KR102432475B1 - 형광표지법 기반 병원균 신속 검출용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 검출방법 - Google Patents

형광표지법 기반 병원균 신속 검출용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 검출방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102432475B1
KR102432475B1 KR1020200172437A KR20200172437A KR102432475B1 KR 102432475 B1 KR102432475 B1 KR 102432475B1 KR 1020200172437 A KR1020200172437 A KR 1020200172437A KR 20200172437 A KR20200172437 A KR 20200172437A KR 102432475 B1 KR102432475 B1 KR 102432475B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
mutans
kctc
probe
nucleic acid
sobrinus
Prior art date
Application number
KR1020200172437A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20220082485A (ko
Inventor
김동엽
전재규
정희영
Original Assignee
전북대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 전북대학교산학협력단 filed Critical 전북대학교산학협력단
Priority to KR1020200172437A priority Critical patent/KR102432475B1/ko
Publication of KR20220082485A publication Critical patent/KR20220082485A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102432475B1 publication Critical patent/KR102432475B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 형광표지법을 기반으로 한 스트렙토코커스 뮤턴스(Streptococcus mutans)를 신속하게 검출하는 조성물, 이를 포함하는 키트 및 검출방법에 관한 것으로, 본 발명의 형광표지법을 이용한 스트렙토코커스 뮤턴스(Streptococcus mutans)의 검출하는 방법은 2시간 이내에 정성적 및 정량적 검사가 가능하며 스트렙토코커스 뮤턴스의 유전형과 표현형의 검증을 통하여 잠재적인 병원성도 검출할 수 있는 신속하고 정밀한 검사법으로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

형광표지법 기반 병원균 신속 검출용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 검출방법{Composition for rapid detecting pathogen based fluorescence in situ hybridization, kit containing the same and method thereof}
본 발명은 형광표지법을 기반으로 한 스트렙토코커스 뮤턴스(Streptococcus mutans)를 신속하게 검출하는 조성물, 이를 포함하는 키트 및 검출방법에 관한 것이다.
스트렙토코커스 뮤턴스(Streptococcus mutans)는 당(sucrose)을 이용하여 포도당(glucose)/과당(fructose)으로 분해 또는 생체외 효소(글루코실전이효소)를 이용하여 생체외 다당류(exopolysaccharide)를 합성하여 견고한 하나의 건축물과 같은 바이오필름을 형성한다. 바이오필름 (Biofilm)이란, '생물막'이라고도 일컬어지는데, 세균이 자기 생식에 있어 불리한 환경에 놓일 경우, 주위에 다당체를 생산하고 이것을 매개로 인접한 세균이 응집하여 한 덩어리가 되어, 고체나 생체 표면에 세균이 막(film)을 형성하는 상태를 가리킨다. S. mutans는 sucrose의 존재하에서 생체외 다당류를 합성하여 치아표면에 부착하고, 이때 당을 분해하는 과정에서 유기산을 발생시켜 바이오필름 내부의 산성조건을 형성하기 때문에 치아의 법랑질을 산 부식시켜 충치를 일으킨다. 이렇듯 충치는 S. mutans가 치면에 부착하여 증식 및 산 생성과정을 거쳐 치아 중 무기질이 탈회되고 상아질이 파괴되어 치아조직의 결손을 초래하는 바이오필름과 다이어트 의존성 치아 경조직 질환이다. 또한, 상기와 같은 충치 원인균에 의해 생성된 유기산이 치질에 직접 작용하기 위해서는 산 생성균이 치면에 체류해야 하고 이를 위해서는 불용성 글루칸이 형성되어야 한다. 이 세균들이 분비하는 GTF(glucosyltransferase)는 수크로즈를 이용하여 글루코스 중합체로 90% 이상의 α-1,3 글루코시드 결합(glucosidic linkage)과 나머지는 α-1,6 글루코시드 결합으로 이루어진 불용성 글루칸을 형성한다. 이것은 물에 녹지 않고 치아표면에 부착하는 능력이 있기 때문에 치면 바이오필름(biofilm)을 형성하여 충치의 원인(병인)이 된다. 이에 S. mutans를 신속하게 검출하고 그 병인을 특정할 수 있는 방법이 필요하다.
다만 S. mutans를 검출하기 위해서는 배양배지법이나 PCR 또는 RT_PCR을 이용한 검출법으로 복잡한 과정과 기술 및 장비가 필요하며, 6~24시간 이상의 시간적 소요가 필요하다. 병원균이 내성을 가진 항생제를 처리한 선택배지 사용한 배양법은 24~48 시간이 필요하고 배양 후 추가적으로 colony PCR 과정이 필요하다. 또한, 병원성에 대한 검증은 치아와 유사한 실험실 모델에서 배양하여 유기산 생성과 생체외 다당류의 형성등을 검증하여야 함으로 장시간(42시간 이상)이 소요된다.
이에 본 발명자들은 형광표지법을 이용하여 충치의 원인균인 S. mutans의 신속한 검출과 더불어 이의 병원성을 검증하였다.
