で表される塩基配列は、配列番号46で表される塩基配列530〜555番領域の相補鎖の塩基配列に相当する。また、配列番号3で表される塩基配列は、配列番号46で表される塩基配列の487〜516番領域に相当し、配列番号4で表される塩基配列は、配列番号46で表される塩基配列487〜516番領域の相補鎖の塩基配列に相当する。16SリボソームRNA遺伝子のヌクレオチドから、領域1プライマー、領域2プライマー、領域3プライマー、及び領域4プライマーを選択すること、及び領域3プローブ及び領域4プローブを選択することにより、口腔内の連鎖球菌数を正確に把握することのできる測定方法を確立することが可能である。
プライマーは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、又は配列番号4で表された塩基配列における連続する少なくとも15塩基、及びそれ以上の塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドでもよく、好ましくは、配列番号1及び配列番号2で表された塩基配列における連続する少なくとも15塩基、及びそれ以上の塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、最も好ましくは、配列番号1に示される塩基配列の2〜30番、又は配列番号2に示される塩基配列の3〜25番の塩基配列における連続する少なくとも15塩基、又はそれ以上の塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。具体的には、配列番号5〜14で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド又は配列番号15〜26で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。表1及び表2に配列番号5〜26のプライマーを示す。
しかしながら、口腔内連鎖球菌の菌数を正確に測定することが可能である限り、プライマーは前記のオリゴヌクレオチドに限定されるものではなく、配列番号1、配列番号2、配列番号3、又は配列番号4で表された塩基配列における連続する少なくとも15塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーでもよい。それらのオリゴヌクレオチドを含むプライマーの場合、前記配列番号1〜4で表された塩基配列以外に連鎖球菌の16SリボソームRNA遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチドを含んでもよく、その他の人工的な塩基配列からなるヌクレオチドを含んでもよい。例えば、オリゴヌクレオチドの5‘末端に1〜10のヌクレオチドを付加することができる。また、1〜数個の塩基の置換を有するオリゴヌクレオチド、又は10%以下程度のミスマッチがあるオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することもできる。
プライマーの長さは、特に限定する必要はないが、好ましくは、15mer〜35merであり、より好ましくは、20mer〜30merであり、最も好ましくは、22mer〜28merである。また、領域1プライマーの長さも、特に限定する必要はないが、好ましくは、15mer〜35merであり、より好ましくは、20mer〜29merであり、最も好ましくは、22mer〜25merである。領域2プライマーの長さも、特に限定する必要はないが、好ましくは、15mer〜35merであり、より好ましくは、16mer〜25merであり、最も好ましくは、16mer〜20merである。
本発明によるプライマーセットは、フォワードプライマー及びリバースプライマーの組み合わせからなる。プライマーセットにおけるフォワードプライマーは1種でも、2種以上の組み合わせでも使用することができる。また、リバースプライマーも、1種でも、2種以上の組み合わせでも使用することができる。本明細書においてフォワードプライマーは、配列番号46で表される塩基配列からなる1本鎖のヌクレオチドに対して、フォワード側のプライマーを意味し、リバースプライマーは、配列番号46で表される塩基配列からなる1本鎖のヌクレオチドに対して、リバース側のプライマーを意味する。具体的にはフォワードプライマーは領域1プライマー又は領域3プライマーであり、リバースプライマーは、領域2プライマー又は領域4プライマーである。プライマーセットの組み合わせは、フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせであれば、特に限定されず、領域1プライマー及び領域2プライマー、領域1プライマー及び領域4プライマー、並びに領域3プライマー及び領域2プライマーの組み合わせを挙げることができるが、好ましくは領域1プライマー及び領域2プライマーの組み合わせである。
本発明のプライマー及びプローブセットは、前記プライマーセット及びプローブからなり、特にはフォワードプライマーである領域1プライマー及びリバースプライマーである領域2プライマー並びにプローブからなる。プライマー及びプローブセットにおけるプローブは、1種でも、2種以上の組み合わせでも使用することができる。また、プライマー及びプローブセットにおけるフォワードプライマーも1種でも、2種以上の組み合わせでも使用することができ、リバースプライマーも、1種でも、2種以上の組み合わせでも使用することができる。プローブは、ゲノムDNAやcDNA等をハイブリダイズの原理を用いた方法で検出するためのオリゴヌクレオチドであるが、好ましくは、リアルタイムPCR法であるTaqMan法において用いるプローブである。従って、プローブは、配列番号46で表された塩基配列において、領域1プライマー及び領域2プライマーに挟まれた塩基配列の領域に設定することが可能であり、配列番号46の塩基配列からなるヌクレオチドにハイブリダイズするものでも、その相補鎖のヌクレオチドにハイブリダイズするものでもよく、それらの混合物でもよい。配列番号46の塩基配列からなるヌクレオチドにハイブリダイズするプローブとしては、好ましくは領域4プローブを挙げることができ、相補鎖のヌクレオチドにハイブリダイズするプローブとしては、好ましくは、領域3プローブを挙げることができる。
プローブは、配列番号3、又は配列番号4で表された塩基配列における連続する少なくとも10塩基、及びそれ以上の塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプローブが好ましく、より好ましくは、配列番号27〜45で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。
しかしながら、口腔内連鎖球菌の菌数を正確に測定することが可能である限り、プライマーはそれらに限定されるものではなく、1〜数個の塩基の置換を有するオリゴヌクレオチド、又は10%以下程度のミスマッチがあるオリゴヌクレオチドを使用することもできる。本明細書において「ハイブリダイズ」とは、通常のリアルタイムPCR条件下で用いる「ハイブリダイズする」と同じ意味である。
TaqMan法に用いられるプローブは、レポーター色素及びクエンチャー色素で標識されており、オリゴヌクレオチドの一端、例えば5’−末端にレポーター色素を結合させ、他端、例えば3’−末端にクエンチャー色素を結合させて標識したプローブを使用する。色素としては、PCR法において従来から使用されている色素を特に限定せずに用いることができ、レポーター色素としては、例えば、6−カルボキシ−フルオレッセイン(FAM)、テトラクロロ−6−カルボキシフルオレッセイン(TET)、2,7−ジメトキシ−4,5−ジクロロ−6−カルボキシフルオレッセイン(JOE)、ヘキソクロロ−6−カルボキシフルオレッセイン(HEX)等を挙げることができる。また、クエンチャー色素の例としては、6−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン(TAMRA)、蛍光を発しないブラックホールクエンチャー(BHQ)等を挙げることができる。
プローブの長さは、特に限定する必要はないが、好ましくは、12mer〜30merであり、より好ましくは、13mer〜29merであり、最も好ましくは、14mer〜18merである。
本発明の口腔内連鎖球菌の菌数を測定する方法には、ポリメレース重合反応(PCR)を用いるが、特には、リアルタイムPCR法である。リアルタイムPCR法には、前記のプライマーセットを用い、二本鎖DNAに結合することで蛍光を発する化合物であるインターカレーター、例えば、SYBR Green IをPCRの反応系に加えるインターカレーター法、並びにプライマーセットと5‘末端をレポーター色素で、3’末端をクエンチャー色素で修飾したプローブ(TaqManプローブ)とをPCRの反応系に加えるTaqMan法等がある。このようなリアルタイムPCR法自体は周知であり、そのためのキット及び装置も市販されているので、前記プライマーセット、又は前記領域1プライマー、前記領域2プライマー及び前記プローブを合成すれば、市販のキット及び装置を用いて容易に実施することができる。
本発明の口腔内連鎖球菌の菌数を測定する方法をインターカレーター法で行う場合には、領域1プライマー及び領域2プライマー、領域1プライマー及び領域4プライマー、又は領域3プライマー及び領域2プライマーの組み合わせのプライマーセットを用いることができるが、領域1プライマー及び領域2プライマーの組み合わせのプライマーセットを用いることが好ましい。また、TaqMan法で行う場合には、フォワードプライマーである領域1プライマー及びリバースプライマーである領域2プライマーからなるプライマーセット並びに領域4プローブ又は領域3プローブを用いることができる。いずれのリアルタイムPCR法も口腔内連鎖球菌の菌数を正確に測定することが可能であるが、TaqMan法が好ましい。TaqMan法は、2本のプライマーに加えて、プローブを用いるため、連鎖球菌の16SリボソームRNA遺伝子に対する特異性を上昇させることができるため、口腔内連鎖球菌の菌数をより正確に測定することが可能となるからである。
PCR法は従来から広く行われている方法が使用可能であり、詳細には下記の3段階から成るDNA合成反応を繰り返して行う。
(1)まず、鋳型となるDNA2本鎖を加熱して変性し、1本鎖にする。
(2)次に、増幅したい特定部位のDNA鎖の両端に相補的な2種類のプライマーを反応系に過剰に加えた状態で温度を下げ、プライマーがDNA鎖の相補的な部位と2本鎖を形成する。
(3)この状態でDNA合成基質のデオキシヌクレオシド三リン酸とDNAポリメラーゼを作用させると、ポリメラーゼはプライマー部位からDNA相補鎖を合成していく。
インターカレーター法は、この反応系にSYBR Green I等のインターカレーターを添加し、1サイクルごとに合成された二本鎖DNAに結合したインターカレーターの蛍光を測定する。TaqMan法は、反応系にTaqManプローブを添加し、分解されたプライマーから分離したレポーター色素が蛍光を発するため、その蛍光を1サイクルごとに測定する。
(1)まず、鋳型となるDNA2本鎖を加熱して変性し、1本鎖にする。
(2)次に、増幅したい特定部位のDNA鎖の両端に相補的な2種類のプライマーを反応系に過剰に加えた状態で温度を下げ、プライマーがDNA鎖の相補的な部位と2本鎖を形成する。
(3)この状態でDNA合成基質のデオキシヌクレオシド三リン酸とDNAポリメラーゼを作用させると、ポリメラーゼはプライマー部位からDNA相補鎖を合成していく。
インターカレーター法は、この反応系にSYBR Green I等のインターカレーターを添加し、1サイクルごとに合成された二本鎖DNAに結合したインターカレーターの蛍光を測定する。TaqMan法は、反応系にTaqManプローブを添加し、分解されたプライマーから分離したレポーター色素が蛍光を発するため、その蛍光を1サイクルごとに測定する。
TaqMan法は、前記のようにオリゴヌクレオチドの一端、例えば5’−末端にレポーター色素を結合させ、他端、例えば3’−末端にクエンチャー色素を結合させて標識したプローブを使用するが、レポーター色素は、例えば励起光の照射によって蛍光を発する化合物である。同一のオリゴヌクレオチドにレポーターとクエンチャーとが一緒に結合している場合、その距離が近いために、レポーターの吸収したエネルギーはエネルギー転移によりクエンチャーに吸収されてしまい、レポーターは励起されない。この結果、本来ならば生じるはずの蛍光が発生しないことになる(このことを蛍光の消光、クエンチングと言う)。クエンチングを起こしているプローブをPCR反応系に添加すると、アニーリングのステップで一本鎖の鋳型DNAの内部に結合する、Taqポリメラーゼは、プライマーの3’末端から新生鎖を合成していくが、その途中でプローブを分解する。こうしてニックトランスレーションが起こり、隣接していたレポーターとクエンチャーとが分解し、クエンチングの抑制を受けていたレポーターが蛍光を発するようになる。この反応はPCRの1サイクルにおいて1分子当たり1回起こるので、レポーターの蛍光強度の増加はPCR反応、すなわちPCR生成物量に概ね比例することになる。このようなレポーター及びクエンチャーを利用した測定法では、PCR後に反応成生物を分離することなく測定が行えるため、リアルタイムに測定が可能である。
本発明の方法で使用される被検試料としては、口腔内から採取した唾液や歯垢等が用いられ、測定に適した粘度に適宜調整して使用する。唾液は、被験者にパラフィン等を噛ませた後に採取することも可能である。歯垢は、例えば、探針又は爪楊枝を用いて採取することができる。
具体的には、本発明の口腔内連鎖球菌の菌数を測定する方法は、下記の工程を含む。
(1)被検試料からDNAを抽出する工程、
(2)抽出されたDNAを鋳型としてプライマーセット又はプライマー及びプローブセットを用いてDNAを増幅する工程、
(3)増幅されたDNAを検出する工程
を含む。
(1)被検試料からDNAを抽出する工程、