대한민국 등록 특허 KR 10-1706070 대한민국 공개 특허 KR 10-2012-0074443
본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 핵산 프로프; 서열번호 2로 표시되는 핵산 프로브; 및 서열번호 3으로 표시되는 핵산 프로브를 포함하는 스트렙토코커스 뮤턴스(Streptococcus mutans) 정밀 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 스트렙토코커스 뮤턴스 정밀 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 1) 제 1항의 조성물을 생물학적 시료와 혼합하여 혼성화 시키는 단계; 및 2) 상이 핵산 프로브의 혼성화 여부를 검출하는 단계를 포함하는 스트렙토코커스 뮤턴스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 3) 생체외 다당류의 형성능을 간편하게 측정함으로써 그 병원성을 진단할 수 있다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 핵산 프로프; 서열번호 2로 표시되는 핵산 프로브; 및 서열번호 3으로 표시되는 핵산 프로브를 포함하는 스트렙토코커스 뮤턴스(Streptococcus mutans) 검출용 조성물을 제공한다.
상기 검출은 FISH(Fluorescence in situ hybridization)법을 이용하는 것이다.
상기 검출은 FISH(Fluorescence in situ hybridization)법을 이용하는 것이다. 형광동소보합법(fluorescence in situ hybridization, FISH)은 특정 DNA 염기서열(DNA sequence)의 존재유무를 규명하기 위하여 균배양이나 DNA의 추출과정을 거치지 않고 염색체나 핵의 형태를 그대로 유지한 세균을 슬라이드 또는 액상에서 고정하고 여기에 표적유전자의 특정 염기서열과 상보적인 DNA에 형광물질을 붙인 여러 종류의 프로브와 반응시켜 표적유전자의 유무와 위치를 확인함으로써 염색체 또는 유전자의 변이를 형광현미경으로 관찰하거나 유동 세포검사법과 형광분광분석법을 이용 분석, 정성 및 정량하는 방법이다.
본 발명에서 용어 "형광동소보합법(fluorescence in situ hybridization, FISH)"은 특정 DNA 염기서열(DNA sequence)의 존재유무를 규명하기 위하여 세포배양이나 DNA의 추출과정을 거치지 않고 염색체나 핵의 형태를 그대로 유지한 채 세포를 슬라이드에 도말하거나 원형의 샘플을 고정시킨 상태로 액상에서 표적유전자의 특정 염기서열과 상보적인 DNA에 형광물질을 붙인 여러 종류의 소식자(probe)를 반응시켜 표적유전자의 유무와 위치를 확인함으로써 염색체 또는 유전자의 변이를 형광현미경으로 관찰 또는 형광분광광도계로 정성, 정량하는 방법이다. 염색체에 형광물질을 부착한 소식자를 상보적으로 결합시키는 과정을 교잡(혼성화)반응(hybridization)이라 부르고, 염색체에 부착되는 DNA 소식자는 특정파장의 광선에 노출될 때 형광을 내면서 대응하는 DNA염기서열의 유무 및 위치를 보여주게 되는 것이다.
본 발명에서 "스트렙토코커스 뮤턴스(Streptococcus mutans)"는 충치의 원인 균으로 바이오필름(Biofilm)을 형성한다.
본 발명에서 용어 "프로브"는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는 것으로, 세균의 16S rRNA의 특정부위와 혼성화되어 스트렙토코커스 뮤턴스 종 간의 유전체 비교 분석시 특이 염기서열의 존재 유무를 효율적으로 확인할 수 있다. 본 명세서 내에서 상기 프로브는 핵산 프로브 또는 프라이머와 혼용될 수 있다.
상기 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있으며, 프로브의 형태 및 혼성화 조건은 본 발명의 목적 및 당업계에 공지된 기술에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 또한, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 핵산서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산서열을 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로는 상기 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 핵산서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의　상동성　또는 동일성을 갖는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 상기 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 핵산서열 중 어느 하나의 핵산서열로 이루어진 핵산서열일 수 있다.
한편 본 발명에 있어서 "핵산 프로브 또는 프라이머 조합체" 또는 "조합체"는 상기 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 핵산서열을 포함하는 프로브 또는 프라이머, 이들의 조합을 더 포함하는 것일 수 있으며, 스트렙토코커스 뮤턴스의 유전체 검색 및/또는 정량, 구체적으로는 FISH를 수행하기 위해 상기 조합체를 활용할 경우 보다 정밀하고 재현성있는 결과를 획득할 수 있다
상기 프로브 또는 프라이머는 그 말단이 형광물질 등으로 표지된 것일 수 있으며, 구체적으로 프로브 또는 프라이머의 말단은 5' 말단일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 형광물질의 종류는 본 발명의 목적상 스트렙토코커스 뮤턴스의 유전체 검색 및/또는 정량에 사용될 수 있는 한 제한이 없고, 예컨대 아미노메틸쿠마린(Aminomethylcoumarin, AMCA), FAM, FITC, Cy3, Cy5 또는 Texas Red일 수 있으며, 그밖에 digoxigenin-11-Dutp, biotin-16-Dutp 또는 Alexa Fluor계열의 Alexa Fluor 405, 488, 532, 647등의 물질로 프로브의 말단이 표지될 수 있다.