(2)抽出されたDNAを鋳型としてプライマーセット又はプライマー及びプローブセットを用いてDNAを増幅する工程、
(3)増幅されたDNAを検出する工程
を含む。
前記工程(1)の口腔内から採取した唾液や歯垢に含まれるDNAの抽出は、具体的には、市販のDNA抽出試薬キットを用い、添付のプロトコールに従って行うことができる。また、唾液や歯垢等を緩衝液又は界面活性剤等を含む溶菌液に混和し、80℃〜100℃で、1〜30分保持し、連鎖球菌を溶菌させ、そのまま又は遠心分離した上清を、DNA試料として用いることも可能である。
工程(2)におけるDNA増幅工程においては、TaqMan法の場合は、具体的には以下の反応が起こる。
(a)検体中に、連鎖球菌が存在すると、連鎖球菌のDNAを鋳型として指数関数的に増幅が起きる。
(b)増幅が起きる過程で、プローブが鋳型DNAにハイブリダイズする。プライマーがハイブリダイズした鎖が鋳型となってその相補鎖がDNAポリメラーゼにより形成される際、プローブは、DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により分解される。
(c)このためプローブに結合しているレポーター色素とクエンチャー色素が離れ離れになり、レポーター色素が検出されるようになる。すなわち、検体中に連鎖球菌が存在すればレポーター色素が検出され蛍光を発するようになる。
(d)蛍光強度は、サイクル数に依存して指数関数的に増大する。
(e)既知の菌濃度の標準試料を種々用意しておいて、各々の菌濃度について発光強度が急激に大きくなるサイクル数であるthreshold cycle値(以下、Ct値と称する)を調べて、菌濃度の対数を横軸、Ct値を縦軸に取ると、ほぼ直線状の検量線が描かれる。
(f)未知の菌濃度の試料についてもCt値を調べ、(e)で作成した検量線に当てはめれば、未知の菌濃度の試料について菌濃度を知ることができる。
工程(3)の増幅されたDNAを検出する工程では、蛍光強度をPCRのサイクル毎に測定する。これによってPCR産物の増加をリアルタイムに測定することが可能である。
工程(2)におけるDNA増幅工程においては、TaqMan法の場合は、具体的には以下の反応が起こる。
(a)検体中に、連鎖球菌が存在すると、連鎖球菌のDNAを鋳型として指数関数的に増幅が起きる。
(b)増幅が起きる過程で、プローブが鋳型DNAにハイブリダイズする。プライマーがハイブリダイズした鎖が鋳型となってその相補鎖がDNAポリメラーゼにより形成される際、プローブは、DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により分解される。
(c)このためプローブに結合しているレポーター色素とクエンチャー色素が離れ離れになり、レポーター色素が検出されるようになる。すなわち、検体中に連鎖球菌が存在すればレポーター色素が検出され蛍光を発するようになる。
(d)蛍光強度は、サイクル数に依存して指数関数的に増大する。
(e)既知の菌濃度の標準試料を種々用意しておいて、各々の菌濃度について発光強度が急激に大きくなるサイクル数であるthreshold cycle値(以下、Ct値と称する)を調べて、菌濃度の対数を横軸、Ct値を縦軸に取ると、ほぼ直線状の検量線が描かれる。
(f)未知の菌濃度の試料についてもCt値を調べ、(e)で作成した検量線に当てはめれば、未知の菌濃度の試料について菌濃度を知ることができる。
工程(3)の増幅されたDNAを検出する工程では、蛍光強度をPCRのサイクル毎に測定する。これによってPCR産物の増加をリアルタイムに測定することが可能である。
本発明のキットは、本発明の口腔内連鎖球菌の菌数を測定する方法に用いることのできるキットであり、少なくとも前記フォワードプライマー及びリバースプライマーを含むことを特徴とする。より好ましくは、領域1プライマー及び領域2プライマーからなるプライマーセット、並びに領域3プローブ又は領域4プローブを含む。
本発明のキットにおいてフォワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブは、混合物として含まれてもよく、個別の試薬として含まれてもよい。また、本発明のキットは、プライマー及びプローブの他に、リアルタイムPCR法を行うのに必要な試薬又は酵素を更に含むこともできる。
口腔内に存在する総連鎖球菌の菌数に対するミュータンス連鎖球菌の菌数の比率を算出することにより、う蝕発生の危険度を予測することができる。口腔内に存在する総連鎖球菌の菌数及びミュータンス連鎖球菌の菌数は、口腔内から採取した被検試料を培養することにより、測定することができる。また、口腔内に存在する総連鎖球菌の菌数及びミュータンス連鎖球菌の菌数は、リアルタイムPCR法を用いて推定することもできる。リアルタイムPCR法により得られる口腔内連鎖球菌の菌数及びミュータンス連鎖球菌の菌数は、培養方法により得られた結果と相関することが好ましい。
口腔内のミュータンス連鎖球菌の菌数は、例えば、後述の比較例4に記載のリアルタイムPCR法で測定することができる。また、口腔内連鎖球菌の菌数は、本発明のプライマー及びプローブセットを用いたリアルタイムPCR法により測定することができる。リアルタイムPCR法により得られた口腔内連鎖球菌の菌数及びミュータンス連鎖球菌の菌数を用いて、比率を算出することが可能であり、う蝕発生の危険度を予測することができる。
すなわち、口腔内から採取した1つの試料中の口腔内連鎖球菌の菌数及びミュータンス連鎖球菌の菌数を測定し、口腔内に存在する総連鎖球菌の菌数に対するミュータンス連鎖球菌の菌数の比率を算出する。
口腔内のミュータンス連鎖球菌の菌数は、例えば、後述の比較例4に記載のリアルタイムPCR法で測定することができる。また、口腔内連鎖球菌の菌数は、本発明のプライマー及びプローブセットを用いたリアルタイムPCR法により測定することができる。リアルタイムPCR法により得られた口腔内連鎖球菌の菌数及びミュータンス連鎖球菌の菌数を用いて、比率を算出することが可能であり、う蝕発生の危険度を予測することができる。
すなわち、口腔内から採取した1つの試料中の口腔内連鎖球菌の菌数及びミュータンス連鎖球菌の菌数を測定し、口腔内に存在する総連鎖球菌の菌数に対するミュータンス連鎖球菌の菌数の比率を算出する。
《作用》
本発明のプライマー及びプローブセット、並びに後述の比較例1〜3で用いたプライマー及びプローブセットは、いずれも口腔内に存在する連鎖球菌であるストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・サンギウス、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・オラリス、及びストレプトコッカス・ゴルドニス、ストレプトコッカス・ミュータンス及びストレプトコッカス・ソブリヌスの16SリボソームRNA遺伝子に存在する共通の塩基配列を有する領域から選択したプライマー及びプローブセットである。本発明のプライマー及びプローブセットを用いたリアルタイムPCR法によれば、培養法と相関する口腔内に存在する総連鎖球菌の菌数の測定が可能である。しかしながら、比較例1〜3で用いたプライマー及びプローブセットによるリアルタイムPCR法では、測定値が培養法で得られた総連鎖球菌の菌数と相関しない場合や、検量線が得られない場合がある。これらの理由は、完全に解明されているわけではないが、以下のように推論することができる。また、本発明は以下の説明によって限定されるものではない。