또한, 상기 핵산 프로브 또는 프라이머는 스트렙토코커스 뮤턴스의 유전체 검색 및/또는 정량을 위한 것으로, 특히 형광동소혼성화, 즉 FISH(Fluorescence in situ hybridization)를 수행하기 위한 것임을 특징으로 하는 것일 수 있다. FISH는 염색체 내 특정 DNA 서열의 존재 유무를 규명하기 위한 방법으로, 염색체에 형광물질이 부착된 프로브를 부착시키는 과정을 혼성화라하며, 염색체에 부착되는 프로브는 특정파장의 광선(예: 자외선)에 노출될 경우 형광을 내면서 대응하는 DNA 서열의 유무 및 위치를 보여주게 되는 방법이다. 본 발명의 핵산 프로브 또는 프라이머, 이를 포함하는 조합체는 FISH 분석에 있어 혼성화 효율이 우수하여 재현성이 높고, 스트렙토코커스 뮤턴스의 유전체 유래의 주요반복서열에 대해 비용 및 시간적으로 효율적인 FISH 분석을 가능하게 하며, 초보자도 용이하게 사용할 수 있어 이를 통해 스트렙토코커스 뮤턴스 종 간의 유전체 비교 분석에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명에서의 용어 "혼성화"란 서로 다른 기원의 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미하는 것으로, 이는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match; 정합) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하는 경우에도 일어날 수 있다. 본 발명에서 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 조성물을 포함하는 스트렙토코커스 뮤턴스 검출용 조성물 키트를 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 핵산 프로브 또는 프라이머, 이의 조합체는 하나 이상의 조성물, 경우에 따라 필요한 혼성화 시약과 함께 제공될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 스트렙토코커스 뮤턴스의 유전체 검색 및/또는 정량을 위한 핵산 프로브 또는 프라이머, 이의 조합체와 선택적으로 혼성화 시약을 함께 포함하는 키트 또는 칩이 제공될 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 키트는 FISH용 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 키트 또는 칩은 본 명세서에 기재되어 있는 핵산 프로브 또는 프라이머의 하나 이상의 조합체, 예를 들면 1 개, 2개, 3개 또는 그 이상의 조합체를 별도의 조성물에 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 1) 제 1항의 조성물을 생물학적 시료와 혼합하여 혼성화 시키는 단계; 및 2) 상이 핵산 프로브의 혼성화 여부를 검출하는 단계를 포함하는 스트렙토코커스 뮤턴스를 검출하는 방법을 제공한다. 상기 생물학적 시료는 구강 유래 시료인 것이다. 상기 구강 유래 시료는 바이오필름(Biofilm)인 것이다.
본 발명의 또다른 하나의 양태는 1) 제 1항의 조성물을 생물학적 시료와 혼합하여 혼성화 시키는 단계; 2) 상이 핵산 프로브의 혼성화 여부를 검출하는 단계 및 3) 상기 생물학적 시료에 포함된 균주의 표현형을 분석하는 단계를 더 포함하는 것이다.
또한, 3) 생체외 다당류의 형성능을 간편하게 측정함으로써 그 병원성을 진단할 수 있다.
상기 균주의 표현형은 생체외 다당류 형성, 산 생성 및 내산성, 및 산화적 스트레스 내성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 검증할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 프로브 또는 프라이머, 그 조합체의 시료 상의 혼성화 여부는 당업계에 알려져 있는 적절한 방법에 의하여 측정될 수 있는데, 예컨대 발광, 특히 형광은 현미경법, 유동 세포검사법, 형광분광분석법 등에 제한됨이 없이 측정될 수 있으며, 현탁액 또는 현탁 배양액에서 보관되어 있는 세포에서 발광, 특히 형광은 유동 세포검사법과 형광분광분석법에 의해 측정될 수 있다. 구체적으로, 상기 핵산 프로브 또는 프라이머, 그 조합체의 시료 상의 혼성화 여부는 본 발명의 핵산 프로브 또는 프라이머, 그 조합체를 표지하는 형광물질을 검출함으로써 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 프로브 또는 프라이머, 이의 조합체를 이용한 FISH 수행은 다른 FISH용 프로브와 혼합하여 동시에 사용될 수 있으며, 이때 각 핵산 프로브 또는 프라이머, 이의 조합체는 서로 다른 형광물질로 표지하는 것이 바람직하다.
본 발명은 형광동소보합법과 실시간 다당류형성 측정법 등의 형광표지법을 이용하여 충치의 원인균인 S. mutans의 신속한 검출과 더불어 이의 병원성을 검증하였으며, 첫 번째, 공시균주를 획득하여 그 표본으로 형광동소보합법을 시험함으로 종내 및 종간다양성을 검증하고, 둘째 실험실내에서 바이오필름 모델을 이용하여 그 구조적특성과 기능적특성등 바이오필름으로써의 잠재적인 병적 표현형에 대하여 검증하였다. 또한, 형광동소보합법(FISH)을 사용할 경우 샘플의 전처리(30분~1시간)+ 형광동소보합법(1~2시간)소요로 2시간 남짓한 시간 안에 병원균의 검출유무를 판정할 수 있으므로 매우 유용하다.