本発明のプライマー及びプローブセット、並びに後述の比較例1〜3で用いたプライマー及びプローブセットは、いずれも口腔内に存在する連鎖球菌であるストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・サンギウス、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・オラリス、及びストレプトコッカス・ゴルドニス、ストレプトコッカス・ミュータンス及びストレプトコッカス・ソブリヌスの16SリボソームRNA遺伝子に存在する共通の塩基配列を有する領域から選択したプライマー及びプローブセットである。本発明のプライマー及びプローブセットを用いたリアルタイムPCR法によれば、培養法と相関する口腔内に存在する総連鎖球菌の菌数の測定が可能である。しかしながら、比較例1〜3で用いたプライマー及びプローブセットによるリアルタイムPCR法では、測定値が培養法で得られた総連鎖球菌の菌数と相関しない場合や、検量線が得られない場合がある。これらの理由は、完全に解明されているわけではないが、以下のように推論することができる。また、本発明は以下の説明によって限定されるものではない。
口腔内には、連鎖球菌以外にもいくつかの常在菌が混在しており、連鎖球菌以外の菌の種類やその量は、個人によっても差があると考えられる。本発明のプライマー及びプローブセットは、1種類の連鎖球菌に特異的な塩基配列の領域にプライマー及びプローブを設計するのではなく、すべての連鎖球菌に共通する塩基配列の領域にプライマー及びプローブを設計する必要がある。従って、領域によっては連鎖球菌以外の常在菌の16SリボソームRNA遺伝子を検出するものと考えられる。また、検量線が得られなかったプライマー及びプローブセットについては、PCR反応が良好に起こっていないものと考えられる。例えば、後述する比較例3のような検量線の得られないプライマーではその領域の標的DNAが、denatureされて一本鎖DNAとなったときに、ヘアピン構造等の2次構造を取りやすい領域の場合には、プライマーやプローブの結合が阻害される。またプライマー同士が結合してプライマーダイマーを形成したり、プライマーやプローブが2次構造を取るようなことも考えられる。従って、正確な口腔内総連鎖球菌数の測定を行うためにリアルタイムPCR法に適したプライマーやプローブを設計する領域は、単純にすべての連鎖球菌に共通する塩基配列の領域を選択すればよいわけでなく、リアルタイムPCR法に適しており、正確に口腔内総連鎖球菌数を測定することのできる領域である必要がある。
以下、本発明を実施例に基づき、より具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
《DNAの抽出例》
5人の被験者の口腔内から唾液0.2mLを採取し、粘度を調整するため滅菌水1.6mLに懸濁後に遠心して沈殿物を回収し、DNA抽出試薬キット(商品名 QuickGene DNA tissue kit S;FUJIFILM社)を用い、キットマニュアルに従いDNAを抽出し、0.2mLのDNAサンプルとした。
5人の被験者の口腔内から唾液0.2mLを採取し、粘度を調整するため滅菌水1.6mLに懸濁後に遠心して沈殿物を回収し、DNA抽出試薬キット(商品名 QuickGene DNA tissue kit S;FUJIFILM社)を用い、キットマニュアルに従いDNAを抽出し、0.2mLのDNAサンプルとした。
《実施例1》
TaqMan Fast Universal PCR Mater Mix(アプライド・バイオシステムズ株式会社)を用いて、1チューブあたり、DNAサンプル及び以下の量の試薬を混合して、全体の液量が20μLの反応液を調整した。
TaqMan Fast Universal PCR Mater Mix :10μL
10μMのF6フォワードプライマー :0.4μL(終濃度200nM)
10μMのR8リバースプライマー :0.4μL(終濃度200nM)
5μMのP8プローブ :0.4μL(終濃度100nM)
DNAサンプル :1.0μL
滅菌水 :7.8μL
反応液20μLの入ったチューブを、Applied Biosystems 7500FastリアルタイムPCRシステムにセットしPCR反応を行った。前処理として95℃、20秒でインキュベートを行った後、95℃、3秒、60℃、30秒を40サイクル繰り返し、増幅サイクル毎に蛍光強度を測定した。なお、プライマーはオリゴDNAを化学合成により作製した。プローブはオリゴDNAを化学合成し、5‘末端にFAMを、3’末端にBHQを結合させたものを用いた。
標準曲線を作成するために、Streptococcus mitis ATCC49456株を培養して種々の菌濃度の標準試料を用意し、各々の菌濃度について発光強度が急激に大きくなる閾値(Ct値)を予め調べて、菌濃度の対数を横軸にCt値を縦軸に取って検量線を作成した。同時に検体についてもCt値を調べ、検量線に当てはめることにより検体中の菌濃度を定量した。結果を表1に示す。
TaqMan Fast Universal PCR Mater Mix(アプライド・バイオシステムズ株式会社)を用いて、1チューブあたり、DNAサンプル及び以下の量の試薬を混合して、全体の液量が20μLの反応液を調整した。
TaqMan Fast Universal PCR Mater Mix :10μL
10μMのF6フォワードプライマー :0.4μL(終濃度200nM)
10μMのR8リバースプライマー :0.4μL(終濃度200nM)
5μMのP8プローブ :0.4μL(終濃度100nM)
DNAサンプル :1.0μL
滅菌水 :7.8μL
反応液20μLの入ったチューブを、Applied Biosystems 7500FastリアルタイムPCRシステムにセットしPCR反応を行った。前処理として95℃、20秒でインキュベートを行った後、95℃、3秒、60℃、30秒を40サイクル繰り返し、増幅サイクル毎に蛍光強度を測定した。なお、プライマーはオリゴDNAを化学合成により作製した。プローブはオリゴDNAを化学合成し、5‘末端にFAMを、3’末端にBHQを結合させたものを用いた。
標準曲線を作成するために、Streptococcus mitis ATCC49456株を培養して種々の菌濃度の標準試料を用意し、各々の菌濃度について発光強度が急激に大きくなる閾値(Ct値)を予め調べて、菌濃度の対数を横軸にCt値を縦軸に取って検量線を作成した。同時に検体についてもCt値を調べ、検量線に当てはめることにより検体中の菌濃度を定量した。結果を表1に示す。
《実施例2》