본 발명의 형광표지법을 이용한 스트렙토코커스 뮤턴스(Streptococcus mutans)의 검출하는 방법은 2시간 이내에 정성적 및 정량적 검사가 가능하며 스트렙토코커스 뮤턴스의 유전형과 표현형의 검증을 통하여 잠재적인 병원성도 검출할 수 있는 신속하고 정밀한 검사법으로 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 형광표지법을 기반으로 한 스트렙토코커스 뮤턴스(Streptococcus mutans)를 신속하게 검출용 키트를 나타낸 모식도이다:
검출기트의 구성과 그 방법으로 4개의 과정에서 각각의 튜브(멤브레인 필터를 함유)를 제공하고, 반응 종료후 benchtop centrifuge로 1000-2000×g정도로 반응액을 제거 다음 단계로 넘어가는 것을 나타내었고, FISH probe는 단계 중에서 3번째 단계인 Hybridization에 3가지의 혼합된 probe를 넣은 것이다.
도 2A는 충치 원인균의 콜로니 PCR을 이용한 1차 스크리닝 결과를 나타낸 사진이다.
도 2B는 충치 원인균의 콜로니 PCR 결과와 FISH를 통한 프로브의 특이성을 검증하여 비교한 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 S. mutans-specific probe MUT590을 나타낸 것이다.
도 4는 All mutans streptococci-specific probe MUT777를 나타낸 것이다.
도 5는 Streptococcus(genus)-specific FISH probe STR405를 나타낸 것이다.
도 6은 세가지 probe(S. mutans-specific probe MUT590, All mutans streptococci-specific probe MUT777, 및 Streptococcus(genus)-specific FISH probe STR405)를 조합하여 이미징한 결과를 나나탠 것이다.
도 7은 생체외 다당류 형성측정의 예시로 육안으로 관찰 가능한 생체외 다당류와 공초점현미경 및 주사전자현미경을 통한 그 구조적특징 확인하고 정량분석한 결과이다.
도 8은 충치 원인균의 생체외 다당류 형성능을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 충치 원인균의 산 생성능 및 내산성능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 충치 원인균의 산화적 스트레스에 대한 내성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 형광동소보합법 기반 충치균 유전형 다양성 검증
<1-1> 콜로니 PCR 수행에 따른 충치균 스크리닝
충치는 S. mutans 뿐만 아니라 mutans streptococci의 일종인 S. sobinus에 의해서도 많이 발생하므로, S. mutans와 S. sobinus를 분리하고 그 특성을 파악하기 위하여 하기 표 1에 기재된 균주를 colony PCR을 이용하여 1차 스크리닝(screening)하였다.
구체적으로, 알코올 램프를 켜고 멸균된 팁(tip)으로 colony를 찍어 PCR mixture(DW, 10XBuffer, MgCl2, dNTP, Primer Forward: 5′-ACCAGAAAGGGACGGCAAC-3′(서열번호 4) Reverse 5′-TAGCCTTTTACTCCAGACTTTCCTG-3′(서열번호 5))가 함유된 PCR tube에 옮긴 다음 95℃에서 5분간 처리한다. 처리후 Taq enyzme와 DW를 첨가, 혼합하여 PCR cycles를 돌린다. PCR Cycles은 95℃에서 5분, 94℃에서 15초, 50℃에서 30초, 72에서℃ 11초간 ×35 cycles를 러닝(running)한다. PCR product가 생산되면 아가로즈 겔(agarose gel)에 내려 PCR 증폭 결과를 확인하였다.
그 결과, 실험실상에서 균주의 특성이 잘 적립된 S. mutans UA159(실험실 모델상에 가장 널리 사용되는 균주), S. mutans 종내(Intra-species) 공시균주인 S. mutans KCTC 3300, S. mutans KCTC 3298, S. mutans KCTC 3065가 S. mutans-specific primer를 이용한 colony PCR에서 증폭된 산물을 전기영동을 통해 확인하였다. S. mutans 외의 mutans streptococci인 S. sobrinus KCTC 3288, S. sobrinus KCTC 3289, S. sobrinus KCTC 3308, S. criceti KCTC 3292, S. ratti KCTC 3294의 증폭산물은 확인되지 않았다. 반면, S. mutans와 유전형으로 밀접한 상관관계가 있는 S. sobrinus KCTC 3307(이전에 S. mutans로 명명되었음)의 경우 증폭산물이 확인되었다(도 2A).
또한, S. mutans-specific 프라이머를 이용한 colony-PCR에서 실험실에 보관중인 공시균주의 확인에서도 유효성을 보였는데, S. sobrinus KCTC 3288의 경우, original stock에서는 증폭산물이 확인되지 않은 반면, 분양 후 stock 과정에서 만든 것을 확인한 결과 PCR 증폭산물이 확인(오류) 되는 것을 바탕으로 올바른 공시균주 확인과정에도 응용할 수 있음을 확인하였다(도 2B).