フォワードプライマーとしてF10フォワードプライマーを、リバースプライマーとしてR4リバースプライマーを、プローブとしてP13プローブを用いたことを除いては、実施例1に記載の測定方法を繰り返した。結果を表4に示す。
フォワードプライマーとしてF10フォワードプライマーを、リバースプライマーとしてR4リバースプライマーを、プローブとしてP13プローブを用いたことを除いては、実施例1に記載の測定方法を繰り返した。結果を表4に示す。
《実施例3》
フォワードプライマーとしてF3フォワードプライマーを、リバースプライマーとしてR5リバースプライマーを、プローブとしてP17プローブを用いたことを除いては、実施例1に記載の測定方法を繰り返した。結果を表4に示す。
フォワードプライマーとしてF3フォワードプライマーを、リバースプライマーとしてR5リバースプライマーを、プローブとしてP17プローブを用いたことを除いては、実施例1に記載の測定方法を繰り返した。結果を表4に示す。
《実施例4》
フォワードプライマーとしてF1フォワードプライマーを、リバースプライマーとしてR2リバースプライマーを、プローブとしてP19プローブを用いたことを除いては、実施例1に記載の測定方法を繰り返した。結果を表4に示す。
フォワードプライマーとしてF1フォワードプライマーを、リバースプライマーとしてR2リバースプライマーを、プローブとしてP19プローブを用いたことを除いては、実施例1に記載の測定方法を繰り返した。結果を表4に示す。
《比較例1》
フォワードプライマーとしてF11フォワードプライマー(配列番号47)を、リバースプライマーとしてR13リバースプライマー(配列番号48)を、プローブとしてP20プローブ(配列番号49)を用いたことを除いては、実施例1に記載の測定方法を繰り返した。各プライマーは、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・サンギウス、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・オラリス(、及びストレプトコッカス・ゴルドニス、ストレプトコッカス・ミュータンス及びストレプトコッカス・ソブリヌスのs16RNA遺伝子において、共通の配列を有する領域に設定した。F11フォワードプライマー、R13リバースプライマー、及びP20プローブの塩基配列を以下に示す。括弧内は配列番号46に示したストレプトコッカス・ミュータンスの塩基配列における相当するヌクレオチド番号を示す。
F11:5‘−GTGTAGCGGTGAAATGCGTAGA−3’(678−699)
R13:5‘−CCCGTCAATTCCTTTGAGTTTC−3’(902−923)
P20:5‘−CAGGATTAGATACCCTGGTAG−3’(778−798)
結果を表4に示す。
フォワードプライマーとしてF11フォワードプライマー(配列番号47)を、リバースプライマーとしてR13リバースプライマー(配列番号48)を、プローブとしてP20プローブ(配列番号49)を用いたことを除いては、実施例1に記載の測定方法を繰り返した。各プライマーは、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・サンギウス、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・オラリス(、及びストレプトコッカス・ゴルドニス、ストレプトコッカス・ミュータンス及びストレプトコッカス・ソブリヌスのs16RNA遺伝子において、共通の配列を有する領域に設定した。F11フォワードプライマー、R13リバースプライマー、及びP20プローブの塩基配列を以下に示す。括弧内は配列番号46に示したストレプトコッカス・ミュータンスの塩基配列における相当するヌクレオチド番号を示す。
F11:5‘−GTGTAGCGGTGAAATGCGTAGA−3’(678−699)
R13:5‘−CCCGTCAATTCCTTTGAGTTTC−3’(902−923)
P20:5‘−CAGGATTAGATACCCTGGTAG−3’(778−798)
結果を表4に示す。
《比較例2》
フォワードプライマーとしてF12フォワードプライマー(配列番号50)を、リバースプライマーとしてR14リバースプライマー(配列番号51)を、プローブとしてP21プローブ(配列番号52)を用いたことを除いては、実施例1に記載の測定方法を繰り返した。各プライマーは、比較例1と同様に、各連鎖球菌の16SリボソームRNA遺伝子において、共通の配列を有する領域に設定した。F12フォワードプライマー、R14リバースプライマー、及びP21プローブの塩基配列を以下に示す。括弧内は配列番号46に示したストレプトコッカス・ミュータンスの塩基配列における相当するヌクレオチド番号を示す。
F12:5‘−GGCTACACACGTGCTACAATGG−3’(1216−1237)
R14:5‘−AAGGCCCGGGAACGTATTC−3’(1368−1386)P21:5‘−TCGCTAGTAATCGCG−3’(1336−1350)
結果を表4に示す。
なお、これらのプライマー及びプローブセットの組み合わせは、連鎖球菌だけでなく、Porphyromonas gingivalis、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus salivarius、Lactobacillus caseiも検出した。
フォワードプライマーとしてF12フォワードプライマー(配列番号50)を、リバースプライマーとしてR14リバースプライマー(配列番号51)を、プローブとしてP21プローブ(配列番号52)を用いたことを除いては、実施例1に記載の測定方法を繰り返した。各プライマーは、比較例1と同様に、各連鎖球菌の16SリボソームRNA遺伝子において、共通の配列を有する領域に設定した。F12フォワードプライマー、R14リバースプライマー、及びP21プローブの塩基配列を以下に示す。括弧内は配列番号46に示したストレプトコッカス・ミュータンスの塩基配列における相当するヌクレオチド番号を示す。
F12:5‘−GGCTACACACGTGCTACAATGG−3’(1216−1237)
R14:5‘−AAGGCCCGGGAACGTATTC−3’(1368−1386)P21:5‘−TCGCTAGTAATCGCG−3’(1336−1350)
結果を表4に示す。
なお、これらのプライマー及びプローブセットの組み合わせは、連鎖球菌だけでなく、Porphyromonas gingivalis、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus salivarius、Lactobacillus caseiも検出した。
《比較例3》
フォワードプライマーとしてF13フォワードプライマー(配列番号53)を、リバースプライマーとしてR15リバースプライマー(配列番号54)を、プローブとしてP22プローブ(配列番号55)を用いたことを除いては、実施例1に記載の測定方法を繰り返した。各プライマーは、比較例1と同様に、各連鎖球菌の16SリボソームRNA遺伝子において、共通の配列を有する領域に設定した。F13フォワードプライマー、R15リバースプライマー、及びP22プローブの塩基配列を以下に示す。括弧内は配列番号46に示したストレプトコッカス・ミュータンスの塩基配列における相当するヌクレオチド番号を示す。