분류 균주 특성 PCR 비고
Well-characterized S. mutans strain S. mutans UA159
(ATCC 700610)		 Intra-species positive
Intra-species in
S. mutans 		S. mutans KCTC 3065
(ATCC 25175)		 Intra-species positive
S. mutans KCTC 3298 Intra-species positive
S. mutans KCTC 3300 Intra-species positive
Closely associated mutant streptococci with S. mutans S. sobrinus KCTC
3289 (ATCC 27351) 		Inter-species negative
S. sobrinus KCTC 3307 Inter-species positive 이전에 S. mutans로 명명되었던 strain
Inter-species association with S.
mutans 		S. sobrinus KCTC 3308 Inter-species negative
S. criceti KCTC 3292 Inter-species negative
S. ratti KCTC 3294 Inter-species negative
Strain confirmation S. sobrinus KCTC 3288 Inter-species negative
S. sobrinus KCTC 3288 Inter-species positive 잘못된 stock
<1-2> 프로브 디자인
스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)는 진정세균(Eubacteria) 계(Kingdom)에 속하는 스트렙토코커스 속(Genus)의 뮤탄스 종(Species) 균주이다. S. mutans에 의하여 치아에 형성된 바이오필름에는 다양한 진정세균 계에 속하는 균주가 포함되어 있을 수 있으므로, 이들로부터 바이오필름 형성 및 치아우식에 핵심적인 역할을 하는 S. mutans를 검출하는 것이 중요하다. 또한, 치아우식은 mutans streptococci의 일종인 스트렙토커커스 소르비누스(Streptococcus sobrinus)에 의해서도 많이 발생하므로, S. mutans와 S. sobrinus를 구별할 필요가 있다.
프로브의 디자인 및 사용을 위하여 NCBI Nucleotide에서 각 공시균주의 16S rRNA 시퀀싱정보를 다운로드하여 이를 in silico 방법으로 alignment하여 특이적 염기서열부분을 확인하였다. 적절한 표적부분을 선택하기 위해, mutans streptococci와 그 외 다른 streptococci의 시퀀싱 정보를 토대로 염기서열 일치·불일치 부분을 확인하고, FISH probe design tool (https://www.arb-silva.de/fish-probes/probe-design/)에서 2차적으로 확인하여 최종적으로 디자인 하였다. 또한, 이미 출판된 논문의 프로브를 확인하고 검증하여 실험에 사용하였다(도 3, 도 4 및 도 5).
종류 서열번호 서열(5'-3')
S. mutans-specific probe MUT590 1 ACTCCAGACTTTCCTGAC
All mutans streptococci-specific probe MUT777 2 AATCCTGTTCDCTACCACG
Streptococcus(genus)-specific FISH probe STR405 3 TAGCCGTCCCTTTCTGGT
<1-3> 형광동소보합법(FISH)의 프로브의 특이성 검증
충치는 병원균이 형성하는 바이오필름의 구조적 특징과 밀접한 상관관계가 있으므로 종내 및 종간 다양성과 그 다양성에 기반한 다양한 미생물이 형성하는 바이오필름의 구조적특징을 파악하기 위한 형광동소보합법(FISH)로 검정하였다.
형광동소보합법(FISH)를 통한 프로브(probe)의 특이성을 검증하기 위하여, 하기 표 2에 개시된 S. mutans-specific probe MUT590(도 3), 5'-ACTCCAGACTTTCCTGAC-3' All mutans streptococci-specific probe MUT777(도 4), 5'-AATCCTGTTCDCTACCACG-3' 및 Streptococcus(genus)-specific FISH probe STR405(도 5), 5'-TAGCCGTCCCTTTCTGGT-3' 혼성화 완충액의 샘플(25% 포름아미드, 0.9M NaCl, 0.01% SDS 및 20mM Tris·HCl pH 7.2) 프로브를 사용하여 46℃에서 2시간(최소 1시간 필요) 동안 배양하였다. 혼성화 된 세포를 세척 완충액 (0.2M NaCl, 20mM Tris·HCl pH 7.5, 5mM EDTA 및 0.01% SDS)으로 세척하고 46℃에서 추가 15분 동안 배양하였다.
Colony-PCR의 결과와 FISH 프로브를 이용한 S. mutans 동일확인 결과, S. mutans-specific 프라이머를 통한 colony PCR에서 그 증폭산물이 확인된 S. mutans UA159, S. mutans KCTC 3300, S. mutans KCTC 3298, S. mutans KCTC 3065가 S. mutans-specific한 FISH probe에서 표지되었다(도 2A).
반면, S. mutans이외의 mutans streptococci인 S. sobrinus KCTC 3288, S. sobrinus KCTC 3289, S. sobrinus KCTC 3308, S. criceti KCTC 3292, S. ratti KCTC 3294은 표지되지 않았다. Colony PCR상에서 S. mutans와 밀접한 상관관계가 있는 S. sobrinus KCTC 3307의 경우 표지되어 S. mutans을 표적으로 한 형광동소보합법(FISH)의 프로브의 특이성이 있는 것을 확인하였다(도 2A).
<1-4> Taxon 기반 이미징 기술 적용에 따른 S. mutans 특이적 검출능 확인
S. mutans, S. mutans를 제외한 mutans streptococci, 그리고 mutans streptococci를 제외한 다른 streptococci를 정밀하게 확인하기 위해, MUT590-Cy3, MUT777-FAM와 STR405-Cy5으로 구성된 probe조합을 이용하여 공시균주의 신속 정확 표지화를 검증하였다. 세가지의 probe조합을 이용하여 형광동소보합법(FISH)을 거친 가 표지된 공시균주들은 위해 균질화된 바이오필름(프로브 검증용)의 경우, 위에서 설명한대로 순차적 스캐닝에서 40 × (1.2 NA) 수침 대물 렌즈 또는 63×(1.4 NA) 오일 침지 렌즈가 장착된 LSM 880 공 초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 이미지를 획득하였다(도 6). 488nm 아르곤 레이저와 561nm DPSS 레이저 및 633nm He-Ne 레이저를 사용한 순차 스캐닝에서 이미지를 획득하였다. Zen software(Carl Zeiss)를 사용하여 이미지를 시각화하는 렌더링을 만들었다(도 6).