F13:5‘−CGCTAGTAATCGCGGATCAGCACG−3’(1337−1360)
R15:5‘−TGTGACGGGCGGTGTGTA−3’(1388−1405)
P22:5‘−CGGTGAATACGTTCCCGGGC−3’(1364−1383)
結果を表4に示す。
このプライマー及びプローブセットの組み合わせは、培養菌からのDNA抽出液の10倍希釈系列を作製し、増幅して検量線を作成したが、検量線が直線にならず、正しく測定することができなかった。
フォワードプライマーとしてF13フォワードプライマー(配列番号53)を、リバースプライマーとしてR15リバースプライマー(配列番号54)を、プローブとしてP22プローブ(配列番号55)を用いたことを除いては、実施例1に記載の測定方法を繰り返した。各プライマーは、比較例1と同様に、各連鎖球菌の16SリボソームRNA遺伝子において、共通の配列を有する領域に設定した。F13フォワードプライマー、R15リバースプライマー、及びP22プローブの塩基配列を以下に示す。括弧内は配列番号46に示したストレプトコッカス・ミュータンスの塩基配列における相当するヌクレオチド番号を示す。
F13:5‘−CGCTAGTAATCGCGGATCAGCACG−3’(1337−1360)
R15:5‘−TGTGACGGGCGGTGTGTA−3’(1388−1405)
P22:5‘−CGGTGAATACGTTCCCGGGC−3’(1364−1383)
結果を表4に示す。
このプライマー及びプローブセットの組み合わせは、培養菌からのDNA抽出液の10倍希釈系列を作製し、増幅して検量線を作成したが、検量線が直線にならず、正しく測定することができなかった。
《比較例4》
非特許文献4に記載のストレプトコッカス・ミュータンスを特異的に検出するプライマーを用いて、5人の被験者の口腔内のDNAサンプルの測定を行った。すなわち、フォワードプライマーとしてSmut3368−Fプライマー(配列番号56)を、リバースプライマーとしてSmut3481−Rプライマー(配列番号57)を、プローブとしてSmut3423Tプローブ(配列番号58)を用いたことを除いては、実施例1に記載の測定方法を繰り返した。各プライマー及びプローブは、ストレプトコッカス・ミュータンスのgtfB遺伝子に設定されている。以下に、Smut3368−Fプライマー、Smut3481−Rプライマー(配列番号57)、及びSmut3423Tプローブの塩基配列を示す。
Smut3368−F:5‘−GCCTACAGCTCAGAGATGCTATTCT−3’
Smut3481−R:5‘−GCCATACACCACTCATGAATTGA−3’Smut3423T:5‘−TGGAAATGACGGTCGCCGTTATGAA−3’
結果を表4に示す。
被験者の口腔内から採取した唾液を適宜希釈し、ミティス・サリバリウス(Mitis Salivarius)寒天培地(以下、MS寒天培地と称す)にて培養した後、コロニー数をカウントすることにより口腔内総連鎖球菌数を測定した結果も表4に纏めて示す。
非特許文献4に記載のストレプトコッカス・ミュータンスを特異的に検出するプライマーを用いて、5人の被験者の口腔内のDNAサンプルの測定を行った。すなわち、フォワードプライマーとしてSmut3368−Fプライマー(配列番号56)を、リバースプライマーとしてSmut3481−Rプライマー(配列番号57)を、プローブとしてSmut3423Tプローブ(配列番号58)を用いたことを除いては、実施例1に記載の測定方法を繰り返した。各プライマー及びプローブは、ストレプトコッカス・ミュータンスのgtfB遺伝子に設定されている。以下に、Smut3368−Fプライマー、Smut3481−Rプライマー(配列番号57)、及びSmut3423Tプローブの塩基配列を示す。
Smut3368−F:5‘−GCCTACAGCTCAGAGATGCTATTCT−3’
Smut3481−R:5‘−GCCATACACCACTCATGAATTGA−3’Smut3423T:5‘−TGGAAATGACGGTCGCCGTTATGAA−3’
結果を表4に示す。
被験者の口腔内から採取した唾液を適宜希釈し、ミティス・サリバリウス(Mitis Salivarius)寒天培地(以下、MS寒天培地と称す)にて培養した後、コロニー数をカウントすることにより口腔内総連鎖球菌数を測定した結果も表4に纏めて示す。
表4に示す結果より、本発明によるプライマー及びプローブセットを用いることによって、口腔内に存在する総連鎖球菌の菌数を短時間で定量することができ、培養法と相関する結果を得ることができた。従って、本発明の方法及びキットを用いれば、口腔内に存在する総連鎖球菌の菌数に対するう蝕発症に関連する連鎖球菌の比率を効率良く算出することができる。実際に、実施例1〜4によって得られた口腔内連鎖球菌数と比較例4によって得られたミュータンス連鎖球菌であるストレプトコッカス・ミュータンスの菌数とから、「総連鎖球菌の菌数」に対する「ミュータンス連鎖球菌の菌数」の比率を算出することが可能である。一方、比較例1〜3のプライマー及びプローブを用いた場合には、培養法とは異なる結果となり口腔内に存在する総連鎖球菌の菌数の測定を行うことができなかった。
《実施例5》
実施例5では、口腔内の代表的な連鎖球菌を用い、本発明のプライマー及びプローブセットがいずれの菌種においても、有効な検量線を引くことができることを確認した。
用いた口腔内連鎖球菌株は以下のとおりであり、括弧内は入手先の菌株名を示している。
Streptococcus mutans(ATCC25175)
Streptococcus mutans(JCM5705)
Streptococcus mutans(OMZ)
Streptococcus mutans(JCM5706)
Streptococcus mutans(MT6229)
Streptococcus sobrinus(ATCC33478)
Streptococcus sobrinus(OMZ65)
Streptococcus sobrinus(6715)
Streptococcus sobrinus(MT8245)
Streptococcus mitis(ATCC903)
Streptococcus mitis(6249)
Streptococcus mitis(ATCC49456)
Streptococcus salivarius(JCM5707)
Streptococcus sanguis(ATCC10556)
Streptococcus sanguis(ATCC10557)
Streptococcus oralis(JCM12997)
実施例5では、口腔内の代表的な連鎖球菌を用い、本発明のプライマー及びプローブセットがいずれの菌種においても、有効な検量線を引くことができることを確認した。