<실시예 2> 바이오필름 모델 분석 기반 충치균 표현형 검증
충치의 예방을 위해서는 세균에 의해 형성된 바이오필름의 형성을 억제하거나 이를 제거하는 것이 가장 중요하다. 충치 유발성이 강한 바이오필름은 병원균인 S. mutans가 첫번째 병인으로 인식 되고 있으며 잠재적으로 충치유발성이 높거나, 충치가 진행중인 환자는 치아 표면에 S. mutans가 높은 비율과 밀도로 분포하고 있다. 메커니즘 분석에서는 S. mutans가 형성하는 바이오 필름의 구조적 특성은 생체 외 다당류인 EPS(exopolysaccharide)에 의존적 특성이 있다. 즉, 명원성 미생물이 검출되었다고 하더라고 그 미생물의 유전형 및 표현형의 차이로 병원성이 다를 수 있으므로 이를 검증해야한다. 따라서 병원균의 바이오필름 형성에 관련된 표현형을 검출하기 위하여 생체외 다당류 형성 측정(Alexa Fluor 647-dextran incorporation assay), pH 강하실험을 통한 산 생성 및 내산성 측정(pH drop assay), 산화적 스트레스 내성(H2O2-stress tolerance assay)을 측정하였다.
<2-1> 충치균의 EPS(exopolysaccharide) 형성 측정
충치 바이오필름의 주요 EPS 성분은 Gtfs에 의해 생성된 세포 외 글루칸으로, 세포 외로 분비되고 미생물 표면에 결합된다. Gtf 활성 위치는 덱스트란 (10 kDa)-접합 형광 지시약을 수크로스 기질의 존재하에 글루칸에 통합함으로써 결정된다. 형광표지된 덱스트란은 프라이머 역할을 하며 박테리아 세포를 염색하지 않고 새로 형성된 글루칸에 형성된다. 박테리아를 배양하여 105 CFU/ml만큼 1 μM Alexa Fluor 647-dextran conjugate(Molecular Probes)를 포함하는 1 ml의 배양배지 (1% 수크로스 함유)에 접종하고, 37℃에서 18 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 공초점 현미경을 사용하여 형광표지된 Gtf-EPS 글루칸을 관찰하거나 형광분광광도계(Hidex)를 이용하여 정성·정량하였다.
그 결과, Gtf-EPS 글루칸이 형성된 경우 도 7에 나타낸 것과 같이 육안으로도 관찰가능하고, 공초점현미경을 통해서 그 구조적 구성특징을 살펴볼 수 있다. 이 그물모양의 matrix는 전자주사현미경(SEM)을 이용하여 실체적인 모습도 관찰하였다. 정성 정량분석을 위해, 형성된 Gtf-EPS 글루칸을 2000xg에서 20분간 원심분리하고, 상측액을 수집하고, PBS 완충액을 이용하여 2~3회 세척, 원심분리하여 최종 1 ml의 용액으로 만든 뒤, sonication 균질화하여 plate에 분주하고, 그 형광도를 정량하였다. 도 7의 결과에서 S. sorbrinus KTCC3307 (이전에 S. mutans로 명명된 균주), S. ratti (mutans streptococcus), S. mutans KTCC 3303 (사전 스크리닝단계에서 colony-PCR과정에서 증폭산물 확인 안됨)를 이용한 경우, S. sorbrinus KTCC 3307만이 활발한 Gtf-EPS 글루칸 형성능을 보여주었다.
선별된 균주(유전자 정보(full genome sequence)가 이용가능한 균주; S. mutans UA159, S. sobrinus KCTC 3288, S. mutans KCTC 3298, S. sobrinus KCTC 3289, S. sobrinus KCTC 3308, S. mutans KCTC 3065, S. criceti KCTC 3292, S. ratti KCTC 3294)를 이용하여 Gtf-EPS 글루칸 형성능을 측정한 결과, 이미 잘 적립된 S. mutans UA159(EPS 글루칸 형성능이 뛰어나고, 충치유발성이 높음)와 비교하였을 때 그 정량적인 부분에서 차이를 기준으로 그 잠재적 병원성을 진단할 수 있었다(도 8). S. criceti KCTC 3292는 UA159와 비슷한 정도의 글루칸 형성능, S. sobrinus KCTC 3289와 S. mutans KCTC 3065는 UA159에 비해 다소 낮으나 비교적 높은 글루칸 형성능을 보였다. 반면, 구강내 공생균이며 충치유발성이 낮은 것(비 병원성)으로 알려진 S. oralis KCTC 13048은 글루칸을 형성하지 않았고, mutans streptococci의 일종인 S. ratti KCTC 3294는 상대적으로 낮은 글루칸 형성능을 보여, 충치유발성이 잠재적으로 다른 mutans streptococci에 비해 낮다고 진단할 수 있다.
<2-2> pH drop assay에 따른 충치균의 산 생성 및 내산성 측정
Mutans streptococci인 S. mutans UA159, S. sobrinus KCTC 3288, S. mutans KCTC 3298, S. sobrinus KCTC 3289, S. sobrinus KCTC 3308, S. mutans KCTC 3065, S. ratti , S. criceti와 더불어 S. oralis (공생균, 비 병원성)의 산 생성능 및 내산성 능을 측정하였다.
구체적으로, 산 생성을 결정하기 위해 Belli & Marquis(1991)에서 설명한 방법을 변형, 사용하여 해당 pH 강하 분석을 수행하였다. 각각의 균주를 하룻밤 배양 후 아침에 새로운 배지에 접종하여 지수적 성장단계(exponential growth phase)까지 배양하였다. 세포를 원심분리하여 수확하고 염 용액 (50 mM KCl 및 1 mM MgCl2)에 재현탁하여 최종 세포 밀도를 OD600 1.0으로 만들었다. 세포 현탁액을 pH 6.8로 조정하고 글루코스를 최종 농도 1%(w/v)가 되도록 첨가하였다. pH 강하 프로파일의 변화는 실온에서 digital pH meter(Thermo Scientific)를 사용하여 90분 동안 기록하였다.
그 결과, 비 병원성의 공생균인 S. oralis가 산생성이 저조하고 90분간 배양에서 pH 6을 유지하는 등 내산성이 낮았고, S. ratti의 경우에도 다른 mutans streptococci에 비해 산생성과 내산성능에서 낮음을 나타내었다. 그 외 mutans streptococci의 경우 산생성 속도와 최종 pH간의 다소 차이는 있었으나 모두 pH 4이하로 그 내산성능이 높았다(도 9).
<2-3> 충치균의 산화적 스트레스 내성 측정
충치균 S. mutans UA159, S. sobrinus KCTC 3288, S. mutans KCTC 3298, S. sobrinus KCTC 3289, S. sobrinus KCTC 3308, S. mutans KCTC 3065, S. criceti, S. ratti, S. oralis의 과산화 수소(H2O2)에 대한 내성을 측정하였다.
S. mutans UA159, S. sobrinus KCTC 3288, S. mutans KCTC 3298, S. sobrinus KCTC 3289, S. sobrinus KCTC 3308, S. mutans KCTC 3065, S. criceti, S. ratti, S. oralis를 적정 생균수(CFU)만큼 배양 (1×108 또는 1×109 CFU/ml)하고, PBS(Phosphate-buffered saline) 완충액 또는 0.89% NaCl에서 10-5배까지 희석 (107, 106, 105, 104, 103) 하였다. 저항성 측정을 위해 과산화수소를 각각 0, 0.01 및 0.015%로 처리한 배양배지를 제조하고, 10-5배까지 희석된 세균들을 한천배지에 5 μl씩 spotting을 한 뒤, 37℃ 배양기에서 24시간 이상 동안 배양하였다.
그 결과, S. mutans UA159 (실험실 모델상에 가장 널리 사용되는 균주)와 비교하였을 때, S. ratti를 제외하고는 모두 S. mutans UA159보다 스트레스 내성이 높거나 비슷한 수준이었다. 그 중에서도 S. criceti의 경우 과산화수소를 분비하는 S. oralis와 비슷한 수준의 내성을 가져, 과산화수소를 분비하고 치아에 잘 부착하는 공생균과의 경쟁에서 우점 할 가능성이 높은 것으로 진단되었다(도 10).
<110> Jeonbuk National University Industry-Academic Collaboration Foundation <120> Composition for rapid detecting pathogen based fluorescence in situ hybridization, kit containing the same and method thereof <130> DHP20-697 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S. mutans-specific probe MUT590 <400> 1 actccagact ttcctgac 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> All mutans streptococci-specific probe MUT777 <400> 2 aatcctgttc dctaccacg 19 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptococcus(genus)-specific FISH probe STR405 <400> 3 tagccgtccc tttctggt 18 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S. mutans Forward Primer <400> 4 accagaaagg gacggcaac 19 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S. mutans Reverse Primer <400> 5 tagcctttta ctccagactt tcctg 25

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 1) 서열번호 1로 표시되는 핵산 프로프; 서열번호 2로 표시되는 핵산 프로브; 및 서열번호 3으로 표시되는 핵산 프로브를 포함하는 조성물을 생물학적 시료와 혼합하여 혼성화 시키는 단계; 및
    2) 상기 핵산 프로브의 혼성화 여부를 검출하는 단계를 포함하는 스트렙토코커스 뮤턴스를 검출하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 구강 유래 시료인 것인 스트렙토코커스 뮤턴스를 검출하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 구강 유래 시료는 바이오필름(Biofilm)인 것인 스트렙토코커스 뮤턴스를 검출하는 방법.
  7. 제 4항에 있어서,
    3) 상기 생물학적 시료에 포함된 균주의 표현형을 분석하는 단계
    를 더 포함하는 것인 스트렙토코커스 뮤턴스를 검출하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 균주의 표현형은 생체외 다당류 형성, 산 생성 및 내산성, 및 산화적 스트레스 내성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 특성인 것인 스트렙토코커스 뮤턴스를 검출하는 방법.