用いた口腔内連鎖球菌株は以下のとおりであり、括弧内は入手先の菌株名を示している。
Streptococcus mutans(ATCC25175)
Streptococcus mutans(JCM5705)
Streptococcus mutans(OMZ)
Streptococcus mutans(JCM5706)
Streptococcus mutans(MT6229)
Streptococcus sobrinus(ATCC33478)
Streptococcus sobrinus(OMZ65)
Streptococcus sobrinus(6715)
Streptococcus sobrinus(MT8245)
Streptococcus mitis(ATCC903)
Streptococcus mitis(6249)
Streptococcus mitis(ATCC49456)
Streptococcus salivarius(JCM5707)
Streptococcus sanguis(ATCC10556)
Streptococcus sanguis(ATCC10557)
Streptococcus oralis(JCM12997)
ブレインハートインフージョン(Brain Heart Infusion:以下、BHIと称する)液体培地により各菌株を培養し、遠心(5,000rpm,5分間)により集菌した。菌をリン酸緩衝化生理食塩水(phosphate buffered saline:以下、PBSと称する)に懸濁し、培養菌懸濁液とした。DNA抽出試薬キットQuickGene DNA tissue kit S(FUJIFILM社)を用いてキットマニュアルに従い、各培養菌懸濁液からDNAを抽出した。同時にMS寒天培地に適当に希釈した培養菌懸濁液を播種し、コロニー数をカウントすることにより懸濁液中の細菌数を測定した。
フォワードプライマーとしてF7フォワードプライマーを、リバースプライマーとしてR7リバースプライマーを、プローブとしてP7プローブを用いたこと、及びDNAサンプルとして各培養懸濁液からのDNAを用いたことを除いては、実施例1に記載の測定方法を繰り返した。
各々のDNAサンプルについてシグナルが急激に大きくなるサイクル数(Ct値)を求め、菌数の対数を縦軸、閾値(Ct値)を横軸に取って検量線を作成した。
フォワードプライマーとしてF7フォワードプライマーを、リバースプライマーとしてR7リバースプライマーを、プローブとしてP7プローブを用いたこと、及びDNAサンプルとして各培養懸濁液からのDNAを用いたことを除いては、実施例1に記載の測定方法を繰り返した。
各々のDNAサンプルについてシグナルが急激に大きくなるサイクル数(Ct値)を求め、菌数の対数を縦軸、閾値(Ct値)を横軸に取って検量線を作成した。
PCR結果より得られたCt値ともとの培養菌懸濁液の菌数をプロットしたものを図1に示す。
図1のS.mutansはATCC25175株を、S.sobrinusはATCC33478株を、S.mitisはATCC49456株を、S.sanguisは、ATCC10556株を示しており、S.mutansやS.sobrinusは複数の株を用いて行ったが、株による増幅の違いはほとんどみられず、異なる連鎖球菌を正確に定量できることがわかった。
《実施例6》
各連鎖球菌の菌株について、培養により得られた菌数とリアルタイムPCR法により得られた菌数の相関を確認した。
実施例5で使用した培養菌株を用い、各株をBHI液体培地で培養し、増殖してきた培養液を集菌した。PBSで適当に懸濁し、この溶液からDNA抽出液を作製した。また、同時にPBS懸濁液をMS寒天培地に播種し、培養法による菌数を算出した。
フォワードプライマーとしてF8フォワードプライマーを、リバースプライマーとしてR7及びR8リバースプライマーを、プローブとしてP8プローブを用いたこと、及びDNAサンプルとして各培養懸濁液からのDNAを用いたことを除いては、実施例1に記載の測定方法を繰り返した。
Streptococcus mitis ATCC49456から得られる検量線を用いて菌数を算出した。
各連鎖球菌の菌株について、培養により得られた菌数とリアルタイムPCR法により得られた菌数の相関を確認した。
実施例5で使用した培養菌株を用い、各株をBHI液体培地で培養し、増殖してきた培養液を集菌した。PBSで適当に懸濁し、この溶液からDNA抽出液を作製した。また、同時にPBS懸濁液をMS寒天培地に播種し、培養法による菌数を算出した。
フォワードプライマーとしてF8フォワードプライマーを、リバースプライマーとしてR7及びR8リバースプライマーを、プローブとしてP8プローブを用いたこと、及びDNAサンプルとして各培養懸濁液からのDNAを用いたことを除いては、実施例1に記載の測定方法を繰り返した。
Streptococcus mitis ATCC49456から得られる検量線を用いて菌数を算出した。
リアルタイムPCR法による測定結果と培養法による測定結果を以下に示す。
リアルタイムPCR法により推定される菌数と培養法により得られる菌数は、よく相関していることがわかった。また、プライマーとして、複数のプライマーを用いてリアルタイムPCR法による増幅を行っても、正確に定量できることがわかった。
《参考例1》
参考例1では、本発明のプライマー及びプローブセットが、連鎖球菌以外の菌は検出しないことを確認した。
用いた口腔内に存在する連鎖球菌以外の菌は、以下のとおりであり、括弧内は入手先の菌株名を示している。
Lactobacillus salivarius(JCM1231)
Lactobacillus rhamnosus(JCM1563)
Lactobacillus casei(ATCC4646)
Actinobacillus actinomycetemcomitans(ATCC29524)
Porphyromonas gingivalis(ATCC33277)
Candida albicans(ATCC10231)
Candida krusei(JCM1609)
Actinomyces naeslundii(JCM8349)
Actinomyces odontolyticus(ATCC17929)
参考例1では、本発明のプライマー及びプローブセットが、連鎖球菌以外の菌は検出しないことを確認した。
用いた口腔内に存在する連鎖球菌以外の菌は、以下のとおりであり、括弧内は入手先の菌株名を示している。
Lactobacillus salivarius(JCM1231)
Lactobacillus rhamnosus(JCM1563)
Lactobacillus casei(ATCC4646)
Actinobacillus actinomycetemcomitans(ATCC29524)
Porphyromonas gingivalis(ATCC33277)
Candida albicans(ATCC10231)
Candida krusei(JCM1609)
Actinomyces naeslundii(JCM8349)
Actinomyces odontolyticus(ATCC17929)
各菌株を以下に示す培地を用いて培養した。各培地の組成は、特に記載しない限り標準的なものを用いた。
Lactobacillus属:MRS培地
Actinobacillus actinomycetemcomitans:BHI 37.5g/Lからなる液体培地。オートクレーブ滅菌後にN2:H2:CO2=8:1:1の混合ガス中にて1晩放置したものを使用した。
Porphyromonas gingivalis培地組成:BHI 37.5g/Lにyeast extract 5g/L、tripticase peptone 5g/L、L−cysteine HCl 0.5g、ヘミン・メナジオン溶液* 1mLからなる液体培地。オートクレーブ滅菌後にN2:H2:CO2=8:1:1の混合ガス中にて1晩放置したものを使用した。
ヘミン・メナジオン溶液*:ヘミン0.05gを1M水酸化ナトリウム1mLに溶解して100mLにメスアップした溶液をオートクレーブ滅菌する(溶液A)。メナジオン0.2gをエタノール20mLに溶解してろ過滅菌する(溶液B)。溶液A100mLと溶液B1mLを混合することにより調製する。
Candida属、YM培地
Actinomyces属:アクチノミセス培地(ベクトン・ディッキンソン)
Lactobacillus属:MRS培地
Actinobacillus actinomycetemcomitans:BHI 37.5g/Lからなる液体培地。オートクレーブ滅菌後にN2:H2:CO2=8:1:1の混合ガス中にて1晩放置したものを使用した。
Porphyromonas gingivalis培地組成:BHI 37.5g/Lにyeast extract 5g/L、tripticase peptone 5g/L、L−cysteine HCl 0.5g、ヘミン・メナジオン溶液* 1mLからなる液体培地。オートクレーブ滅菌後にN2:H2:CO2=8:1:1の混合ガス中にて1晩放置したものを使用した。
ヘミン・メナジオン溶液*:ヘミン0.05gを1M水酸化ナトリウム1mLに溶解して100mLにメスアップした溶液をオートクレーブ滅菌する(溶液A)。メナジオン0.2gをエタノール20mLに溶解してろ過滅菌する(溶液B)。溶液A100mLと溶液B1mLを混合することにより調製する。
Candida属、YM培地
Actinomyces属:アクチノミセス培地(ベクトン・ディッキンソン)
増殖した培養液を遠心(5,000rpm,5分間)により集菌した。PBSに懸濁し、培養菌懸濁液とした。DNA抽出試薬キットQuickGene DNA tissue kit S(FUJIFILM社)を用いてキットマニュアルに従い、各培養菌懸濁液からDNAを抽出した。同時に以下に示す寒天培地に適当に希釈した培養菌懸濁液を播種し、コロニー数をカウントすることにより懸濁液中の細菌数を測定した。
Lactobacillus属:ROGOSA寒天培地
Actinobacillus actinomycetemcomitans、Porphyromonas gingivalis:羊血液寒天培地(栄研化学)
Candida属:ポテトデキストロース培地
Actinomyces属:GAM半流動培地
PCR反応については実施例1と同じプライマー及びプローブセットを用い、実施例1に記載の測定方法を繰り返した。
どの培養菌株から得られたDNAサンプルからも増幅がみられなかった。
Lactobacillus属:ROGOSA寒天培地
Actinobacillus actinomycetemcomitans、Porphyromonas gingivalis:羊血液寒天培地(栄研化学)
Candida属:ポテトデキストロース培地
Actinomyces属:GAM半流動培地
PCR反応については実施例1と同じプライマー及びプローブセットを用い、実施例1に記載の測定方法を繰り返した。
どの培養菌株から得られたDNAサンプルからも増幅がみられなかった。
本発明のプライマー及びプローブセットを用いた口腔内連鎖球菌数を測定する方法により、総連鎖球菌の菌数とミュータンス連鎖球菌の比率を算出することが可能である。この比率を求めることによって、う蝕のリスクを検出することが可能であり、う蝕の予防及び治療に役立てることができる。また、本発明の方法は、培養法と比較して多数の検体を処理することができるため、臨床検査センター等における多数検体の処理が可能である。
Claims (8)
- 配列番号1で表される塩基配列における連続する少なくとも15塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含む少なくとも1種のフォワードプライマーと、
配列番号2で表される塩基配列における連続する少なくとも15塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含む少なくとも1種のリバースプライマーとの組み合わせ、からなる口腔内連鎖球菌の菌数測定用プライマーセット。 - 前記フォワードプライマーが、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、若しくは配列番号14で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又はそれらの2種以上のオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、若しくは配列番号26で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又はそれらの2種以上のオリゴヌクレオチドである請求項1に記載のプライマーセット。
- 請求項1又は2に記載のプライマーセットと、配列番号3又は配列番号4で表される塩基配列における連続する少なくとも10塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含む少なくとも1種のプローブとからなる口腔内連鎖球菌の菌数測定用プライマー及びプローブセット。
- 前記プローブが、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、若しくは配列番号45で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又はそれらの2種以上のオリゴヌクレオチドである請求項3に記載のプライマー及びプローブセット。
- 請求項1又は2に記載のプライマーセットを用いたリアルタイムPCR法により、口腔内連鎖球菌の菌数を測定する方法。
- 請求項3又は4に記載のプライマー及びプローブセットを用いたリアルタイムPCR法により、口腔内連鎖球菌の菌数を測定する方法。
- 請求項1又は2に記載のプライマーセットを含む、口腔内連鎖球菌の菌数測定用リアルタイムPCRキット。
- 請求項3又は4に記載のプライマー及びプローブセットを含む、口腔内連鎖球菌の菌数測定用リアルタイムPCRキット。
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