KR1020200172437A 2020-12-10 2020-12-10 형광표지법 기반 병원균 신속 검출용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 검출방법 KR102432475B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200172437A KR102432475B1 (ko) 2020-12-10 2020-12-10 형광표지법 기반 병원균 신속 검출용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 검출방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200172437A KR102432475B1 (ko) 2020-12-10 2020-12-10 형광표지법 기반 병원균 신속 검출용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 검출방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220082485A KR20220082485A (ko) 2022-06-17
KR102432475B1 true KR102432475B1 (ko) 2022-08-16

Family

ID=82269121

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200172437A KR102432475B1 (ko) 2020-12-10 2020-12-10 형광표지법 기반 병원균 신속 검출용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 검출방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102432475B1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008206516A (ja) 2007-01-31 2008-09-11 Gc Corp 口腔内連鎖球菌数を測定する方法及びそれに用いるｐｃｒプライマー及びプローブセット

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100074455A (ko) * 2008-12-24 2010-07-02 김연수 치주 질환 원인균 탐지용 프로브 및 이를 이용한 분석 장치
KR20120074443A (ko) 2010-12-28 2012-07-06 한국산업기술대학교산학협력단 구강내의 충치균 진단 키트 및 이를 이용한 충치균 항체 검출 진단 방법
KR101706070B1 (ko) 2016-06-28 2017-02-13 (주) 와이디생명과학 멀티플렉스 실시간 pcr을 이용한 다수의 구강질환 원인 세균의 동시 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출 방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008206516A (ja) 2007-01-31 2008-09-11 Gc Corp 口腔内連鎖球菌数を測定する方法及びそれに用いるｐｃｒプライマー及びプローブセット

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D. Kim et al., J. Dent. Res., 99(6), p.597-603, 2020.
Erin L. Gross et al., PLOS one, 7(10), e47722, 2012.
S.S. Momeni et al., Journal of Dental Research, 99(8), p.969-976, 2020.
T. Thurnheer et al., Journal of Microbiological Methods, 44, p.39-47, 2001.

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220082485A (ko) 2022-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108350484A (zh) Rna分析的组合物和方法
JP2017023093A (ja) 歯周病及び齲蝕のリスクの判定方法
Fearnley et al. The development of a real-time PCR to detect pathogenic Leptospira species in kidney tissue
JP6007652B2 (ja) メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を検出するためのプライマーおよびプローブ、ならびに、それらを用いたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出方法
JP2013520186A (ja) 緑膿菌の血清型決定のためのアッセイ法およびキット、ならびにそのような方法およびキットにおいて有用なオリゴヌクレオチド配列
WO2019088271A1 (ja) 歯周ポケット炎症面積の推定方法
JP6160015B2 (ja) アシネトバクター属菌の遺伝子型タイピング法及びこれに用いるプライマーセット
CN113015814A (zh) 检测串联重复的方法
JP2015231362A (ja) 菌叢解析方法と菌叢解析用デバイス
KR20120081129A (ko) 헬리코박터 피로리 및/또는 클래리스로마이신 내성 프로필을 검출하기 위한 펩티드 핵산 프로브, 키트 및 방법 및 적용 방법
KR102274011B1 (ko) 결핵균 및 비결핵항산균을 동시에 감별하여 검출할 수 있는 고감도 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트
KR102432475B1 (ko) 형광표지법 기반 병원균 신속 검출용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 검출방법
TW201102436A (en) Probe for identification of mycobacterium tuberculosis and mycobacterium tuberculosis complex and method using the same
RU2684314C2 (ru) Способ выявления микобактерий туберкулеза генотипа Beijing В0-кластер в формате реального времени
JP6387500B2 (ja) 大腸菌の遺伝子型タイピング法及びこれに用いるプライマーセット
PL228161B1 (pl) Sposób jednoczesnej detekcji bakterii i grzybów w preparacie biologicznym metoda PCR oraz zestaw do detekcji bakterii i grzybów w preparacie biologicznym metoda PCR
JP2022025117A (ja) ｍｅｃＡ遺伝子増幅用プライマーペア、ｍｅｃＡ遺伝子検出キット及びｍｅｃＡ遺伝子検出方法
Shin et al. DNA Microarray-based detection of bacteria in samples containing antibiotics: Effect of antibiotics on the performance of pathogen detection assays
Mandlik et al. Microbial identification in endodontic infections with an emphasis on molecular diagnostic methods: a review
JP5548385B2 (ja) 耐熱性菌類の検出方法
RU2567011C2 (ru) ЗОНД ПЕПТИДНО-НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, НАБОР И СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ И/ИЛИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ Salmonella spp. И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
JP5548389B2 (ja) ビソクラミス属に属する菌類の検出方法
US20130005593A1 (en) RNA-Oligonucleotide Quantification Technique for the Enumeration of Uncultivated Bacterial Species
KR101497977B1 (ko) 총세균 검출용 ｄｎａ 탐침자
US20230374570A1 (en) Method and system for detecting fungal genes and kit for use with same

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant